intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 6 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng

Chia sẻ: Bạch Khinh Dạ Lưu | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:20

Thêm vào BST
Báo xấu
22
lượt xem 1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 6 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng cung cấp đến học viên các kiến thức về Sử dụng chỉ thị phân tử trong xây dựng bản đồ di truyền và QTLs; bản đồ di truyền; sử dụng chỉ thị phân tử trong xây dựng bản đồ QTL;... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 6 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng

  1. 07/08/2017 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Nội dung Chương 6. Sử dụng chỉ thị phân tử trong 1. Khái niệm chung xây dựng bản đồ di truyền và QTLs 2. Bản đồ di truyền 3. Sử dụng chỉ thị phân tử trong xây dựng bản đồ QTL Vũ Thị Thúy Hằng Chromosome bands 1. KHÁI NIỆM CHUNG Bản đồ NST Gen Bản đồ gen Cho biết vị trí và khoảng cách của các gen hay các trình tự trên chromosomes 1 Bản đồ di truyền Chỉ thị phân tử Bản đồ tế bào/Bản đồ vật lý Vị trí các gen hoặc đoạn DNA với khoảng cách vật lý 2 Bản đồ vật lý Bản đồ di truyền Vị trí các gen hoặc chỉ thị phân tử dựa trên tần số trao đổi gen Các đoạn trình tự gối nhau 3 Trình tự DNA 1 Cắt DNA thành những đoạn nhỏ có đoạn trình tự gối Bản đồ vật lý nhau để giải trình tự gen • Bản đồ vật lý cho biết khoảng cách giữa các đoạn gen/ chỉ thị phân tử, thường đo bằng số cặp nuleotit 2 Nhân dòng các đoạn cắt dọc theo DNA • Bản đồ vật lý được thiết lập nhờ cắt DNA thành nhiều đoạn nhỏ và các đoạn đó được sắp xếp theo 3 Đọc trình tự các đoạn cắt trật tự dựa trên xác định các đoạn có trình tự gối nhau (bằng phần mềm) 4 Sắp xếp các trình tự dựa vào các đoạn gối nhau bằng phần mềm https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 1
  2. 07/08/2017 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Bản đồ di truyền Bản đồ di truyền vs. bản đồ vật lý • Bản đồ di truyền là sơ đồ sắp xếp vị trí tương đối của các gen, đoạn • Khoảng cách trên bản đồ di truyền dựa trên tần số hoán vị DNA/ chỉ thị phân tử trên từng NST theo đường thẳng, mỗi gen; trong khi khoảng cách trên bản đồ vật lý tính bằng só cặp gen/đoạn DNA chiếm một vị trí nhất định và khoảng cách được xác nuletotit; định dựa vào tần số trao đổi chéo với đơn vị là centiMorgan, cM. • Biết được trình tự DNA sẽ biết được trình tự, khoảng cách gen • Tần số trao đổi chéo giữa các gen càng thấp thì khoảng cách giữa – bản đồ vật lý. các gen càng gần, tần số trao đổi chéo giữa các gen càng cao thì khoảng cách giữa các gen càng xa nhau. • Nhìn chung: 1 cM ~ 1 MB of DNA. • Đơn vị đo khoảng cách gen được tính bằng tần số hoán vị gen • Ở vùng chromosome có tần số hoán vị gen lớn, chiều dài bản đồ vật lý có thể bị dự đoán quá dài • Ngược lại, ở vùng ít có sự trao đổi chéo gen, chiều dài bản đồ vật lý có thể bị dự đoán quá ngắn Bản đồ di truyền và vật lý có thể khác nhau ở khoảng cách tương đối, ngay cả về vị trí của gen trên chromosome 2. BẢN ĐỒ DI TRUYỀN 1. Bản đồ vật lý 2. Bản đồ di truyền dựa cho biết vị trí trên tần số hoán vị và có • Bản đồ di truyền là sơ đồ sắp xếp vị trí tương đối của các gen, thực của một độ chính xác thấp hơn đoạn DNA/ chỉ thị phân tử trên từng NST theo đường thẳng, gen. mỗi gen/đoạn DNA chiếm một vị trí nhất định và khoảng cách được xác định dựa vào tần số hoán vị gen với đơn vị là centiMorgan, cM. • Thường sử dụng các chỉ thị phân tử để thiết lập bản đồ di truyền • Các tên gọi: bản đồ di truyền, bản đồ liên kết gen, bản đồ locut tính trạng số lượng (bản đồ QTL) Bản đồ vật lý Bản đồ di truyền - Một bản đồ di truyền cho biết vị trí của các chỉ thị phân tử (vd SSR, SNPs, RFLPs) trong một nhóm liên kết gen. Một nhóm liên kết gen = một bản đồ di truyền. - Thiết lập/vẽ bản đồ di truyền có nghĩa là sử dụng các chỉ thị phân tử, xác định khoảng • Khoảng cách tương đối trên bản đồ di truyền giữa các gen/chỉ cách giữa chúng. Khi thiết lập bản đồ di truyền, có thể thu được chỉ một nhóm liên kết gen hoặc toàn bộ các nhóm liên kết gen cho loài. Thường thì số nhóm liên kết gen = số NST thị phân tử được tính bằng tần số hoán vị gen của loài • 1 đơn vị trên bản đồ gen = 1 cM = 1% hoán vị gen. 2 chỉ thị - Thông thường: phân tử có khoảng cách 1 cM, tức là số lần trung bình xảy ra + Khi đề cập đến xây dựng bản đồ liên kết gen cũng có nghĩa là xác định một gen chính trao đổi chéo giữa hai chỉ thị phân tử là 0.01 của một tính trạng trên bản đồ/hay nhóm liên kết gen • Gen/chỉ thị với tần số hoán vị gen < 50% thuộc cùng một + Khi đề cập đến xây dựng bản đồ các locut tính trạng số lượng, nghĩa là xác định các nhóm liên kết gen locut cho tính trạng số lượng trên một hoặc một vài nhóm liên kết gen • Hai gen/chỉ thị phân ly độc lập có tần số tái tổ hợp 50% sẽ M1 nằm trên NST không tương đồng hoặc nằm rất xa nhau trên M1 M1 0.1cM 0.2cM M2 0.1cM 0.2cM M2 0.1cM 0.2cM M2 cùng một NST (không liên kết) M3 M3 M3 0.1cM 0.25cM 0.25cM T1 (flower color) 0.15cM M4 M4 M4 0.1cM 0.1cM 0.1cM M6 M5 M6 Nhóm liên kết gen Bản đồ locut tính trạng số lượng Bản đồ liên kết gen (Bản đồ QTL) https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 2
  3. 07/08/2017 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Bản đồ di truyền dùng để làm gì? Nguyên lý • Cho thông tin về liên kết giữa gen/đoạn DNA/chỉ thị phân tử Tính tần số hoán vị gen với tính trạng quan tâm; • Xác định vị trí gen/đoạn DNA để nhân dòng • Tần số hoán vị gen là tỷ lệ % số cá thể tái tổ hợp trên tổng số các thể đời con • Trong quá trình xây dựng bản đồ di truyền, những chỉ thị phân tử đồng phân ly với tính trạng đánh giá trong quần thể phân ly Số cá thể tái tổ hợp x 100 có thể được sử dụng làm chỉ thị trong chọn tạo giống; Tần số hoán vị gen = Tổng số cá thể đời con • Dùng trong các nghiên cứu so sánh bản đồ di truyền giữa các loài, giúp cho việc tìm hiểu quá trình tiến hóa và đa dạng hóa của loài; • Cung cấp khung sườn để xây dựng bản đồ vật lý Khoảng cách giữa 2 gen Tần số hoán vị gen Với dòng thuần, Lai P1(AA BB) và P2 (aa bb) Bộ NST ở F1 gồm AB và ab Lai F1 (AB ab) với cây thử (ab ab) để kiểm tra hoán vị gen Giả sử thu được …… AB ab 583
  4. 07/08/2017 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Xây dựng bản đồ gen Các bước xây dựng bản đồ gen sử dụng chỉ thị phân tử Con cái của quần thể lai lại (F1 x bố mẹ lai lại): dùng 3 Bố mẹ lại lại Bố mẹ cho • Tạo quần thể phân ly chỉ thị 3 SSR + và 1 tính trạng đánh giá F1 • Sử dụng các chỉ thị phân tử để đánh giá kiểu gen của quần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 thể phân ly • Phân tích liên kết gen giữa các chỉ thị phân tử để xác định A khoảng cách giữa các chỉ thị - sử dụng phần mềm C • Vẽ bản đồ gen – sử dụng phần mềm D Số tái tổ hợp: A 4/20 D C AC = 6/20 (1, 3, 10, 13, 18, 19) AD = 4/20 (1, 3, 10, 13) 2/20 CD = 2/20 6/20 C = 1/20 (18) D = 1/20 (19) 20 3. Sử dụng chỉ thị phân tử trong phân tích locut tính trạng số lượng (QTL) Locut tính trạng số lượng là gì?  Một gen/đoạn DNA hoặc một vùng chromosome ảnh - Khái niệm hưởng đến tính trạng số lượng - Nguyên lý  Gen/vùng đó phải đa hình: tức là có sự biến động - Phương pháp phân tích: phân tích từng chỉ thị dẫn đến những ảnh hưởng tới cá thể trong quần thể và phân tích khoảng  Phải liên kết với một chỉ thị đa hình (chỉ thị đa hình là chỉ thị cho thấy mức độ biện động của quần thể) Thiết kế /xác định một chỉ thị phân tử cho tính trạng Thiết kế/xác định chỉ thị phân tử (tiếp) • Một chỉ thị tốt nhất là trình tự DNA tác động đến kiểu hình (hay gen) • Lai các cá thể khác nhau/đối lập nhau về tính trạng cần xác định chỉ thị phân tử • Nếu một gen đã biết có liên quan đến tính trạng và được phân lập, có thể so sánh trình tự gen đó với các dạng dại hoặc • Nhân thế hệ, tự thụ hoặc giao phấn thu thế hệ con dạng đột biến DNA • Thu thập số liệu cho tính trạng đó ở thế hệ F2 • Thiết kết mồi đặc hiệu cho đoạn gen đó • Chọn 5 - 10 cá thể ở F2 có biểu hiện các dạng tính trạng đó • Trường hợp không biết gen, sàng lọc trong các quần thể đối lập nhau https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 4
  5. 07/08/2017 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam • Tách DNA từ cá thể chọn F2 Xây dựng bản đồ QTL • Hỗn hợp lượng bằng nhau DNA từ các cá thể đó thành 2 phần: • Là xác định vị trí của một locut gây những biến động trong mỗi phần cho một dạng tính trạng genome dẫn đến biến động với tính trạng số lượng • Sàng lọc hỗn hợp DNA bằng loại chỉ thị cần sử dụng • Ước tính ảnh hưởng của alen đó lên sự biến động của tính • Phân tích liên kết gen để xác định chỉ thị liên kết với tính trạng và kiểu di truyền. trạng/chỉ thị liên quan đến locut liên xác định tính trạng đó – chỉ thị QTL Bản đồ QTL để làm gì ? Ngoài ra, còn có thể sử dụng các quần thể khác để xác định chỉ thị QTLs nhưng chi phí đắt và lâu hơn như các dòng NILs (Near • Cho biết ảnh hưởng và tương tác của từng gen riêng rẽ Isogenic Lines), RILs (Recombinant Inbreeds), các thế hệ nhân • Xác định vị trí của gen để nhân dòng theo phương pháp một hạt • Dự đoán giá trị chọn giống và phương pháp chọn lọc phù hợp nhờ chỉ thị phân tử Nguyên lý của xây dựng bản đồ QTLs Nguyên lý (tiếp) • Dựa trên đồng phân ly của locut QTL với chỉ thị phân tử • Dựa trên đồng phân ly của kiểu hình và kiểu gen trong quần trong quần thể phân ly thể phân ly – Chỉ thị di truyền cung cấp thông tin về kiểu gen Q M Cặp NST – Mối quan hệ giữa kiểu hình và kiểu gen sẽ cho biết vị trí và q m ảnh hưởng của QTL • Cần thiết lập quần thể để xây dựng bản đồ QTL QTL alen không Alen có chỉ thị phân tử quan sát được quan sát được Tái tổ hợp Đồng phân ly (liên kết gen) A1 Q1 Kiểu gen bố mẹ A1 Q1 A1A2 A3A4 A2 Q2 Giao tử (Không trao đổi chéo) A2 Q2 A1A3 A2A4 A2A3 “Phân tích liên kết gen = đếm các tái tổ hợp A1 Q2 Chỉ thị phân tử alen Giao tử ít khi xảy ra A1 đồng phân ly (Trao đổi chéo) kháng bệnh (trội) A1A2 A1A4 A3A4 A3A2 A2 Q1 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 5
  6. 07/08/2017 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoảng cách trên bản đồ di truyền Tương quan giữa tái tổ hợp và khoảng cách di truyền Khoảng cách giữa hai locut (Morgans) = Tần số trao đổi gen 1 -HALDANE FUNCTION X= 0.5log(1-2y) Haldane (1919) Tuy nhiên, khoảng cách có thể cộng, nhưng tần số không 2. KOSAMBI FUNCTION Map Function 1 Morgan = 100 cM; 1 cM ~ 1 Mb X= 0.25 log(1+2y) (1-2y) Sử dụng hàm số Haldane hoặc Kosambi để tính khoảng x = khoảng cách di truyền cách trên bản đồ di truyền từ tần số tái tổ hợp y= tần số trao đổi chéo • VD: Khoảng cách di truyền khi tần số trao đổi chéo 2% là bao nhiêu? y = 2% = .02 M x = -1/2ln(1-2 x 0.02) = -1/2ln(0.96) = 0.02041 = 2.041 cM. Khi y dùng 0 – 1/2 thì x có đơn vị Morgan (M) Khi y dùng 0 – 50% thì x có đơn vị cM Các bước xây dựng bản đồ QTL Bước 6: Phát hiện QTL Tất cả các thí nghiệm xây dựng bản đồ di truyền, bản đồ QTL đều có chung các bước: Gồm: 1. Chọn bố mẹ khác nhau về tính trạng - xác định vị trí của QTL thông qua sự liên kết giữa QTL và 2. Đánh giá 2 bố mẹ để tìm các chỉ thị đa hình chỉ thị liên kết; 3. Thiết lập các dòng tái tổ hợp (dòng từ F2 …) - Xác định mức độ ảnh hưởng của QTLs lên sự biểu hiện 4. Đánh giá kiểu hình trên đồng ruộng của tính trạng đó; từ đó xem QTL đó có ảnh hưởng chính, hay phụ đến tính trạng số lượng 5. Đánh giá kiểu gen của các dòng tái tổ hợp - Có nhiều phương pháp hay thuật toán khác nhau để 6. Phát hiện QTL: So sánh, phân tích giá trị kiểu hình và phát hiện QTLs: phân tích từng chỉ thị (single marker tìm mối tương quan giữa kiểu gen với kiểu hình analysis), Interval mapping (phân tích khoảng), CIM https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 6
  7. 07/08/2017 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Bước 6: Phương pháp phân tích để phát hiện QTL: Phương pháp phân tích để phát hiện QTL: Phân tích với từng Cách 1: Phân tích với từng chỉ thị phân tử chỉ thị phân tử (tiếp) Chỉ thị DNA thể dùng để xây dựng bản đồ di truyền: A M Nguyên lý: - Kiểm tra sự khác nhau ở giá trị trung bình của kiểu hình QTL Chỉ thị DNA giữa các nhóm cá thể có/ hay không có chỉ thị phân tử. a m Nếu giá trị trung bình kiểu hình khác nhau ở mức có ý nghĩa (qua phân tích ANOVA) thì chỉ thị phân tử đó liên kết với một QTL • Chỉ thị gần QTL nào sẽ cùng phân ly với QTL đó - Từ đó, xác định một cách tương đối vị trí và mức độ ảnh • Chỉ thị liên kết chặt với QTL được phát hiện nhờ tính toán hưởng của QTLs phân tích AOVA • Hầu hết các giao tử F1 là AM hay am, nếu có trao đổi chéo giữa chỉ thị và QTLs, thì sẽ thu được giao tử Am & aM Ưu và nhược điểm của cách 1 Bước 6: Phương pháp phân tích để phát hiện QTL: Ưu điểm: Nhanh, đơn giản, không cần bản đồ di truyền Cách 2: Phương pháp khoảng Nhược điểm: Các chỉ thị phân tử dùng để xây dựng bản đồ di truyền:  Không cho vị trí QTL chính xác vì không tính đến tái tổ hợp giữa chỉ thị và QTL, không tính đến tương tác giữa các locut M1 A M2  Không cho kết quả nếu vị trí của chỉ thị phân tử và QTL ở quá xa nhau QTL  Số lượng các dòng tái tổ hợp dùng để đánh giá lớn m1 a m2  Không phân biệt được giữa khoảng cách và mức độ ảnh hưởng của QTL: chỉ thị gần với QTL có ảnh hưởng nhỏ lên tính trạng cũng giống như chỉ thị ở xa QTL nhưng có ảnh • Chỉ thị gần QTL nào thì sẽ phân ly cùng với QTL đó hưởng lớn lên tính trạng • Chỉ thị liên kết chặt với QTL được phân tích nhờ ANOVA Phân tích QTLs: Phương pháp khoảng Ưu và nhược điểm của phương pháp phân tích khoảng Ưu điểm: Nguyên lý: • Dự đoán chính xác hơn vị trí của QTL • Phương pháp khoảng (Interval mapping method) dùng thông tin dựa trên giá trị của chỉ thị phân tử ở cả 2 đầu • Phân tích được khoảng cách và ảnh hưởng của QTL của QTLs để xác định vị trí QTL • Xác suất một QTL ở một vài vị trí giữa các chỉ thị được Nhược điểm: tính toán - Phương pháp phân tích khoảng không tính đến ảnh hưởng • QTL được xác nhận khi xác suất xảy ra cao nhất của các QTL khác, do đó, vị trí và mức độ ảnh hưởng của Xác định vị trí của QTL ở giữa 02 chỉ thị phân tử; QTL chính có thể không chính xác - Cần có phần mềm https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 7
  8. Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 1. Chọn lọc dựa vào chỉ thị Khái niệm: SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Chọn lọc dựa vào chỉ thị (Marker asisted TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG selection - MAS) là sử dụng chỉ thị ADN liên kết chặt với các locut mục tiêu thay thế hoặc hỗ trợ chọn lọc dựa vào kiểu hình Dựa trên giả thuyết: Các chỉ thị phân tử có thể dự đoán kiểu hình ở mức độ tin cậy  Tại sao phải sử dụng chỉ chị phân tử? Tại sao? Kiểu hình không cho thông tin một cách chính xác về kiểu gen: Nhiều tính trạng không thể quan sát được trước khi tiến hành Chỉ thị phân tử DNA = phản ánh trực tiếp kiểu gen chọn lọc  Hai cây có thể có kiểu hình giống nhau, nhưng rất Kiểu hình là kết quả biểu hiện của kiểu gen, tuy nhiên kiểu hình khác nhau về kiểu gen cũng chịu tác động lớn của môi trường Kiểu hình không hiệu quả khi xem xét đến những liên kết với gen không mong muốn Kiểu gen A Kiểu gen B Kiểu gen Môi trường Ghi nhớ: • Các yếu tố di truyền Nhà chọn giống dựa trên kiểu • Mức độ ảnh hưởng tương đối của mỗi hình; chỉ thị phân tử cho thông tin yếu tố di truyền lên kiểu hình về kiểu gen • Tương tác giữa các yếu tố di truyền (ức chế, trội lặn, liên kết gen) cùng kiểu hình Kiểu hình Tại sao Hoặc  2 cây có kiểu hình rất khác nhau nhưng lại giống • Chỉ thị phân tử cho phép nhà chọn giống đưa vào nhau về kiểu gen giống cây trồng chỉ một hoặc một vài gen mong muốn; VD. Kiểu gen đột biến ở táo (Malus domestica). Kiểu đốt • Trong khi phương pháp truyền thống chuyển toàn bộ ngắn ở giống táo cv. Telamon do đột biến ở một locut genome (kèm theo gen mong muốn và gen không mong muốn) • Tích lũy các alen lặn trong phương pháp lai lại truyền Kiểu dại Đột biến thống yêu cầu thời gian dài để thu được đồng hợp tử vì cần phải tự thụ ở mỗi lần lai lại Các đốt ngắn • Một số tính trạng phức tạp như kháng bệnh và chống Giảm chiều cao cây, chịu điều kiện bất thuận (QTLs) khó được phát hiện nhiều cành qua phương pháp chọn giống truyền thống, do ảnh hưởng của môi trường Kiểu hình khác nhau https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 1
  9. Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Phương pháp chọn giống truyền thống vs. Công nghệ sin học Chỉ thị phân tử sử dụng như thế nào? Chọn giống truyền thống kết hợp nhiều gen một lúc Chỉ thị phân tử đánh giá và cho thông tin kiểu gen một Nhiều gen được chuyển do Gen mong muốn tái tổ hợp cách trực tiếp X Giống thương Phân tích ảnh hưởng của kiểu gen lên kiểu hình mại Giống Thể cho mới Công nghệ sinh học thực vật Cung cấp cho nhà chọn giống công cụ để hiểu rõ các yếu Ứng dụng CNSH, một gen được chuyển. tố di truyền, tương tác giữa các yếu tố di truyền và mức độ ảnh hưởng lên sự biểu hiện kiểu hình Gen mong muốn Gen mong muốn Lúa Một gen được chuyển + Thể cho B-carotene Giống TM Improved Commercial 8 Lúa vàng Plant Variety Ưu điểm của MAS Lợi ích từ MAS  Phương pháp đơn giản hơn so với sàng lọc kiểu hình  Chọn lọc các kiểu gen đặc • Đặc biệt đối với các tính trạng sàng lọc tốn công lao động thù chính xác và hiệu quả hơn • Tiết kiệm thời gian và nguồn lực  Có thể đẩy nhanh quá  Chọn lọc ở giai đoạn cây con trình tạo giống • Quan trọng đối với các tính trạng như chất lượng sản  Sử dụng nguồn lực hiệu phẩm là hạt quả hơn; đặc biệt thí • Có thể chọn lọc trước khi trồng (lúa trước khi cấy) nghiệm đồng ruộng  Tăng độ tin cậy • Không bị ảnh hưởng ngoại cảnh • Phân biệt được các thể đồng hợp tử với các thể dị hợp tử và chọn lọc từng cây riêng rẽ Vườn lai lại Điều kiện chọn lọc dựa vào chỉ thị Các chỉ thị phải liên kết chặt với các locut mục tiêu!  Lý tưởng nhất là chỉ thị liên kết chặt với gen/QTL mục  Công nghệ chi phí thấp: cho phép xác định hàng ngàn tiêu, cách
  10. Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 CHỌN GIỐNG TRUYỀN THỐNG CHỌN GIỐNG NHỜ CHỈ THỊ P1 x P2 P1 x P2 Thể nhận Thể cho (tính kháng bệnh) Cảm nhiễm Kháng F1 Quần thể lớn với hàng ngàn cá thể F1 F2 CHỌN LỌC KIỂU HÌNH F2 Quần thể lớn với hàng ngàn cá thể Chọn lọc nhờ chỉ thị (MAS) Chọn lọc kháng mặn Chọn lọc vi khuẩn bạc lá Chọn lọc chống chịu thiếu phốtpho trong đất (1) Lấy mẫu lá Qui trình ‘xác Những lưu ý khi sử dụng chỉ thị ADN trong chọn giống định chỉ thị’  Phương pháp kỹ thuật (đơn giản hay phức tạp) (2) Tách chiết ADN  Độ tin cậy  Độ đa hình (3) PCR  Chất lượng và số lương ADN cần thiết  Chi phí  Nguồn lực sẵn có: thiết bị, máy móc, đội ngũ chuyên (4) Điện di GEL môn kỹ thuật (5) Phân tích chỉ thị Chỉ thị phải đa hình 2. QUY TRÌNH CHỌN GIỐNG DỰA RM84 RM296 VÀO CHỈ THỊ 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 P1 P2 1. Lai lại nhờ chỉ thị P1 P2 2. Tích tụ gen - Pyramiding 3. Chọn lọc sớm 4. ‘Kết hợp” các phương pháp Không đa hình Đa hình! https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 3
  11. Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 2.1. Lai lại nhờ chỉ thị (MAB)  MAB có nhiều ưu điểm so với phương pháp truyền thống: Chọn lọc dựa và chỉ thị có ích khi gen mong muốn khó • Chọn lọc các locut mục tiêu hiệu quả chọn lọc do: • Giảm thiểu liên kết xấu đi kèm 1. Gen lặn • Phục hồi nhanh bố mẹ lai lại 2. Nhiều gen cho tính trạng kháng bệnh 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 3. Tính trạng số lượng: do nhiều gen tham gia vào sự biểu hiện của tính trạng Target locus 4. Tương tác lớn của kiểu gen x môi trường CHỌN LỌC LOCUT CHỌN LỌC TÁI TỔ CHỌN LỌC NỀN MỤC TIÊU HỢP CHỌN LỌC THỂ CHO CHỌN LỌC NỀN DI TRUYỀN – THỂ NHẬN * Chọn lọc gen từ thể cho Để đánh gía sự có mặt của gen khi đánh giá kiểu hình trực tiếp MAB: CHỌN LỌC – từ thể cho không thể thực hiện được hay tốn kém, hoặc chỉ thực hiện được 1 2 3 4 ở giai đoạn muộn.  Chọn lọc gen mục tiêu hay QTL * Chọn lọc thể tái tổ hợp:  Có ích đối với những tính trạng khó Locut đánh giá, các allen lặn mục tiêu Sử dụng chỉ thị hai sườn để chọn các thể tái tổ hợp giữa gen mục tiêu và chỉ thị sườn * Chọn lọc nền di truyền thể nhận Chọn lọc locut - Để xúc tiến sự phục hồi kiểu gen của thể nhận ở các locut khác. mục tiêu - Sử dụng các chỉ thị phân tử để chọn lọc nền trong chương trình lai lại được kiểm chứng và chứng minh rất hiệu quả ‘Liên kết xấu’ • “Liên kết xấu” là khi: Lượng lớn NST của thể cho giữ lại sau Sử dụng chỉ thị giảm thiểu lượng NST của thể cho nhanh hơn nhiều lần lai lại; Không mong muốn vì những gen khác của thể cho ảnh Lai lại truyền thống hưởng xấu các tính trạng nông học GEN MỤC TIÊU c c GEN LIÊN KẾT Ở F1 BC1 BC2 BC3 BC10 BC20 THỂ CHO LOCUT c MỤC TIÊU LOCUT Lai lai dựa vào chỉ thị MỤC TIÊU ThỂ BC1 BC3 BC10 cho/F1 NST bố mẹ lai lại GEN MỤC TIÊU c NST thể cho Ribaut, J.-M. & Hoisington, D. 1998 Marker-assisted selection: new tools and strategies. Trends Plant Sci. 3, 236-239. F1 BC1 BC2 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 4
  12. Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 BC1 Bước 1 – chọn locut mục tiêu MAB: CHỌN LỌC THỂ TÁI TỔ HỢP Bước 2 – chọn thể tái tổ hợp một trong hai phía của locut mục tiêu  Sử dụng chỉ thị hai sườn để 1 2 3 4 chọn các thể tái tổ hợp giữa gen mục tiêu và chỉ thị sườn HOẶC  Giảm thiểu liên kết xấu BC2 Bước 3 – chọn locut mục tiêu lần nữa  Đòi hỏi quần thể lớn CHỌN LỌC THỂ TÁI • phụ thuộc vào khoảng cách của chỉ TỔ HỢP thị sườn với locut mục tiêu) Bước 4 – chọn thể tái tổ hợp một trong hai phía của locut mục tiêu * * Hoặc LAI LẠI TRUYỀN THỐNG LAI LẠI NHỜ CHỈ THỊ MAB: CHỌN LỌC NỀN P1 x P2 P1 x P2  Sử dụng chỉ thị không liên kết để 1 2 3 4 P1 x F1 P1 x F1 đào thải thể cho, chọn lọc cây có chỉ thị của bố mẹ lai lại nhiều nhất và BC1 BC1 lượng genome thể cho nhỏ nhất CHỌN LỌC KIỂU HÌNH CÂY BC1 SỬ DỤNG CHỈ THỊ NỀN ĐỂ CHỌN LỌC CÂY CÓ GẦN GIỐNG BỐ MẸ LAI LẠI CHỈ THỊ CỦA BỐ MẸ LAI LẠI NHIỀU NHẤT VÀ LƯỢNG GENOM THỂ CHO NHỎ NHẤT  Xúc tiến sự phục hồi genom của bố mẹ lai lại (thể nhận) CHỌN LỌC NỀN  Rút ngắn 2, 3 hoặc 4 thế hệ lai lại BC2 BC2 Quá trình kết hợp nhiều gen vào trong 1 kiểu gen, thường từ hai 2.2. Tích tụ gen bố mẹ khác nhau Quy trình chọn giống Kiểu gen  Sử dụng để kết hợp nhiều gen kháng bệnh đối với các chủng đặc thù của một thể gây bệnh P1 x P1 P1: AAbb x P2: aaBB Gen A Gen B  Tích tụ gen cực khó đạt được bằng phương pháp truyền F1 F1: AaBb thống Gen A + B  Lưu ý: đánh giá kiểu hình của một cây đối với nhiều F2 AB Ab aB ab dạng kháng cây con hầu như không thực hiện được F2 AB AABB AABb AaBB AaBb MAS  Có ý nghĩa để tạo ra khả năng kháng “bền vững” với Ab AABb AAbb AaBb Aabb nhiều chủng của thể gây bệnh aB AaBB AaBb aaBB aaBb Chọn cây F2 có Gen A và Gen B ab AaBb Aabb aaBb aabb Hittalmani et al. (2000). Fine mapping and DNA marker-assisted pyramiding of the three major genes for blast resistance in riceTheor. Appl. Genet. 100: 1121-1128 Liu et al. (2000). Molecular marker-facilitated pyramiding of different genes for powdery mildew resistance in wheat. Plant Breeding 119: 21-24. https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 5
  13. Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 P1 x P2 2.3. Chọn lọc MAS sớm Cảm nhiễm Kháng F1  MAS tiến hành ở F2 hoặc F3  Chọn lọc cây có gen mong muốn, các allen được cố F2 Quần thể lớn ( 2000 cây) định ở trạng thái đồng hợp tử; đào thải cây có tổ hợp gen không mong muốn  Tập trung nguồn lực cho ít dòng ở các giai đoạn sau MAS 1 QTL – đào thải 75% kiểu gen không mông muốn MAS 2 QTLs – đào thải 94% kiểu gen không mong muốn Refeences: Ribaut & Betran (1999). Single large-scale marker assisted selection (SLS-MAS). Mol Breeding 5: 21-24. PP PHẢ HỆ (SLS-MAS) P1 x P2 P1 x P2 F1 F1 MAS  Ví dụ: bản đồ F2 Chọn lọc KIỂU HÌNH F2 liên kết từ quần Chỉ gieo trồng thể dòng thuần F3 Trồng thưa để F3 các dòng F3 trên chọn lọc cá thể tái tổ hợp nhỏ đồng ruộng của 20 cá thể F4 Các gia đình F4 Các gia đình gieo thành hàng gieo thành hàng để chọn lọc. để chọn lọc. F5 Chọn phả hệ F5 KN năng suất F6 F6 sơ bộ. Chọn lọc Thí nghiệm F7 F7 năng suất F8 – F12 Khảo nghiệm nhiều điểm, F8 – F12 Khảo nghiệm nhiều điểm, nhân giống và phổ biến nhân giống và phổ biến Ưu điểm: giảm số dòng/cá thể và tập trung Collard et al., (2005) Euphytica 142 p 169 vào số ít dòng/cá thể để đánh giá 2.4 Các phương pháp kết hợp Đánh gía kiểu hình ‘Hướng theo chỉ thị’ (còn gọi là chọn lọc lần lượt’) P1 (S) x P2 (R) Trong một số trường hợp, sự kết hợp sàng lọc kiểu hình và Bố mẹ lai lại Bố mẹ cho MAS rất có ích • Sử dụng khi chỉ thị không chính xác 100% hay sàng lọc F1 (R) x P1 (S) 1. Đạt tối đa tiến bộ di truyền (khi một số QTLs chưa kiểu hình tốn kém hơn so với được xác định từ lập bản đồ QTL) xác định chỉ thị BC1F1 , kiểu hình R & S 2. Mức tái tổ hợp giữa chỉ thị và QTL không phải chính xác 100% Chọn lọc dựa vào chỉ thị (MAS) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 … 3. Giảm được kích thước quần thể đối với những tính trạng mà sử dụng chỉ thị phân tử ít chi phí hơn hay tiết kiệm thời gian dễ hơn so với sàng lọc kiểu hình và giảm chi phí CHỌN LỌC KIỂU HÌNH https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 6
  14. Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 VÍ DỤ: ỨNG DỤNG MAS Ở VIỆN NC LÚA QUỐC TẾ (IRRI) Câu hỏi??? Bất lợi phi sinh vật là trở ngại lớn đối với SX lúa ở ĐN Châu Á Lai lại dựa vào chỉ thị đối với khả năng chịu ngập  Các trở ngại phi sinh vật chủ yếu gồm: • Hạn • Ngập nước • Mặn • Thiếu lân  Ưu tiên cao nhất ở IRRI  Nguồn chống chịu cho tất cả các tính trạng có trong nguồn gen, những QTL chính liên kết chặt với chỉ thị DNA đã được xác định cho một số tính trạng Photo by Abdel Ismail David Mackill, Reycel Mighirang-Rodrigez, Varoy Pamplona, CN Neeraja, Sigrid Heuer, Iftekhar Khandakar, Darlene Sanchez, Endang Septiningsih & Abdel Ismail ‘Các giống Mega’ Chiến lược lai lại  Nhiều giống lúa phổ biến và trồng BR11 Bangladesh  Áp dụng chiến lược lai lại để chuyển các gen/QTLs vào diện tích lớn gọi là “các giống CR1009 India các giống mega Mega” IR64 Toàn châu Á  Sử dụng chỉ thị DNA để lai lại với hiệu quả cao – lai lại • Đặc biệt quen thuộc với nông dựa vào chỉ thị (MAB) KDML105 Thái Lan dân  Các giống truyền thống có khả Mahsuri Ấn Độ năng chịu bất lợi phi sinh vật, nông MTU1010 Ấn Độ dân ngại trồng các giống khác RD6 Thái Lan • các đặc điểm nông học và chất Samba Ấn Độ lượng kém Mahsuri Swarna Ấn Độ, Bangladesh 1-10 triệu hectares https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 7
  15. Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Lai lại truyền thống P1 x P2 Chọn giống chịu ngập úng • NS cao Tính trạng tốt; vd kháng • Mẫn cảm Giống ưu Thể bệnh • Bố mẹ lai lại (RP) việt P x F cho 1 1  DT lúa đồng bằng bị ngập ngắn hạn lớn P1 x BC1 loại bỏ ~50% BC1 (đông Ấn đến ĐN Á; > 10 tr. ha Chọn trực quan BC1 giống RP  Những vùng thuận lợi cũng bị ngập ngắn P1 x BC2 Lặp lại cho đến BC6 hạn trong một số năm P1 x BC3  Phân biệt với các kiểu chịu ngập úng khác P1 x BC4 • Khả năng vươn dài P1 x BC5 • Nảy mầm trong điều kiện yếm khí phục hồi genome của giống lai lại (RP) P1 x BC6 Có thể phải lai lại bổ sung do liên kết xấu BC6F2 Sàng lọc khả năng chịu ngập Một QTL chính trên NST 9 kiểm soát tính chịu ngập úng – Sub1 QTL LOD score 0 10 20 30 40 OPQ1 IR40931-26 PI543851 600 OPN41200 20 OPAB16 850 Sub-1(t) C1232 RZ698 15 OPS14 900 RG553 R1016 50cM RZ206 OPH7 10 950 RZ422 5 100cM C985 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Submergence tolerance score RG570 Phân ly ở quần thể F3 RG451 150cM RZ404 Xu and Mackill (1996) Mol Breed 2: 219 Lai lại Gieo BC1F1 X Swarna IR49830 Thể cho Sub1 Cho hat F1 nảy mầm và gieo F1 X trong khay Swarna BC1F1 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 8
  16. Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Thu mẫu lá - 10 sau khi cấy để phân tích chỉ thị Phân tích kiểu gen để chọn lọc cây BC1F1 mang gen mong muốn để lai lại Chọn lọc Swarna+Sub1 Nhân cây BC2F2 chịu ngập úng Swarna/ Swarna IR49830 F1 376 có Sub1 Cây #242 21 thể TTH BC1F1 Swarna Chọn cây 697 cây mang allen thể cho ít nhất Cây #246 BC2F1 BC2F2 320cây 158 có Sub1 937 plants và #81 5 thể TTH Cây #227 Swarna Cây 237 BC2F2 1 cây mang Sub1 có BC3F1 2 đoạn thể cho 18 cây Khung thời gian để “tăng cường” các giống mega Swarna với Sub1 Mackill et al 2006. QTLs in rice breeding: examples for abiotic stresses. Paper presented Có thể phải tiếp tục đến BC3F2 at the Fifth International Rice Genetics Symposium. Ribaut et al. 2002. Ribaut, J.-M., C. Jiang & D. Hoisington, 2002. Simulation experiments on efficiencies of gene introgression by backcrossing. Crop Sci 42: 557–565. https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 9
  17. Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Kiểu gen của Swarna-Sub1 Swarna 246-237 Tỉ lệ hạt bạc bụng Bạc bụng(0-10%)=84.9 Bạc bụng(0-10%)=93.3 Bạc bụng(10-25%)=9.1 Bạc bụng(10-25%)=2.3 Bạc bụng(25-50%)=3.5 Bạc bụng(25-50%)=3.7 Bạc bụng(>75%)=2.1 Bạc bụng(>75%)=0.8 CD Trung bình =0.2mm Chiều dài TB=0.2mm Chiều rộng TB =2.3mm Chiều rộng TB=2.2mm Dòng BC3F2 Xấp xỉ 2,9 MB của thể cho DNA Amylose content (%)=25 Amylose content (%)=25 Gel temperature=HI/I Gel temperature=I Gel consistency=98 Gel consistency=92 Hiện trạng chọn giống phân tử  Tổng quan tài liệu cho thấy hàng ngàn nghiên cứu lập bản đồ QTL nhưng không có 4. HIỆN TRẠNG CỦA MAS: nhiều báo cáo về áp dụng cho MAS trong chọn giống TRỞ NGẠI VÀ THÁCH THỨC  Tại sao? Chi phí – một cản trở chính Nguyên nhân tác động ít của MAS trong chọn giống  Hiệu quả chi phí chưa được hạch toán nhưng  Thiếu nguồn lực (thiết bị) MAS đắt hơn đối với phần lớn tính trạng  Chỉ thị không có hiệu quả chi phí • Các tính trạng phẩm chất là ngoại lệ  Độ chính xác của các nghiên cứu lập bản đồ  Được xác định bởi:  Ảnh hưởng của QTL có thể phụ thuộc vào nền di truyền • Tính trạng và phương pháp sàng lọc kiểu hoặc bị chi phối bởi điều kiện ngoại cảnh hình  Không có đa hình chỉ thị trong vật liệu chọn giống • Chi phí nhà kính/Thí nghiệm đồng ruộng  Kết hợp di truyền phân tử và chon giống truyền thống • Chi phí lao động kém • Loại chỉ thị sử dụng https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 10
  18. Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Chi phí MAS Chi phí MAS ở IRRI (ví dụ 1) *gồm cả chi phí lao động Vật tư tiêu hao: Chi phí cho  Ước lượng PTN lập bản đồ Genom (GML) Cở sở nghiên cứu Nước Cây trồng một mẫu* Tài liệu (US$) • USD $0.26 một mẫu (chi phí tối thiểu) ĐH Guelph • Chi phí chia nhỏ: tách chiết DNA: 19.1%; PCR: 61.6%; Canada Đậu 2.74 Yu et al. (2000) ddieeenj di Gel: 19.2% Dreher et al. CIMMYT Mexico Ngô 1.24–2.26 • Không tính phí găng tay, giấy thấm, điện, nước, thải rác (2003) Australi Kuchel et al.  GAMMA Lab = USD $0.86 một mẫu ĐH Adelaide Lúa mì 1.46 a (2005) Lao động: ĐH. Kentucky, • USD $0.06 một mẫu (KTV) Minnesota, . Lúa mì và Van Sanford et Oregon, Michigan, Hoa kỳ đại mạch 0.50–5.00 al. (2001) • USD $0.65 một mẫu (TTS sau tiến sĩ) USDA-ARS Yu et al. 2000 Plant Breed. 119, 411-415; Dreher et al. 2003 Mol. Breed. 11, 221-234; Kuchel et al. 2005 Mol. Breed. 16, 67-78; and Van Sanford et al. 2001 Crop Sci. 41, 638-644. Chi phí cho MAS: Thế hệ đầu MAS Chi phí MAS: ví dụ 2 - chọn lọc Swarna+Sub1 P1 x P2 Swarna/ Swarna IR49830 F1 F1 376 có Sub1 Cây #242 21 thể TTH BC1F1 Swarna Chọn lọc nền – 57 697 cây chỉ thị F2 2000 cây 158 mang Sub1 Cây #246 BC2F1 5 TTH Chỉ tính chi phí VT tiêu 23 chỉ thị nền 320 cây Swarna hao. CL gen mục tiêu, TTH và CL nền BC1- BC3F2 = USD $2201 11 cây mang Sub1 BC3F1 10 chỉ thị nền 18 cây USD $640 để sàng lọc 2000 cây với một chỉ thị cho một quần thể Swarna+Sub1 Chi phí MAS cụ thể Vd 1- Chọn lọc phả hệ (2000 cây F2) = USD $640 Xem xét các ví dụ về MAS cho thấy một • Philippines (Peso) = 35,200 vấn đề chung: • India (Rupee) = 28,800 • Bangladesh (Taka) = 44,800  Hầu hết các chỉ thị DNA được xây dựng cho các • Iran (Tuman) = 576,000 VD 2: Swarna+Sub1 = USD $2201 (*vật tư tiêu hao) • Philippines (Peso) = 121,055 • India (Rupee) = 99,045 • Bangladesh (Taka) = 154,070 • Iran (Tuman) = 1,980,900 • Nói cách khác, không phải là QTLs. Xác định chỉ thị cho  Chi phí tăng nhanh! QTLs khó hơn rất nhiều https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 11
  19. Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Độ tin cậy của bản đồ QTLs cũng ảnh hưởng đến thành công của MAS Tích hợp giữa sinh học phân tử và chọn giống thường thiếu  Độ tin cậy của số liệu kiểu hình quan trọng!  Khoảng cách lớn giữa phát triển các chỉ thị phân tử • Đòi hỏi: nhiều lần lặp lại ở nhiều môi trường và chọn tạo giống  Khẳng định lại kết quả QTLs ở các quần thể độc lập - Xây dựng chỉ thị, bản đồ QTL thường tách rời khỏi chọn giống  Kiểm tra “Giá trị của chỉ thị” phải được thực hiện - Sự trao đổi thông tin số liệu giữa các viện • Kiểm tra độ tin cậy của chỉ trị trong dự đoán kiển nghiên cứu và chọn giống thường thiếu hình  Những quan điểm quan trọng không được hiểu như • Kiểm tra mức độ đa hình của chỉ thị nhau giữa các lĩnh vực  Ảnh hưởng của nền di truyền phải được xác định Hết chương VI https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 12
  20. 07/08/2017 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Sử dụng QTL trong chọn giống Tóm tắt • Thiết lập bản đồ QTL mapping = là quá trình xác định vị • QTLs với ảnh hưởng nhỏ = khó có được bản đồ chính trí của gen với ảnh hưởng lên tính trạng số lượng, sử xác dụng chỉ thị phân tử • Chỉ những QTLs trên đoạn chromosome rất nhỏ có thể • Phân tích QTL = dựa trên xác định sự khác nhau về giá sử dụng trong chọn giống lai lại trị trung bình giữa các dòng với các chỉ thị phân tử • QTL có ảnh hưởng lớn trong hầu hết các nền di truyền và môi trường là có hữu ích nhất trong chọn giống • QTL mapping = bước khởi đầu để khám phá gen có ích trong chọn giống https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 8
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
19=>1