TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 8683-16:2017
GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - PHẦN 16: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI RÚT GUMBORO NHƯỢC ĐỘC
CHỦNG 2512
Master seed of microorganisms for veterinary use - Part 16: The procedure for preservation of gumboro
virus, 2512 strain, living
Lời nói đầu
TCVN 8683-16 : 2017 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ
Khoa học và Công nghệ công bố.
Bộ TCVN 8683 Giống vi sinh vật thú y - Quy trình giữ giống gồm các phần:
- TCVN 8683-1 : 2011, Phần 1: Quy trình giữ giống vi rút dịch tả lợn qua thỏ, chủng C;
- TCVN 8683-2 : 2011, Phần 2: Quy trình giữ giống vi rút cường độc dịch tả lợn, chủng Thạch môn;
- TCVN 8683-3 : 2011, Phần 3: Quy trình giữ giống vi rút Newcastle, chủng hệ I;
- TCVN 8683-4 : 2011, Phần 4: Quy trình giữ giống vi rút dại chủng cố định;
- TCVN 8683-5 : 2011, Phần 5: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn nhược độc, chủng VR2;
- TCVN 8683-6 : 2011, Phần 6: Quy trình giữ giống vi khuẩn nhiệt thán vô độc, chủng 34 F2;
- TCVN 8683-7 : 2011, Phần 7: Quy trình giữ giống vi khuẩn nhiệt thán cường độc, chủng 17JB;
- TCVN 8683-8 : 2011, Phần 8: Quy trình giữ giống vi khuẩn phó thương hàn lợn, các chủng SC.1;
SC.2; SC.4 và SC.5;
- TCVN 8683-9 : 2011, Phần 9: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng trâu bò, các chủng PB.1,
PB.2, P.52, PBU.1 và PBU.2;
- TCVN 8683-10 : 2011, Phần 10: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng lợn nhược độc, chủng
AVPS3;
- TCVN 8683-11 : 2011, Phần 11: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng lợn, chủng PS1;
- TCVN 8683-12 : 2011, Phần 12: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng gà, các chủng PA.1,
PA.2;
- TCVN 8683-13 : 2011, Phần 13: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn, các chủng E.37, E.47 và
E.80;
- TCVN 8683-14 : 2011, Phần 14: Quy trình giữ giống vi khuẩn ung khí thán, các chủng CL.C1 và
CL.C2;
- TCVN 8683-15 : 2017, Phần 15: Quy trình giữ giống vi rút viêm gan vịt cường độc;
- TCVN 8683-16 : 2017, Phần 16: Quy trình giữ giống vi rút gumboro nhược độc chủng 2512;
-TCVN 8683-17 : 2017, Phần 17: Quy trình giữ giống vi khuẩn bordetella bronchiseptica.
GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - PHẦN 16: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI RÚT GUMBORO NHƯỢC ĐỘC
CHỦNG 2512
Master seed of microorganisms for veterinary use - Part 16: The procedure for preservation of
gumboro virus, 2512 strain, living
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao
tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên
quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an
toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng
tiêu chuẩn.
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định quy trình nuôi giữ giống vi rút Gumbro nhược độc chủng 2512 được sử dụng
trong công tác giữ giống, đánh giá chất lượng vắc xin và chế phẩm sinh học, chẩn đoán, nghiên cứu và
giảng dạy.
2 Tài liệu viện dẫn
Tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì
áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 8684 : 2011, vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết.
3 Ký hiệu và chữ viết tắt
AGID Agar gel immunodiffussion
AND Acid deribonucleic
ARN Acid ribonucleic
EID50 50 Egg Infective Dose
CID50 50 Chicken infective dose
SN Serum neutralization
SPF Specific Pathogen Free
TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
RT-PCR Reverce Transcription Polymerase Chain Reaction
4 Nguyên tắc
Lấy giống vi rút Gumbro nhược độc được giữ ở dạng đông khô để kiểm tra đặc tính sinh học của giống
bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm. Giống được bồi dưỡng bằng cách cấy
truyền trên tế bào xơ phôi gà 1 lớp, sau 48 h đến 72 h, giống được thu hoạch, giám định vi rút bằng
phương pháp RT-PCR, nếu giống vi rút Gumbro nhược độc đạt yêu cầu được đông khô và bảo quản
quản ở nhiệt độ âm 80 °C.
5 Vật liệu và thuốc thử
5.1 Vật liệu
5.1.1 Giống vi rút Gumbro nhược độc chủng 2512 thuộc serotype 1, họ Birnaviridae, được đông khô
với lượng giống 0,1 ml/lọ với hiệu giá vi rút là 103 TCID50/0,1 ml, được kiểm tra vô trùng, thuần khiết,
tính an toàn, tính miễn dịch, tính nhân lên của vi rút
5.1.2 Gà 14 ngày tuổi (gà khỏe mạnh, không có kháng thể kháng vi rút Gumboro, có nguồn gốc từ đàn
gà bố mẹ khỏe mạnh)
5.1.3 Tế bào xơ phôi gà một lớp trên đĩa nhựa đáy phẳng 96 giếng hoặc chai Flash T25 hoặc T75
5.1.4 Trứng gà SPF có phôi từ 9 ngày tuổi đến 11 ngày tuổi
5.1.5 Giống vi rút Gumboro cường độc
5.2 Thuốc thử
5.2.1 Dung dịch PBS pH 7,2 (xem phụ lục A)
5.2.2 Môi trường nuôi cấy tế bào
5.2.3 Thạch Agar
5.2.4 Huyết thanh dương tính chuẩn (với Gumboro)
5.2.5 Kháng nguyên chuẩn (với Gumboro)
5.2.6 Huyết thanh âm tính chuẩn (với Gumboro)
5.2.7 Bộ kit dùng cho phản ứng RT-PCR
5.2.8 Các loại kháng sinh Penicillin (200 Ul/ml), Streptomycin (200 μg/ml)
5.2.9 Sữa bò tách bơ 10% (xem phụ lục A)
Xem Phụ lục A về mô tả các dung dịch thuốc thử.
6 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
6.1 Tủ lạnh (có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C), tủ lạnh sâu (có thể duy trì nhiệt độ âm 80 °C)
6.2 Tủ ấm CO2 có thể duy trì nhiệt độ 37 °C
6.3 Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2400 rpm
6.4 Máy khuấy từ có tốc độ khuấy tới 2400 vòng/phút
6.5 Nồi cách thủy có thể duy trì ở các nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C trong thời gian 10 min, 15 min,
20 min
6.6 BSC II màng lọc ULPA với hiệu suất lọc 99,99% đối với các hạt có kích thước 0,1 - 0,3 mm
6.7 Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc tới 12 000 g
6.8 Máy đông khô có nhiệt độ âm sâu tới âm 80 °C
6.9 Máy RT-PCR
6.10 Máy điện di kiểm tra sản phẩm PCR/RT-PCR của hãng Fermentas và Bio-Rad
6.11 Máy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, Mỹ)
6.12 Máy tính và các phần mềm sinh - tin học
6.13 Micropipet, dung tích từ 0,5 μl đến 10 μl, từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến
1000 μl
6.14 Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl
6.15 Chai nuôi cấy tế bào T25, T75
6.16 Đầu tip phù hợp với micropipet
6.17 Đèn soi trứng
6.18 Tủ ấp trứng có thể duy trì nhiệt độ 37 °C
6.19 Cốc có mỏ, dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml
6.20 Bộ cối chày sứ vô trùng
6.21 Lọ đông khô giống vô trùng
6.22 Đĩa Petri vô trùng
6.23 Dao, kéo, panh kẹp vô trùng
6.24 Chai Schott vô trùng 100 ml, 200 ml, 500ml
7 Yêu cầu của giống vi rút Gumboro nhược độc
7.1 Yêu cầu kỹ thuật đối với ống giống
- Lọ kín, không rạn nứt, đảm bảo chân không.
- Hợp chất trong ống giống xốp, màu đồng nhất, độ ẩm dưới 4% và hòa tan hoàn toàn trong nước sinh
lý sau 2 min.
7.2 Yêu cầu sinh học của giống
- Giống vi rút đảm bảo vô trùng (không bị tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc), đảm bảo thuần khiết (không bị
tạp nhiễm Mycoplasma, Salmonella và vi rút ngoại lai)
- Giống vi rút được nhận dạng bằng phương pháp RT-PCR (xuất hiện vạch giống như mẫu đối chứng
dương) hoặc phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (vi rút kết tủa với kháng huyết thanh đặc hiệu tạo
thành đường kết tủa màu trắng)
- Hiệu giá vi rút của giống phải đạt ít nhất 103 TCID50/0,1 ml
- Giống vi rút được kiểm tra tính an toàn trên gà (khi nhỏ giống vi rút cho gà thì gà sống khỏe, không có
biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Gumboro)
- Giống vi rút được kiểm tra khả năng nhân lên của vi rút trên môi trường tế bào xơ phôi gà 1 lớp (sau
48 h đến 72 h gây nhiễm, vi rút nhân lên và phá hủy ≥ 80% diện tích tế bào)
- Giống vi rút được kiểm tra tính gây miễn dịch bằng phương pháp công cường độc hoặc phương pháp
trung hòa.
8 Cách tiến hành
8.1 Nhận dạng giống
Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:
8.1.1 Nhận dạng vi rút bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch AGID
Giống vi rút (5.1.1) được nhận dạng bằng phương pháp kết tủa khuếch tán miễn dịch trên thạch
(AGID). Vi rút (5.1.1) kết tủa với kháng huyết thanh đặc hiệu tạo thành đường kết tủa màu trắng khi
thực hiện phản ứng kết tủa khuếch tán miễn dịch trên thạch (xem phụ lục C).
8.1.2 Nhận dạng vi rút bằng phương pháp RT- PCR
Giống vi rút (5.1.1) được nhận dạng bằng phương pháp RT - PCR (tham khảo phụ lục F).
8.2 Kiểm tra vô trùng
8.2.1 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn. Theo TCVN 8684:2011
8.2.2 Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc. Theo TCVN 8684:2011
8.3 Kiểm tra thuần khiết
8.3.1 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma. Theo TCVN 8684:2011
8.3.2 Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella. Theo TCVN 8684:2011
8.3.3 Kiểm tra vi rút ngoại lai
Kiểm tra tạp nhiễm vi rút Cúm gia cầm được tiến hành bằng phản ứng RT-PCR (tham khảo phụ lục B).
8.4 Chuẩn độ vi rút
Chuẩn độ giống vi rút (5.1.1) trên môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp (5.1.3) được thực hiện ở
tấm nhựa 96 giếng đáy bằng (xem phụ lục D). Giống đạt yêu cầu khi hiệu giá vi rút của giống phải đạt
103 TCID50/0,1 ml.
8.5 Kiểm tra tính an toàn
8.5.1 Chuẩn bị
- 10 gà (5.1.2).
- Giống vi rút (5.1.1) được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong
khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha loãng với PBS (5.2.1) thành nồng độ 10-3.
8.5.2 Cách tiến hành
Nhỏ mắt, mũi hoặc cho uống mỗi gà 0,1 ml giống vi rút (5.1.1) đã pha loãng ở trên. Theo dõi biểu hiện
triệu chứng lâm sàng của gà trong vòng 21 ngày.
8.5.3 Đánh giá kết quả
Giống vi rút (5.1.1) được coi là an toàn khi: Sau 21 ngày nhỏ giống vi rút (5.1.1) 10/10 gà (5.1.2) sống
khỏe, không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Gumboro. Toàn bộ gà thí nghiệm bị giết và
kiểm tra bệnh tích, không có gà thí nghiệm nào có bệnh tích của bệnh Gumboro.
Ghi chú: - Triệu chứng điển hình của bệnh Gumboro: Gà quay đầu tự mổ vào hậu môn, gà có dấu hiệu
hoảng loạn và có tiếng kêu khác thường. Sau 2 ngày đến 3 ngày gà bị ỉa chảy, phân loãng, nhiều
nước, trắng, nhớt
- Bệnh tích của bệnh Gumboro: Xuất huyết cơ đùi, cơ ngực; thận và lách sưng; túi Fabricius sưng, xuất
huyết có dịch nhày xung quanh.
8.6 Kiểm tra khả năng nhân lên của vi rút
Kiểm tra khả năng nhân lên của giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 trên môi trường tế bào
xơ phôi gà 1 lớp (5.1.3).
8.6.1 Chuẩn bị
- Tế bào xơ phôi gà 1 lớp (5.1.3) (xem phụ lục A.6).
- Giống vi rút (5.1.1) được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong
khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha loãng với môi trường nuôi cấy tế bào (5.2.2) thành nồng độ 103
TCID50/0,1 ml.
8.6.2 Cách tiến hành
- Dùng pipette hút bỏ môi trường nuôi cấy (5.2.2) trong chai T25 (6.15) đã có tế bào phát triển.
- Chia huyễn dịch giống vi rút đã pha ở trên vào các chai nuôi cấy.
- Bổ sung môi trường nuôi cấy (5.2.2) sao cho lượng môi trường cho vào bằng lượng môi trường hút
ra.
- Tiếp tục nuôi cấy chai tế bào trong tủ ấm CO2 ở nhiệt độ 37 °C từ 48 h đến 72 h.
- Hàng ngày kiểm tra sự phát triển của vi rút và bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi ngược.
8.6.3 Đánh giá kết quả
Giống vi rút (5.1.1) đạt yêu cầu khi: Sau 48 h đến 72 h gây nhiễm (8.6.2), vi rút nhân lên và phá hủy ≥
80% diện tích tế bào.
- Bệnh tích tế bào: Các tế bào vỡ ra, co cụm thành từng khối, bong ra khỏi thành giếng.
8.7 Kiểm tra tính gây miễn dịch
Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:
8.7.1 Phương pháp công cường độc
8.7.1.1 Chuẩn bị
- 20 gà (5.1.2)
- Giống vi rút (5.1.1) được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong
khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha loãng với môi trường nuôi cấy (5.2.2) thành nồng độ 103 TCID50/0,1
ml.
8.7.1.2 Cách tiến hành
- 20 gà (5.1.2) được chia làm 2 nhóm:
+ Nhóm miễn dịch: 10 gà (5.1.2) được nhỏ mắt, mũi hoặc cho uống mỗi con 0,1 ml giống vi rút (5.1.1)
đã pha loãng ở trên.
+ Nhóm đối chứng: 10 gà (5.1.2) được nhỏ mắt, mũi hoặc cho uống mỗi con 0,1 ml PBS (5.2.1).
- Sau 14 ngày cả hai nhóm gà được công cường độc bằng giống vi rút Gumboro cường độc (5.1.5) liều
102 CID50/0,1 ml.
- Theo dõi đàn gà từ 24 h đến 72 h sau khi công cường độc. Toàn bộ gà thí nghiệm bị giết và kiểm tra
bệnh tích.
8.7.1.3 Đánh giá kết quả
- Giống vi rút Gumboro (5.1.1) đạt tiêu chuẩn về tính gây miễn dịch khi:
+ Nhóm miễn dịch ít nhất 80% gà không có bệnh tích của bệnh Gumboro.
+ Nhóm đối chứng ít nhất 80% gà có bệnh tích của bệnh Gumboro như xuất huyết cơ đùi, sưng, xuất
huyết và có dịch ở túi Fabricius.
8.7.2 Phương pháp trung hòa (SN)