Bài giảng Dinh dưỡng - Tăng trưởng của vi khuẩn

DINH DƯỠNG –

TĂNG TRƯỞNG VI KHUẨN TĂNG TRƯỞNG VI KHUẨN

Ths. Nguyễn Thanh Tố Nhi

DINH DƯỠNG – TĂNG TRƯỞNG VI KHUẨN (cid:1)DINH DƯỠNG VI KHUẨN (cid:1)SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN (cid:1)KIỂM SOÁT VSV

Chất dinh dưỡng

pH, độ ẩm ẩm

Môi trường nhân nhân tạo

Môi trường thông khí, CO2, O2 CO , O (yếm khí)

Điều kiện #

Tạo cấu trúc TB, năng lượng cho hoạt động sống

DINH DƯỠNG VI KHUẨN

(cid:2)Nhu cầu dinh dưỡng (cid:3)Chất dinh dưỡng oĐa lượng oVi lượng oYếu tố tăng trưởng (cid:2)Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (cid:3)Phân loại theo thành phần (cid:3)Phân loại theo thành phần oTổng hợp oTự nhiên (cid:3)Phân loại theo mục đích sử dụng oCơ bản (dinh dưỡng) oChuyên chở oPhong phú (tăng sinh) oChọn lọc oSinh hóa oPhân biệt

CHẤT DINH DƯỠNG

(cid:2)Thiết yếu: TB không tăng trưởng được nếu không có (cid:2)Có ích: Nếu có, VK sử dụng, không bắt buộc (cid:3)Đa lượng: C, N, P, S, K, Mg, Na, Ca, Fe (cid:3)Vi lượng (Nguyên tố vết - cần với lượng nhỏ, không thể (cid:3)Vi lượng (Nguyên tố vết - cần với lượng nhỏ, không thể

thiếu đ/v VSV): Co (tạo vit B12), Zn, Mo, Cu, Mn, Ni, W,

Se (cid:3)Yếu tố tăng trưởng: Vitamin, aa, purin & pyrimidin

1. Carbon • ½ chất khô tb (cid:4) Ý nghĩa hàng đầu trong sự sống VSV

• Giá trị dd và khả năng hấp thụ nguồn C tuỳ thuộc:

• TP & cấu tạo hóa học nguồn C: mức độ oxy hóa của

nguyên tử C

- C vô cơ thuần: VSV không sử dụng

- C hữu cơ: sử dụng được

- CO2: nguồn C duy nhất của VSV quang tổng hợp • Đặc điểm sinh lý VSV: VSV đồng hóa trực tiếp chất phân tử thấp (các loại đường), thủy phân chất cao phân tử

(tinh bột, protein…)

CHẤT DINH DƯỠNG ĐA LƯỢNG

Phân loại VSV theo nguồn năng lượng và carbon:

Vi sinh vật

Nguồn C

Nguồn NL

Dị dưỡng (Chất hữu cơ)

Quang (Ánh sáng)

Hóa (Chất VC/HC)

Tự dưỡng (CO2)

Phân loại VSV theo nguồn năng lượng và carbon:

Quang tự dưỡng?

Hóa tự dưỡng?

Quang dị dưỡng?

Hóa dị dưỡng?

Nguồn C từ CO2, nguồn NL từ chất vô cơ?

Nguồn NL từ ánh sáng, nguồn C từ CO2?

Nguồn C từ chất hữu cơ, nguồn NL từ ánh sáng?

Nguồn NL từ chất vô cơ, nguồn C từ chất hữu cơ?

Nguồn C từ CO2, nguồn NL từ ánh sáng?

Nguồn C từ CO2, nguồn NL từ chất chất hữu cơ?

2. Nitơ

• Thành phần chiếm tỷ lệ lớn thứ 2 trong TB

• Cấu tạo protein, acid nucleic, peptidoglycan

• VSV sử dụng N ko chỉ phụ thuộc nguồn N, tùy tỉ lệ C:N / mtr

• Nguồn N ở 2 dạng: vô cơ (muối nitrat, nitrit), hữu cơ (pepton, • Nguồn N ở 2 dạng: vô cơ (muối nitrat, nitrit), hữu cơ (pepton,

nước thịt,…); N không khí: VSV cố định đạm

3. Phospho

• Tổng hợp ADN, ARN, ATP, phospholipid…

• Nguồn P vô cơ dễ sử dụng (KH2PO4). Hữu cơ: phức tạp, cần

enzym thủy phân thành P tự do; đắt tiền

CHẤT DINH DƯỠNG ĐA LƯỢNG

4. Lưu huỳnh

Cấu tạo aa và vitamin. Thường dùng MgSO4.7H2O

5. Kali

Hoạt hoá enzym tổng hợp protein, thường dùng KH2PO4

6. Magie

Ổn định ribosom, cần cho hoạt động các enzym, thường dùng Ổn định ribosom, cần cho hoạt động các enzym, thường dùng MgSO4.7H2O

7. Canxi

Không thiết yếu, ổn định nhiệt nội bào tử, dùng CaCl2

8. Natri: dùng NaCl 9. Sắt: cần cho enzym hô hấp, dùng FeCl3, FeSO4

CHẤT DINH DƯỠNG ĐA LƯỢNG

YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG

• Là chất cần với lượng rất nhỏ, thiết yếu cho sự

tăng trưởng của VK nhưng tb không tự tổng hợp được

• Thường cung cấp dưới dạng

• Vitamin: chức năng coenzym • Vitamin: chức năng coenzym • Acid amin: cấu tạo protein • Purin và pyrimidin: tổng hợp acid nucleic (cid:4) Nếu dùng nguyên liệu hữu cơ (pepton,

cao men) thì đa số YTTT đã có sẵn, không cần bổ sung thêm

oYếu tố tăng trưởng

DINH DƯỠNG VI KHUẨN

(cid:2)Nhu cầu dinh dưỡng (cid:3)Nguồn năng lượng (cid:3)Chất dinh dưỡng oVi lượng oĐa lượng (cid:2)Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (cid:3)Phân loại theo thành phần (cid:3)Phân loại theo trạng thái / thể chất môi trường (cid:3)Phân loại theo trạng thái / thể chất môi trường (cid:3)Phân loại theo mục đích sử dụng

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Phân loại theo thành phần • MT tổng hợp: TPHH xác định, khó làm, đắt tiền • MT tự nhiên: TPHH không xác định (protein

đậu nành, cao thịt, mô sống)

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Phân loại theo trạng thái / thể chất môi trường • Lỏng (canh thang) • Rắn (thạch): 1 – 2 % agar • Bán rắn:

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Phân loại theo mục đích sử dụng • MT cơ bản (dinh dưỡng) • MT chuyên chở • MT phong phú (tăng sinh • MT phân biệt • MT phân biệt • MT chọn lọc • MT xác định tính chất sinh hóa

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY • MT cơ bản (dd): đầy đủ cdd cho đa số VK tăng

trưởng

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY • MT chuyên chở: rất ít cdd (cid:4) VK sống mà

ko phát triển (cid:4) giữ mẫu bệnh phẩm

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY • MT phong phú (tăng sinh): MT cơ bản bổ sung thêm máu, dịch nấm men,… để VK “kén ăn” phát triển

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY • MT phân biệt: giúp khuẩn lạc VK cần khảo sát

có hình thức riêng biệt, dễ quan sát

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

• MT chọn lọc: ngăn chặn hầu hết VK trừ VK

khảo sát

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

• MT xác định tính chất sinh hóa: phát hiện

hoạt tính enzym của VK thuần chủng

SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VK

(cid:2)KHÁI NIỆM (cid:2)ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG (cid:2)ĐO SỰ TĂNG TRƯỞNG (cid:2)YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TĂNG TRƯỞNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TĂNG TRƯỞNG

KHÁI NIỆM

Sinh sản phân đôi

KHÁI NIỆM

Một số định nghĩa • Sự tăng trưởng tb: gia tăng số lượng tb/ sinh khối

• Tốc độ tăng trưởng: sự thay đổi số tb/ sinh khối tb

trong 1 đơn vị thời gian trong 1 đơn vị thời gian

• Thời gian thế hệ: thời gian để số tế bào nhân đôi • Tăng trưởng lũy thừa: sự tăng trưởng có số tế bào tăng gấp đôi ở mỗi giai đoạn (cid:4) đường biểu diễn logarit 10 là đường thẳng

KHÁI NIỆM

Tính thời gian thế hệ trong tăng trưởng lũy thừa N = No.2n logN = logNo + nlog2 n = logN - logNo

log2 log2

n = logN - logNo

-N: Số tb cuối cùng -No: Số tb ban đầu -t: Thgian tăng trưởng lũy -t: Thgian tăng trưởng lũy

0.301

thừa

-n: Số thế hệ trong gđ lũy

n = 3,3.logN/No G = t/n =

t 3,3.logN/No

thừa

-G: Thời gian thế hệ

KHÁI NIỆM

VD: Tính thời gian thế hệ của 1 loài VK? Biết từ 103 tế

bào khi nuôi cấy trong 2 giờ thu được 107 tế bào?

A. 9 phút

B. B. 12 phút 12 phút

C. 18 phút

D. 27 phút

KHÁI NIỆM

Một loài VK cứ sau 20 phút nhân đôi 1 lần. Sau 3 giờ

nuôi cấy thu được 105 VK. Hỏi số lượng tế bào ban

đầu cho vào bình nuôi cấy là bao nhiêu?

A. 300 A. 300

B. 10

C. 100

D. 200

KHÁI NIỆM

Từ 8 tế bào, sau 5 thế hệ ta thu được lượng tế bào

trong bình nuôi cấy là

A. 125

B. 2048 B. 2048

C. 1012

D. 256

KHÁI NIỆM

Từ 3 tế bào, sau bao nhiêu thế hệ ta thu được 9.104 tế

bào

A. 15

B. 20

C. 19

D. 12

ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG

1. Pha tiềm ẩn • VK thích ứng dần với MT mới, tích lũy cdd cho gđ

phân chia; dân số không tăng

• Cấy VK đang tăng trưởng lũy thừa vào cùng loại

MT, trong cùng đk nuôi cấy (cid:4) bỏ qua pha tiềm ẩn

2. Pha lũy thừa 2. Pha lũy thừa • Số lượng tb tăng theo cấp số nhân đến khi cạn

kiệt cdd thiết yếu/MT hoặc sản phẩm thải (độc tố tích trữ do biến dưỡng) đạt đủ mức kiềm chế • Tb có trạng thái khỏe mạnh nhất (cid:4) lý tưởng để nghiên cứu về enzym hoặc các thành phần khác

ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG

3. Pha ổn định • Số tb sinh ra = số tb chết đi • TB vẫn hoạt động (TĐC chuyển hóa năng

lượng) lượng)

4. Pha suy thoái • Số tb chết đi > số tb sinh mới • Sau khi đa số tb chết, tỷ suất chết giảm

mạnh: một ít tb tiếp tục sống sót 1 thời gian dài nhờ cdd từ tb chết thải ra MT

ĐO SỰ TĂNG TRƯỞNG TB VK

Xác định toàn phần vi khuẩn • Đếm tổng số tế bào bằng buồng đếm • Đo tỉ trọng tế bào • Đo độ đục • Định lượng nitơ toàn phần (cid:4) Nhược điểm: (cid:4) Nhược điểm:

(1) Không phân biệt sống – chết (2) Không chính xác, nhất là mật độ tb thấp

Xác định vk sống • Đếm sống bằng pp trải đĩa/đếm SL khuẩn lạc • Xác định sản phẩm của vk sống (O2 hấp thu, ATP…)

• Đếm tổng số tế bào bằng buồng đếm

Đếm tổng số tế bào bằng buồng đếm

Đo tỉ trọng tế bào (cid:3) Rửa sạch khối VK, làm khô (cid:3) Cân trọng lượng khô TB/thể tích môi trường lỏng

• Đo độ đục số tế bào

• Đếm sống - PP đổ đĩa vs trải đĩa

YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TĂNG TRƯỞNG

• Nhiệt độ • pH • Áp suất thẩm thấu • Oxy • Oxy

Nhiệt độ

Nhiệt độ tối ưu

Các PƯ enzym cao nhất

Tốc độ tăng trưởng

Các PƯ enzym tăng

Nhiệt độ

NĐ tối thiểu

NĐ tối đa Protein biến tính, màng tb bị phá hỏng, ly giải

tạo gel, quá Màng bị trình vận chuyển chậm, tăng trưởng ko diễn ra

NHIỆT ĐỘ

•Nhóm ưa lạnh: To~<15oC •Nhóm trung bình: To~20- 40oC

•Nhóm ưa nhiệt: To~45- 60oC •Nhóm ưa nhiệt cao: To~>80oC

NHIỆT ĐỘ

pH

(cid:3)Hầu hết VK phát triển tốt ở pH trung tính (6-8) Nấm mốc, nấm men phát triển tốt ở pH acid (5 – 6) tốt ở pH acid (5 – 6)

ÁP SUẤT THẨM THẤU

• Môi trường hoạt tính nước thấp: VSV lấy nước

bằng cách tăng nồng độ chất tan nội bào

Oxy

Mối liên hệ với oxy

Nhóm

Phân loại VSV theo nhu cầu oxy

Hiếu khí

Bắt buộc

Cần

Tùy ý

Không cần nhưng tăng trưởng tốt hơn nếu có oxyoxy

Vi hiếu khí Cần nhưng mới mức thấp hơn trong không khí

Kỵ khí

Bắt buộc

Có hại hoặc chết

Chịu đc kk

Không cần, tăng trưởng tốt hơn nếu ko có oxy

(tùy ý)

Oxy Sản phẩm của hô hấp là các dạng độc tính cao của oxy như: superoxid (O2-), hydroxyl (OH*), H2O2 có khả năng oxy hóa các chất hữu cơ/ tb (cid:4) VSV có enzym phân hủy oxy độc: catalase, peroxidase, superoxid dismutase

Oxy

Ý nghĩa trong nuôi cấy VSV •VSV hiếu khí: lắc, khuấy, sục khí tiệt trùng vào MT vào MT •VSV kỵ khí: khử oxy trong MT như thioglycolat, cho khí tiêu oxy vào bình

Oxy

Phân loại vi khuẩn theo nhu cầu oxy

KIỂM SOÁT VSV

Một số khái niệm

• Sự vô trùng (Sterility) / Sự vô khuẩn (Aseptic) • Tiệt trùng (Sterilisation) / Sát trùng (Antiseptic) /

Tẩy trùng (Disinfection) Tẩy trùng (Disinfection)

• Chất kìm khuẩn (Bacteriostatic agent) / Chất diệt

khuẩn (Bacteriocidal agent)

• Sự nhiễm trùng (Contamination) • Vệ sinh (Sanitation)

KIỂM SOÁT VSV – pp vật lý

• Nhiệt ẩm có áp suất: 121oC, 1.1 kg/cm2. Dùng cho

sản phẩm y tế, dụng cụ, MT nuôi cấy

• Nhiệt ẩm không áp suất: 62.8oC/30ph hoặc

71.7oC/15ph (PP Pasteur, Tyndall)

• Nhiệt khô: 180oC/2h. Thủy tinh, bột, dầu (lò sấy) • Tia tử ngoại: không khí, bề mặt • Tia tử ngoại: không khí, bề mặt • Tia phóng xạ: chỉ khâu, đồ nhựa dùng 1 lần • Lọc: dung dịch (màng cellulose 0.45, 0.22µm)

hoặc không khí (lọc HEPA)

Nhiệt ẩm có áp suất

Nhiệt ẩm không áp suất

TIA TỬ NGOẠI + NHIỆT KHÔ (TỦ SẤY) + TIA PHÓNG XẠ

PP LỌC

KIỂM SOÁT VSV – pp hóa học

• Dung môi hữu cơ • Kim loại nặng • Phenol và dẫn xuất • Phenol và dẫn xuất • Halogen • Chất tẩy • Chất tác động bề mặt

KIỂM SOÁT VSV – pp hóa học

Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tẩy trùng • Thời gian • Nhiệt độ • Nhiệt độ • pH • Loại VSV • Nồng độ chất tẩy trùng • Môi trường xung quanh

KIỂM SOÁT VSV – hóa trị liệu • Tác nhân chọn lọc trên VSV, ít ảnh hưởng đến tb chủ • Kháng sinh: chất nguồn gốc tự nhiên/ tổng hợp, tác động tại chỗ/ hệ thống, hiệu quả kìm khuẩn/ diệt khuẩn

Kháng sinh

Đích tác động của kháng sinh kháng sinh

β-lactam (penicillin, cephalosporin)

Ức chế tổng hợp thành tế bào

Ức chế tổng hợp màng tế bào

Polymycin Kháng nấm (Amphotericin B, Nystatin)

Ức chế tổng hợp acid nucleic

Quinolon, Rifampicin 5-nitroimidazol

Ức chế tổng hợp protein

Aminoglycosid, Tetracyclin, Spectinomycin Chloramphenicol, Erythromycin

SỰ TRAO ĐỔI CHẤT CỦA VSV

Đại cương

(cid:2)Sự trao đổi chất nhằm cung cấp: • Vật liệu để xây dựng cơ thể • Năng lượng ở dạng thích hợp cho tb. Quan trọng nhất là NL ở dạng ATP, xem như “tiền tệ năng lượng” cho các PƯ trao đổi NL của tb

(cid:2)Năng lượng được tạo ra bởi cơ chế hô hấp,

quang hợp, lên men quang hợp, lên men

Glucose

EM, HMP, ED

Đường phân

Acid pyruvic

CT Krebs

CO2

Chuỗi chuyền điện tử

Chấtnhậnđiệntửcuốicùnglà:

Oxy

Chất hữu cơ