Xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến gen yếu tố 8 gây bệnh hhemophila A

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN GEN YẾU TỐ VIII <br /> GÂY BỆNH HEMOPHILIA A <br /> Nguyễn Ngọc Minh*, Đỗ Thị Thanh Thủy*, Nguyễn Thị Băng Sương* <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Mở đầu: Bệnh hemophilia A là một bệnh di truyền do thiếu hụt hay bất thường chức năng của yếu tố đông <br /> máu VIII. Đây là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X nên bệnh gặp chủ yếu ở nam giới và nữ <br /> giới là người mang gen bệnh. Biểu hiện bệnh trên lâm sàng chủ yếu là chảy máu, mức độ chảy máu có thể là nhẹ, <br /> trung bình hoặc nặng tùy thuộc vào nồng độ của yếu tố VIII trong huyết tương. Chẩn đoán chính xác và điều trị <br /> sớm căn bệnh này có một ý nghĩa quan trọng nhằm hạn chế tối đa tình trạng chảy máu cũng như giảm thiểu khả <br /> năng bệnh nhân trở thành tàn tật. Tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử ngày nay cho phép phân tích DNA để <br /> phát hiện những tổn thương gen gây ra bệnh hemophilia A, phát hiện người lành mang gen bệnh và ứng dụng <br /> trong chẩn đoán trước sinh cũng như tư vấn di truyền. <br /> Mục  tiêu:  Xây dựng và chẩn hóa quy trình xét nghiệm xác định đột biến gen F8 gây bệnh Hemophila A <br /> bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen. <br /> Đối tượng và phương pháp: Phân tích đột biến gen F8 ở hai bệnh nhân nam mắc bệnh Hemophilia A ở thể <br /> nặng đã được chẩn đoán trên lâm sàng. DNA từ máu ngoại vi của bệnh nhân sau khi tách chiết được dùng làm <br /> khuôn cho phản ứng PCR với 33 cặp mồi nhằm khuếch đại toàn bộ 26 exon và vùng nối intron – exon của gen <br /> F8. Sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự và phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng nhằm xác định <br /> các đột biến gây bệnh. <br /> Kết quả: Trong hai bệnh nhân nam tham gia vào nghiên cứu, một bệnh nhân được xác định mang đột biến <br /> dịch khung do mất 4 nucleotid ở exon 14. Bệnh nhân còn lại mang đột biến thay thế nucleotide T bằng A cũng <br /> trên exon 14, đột biến này tạo ra một stop codon làm ngừng quá trình phiên mã ngay tại vị trí đột biến.  <br /> Kết luận: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết kế 33 cặp mồi và chẩn hóa thành công quy trình phản <br /> ứng PCR và giải trình tự các vùng mã hóa của gen F8. Với quy trình này, chúng tôi cũng xác định được đột <br /> biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A trên hai bệnh nhân nam. Trong hai đột biến được xác định, một đột biến vô <br /> nghĩa chưa từng được công bố trên các cơ sở dữ liệu về Hemophilia A. <br /> Từ khoá: Hemophilia A, gen yếu tố 8, đột biến. <br /> <br /> ABSTRACT <br /> ESTABLISH PROTOCOL FOR DIAGNOSIS OF MUTATION IN FACTOR VIII ENCODING GENE <br /> CAUSING HEMOPHILIA A <br /> Nguyen Ngoc Minh, Do Thi Thanh Thuy, Nguyen Thi Bang Suong <br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 4 ‐ 2013: 18‐ 23 <br /> Introduction:  Hemophilia A is an X‐linked congenital bleeding disorder caused by Factor VIII deficiency. <br /> Different  mutations  including  point  mutations,  deletions,  insertions  and  inversions  have  been  reported  in  the <br /> FVIII gene, which cause hemophilia A. <br /> Objectives: Establish a standard protocol to diagnose and identify genetic mutations that cause Hemophilia <br /> A disorder by PCR and Sequencing methods.  <br /> * Đại học Y Dược TP.HCM  <br /> Tác giả liên lạc: TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương,   ĐT: 0914007038,  <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> <br /> Email: suongnguyenmd@gmail.com. <br /> <br /> 19<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013<br /> <br /> Methods: Two male patients’ peripheral blood samples were collected to conduct the research. These patients <br /> have severe Hemophilia A symptoms. DNA from blood samples were extracted using Quiagen Kit and performed <br /> PCR  with  33  pair  of  primers  in  order  to  amplify  26  exons  with  exon‐intron  boundaries  regions.  The  PCR‐<br /> amplified fragments were then subjected to Sequencing analysis.  <br /> Results:  In the current study, with the use of PCR and sequencing analysis, we identified a 4‐nt deletion <br /> mutant occurring in exon 14 of the FVIII gene and a nonsense mutant caused by a substitution of A for T in exon <br /> 14.  This  mutation  that  cause  a  premature  stop‐codon  at  732  has  not  previously  been  reported  in  the  F8 <br /> Hemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site (HAMSTeRS) database. <br /> Conclusion: We have successfully designed the primer set for amplification the whole functional FVIII gene <br /> and standardized the diagnostic protocol for FVIII gene mutant. In addition, we detected a nonsense mutant that <br /> has not been report before on the HAMSTeRS database.  <br /> Keywords: Factor VIII, Hemophilia A, deletion, frame shift, nonsense mutants. <br /> do  chấn  thương  dù  rất  nhẹ  và  khó  cầm  máu. <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ  <br /> Hiện tượng chảy máu khớp kéo dài và tái phát <br /> Bệnh ưa chảy máu Hemophilia A là bệnh di <br /> nhiều lần có thể dẫn tới biến chứng teo khớp, teo <br /> truyền lặn liên kết NST X gây ra do đột biến gen <br /> cơ, lâu dần làm mất chức năng vận động. Bệnh <br /> yếu tố VIII (F8) ‐ gen chịu trách nhiệm tổng hợp <br /> nhân cần được chẩn đoán bệnh càng sớm càng <br /> protein FVIII tham gia vào con đường đông máu <br /> tốt và được điều trị bằng cách truyền chế phẩm <br /> nội sinh(4). Do không có cặp gen tương đồng trên <br /> máu. <br /> NST Y nên người nam dễ mắc bệnh hơn người <br /> Bản  đồ  của  gen  F8  được  công  bố  vào  năm <br /> nữ  do  chỉ  cần  mang  một  gen  đột  biến  là  biểu <br /> 1984, gen nằm trên cánh dài của NST X (Xq28). <br /> hiện  bệnh.  Người  nữ  dị  hợp  sẽ  không  có  biểu <br /> Gen  F8  gồm  26  exons  có  chiều  dài  186  kb,  mã <br /> hiện  bệnh  nhưng  khả  năng  di  truyền  gen  bệnh <br /> hóa cho protein FVIII gồm 2332 acid amin(5). Có <br /> cho thế hệ sau, đặc biệt là cho con trai, rất  cao. <br /> rất nhiều đột biến gen F8 đã được xác định, phổ <br /> Trong các bệnh rối loạn đông máu, Hemophilia <br /> biến  là  đột  biến  đảo  đoạn  intron  22  gây  ra  40‐<br /> A  là  bệnh  phổ  biến  nhất  với  tỷ  lệ  ước  tính <br /> 50% ca bệnh Hemophilia A thể nặng và đột biến <br /> khoảng 1/5000 tới 1/10000 nam giới(8).  <br /> đảo  đoạn  intron  1  gây  ra  5‐7%  ca  bệnh  thể <br /> Thể  bệnh  nặng  hay  nhẹ  phụ  thuộc  vào  số <br /> nặng(11). Những trường hợp còn lại mắc bệnh do <br /> lượng các yếu tố đông máu trong máu. Nồng độ <br /> nhiều đột biến điểm và đột biến tái sắp xếp gen <br /> yếu  tố  VIII  ở  người  bình  thường  là  200  ng/ml. <br /> nhỏ khác nhau rải rác trên khắp hệ gen(14). Theo <br /> 80%  bệnh  nhân  Hemophilia  A  mắc  bệnh  ở  thể <br /> các  nghiên  cứu,  90‐95%  các  bệnh  nhân <br /> nặng (5% yếu tố đông <br /> được công bố(9). <br /> máu), bệnh nhân thường không được phát hiện <br /> Nguy  cơ  trẻ  mắc  bệnh  Hemophilia  A  bẩm <br /> bệnh sớm. Triệu chứng lâm sàng của bệnh khác <br /> sinh phụ thuộc vào tình trạng của mẹ. Nếu mẹ <br /> nhau ở các bệnh nhân với thể bệnh khác  nhau. <br /> là người lành mang gen bệnh, 50% con trai sẽ có <br /> Thể bệnh càng nặng thì triệu chứng xuất huyết <br /> nguy  cơ  mang  gen  F8  đột  biến  của  mẹ  và  biểu <br /> xảy  ra  càng  sớm.  Triệu  chứng  lâm  sàng  thông <br /> hiện bệnh. 50% con gái thừa hưởng gen đột biến <br /> thường là hiện tượng chảy máu kéo dài hay gặp <br /> của mẹ  trở  thành  người  lành  mang  bệnh.  Bệnh <br /> nhất ở các khớp cổ tay, cổ chân, chảy máu dưới <br /> nhân  nam  di  truyền  gen  bệnh  cho  toàn  bộ  con <br /> da, chảy máu cơ, chảy máu nội tạng, chảy máu <br /> gái của mình. Khoảng 1/3 các trường hợp là do <br /> <br /> 20<br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 <br /> đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao <br /> tử ở  bố  hoặc mẹ. Chẩn đoán chính xác  và  điều <br /> trị  sớm  căn  bệnh  này  có  ý  nghĩa  quan  trọng <br /> nhằm hạn chế tối đa tình trạng chảy máu cũng <br /> như giảm thiểu nguy cơ tàn tật cho bệnh nhân. <br /> Tiến bộ của các kỹ thuật sinh học phân tử ngày <br /> nay cho phép phân tích DNA để  phát hiện đột <br /> biến gen gây bệnh, phát hiện người lành  mang <br /> bệnh  và  ứng  dụng  trong  chẩn  đoán  trước  sinh <br /> và tư vấn di truyền.  <br /> Ở Việt Nam, cho đến nay đã có nhiều công <br /> trình  nghiên  cứu  về  bệnh  Hemophilia  A,  chủ <br /> yếu là các nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng, cận <br /> lâm  sàng,  đánh  giá  tỷ  lệ  mắc  bệnh  hay  các <br /> nghiên cứu đánh giá hiệu quả điều trị bệnh bằng <br /> các chế phẩm thay thế… Gần đây, một số tác giả <br /> đã  định  hướng  phân  tích  gen  FVIII  nhưng  các <br /> nghiên cứu mới chỉ là bước đầu. Tại Thành phố <br /> Hồ  Chí  Minh,  các  bệnh  viện  có  chuyên  khoa <br /> Huyết  học  chưa  chẩn  đoán  được  đột  biến  gen <br /> FVIII cũng như tiến hành chẩn đoán trước sinh <br /> bệnh  hemophilia  A,  gây  hạn  chế  trong  điều  trị <br /> và tư vấn di truyền cho bệnh nhân và gia đình <br /> và không kiểm soát được sự lan truyền gen bệnh <br /> trong  cộng  đồng.  Xuất  phát  từ  thực  tiễn  đó, <br /> chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình <br /> giải  trình  tự  chẩn  đoán  đột  biến  điểm  của  gen <br /> yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A”. <br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU <br /> Đối tượng nghiên cứu <br /> Hai  mẫu  máu  ngoại  vi  của  hai  bệnh  nhân <br /> nam  đã  được  chẩn  đoán  lâm  sàng  mắc  bệnh <br /> Hemophilia A.  <br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu <br /> Thiết kế nghiên cứu <br /> Sử dụng phần mềm chuyên dụng thiết kế 33 <br /> cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại toàn bộ 26 exon, <br /> các vùng lân cận vị trí nối intron của gen yếu tố <br /> 8.  Các  cặp  mồi  được  thiết  kế  không  có  hiện <br /> tượng SNP (single nucleotide polymorphism) và <br /> có nhiệt độ gắn mồi xấp xỉ nhau. <br /> Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi  <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Tiến hành lấy 2 ml máu tĩnh mạch của bệnh <br /> nhân.  Máu  tươi  được  chống  đông  bằng  EDTA, <br /> được  tách  chiết  DNA  trong  vòng  24  giờ.  Quy <br /> trình  tách  chiết  DNA  từ  200μl  máu  ngoại  vi <br /> được tiến hành theo QiAgen Kit. Đo nồng độ và <br /> độ tinh sạch của DNA, những mẫu có giá trị tỷ <br /> lệ về mật độ quang đo ở bước sóng 260/280 đạt ≥ <br /> 1,8 mới được  sử  dụng  làm  khuôn  để  tiến  hành <br /> phản ứng PCR và giải trình tự gen. <br /> <br /> Kỹ thuật giải trình tự gen <br /> Tiến  hành  các  phản  ứng  PCR  khuếch  đại <br /> toàn bộ 26 exon và các vị trí nối intron‐ exon của <br /> gen  F8.  Thành  phần  của  phản  ứng  PCR  gồm <br /> 50μl  chứa  các  thành  phần:  200‐300  ng  khuôn <br /> mẫu  DNA’  0.2  mmol.l  dNTP;  20  mmol/l  Tris‐<br /> HCl  (pH  8.4);  125  ng  mỗi  mồi  và  2  đơn  vị  Taq <br /> polymerase.  <br /> Tinh  sạch  sản  phẩm  PCR  và  giải  trình  tự <br /> từng  đoạn  gen  được  khuếch  đại  bằng  cả  mồi <br /> xuôi và mồi ngược. <br /> <br /> Phân tích kết quả giải trình tự <br /> Xác  định  đột  biến,  kiểm  tra  khả  năng  gây <br /> bệnh  của  các  đột  biến  bằng  những  phần  mềm <br /> chuyên dụng. <br /> Hình 1 là kết quả giải trình tự exon 14 bằng <br /> mồi xuôi của bệnh nhân 01 cho thấy gen F8 của <br /> bệnh  nhân  này  bị  đột  biến  mất  4  nucleotid <br /> TAGA, tại vị trí c.4121‐4124del, đột biến gây lệch <br /> khung dịch mã (frameshift) và làm thay đổi cấu <br /> trúc  protein  F8:  pIle1374thrfs*49.  Kết  quả  giải <br /> trình tự exon 14 bằng mồi ngược khẳng định lại <br /> đột biến này. Đột biến này đã được Lin công bố <br /> lần  đầu  tiên  vào  năm  1993  trên  tạp  chí <br /> Genomics(10). <br /> Kết quả giải trình tự  gen F8 của bệnh nhân <br /> 02 cho thấy bệnh nhân mang đột biến thay thế T <br /> bằng  A  tại  codon  732  trên  exon  14  (Hình  2). <br /> Codon  bình  thường  trên  Genbank  là  TAT  mã <br /> hóa  cho  acid  amin  Tyrosine  bị  đột  biến  thành <br /> trình tự TAA, đột biến thay nucleotit này đã tạo <br /> thành stop codon, làm kết thúc quá trình phiên <br /> mã ngay tại vị trí đột biến.  <br /> <br /> 21<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013<br /> <br /> KẾT QUẢ <br /> Bệnh nhân 01 <br /> <br /> Hình 1: Kết quả giải trình tự exon 14 của bệnh nhân 01. <br /> <br /> Bệnh nhân 02 <br /> <br /> Hình 2: Kết quả giải trình tự gen F8 của bệnh nhân HA 02. <br /> (1958  bp).  Trong  một  nghiên  cứu  thống  kê  dữ <br /> BÀN LUẬN <br /> liệu đột biến 845 gia đình có người nhà là bệnh <br /> Hemophilia  A  là  bệnh  chảy  máu  do  thiếu <br /> nhân  hemophilia  A,  Oldenburg  và  cộng  sự  đã <br /> yếu  tố  đông  máu  VIII.  Bệnh  có  tính  chất  di <br /> chỉ  ra  rằng  các  dạng  đột  biến  điểm  (thay  thế <br /> truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X. <br /> nucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) <br /> Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII (FVIII) là một <br /> chiếm tỉ lệ cao nhất (47,5%) tiếp đến là dạng đột <br /> trong  những  gen  lớn  với  26  exon  trong  đó  2 <br /> biến  đảo  đoạn  bao  gồm  đảo  đoạn  intron  1và <br /> exon  lớn  nhất  là  exon  14  (3106  bp)  và  exon  26 <br /> <br /> 22<br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 <br /> intron  22  (36,7%),  còn  lại  là  đột  biến  xóa  đoạn <br /> gen chiếm khoảng 10‐15%(12). Tùy thuộc vào kiểu <br /> và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thể <br /> bệnh nặng nhẹ khác nhau. Việc xác định các đột <br /> biến gây bệnh Hemophilia không dễ dàng vì các <br /> đột biến phần lớn là đột biến điểm nằm rải rác <br /> trên suốt chiều dài của gen F8. Do đó, trong các <br /> kỹ thuật xác định đột biến gen F8, phương pháp <br /> giải trình  tự  gen  thường  được  sử  dụng  hơn  cả. <br /> Trong  nghiên  cứu  này,  chúng  tôi  đã  sử  dụng <br /> phương  pháp  giải  trình  tự  trực  tiếp  sản  phẩm <br /> PCR 26 exon của gen F8 trên hai bệnh nhân mắc <br /> bệnh Hemophilia A.  <br /> Ở  bệnh  nhân  thứ  nhất,  chúng  tôi  xác  định <br /> được  đột  biến  mất  4  nucleotid  tại  codon  1355 <br /> trên exon 14 của bệnh nhân này. Mất nucleotide <br /> hay mất đoạn trên vùng mã hóa của gen thường <br /> gây đột biến dịch khung và một nửa các đột biến <br /> này thường xảy ra trên exon lớn là exon 14. Hầu <br /> hết  các  đột  biến  mất  nucleotid  trên  gen  F8 <br /> thường  làm  giảm  nồng  độ  và  hoạt  tính  của <br /> protein FVIII và do đó, gây ra bệnh Hemophilia <br /> A(6).  Bệnh  nhân  01  mang  đột  biến  này  có  biểu <br /> hiện  bệnh  thể  nặng  trên  lâm  sàng  với  nồng  độ <br /> protein  FVIII  dưới  1%.  Trong  5  trường  hợp <br /> mang đột biến này đã được công bố  trên cơ sở <br /> dữ  liệu  quốc  tế,  4  trường  hợp  đều  biểu  hiện <br /> bệnh ở thể nặng, chỉ có 1 trường hợp biểu hiện ở <br /> thể trung bình với nồng độ  protein FVIII là 2% <br /> công  bố  vào  năm  2010  bởi  Abdul‐Ghafar  và <br /> cộng sự(1). <br /> Kết  quả  giải  trình  tự  gen  FVIII  của  bệnh <br /> nhân 02 cho thấy có xuất hiện đột biến thay thế <br /> nucleotide  T  bằng  A  tại  vị  trí  codon  732  trên <br /> exon  14.  Đột  biến  này  làm  thay  đổi  trình  tự <br /> codon  TAT  mã  hóa  cho  acid  amin  Tyrosine <br /> thành TAA, tạo ra stop codon ngay tại vị trí này. <br /> Sự  thay  đổi  này  làm  cho  protein  FVIII  không <br /> được  tổng  hợp  hoàn  chỉnh  mà  chỉ  tổng  hợp <br /> được 732 acid amin.  <br /> Protein  yếu  tố  VIII  chứa  2332  acid  amin <br /> sắp  xếp  thành  6  vùng  là  A1‐A2‐B‐A3‐C1‐C2(7) <br /> (Hình 3). <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Hình 3: Trình tự mã hóa các vùng của protein FVIII <br /> trên gen. <br /> Protein  yếu  tố  VIII  lưu  thông  trong  máu <br /> gồm  hai  chuỗi  polypeptide:  một  chuỗi  nhẹ  với <br /> trọng  lượng  phân  tử  80.000  Da  và  một  chuỗi <br /> nặng  có  trọng  lượng  phân  tử  là  200.000  Da. <br /> Chuỗi nặng bao gồm tiểu phần A1 (từ codon 1‐<br /> 336), vùng mang tính acid a1 (từ codon 337‐372), <br /> vùng A2 (từ codon 373‐710) và vùng mang tính <br /> acid  a2  (từ  codon  711‐740).  Vùng  A3  (từ  codon <br /> 1690‐2019), vùng C1 (codon 2020‐2172) và vùng <br /> C2  (codon  2173‐2332)  tạo  nên  chuỗi  nhẹ.  Vùng <br /> C2 là vị trí liên kết màng tế bào của protein yếu <br /> tố FVIII và cũng là vị trí tương tác với yếu tố von <br /> Willebrand(13).  <br /> Ở  bệnh  nhân  02,  codon  đột  biến  732  thuộc <br /> vùng a2 cấu thành nên chuỗi nặng. Đột biến này <br /> làm cho quá trình tổng hợp  protein  yếu  tố  VIII <br /> dừng ngay tại codon 732, do đó, protein yếu tố <br /> VIII  của  bệnh  nhân  02  hoàn  toàn  không  có <br /> những  vùng  còn  lại.  Đột  biến  này  khiến  cho <br /> protein  không  hoàn  chỉnh  và  không  thể  thực <br /> hiện chức năng trong quá trình đông máu. Điều <br /> này  khiến  cho  bệnh  nhân  biểu  hiện  bệnh <br /> Hemophilia A ở thể nặng. <br /> Hiện  nay,  trên  cơ  sở  dữ  liệu  thế  giới  về <br /> Hemophilia  A  và  các  đột  biến  trên  gen  FVIII <br /> (F8  Hemophilia  A  Mutation,  Structure,  Test <br /> and  Resource  Site  –  HAMSTeRS  ‐  database), <br /> chưa  có  công  bố  nào  về  đột  biến  vô  nghĩa  tại <br /> codon  732.  Bằng  phương  pháp  giải  trình  tự <br /> trực  tiếp  gen  F8,  chúng  tôi  đã  ghi  nhận  được <br /> đột biến này lần đầu tiên.  <br /> Trong  những  nghiên  cứu  tiếp  theo,  chúng <br /> tôi sẽ tiếp tục phân tích  gen  F8  cho  mẹ,  chị  em <br /> gái của bệnh nhân 01 và 02, đặc biệt tại các vị trí <br /> phát hiện đột biến trên exon 14 nhằm phân tích <br /> di truyền cho gia đình có gen bệnh và đưa ra các <br /> <br /> 23<br /> <br />