ISSN: 1859-2171<br />
<br />
TNU Journal of Science and Technology<br />
<br />
197(04): 205 - 210<br />
<br />
SỬ DỤNG MÃ VẠCH DNA matK ĐỂ ĐỊNH DANH MẪU SUM LIÊN THU<br />
TẠI TỈNH LÀO CAI, VIỆT NAM<br />
Nguyễn Hữu Quân*, Kiều Thị Trà Giang<br />
Trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Loài Sum liên có tên khoa học là Adinandra lienii phân bố ở khu vực miền núi phía Bắc, Việt<br />
Nam. Mẫu Sum liên thu tại tỉnh Lao Cai, Việt Nam đã đƣợc nhận diện bằng phân tích các đặc<br />
điểm hình thái dựa trên Khóa phân loại. Để khẳng định mẫu Sum liên thu đƣợc thuộc loài<br />
Adinandra lienii, nghiên cứu này trình bày kết quả sử dụng mã vạch DNA dựa trên trình tự đoạn<br />
gen matK phân lập từ mẫu Sum liên thu tại Lào Cai, Việt Nam. Đoạn gen matK của mẫu Sum liên<br />
có kích thƣớc 867 nucleotide. Kết quả so sánh tƣơng đồng bằng chƣơng trình BLAST trong NCBI<br />
cho thấy trình tự đoạn gen matK của mẫu Sum liên thu tại Lào Cai thuộc loài Adinandra lienii, chi<br />
Dƣơng đồng (Adinandra). Kết quả nghiên cứu này đã mở ra triển vọng sử dụng mã vạch DNA với<br />
trình tự gen matK trong định danh các loài thuộc chi Adinandra.<br />
Từ khóa: Adinandra lienii, DNA barcoding, gen matK, giám định loài, Sum liên<br />
Ngày nhận bài: 16/4/2019; Ngày hoàn thiện: 26/4/2019;Ngày duyệt đăng: 29/4/2019<br />
<br />
USE OF MATK DNA BARCODE TO IDENTIFY Adinandra SAMPLES<br />
COLLECTED AT LAO CAI, VIETNAM<br />
Nguyen Huu Quan*, Kieu Thi Tra Giang<br />
University of Education - TNU<br />
<br />
ABSTRACT<br />
Sum lien has scientific name as Adinandra lienii, distributed in the North of Vietnam. The Sum<br />
lien sample collected in Lao Cai, Vietnam has been identified by analyzing morphological<br />
characteristics based on Lock classification. In order to confirm the Sum lien sample obtained<br />
from Adinandra lienii, this study presents the results using DNA barcodes based on the matK gene<br />
sequence isolated from the Sum lien samples collected in Lao Cai, Vietnam. The matK gene of<br />
Sum sample has the size of 867 nucleotide. The parralel comparision by BLAST in NCBI showed<br />
that the sequence of the matK gene of Sum lien sample collected in Lao Cai is among Adinandra<br />
lienii specie, Adinandra genus. The results of this study open up the prospect of using DNA<br />
barcodes with the matK gene sequence in identifying species belonging to the Adinandra genus.<br />
Key words: Adinandra lienii, DNA barcoding, matK gene, species identification.<br />
<br />
Received: 16/4/2019; Revised: 26/4/2019; Approved: 29/4/2019<br />
<br />
* Corresponding author: Tel: 0369 238303; Email: quannh@dhsptn.edu.vn<br />
http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn<br />
<br />
205<br />
<br />
Nguyễn Hữu Quân và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN<br />
<br />
MỞ ĐẦU<br />
Chi Adinandra thuộc họ Chè Theaceae,<br />
thƣờng là cây gỗ ít khi là cây bụi, nhánh non,<br />
có lông nhung. Hoa mọc đơn độc ở nách lá,<br />
lƣỡng tính, mẫu 5. Lá đài có lông mềm hay<br />
lông ráp. Cánh hoa không lông hay chỉ có<br />
lông ở mặt ngoài. Nhị nhiều lên tới 25 nhị.<br />
Bao phấn có lông ngắn hay dài và có mũi<br />
nhọn. Bầu trên, không lông hay có lông mềm;<br />
noãn nhiều. Quả khô không tự mở; hạt nhiều,<br />
nhỏ. Chi Adinandra có khoảng 85 loài phân<br />
bố ở các nƣớc châu Phi, Trung Quốc, Nhật<br />
Bản, Ấn độ, Srilanka, Banglades, và một số<br />
nƣớc Đông Nam Á [1]. Ở Việt Nam, chi<br />
Adinandra đã đƣợc tìm thấy có 13 loài, phân<br />
bố ở các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng, Quảng<br />
Ninh, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Kon Tum, Lâm<br />
Đồng, Gia Lai, Hà Giang [2].<br />
Sum liên hay còn gọi Hồng đạm liên có tên<br />
khoa học là Adinandra lienii đƣợc mô tả vào<br />
năm 1986 và đƣợc công nhận vào năm 2012.<br />
Loài Adinandra lienii phân bố ở tỉnh Hà<br />
Giang và Lào Cai, Việt Nam. Loài Adinandra<br />
lienii chƣa có bất kì một nghiên cứu nào công<br />
bố về đặc điểm sinh học, thành phần hóa học<br />
và di truyền. Ngoài ra, dựa vào đặc điểm hình<br />
thái và cấu tạo hiển vi rễ, thân và lá chúng tôi<br />
nhận thấy mẫu Sum liên thu tại Lào Cai đều<br />
thuộc loài Adinandra lienii.<br />
Gen matK thuộc hệ gen lục lạp, có kích thƣớc<br />
khoảng 1550 bp và mã hóa enzyme<br />
maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các<br />
intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA.<br />
Do gen matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu<br />
hết trong thực vật nên đã đƣợc sử dụng nhƣ<br />
một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ và<br />
phát sinh loài ở thực vật. CBOL đã thử<br />
nghiệm gen matK trên gần 550 loài thực vật<br />
và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ<br />
dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng<br />
một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng gen<br />
matK là một trong những locus barcode chuẩn<br />
cho thực vật [3], [4], [5].<br />
206<br />
<br />
197(04): 205 - 210<br />
<br />
Hiện nay, chƣa có công bố nào về đặc điểm<br />
phân loại học phân tử, cũng nhƣ các đặc điểm<br />
sinh học của loài Sum liên. Các mẫu Sum liên<br />
thu thập tại các địa phƣơng khác nhau có thể<br />
có sự sai khác về đặc điểm hình thái, vì vậy,<br />
cần thiết phải căn cứ vào các dữ liệu phân loại<br />
học phân tử để nhận diện loài Adinandra<br />
lienii. Trong bài báo này, chúng tôi sử dụng<br />
trình tự đoạn gen matK để định danh loài<br />
Adinandra lienii thu thập tại tỉnh Lào Cai và<br />
nhằm bổ sung cơ sở dữ liệu phân loại học<br />
phân tử của loài.<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br />
Vật liệu: Mẫu lá non Sum liên đƣợc thu tại<br />
huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai sử dụng để tiến<br />
hành phân lập đoạn gen matK.<br />
Hóa chất: Các hóa chất tách chiết ADN tổng<br />
số do hãng Wako (Nhật bản) và Merck (Đức)<br />
cung cấp; Hóa chất PCR, điện di ADN do các<br />
hãng Fermentas (Đức), Bioneer (Hàn quốc),<br />
Research Organics (Mỹ) cung cấp.<br />
Phương pháp<br />
Phân lập gen matK: DNA tổng số đƣợc phân<br />
lập dựa trên phƣơng pháp của Shaghai và<br />
cộng sự (1984) [6]. Khuếch đại gen matK<br />
bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu<br />
đƣợc tổng hợp theo Kress và cộng sự (2005)<br />
[7]. Kích thƣớc mồi và trình tự mong muốn<br />
của đoạn DNA khuếch đại đƣợc mô tả theo<br />
bảng 1.<br />
Hỗn hợp phản ứng PCR (tổng thể tích 25 μl)<br />
gồm: 12,5 μl master mix (2X); 0,5 μl mồi mỗi<br />
loại (10 pmol/μl); 1,0 μl DNA khuôn (10<br />
ng/μl); 9,5 μl nƣớc cất. Phản ứng PCR đƣợc<br />
thực hiện theo chƣơng trình: 94C/4 phút; 35<br />
chu kỳ (94C/30 giây; 55C/30 giây; 72C/45<br />
giây); 72C/10 phút và giữ ở 4C. Sản phẩm<br />
PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1,0% và<br />
đƣợc tinh sạch theo kit tinh sạch của hãng<br />
Qiagen. Trình tự DNA đƣợc xác định trên<br />
máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100<br />
Avant Genetic Analyzer. Trình tự nucleotide<br />
của gen đƣợc phân tích bằng phần mềm<br />
BLAST, BioEdit và DNAstar.<br />
http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn<br />
<br />
Nguyễn Hữu Quân và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN<br />
<br />
197(04): 205 - 210<br />
<br />
Bảng 1. Thông tin về cặp mồi nhân gen matK sử dụng trong nghiên cứu<br />
Trình tự mồi<br />
(5′3′)<br />
<br />
Tên mồi<br />
MatK-F<br />
<br />
5’- CGATCTATTCATTCAATATTTC-3’<br />
<br />
MatK-R<br />
<br />
5’- TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT-3’<br />
<br />
Nhiệt độ<br />
gắn mồi<br />
<br />
Kích thước đoạn<br />
gen dự kiến<br />
<br />
55°C<br />
<br />
~ 800 bp<br />
<br />
Bảng 2. Các trình tự nucleotide của đoạn gen matK sử dụng trong phân tích<br />
Tác giả<br />
<br />
Năm<br />
<br />
Adinandra sp. JH-2017<br />
<br />
Mã số trên<br />
GanBank<br />
MF418698.1<br />
<br />
Heckenhauer và cs<br />
<br />
2017<br />
<br />
Kích thước<br />
(bp)<br />
827<br />
<br />
2<br />
<br />
Adinandra sp. JH-2017<br />
<br />
MF418697.1<br />
<br />
Hecken auer và cs<br />
<br />
2017<br />
<br />
826<br />
<br />
3<br />
<br />
Adinandra millettii<br />
<br />
HQ427369.1<br />
<br />
Pei và cs<br />
<br />
2016<br />
<br />
830<br />
<br />
4<br />
<br />
Adinandra nitida<br />
<br />
KP093833.1<br />
<br />
Liu và cs<br />
<br />
2015<br />
<br />
756<br />
<br />
5<br />
<br />
Adinandra dumosa<br />
<br />
KU853076.1<br />
<br />
Srivathsan và cs<br />
<br />
2016<br />
<br />
754<br />
<br />
TT<br />
<br />
Loài<br />
<br />
1<br />
<br />
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
Phân lập đoạn gen matK bằng phản ứng PCR<br />
Lá non của mẫu Sum liên thu tại tỉnh Lào Cai<br />
sử dụng để tách DNA tổng số. Sản phẩm<br />
DNA tổng số đƣợc điện di trên gel agarose<br />
0,8% và đo quang phổ để kiểm tra chất lƣợng<br />
tách. Kết quả kiểm tra cho thấy DNA tổng số<br />
thu đƣợc đảm bảo chất lƣợng cho phản ứng<br />
nhân gen.<br />
Đoạn gen matK đƣợc phân lập bằng phản ứng<br />
PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi đặc<br />
hiệu MatK-F/MatK-R. Sản phẩm PCR đƣợc<br />
tiến hành điện di trên gel agarose 0,8%, kết<br />
quả điện di xuất hiện 1 băng có kích thƣớc<br />
khoảng 800 bp, ứng với đoạn gen matK theo<br />
lý thuyết (Hình 1).<br />
Giải trình tự đoạn gen matK thu được từ<br />
phản ứng PCR<br />
Đoạn gen matK đƣợc tiến hành tinh sạch và<br />
giải trình tự nucleotit trên máy giải trình tự tự<br />
động ABI PRISM 3100 Avant Genetic<br />
Analyzer. Kết quả giải trình tự đã xác định<br />
đƣợc đoạn gen matK phân lập từ loài Sum<br />
liên dài 867 nucleotit (Hình 2). Đoạn gen<br />
matK đã phân lập từ mẫu Sum liên thu tại Lào<br />
Cai đƣợc kí hiệu là LC201904.<br />
<br />
http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn<br />
<br />
Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn<br />
DNA tổng số của mẫu Sum liên<br />
Làn 1: đoạn gen matK, Làn M: DNA marker<br />
<br />
Sử dụng phần mềm BLAST trong NCBI để<br />
phân tích sự tƣơng đồng giữa trình tự của<br />
đoạn gen matK từ loài Sum liên với trình tự<br />
gen matK trên GenBank. Kết quả phân tích<br />
cho thấy hệ số tƣơng đồng giữa trình tự<br />
nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ<br />
mẫu Sum liên thu tại Lào Cai so với đoạn gen<br />
matK của các loài thuộc chi Adinadra trên<br />
GenBank dao động từ 99,39-100% (Hình 3).<br />
<br />
207<br />
<br />
Nguyễn Hữu Quân và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN<br />
<br />
197(04): 205 - 210<br />
<br />
Hình 2. Kết quả giải trình tự đoạn gen matK của loài Sum liên thu tại tỉnh Lào Cai<br />
<br />
Hình 3. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự đoạn gen matK của loài Sum liên<br />
so với trình tự đoạn gen matK trên GenBank bằng BLAST trong NCBI<br />
<br />
Phân tích mối quan hệ giữa loài Sum liên<br />
với các loài thuộc chi Adinandra dựa trên<br />
trình tự đoạn gen matK<br />
Tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền<br />
giữa loài Sum liên Adinandra lienii với một<br />
số loài Adinandra millettii, Adinandra sp. JH2017, Adinandra nitida và Adinandra dumosa<br />
thuộc chi Adinandra dựa trên trình tự đoạn<br />
208<br />
<br />
gen matK. Kết quả so sánh đã thống kê đƣợc<br />
trình tự đoạn gen matK thuộc loài Sum liên<br />
Adinandra lienii và các trình tự từ các loài<br />
Adinandra millettii (mã số HQ427369.1), loài<br />
Adinandra sp. JH-2017 (mã số MF418697.1,<br />
MF418698.1), loài Adinandra dumosa (mã số<br />
KU853076.1) và loài Adinandra nitida (mã số<br />
KP093833.1) thuộc chi Adinandra có số<br />
http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn<br />
<br />
Nguyễn Hữu Quân và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN<br />
<br />
lƣợng nucleotide khác nhau (Bảng 2). Cụ thể,<br />
số nucleotide của các loài Adinandra lienii<br />
(trong nghiên cứu này) là 867, loài Adinandra<br />
millettii là 830, loài Adinandra sp. JH-2017 là<br />
826-827, loài Adinandra nitida là 756 và loài<br />
Adinandra dumosa là 754 nucleotide. Kết quả<br />
này cho thấy, đoạn gen matK từ mỗi loài<br />
thuộc chi Adinandra có kích thƣơc khác nhau<br />
và đặc trƣng cho từng loài.<br />
Trình tự nucleotide của đoạn gen matK của<br />
loài Adinandra lienii đƣợc so sánh với các<br />
loài trong bảng 2 tại vị trí nucleotide thứ 113<br />
đến 628 cho thấy trình tự các nucleotide của 6<br />
loài tƣơng đối giống nhau, ngoại trừ một số<br />
điểm khác biệt tại các vị trí nucleotide số 192,<br />
<br />
197(04): 205 - 210<br />
<br />
193 (T thay bằng C), 663 (A thay bằng C) và<br />
778 (G thay bằng A). Các trình tự nucleotide<br />
còn lại liên quan tới sự sai khác số lƣợng<br />
nucleotide (Hình 4).<br />
Xây dựng cây phát sinh chủng loại<br />
Trình tự nucleotide của đoạn gen matK từ 6<br />
loài đƣợc chúng tôi sử dụng phần mềm<br />
MegAlign để xác định hệ số tƣơng đồng, hệ<br />
số phân li và cây phát sinh chủng loại. Kết<br />
quả bảng 3 cho thấy hệ số tƣơng đồng và hệ<br />
số phân li trình tự của đoạn gen matK từ loài<br />
Adinandra lienii với các loài thuộc chi<br />
Adinandra dao động từ 95,9-100% và hệ số<br />
phân li từ 0-2,2%.<br />
<br />
Hình 4. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân l p từ loài Sum liên Adinandra lienii thu tại Lào Cai<br />
iệt Nam và trình tự đoạn gen matK công bố trên GenBank<br />
http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn<br />
<br />
209<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
