Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà nước: Nghiên cứu quy trình chiết tách ent-kauran ditecpenoit có tác dụng chống ung thư và chống viêm từ cây khổ sâm Bắc Bộ

®¹i häc quèc gia hµ néi tr−êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi ®éc lËp cÊp nhµ n−íc Nghiªn cøu quy tr×nh chiÕt t¸ch ent-kauran ditecpenoit cã t¸c dông chèng ung th− vµ chèng viªm tõ c©y khæ s©m b¾c bé M· sè §T§L-2005/05

Chñ nhiÖm ®Ò tµi: gs, tskh. phan tèng s¬n

6761 24/3/2008

hµ néi - 2007

Lêi më ®Çu

C©y khæ s©m B¾c Bé (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) mäc

hoang vµ ®−îc trång kh¾p n¬i ë c¸c tØnh phÝa B¾c n−íc ta. C©y dÔ trång vµ sau

mét thêi gian ng¾n ®· cã thÓ thu h¸i lÊy nguyªn liÖu. C©y khæ s©m B¾c Bé

®−îc dïng phæ biÕn trong y häc d©n gian cña ViÖt Nam. L¸ c©y khæ s©m B¾c

Bé dïng ch÷a ung nhät, lë loÐt, viªm mòi, ®au bông, tiªu hãa kÐm, lþ, vµ

viªm loÐt d¹ dµy - t¸ trµng.

KÕt qu¶ cña c¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu gÇn ®©y ®· ph¸t hiÖn sù cã mÆt

cña nhiÒu ent-kauran ditecpenoit trong c©y khæ s©m B¾c Bé, trong sè ®ã cã

nhiÒu hîp chÊt míi vµ cã nh÷ng ho¹t tÝnh sinh häc rÊt ®¸ng quan t©m, nh−

ho¹t tÝnh ®éc h¹i tÕ bµo ung th−, t¸c dông øc chÕ sù ho¹t hãa nh©n tè phiªn m·

NF-кB, t¸c dông øc chÕ enzym nitric oxide synthase (iNOS). Ho¹t chÊt ent-

kauran ditecpenoit chñ yÕu cña l¸ c©y khæ s©m B¾c Bé lµ ent-7β-hydroxy-15-

oxokaur-16-en-18-yl axetat (1).

§Ò tµi nghiªn cøu Khoa häc vµ Ph¸t triÓn C«ng nghÖ ®éc lËp cÊp Nhµ

n−íc “Nghiªn cøu quy tr×nh chiÕt t¸ch ent-kauran ditecpenoit cã t¸c dông

chèng ung th− vµ chèng viªm tõ c©y khæ s©m B¾c Bé (Croton tonkinensis

Gagnep., Euphorbiaceae)”, M· sè: §T§L-2005/05, cã c¸c môc tiªu:

- X©y dùng quy tr×nh chiÕt t¸ch ent-kauran ditecpenoit cã t¸c dông

chèng ung th− vµ chèng viªm tõ c©y khæ s©m B¾c Bé;

- Thö ®é an toµn cña ho¹t chÊt chiÕt t¸ch ®−îc;

- Chøng minh t¸c dông chèng ung th− vµ chèng viªm thùc nghiÖm cña

ho¹t chÊt chiÕt t¸ch ®−îc.

C¸c néi dung nghiªn cøu ®−îc x¸c ®Þnh cho §Ò tµi §T§L-2005/05 lµ:

1. X©y dùng quy tr×nh æn ®Þnh chiÕt t¸ch ent-kauran ditecpenoit cã t¸c

dông chèng ung th− vµ chèng viªm ë quy m« Phßng thÝ nghiÖm;

2. Ph©n lËp ho¹t chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT-2005 giµu ho¹t chÊt 1 cã t¸c

dông diÖt tÕ bµo ung th− dïng lµm chuÈn ®èi chøng trong kiÓm nghiÖm;

3. Thö ®é an toµn cña ChÕ phÈm CT-2005;

4. Kh¶o s¸t ho¹t tÝnh kh¸ng u trùc tiÕp cña ChÕ phÈm CT-2005 trªn mét

sè dßng tÕ bµo ung th− ng−êi nu«i cÊy in vitro;

5. Nghiªn cøu t¸c dông cña ChÕ phÈm CT-2005 ®Õn h¹n chÕ sù ph¸t triÓn

ung th− sarcoma 180 trªn ®éng vËt thùc nghiÖm;

6. Nghiªn cøu t¸c dông chèng viªm cña ChÕ phÈm CT-2005 ë sóc vËt

thùc nghiÖm.

Ch−¬ng 1

TæNG QUAN

1.1 C¸c hîp chÊt thiªn nhiªn tõ thùc vËt trong liÖu ph¸p chèng bÖnh ung

th− vµ chèng viªm

Theo thèng kª, bÖnh ung th− hiÖn lµ nguyªn nh©n chÝnh thø hai g©y tö

vong ë c¸c n−íc ph¸t triÓn. ë Mü mçi n¨m cã kho¶ng 500.000 ng−êi chÕt do

ung th− [1]. ë c¸c n−íc ®ang ph¸t triÓn bÖnh ung th− còng ®ang trë thµnh phæ

biÕn. Theo ®¸nh gi¸ cña DiÔn ®µn Y tÕ ch©u ¸ ®−îc tæ chøc t¹i Singapore

trung tuÇn th¸ng 4 n¨m 2007 th× ë ch©u lôc nµy c¨n bÖnh ung th− t¨ng vät

trong Ýt n¨m gÇn ®©y; riªng n¨m 2002, 3,5 triÖu ca ung th− ®· ®−îc ph¸t hiÖn

t¹i c¸c n−íc ch©u ¸ [2]. Theo −íc tÝnh cña C¬ quan nghiªn cøu ung th− quèc

tÕ th× ë ViÖt Nam n¨m 1990 cã 52.700 ca ung th− míi vµ 37.000 ng−êi chÕt

do c¨n bÖnh nµy [3].

§· cã nhiÒu tiÕn bé trong viÖc chÈn ®o¸n sím vµ ®iÒu trÞ ung th−. Vµo

®Çu thÕ kû hai m−¬i, Ýt bÖnh nh©n ung th− sèng sãt ®−îc. Vµo nh÷ng n¨m

1930 d−íi mét trong n¨m bÖnh nh©n ung th− cßn sèng n¨m n¨m sau khi chÈn

®o¸n ra bÖnh. Vµo nh÷ng n¨m 1940, con sè nµy ®· ®¹t mét trong bèn, vµo

nh÷ng n¨m 1960 mét trong ba, vµ vµo kho¶ng 1990 lµ gÇn 50% [1].

MÆc dÇu ®· cã nhiÒu liÖu ph¸p míi ®−îc ph¸t triÓn, phÉu thuËt, bøc x¹

liÖu ph¸p (x¹ trÞ) vµ hãa liÖu ph¸p ®−îc dïng riªng biÖt hoÆc trong sù phèi hîp

vÉn lµ c¸c ph−¬ng ph¸p ®iÒu trÞ ung th− cã hiÖu qu¶ [1].

C¸c bÖnh viªm vµ tù miÔn, bao gåm c¶ viªm khíp d¹ng thÊp, c¸c bÖnh

viªm ruét, ®a x¬ cøng, bÖnh v¶y nÕn vµ suyÔn, ®ang ®Æt ra cho c¸c nhµ nghiªn

cøu ph¸t triÓn thuèc ch÷a bÖnh nh÷ng th¸ch thøc to lín. Nh÷ng bÖnh nµy hiÖn

®−îc ®iÒu trÞ b»ng c¸c thuèc chèng viªm non-steroid (NSAIDs), c¸c

corticosteroit vµ methotrexat, c¸c thuèc nµy cã t¸c dông h¹n chÕ vµ/hoÆc kh«ng

®ñ an toµn [4]. Mét cuéc ch¹y ®ua ®ang diÔn ra nh»m t¹o ra c¸c thÕ hÖ míi c¸c

thuèc chèng viªm cã hiÖu qu¶ cao, an toµn vµ ®em l¹i nhiÒu lîi nhuËn, vµ bæ

sung hoÆc thay thÕ c¸c liÖu ph¸p hiÖn ®−îc ¸p dông.

C¸c hîp chÊt thiªn nhiªn lu«n cã vai trß chÝnh trong viÖc ph¸t hiÖn vµ

ph¸t triÓn c¸c d−îc phÈm míi [5-11]. Gi¸ trÞ cña nhiÒu hîp chÊt thiªn nhiªn cã

ho¹t tÝnh sinh häc kh«ng chØ ë c«ng dông trùc tiÕp cña chóng lµm thuèc ch÷a

bÖnh, mµ cßn v× chóng cã thÓ dïng lµm c¸c nguyªn mÉu hoÆc c¸c cÊu tróc dÉn

®−êng cho sù ph¸t hiÖn vµ ph¸t triÓn c¸c d−îc phÈm míi. Thùc vËt bËc cao

lu«n lµ mét träng t©m ®Æc biÖt quan träng trong nghiªn cøu c¸c hîp chÊt thiªn

nhiªn cã ho¹t tÝnh sinh häc do sù ®a d¹ng sinh häc - vµ v× thÕ sù ®a d¹ng ho¸

häc - cña chóng.

Còng nh− trong lÜnh vùc thuèc chèng HIV, nhiÒu thuèc chèng bÖnh ung

th− hiÖn ®ang ®−îc sö dông trong liÖu ph¸p hãa häc hoÆc ®−îc thu nhËn mét

c¸ch trùc tiÕp tõ c¸c s¶n phÈm thiªn nhiªn hoÆc lµ c¸c chÊt ®−îc tæng hîp dùa

trªn c¸c mÉu hîp chÊt thiªn nhiªn [1, 7, 8, 12-19]. C¸c t¸c nh©n chèng ung th−

b¾t nguån tõ thiªn nhiªn (thùc vËt, vi sinh vËt, sinh vËt biÓn) còng ®ang cho ta

c¬ héi to lín ®Ó ®¸nh gi¸ kh«ng nh÷ng c¸c líp hîp chÊt hãa häc chèng ung

th− hoµn toµn míi, mµ l¹i cßn c¸c c¬ chÕ t¸c dông míi.

NhiÒu hîp chÊt cã nguån gèc thùc vËt hiÖn ®ang ®−îc sö dông cã hiÖu

qu¶ trong ®iÒu trÞ ung th−. Mét trong c¸c thÝ dô ®¸ng kÓ nhÊt lµ nhãm c¸c

Vinca ancaloit ®−îc ph©n lËp tõ c©y dõa c¹n (Catharanthus roseus). Trong sè

bèn ancaloit cña c©y dõa c¹n thÓ hiÖn ho¹t tÝnh chèng bÖnh b¹ch cÇu trªn

chuét chØ cã vincristin vµ vinblastin ®−îc sö dông ®Ó ®iÒu trÞ ung th− trªn

ng−êi. C¸c hîp chÊt nµy ®· chøng tá cã hiÖu qu¶ trong ®iÒu trÞ c¸c bÖnh b¹ch

cÇu, c¸c u b¹ch huyÕt, vµ mét sè carcinoma. C¸c Vinca ancaloit ph¸ vì c©n

b»ng tubulin/microtubule, do liªn kÕt víi c¸c Vinca ancaloit mµ c¸c dime

tubulin kh«ng thÓ tËp hîp ®Ó t¹o thµnh c¸c microtubule.

OH

N

H

N

H

H3COOC

N

H3CO

OCOCH3

HO

COOCH3

R

Vincristin: R = CHO

Vinblastin: R = CH3

Mét thÝ dô kh¸c vÒ mét t¸c nh©n cã ho¹t tÝnh cao cã nguån gèc thùc vËt

lµ etoposide (VP-16), chÊt nµy ®· ®−a l¹i tû lÖ ch÷a khái cao trong ®iÒu trÞ ung

th− tinh hoµn khi dïng phèi hîp víi bleomycin (còng lµ mét s¶n phÈm thiªn

nhiªn) vµ cisplatin; etoposide còng cã ho¹t tÝnh ®¸ng kÓ chèng l¹i carcinoma

phæi tÕ bµo nhá. Etoposide lµ mét dÉn xuÊt b¸n tæng hîp cña podophyllotoxin,

mét chÊt øc chÕ gi¸n ph©n do liªn kÕt thuËn nghÞch víi tubulin vµ øc chÕ viÖc

l¾p r¸p microtubule. Podophyllotoxin lµ mét thµnh phÇn cña c©y Podophyllum

pelatum, P. emodi, vµ P. pleianthum. Etoposide øc chÕ enzym hÕt søc quan

träng DNA topoisomerase II vµ, sau ®ã, lµm t¨ng sù ph©n c¾t DNA.

H

O

H3C

O

OH

O

O HO

HO

O

H3CO

OCH3

H3CO

OCH3

OH

Podophyllotoxin Etoposide (VP-16)

ChÊt ancaloit tù nhiªn camptothecin ®−îc ph©n lËp tõ c©y Camptotheca

acuminata cña Trung Quèc lµ mét hîp chÊt kh¸c ®· ®−îc liªn tôc biÕn c¶i cÊu

tróc nh»m ph¸t triÓn c¸c t¸c nh©n h÷u Ých h¬n cho liÖu ph¸p hãa häc.

Camptothecin ®−îc dïng ®iÒu trÞ c¸c bÖnh ung th− d¹ dµy, trùc trµng, ruét kÕt,

vµ bµng quang, tuy nhiªn nã khã kiÕm ®−îc tõ thiªn nhiªn vµ kÐm tan trong

n−íc. C¸c chÊt thiªn nhiªn camptothecin vµ 10-hydroxy-camptothecin còng

nh− c¸c dÉn xuÊt tæng hîp cña camptothecin (9-aminocamptothecin,

topotecan, vµ irinotecan (CPT-11)) lµ c¸c t¸c nh©n chèng khèi u m¹nh vµ øc

chÕ DNA topoisomerase I. C¸c hîp chÊt topotecan vµ irinotecan ®Òu lµ c¸c

muèi amin-hydroclorua; topotecan tan trong n−íc nhiÒu gÊp 100 lÇn so víi

camptothecin vµ ®−îc dïng ®Ó ch÷a ung th− buång trøng t¸i ph¸t; vµ

irinotecan chuyÓn hãa thµnh chÊt phenolic cã t¸c dông øc chÕ topoisomerase I

in vivo m¹nh h¬n, thËm chÝ gÊp 200-1.000 lÇn. Irinotecan còng thÓ hiÖn ho¹t

tÝnh chèng khèi u m¹nh ®èi víi ung th− buång trøng. C¶ topotecan lÉn

irinotecan ®Òu cã t¸c dông m¹nh chèng ung th− ruét kÕt-th¼ng.

R2

O

NN

N

O

HO

O

Camptothecin: R1 = R2 = H

10-Hydroxycamptothecin: R1 = OH; R2 = H

9-Aminocamptothecin: R1 = H; R2 = NH2

.

HCl

CH2N(CH3)2HCl

HO

N

O

N

NN

O

N

O

HO

O

Topotecan Irinotecan

C¸c taxoit taxol® (paclitaxel), lóc ®Çu ®−îc ph©n lËp tõ vá c©y th«ng ®á T©y Th¸i b×nh d−¬ng (Taxus brevifolia), vµ taxotere® (docetaxel), mét chÊt

t−¬ng tù ®−îc b¸n tæng hîp tõ 10-deacetyl-baccatin III nhËn ®−îc tõ l¸ c©y

Taxus baccata thÓ hiÖn ho¹t tÝnh m¹nh trªn l©m sµng ®èi víi ung th− vó vµ

ung th− buång trøng. Paclitaxel cã mét ph−¬ng thøc t¸c dông ®éc ®¸o, nã øc

chÕ gi¸n ph©n b»ng c¸ch ®Èy m¹nh sù l¾p r¸p c¸c microtubule.

Nh− vËy c¸c Vinca ancaloit vµ c¸c taxoit cã thÓ ®−îc coi nh− lµ c¸c thuèc

t¸c dông trªn cïng mét ®Ých, tøc lµ bé m¸y gi¸n ph©n, nh−ng cã c¸c c¬ chÕ t¸c

dông kh¸c nhau vµ bæ sung nhau: c¸c Vinca ancaloit øc chÕ sù polyme hãa

tubulin thµnh c¸c microtubule, trong khi c¸c taxoit øc chÕ ph¶n øng ng−îc l¹i,

®ã lµ sù depolyme hãa c¸c microtubule thµnh tubulin hßa tan. Hai hä thuèc

chèng gi¸n ph©n nµy cã c¸c tÝnh chÊt l©m sµng rÊt cã gi¸ trÞ vµ kh¸c nhau.

R1O

O

R2

OH

CH3

H

CH3

O

CH3

OH

HO

H

H OCOC6H5

O

OCOCH3

Taxol: R1 = COCH3, R2 = HNCOC6H5

Taxotere: R1 = H, R2 = HNCOOC(CH3)3

H3COCO

O

H3C

OH

CH3

HO

CH3

HO

H

H OCOC6H5

O

OCOCH3

10-Deacetyl-baccatin III

Flavopiridol lµ mét trong c¸c t¸c nh©n b¾t nguån tõ thùc vËt lý thó nhÊt

hiÖn ®ang trong b−íc ph¸t triÓn, nã lµ chÊt øc chÕ kinase phô thuéc cyclin ®Çu

tiªn ®i vµo nghiªn cøu l©m sµng. Flavopiridol lµ mét flavon tæng hîp cã nguån

gèc tõ chÊt ancaloit thùc vËt rohitukine, ancaloit nµy ®Çu tiªn ®−îc ph©n lËp tõ

l¸ vµ th©n c©y Amoora rohituka vµ sau nµy tõ c©y Dysoxylum binectariferum.

C¬ chÕ t¸c dông cña flavopiridol bao hµm viÖc c¶n trë sù photphoryl hãa c¸c

kinase phô thuéc cyclin, ng¨n trë sù ho¹t hãa chóng vµ ng¨n c¶n sù tiÕn triÓn

cña chu tr×nh tÕ bµo ë giai ®o¹n khèi u 1 (G1) hoÆc 2 (G2). C¸c cuéc thö l©m sµng giai ®o¹n I ®· ®¹t ®−îc c¸c tû lÖ ®¸p øng ®¸ng khÝch lÖ ®èi víi nhiÒu lo¹i

u ¸c tÝnh r¾n vµ u huyÕt ¸c tÝnh. C¸c kÕt qu¶ ®ã ®· dÉn ®Õn sù b¾t ®Çu c¸c cuéc

thö l©m sµng giai ®o¹n II víi c¸c bÖnh nh©n m¾c c¸c bÖnh carcinoma ruét kÕt-

th¼ng, tuyÕn tiÒn liÖt, tÕ bµo thËn vµ phæi tÕ bµo kh«ng nhá, còng nh− u

lymph« kh«ng Hodgkin vµ bÖnh b¹ch cÇu lymph« m¹n tÝnh.

OH

O

O CH3

HO

O

C

CH3

O

HO

O

CH3

O

OH

S

C

HO

CH3

S

R

O

N

H

CH3

O

Rohitukine Homoharringtonine (absolute configuration)

Mét sè t¸c nh©n cã nguån gèc thùc vËt kh¸c hiÖn còng ®ang ®−îc nghiªn

cøu. ThÝ dô, homoharringtonine, mét ancaloit ®−îc ph©n lËp tõ c©y Cephalotaxus

harringtonia cña Trung Quèc, thÓ hiÖn tÝnh hiÖu qu¶ chèng nhiÒu bÖnh b¹ch cÇu

kh¸c nhau. C¬ chÕ t¸c dông chñ yÕu cña homoharringtonine lµ øc chÕ sù tæng

hîp protein, ng¨n c¶n sù tiÕn triÓn cña chu tr×nh tÕ bµo. 4-Ipomeanol lµ mét

dÉn xuÊt furan ®éc ®èi víi phæi ®−îc ph©n lËp tõ cñ khoai lang (Ipomoeca

batatas) bÞ nÊm Fusarium solani hoÆc Ceratocystis fimbriata lµm h− h¹i vµ

®ang ®−îc ®¸nh gi¸ trªn l©m sµng vÒ t¸c dông chèng ung th− ®Æc hiÖu ®èi víi

bÖnh ung th− phæi. Hîp chÊt nµy chuyÓn hãa thµnh c¸c s¶n phÈm chuyÓn hãa

liªn kÕt víi DNA nhê sù ho¹t hãa chuyÓn hãa bëi c¸c enzym cytochrome

P450 cã mÆt trong c¸c tÕ bµo phæi. β-Lapachone ((tõ gç lâi cña c©y tÕch,

Tectona grandis) lµ mét chÊt øc chÕ DNA topoisomerase I g©y ra sù chËm trÔ

cña chu tr×nh tÕ bµo ë giai ®o¹n G1 hoÆc S (tæng hîp) tr−íc khi g©y ra sù chÕt cña tÕ bµo do ch−¬ng tr×nh hãa hoÆc do ho¹i tö trong nhiÒu lo¹i tÕ bµo

carcinoma ë ng−êi, bao gåm buång trøng, ruét kÕt, phæi, tuyÕn tiÒn liÖt vµ vó.

Mét t¸c nh©n míi n÷a còng ®ang ®−îc thö l©m sµng lµ combretastatin A4

phosphate (CA4-P). Combretastatin A4 lµ mét hîp chÊt thiªn nhiªn ®−îc ph©n

lËp tõ c©y Combretum caffrum cña Nam Phi. ChÊt nµy lµ mét dÉn xuÊt cis-

stilben liªn kÕt ®−îc vµo cïng mét vÞ trÝ liªn kÕt cña tubulin nh− colchicine,

colchicine lµ mét chÊt øc chÕ sù trïng hîp tubulin ®· ®−îc biÕt ®Õn. C¸c

nghiªn cøu réng r·i trªn c¸c khèi u ®−îc cÊy d−íi da vµ ë ®óng vÞ trÝ ë chuét

cßn cho thÊy combretastatin A4 cã thÓ ng¾t sù cung cÊp m¸u cho c¸c khèi u,

lµm “chÕt ®ãi” khèi u ®ang ph¸t triÓn, mµ vÉn duy tr× dßng m¸u ch¶y b×nh

th−êng ë c¸c m« b×nh th−êng ë bªn c¹nh.

O

H3CO

O

CH3

O

H3CO

CH3

P

OCH3

O

ONa ONa

O

OCH3

HO

O

Ipomeanol Combretastatin A4-phosphate (CA4-P) β-Lapachone

§ang ®−îc thö l©m sµng cßn cã mét sè ho¹t chÊt kh¸c ®−îc ph©n lËp tõ

c¸c loµi c©y mäc ë Trung Quèc, nh− lycobetaine, mét phenanthridinium

ancaloit bËc bèn ®−îc ph©n lËp tõ mét sè loµi c©y thuéc hä Amaryllidaceae,

thÝ dô tõ Lycoris radiata, ®−îc xem lµ cã t¸c dông ®iÒu trÞ ung th− cæ, buång

trøng vµ d¹ dµy; vµ indirubin lµ mét thµnh phÇn phô cã cÊu tróc bisindol víi

mét liªn kÕt 3,2′ trong c©y Indigo naturalis, idirubin thÓ hiÖn hiÖu qu¶ ®iÒu trÞ

cao trªn l©m sµng ë c¸c bÖnh nh©n bÞ bÖnh b¹ch cÇu tñy bµo m¹n tÝnh.

- O

O

N

H

N

O

N +

H

Lycobetain Indirubin

Liªn quan ®Õn t¸c dông chèng vµ dù phßng ung th− còng nh− t¸c dông

chèng viªm, gÇn ®©y ng−êi ta quan t©m nhiÒu ®Õn nhãm c¸c ent-kauran

ditecpenoit (thuéc ph©n líp ditecpen, C20; víi cÊu tróc lËp thÓ ent so víi cÊu

tróc gèc kauran) [20-33, vµ 15]. C¸c ent-kauran ditecpenoit ®−îc t×m thÊy ë

nhiÒu loµi c©y thuèc ®−îc dïng ®iÒu trÞ chèng viªm vµ khèi u trong y häc d©n

gian cña nhiÒu n−íc ch©u ¸, nh− tõ chi Isodon (cßn gäi lµ Rabdosia). NhiÒu

ent-kauran ditecpenoit thÓ hiÖn ho¹t tÝnh ®éc h¹i tÕ bµo ®èi víi nhiÒu dßng tÕ

bµo ung th− ng−êi [21-27], øc chÕ sù t¹o m¹ch [28], øc chÕ sù ho¹t hãa nh©n

tè phiªn m· NF-кB [29]; vµ nhiÒu ho¹t tÝnh kh¸c nh− kh¸ng vi sinh vËt, chèng

sèt rÐt, chèng sù kÕt tô tiÓu cÇu, chèng co th¾t [30-33].

§Æc biÖt tõ c©y Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara cña Trung Quèc

ng−êi ta ®· ph©n lËp ®−îc c¸c ent-kauran ditecpenoit oridinin vµ ponicidin,

c¸c ditecpenoit nµy ®· ®−îc ph¸t hiÖn lµ c¸c ho¹t chÊt ®éc h¹i tÕ bµo chñ yÕu

cña c¸c loµi Rabdosia [15]; chóng còng thÓ hiÖn ho¹t tÝnh chèng t¹o m¹ch

m¹nh [28]. Oridonin thÓ hiÖn t¸c dông ®éc h¹i tÕ bµo ®èi víi carcinoma cæ

tr−íng Ehrlich vµ bÖnh b¹ch cÇu L1210 ë chuét sau khi tiªm trong mµng bông

(i.p.) C¸c tû lÖ g©y chÕt tÕ bµo cña oridonin (15 mg/kg i.p.) ë ngµy 5 vµ ngµy 8

CH2

H3C

CH3

Oridonin Ponicidin

ë c¸c tÕ bµo L1210 lÇn l−ît lµ 73% vµ 39%.

Trong thö l©m sµng, 115 bÖnh nh©n bÞ bÖnh carcinoma thùc qu¶n kh«ng

phÉu thuËt ®−îc ®· ®−îc ®iÒu trÞ b»ng liÖu ph¸p hãa häc ®¬n thuÇn (nhãm A)

hoÆc b»ng liÖu ph¸p hãa häc céng R. rubescens (nhãm B). ë nhãm A, 10

trong sè 31 bÖnh nh©n (32,3%) ®−îc ®iÒu trÞ b»ng liÖu ph¸p hãa häc ®¬n

thuÇn ®· ®¸p øng sù ®iÒu trÞ, gåm 2 ®¸p øng bé phËn (sù tho¸i triÓn cña khèi u

lín h¬n 50%) vµ 8 ®¸p øng tèi thiÓu. ë nhãm B, 59 trong sè 84 bÖnh nh©n

(70,2%) ®· ®¸p øng sù ®iÒu trÞ, gåm 10 ®¸p øng hoµn toµn (khèi u tho¸i triÓn

100%), 16 ®¸p øng bé phËn vµ 33 ®¸p øng tèi thiÓu. Tû lÖ sèng sãt mét n¨m

cña nhãm A lµ 13,6%, cña nhãm B lµ 41,3%.

Trong mét cuéc thö l©m sµng kh¸c, 650 bÖnh nh©n m¾c bÖnh carcinoma

thùc qu¶n ë møc võa vµ møc nÆng ®· ®−îc ®iÒu trÞ b»ng sù phèi hîp liÖu ph¸p

hãa häc vµ R. rubescens hoÆc R. rubescens céng c¸c thuèc cæ truyÒn kh¸c

nhau cña Trung Quèc ®· ®−îc cÊp b»ng s¸ng chÕ. Bèn m−¬i bÖnh nh©n ®·

sèng sãt trªn 5 n¨m (tû lÖ sèng sãt trªn 5 n¨m lµ 6,15%); 32 trªn 6 n¨m; 23

trªn 10 n¨m, vµ 5 trªn 15 n¨m. Còng ®· cã th«ng b¸o lµ oridonin vµ ponicidin

®· ®−îc thö l©m sµng víi bÖnh nh©n ung th− thùc qu¶n [15].

Thuèc chèng viªm vµ gi¶m ®au cã nguån gèc thùc vËt ®−îc biÕt ®Õn

nhiÒu vµ sö dông réng r·i nhÊt lµ aspirin [13], chÊt nµy ®−îc coi lµ nguyªn

mÉu cña c¸c t¸c nh©n gi¶m ®au vµ chèng viªm nhÑ. C¸c thuèc chèng viªm

non-steroid vÉn ®−îc ®¸nh gi¸ so s¸nh víi aspirin. Nh÷ng cè g¾ng nh»m biÕn

c¶i hãa häc ph©n tö aspirin ®· dÉn ®Õn sù tæng hîp vµ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh

chèng viªm cña hµng tr¨m chÊt míi. MÆt kh¸c viÖc t×m kiÕm c¸c thuèc chèng

viªm míi tõ thùc vËt vÉn ®ang ®−îc tiÕp tôc. Trong mét bµi tæng quan míi

®©y, S. Darshan vµ Doreswamy [34] ®· nªu c¸c b»ng s¸ng chÕ ®−îc b¶o vÖ

cña c¸c thuèc chèng viªm th¶o méc cã nguån gèc tõ 38 loµi c©y. C¸c t¸c gi¶

nµy ®· nªu bËt vai trß cña c¸c thµnh phÇn trong c©y, nh− polysaccarit,

tecpenoit, curcuminoit, ancaloit,…, ®èi víi t¸c dông lµm gi¶m c¸c bÖnh viªm

bao gåm viªm khíp, bÖnh thÊp, viªm nang b·,… Mét vÊn ®Ò ®ang thu hót sù

quan t©m ®Æc biÖt cña c¸c nhµ nghiªn cøu ph¸t triÓn thuèc lµ t×m kiÕm c¸c

chÊt thiªn nhiªn cã t¸c dông øc chÕ nh©n tè phiªn m· NF-кB ®Ó ph¸t triÓn lµm

thuèc chèng viªm.

1.2 Nh©n tè phiªn m· NF-кB vµ bÖnh ung th− vµ viªm

1.2.1 Vµi nÐt vÒ nh©n tè phiªn m· NF-кB vµ bÖnh ë ng−êi

Khëi ®Çu víi sù ph¸t hiÖn ra nã bëi Sen vµ Baltimore vµo n¨m 1986 vµ liªn

tôc cho ®Õn ngµy nay nh©n tè phiªn m· NF-кB ®· thu hót sù quan t©m réng r·i

c¨n cø vµo sù ®iÒu chØnh kh¸c th−êng cña nã, sù ®a d¹ng cña c¸c t¸c nh©n

kÝch thÝch lµm cho nã ho¹t ®éng, c¸c gen vµ ®¸p øng sinh häc kh¸c nhau mµ

nã ®iÒu chØnh, vµ sù dÝnh lÝu hiÓn nhiªn cña nã tíi nhiÒu thø bÖnh kh¸c nhau ë

ng−êi [35-37].

Nh©n tè phiªn m· NF-кB ®iÒu chØnh nhiÒu qu¸ tr×nh sinh lý quan träng,

bao gåm c¸c qu¸ tr×nh ph¸t triÓn, c¸c ®¸p øng viªm vµ miÔn dÞch, sù t¨ng

tr−ëng cña tÕ bµo, ung th−, sù chÕt ®−îc ch−¬ng tr×nh hãa cña tÕ bµo

(apoptosis), vµ sù biÓu hiÖn cña mét vµi gen virót. Bëi vËy NF-кB còng lµ ®Ých

cña nhiÒu thuèc chèng ung th− vµ chèng viªm.

C¸c nh©n tè phiªn m· NF-кB lµ mét trong c¸c nhãm protein ®iÒu chØnh

gen thuéc nh©n chuÈn ®−îc nghiªn cøu nhiÒu nhÊt. ë c¸c ®éng vËt cã x−¬ng

sèng, NF-кB ®ang ho¹t ®éng cã thÓ lµ bÊt cø dime nµo trong sè nhiÒu homo-

vµ heterodime ®−îc t¹o thµnh bëi c¸c tiÓu ®¬n vÞ p50, p52, RelA (p65), RelB

vµ c-Rel. Trong c¸c ®iÒu kiÖn c¬ b¶n, NF-кB ®−îc gi÷ ë trong chÊt tÕ bµo,

trong mét tr¹ng th¸i kh«ng ho¹t ®éng, bëi mét protein ®Ó kiÒm chÕ cã liªn

quan ®−îc gäi lµ chÊt øc chÕ (I)кB (Inhibitor of кB; quan träng nhÊt trong sè

c¸c Inhibitor of кB cã thÓ lµ c¸c protein IкBα, IкBβ, vµ IкBε). IкB ch¾n c¶n

c¸c chuçi di chuyÓn vµo nh©n cña NF-кB vµ gi÷ NF-кB ë trong chÊt tÕ bµo.

Mét trong nh÷ng c¬ chÕ phæ biÕn nhÊt dÉn ®Õn sù ho¹t hãa NF-кB ®ßi hái

sù photphoryl hãa nhanh IкB (cô thÓ lµ ë serine-32 vµ -36 cña IкBα) ®Ó ®¸p

l¹i c¸c t¸c nh©n kÝch thÝch kh¸c nhau, thÝ dô c¸c t¸c nh©n kÝch thÝch g©y viªm

(xem Môc 1.2.3). IкB ®−îc photphoryl hãa lan táa réng nhanh chãng, vµ råi

IкB ®−îc lan táa réng lµ ®Ých cho sù tho¸i biÕn mau lÑ bëi 26S proteasome.

Sù tho¸i biÕn IкB gì bá sù ch¾n c¶n c¸c chuçi di chuyÓn vµo nh©n cña NF-

кB, v× vËy ®Ó cho NF-кB ®i vµo nh©n ®Ó ®iÒu khiÓn sù phiªn m· c¸c gen môc

tiªu.

C¸c c¬ chÕ lµm mÊt ho¹t tÝnh cña NF-кB sau khi cã ®· ®−îc ho¹t hãa bëi

mét sù kÝch thÝch g©y viªm ch¼ng h¹n, nh− vËy phôc vô nh− c¸c “c¸i h·m”

ph©n tö ®èi víi sù ho¹t hãa NF-кB ®ang tiÕn triÓn, ®· ®−îc m« t¶ t−¬ng ®èi râ.

Mét trong c¸c c¬ chÕ lµm mÊt ho¹t tÝnh cña NF-кB ®−îc biÕt râ nhÊt cã sù

tham gia cña IкBα. Vïng khëi ®Çu cña gen IкBα bao gåm ba vÞ trÝ liªn kÕt

NF-кB. V× thÕ khi NF-кB ®−îc ho¹t hãa th× nã kh«ng chØ kÝch thÝch sù biÓu

hiÖn cña c¸c gen g©y viªm, mµ cßn kÝch thÝch míi sù biÓu hiÖn cña chÊt øc

chÕ chÝnh nã, IкBα. Råi th× IкBα ®−îc tæng hîp míi l¹i cã thÓ lµm suy gi¶m

sù ho¹t hãa NF-кB ®ang tiÕn triÓn b»ng c¸ch l¹i ch¾n c¶n c¸c chuçi di chuyÓn

vµo nh©n cña NF-кB. Thªm vµo ®ã IкBα ®−îc tæng hîp míi ®i vµo nh©n ®Ó

liªn kÕt NF-кB ®−îc ho¹t hãa vµ råi cã thÓ ®−a NF-кB trë l¹i chÊt tÕ bµo dÓ

chÊm døt sù phiªn m· phô thuéc vµo NF-кB.

MÆc dï IкBα ®ãng vai trß trung t©m trong sù ho¹t hãa vµ lµm mÊt ho¹t

tÝnh cña NF-кB, b−íc h¹n chÕ tèc ®é trong sù ho¹t hãa NF-кB xem ra n»m ë

ho¹t tÝnh cña IкB kinase (IKK) ®−îc ®Þnh râ ®Æc ®iÓm c¸ch ®©y kh«ng l©u.

IKK gåm bëi ba tiÓu ®¬n vÞ; c¸c tiÓu ®¬n vÞ cã t¸c dông xóc t¸c IKKα vµ

IKKβ vµ mét tiÓu ®¬n vÞ ®Ó ®iÒu chØnh IKKγ. HiÖn nay IKK ®−îc thõa nhËn lµ

kinase quan träng nhÊt, sù ho¹t hãa IKK khëi ®Çu sù photphoryl hãa IкB mét

c¸ch ®Æc hiÖu ë c¸c gèc serine cã ®Çu cuèi NH2, dÉn ®Õn sù tho¸i biÕn IкB vµ

tiÕp ®ã lµ sù ho¹t hãa NF-кB.

Nãi tãm l¹i, sù ho¹t hãa NF-кB ®−îc ®iÒu chØnh mét c¸ch tinh vi ë nhiÒu

møc ®é (H×nh 1.1).

H×nh 1.1: C¸c c¬ chÕ ph©n tö cña sù ho¹t hãa NF-кB

1.2.2 Nh©n tè phiªn m· NF-кB vµ bÖnh ung th−

C¸c protein NF-кB lµ mét ®Ých ®Çy triÓn väng cho c¸c liÖu ph¸p chèng

ung th− míi [38-50]. Ung th− lµ mét sù rèi lo¹n t¨ng sinh cao

(hyperproliferative disorder), trong ®ã sù x©m nhËp (invasion) vµ sù t¹o m¹ch

(angiogenesis) dÉn ®Õn sù di c¨n khèi u (tumor metastasis). NhiÒu gen dµn

xÕp sù t¹o u vµ di c¨n ®−îc ®iÒu chØnh bëi nh©n tè phiªn m· NF-кB.

• NF-кB ®−îc ho¹t hãa bëi c¸c chÊt g©y ung th− vµ c¸c chÊt xóc tiÕn khèi u

NhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy NF-кB ®−îc ho¹t hãa bëi

c¸c chÊt g©y ung th− vµ c¸c chÊt xóc tiÕn khèi u kh¸c nhau, thÝ dô

benzo[a]pyren, sù bøc x¹ UV, c¸c phorbol este. Ch¼ng h¹n sù bøc x¹ UV ®·

®−îc chøng minh lµ g©y ra c¸c ph¶n øng s¹m n¾ng (s−ng tÊy, sù th©m nhiÔm

b¹ch cÇu, sù t¨ng s¶n biÓu b×, vµ sù tÝch tô c¸c cytokin g©y viªm) dÉn ®Õn ung

th− da, vµ sù øc chÕ NF-кB h¹n chÕ sù h− h¹i g©y ra bëi sù s¹m n¾ng.

• NF-кB lµ cÇn thiÕt cho sù sèng sãt cña tÕ bµo vµ sù t¨ng sinh cña tÕ bµo

C¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu ®· chØ ra r»ng sù ho¹t hãa NF-кB xóc tiÕn sù

sèng sãt cña tÕ bµo vµ sù ®iÒu chØnh xuèng cña NF-кB lµm cho tÕ bµo mÉn

c¶m víi sù chÕt ®−îc ch−¬ng tr×nh hãa (apoptosis) ®−îc g©y ra bëi c¸c cytokin

vµ c¸c t¸c nh©n ®iÒu trÞ hãa häc. C¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu còng cho thÊy sù

biÓu hiÖn cña NF-кB ®−îc ho¹t hãa xóc tiÕn sù t¨ng sinh cña tÕ bµo vµ sù øc

chÕ NF-кB dÉn ®Õn thñ tiªu sù t¨ng sinh.

• NF-кB ®iÒu chØnh c¸c gen tham gia vµo sù x©m nhËp vµ sù t¹o m¹ch cña tÕ

bµo khèi u

Sù x©m nhËp vµ sù t¹o m¹ch lµ c¸c sù kiÖn quyÕt ®Þnh ®èi víi sù di c¨n.

C¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu ®· chøng minh lµ nhiÒu gen kh¸c nhau tham gia

vµo sù x©m nhËp vµ sù t¹o m¹ch ®−îc ®iÒu chØnh bëi NF-кB. Chóng bao

gåm c¸c ph©n tö dÝnh b¸m tÕ bµo (ICAM-1, VCAM-1, ELAM-1), COX-2,

iNOS, uPA, MMP-9, MMP-2, VEGF, c¸c chemokin, vµ c¸c cytokin viªm. V×

vËy sù ng¨n chÆn ho¹t hãa NF-кB sÏ cã thÓ triÖt tiªu sù biÓu hiÖn cña c¸c gen

nµy, do ®ã, ng¨n c¶n sù di c¨n khèi u.

• NF-кB ®−îc biÓu hiÖn mét c¸ch c¬ ®Þnh trong c¸c tÕ bµo khèi u

Trong khi tõ nh÷ng ®iÒu miªu t¶ ë trªn cã thÓ thÊy râ NF-кB lµ cÇn thiÕt

cho sù t¨ng sinh, sù x©m nhËp vµ sù t¹o m¹ch cña tÕ bµo ung th− th× ng−êi ta

®· ph¸t hiÖn ®−îc lµ nhiÒu lo¹i tÕ bµo ung th− kh¸c nhau, bao gåm c¸c dßng tÕ

bµo bÖnh b¹ch cÇu, u lympho, u tñy, u mªlanin, c¸c lo¹i ung th− tuyÕn tiÒn

liÖt, ruét kÕt, vó, tuyÕn tôy, carcinoma cã v¶y ë ®Çu vµ cæ , ®· biÓu hiÖn d¹ng

ho¹t ®éng cña NF-кB mét c¸ch c¬ ®Þnh. Mét sè c«ng tr×nh nghiªn cøu cßn ®·

chøng minh ®−îc r»ng c¸c mÉu nhËn ®−îc tõ c¸c bÖnh nh©n ung th− còng biÓu

lé NF-кB c¬ ®Þnh. Ng−êi ta còng ®· chøng minh ®−îc r»ng sù biÓu hiÖn c¬

®Þnh cña TNF vµ IL-1 lµ nguyªn nh©n dÉn ®Õn sù biÓu hiÖn cña d¹ng ho¹t

®éng cña NF-кB ë u lympho da tÕ bµo T (do TNF) vµ bÖnh b¹ch huyÕt cÊp

tÝnh ë tñy x−¬ng (do IL-1). Sù k×m h·m viÖc s¶n xuÊt TNF vµ IL-1 ®· ®−îc

chøng minh lµ cã t¸c dông ®iÒu chØnh xuèng sù biÓu hiÖn cña NF-кB ho¹t

®éng, vµ viÖc nµy cã t−¬ng quan víi sù sù øc chÕ t¨ng sinh cña c¸c tÕ bµo ung

th− nµy.

• Sù ho¹t hãa NF-кB bÞ øc chÕ bëi c¸c t¸c nh©n dù phßng hãa häc

NhiÒu thÝ nghiÖm ®· ®−îc ph¸t triÓn nh»m x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dù phßng

hãa häc (chemopreventive) cña mét t¸c nh©n. §a sè t¸c nh©n cã t¸c dông dù

phßng hãa häc øc chÕ sù ho¹t hãa NF-кB. C¸c t¸c nh©n nµy lµ curcumin (tõ

cñ nghÖ, Curcuma longa ), resveratrol (tõ qu¶ nho, cã trong r−îu vang ®á),

emodin (cã trong loµi l« héi Aloe barbadensis; vµ trong cèt khÝ cñ,

Polygonum cuspidatum), c¸c polyphenol cña chÌ xanh (tõ l¸ chÌ, Camellia

sinensis), silymarin (tõ qu¶ c©y cóc gai, Silybum marianum), β-lapachone (tõ

gç lâi cña c©y tÕch, Tectona grandis),…. V× NF-кB ®iÒu chØnh sù biÓu hiÖn

cña rÊt nhiÒu gen tham gia vµo sù g©y ung th− nªn sù øc chÕ biÓu hiÖn cña c¸c

gen nµy th«ng qua viÖc øc chÕ sù ho¹t hãa NF-кB cã thÓ lµ mét trong c¸c c¬

chÕ mµ c¸c t¸c nh©n dù phßng hãa häc (chemopreventive agents) ph¸t huy t¸c

dông cña chóng.

• NF-кB ®−îc ho¹t hãa bëi c¸c t¸c nh©n ®iÒu trÞ hãa häc ®· dÉn ®Õn sù ®Ò

kh¸ng hãa chÊt

Ng−êi ta ®· ph¸t hiÖn ra r»ng hÇu hÕt c¸c t¸c nh©n ®iÒu trÞ hãa häc

(chemotherapeutic agents) ho¹t hãa NF-кB. C¸c t¸c nh©n nµy lµ taxol,

doxorubicin, daunorubicin, etoposide, vincristin, vinblastin, ara-C, cisplatin,

phenobarbital, tamoxifen, camptothecin,….Ngay c¶ sù bøc x¹ gamma,

thuêng dïng ®iÒu trÞ bÖnh nh©n ung th−, còng ®−îc thÊy ho¹t hãa NF-кB. Sù

ho¹t hãa NF-кB cã thÓ dÉn ®Õn sù chèng l¹i sù chÕt ®−îc ch−¬ng tr×nh hãa

cña c¸c tÕ bµo (apoptosis) th−êng ®−îc g©y ra bëi sù trÞ liÖu hãa häc hoÆc bëi

sù bøc x¹. Nh− thÕ trong khi ho¹t hãa apoptosis, còng t¸c nh©n Êy l¹i cã thÓ

ho¹t hãa NF-кB, vµ ®iÒu nµy cã thÓ dÉn ®Õn antiapoptosis.

• Sù øc chÕ NF-кB lµm cho c¸c tÕ bµo ung th− mÉn c¶m víi c¸c t¸c nh©n

®iÒu trÞ hãa häc vµ sù bøc x¹ ion hãa

HÇu hÕt c¸c t¸c nh©n ®iÒu trÞ hãa häc vµ sù bøc x¹ ion hãa g©y ra apoptosis

th«ng qua nhiÒu con ®−êng kh¸c nhau. Chóng còng ho¹t hãa antiapoptosis

th«ng qua sù ho¹t hãa NF-кB, ®iÒu nµy rót côc dÉn ®Õn sù ®Ò kh¸ng cña c¸c tÕ

bµo khèi u ®èi víi sù ®iÒu trÞ. V× nh− ®· biÕt hÇu hÕt c¸c t¸c nh©n dù phßng

hãa häc øc chÕ sù ho¹t hãa NF-кB, nªn c¸c t¸c nh©n ®iÒu trÞ hãa häc vµ sù

bøc x¹ gamma nªn ®−îc sö dông trong sù phèi hîp víi c¸c t¸c nh©n dù phßng

hãa häc trong viÖc ®iÒu trÞ ung th−. Ngoµi viÖc ng¨n c¶n sù ho¹t hãa NF-кB,

c¸c t¸c nh©n dù phßng hãa häc nh− curcumin vµ resveratrol còng ®−îc biÕt lµ

cã t¸c dông g©y ra apoptosis. Nh− vËy kh«ng gièng nh− c¸c t¸c nh©n ®iÒu trÞ

hãa häc, c¸c t¸c nh©n dù phßng hãa häc g©y ra apoptosis mµ kh«ng ho¹t hãa

con ®−êng antiapoptosis. V× hÇu hÕt c¸c t¸c nh©n dù phßng hãa häc lµ c¸c

s¶n phÈm cã nguån gèc thiªn nhiªn tõ thùc vËt, nªn ®éc tÝnh cña chóng

th−êng rÊt thÊp. §iÒu nµy cung cÊp thªm mét lý do c¨n b¶n cho viÖc ®iÒu trÞ

phèi hîp.

C¸c b»ng chøng ®−îc giíi thiÖu ë trªn cho thÊy sù ho¹t hãa NF-кB cã thÓ

dÉn ®Õn sù t¨ng sinh cña tÕ bµo khèi u, sù x©m nhËp, sù t¹o m¹ch, vµ sù di

c¨n. Nh− vËy sù øc chÕ NF-кB trong c¸c tÕ bµo ung th− cã thÓ cung cÊp thªm

mét ®Ých cho viÖc ng¨n ngõa, dù phßng ung th−. C¸c chÊt øc chÕ NF-кB ,

trong sè ®ã cã nhiÒu s¶n phÈm cã nguån gèc thiªn nhiªn tõ thùc vËt, còng cã

thÓ ®−îc xem xÐt ®Ó sö dông cho ®iÒu trÞ ung th−, cã thÓ lµ trong sù phèi hîp

víi c¸c t¸c nh©n ®iÒu trÞ hãa häc hay sù bøc x¹ gamma. ViÖc sö dông phèi

hîp c¸c t¸c nh©n ®iÒu trÞ hãa häc (chemotherapeutic agents) víi c¸c t¸c nh©n

dù phßng hãa häc (chemopreventive agents) cã thÓ lµ mét ph−¬ng thøc hîp lý

trong ®iÒu trÞ bÖnh ung th−.

1.2.3 Nh©n tè NF-кB vµ viªm

ý kiÕn cho r»ng cã mèi liªn kÕt gÇn gòi gi÷a viªm vµ sù g©y ung th− ®· cã

tõ l©u. Ch¼ng h¹n, c¸c t¸c nh©n cã tÝnh chÊt chèng viªm, nh− c¸c thuèc chèng

viªm non-steroid, bao gåm aspirin, piroxicam vµ indomethacin cã thÓ cã t¸c

dông dù phßng hãa häc chèng ung th−. Mét sè c«ng tr×nh nghiªn cøu trªn

ng−êi ®· cho thÊy viÖc sö dông ®Òu ®Æn aspirin lµm gi¶m nguy c¬ ung th− ruét

kÕt-th¼ng tíi kho¶ng 50%. C¶ hai m« h×nh in vitro vµ in vivo ®Òu gîi ra r»ng

c¸c thuèc chèng viªm non-steroid øc chÕ c¸c khèi u ruét kÕt th«ng qua sù c¶m

øng apoptosis, tøc sù chÕt ®−îc ch−¬ng tr×nh hãa cña c¸c tÕ bµo [46].

Vai trß then chèt cña NF-кB trong viªm ®· ®−îc chøng minh th«ng qua

nhiÒu nghiªn cøu thùc nghiÖm [44, 51-58]. C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu nµy ®· cho

thÊy NF-кB ®−îc ho¹t hãa bëi mét sè tÝn hiÖu vµ ®iÒu chØnh nhiÒu gen liªn

quan tíi ph¶n øng viªm. ThËt vËy, nh− ®· nãi ®Õn ë Môc 1.2.1, mét sè c¸c t¸c

nh©n kÝch thÝch g©y viªm (c¸c cytokin nh− TNF-α hoÆc IL-1, stress oxi hãa,

c¸c t¸c nh©n truyÒn nhiÔm, c¸c endotoxin) cã thÓ ho¹t hãa NF-кB trong mét

sè c¸c lo¹i tÕ bµo kh¸c nhau (xem H×nh 1.2). NF-кB ë d¹ng ho¹t ®éng cã thÓ

lÇn l−ît ho¹t hãa sù biÓu hiÖn cña nhiÒu trung gian viªm: c¸c cytokin (TNF-

α, IL-1, ΙL-6), c¸c chemokin (RANTES, IL-8), c¸c enzym g©y viªm (iNOS,

COX-2, c¸c lipoxygenase) vµ c¸c ph©n tö dÝnh b¸m (ICAM-1,…). MÆt kh¸c

c¸c cytokin ®−îc tæng hîp nµy l¹i cã thÓ trùc tiÕp ho¹t hãa NF-кB, vµ nh− vËy

thiÕt lËp mét vßng tù ®iÒu chØnh theo chiÒu d−¬ng cã thÓ khuÕch ®¹i sù ®¸p

øng viªm vµ kÐo dµi kho¶ng thêi gian viªm m¹n tÝnh.

GÇn ®©y h¬n, sù ho¹t hãa NF-кB ®· ®−îc quan s¸t thÊy ë c¸c m« h×nh

®éng vËt còng nh− ë c¸c bÖnh viªm ë ng−êi. Ch¼ng h¹n sù ho¹t hãa liªn tôc

NF-кB ®· ®−îc chøng minh trong vi tÕ bµo thÇn kinh ®Öm cña chuét bÞ m¾c

viªm n·o tñy thùc nghiÖm, trong c¸c tæn th−¬ng v÷a x¬ ®éng m¹ch, trong m«

ho¹t dÞch tõ c¸c ®éng vËt hoÆc bÖnh nh©n bÞ viªm ®a khíp d¹ng thÊp vµ trong

hen. C¸c th«ng tin ®· thu thËp ®−îc nµy ®· thiÕt lËp sù liªn quan vÒ mÆt l©m

sµng cña sù ho¹t hãa NF-кB trong c¸c tæn th−¬ng viªm.

NhiÒu thuèc chèng viªm kh¸c nhau, bao gåm c¸c chÊt chèng oxi hãa, c¸c

glucocorticoit, c¸c thuèc chèng viªm non-steroid (NSAIDs), c¸c chÊt øc chÕ

miÔn dÞch vµ c¸c hîp chÊt thùc vËt lµ c¸c chÊt øc chÕ con ®−êng NF-кB, gîi

ra r»ng sù øc chÕ NF-кB lµ mét phÇn quan träng cña ho¹t tÝnh chèng viªm cña

chóng. LiÖu ph¸p chèng NF-кB cung cÊp c¸c biÖn ph¸p øc chÕ ®ång thêi sù

biÓu hiÖn nhiÒu chÊt trung gian viªm, bao gåm TNF-α vµ IL-1, cã thÓ lµ mét

b−íc ph¸t triÓn míi trong ®iÒu trÞ c¸c bÖnh viªm.

H×nh 1.2: Vai trß trung t©m cña NF-кB trong viªm

1.3 Nghiªn cøu c©y khæ s©m B¾c Bé (Croton tonkinensis Gagnep.,

Euphorbiaceae)

C©y khæ s©m B¾c Bé mµ chóng t«i dïng ®Ó chiÕt t¸ch c¸c ho¹t chÊt ent-

kauran ditecpenoit mäc hoang vµ ®−îc trång kh¾p n¬i ë c¸c tØnh phÝa B¾c

n−íc ta. C©y dÔ trång vµ sau mét thêi gian ng¾n ®· cã thÓ thu h¸i lÊy nguyªn

liÖu. Mét −u ®iÓm n÷a lµ c©y khæ s©m B¾c Bé ®· ®−îc dïng phæ biÕn trong y

häc d©n gian cña ViÖt Nam vµ theo kinh nghiÖm d©n gian th× kh«ng ®éc [59-

61].

Ta dïng l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé. Theo GS. §ç TÊt Lîi [50], c©y

nµy ®−îc chó ý do l¸ cña nã ®−îc dïng trong ®¬n thuèc ®au d¹ dµy. L¸ khæ

s©m B¾c Bé cßn dïng ch÷a ung nhät, lë loÐt, viªm mòi, viªm loÐt d¹ dµy - t¸

trµng, lþ, ®au bông, tiªu hãa kÐm. Theo TS. Vâ V¨n Chi [61], l¸ khæ s©m B¾c

Bé th−êng dïng s¾c víi d©y ngÊy h−¬ng uèng thay trµ ®Ó ch÷a ®au bông l©m

r©m hay sau khi ¨n ®au bông khã tiªu.

Cho ®Õn nay, nghiªn cøu c©y khæ s©m B¾c Bé chØ ®−îc tiÕn hµnh bëi c¸c

nhµ khoa häc ViÖt Nam.

GS. Vò ThÞ Phan, ViÖn Sèt rÐt, Ký sinh trïng vµ C«n trïng, ®· s−u tÇm

®−îc mét bµi thuèc d©n gian ch÷a sèt rÐt ë Thanh Hãa gåm hai vÞ: l¸ khæ

s©m B¾c Bé (200 g), vá b−ëi ®µo (200 g), n−íc (600 ml), s¾c cßn 200 ml,

chia lµm hai lÇn uèng trong ngµy. Vò ThÞ Phan, §µo Béi Hoµn, Vò Thu

TuyÕt, Tr−¬ng V¨n Nh−, xuÊt ph¸t tõ bµi thuèc nµy ®· sö dông l¸ khæ s©m

B¾c Bé d−íi d¹ng thuèc s¾c hoÆc siro ®Ó ®iÒu trÞ 55 bÖnh nh©n sèt rÐt g©y

ra bëi Plasmodium falciparum vµ Plasmodium vivax. Thuèc thÓ hiÖn râ rÖt

t¸c dông øc chÕ ký sinh trïng sèt rÐt vµ h¹ sèt vµ kh«ng thÊy nh÷ng biÓu

hiÖn ®éc tÝnh, tuy nhiªn so víi c¸c thuèc tæng hîp th× t¸c dông cßn thÊp vµ

l−îng thuèc dïng cßn nhiÒu [62]. Theo TS. Tr−¬ng V¨n Nh− vµ céng sù

[63, 64], ho¹t chÊt cña l¸ khæ s©m B¾c Bé chñ yÕu thuéc c¸c líp flavonoit

vµ ancaloit, trong sè ®ã ancaloit toµn phÇn cã t¸c dông trªn ký sinh trïng

sèt rÐt, cßn nhãm flavonoit cã t¸c dông kh¸ng khuÈn.

Trong khu«n khæ mét kÕ ho¹ch nghiªn cøu dµi h¹n, chóng t«i (Phan

Tèng S¬n vµ céng sù) ®· ®i s©u nghiªn cøu c¸c hîp chÊt cã ho¹t tÝnh sinh häc

cña c©y khæ s©m B¾c Bé theo c¸ch ®Þnh h−íng bëi c¸c xÐt nghiÖm ho¹t tÝnh

sinh häc (bioactivity-guided) [65-81], víi sù quan t©m tr−íc hÕt ®Õn c¸c thµnh

phÇn tecpenoit cña c©y nµy. Cho ®Õn c¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu cña chóng t«i

®· kh«ng cã mét c«ng bè nµo vÒ c¸c hîp chÊt tecpenoit cña c©y khæ s©m B¾c

Bé. N¨m 1999 chóng t«i ®· c«ng bè kÕt qu¶ lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp ®−îc mét

hîp chÊt ent-kauran ditecpenoit míi tõ l¸ c©y khæ s©m B¾c Bé vµ x¸c ®Þnh

®−îc cÊu tróc hãa häc cña nã lµ ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl

axetat (1) [65, 66], chÊt 1 nµy lµ hîp chÊt ent-kauran ditecpenoit chñ yÕu cã

hµm l−îng cao nhÊt vµ ho¹t tÝnh sinh häc m¹nh nhÊt cña c©y. KÕt qu¶ x¸c

®Þnh cÊu tróc cña hîp chÊt gèc 1 cña chóng t«i lµ rÊt cã ý nghÜa ®èi víi viÖc

gi¶i cÊu tróc c¸c ent-kauran cã cÊu tróc t−¬ng tù kh¸c cña c©y nµy.

1 2 3 4 5 6 7

R1 = H R1 = OAc R1 = H R1 = H R1 = OAc R1 = OAc R1 = H

R2 = OAc R2 = H R2 = OAc R2 = H R2 = H R2 = H R2 = OAc

R3 = H R3 = OH R3 = OH R3 = OH R3 = OAc R3 = OH R3 = OH

R4 = OH R4 = OH R4 = OH R4 = OH R4 = OH R4 = OAc R4 = H

ViÖc thö ho¹t tÝnh sinh häc cña chÊt 1 b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p thö ®¸ng

tin cËy ®· cho nh÷ng kÕt qu¶ rÊt ®¸ng quan t©m. ChÊt 1 cã ho¹t tÝnh kh¸ng ký

sinh trïng sèt rÐt Plasmodium falciparum in vitro râ rÖt ®èi víi c¶ chñng nh¹y

lÉn chñng kh¸ng chloroquine [65, 68, 69] (n¬i thö: ViÖn Sèt rÐt, Ký sinh trïng

vµ C«n trïng). §Æc biÖt chÊt 1 cã ho¹t tÝnh ®éc h¹i tÕ bµo m¹nh ®èi víi c¸c

dßng tÕ bµo ung th− ng−êi Hep-G2 (ung th− gan, IC50 4,06 µg/ml), RD (ung

th− mµng tim, IC50 1,04 µg/ml), Fl (ung th− mµng tö cung, IC50 2,90 µg/ml);

vµ khØ VR (tiÒn ung th− thËn khØ, IC50 1,10 µg/ml [69] (n¬i thö: Phßng Thö

nghiÖm ho¹t tÝnh sinh häc, ViÖn Ho¸ häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn, ViÖn

Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam). Thªm vµo ®ã chÊt 1 cßn cã ho¹t tÝnh

kh¸ng khuÈn, kh¸ng nÊm in vitro râ rÖt ®èi víi Bacillus subtilis, Aspergillus

niger, Fusarium oxysporum vµ Candida albicans [69] (n¬i thö: Phßng thö

nghiÖm ho¹t tÝnh sinh häc, ViÖn Hãa häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn, ViÖn

Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam).

KÕt qu¶ nghiªn cøu cña chóng t«i còng ®· cho thÊy c¸c thµnh phÇn cña

c©y khæ s©m B¾c Bé cã thÓ ph©n thµnh hai líp chñ yÕu: c¸c ent-kauran

ditecpenoit vµ c¸c flavonoit glucozit (vitexin, isovitexin vµ tiliroside); ngoµi ra

cßn cã mét sè hîp chÊt steroit (β-sitosterol, stigmasterol) vµ ankyl ancol m¹ch

dµi (n-nonacosan-2-ol, n-triacontan-1-ol), c¸c chÊt nµy còng n»m trong ph©n

®o¹n lipoit cïng víi c¸c ditecpenoit. Thµnh phÇn c¸c ent-kauran ditecpenoit

cña c©y khæ s©m B¾c Bé kh¸ phong phó. Tæng céng chóng t«i ®· ph©n lËp vµ

x¸c ®Þnh ®−îc cÊu tróc hãa häc 18 ent-kauran ditecpenoit tõ c©y nµy, trong sè

®ã cã 13 hîp chÊt míi [65, 66, 70, 71, 77, 79, 80]. ChØ tÝnh riªng c¸c hîp chÊt

ent-kaur-16-en-15-one lµ c¸c chÊt mang cÊu tróc α-metylenxiclopentanon cã

thÓ dÉn ®Õn ho¹t tÝnh th× cho ®Õn nay chóng t«i ®· c«ng bè kÕt qu¶ lÇn ®Çu

tiªn ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh ®−îc cÊu tróc 13 hîp chÊt tõ c©y khæ s©m B¾c Bé,

trong sè ®ã cã 9 hîp chÊt míi. ë trang 23 cã nªu c«ng thøc cña 7 hîp chÊt

ent-kaur-16-en-15-one cã hµm l−îng t−¬ng ®èi cao trong l¸ c©y khæ s©m B¾c

Bé, trong sè ®ã cã 6 hîp chÊt míi lµ c¸c chÊt 1 (ho¹t chÊt chñ yÕu), 2, 3, 5,

6 vµ 7. C¸c kh¶o s¸t nhê ph−¬ng ph¸p S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC)

®−îc thùc hiÖn víi phÇn chiÕt metanol cña l¸ khæ s©m B¾c Bé vµ c¸c chÊt ph©n

lËp ®−îc ®· kh¼ng ®Þnh nguån gèc tù nhiªn cña c¸c chÊt nµy.

§Æc biÖt c¸c ent-kauran ditecpenoit míi mµ chóng t«i ph©n lËp ®−îc tõ

c©y khæ s©m B¾c Bé cã cÊu tróc hãa häc t−¬ng tù oridonin vµ ponicidin lµ c¸c

chÊt ®· thÓ hiÖn t¸c dông chèng khèi u m¹nh (xem PhÇn tæng quan ë trªn).

C¸c kÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh øc chÕ sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo ung th− víi ent-

kauran ditecpenoit tõ c©y khæ s©m B¾c Bé nh− nªu ë trªn ®· lµ mét ®ãng gãp

tÝch cùc vµo viÖc sµng läc ho¹t chÊt cña c©y nµy. Tuy nhiªn nh»m t¹o lËp c¬ së

khoa häc cho viÖc x¸c ®Þnh triÓn väng øng dông c¸c ent-kauran ditecpenoit

ph©n lËp ®−îc tõ c©y khæ s©m B¾c Bé vµo ®iÒu trÞ viªm vµ ung th−, chóng t«i

®· tiÕn hµnh thö ho¹t tÝnh cña chóng b»ng hai ph−¬ng ph¸p ®¸ng tin cËy vµ

hiÖn ®¹i: x¸c ®Þnh t¸c dông øc chÕ nh©n tè phiªn m· NF-κB vµ t¸c dông øc

chÕ enzym nitric oxide synthase (iNOS) [71]; kÕt qu¶ ®−îc nªu ë B¶ng 2.1

d−íi ®©y.

B¶ng 1.1: C¸c gi¸ trÞ IC50 (µM) cña c¸c ent-kauran ditecpenoit 1-4

Hîp chÊt 1 2 3 4

S¶n sinh NO 0,21 0,47 0,15 0,26 2,01 4,06

Parthenolide (®èi chøng) Aminoguanidine (®èi chøng)

trong c¸c thö nghiÖm ho¹t hãa NF-κB vµ s¶n sinh NO Ho¹t hãa NF-κB 0,10 0,42 0,07 0,11 2,34

Nh− vËy c¸c ent-kauran ditecpenoit cña c©y khæ s©m cã t¸c dông øc chÕ

sù ho¹t hãa NF-κB m¹nh h¬n rÊt nhiÒu so víi chÊt ®èi chøng Parthenolide,

mµ kh«ng cã ¶nh h−ëng tíi kh¶ n¨ng sèng ®−îc cña tÕ bµo ë nång ®é t¸c

dông trong c¸c thö nghiÖm MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide] trªn c¬ së cña phÐp so mµu [71]. C¸c ent-

kauran ditecpenoit cña c©y khæ s©m còng øc chÕ iNOS m¹nh h¬n hµng chôc

lÇn so víi aminoguanidine lµm ®èi chøng.

XuÊt ph¸t tõ nh÷ng kÕt qu¶ nghiªn cøu ®−îc nªu tãm t¾t ë trªn, n¨m

2003 chóng t«i ®· ®Ò xuÊt §Ò tµi Nghiªn cøu cÊp Nhµ n−íc nµy, vµ n¨m 2004

chóng t«i ®· ®Ò xuÊt l¹i. Trong c¶ hai lÇn ®Ò xuÊt cña chóng t«i ®Òu ®−îc chÊp

nhËn, dÉn ®Õn viÖc Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ ®· xÐt duyÖt cho thùc hiÖn §Ò

tµi Nghiªn cøu Khoa häc vµ C«ng nghÖ ®éc lËp cÊp Nhµ n−íc nµy.

Sau chóng t«i, Ph¹m Hoµng Ngäc vµ Ph¹m ThÞ Hång Minh còng ®·

nghiªn cøu c©y khæ s©m B¾c Bé vµ ®· chiÕt t¸ch ®−îc mét vµi dÉn xuÊt ent-

kauran cã ho¹t tÝnh [82, vµ c¸c tµi liÖu dÉn ë ®ã], tuy nhiªn nh÷ng chÊt nµy

n»m trong sè c¸c ent-kauran ditecpenoit cã ho¹t tÝnh sinh häc mµ chóng t«i ®·

ph©n lËp ®−îc tõ c©y nµy vµ ®· x¸c ®Þnh ®−îc cÊu tróc còng nh− kh¶o s¸t ho¹t

tÝnh cña chóng vµ ®· c«ng bè tr−íc ®ã (xin xem c¸c bµi b¸o 65, 66, 69, 70,

71, 77, 79, 80] cña chóng t«i trong PhÇn Tµi liÖu tham kh¶o).

Tµi liÖu tham kh¶o

1. Pratt, W. B.; Ruddon, R. W. ; Ensminger, W. D.; Maybaum, J., The

anticancer drugs, Second Edition, Oxford University Press, New York –

Oxford (1994).

2. Ngäc Nh©n, Toµn c¶nh ®¹i dÞch ung th− toµn cÇu, ThÕ giíi míi, 2007, Sè

733, tr. 36-40.

3. Pham Thi Hoang Anh and Nguyen Ba Duc, The Situation with Cancer

Control in Vietnam, Jpn J Clin Oncol, 2002, 32 (Supplement 1), 92-97.

4. Lewis, A. J. and Manning, A. M., New targets for anti-inflammatory

drugs, Current Opinion in Chemical Biology, 1999, 3, 489-494.

5. Hamburger, M. and Hostettmann K., Bioactivity in Plants: The Link

between Phytochemistry and Medicine, Phytochemistry, 1991, 30(12),

3864-3874.

6. Clark, A. M., Natural Products as a Resource for New Drugs,

Pharmaceutical Research, 1996, 13(8), 1133-1141.

7. Newman, D. J.; Cragg, G. M.; and Snader, K. M., Natural Products as

Sources of New Drugs over the Period 1981-2002, J. Nat. Prod., 2003, 66,

1022-1037.

8. Lee, K.-H., Current Developments in the Discovery and Design of New

Drug Candidates from Plant Natural Products Leads, J. Nat. Prod., 2004,

67, 273-283.

9. Reutrakul, V.; Tuchinda, P.; Pohmakotr, M.; Sophasan, S.; Upatham, E. S.

and Yoosook, C., Cytotoxic and Anti-HIV Compounds from Tropical

Forests, Plenary Lecture, Tenth Asian Symposium on Medicinal Plants,

Spices and Other Natural Products, 2000, 18-23 November, Dhaka,

Bangladesh.

10. Grabley, S. and Sattler, I., Natural products for lead identification: Nature

is a valuable resource for providing tools, in Modern Methods of Drug

Discovery (ed. by Hillisch, A. and Hilgenfeld, R.), 87-107, Birkhäuser

Verlag, Switzerland (2003).

11. Cordell, G. A., Plants in Drug Discovery – Creating a New Vision, in

Novel Compounds from Natural Products in the New Millennium Potential

and Challenges (ed. by Tan, B. K.-H.; Bay, B.-H.; Zhu, Y.-Z.), World

Scientific Publishing, New Jersey (2004).

12. Yang, S. S.; Cragg, G. M.; Newman, D. J.; and Bader, J. P., Natural

Product-Based Anti-HIV Drug Discovery and Development Facilitated by

the NCI Developmental Therapeutics Program, J. Nat. Prod., 2001, 64,

265-277.

13. Rocha, A. B.; Lopes, R. M. and Schwartsmann, G., Natural products in

anticancer therapy, Current Opinion in Pharmacology, 2001, 1, 364-369.

14. Adams, J. and Elliott, P. J., New agents in cancer clinical trials, Oncogene,

2000, 19, 6687-6692.

15. Tang, W.; Hemm, I.; Bertram, B., Recent Development of Antitumor

Agents from Chinese Herbal Medicines; Part I. Low Molecular

Compounds, Planta Med, 2003, 69, 97-108.

16. Wong, R.; Sagar, C. M. and Sagar, S. M., Integration of Chinese medicine

into supportive cancer care: A modern role for an ancient tradition, Cancer

Treatment Reviews, 2001, 27, 235-246.

17. Lee, K.-H., Novel Antitumor Agents from Higher Plants, in Antitumor

Agents 197, pp. 569-596, John Wiley & Sons, Inc. (1999).

18. Miller, M. L.; Ojima, I., Chemistry and Chemical Biology of Taxane

Anticancer Agents, The Chemical Record, 2001, 1, 195-211.

19. Oberlies, N. H. and Kroll, D. J., Camptothecin and Taxol: Historic

Achievements in Natural Products Research, J. Nat. Prod., 2004, 67, 129-

135.

20. Takeda, Y.; Otsuka, H., in “Studies in Natural Products Chemistry”, Vol.

15, ed. by Atta-ur-Rahman, 111-185, Elsevier, Amsterdam (1995).

21. Zhang, H.; Fan, Z.; Tan, G. T.; Chai, H.-B.; Pezzuto, J. M.; Sun, H.; and

Fong, H. H. S., Pseudoirroratin A, a New Cytotoxic ent-Kaurene Diterpene

from Isodon pseudo-irrorata, J. Nat. Prod., 2002, 65, 215-217.

22. Jiang, B.; Yang, H.; Li, M.-L.; Hou, A.-J.; Han, Q.-B.; Wang, S.-J., Li, S.-

H., and Sun, H.-D., Diterpenoids from Isodon adenantha, J. Nat. Prod.,

2002, 65, 1111-1116.

23. Niu, X.-M.; Li, S.-H.; Mei, S.-X.; Na, Z., Zhao, Q.-S.; Lin, Z.-W.; and Sun,

H.-D., Cytotoxic 3,20-Epoxy-ent-Kaurane Diterpenoids from Isodon

eriocalyx var. laxiflora, J. Nat. Prod., 2002, 65, 1892-1896.

24. Niu, X.-M.; Li, S.-H.; Li, M. L.; Zhao, Q.-S.; Mei, S.-X.; Na, Z.; Wang, S.-

J.; Lin, Z.-W.; Sun, H.-D., Cytotoxic ent-Kaurane Diterpenoids from

Isodon eriocalyx var. laxiflora, Planta Med, 2002, 68, 528-533.

25. Jiang, B.; Hou, A.-J.; Li, M.-L.; Li, S.-H.; Han, Q.-B.; Wang, S.-J.; Lin, Z.-

W.; Sun, H.-D., Cytotoxic ent-Kaurane Diterpenoids from Isodon

sculponeata, Planta Med, 2002, 68, 921-925.

26. Li, S.-H.; Niu, X.-M.; Peng, L.-Y.; Zhang, H.-J.; Yao, P.; Sun, H.-D., ent-

Kaurane Diterpenoids from the Leaves of Isodon xerophilus, Planta Med,

2002, 68, 946-948.

27. Han, Q.-B.; Zhao, A.-H.; Zhang, J.-X.; Lu, Y.; Zhang, L.-L.; Zheng, Q.-T.;

and Sun, H.-D., Cytotoxic Constituents of Isodon rubescens var. lushiensis,

J. Nat. Prod., 2003, 66, 1391-1394.

28. Meade-Tollin, L. C.; Wijeratne, E. M. K.; Cooper, D.; Guild, M.; Jon, E,;

Fritz, A.; Zhou, G.-X.; Whitesell, L.; Liang, J.; and Gunatilaka, A. A. L.,

Ponicidin and Oridonin Are Responsible for the Antiangiogenic Activity of

Rabdosia rubescens, a Constituent of the Herbal Supplement PC SPES, J.

Nat. Prod., 2004, 67, 2-4.

29. Lee, J.-H.; Koo, T. H.; Hwang, B. Y.; and Lee, J. J., Kaurane Diterpene,

Kamebakaurin, Inhibits NF-кB by Directly Targeting the DNA-binding

Activity of p50 and Blocks the Expression of Antiapoptotic NF-кB Target

Genes, The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(21), 18411-18420.

30. Wilkens, M.; Alarcon, C.; Urzua, A.; Mendoza, L., Characterization of the

Bactericidal Activity of the Natural Diterpene Kaurenoic Acid, Planta

Med, 2002, 68, 452-454.

31. Thongtan, J.; Kittakoop, P.; Ruangrungsi, N.; Saenboonrueng, J.; and

Thebtaranonth, Y., New Antimycobacterial and Antimalarial 8,9-

Secokaurane Diterpenes from Croton kongensis, J. Nat. Prod., 2003, 66,

868-870.

32. Yang, Y.-L.; Chang, F.-R.; Wu, C.-C.; Wang, W.-Y.; and Wu, Y.-C., New

ent-Kaurane Diterpenoids with Anti-Platelet Aggregation Activity from

Annona squamosa, J. Nat. Prod., 2002, 65, 1462-1467.

33. Zamilpa, A.; Tortoriello, J.; Navarro, V.; Delgado, G.; Alvarez, L.,

Antispasmodic and Antimicrobial Diterpenic Acids from Viguiera

hypargyra Roots, Planta Med, 2002, 68, 281-283.

34. Darshan, S. and Doreswamy, R., Patented Antiinflammatory Plant Drug

Development from Traditional Medicine, Phytother. Res., 2004, 18, 343-

357.

35. Baldwin, A. S., Jr., The transcription factor NF-кB and human disease, The

Journal of Clinical Investigation, 2001, 107(1), 3-6.

36. Zingarelli, B.; Sheehan, M.; Wong, H. R., Nuclear factor-кB as a

therapeutic target in critical care medicine, Crit Care Med, 2003, 31(1,

Suppl.), S105-S111.

37. Epinat, J.-C. and Gilmore, T. D., Diverse agents act at multiple levels to

inhibit the Rel/NF-кB signal transduction pathway, Oncogene, 1999, 18,

6896-6909.

38. Bharti, A. C.; Aggarwal, B. B., Nuclear factor-kappa B and cancer: its role

in prevention and therapy, Biochemical Pharmacology, 2002, 64, 883-888.

39. Schwartz, S. A.; Hernandez, A.; Evers, B. M., The role of NF-кB/IкB

proteins in cancer: implications for novel treatment strategies, Surgical

Oncology, 1999, 8, 143-153.

40. Baldwin, A. S., Control of oncogenesis and cancer therapy resistance by

the transcription factor NF-кB, The Journal of Clinical Investigation, 2001,

107(3), 241-246.

41. Gilmore, T.; Gapuzan M.-E.; Kalaitzidis, D., Starczynowski, D., Rel/NF-

кB/IкB signal transduction in the generation and treatment of human

cancer, Cancer Letters, 2002, 181, 1-9.

42. Subbaramaiah, K. and Dannenberg, A. J., Cyclooxygenase 2: a molecular

target for cancer prevention and treatment, TRENDS in Pharmacological

Sciences, 2003, 24(2), 96-102.

1. Yamamoto, Y. and Gaynor, R. B., Therapeutic potential of inhibition of the

NF-кB pathway in the treatment of inflammation and cancer, The Journal

of Clinical Investigation, 2001, 107(2), 135-142.

2. Bours, V.; Bonizzi, G.; Bentires-Alj, M.;Bureau, F.; Piette, J.; Lekeux, P.;

Merville, M.-P., NF-кB activation in response to toxical and therapeutical

agents: role in inflammation and cancer treatment, Toxicology, 2000, 153,

27-38.

3. Sporn, M. B. and Suh, N., Chemoprevention of cancer, Carcinogenesis,

2000, 21(3), 525-530.

4. Tamini, R. M.; Lagiou, P.; Adami, H.-O. and Trichopoulos, D., Prospects

for chemoprevention of cancer, Journal of Internal Medicine, 2002, 251,

286-300.

5. Surh, Y.-J., Molecular mechanims of chemopreventive effects of selected

dietary and medicinal phenolic substances, Mutation Research, 1999, 428,

305-327.

6. Gerhäuser, C.; Klimo, K.; Heiss, E.; Neumann, I.; Gamal-Eldeen, A.;

Knauft, J.; Liu, G.-Y.; Sitthimonchai, S.; Frank, N., Mechanism-based in

vitro screening of potential cancer chemopreventive agents, Mutation

Research, 2003, 523-524, 163-172.

7. Fujiki, H., Two stages of cancer prevention with green tea, J Cancer Res

Clin Oncol, 1999, 125, 589-597.

8. Fujiki, H.; Suganuma, M.; Imai, K.; Nakachi, K., Green tea: cancer

preventive beverage and/or drug, Cancer Letters, 2002, 188, 9-13.

9. Tak, P. P. and Firestein, G. S., NF-кB: a key role in inflammatory diseases,

The Journal of Clinical Investigation, 2001, 107(1), 7-11.

10. Makarov, S. S., NF-кB as a therapeutic target in chronic inflammation:

recent advances, Molecular Medicine Today, 2000, 6, 441-448.

11. Surh, Y. -J.; Chun, K. -S.; Cha, H. -H.; Han, S. S.; Keum, Y. -S.; Park, K.

K.; Lee, S. S., Molecular mechanisms underlying chemopreventive

activities of anti-inflammatory phytochemicals: down-regulation of COX-2

and iNOS through suppression of NF-кB activation, Mutation Research,

2001, 480-481, 243-268.

12. Roshak, A. K., Callahan, J. F. and Blake, S. M., Small-molecule inhibitors

of NF-кB for the treatment of inflammatory joint disease, Current opinion

in Pharmacology, 2002, 2, 316-321.

13. Lewis, A. J. and Manning, A. M., New targets for anti-inflammatory

drugs, Current opinion in Chemical Biology, 1999, 3, 489-494.

14. Xagorari, A.; Papapetropoulos, A.; Mauromatis, A.; Economou, M.; Fotsis,

T.; and Roussos, C., Luteolin Inhibits an Endotoxin-Stimulated

Phosphorylation Cascade and Proinflammatory Cytokine Production in

Macrophages, The Journal of Pharmacology and Experimental

Therapeutics, 2001, 296, 181-187.

15. Castro, V.; Rüngeler, P.; Murillo, R.; Hernandez, E.; Mora, G.; Pahl, H. L.;

Merfort, I., Study of sesquiterpene lactones from Milleria quinqueflora on

their anti-inflammatory activity using the transcription factor NF-кB as

molecular target, Phytochemistry, 2000, 53, 257-263.

16. Surh, Y. -J., Anti-tumor promoting potential of selected spice ingredients

with antioxidative and anti-inflammatory activities: a short review, Food

and Chemical Toxicology, 2002, 40, 1091-1097.

17. Bé Y tÕ, D−îc liÖu ViÖt Nam, Nhµ XuÊt b¶n Y häc (1972), 310-311.

18. §ç TÊt Lîi, Nh÷ng c©y thuèc vµ vÞ thuèc ViÖt Nam, Nhµ XuÊt b¶n Khoa

häc vµ Kü thuËt (1991), 907-908.

19. Vâ V¨n Chi, Tõ ®iÓn c©y thuèc ViÖt Nam, Nhµ XuÊt b¶n Y häc (1997),

622-623.

20. Tr−¬ng V¨n Nh−, LuËn ¸n TiÕn sÜ, §¹i häc D−îc Hµ Néi (1992).

21. BÕ ThÞ ThuÇn, Tr−¬ng V¨n Nh−, NguyÔn Duy Khang, T¹p chÝ D−îc häc,

1991,Sè 1, 16-17.

22. BÕ ThÞ ThuÇn, Tr−¬ng V¨n Nh−, T¹p chÝ D−îc häc, 1991, Sè 5, 11-12.

23. Phan Tèng S¬n, V¨n Ngäc H−íng, Phan Minh Giang, Walter C. Taylor,

§ãng gãp vµo viÖc nghiªn cøu ho¹t chÊt sinh häc tõ c©y khæ s©m cho l¸

(Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae), T¹p chÝ Hãa häc, 1999, 37

(4), 1-2.

24. Phan, T. S.; Phan, M. G. and Taylor, W. C., An ent-Kaurane Diterpenoid

from Croton tonkinensis Gagnep., Australian Journal of Chemistry, 2000,

53, 1003-1005.

25. Phan, M. G.; Phan, T. S. and Taylor, W. C., A New Diterpenoid with

Antimalarial Activity from Croton tonkinensis Gagnep. of Vietnam, The

Tenth Asian Symposium on Medicinal Plants, Spices and Other Natural

Products, ASOMPS X, Dhaka, Bangladesh, 18-23 November 2000, Oral

presentation, OP 97.

26. Phan Tèng S¬n, B¸o c¸o tæng kÕt §Ò tµi QG-98-05 §¹i häc Quèc gia Hµ

Néi (1998-2000), Hå s¬ l−u t¹i Trung t©m Th«ng tin Khoa häc vµ C«ng

nghÖ Quèc gia, 24 Lý Th−êng KiÖt, Hµ Néi, Sè 4676/KQNC.

27. Phan Tèng S¬n, Lª HuyÒn Tr©m, Phan Minh Giang, §ãng gãp vµo viÖc

nghiªn cøu thµnh phÇn hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc c©y khæ s©m cho l¸

(Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae), T¹p chÝ Hãa häc, 2002, 40

(Sè §B), 53-57.

28. Phan, M. G.; Lee, J. J.; Phan T. S. , Further Study on Chemical

Constituents of Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae, in English,

T¹p chÝ Hãa häc, 2003, 41(1), 1.

29. Phan, M. G.; Jin, H. Z.; Phan T. S.; Lee, J. H.; Hong, Y. S. and Lee, J. J.,

ent-Kaurane Diterpenoids from Croton tonkinensis Inhibit LPS-Induced

NF-ĸB Activation and NO Production, Journal of Natural Products, 2003,

66 (9), 1217-1220.

30. Phan, M. G.; Lee, J. J.; Taylor, W. C.; Phan, T. S., Chemical constituents

and biological activities of Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae, 8th

Eurasia Conference on Chemical Sciences (EuAsC2S-8), October 21-24,

2003, Hanoi, Vietnam, 350.

31. Phan, M. G.; Lee, J. J.; Taylor, W. C. and Phan, T. S., Chemical

Constituents and Therapeutic Potential of the Vietnamese Medicinal Plant

Croton tonkinensis, Asian Symposium on Medicinal Plants, Spices and

Other Natural Products XI, Kunming, China, October 26-30, 2003, Oral

Presentation Session, PC-OP-11.

32. Phan, M. G.; Jin, H. Z.; Lee, J. J., ent-Kaurane diterpenoids from Croton

tonkinensis inhibit LPS-induced transcription factor NF-кB activation and

NO production, The 52th Annual Convention of the Pharmaceutical

Society of Korea, Daegu, Korea, 17-18 April 2003, Oral presentation,

Proceedings paper, 120.

33. Phan, M. G.; Lee, J. J.; Phan, T. S. , Flavonoid glucosides from the leaves

of Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae, in English, T¹p chÝ Hãa

häc, 2004, 42(1), 125-128.

34. Phan, M. G.; Phan, T. S. , Two long chain alkyl alcohols from the leaves

of Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae, in English, T¹p chÝ Hãa

häc, 2004, 42(1),132.

35. Phan, M. G.; Phan, T. S.; Lee, J. J.; and Otsuka, H., Four ent-Kaurane-

Type Diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep., Chem. Pharm. Bull.,

2004, 52(7), 879-882.

36. Phan, M. G.; Phan, T. S.; Lee, J. J. and Otsuka, H., ent-Kaurane-type

Diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep., The 51th (Year 2004)

Annual Meeting of the Japanese Society of Pharmacognosy, Kobe, Japan,

9-10 September 2004, Proceedings paper, 105.

37. Phan, M. G.; Phan, T. S.; Hamada Y.; and Otsuka, H., Cytotoxic

Diterpenoids from Vietnamese Medicinal Plant Croton tonkinensis

Gagnep., Chem. Pharm. Bull., 2005, 53(3), 296-300.

38. Phan, M. G.; Otsuka, H.; Phan, T. S. , Three minor ent-kaur-16-ene-type

diterpene from Croton tonkinensis Gagnep., in English, T¹p chÝ Hãa häc,

2005, 43(2), 263-264.

39. Phan, M. G.; Phan, T. S.; Hamada Y.; and Otsuka, H., Cytotoxic

diterpenoids from Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis

Gagnep., The 125th Annual Meeting of The Pharmaceutical Society of

Japan, Tokyo, Japan, 29-31 March 2005, Proceedings paper, 159.

40. Ph¹m ThÞ Hång Minh, Ph¹m Hoµng Ngäc, ent-(16S)-7β-hi®roxy-18-

axetoxykauran-15-on, mét kauran-ditecpen míi, ph©n lËp tõ c©y khæ s©m

cho l¸ (Croton tonkinensis Gagnep.), T¹p chÝ Hãa häc, 2003, 41(2), 104-

109.

Ch−¬ng 2

NGHI£N CøU QUY TR×NH CHIÕT T¸CH ENT-KAURAN DITECPENOIT Tõ C¢Y KHæ S¢M B¾C Bé

Néi dung nghiªn cøu ®−îc ®Ò ra cho phÇn nµy lµ x©y dùng quy tr×nh æn

®Þnh ë quy m« Phßng thÝ nghiÖm cho phÐp chiÕt t¸ch ent-kauran ditecpenoit

cã ho¹t tÝnh chèng ung th− vµ chèng viªm tõ c©y khæ s©m B¾c Bé (Croton

tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) ®Ó thu nhËn ho¹t chÊt chñ yÕu 1 vµ ChÕ

phÈm CT-2005 giµu ho¹t chÊt ent-kauran, vµ ¸p dông quy tr×nh chiÕt t¸ch nµy

nµy vµo quy m« 10 kg l¸ khæ s©m kh«/mÎ ®Ó thu nhËn vµ s¶n xuÊt ChÕ phÈm CT-2005 cung cÊp cho c¸c kh¶o s¸t ho¹t tÝnh sinh häc in vitro vµ in vivo.

2.1 Kh¶o s¸t ®Þnh h−íng cho viÖc x©y dùng quy tr×nh chiÕt t¸ch

Nh− ®· nªu ë Môc 1.3, thµnh phÇn hãa häc cña c©y khæ s©m B¾c bé

(Croton tonkinensis Gagnep.) kh¸ phøc t¹p. KÕt qu¶ nghiªn cøu cña chóng t«i

®· cho thÊy l¸ c©y khæ s©m B¾c Bé cã chøa c¸c hîp chÊt thuéc hai líp chñ

yÕu lµ ent-kauran ditecpenoit vµ flavonoit glucozit, ngoµi ra cßn cã mét sè hîp

chÊt steroit vµ ankyl ancol m¹ch dµi. C¸c ent-kauran ditecpenoit xuÊt hiÖn

trong l¸ c©y khæ s©m B¾c Bé kh¸ phong phó, víi tæng céng 18 hîp chÊt lo¹i

nµy ®· ®−îc chóng t«i ph©n lËp x¸c ®Þnh cÊu tróc cho ®Õn nay, trong sè ®ã cã

13 hîp chÊt míi. C¸c kh¶o s¸t nhê ph−¬ng ph¸p S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao

(HPLC) ®−îc thùc hiÖn víi l¸ c©y khæ s©m B¾c Bé vµ c¸c hîp chÊt ph©n lËp

®−îc ®· kh¼ng ®Þnh nguån gèc thiªn nhiªn cña c¸c chÊt nµy. §¸ng chó ý lµ sù

xuÊt hiÖn nhiÒu hîp chÊt ent-kaur-16-en-15-one lµ c¸c chÊt mang cÊu tróc α-

metylenxiclopentanon cã thÓ dÉn ®Õn c¸c ho¹t tÝnh sinh häc kh¸c nhau (13

hîp chÊt, trong sè ®ã cã 9 chÊt míi); ë trang 23 cã nªu c«ng thøc cña 7 trong

sè 13 hîp chÊt nµy, víi ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) lµ

hîp chÊt ent-kauran ditecpenoit chñ yÕu cã hµm l−îng cao nhÊt vµ thuéc vµo

sè c¸c chÊt cã ho¹t tÝnh sinh häc m¹nh nhÊt cña c©y.

KÕt qu¶ kh¶o s¸t cña chóng t«i ®· cho thÊy c¸c ent-kaur-16-en-15-one

cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®Òu cã ho¹t tÝnh ®éc h¹i tÕ bµo m¹nh ®èi víi c¸c

dßng tÕ bµo ung th− ng−êi Hep-G2 (ung th− gan - Hepatocellular carcinoma,

gi¸ trÞ IC50 (µg/ml) n»m trong kho¶ng tõ 0,12 ®Õn 4,06), RD (ung th− mµng

tim - Rhabdosarcoma, tõ 1,04 ®Õn 1,67), vµ LU ( ung th− phæi –Lung cancer,

tõ 0,25 ®Õn 1,75). C¸c kÕt qu¶ thö còng ®· cho thÊy c¸c ent-kauran ditecpenoit

1-4 cã t¸c dông øc chÕ m¹nh nh©n tè phiªn m· NF-кB vµ enzym nitric oxide

synthase (iNOS) (xem Môc 1.3).

Chóng t«i ®· tiÕn hµnh mét sè kh¶o s¸t c¬ b¶n nh»m ®Þnh h−íng cho qu¸

tr×nh chiÕt t¸ch ent-kauran ditecpenoit tõ l¸ c©y khæ s©m B¾c Bé.

C©y khæ s©m B¾c Bé (Croton tonkinensis Gagnep., H×nh 2.1) ®−îc thu

thËp ë ngo¹i thµnh Hµ Néi vµo th¸ng 7 ©m lÞch. Bé phËn ®−îc sö dông cho

viÖc chiÕt t¸ch lµ l¸ c©y khæ s©m B¾c Bé. Nguyªn liÖu thùc vËt ®−îc hong

kh« trong r©m, råi sÊy ë 40OC vµ xay thµnh bét. TiÕn hµnh ng©m chiÕt bét l¸

khæ s©m kh« b»ng metanol ë nhiÖt ®é phßng. Sau khi gép c¸c dÞch chiÕt vµ cÊt

lo¹i dung m«i d−íi ¸p suÊt gi¶m ta thu ®−îc phÇn chiÕt metanol d−íi d¹ng

mét chÊt láng ®Æc s¸nh cã mµu n©u thÉm.

Kh¶o s¸t phÇn chiÕt metanol nhËn ®−îc nµy b»ng ph−¬ng ph¸p S¾c ký

láng hiÖu n¨ng cao trªn pha ®¶o (RP HPLC) ®−îc ghÐp nèi víi mét

Photodiode Array (PDA) Detector ®· cho thÊy sù cã mÆt cña hai líp hîp chÊt

chñ yÕu nµy, ®ã lµ c¸c flavonoit glucozit (chiÕm 60,4% phÇn chiÕt metanol) vµ

c¸c ent-kauran ditecpenoit (11,4%) (xem H×nh 2.2). Kh¶o s¸t nhê on-line

HPLC UV còng ®· cho thÊy sù ph©n bè cña c¸c ent-kauran ditecpenoit 1-4 lµ

c¸c ho¹t chÊt ent-kauranoit chiÕm hµm l−îng cao cña l¸ c©y khæ s©m B¾c Bé

(xem H×nh 2.3).

H×nh 2.1: C©y khæ s©m B¾c Bé (Croton tonkinensis Gagnep.)

Nh− vËy c¸c kh¶o s¸t HPLC vµ ho¹t tÝnh sinh häc ®· cung cÊp nhiÒu

th«ng tin h÷u Ých vÒ ®é ph©n cùc vµ sù ph©n bè cña c¸c thµnh phÇn cña l¸ c©y

khæ s©m B¾c Bé, gióp cho sù lùa chän c¸c ph−¬ng ¸n chiÕt chän läc b»ng c¸c

dung m«i cã ®é ph©n cùc kh¸c nhau vµ c¸c hÖ dung m«i röa gi¶i s¾c ký cét ®Ó

thu ®−îc chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT-2005 víi hiÖu suÊt cao vµ chÊt l−îng æn

CT-MeOH

2000

UV_VIS_1 WVL:210 nm

ANAL #40 mAU

%D: 0.0 %

11 - 10.827

%C: 0.0 %

1800

100.0

10 - 10.160

1600

1400

1200

1000

800

2 - 1.547

17 - 23.653

600

3 - 1.660

400

23 - 31.0

1 - 1.427

15 - 20.607

19 - 25.940

21 - 28.613

14 - 19.880

16 - 21.940

200

13 - 19.547

20 - 28.267

22 - 28.960

12 - 15.753

9 - 9.153

18 - 24.120

4 - 2.807

7 - 6.860

8 - 7.313

5 - 5.4736 - 6.160

%B: 20.0 %

20.0

Flow: 1.000 ml/min

min

-200

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

18.0

20.0

22.0

24.0

26.0

28.0

30.0

32.0

®Þnh.

CT-MeOH

UV_VIS_1

WVL:210 nm

ANAL #57 mAU

Peak #1419.94 .0

Peak #1622.02 .0

Peak #1723.74 .0

Peak #1824.17 .0

228.4

230.1

227.2

OAc

5.0

AcO

H×nh 2.2: HPLC Profile cña phÇn chiÕt metanol tõ l¸ c©y khæ s©m B¾c Bé

2

3

1

4

702.1 698.1

0.0

190

250

300 350

400 450

500 550

600 650 700

750 80

190

250

300 350 400

450 500 550

600 650

700 750 80

190

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 80

.0 190

1 17 - 23.653

2

4

15 - 20.607

16 - 21.940

3

13 - 19.547 14 - 19.880

18 - 24.120

min

1184 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 -115

19.50

20.50

21.00

21.50

22.00

22.50

23.00

24.50

24.89

18.80

20.00

23.50

24.00

H×nh 2.3: On-line HPLC UV cña c¸c ho¹t chÊt ent-kauran ditecpenoit

cña l¸ c©y khæ s©m B¾c Bé

2.2 Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh chiÕt t¸ch

C¸c quy tr×nh chiÕt t¸ch ent-kauran ditecpenoit tõ c©y khæ s©m B¾c Bé

cÇn ®¸p øng c¸c yªu cÇu c¬ b¶n: ph©n lËp ®−îc ho¹t chÊt chñ yÕu 1 vµ ChÕ

phÈm CT-2005 víi hiÖu suÊt tèt vµ chÊt l−îng æn ®Þnh ®Ó cã thÓ dïng cho c¸c

kh¶o s¸t ho¹t tÝnh sinh häc; kh«ng sinh ra c¸c chÊt t¹o t¸c (artefacts) do m«i

tr−êng chiÕt t¸ch kh«ng thÝch hîp (cã mÆt axit, kiÒm,…), ®iÒu nµy cÇn ®−îc

®Æc biÖt l−u ý, v× c¸c hîp chÊt tecpenoit th−êng dÔ ®i vµo c¸c ph¶n øng chuyÓn

vÞ.

C¸c quy tr×nh chiÕt t¸ch ®· ®−îc x©y dùng th«ng qua viÖc tiÕn hµnh c¸c

thùc nghiÖm ®−îc lÆp l¹i nhiÒu lÇn, cho ®Õn khi ®¹t ®−îc kÕt qu¶ æn ®Þnh.

2.2.1 Quy tr×nh 1

Quy tr×nh chung:

Bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc ®un håi l−u c¸ch thñy víi axeton

trong 2 giê. §Ó nguéi hçn hîp, råi läc lÊy dÞch chiÕt ra khái phÇn b· trªn phÔu

läc Buchner. DÞch chiÕt ®−îc läc l¹i trªn giÊy läc ®Ó lo¹i hÕt b· l¸ khæ s©m

B¾c Bé, sau ®ã c« c¸ch thñy ®Ó lo¹i hÕt axeton. PhÇn cÆn chiÕt ®−îc hßa tan

vµo dung dÞch etanol-n−íc 70%, råi chiÕt b»ng petrolete (kho¶ng s«i 30-60OC)

®Ó lo¹i bá phÇn c¸c chÊt kh«ng ph©n cùc vµ c¸c chÊt mµu, tiÕp ®ã c« d−íi ¸p

suÊt gi¶m ®Ó lo¹i etanol ra khái dÞch etanol-n−íc råi chiÕt b»ng benzen. C¸c

dÞch chiÕt benzen ®−îc gép chung, röa b»ng dung dÞch natri cacbonat ®Õn pH

= 9, råi b»ng n−íc ®Õn pH = 7, lµm khan b»ng natri sunfat, råi c« quay d−íi

¸p suÊt gi¶m ®Ó thu phÇn chiÕt benzen (B) . Quy tr×nh chiÕt ®−îc chØ ra ë S¬

®å 2.1.

TiÕn hµnh ph©n t¸ch s¾c ký cét víi phÇn chiÕt B ®Ó thu ho¹t chÊt ent-kauran

ditecpenoit (chÊt 1, ChÕ phÈm CT-2005).

ThÝ dô:

Cho 1,0 kg bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé vµo mét b×nh cÇu cã dung tÝch

4 lit, cho axeton vµo b×nh ®Õn ngËp nguyªn liÖu, l¾p èng sinh hµn håi l−u, vµ

®un s«i c¸ch thñy trong 2 giê. §Ó nguéi, råi läc lÊy dÞch chiÕt ra khái phÇn b·

l¸ c©y trªn phÔu Buchner. DÞch chiÕt ®−îc läc l¹i trªn giÊy läc ®Ó lo¹i hÕt b·

nguyªn liÖu, råi c« quay d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó lo¹i hÕt axeton. PhÇn cÆn thu

®−îc ®−îc hßa tan vµo dung dÞch etanol-n−íc 70%, råi chiÕt víi petrolete

(kho¶ng s«i 30-60OC). DÞch etanol-n−íc ®−îc c« d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó lo¹i

etanol, råi chiÕt bèn lÇn b»ng benzen. C¸c dÞch chiÕt benzen ®−îc gép chung,

röa b»ng dung dÞch natri cacbonat ®Õn pH = 9, råi b»ng n−íc ®Õn pH = 7, råi

lµm khan b»ng natri sunfat. Sau khi c« quay d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó lo¹i dung

m«i ta thu ®−îc phÇn chiÕt benzen (B, 0,465% so víi khèi l−îng nguyªn liÖu

l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé).

PhÇn chiÕt benzen (B, 4,6g ®−îc ph©n t¸ch trªn cét silica gel (0,063-0,100

mm, Merck), röa gi¶i b»ng hÖ dung m«i toluen/ etyl axetat (7/3, v/v), thu 75

ph©n ®o¹n ®−îc gom thµnh 8 nhãm ph©n ®o¹n (B1-B8) trªn c¬ së TLC (silica

gel 60 F254, Merck; toluen/ etyl axetat (7/3); ph¸t hiÖn vÖt b»ng c¸c thuèc thö Dragendorff-Munier vµ vanilin/axit sunfuric 1%) vµ b»ng soi d−íi ¸nh s¸ng

UV). C¸c ph©n ®o¹n B2 (1,0 g) vµ B3 (0,26 g) ®−îc gép chung, råi ph©n t¸ch

mét lÇn n÷a qua cét silica gel (0,063-0,100 mm, Merck), röa gi¶i b»ng hÖ

dung m«i toluen/ etyl axetat (7/3, v/v), thu ®−îc 1,1 g ent-7β-hydroxy-15-

oxokaur-16-en-18-yl axetat (1), hiÖu suÊt ®¹t 0,11% so víi khèi l−îng

nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé.

Bét l¸ kh« c©y Khæ s©m B¾c Bé

chiÕt axeton nãng

B∙ l¸

DÞch chiÕt axeton

1. cÊt lo¹i axeton 2. hoµ tan cÆn trong etanol-n−íc 70% 3. chiÕt petrolete (30-60oC)

DÞch chiÕt petrolete

DÞch etanol-n−íc

1. cÊt lo¹i etanol 2. chiÕt benzen 3. röa dÞch chiÕt b»ng dung dÞch Na2CO3 ®Õn pH=9 4. röa dÞch chiÕt b»ng n−íc ®Õn pH=7

DÞch chiÕt benzen

1. lµm khan b»ng Na2SO4 2. cÊt lo¹i benzen

PhÇn chiÕt benzen (B)

S¬ ®å 2.1: Quy tr×nh 1 chiÕt l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé

2.2.2 Quy tr×nh 2

Quy tr×nh chung:

Bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc ng©m chiÕt ë nhiÖt ®é phßng víi

axeton. DÞch ng©m chiÕt ®−îc c« d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó lo¹i axeton. CÆn chiÕt

axeton ®−îc hßa tan trong dung dÞch metanol - n−íc 70% vµ chiÕt víi n-hexan

®Ó lo¹i c¸c hîp chÊt kh«ng ph©n cùc. C« dÞch metanol – n−íc nhËn ®−îc ®Ó

lo¹i metanol, råi chiÕt tiÕp víi benzen. C¸c dÞch chiÕt benzen ®−îc gép l¹i vµ

lµm khan. Sau khi cÊt lo¹i benzen d−íi ¸p suÊt gi¶m, ta thu ®−îc phÇn chiÕt

benzen chøa líp chÊt cã ®é ph©n cùc trung b×nh (ký hiÖu lµ B). Quy tr×nh chiÕt

®−îc chØ ra ë S¬ ®å 2.2.

TiÕn hµnh ph©n t¸ch s¾c ký cét víi phÇn chiÕt B ®Ó thu ho¹t chÊt ent-kauran

ditecpenoit (chÊt 1, ChÕ phÈm CT-2005).

ThÝ dô:

1,0 kg bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc ng©m chiÕt víi axeton ë nhiÖt

®é phßng ba lÇn, mçi lÇn trong ba ngµy. C¸c dÞch ng©m chiÕt ®−îc gép chung

vµ c« d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó lo¹i hÕt axeton. Hßa tan cÆn thu ®−îc vµo dung

dÞch metanol – n−íc 70% vµ chiÕt víi n-hexan, tiÕp ®ã c« dÞch metanol-n−íc

nhËn ®−îc d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó lo¹i metanol vµ chiÕt tiÕp víi benzen. C¸c

dÞch chiÕt benzen ®−îc gép l¹i, röa b»ng dung dÞch natri cacbonat 5% ®Õn pH

= 9, råi b»ng n−íc ®Õn pH = 7, vµ lµm khan b»ng natri sunfat. Sau khi cÊt lo¹i

benzen d−íi ¸p suÊt gi¶m, ta thu ®−îc phÇn chiÕt benzen (ký hiÖu lµ B, hiÖu

suÊt ®¹t 10,7 g, tøc 1,07% so víi khèi l−îng nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ

s©m B¾c Bé)..

10 g phÇn chiÕt B ®−îc ph©n t¸ch trªn cét silica gel (0,063-0,200 mm, Merck),

röa gi¶i b»ng n-hexan/axeton (gradient 20/1 – 1/1, v/v) thu ®−îc 72 ph©n ®o¹n

®−îc chia thµnh 4 nhãm ph©n ®o¹n (B1 ®Õn B4).

Nhãm ph©n ®o¹n B2 (2,3 g) ®−îc ph©n t¸ch tiÕp trªn cét cét silica gel (0,063-

0,100 mm, Merck), röa gi¶i b»ng n-hexan/axeton (10/1, v/v) thu ®−îc 20 ph©n

®o¹n ®−îc chia thµnh 3 nhãm ph©n ®o¹n (B2.1 ®Õn B2.3).

Nhãm ph©n ®o¹n B2.2 t−¬ng ®èi s¹ch, ®−îc tinh chÕ tiÕp b»ng s¾c ký cét

nhanh (FC) trªn silica gel (0,040-0,063 mm, Merck), röa gi¶i b»ng n-

hexan/axeton (10/1, v/v), thu ®−îc 0,748 g chÊt 1 (hiÖu suÊt ®¹t 0,08% so víi

khèi luîng nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé).

Bét l¸ kh« c©y Khæ s©m B¾c Bé

1. ng©m chiÕt axeton 4 lÇn (mçi lÇn 3 ngµy) 2. läc kiÖt trªn phÔu Buchner

B∙ läc

DÞch läc

cÊt lo¹i axeton

CÆn axeton

hoµ tan trong metanol-n−íc 70%

DÞch metanol-n−íc

chiÕt n-hexan

PhÇn chiÕt n-hexan

DÞch metanol-n−íc

1. cÊt lo¹i hÕt metanol 2. chiÕt benzen

DÞch chiÕt benzen

1. röa b»ng Na2CO3 5% (pH=9) 2. röa b»ng n−íc cÊt (pH=7) 3. lµm kh« b»ng Na2SO4 4. cÊt lo¹i benzen

PhÇn chiÕt benzen

S¬ ®å 2.2: Quy tr×nh 2 chiÕt l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé

2.2.3 Quy tr×nh 3

Quy tr×nh chung:

Bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc ng©m chiÕt ë nhiÖt ®é phßng víi

diclometan lµ mét dung m«i cã ®é ph©n cùc trung b×nh ®Ó thu nhËn líp chÊt

cã ®é ph©n cùc trung b×nh. C« dÞch chiÕt ®Ó lo¹i diclometan, thu ®−îc phÇn

chiÕt diclometan (ký hiÖu lµ D). Quy tr×nh chiÕt ®−îc chØ ra ë S¬ ®å 2.3.

TiÕn hµnh ph©n t¸ch s¾c ký cét víi phÇn chiÕt D ®Ó thu ho¹t chÊt ent-kauran

ditecpenoit (chÊt 1, ChÕ phÈm CT-2005).

ThÝ dô:

C©n 0,3 kg bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé vµo mét b×nh cÇu cã dung tÝch

1 lit, råi ®æ diclometan vµo b×nh cho ®Õn ngËp mÉu. Sau ba ngµy ta g¹n läc lÊy

dÞch ng©m chiÕt diclometan. Ta lÆp l¹i qu¸ tr×nh ng©m chiÕt nµy thªm hai lÇn

n÷a. C¸c dÞch ng©m chiÕt ®−îc gép chung, råi c« ®Ó lo¹i hÕt diclometan, thu

®−îc phÇn chiÕt diclometan (ký hiÖu lµ D, 14,31 g, tøc 4,77% so víi khèi

l−îng nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé).

5 g phÇn chiÕt diclometan (tøc D) ®−îc ph©n t¸ch b»ng s¾c ký cét trªn silica

gel (0,063-0,200 mm, Merck), röa gi¶i b»ng n-hexan/etyl axetat (gradient

10/1 – 2/1, v/v), thu ®−îc 80 ph©n ®o¹n ®−îc chia thµnh 3 nhãm ph©n ®o¹n

(D1 ®Õn D3). Nhãm ph©n ®o¹n D2 (0,5 g) ®−îc ph©n t¸ch tiÕp b»ng s¾c ký cét

trªn silica gel (0,063-0,200 mm, Merck), röa gi¶i b»ng n-hexan/axeton (6/1,

v/v), thu ®−îc 35 ph©n ®o¹n ®−îc chia thµnh 3 nhãm ph©n ®o¹n (D2.1 ®Õn

D2.3).

Nhãm ph©n ®o¹n D2.2 t−¬ng ®èi s¹ch, ®−îc tinh chÕ b»ng c¸ch röa b»ng hçn

hîp n-hexan-axeton, råi kÕt tinh l¹i trong axeton, cho 0,125 g chÊt 1 (hiÖu suÊt

®¹t 0,12 % so víi khèi l−îng nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé).

S¶n phÈm chÊt 1 thu ®−îc h¬i cã mµu xanh lôc nh¹t.

Bét l¸ kh« c©y Khæ s©m B¾c Bé

1. ng©m chiÕt víi ®iclometan 3 lÇn (mçi lÇn 3 ngµy) 2. läc kiÖt trªn phÔu Buchner

DÞch chiÕt ®iclometan

cÊt lo¹i ®iclometan

PhÇn chiÕt ®iclometan

S¬ ®å 2.3: Quy tr×nh 3 chiÕt l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé

2.2.4 Quy tr×nh 4

Quy tr×nh chung:

Bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc ng©m chiÕt ba lÇn víi metanol ë

nhiÖt ®é phßng . C« dÞch chiÕt d−íi ¸p suÊt gi¶m xuèng cßn 1/10 thÓ tÝch ®Ó

lo¹i metanol, råi pha lo·ng phÇn cÆn víi n−íc cÊt theo mét tû lÖ thÝch hîp.

DÞch metanol-n−íc ®−îc chiÕt lÇn l−ît víi petrolete (kho¶ng s«i 30-60OC),

diclometan vµ etyl axetat. Lµm khan c¸c dÞch chiÕt b»ng natri sunfat, råi cÊt

lo¹i dung m«i ®Ó thu c¸c phÇn chiÕt petrolete (PE), diclometan (D) vµ etyl

axetat (E) t−¬ng øng. Quy tr×nh chiÕt ®−îc chØ ra ë S¬ ®å 2.4.

TiÕn hµnh ph©n t¸ch s¾c ký cét víi phÇn chiÕt D ®Ó thu ho¹t chÊt ent-kauran

ditecpenoit (chÊt 1, ChÕ phÈm CT-2005).

ThÝ dô:

2,7 kg bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc ng©m chiÕt víi metanol ba

lÇn ë nhiÖt ®é phßng, mçi lÇn trong ba ngµy. C¸c dÞch chiÕt ®−îc gép chung,

c« d−íi ¸p suÊt gi¶m xuèng cßn 1/10 thÓ tÝch ban ®Çu, råi pha lo·ng víi n−íc

cÊt. DÞch metanol-n−íc ®−îc chiÕt lÇn l−ît víi petrolete (kho¶ng s«i 30-

60OC), diclometan vµ etyl axetat. Lµm khan c¸c dÞch chiÕt b»ng natri sunfat,

råi cÊt lo¹i dung m«i, thu phÇn chiÕt petrolete (ký hiÖu lµ PE, 45,9 g, tøc 1,7%

so víi khèi l−îng nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé), phÇn chiÕt

diclometan (D, 59,4 g, tøc 2,2%), vµ phÇn chiÕt etyl axetat (E, 16,2 g, tøc

0,6%).

(a) 10 g phÇn chiÕt diclometan (D) ®−îc ph©n t¸ch b»ng s¾c ký cét trªn silica

gel (cì h¹t 0,063-0,100 mm, Merck), röa gi¶i b»ng n-hexan/etyl axetat

(gradient), thu ®−îc 200 ph©n ®o¹n ®−îc chia thµnh 7 nhãm ph©n ®o¹n (D1

®Õn D7). Nhãm ph©n ®o¹n D4 (0,5 g) ®−îc ph©n t¸ch tiÕp b»ng tinh chÕ b»ng

s¾c ký cét nhanh (FC) trªn silica gel, röa gi¶i b»ng n-hexan/axeton (gradient,

20/1 – 3/1,v/v), thu 13 ph©n ®o¹n ®−îc chia thµnh 3 nhãm ph©n ®o¹n. Nhãm

ph©n ®o¹n D4.2 ®−îc kÕt tinh l¹i trong n-hexan, cho 0,318g chÊt 1 (hiÖu suÊt

®¹t 0,07 % so víi khèi l−îng nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé).

(b) 20 g phÇn chiÕt diclometan (D) ®−îc ph©n t¸ch b»ng s¾c ký cét trªn silica

gel (cì h¹t 0,063-0,100 mm, Merck), röa gi¶i b»ng n-hexan/axeton (gradient),

thu ®−îc 120 ph©n ®o¹n ®−îc chia thµnh 10 nhãm ph©n ®o¹n (D1 ®Õn D10).

Nhãm ph©n ®o¹n D5 (0,5 g) kÕt tinh khi dung m«i bay h¬i, s¶n phÈm kÕt tinh

®−îc röa b»ng n-hexan l¹nh, cho 0,640 g chÊt 1 (hiÖu suÊt ®¹t 0,07 % so víi

khèi l−îng nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé).

Bét l¸ kh« c©y Khæ s©m B¾c Bé

1. chiÕt víi metanol 2. läc kiÖt b»ng phÔu Buchner 3. gép cÊt lo¹i dung m«i xuèng 1/10 thÓ tÝch

B∙ l¸

PhÇn chiÕt metanol

1. pha lo·ng víi n−íc cÊt 2. chiÕt petrolete (30-60oC) 3. lµm kh« dÞch chiÕt b»ng Na2SO4 4. gép cÊt lo¹i dung m«i

DÞch metanol-n−íc

PhÇn chiÕt petrolete

1. chiÕt ®iclometan 2. lµm kh« dÞch chiÕt b»ng Na2SO4 3. gép cÊt lo¹i dung m«i

DÞch metanol-n−íc

PhÇn chiÕt ®iclometan

1. chiÕt etyl axetat 2. lµm kh« dÞch chiÕt b»ng Na2SO4 3. gép cÊt lo¹i dung m«i

DÞch metanol-n−íc

PhÇn chiÕt etyl axetat

S¬ ®å 2.4: Quy tr×nh 4 chiÕt l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé

2.2.5 Quy tr×nh 5

Quy tr×nh chung:

Bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc ng©m chiÕt hai lÇn víi metanol ë

nhiÖt ®é phßng . C« dÞch chiÕt d−íi ¸p suÊt gi¶m xuèng cßn 1/10 thÓ tÝch ®Ó

lo¹i metanol, råi pha lo·ng phÇn cÆn víi n−íc cÊt theo mét tû lÖ thÝch hîp.

DÞch metanol–n−íc ®−îc chiÕt lÇn l−ît víi n-hexan, diclometan vµ etyl axetat.

Lµm khan c¸c dÞch chiÕt b»ng natri sunfat, råi cÊt lo¹i dung m«i ®Ó thu c¸c

phÇn chiÕt n-hexan (H), diclometan (D) vµ etyl axetat (E) t−¬ng øng. Quy

tr×nh chiÕt ®−îc chØ ra ë S¬ ®å 2.5.

TiÕn hµnh ph©n t¸ch s¾c ký cét víi phÇn chiÕt D ®Ó thu ho¹t chÊt ent-kauran

ditecpenoit (chÊt 1, ChÕ phÈm CT-2005).

ThÝ dô:

1,1 kg bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc ng©m chiÕt víi metanol hai

lÇn ë nhiÖt ®é phßng, mçi lÇn víi 4 lit metanol trong ba ngµy. Sau mçi lÇn

ng©m chiÕt g¹n läc trªn phÔu Buchner ®Ó thu dÞch chiÕt. LÊy 100 g b· l¸ c©y

sau lÇn chiÕt thø hai ®em ng©m chiÕt tiÕp víi mét l−îng võa ®ñ metanol trong

ba ngµy ë nhiÖt ®é phßng, sau ®ã läc lÊy dÞch chiÕt vµ kiÓm tra b»ng TLC so

s¸nh víi ent-kauran ditecpenoit chuÈn. B»ng c¸ch nµy ®· cã thÓ chøng minh lµ

kh«ng cßn sù cã mÆt cña ent-kauran ditecpenoit trong dÞch ng©m chiÕt lÇn thø

ba nµy. C¸c dÞch läc cña hai lÇn ng©m chiÕt ®−îc gép chung råi c« d−íi ¸p

suÊt gi¶m xuèng cßn 800 ml vµ pha lo·ng víi n−íc cÊt. DÞch metanol-n−íc

®−îc chiÕt lÇn l−ît víi n-hexan vµ diclometan. Lµm khan dÞch chiÕt

diclometan b»ng natri sunfat, råi cÊt lo¹i dung m«i d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó thu

phÇn chiÕt diclometan (ký hiÖu lµ D, 13,64 g, tøc 1,24% so víi khèi l−îng

nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ).

(a) 4,4 g phÇn chiÕt diclometan (D) ®−îc ph©n t¸ch b»ng s¾c ký cét trªn silica

gel (cì h¹t 0,063-0,100 mm, Merck), röa gi¶i b»ng n-hexan/etyl axetat (4/1,

v/v), thu ®−îc 110 ph©n ®o¹n ®−îc chia thµnh 3 nhãm ph©n ®o¹n (D1 ®Õn D3).

Nhãm ph©n ®o¹n D2 ®−îc c« d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó lo¹i hÕt dung m«i, phÇn

cÆn ®−îc kÕt tinh l¹i trong n-hexan, cho 0,6 g chÊt 1 (hiÖu suÊt ®¹t 0,17 % so

víi khèi l−îng nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé).

Bét l¸ kh« c©y Khæ s©m B¾c Bé

1. chiÕt víi metanol 2. läc kiÖt b»ng phÔu Buchner 3. gép cÊt lo¹i dung m«i xuèng1/10 thÓ tÝch

B∙ l¸

PhÇn chiÕt metanol

1. pha lo·ng víi n−íc cÊt 2. chiÕt n-hexan 3. lµm kh« dÞch chiÕt b»ng Na2SO4 4. gép cÊt lo¹i dung m«i

DÞch metanol-n−íc

PhÇn chiÕt n-hexan

1. chiÕt ®iclometan 2. lµm kh« dÞch chiÕt b»ng Na2SO4 3. gép cÊt lo¹i dung m«i

DÞch metanol-n−íc

PhÇn chiÕt ®iclometan

S¬ ®å 2.5: Quy tr×nh 5 chiÕt l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé

(b) 6,3 g phÇn chiÕt diclometan (D) ®−îc ph©n t¸ch b»ng s¾c ký cét trªn silica

gel (cì h¹t 0,063-0,100 mm, Merck), röa gi¶i b»ng n-hexan/axeton (10/1, v/v),

thu ®−îc 70 ph©n ®o¹n ®−îc chia thµnh 3 nhãm ph©n ®o¹n (D1 ®Õn D3).

Nhãm ph©n ®o¹n D2 ®−îc c« d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó lo¹i dung m«i, phÇn cÆn

®−îc kÕt tinh l¹i trong n-hexan/axeton (10/1), cho 1,0 g chÊt 1 (hiÖu suÊt ®¹t

0,20 % so víi khèi l−îng nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé).

2.2.6 Quy tr×nh 6

Quy tr×nh chung:

Bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc ng©m chiÕt ba lÇn víi metanol ë

nhiÖt ®é phßng (mçi lÇn trong ba ngµy). DÞch ng©m chiÕt ®−îc c« kiÖt dung

m«i d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó cho phÇn chiÕt metanol toµn phÇn. PhÇn chiÕt

metanol toµn phÇn ®−îc hoµ víi n−íc cÊt, sau ®ã ®−îc chiÕt lÇn l−ît víi n-

hexan, diclometan, etyl axetat vµ n-butanol. Gép c¸c dÞch chiÕt t−¬ng øng

riªng rÏ, råi cÊt lo¹i kiÖt dung m«i d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó thu c¸c phÇn chiÕt n-

hexan, diclometan, etyl axetat vµ n-butanol. Quy tr×nh chiÕt ®−îc chØ ra ë S¬

®å 2.6.

TiÕn hµnh ph©n t¸ch s¾c ký cét víi hai phÇn chiÕt n-hexan vµ diclometan gép

chung ®Ó thu ho¹t chÊt ent-kauran ditecpenoit (chÊt 1, ChÕ phÈm CT-2005).

ThÝ dô:

2 kg bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc ng©m chiÕt víi metanol ba lÇn ë

nhiÖt ®é phßng, mçi lÇn trong ba ngµy. Sau mçi lÇn ng©m chiÕt läc kiÖt ®Ó

t¸ch phÇn dÞch chiÕt vµ b· l¸; b· l¸ nµy sau ®ã ®−îc sö dông tiÕp cho lÇn ng©m

chiÕt tiÕp theo. C¸c dÞch läc cña ba lÇn ng©m chiÕt ®−îc gép chung råi c« kiÖt

dung m«i d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó cho phÇn chiÕt metanol toµn phÇn ë d¹ng cao

(103 g). PhÇn chiÕt metanol toµn phÇn ®−îc hoµ víi mét l−îng n−íc cÊt tèi

thiÓu, sau ®ã ®−îc chiÕt lÇn l−ît víi n-hexan, diclometan, etyl axetat vµ n-

butanol. Gép c¸c dÞch chiÕt t−¬ng øng riªng rÏ, råi cÊt lo¹i kiÖt dung m«i d−íi

¸p suÊt gi¶m ®Ó thu c¸c phÇn chiÕt n-hexan (55 g, tøc 2,75% so víi khèi l−îng

nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé), diclometan (4,2 g, tøc 0,21%),

etyl axetat (2,4 g, tøc 0,12%) vµ n-butanol (8,2 g, tøc 0,41%).

S¾c ký líp máng so s¸nh cho thÊy hai phÇn chiÕt n-hexan vµ diclometan cã

chøa cïng c¸c thµnh phÇn ditecpenoit chÝnh. Hai phÇn chiÕt nµy ®−îc gép l¹i

vµ ®−îc ph©n t¸ch b»ng s¾c ký cét trªn silica gel (cì h¹t 0,063-0,200 mm,

Merck), kÝch th−íc cét theo silica gel (7 cm × 50 cm), röa gi¶i b»ng gradient

n-hexan (3 l), n-hexan/etyl axetat (v/v): 6/1 (4,2 l), 3/1 (8 l), 1/1 (9 l) vµ etyl

axetat (8 l). C¸c ph©n ®o¹n gãp ®−îc thu theo thÓ tÝch cña c¸c hÖ dung m«i röa

gi¶i thµnh c¸c ph©n ®o¹n n-hexan (2,9 g), n-hexan/etyl axetat: 6/1 (22,8 g),

3/1 (17,2 g), 1/1 (9,5 g) vµ etyl axetat (8 g). Ph©n ®o¹n gãp ®−îc röa gi¶i b»ng

hÖ dung m«i n-hexan/etyl axetat 3/1 (17,2 g) ®−îc ph©n t¸ch hai lÇn b»ng s¾c

ký cét trªn silica gel (cì h¹t 0,063-0,200 mm, Merck), kÝch th−íc cét theo

silica gel (5 cm × 40 cm), röa gi¶i víi hÖ dung m«i n-hexan/etyl axetat 3/1

(v/v), råi ®−îc tinh chÕ b»ng mét lÇn s¾c ký cét trªn octadecylsilica gel (ODS,

YMC), kÝch th−íc cét theo ODS gel (4 cm × 20 cm), röa gi¶i víi hÖ dung m«i

MeOH/H2O 4/1 (v/v) ®Ó cho 1,4 g chÊt 1 (hiÖu suÊt ®¹t 0,07% so víi khèi

l−îng nguyªn liÖu l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé). KiÓm tra qu¸ tr×nh ph©n

t¸ch ph©n ®o¹n n-hexan/etyl axetat 3/1 b»ng s¾c ký líp máng silica gel víi hÖ

dung m«i n-hexan/etyl axetat 3/1 (v/v).

Bét l¸ kh« c©y Khæ s©m B¾c Bé

1. chiÕt víi metanol 3 lÇn 2. gép cÊt lo¹i dung m«i

B∙ l¸

PhÇn chiÕt metanol

1. hoµ víi n−íc cÊt 2. chiÕt n-hexan 3. gép cÊt lo¹i dung m«i

DÞch n−íc

PhÇn chiÕt n-hexan

1. chiÕt ®iclometan 2. lµm kh« dÞch chiÕt b»ng Na2SO4 3. gép cÊt lo¹i dung m«i

PhÇn chiÕt ®iclometan

DÞch n−íc

1. chiÕt etyl axetat 2. lµm kh« dÞch chiÕt b»ng Na2SO4 3. gép cÊt lo¹i dung m«i

PhÇn chiÕt etyl axetat

DÞch n−íc

1. chiÕt n-BuOH 2. lµm kh« dÞch chiÕt b»ng Na2SO4 3. gép cÊt lo¹i dung m«i

PhÇn chiÕt n-butanol

DÞch n−íc

S¬ ®å 2.6: Qui tr×nh 6 chiÕt l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé

NhËn xÐt chung:

Nhê ®−îc ®Þnh h−íng bëi c¸c kh¶o s¸t c¬ b¶n (Môc 2.1) vµo líp chÊt cã

®é ph©n cùc trung b×nh nªn trong c¶ 6 quy tr×nh ®−îc ®Ò xuÊt ë trªn chóng t«i

®· lùa chän ®−îc c¸c dung m«i thÝch hîp cho viÖc chiÕt chän läc c¸c ent-

kauran ditecpenoit ra khái c¸c líp chÊt kh¸c cña l¸ c©y khæ s©m B¾c Bé theo

c¸c ph−¬ng ¸n kh¸c nhau. Trong c¸c quy tr×nh nµy c¸c ph−¬ng ¸n kh¸c nhau

®Ó ph©n t¸ch s¾c ký cét vµ tinh chÕ s¶n phÈm còng ®· ®−îc thö nghiÖm chi tiÕt

vµ mang l¹i hiÖu qu¶ tèt trong viÖc ph©n lËp ent-kauran ditecpenoit 1 lµ ho¹t

chÊt chñ yÕu cña c©y khæ s©m B¾c Bé, còng nh− c¸c ph©n ®o¹n (s¶n phÈm)

giµu ho¹t chÊt 1.

Dùa vµo c¸c kÕt qu¶ ®ã chóng t«i ®· cã thÓ lùa chän ph−¬ng ¸n tèt nhÊt

cã thÓ ®−îc, dùa trªn sù c©n nh¾c ®Ó chän c¸c dung m«i cã ®é bay h¬i thÝch

hîp, phï hîp vÒ c¸c mÆt gi¸ c¶ vµ b¶o vÖ m«i tr−êng, còng nh− chÊt l−îng

t−¬ng ®èi cña s¶n phÈm nhËn ®−îc. Cuèi cïng chóng t«i ®· lùa chän vµ dùa

chñ yÕu vµo quy tr×nh 5 ®Ó triÓn khai chiÕt t¸ch ë quy m« 10 kg l¸ khæ s©m

B¾c Bé/ mÎ.

2.3 X©y dùng quy tr×nh chiÕt t¸ch ë quy m« 10 kg l¸ kh« cña c©y khæ

s©m B¾c Bé/mÎ

Dùa trªn c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu quy tr×nh chiÕt t¸ch ent-kauran

ditecpenoit tõ c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc nªu ë Môc 2.2, chóng t«i ®· x©y

dùng quy tr×nh chiÕt t¸ch ë quy m« 10 kg l¸ kh«/mÎ, nh»m thu nhËn mét

l−îng lín ho¹t chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT-2005 giµu ho¹t chÊt 1 víi hiÖu suÊt tèt

vµ chÊt l−îng æn ®Þnh dïng cho c¸c kh¶o s¸t sinh häc in vitro vµ in vivo. Quy

tr×nh nµy ®· ®−îc tiÕn hµnh lÆp l¹i nhiÒu lÇn vµ ®· cho kÕt qu¶ mong ®îi. D−íi

®©y nªu Quy tr×nh chung vµ mét thÝ dô ¸p dông Quy tr×nh chung nµy.

Quy tr×nh chung:

1 Xö lý mÉu thùc vËt vµ ng©m chiÕt

L¸ khæ s©m B¾c Bé sau khi thu h¸i vÒ ®−îc ph¬i kh«, nhÆt bá hÕt cµnh to vµ

sÊy ë nhiÖt ®é 45OC cho ®Õn kh« hoµn toµn, sau ®ã nghiÒn thµnh bét. TiÕn

hµnh ng©m chiÕt bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé víi metanol hai lÇn trong

b×nh ng©m chiÕt cã dung tÝch 100 lit lµm b»ng thÐp kh«ng rØ, mçi lÇn trong

bèn ngµy. DÞch chiÕt sau mçi lÇn ®−îc th¸o ra khái b×nh ng©m chiÕt, phÇn b·

l¸ trong b×nh ®−îc tr¸ng röa kü b»ng metanol, dïng mét b¬m ch©n kh«ng

mµng rung ®Ó ®Èy dÞch metanol tr¸ng b· ra khái b×nh ng©m chiÕt cho ®Õn hÕt

kiÖt. L−îng metanol dïng ng©m chiÕt lµ 5,5 lit/1 kg nguyªn liÖu bét l¸ kh«, vµ

l−îng metanol dïng ®Ó tr¸ng röa lµ 1,0 lit/1 kg nguyªn liÖu bét l¸ kh«.

C¸c dÞch metanol ®−îc gép chung, råi c« d−íi ¸p suÊt gi¶m ®Ó lo¹i bít

metanol ®Õn cßn 0,65 lit dÞch metanol tÝnh cho 1 kg nguyªn liÖu bét l¸ kh«.

Sau ®ã ta pha lo·ng dÞch metanol ®· c« b»ng n−íc cÊt theo tû lÖ 0,65 (dÞch

c«)/0,35 (n−íc cÊt), råi chiÕt dÞch metanol-n−íc b»ng n-hexan, dïng hÕt 1,0 lit

n-hexan/1 kg nguyªn liÖu bét l¸ kh«; dÞch chiÕt n-hexan nµy cã chøa rÊt nhiÒu

chÊt mµu. DÞch metanol-n−íc nhËn ®−îc sau khi ®· chiÕt n-hexan l¹i ®−îc pha

lo·ng b»ng n−íc cÊt thµnh tû lÖ 1/1, råi chiÕt tiÕp b»ng diclometan, dïng hÕt

0,45 lit diclometan/1 kg nguyªn liÖu bét l¸ kh«.

CÊt lo¹i hÕt dung m«i ra khái dÞch chiÕt diclometan d−íi ¸p suÊt gi¶m, thu

®−îc phÇn chiÕt diclometan.

KÕt qu¶ kh¶o s¸t dÞch chiÕt n-hexan, dÞch chiÕt diclometan vµ dÞch metanol-

n−íc b»ng TLC trªn silica gel so víi chÊt chuÈn 1 víi hÖ dung m«i n-

hexan/axeton (2/1) ®· cho thÊy trong dÞch metanol-n−íc kh«ng cßn cã mÆt 1,

trong dÞch chiÕt n-hexan chØ cßn mét l−îng nhá 1, vµ chÊt 1 tËp trung chñ yÕu

trong dÞch chiÕt diclometan. V× vËy phÇn chiÕt diclometan ®−îc ®−a vµo ph©n

t¸ch s¾c ký trªn cét s¾c ký cì lín.

Quy tr×nh chiÕt ë quy m« 10 kg l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé/mÎ ®−îc chØ

ra ë S¬ ®å 2.7.

2. Ph©n t¸ch s¾c ký ®Ó thu nhËn hîp chÊt 1 vµ/hoÆc ChÕ phÈm CT-2005

Kh¶o s¸t TLC: TiÕn hµnh kh¶o s¸t l¹i phÇn chiÕt diclometan b»ng TLC trªn

silica gel so víi chÊt chuÈn 1, dïng c¸c hÖ dung m«i n-hexan/etyl axetat vµ n-

hexan/axeton víi c¸c tû lÖ kh¸c nhau. KÕt qu¶ cho thÊy hÖ dung m«i n-

hexan/axeton (2/1, v/v) cho kÕt qu¶ ph©n t¸ch tèt nhÊt trªn líp máng silica

gel.

Ph©n t¸ch CC: PhÇn chiÕt diclometan ®−îc hoµ tan trong l−îng võa ®ñ

diclometan, råi tÈm toµn bé dung dÞch nµy vµo silica gel (0,063-0,200 mm,

Merck) theo tû lÖ 0,8 (phÇn chiÕt)/1,0 (silica gel) theo khèi l−îng, sau ®ã lµm

bay h¬i hÕt dung m«i, thu ®−îc “bét silica gel cã tÈm phÇn chiÕt diclometan”.

Ph©n t¸ch phÇn chiÕt diclometan (d−íi d¹ng “bét silica gel cã tÈm phÇn chiÕt

diclometan”) trªn cét s¾c ký cã ®−êng kÝnh 5 cm, chiÒu dµi 120 cm, ®−îc nhåi

silica gel (0,040-0,063 mm, Merck) b»ng ph−¬ng ph¸p nhåi −ít trong dung

m«i n-hexan víi tû lÖ phÇn chiÕt diclometan/silica gel lµ 1/16 theo khèi l−îng;

®Ó cét nhåi silica gel æn ®Þnh qua ®ªm råi míi ch¹y s¾c ký; dung m«i röa gi¶i

lµ n-hexan/axeton (2/1, v/v).

TiÕn hµnh høng c¸c ph©n ®o¹n, mçi ph©n ®o¹n 100 ml, víi tèc ®é nhá giät lµ

70 giät/phót. Gép chung c¸c ph©n ®o¹n trªn c¬ së kh¶o s¸t TLC thµnh c¸c

nhãm ph©n ®o¹n. Tinh chÕ tiÕp b»ng c¸ch kÕt tinh trong n-hexan/axeton (4/1)

hoÆc ch¹y s¾c ký cét ®Ó thu 1 vµ/hoÆc ChÕ phÈm CT-2005.

Quy tr×nh chiÕt ®−îc chØ ra ë S¬ då 2.7.

C¸c H×nh 2.4, 2.5, vµ 2.6 cho thÊy c¸c cét s¾c ký cì lín, b×nh chiÕt dung tÝch

100 lit vµ s¬ ®å hÖ thèng ng©m chiÕt mÉu ®−îc sö dông cho §Ò tµi.

Bét l¸ kh« c©y Khæ s©m B¾c Bé (10 - 25 kg)

1. ng©m chiÕt metanol 2 lÇn (mçi lÇn 4 ngµy) 2. c« dÞch ng©m chiÕt

DÞch c« metanol

1. pha lo·ng víi n−íc cÊt theo tû lÖ 0,65 (dÞch c«)/0,35 (n−íc cÊt) 2. chiÕt n-hexan

DÞch chiÕt n-hexan

DÞch metanol-n−íc

1. pha lo·ng víi n−íc thµnh tû lÖ 1/1 2. chiÕt ®iclometan

DÞch ®iclometan

DÞch metanol-n−íc

cÊt lo¹i dung m«i

PhÇn chiÕt ®iclometan

S¬ ®å 2.7: Quy tr×nh chiÕt l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé

ë quy m« 10 kg/ mÎ

§Ò tµi §T§L-2005/05

H×nh 2.4: C¸c cét ph©n t¸ch s¾c ký ®iÒu chÕ cì lín (5 cm × 120 cm)

H×nh 2.5: B×nh ng©m chiÕt dung tÝch 100 lit và ThiÕt bÞ xay mÉu

§Ò tµi §T§L-2005/05

H×nh 2.6: HÖ thèng ng©m chiÕt mÉu thùc vËt (dung tÝch 100 lit)

§Ò tµi §T§L-2005/05

ThÝ dô:

MÎ K: 17,5 kg bét l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc ng©m chiÕt trong 61

lit metanol ë nhiÖt ®é phßng trong bèn ngµy. Th¸o dÞch chiÕt ra khái b×nh

ng©m chiÕt, tr¸ng b· l¸ b»ng 9 lit metanol, th¸o dÞch tr¸ng vµ dïng b¬m ®Èy

hÕt kiÖt metanol ra khái b×nh ng©m chiÕt. TiÕn hµnh ng©m chiÕt tiÕp lÇn thø

hai víi 35 lit metanol cho chiÕt vµ 9 lit metanol cho tr¸ng röa b·. Gép chung

c¸c dÞch metanol, råi c« d−íi ¸p suÊt gi¶m xuèng cßn 11,4 lit, pha lo·ng dÞch

c« nµy víi 6,1 lit n−íc cÊt, råi chiÕt bèn lÇn víi n-hexan.

DÞch metanol-n−íc sau khi ®· chiÕt víi n-hexan ®−îc pha thªm n−íc, cø mçi

lit thªm 300 ml n−íc cÊt, råi chiÕt ba lÇn víi diclometan.

Lµm khan dÞch chiÕt diclometan b»ng natri sunfat, råi c« d−íi ¸p suÊt gi¶m,

thu ®−îc 244,2 g cÆn (cÆn K). L−îng cÆn nµy ®−îc tÈm vµo 300 g silica gel

(0,063-0,200 mm, Merck), råi lµm bay h¬i hÕt dung m«i, thu ®−îc bét silica

gel cã tÈm chÊt. Chia l−îng bét silica gel cã tÈm chÊt nµy ra thµnh 6 phÇn

b»ng nhau, mçi phÇn chøa 40,7 g cÆn K.

TiÕn hµnh ph©n t¸ch cÆn K b»ng s¾c ký cét trªn silica gel, dïng 6 cét, mçi cét

nhåi 650 g silica gel (0,040-0,063 mm, Merck), víi hÖ dung m«i n-

hexan/axeton (2/1, høng 100 ml/ph©n ®o¹n, tèc ®é nhá giät lµ 70 giät/phót;

vµ sau ®ã b»ng kÕt tinh ph©n ®o¹n. C¸c qu¸ tr×nh ph©n t¸ch ®−îc kiÓm tra

b»ng TLC. Toµn bé l−îng cÆn K ®−îc ph©n t¸ch trªn 6 cét s¾c ký, kÕt qu¶

®−îc nªu ë B¶ng 2.1.

§Ò tµi §T§L-2005/05

B¶ng 2.1: Ph©n t¸ch s¾c ký cét cÆn K

PhÇn cÆn K (mçi phÇn: 40,7 g)

C¸c nhãm ph©n ®o¹n

K1

K2

K2.5 (5,7 g) P®: 9-12

K3

K4

K5

K6

K1.1 (6,7 g) P®: 1-4 K2.1 (0,4 g) P®: 1 K3.1 (6,3 g) P®: 1-4 K4.1 (7,4 g) P®: 1-4 K5.1 (0,3 g) P®: 1 K6.1 (0,3 g) P®: 1

K1.2 (6,5 g) P®: 5-6 K2.2 (5,7 g) P®: 2-4 K3.2 (7,5 g) P®: 5-6 K4.2 (8,2 g) P®: 5-6 K5.2 (3,7 g) P®: 2-3 K6.2 (3,8 g) P®: 2-3

K1.3 (4,9 g) P®: 7-8 K2.3 (7,4 g) P®: 5-6 K3.3 (4,8 g) P®: 7-8 K4.3 (4,2 g) P®: 7-8 K5.3 (8,8 g) P®: 4-6 K6.3 (7,5 g) P®: 4-5

K1.4 (6,6 g) P®: 9-12 K2.4 (5,8 g) P®: 7-8 K3.4 (4,6 g) P®: 9-11 K4.4 (3,4 g) P®: 9-10 K5.4 (6,8 g) P®: 7-10 K6.4 (6,5 g) P®: 6-7

K6.5 (8,7 g) P®: 8-11

C¸c nhãm ph©n ®o¹n K1.1, K1.2, K2.2, K2.3, K3.1, K3.2, K4.1, K4.2,

K5.2, K5.3, K6.2, K6.3 ®−îc gép chung råi kÕt tinh ph©n ®o¹n trong hÖ dung

m«i n-hexan/axeton (4/1). Gom c¸c ph©n ®o¹n kÕt tinh trªn c¬ së ph©n tÝch

s¾c ký líp máng (TLC), thu ®−îc ba s¶n phÈm:

CT1-K(1): 12,9447 g (lµ hîp chÊt 1 tinh khiÕt).

CT1-K(2): 6,0268 g, qua tinh chÕ b»ng s¾c ký cét thu 4,85 g

ChÕ phÈm CT-2005.

CT1-K(3H): 2,1065 g.

C¸c n−íc c¸i ®−îc gép chung vµ lµm bay b¬i hÕt dung m«i, thu cÆn K7 (91,2

g). L−îng cÆn nµy ®−îc tÈm vµo 120 g silica gel (0,063-0,200 mm, Merck) vµ

lµm bay h¬i hÕt dung m«i, råi chia l−îng bét silica gel cã tÈm chÊt nµy ra

thµnh 2 phÇn b»ng nhau, mçi phÇn chøa 45,6 g cÆn K7.

TiÕn hµnh ph©n t¸ch cÆn K7 b»ng s¾c ký cét trªn silica gel, dïng 2 cét, mçi

cét nhåi 650 g silica gel (0,040-0,063 mm, Merck), víi hÖ dung m«i n-

hexan/axeton (4/1). Gom c¸c ph©n ®o¹n kÕt tinh trªn c¬ së kh¶o s¸t TLC, thu

®−îc hai s¶n phÈm:

CT1-K7(1): 9,2727 g

§Ò tµi §T§L-2005/05

CT1-K7(2): 9,7851 g.

TiÕp tôc tinh chÕ CT1-K7(1) vµ CT1-K7(2) th«ng qua s¾c ký cét (tû lÖ chÊt

ph©n t¸ch/silica gel (cì h¹t 0,040-0,063 mm, Merck) 1/16, hÖ dung m«i n-

hexan/axeton 4/1 (v/v) vµ kÕt tinh ph©n ®o¹n (n-hexan/axeton 4/1 (v/v)) ®· thu

thªm ®−îc tæng céng 0,9200 g chÊt 1 vµ 8 g ChÕ phÈm CT-2005.

KÕt qu¶ ph©n lËp:

Tõ 17,5 kg l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®· thu ®−îc:

ChÊt 1: 13,8647 g, tøc 0,079% so víi khèi l−îng l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c

Bé , vµ

ChÕ phÈm CT-2005: 12,85 g, tøc 0,073 % so víi khèi l−îng l¸ kh« cña c©y

khæ s©m B¾c Bé.

Nh− vËy Tæng l−îng ho¹t chÊt ent-kauran (chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT-2005

giµu hîp chÊt 1) thu ®−îc tõ 17,5 kg l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé lµ:

26,7147 g.

Dùa trªn kinh nghiÖm ph©n t¸ch phÇn chiÕt, chóng t«i ®· cã thÓ chñ ®éng thay

®æi c¸ch gom c¸c ph©n ®o¹n vµ tinh chÕ s¶n phÈm ®Ó cã thÓ thu ®−îc nhiÒu

chÊt 1 h¬n, hay nhiÒu ChÕ phÈm CT-2005 h¬n so víi l−îng nªu ë trªn.

L−îng chÊt hÊp phô vµ dung m«i ®· sö dông:

§Ó chiÕt t¸ch 17,5 kg l¸ kh« cña c©y khæ s©m B¾c Bé ®· sö dông:

Silica gel (0,063-0,200 mm, Merck): 0,420 kg

Silica gel (0,04-0,063 mm, Merck): 5,85 kg

Metanol: 114 lit

n-hexan (chiÕt, nhåi cét, ch¹y cét): 50 lit

diclometan: 10 lit

axeton: 10 lit

Silica gel DC-Alufolien 60 F254 (Merck). Ghi chó: §Ó ®¹t yªu cÇu kü thuËt, c¸c dung m«i cÇn ®−îc tinh chÕ vµ ®¹t ®é

tinh khiÕt cÇn thiÕt.

§Ò tµi §T§L-2005/05

Quy tr×nh trªn ®· ®−îc thö nghiÖm ë c¸c quy m« kh¸c nhau, tõ 10 kg l¸ kh«

cña c©y khæ s©m B¾c Bé/mÎ ®Õn 25 kg/ mÎ.

§· ¸p dông quy tr×nh nµy ®Ó s¶n xuÊt ®ñ chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT-2005 cã chÊt

l−îng æn ®Þnh cho c¸c kh¶o s¸t sinh häc in vitro vµ in vivo.

H»ng sè vËt lý vµ c¸c d÷ kiÖn phæ cña s¶n phÈm ent-7β-Hydroxy-15-

oxokaur-16-en-18-yl axetat (1)

Tinh thÓ h×nh kim màu tr¾ng, ®.n.c. 132-135oC. EI-MS: m/z (%) 360 (C22H32O4, M+.). IR (KBr): νmax cm−1 3483, 1721 (br), 1643, 1469, 1381, 1367, 1249. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ ppm 0,74 (1H, tdq, J = 13,1 Hz, 13,0 Hz, 3,7

Hz, H-1β), 0,85 (3H, s, H-19), 1,14 (3H, s, H-20), 1,23 (1H, br d, J = 8,5 Hz,

H-9β), 1,28 (1H, dd, J = 12,5 Hz, 1,0 Hz, H-5β), 1,35 (1H, m, H-3β), 1,38

(1H, br d, J = 4,2 Hz, H-3α), 1,45 (1H, q, J = 12,0 Hz, H-6α), 1,47 (1H, m, H-

11β), 1,50 (1H, m, H-2β), 1,65 (1H, m, H-2α), 1,70 (3H, m, H-6β, H-11α, H-

12β), 1,79 (1H, dt, J = 13,0 Hz, 3,0 Hz, H-1α), 1,96 (1H, tdd, J = 13,0 Hz, 6,5

Hz, 2,5 Hz, H-12α), 2,07 (2H, m, H2-14), 2,09 (3H, s, -OCOCH3), 3,10 (1H,

br s, H-13), 3,66 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18A), 3,87 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-

18B), 4,05 (1H, br d, J = 11,5 Hz, H-7β), 5,28 (1H, s, H-17A), 5,96 (1H, s, H-

17B).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ ppm 17,6 (t, C-2), 17,6 (q, C-19), 18,0 (t, C-

11), 18,2 (q, C-20), 21,1 (q, -OCOCH3), 27,7 (t, C-6), 27,9 (t, C-14), 32,8 (t, C-12), 35,5 (t, C-3), 36,4 (s, C-4), 37,6 (d, C-13), 38,9 (t, C-1), 39,7 (s, C-10),

46,3 (d, C-5), 51,8 (d, C-9), 58,4 (s, C-8), 70,8 (d, C-7), 72,3 (t, C-18), 115,0

(t, C-17), 149,2 (s, C-16), 171,3 (s, -OCOCH3), 209,8 (s, C-15).

2.4 Phân tích các sản phẩm ent-kauran ditecpenoit

§Ò tµi §T§L-2005/05

Các sản phẩm ent-kauran ditecpenoit (hợp chất 1 và Chế phẩm CT-2005)

được phân tích bằng các phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).

2.4.1 Mẫu chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (CHU)

Phương pháp và Thiết bị

Điểm nóng chảy được đo trên thiết bị Boetius và không hiệu chỉnh.

Độ quay cực được đo trên thiết bị Polartronic D (Schmidt + Haensch).

Phổ hồng ngoại (KBr) được đo trên thiết bị Nicolet Impact 410 FT-IR

spectrometer.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ 1H-NMR (400 MHz) và phổ 13C-

NMR (100 MHz) được đo trên thiết bị Bruker Avance 400 spectrometer.

Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) và phổ khối lượng va chạm điện

tử phân giải cao (HR EI-MS) được đo trên thiết bị MS902 spectrometer.

Mẫu chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (CHU) được

phân lập từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.,

Euphorbiaceae) bằng sắc ký cột và được tinh chế bằng HPLC điều chế.

Ent-7β-Hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat. Hằng số vật lý và các dữ

kiện phổ Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 132-135oC.

D –121o (c 1,0, CHCl3)

[α]16

Rf 0,53 [silica gel TLC, n-hexan/EtOAc 1/1 (v/v)].

Rf 0,36 [silica gel TLC, n-hexan-(CH3)2CO 4/1 (v/v)].

Hiện màu tím hồng với thuốc hiện vanilin/H2SO4 đặc 1%.

Hiện màu vàng sẫm với thuốc hiện Dragendorff-Munier.

HR EI-MS: Tìm được: M+. 360,2311 (C22H32O4). Tính được: M+. 360,2300. EI-MS: m/z (%) 360 (C22H32O4, M+., 15), 332 (8), 269 (10), 227 (6), 161

(11), 135 (27), 105 (61), 91 (59), 67 (59), 55 (73), 43 (100), 41 (72), 39 (56).

§Ò tµi §T§L-2005/05

IR (KBr): νmax cm−1 3482, 1735, 1729, 1649, 1387, 1367, 1252. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 0,74 (1H, tdq, J = 13,0 Hz, 13,0 Hz, 4,0

Hz, H-1β), 0,84 (3H, s, H-19), 1,14 (3H, d, J = 1,19 Hz, H-20), 1,23 (1H, br d,

J = 8,5 Hz, H-9β), 1,28 (1H, dd, J = 12,6 Hz, 1,8 Hz, H-5β), 1,35 (1H, m, H-

3β), 1,38 (1H, br d, J = 4,2 Hz, H-3α), 1,45 (1H, q, J = 12,0 Hz, H-6α), 1,47

(1H, m, H-11β), 1,50 (1H, m, H-2β), 1,63 (1H, s, OH), 1,65 (1H, m, H-2α),

1,70 (1H, ddd, J = 12,0 Hz, 4,4 Hz, 1,6 Hz, H-6β), 1,70 (1H, m, H-11α), 1,70

(1H, m, H-12β), 1,79 (1H, ddd, J = 13,0 Hz, 3,5 Hz, 3,5 Hz, H-1α), 1,96 (1H,

tdd, J = 13,0 Hz, 6,2 Hz, 2,7 Hz, H-12α), 2,07 (2H, m, H2-14), 3,10 (1H, m,

H-13), 2,10 (3H, s, -OCOCH3), 3,66 (1H, d, J = 10,8 Hz, H-18A), 3,87 (1H,

d, J = 10,8 Hz, H-18B), 4,05 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 4,4 Hz, H-7β), 5,29 (1H, t,

J = 1,1 Hz, H-17A), 5,97 (1H, t, J = 1,1 Hz, H-17B).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ ppm 17,5 (t, C-2), 17,5 (q, C-19), 18,0 (t, C-

11), 18,2 (q, C-20), 21,1 (q, -OCOCH3), 27,7 (t, C-6), 27,9 (t, C-14), 32,8 (t,

C-12), 35,4 (t, C-3), 36,4 (s, C-4), 37,6 (d, C-13), 38,9 (t, C-1), 39,6 (s, C-10),

46,3 (d, C-5), 51,8 (d, C-9), 58,3 (s, C-8), 70,8 (d, C-7), 72,3 (t, C-18), 115,0

(t, C-17), 149,2 (s, C-16), 171,2 (s, -OCOCH3), 209,7 (s, C-15).

2.4.2 Phân tích các sản phẩm ( 1 và Chế phẩm CT-2005)

2.4.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Hoá chất và điều kiện phân tích

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn TLC aluminium

sheets Silica gel 60F254 (bề dày của lớp silica gel là 0,20 mm) của hãng

Merck (Darmstadt, CHLB Đức).

Mẫu phân tích (1 mg) và mẫu chuẩn (CHU) (1 mg) được hoà tan trong

dung môi CHCl3 (1 ml) và 3 µl dung dịch thử được đưa lên bản mỏng.

Hệ dung môi sắc ký là n-hexan/EtOAc 1/1.

§Ò tµi §T§L-2005/05

Sắc ký đồ được triển khai trong bình triển khai đã bão hoà dung môi ở

nhiệt độ phòng.

Hiện màu sắc ký đồ TLC bằng cách phun thuốc hiện vanilin/H2SO4 đặc

1%, sau đó hơ nóng bản mỏng ở 100oC.

Mẫu chuẩn là ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (CHU) từ lá

cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae), xem Mục

2.4.1.

Phân tích TLC so sánh: Phân tích TLC so sánh được thực hiện với mẫu

phân tích và mẫu chuẩn (CHU) được đưa lên trên cùng một bản mỏng, được

triển khai đồng thời trong cùng một điều kiện phân tích, sau khi hiện màu

bằng thuốc hiện chúng được kiểm tra các giá trị Rf tương đối so với nhau.

Phân tích co-TLC: Phân tích co-TLC được thực hiện sau khi nhận được

kết quả dương tính của phân tích TLC so sánh. Theo phương pháp này mẫu

phân tích và mẫu chuẩn (CHU) được hoà tan chung với nhau trong dung môi

CHCl3 và dung dịch chứa hai mẫu này được đưa lên bản mỏng. Sau khi triển

khai và hiện màu, sự xuất hiện của một vệt màu tròn trên bản mỏng cho phép

xác định sự đồng nhất của mẫu cần phân tích và mẫu chuẩn.

2.4.2.1.1 Sản phẩm 1

Sản phẩm 1 (tức hợp chất 1 do đề tài sản xuất) được phân tích bằng TLC

so sánh và co-TLC với mẫu chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl

axetat (CHU). Sau khi được phun thuốc hiện vanilin/H2SO4 đặc 1% sản phẩm

này xuất hiện dưới dạng một vệt tròn màu tím hồng duy nhất trên bản mỏng

với cùng giá trị Rf 0,53 khi so với vệt chất chuẩn được triển khai trên cùng

một bản mỏng theo phương pháp TLC phân tích. Khi được thực hiện theo

phương pháp co-TLC sản phẩm 1 này xuất hiện cùng với vệt chất chuẩn

(CHU) dưới dạng một vệt tròn đều màu tím hồng duy nhất trên bản mỏng ở

Rf 0,53. Các kết quả phân tích này đã cho phép xác định định tính sản phẩm 1.

§Ò tµi §T§L-2005/05

2.4.2.1.2 Chế phẩm CT-2005 và TLC profile

Chế phẩm CT-2005 được phân tích bằng TLC so sánh và co-TLC với mẫu

chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (CHU). Sau khi được

phun thuốc hiện vanilin/H2SO4 đặc 1% chế phẩm này xuất hiện dưới dạng ba

vệt tròn màu tím hồng gần nhau trên bản mỏng với các giá trị Rf 0,44; 0,53 và

0,60, vệt chất chuẩn (CHU) được triển khai trên cùng một bản mỏng theo

phương pháp TLC phân tích hiện màu ở Rf 0,53. Khi được thực hiện theo

phương pháp co-TLC chế phẩm này xuất hiện với ba vệt tròn màu tím hồng,

vệt trung tâm với Rf 0,53 chồng khít với của mẫu chuẩn CHU. Các kết quả

phân tích này đã cho phép xác định định tính và cho sắc ký đồ các fingerprint

hoá học (TLC profile) của Chế phẩm CT-2005.

2.4.2.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)

Thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và điều kiện phân tích 1H-

NMR

Phân tích bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) được thực

hiện ở nhiệt độ khoảng 300 K trên thiết bị Bruker Avance 500 spectrometer ở

tần số 500 MHz. Tetramethylsilane (TMS) được sử dụng làm điểm chuẩn

zero.

Dung môi ghi đo cho phân tích 1H-NMR là CDCl3.

Trong phân tích này NMR tube 5 mm đã được sử dụng.

Lượng mẫu dùng cho phân tích NMR là từ 3 đến 4 mg mẫu rắn.

Số lần scan cho một mẫu phân tích là 32. 2.4.2.2.1 Sản phẩm 1 và 1H-NMR profile

Sản phẩm 1 được phân tích bằng phổ 1H-NMR. Phổ 1H-NMR của sản

phẩm 1 cùng với phần dãn rộng của vùng δ 0,7 - 1,85 ppm và 3,05 - 4,1 ppm được đưa ra trong các Hình 2.7, 2.8 và 2.9. Phổ 1H-NMR của sản phẩm 1

hoàn toàn chồng khớp với phổ 1H-NMR của mẫu chuẩn ent-7β-hydroxy-15-

§Ò tµi §T§L-2005/05

oxokaur-16-en-18-yl axetat (CHU) cho phép khẳng định sự đồng nhất của

hai mẫu này.

Hình 2.7: Phổ 1H-NMR của sản phẩm 1

Các dữ kiện phổ IR, EI-MS và 13C-NMR của sản phẩm 1 cũng chồng khớp với của mẫu chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetate (CHU). Khảo sát các tín hiệu cộng hưởng từ proton trong khoảng δ 2,5 - 6 ppm có sự vắng mặt của các proton vinylic và các tín hiệu của H-13 cho thấy sản phẩm

vắng mặt của các proton vinylic và các tín hiệu của H-13 cho thấy sản phẩm

này đã hoàn toàn được làm sạch khỏi các ent-kauren khác. Ở vùng δ 0,7 - 2,1

ppm phân tích các tín hiệu cộng hưởng cũng cho thấy sản phẩm đã được làm

sạch khỏi các ankyl ancol mạch dài và các sterol có thể có trong phần chiết.

Với điều kiện ghi đo của thiết bị NMR như đã mô tả, thành phần mol% của

hoạt chất chính ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat đối với các ent-kauren khác trong sản phẩm 1 là khoảng 100%. Như vậy 1H-NMR profile

của sản phẩm 1 có thể được sử dụng trong việc xây dựng tiêu chuẩn cho các

chế phẩm giàu hoạt chất ent-kauran ditecpenoit được điều chế từ cây khổ sâm

Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.).

Hình 2.8: Phần dãn rộng trên phổ 1H-NMR của sản phẩm 1 ở vùng δ 0,7-1,85 ppm

Hình 2.9: Phần dãn rộng trên phổ 1H-NMR của sản phẩm 1 ở vùng δ 3,05-4,1 ppm

2.4.2.2.2 Chế phẩm CT-2005 và 1H-NMR profile

Chế phẩm CT-2005 được phân tích bằng phổ 1H-NMR. Phổ 1H-NMR của

Chế phẩm CT-2005 cùng với phần dãn rộng của vùng δ 0,7-2,2 ppm và 3,6- 6,2 ppm được đưa ra trong các Hình 2.10, 2.11 và 2.12. Trên phổ 1H-NMR

của Chế phẩm CT-2005 xuất hiện cụm các tín hiệu của các proton vinylic và các nhóm oximetin ở vùng 3,6 - 6,2 ppm. So sánh phổ này với phổ 1H-NMR

của mẫu chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (CHU) và với

của các mẫu ent-kauran ditecpenoit khác từ cây khổ sâm Bắc Bộ đã cho phép

xác định Chế phẩm CT-2005 chứa chủ yếu là ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-

16-en-18-yl axetat (1) và 2 ent-kauren khác, ent-1α,14α-diaxetoxy-7β-

hydroxykaur-16-en-15-on (5) và ent-1α,7β-diaxetoxy-14α-hydroxy- kaur-16- en-15-on (6). Như vậy sử dụng phổ 1H-NMR đã cho phép xác định định tính

thành phần hoá học của Chế phẩm CT-2005. Hơn thế nữa, định lượng tương

đối của chế phẩm này trên cơ sở các đường cong tích phân cho thấy chế phẩm

chứa chủ yếu 3 ent-kauren với hoạt chất chính là ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-

16-en-18-yl axetat (1) được xác định là chiếm 86 mol % tổng các ent-kauren

của chế phẩm và mỗi ent-kauren còn lại chiếm 7 mol %.

Hình 2.10: Phổ 1H-NMR của Chế phẩm CT-2005

Như vậy kết quả phân tích định tính hoàn toàn phù hợp với các kết quả phân tích bằng TLC. Dựa trên 1H-NMR profile này các chế phẩm giàu các hoạt

chất ent-kauran ditecpenoit được điều chế từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton

tonkinensis Gagnep.) có thể được xác định theo tiêu chuẩn của Chế phẩm CT-

2005.

Hình 2.11: Phần dãn rộng trên phổ 1H-NMR của Chế phẩm CT-2005 ở vùng δ 0,7-2,2 ppm

Hình 2.12: Phần dãn rộng trên phổ 1H-NMR của Chế phẩm CT-2005 ở vùng δ 3,6-6,2 ppm

2.4.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Thiết bị sắc ký và điều kiện phân tích

Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo được thực hiện trên

thiết bị HPLC AGILENT TECHNOLOGY với Photodiode Array detector

1100 DAD.

Cột tách pha đảo ODS có kích thước (250 mm × 4,6 mm), cỡ hạt 5 µm.

Pha động là hệ dung môi gradient MeOH (loại HPLC)-H2O bắt đầu từ

20% MeOH (v/v) đến 100% MeOH trong 25 phút, sau đó là 100% MeOH

trong 5 phút.

Tốc độ dòng 1ml/phút.

Thể tích bơm mẫu là 10 µl.

Phát hiện chất bằng đetectơ DAD được đặt ở các bước sóng 210, 240 và

360 nm.

Mẫu thử (các sản phẩm 1 và Chế phẩm CT-2005) và mẫu chuẩn CHU,

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (xem 2.4.1), được pha ở nồng

độ 5 mg/ml MeOH (loại HPLC) và phần chiết MeOH ở nồng độ 10 mg/ml

MeOH (loại HPLC).

2.4.2.3.1 Phân tích phần chiết MeOH: Sắc ký đồ HPLC tiêu chuẩn

Phần chiết MeOH từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.,

Euphorbiaceae) được phân tích bằng HPLC-DAD phân tích với các bước

sóng 210 nm, 240 nm và 360 nm. Bước sóng 210 nm gần với các đỉnh hấp thụ

UV của các ent-kauran ditecpenoit được sử dụng cho phân tích tiêu chuẩn; ở

bước sóng này các thành phần flavonoit chính của lá cây khổ sâm Bắc Bộ

cũng được xác định đồng thời. Sắc ký đồ HPLC của phần chiết MeOH được

nêu trong Hình 2.13 biểu diễn các pic HPLC của hai lớp hợp chất, các hợp

chất flavonoit I, II, III và các hợp chất ent-kauran ditecpenoit 1, 2, 3, 4, 5, 6.

Sắc ký đồ HPLC sẽ cho phép xác định chính xác nguyên liệu và định tính các

chế phẩm nhận được từ cây khổ sâm Bắc Bộ theo các hợp chất đánh dấu I, II,

III và 1, 2, 3, 4, 5, 6.

Sắc ký đồ HPLC của phần chiết MeOH này có thể được sử dụng làm tiêu

chuẩn trong việc xác định nguyên liệu và phân tích định tính các sản phẩm

được điều chế từ cây khổ sâm Bắc Bộ.

CT-MeOH

2000

UV_VIS_1 WVL:210 nm

ANAL #40 mAU

II

%D: 0.0 %

11 - 10.827

%C: 0.0 %

1800

100.0

I

10 - 10.160

1600

1400

1200

1000

800

1

2 - 1.547

17 - 23.653

600

3 - 1.660

400

23 - 31

3 5 6 2

1 - 1.427

15 - 20.607

19 - 25.940

21 - 28.613

14 - 19.880

4 III

16 - 21.940

200

13 - 19.547

20 - 28.267

22 - 28.960

12 - 15.753

9 - 9.153

18 - 24.120

4 - 2.807

7 - 6.860

8 - 7.313

5 - 5.4736 - 6.160

%B: 20.0 %

20.0

Flow: 1.000 ml/min

min

-200

0.0

32.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

18.0

20.0

22.0

24.0

26.0

28.0

30.0

Hình 2.13: Sắc ký đồ HPLC của phần chiết MeOH từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ

Bảng 2.2 đưa ra các hợp chất đánh dấu I-III và 1-6 của phần chiết MeOH

từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ. Các hợp chất này được xác định bằng cách so sánh

các giá trị tR và phổ UV được ghi on line của các hợp chất này với của các

chất chuẩn đã được phân lập và xác định cấu trúc từ cây khổ sâm Bắc Bộ. Cấu

trúc của các hợp chất đánh dấu này được biểu diễn trong Hình 2.14.

Bảng 2.2: Các hợp chất đánh dấu I-III và 1-6 của phần chiết MeOH

Lớp chất Hợp chất

Flavonoit

vitexin Isovitexin Tiliroside Ký hiệu trên sắc ký đồ HPLC I II III

Ent- kauran ditecpenoit 4

6 Ent-7β-hydroxy-15-oxokaur- 16-en-18-yl axetat Ent-1α-axetoxy-7β,14α- dihydroxykaur-16-en-15-on Ent-18-axetoxy-7β,14α- dihydroxykaur-16-en-15-on Ent-7β,14α-dihydroxykaur- 16-en-15-on Ent-1α,14α-diaxetoxy-7β- hydroxykaur-16-en-15-on Ent-1α,7β-diaxetoxy-14α- hydroxykaur-16-en-15-on

R1 R2 I OGlc H II H OGlc

R1 R2 R3 R4 1 H OAc OH H 2 OAc H OH OH 3 H OAc OH OH 4 H H OH OH 5 OAc H OH OAc 6 OAc H OAc OH

III

Hình 2.14: Cấu trúc của các hợp chất đánh dấu I-III và 1-6 của cây khổ sâm Bắc Bộ

Trên sắc ký đồ HPLC các ent-kauran ditecpenoit 1-6 được rửa giải lần lượt

ở tR 19,547 (5), 19,880 (6), 20,607 (2), 21,940 (4), 23,653 (1) và 24,120 phút

(3).

Trên Hình 2.15 sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn CHU ent-7β-hydroxy-15-

oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) (tR 23,500 phút; độ tinh khiết 100% theo

HPLC phân tích) ở 210 nm và phổ UV được ghi on line của nó trong MeOH-

H2O bằng DAD được đưa ra.

CT1833

3000

UV_VIS_1 WVL:210 nm

ANAL #80 mAU

Phổ UV của 1 cho một đỉnh hấp thụ ở λ 232,3 nm.

1 - 23.500

2500

Peak #1

23.45

60.0

232.3

50.0

2000

40.0

30.0

20.0

1500

10.0

193.0

0.0

1000

-10.0

190

300

400

500

600

700

800

500

min

-500

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

18.0

20.0

22.0

24.0

26.0

28.0

30.0

32.0

0.0

Hình 2.15: Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn CHU ent-7β-hydroxy-15- oxokaur-16-en-18-yl axetat (100% độ tinh khiết HPLC) và phổ UV của hợp chất này được ghi on line trong MeOH-H2O bằng DAD

Phần dãn rộng của sắc ký đồ HPLC của phần chiết MeOH đối với các

flavonoit đánh dấu I-III được đưa ra ở Hình 2.16. Các flavonoit glucoside

vitexin (I), isovitexin (II) và flavonoit axyl glucoside tiliroside (III) rất thích

hợp cho việc sử dụng làm các hợp chất đánh dấu trong kiểm tra nguyên liệu

ban đầu. Trong điều kiện sắc ký được đưa ra các flavonoit được rửa giải ở tR

10,160 phút (I), 10,827 phút (II) và 15,753 phút (III). Các phổ UV của I, II

và III được ghi on line trong MeOH-H2O bằng DAD cùng với giá trị tR cũng

đặc trưng cho phân tích định tính bằng HPLC-DAD.

Phổ UV của I cho các đỉnh hấp thụ ở λ 208,3, 265 và 337,9 nm.

Phổ UV của II cho các đỉnh hấp thụ ở λ 207,7, 265,3 và 337,8 nm.

CT-MeOH

1937

UV_VIS_1 WVL:210 nm

ANAL #57 mAU

11 - 10.827

Peak #1110.93

Phổ UV của III cho các đỉnh hấp thụ ở λ 199,2, 218,0 (vai), 265 và 310,7 nm.

II

0.0

Peak #1010.24 0.0

1800

207.7

208.3

0.0

193.6

10 - 10.160

337.8

7.5

1600

265.3

I II

I

337.9

5.0

1400

2.5

0.0

1200

0.0

190

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

190

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

Peak #1215.83 0.0

1000

199.2

0.0

800

7.5

310.7

218.0

5.0

600

2.5

400

0.0

190

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

200

12 - 15.753

9 - 9.153

III

min

-52

18.05

10.00

11.00

12.00

13.00

14.00

15.00

16.00

17.00

8.68

Hình 2.16: Sắc ký đồ HPLC của các flavonoit trong phần chiết MeOH từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) và các phổ UV của I (vitexin), II (isovitexin) và III (tiliroside) được ghi on line trong MeOH-H2O bằng DAD

2.4.2.3.2 Sản phẩm 1

Sản phẩm 1 được phân tích bằng HPLC phân tích ở các bước sóng 210

nm và 240 nm gần với các đỉnh hấp thụ tử ngoại của các ent-kauran

ditecpenoit. Trên sắc ký đồ HPLC của sản phẩm 1 (Hình 2.17) có một hợp

chất chính được phát hiện. Hợp chất này được rửa giải ở tR ở 27,133 phút và

phổ UV được ghi on line (Hình 2.18) phù hợp với của mẫu chuẩn CHU ent-

7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat được đo trong cùng một điều

kiện. Do đó trong phân tích định tính sản phẩm 1 được đặc trưng chủ yếu bởi

hợp chất đánh dấu 1, ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat. Kết quả

DAD1 A, Sig=210,8 Ref=400,100 (HUONGS1\611-K110.D) DAD1 B, Sig=240,8 Ref=400,100 (HUONGS1\611-K110.D) DAD1 C, Sig=360,8 Ref=400,100 (HUONGS1\611-K110.D)

mAU

2500

6 8 0

7 2

2000

1500

1000

500

-500

min

phân tích này hoàn toàn phù hợp với các kết quả phân tích định tính bằng TLC và phổ 1H-NMR.

*DAD1, 27.105 (1453 mAU, - ) Ref=26.998 & 27.171 of 611-K110.D

mAU

1200

1000

800

600

400

200

225

250

275

300

325

350

375

Hình 2.17: Sắc ký đồ HPLC của sản phẩm 1

Hình 2.18: Phổ UV của hợp chất đánh dấu 1 trong sản phẩm 1 được ghi on line trong MeOH-H2O bằng DAD Sử dụng đồng thời cả 3 phương pháp phân tích này sẽ cho

Sử dụng đồng thời cả 3 phương pháp phân tích này sẽ cho các kết quả

định tính chính xác về các chế phẩm được điều chế theo tiêu chuẩn của sản

phẩm 1.

2.4.2.3.3 Chế phẩm CT-2005

Chế phẩm CT-2005 được phân tích bằng HPLC phân tích ở các bước sóng

210 nm và 240 nm gần với các đỉnh hấp thụ tử ngoại của các ent-kauran

ditecpenoit. Trên sắc ký đồ HPLC (Hình 2.19) có 3 hợp chất chính được rửa

giải ở tR 22,599, 23,301 và 27,133 phút. Các phổ UV được ghi on line của các

hợp chất này phù hợp với của các ent-kauran ditecpenoit đánh dấu và được

đưa ra ở Hình 2.20. Hợp chất có tR 27,133 phút có thời gian lưu và phổ UV

phù hợp với mẫu chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat được

đo trong cùng một điều kiện và do đó được xác định là hợp chất đánh dấu 1.

Các hợp chất có thời gian lưu ở tR 22,599 và 23,301 phút phù hợp với các hợp

chất đánh dấu 5 và 6. Kết quả phân tích này hoàn toàn phù hợp với các kết quả định tính bằng TLC và phổ 1H-NMR.

Ba phương pháp phân tích này có thể được sử dụng đồng thời cho độ

chính xác cao trong kiểm tra chất lượng sản phẩm của các chế phẩm theo tiêu

chuẩn của Chế phẩm CT-2005.

Như vậy Chế phẩm CT-2005 được đặc trưng bởi 3 hợp chất đánh dấu 5, 6

và 1. Sắc ký đồ HPLC này sẽ được sử dụng cho việc sản xuất các chế phẩm từ

lá cây khổ sâm Bắc Bộ theo tiêu chuẩn của Chế phẩm CT-2005. Theo kết quả

khảo sát của chúng tôi, cả 3 thành phần 1, 5 và 6 của Chế phẩm CT-2005 đều

có tác dụng độc hại tế bào mạnh đối với một số dòng tế bào ung thư người

nuôi cấy in vitro.

2.5 Ph©n lËp s¶n phÈm ent-kauran ditecpenoit dïng lµm chuÈn ®èi chøng

§· ph©n lËp ho¹t chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT-2005 ®Ó dïng lµm chuÈn ®èi chøng

trong kiÓm nghiÖm vµ trong kiÓm tra c¸c mÎ s¶n phÈm chiÕt t¸ch.

DAD1 A, Sig=210,8 Ref=400,100 (HUONGS1\611-GOP1.D) DAD1 B, Sig=240,8 Ref=400,100 (HUONGS1\611-GOP1.D) DAD1 C, Sig=360,8 Ref=400,100 (HUONGS1\611-GOP1.D)

mAU

2500

2000

3 3 1 . 7 2

1500

1000

500

1 0 3 . 3 2

9 9 5 . 2 2

7 9 5 . 7 2

-500

min

5 6

*DAD1, 23.279 (166 mAU, - ) Ref=23.159 & 23.452 of 611-GOP1.D

mAU

Hình 2.19: Sắc ký đồ HPLC của Chế phẩm CT-2005

140

120

100

200

225

250

275

300

325

350

375

*DAD1, 23.279 (166 mAU, - ) Ref=23.159 & 23.452 of 611-GOP1.D

mAU

140

120

100

200

225

250

275

300

325

350

375

*DAD1, 27.105 (1051 mAU, - ) Ref=27.039 & 27.225 of 611-GOP1.D

mAU

800

600

400

200

225

250

275

300

325

350

375

Hình 2.20: Các phổ UV của các hợp chất đánh dấu 5, 6 và 1 trong Chế phẩm CT-2005 được ghi on line trong MeOH-H2O bằng DAD Ch−¬ng 3

Thö ®éc tÝnh cÊp vµ ®éc tÝnh b¸n tr−êng diÔn,

Vµ kh¶o s¸t ¶nh h−ëng tíi vËt liÖu di truyÒn ë sóc vËt thÝ nghiÖm

3.1 thö ®éc tÝnh cÊp vµ ®éc tÝnh b¸n tr−êng diÔn cña ent-kauran ditecpenoit tõ c©y khæ s©m b¾c bé*) 3.1.1 §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

3.1.1.1 Thuèc

C¸c ®èi t−îng ®−îc thö (thuèc) lµ hîp chÊt ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-

16-en-18-yl axetat (1), gäi t¾t lµ hîp chÊt 1 hoÆc 1, vµ ChÕ phÈm CT-2005,

gäi t¾t lµ ChÕ phÈm CT hoÆc CT, do GS TSKH Phan Tèng S¬n vµ céng sù,

Khoa Hãa häc, Tr−êng §¹i häc Khoa häc tù nhiªn, §¹i häc Quèc gia Hµ Néi

s¶n xuÊt vµ cung cÊp d−íi d¹ng bét tinh thÓ. Dung m«i dïng lµm chøng lµ dÇu

h−íng d−¬ng.

3.1.1.2 Hãa chÊt

- KÝt ®Þnh l−îng c¸c enzym vµ chÊt chuyÓn hãa trong m¸u: ALT (alanin

aminotransferase), AST (aspartat amino transferase), bilirubin toµn phÇn,

protein toµn phÇn, cholesterol vµ creatinin cña h·ng Hospitex Diagnostics

(Italy) vµ h·ng DIALAB GmbH (¸o), ®Þnh l−îng trªn m¸y Screen master cña

h·ng Hospitex Diagnostics (Italy).

- Dung dÞch xÐt nghiÖm m¸u ABX Minidil LMG cña h·ng ABX-

Diagnostics, ®Þnh l−îng trªn m¸y Vet abcTM Animal Blood Counter.

- C¸c hãa chÊt xÐt nghiÖm vµ lµm tiªu b¶n m« bÖnh häc ®¹t tiªu chuÈn

phßng thÝ nghiÖm.

*)ViÖc thö ®éc tÝnh cÊp vµ ®éc tÝnh b¸n tr−êng diÔn ®−îc tiÕn hµnh t¹i Bé m«n D−îc lý,

Tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi d−íi sù chØ ®¹o cña GS TS §µo V¨n Phan.

___________________

3.1.1.3 §éng vËt thùc nghiÖm

C¸c lo¹i ®éng vËt thùc nghiÖm ®−îc sö dông trong ®Ò tµi:

- Chuét nh¾t tr¾ng (Mus musculus) chñng Swiss, thuÇn chñng, c¶ 2

gièng, tuæi 6 tuÇn, träng l−îng 20 ± 2 gam do ViÖn VÖ sinh dÞch tÔ Trung -

−¬ng cung cÊp.

- Thá chñng Orytolagus cuniculus, c¶ hai gièng, khoÎ m¹nh, l«ng tr¾ng,

nÆng 1,8- 2,5 kg do tr¹i ch¨n nu«i ViÖn KiÓm nghiÖm cung cÊp.

§éng vËt ®−îc nu«i trong ®iÒu kiÖn ®Çy ®ñ thøc ¨n vµ n−íc uèng t¹i

Phßng thÝ nghiÖm Bé m«n D−îc lý Tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi tõ 3-7 ngµy

tr−íc khi nghiªn cøu vµ trong suèt thêi gian nghiªn cøu.

3.1.1.4 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

3.1.1.4.1 X¸c ®Þnh ®éc tÝnh cÊp

§éc tÝnh cÊp ®−îc x¸c ®Þnh theo ph−¬ng ph¸p Litchfield- Wilcoxon.

Chuét nh¾t tr¾ng, nhÞn ®ãi 12 giê, ®−îc chia thµnh c¸c l« kh¸c nhau, mçi l«

10 con. Chuét ®−îc uèng thuèc (hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT) víi liÒu t¨ng

dÇn trong cïng mét khèi l−îng ®Ó x¸c ®Þnh liÒu thÊp nhÊt g©y chÕt 100%

chuét vµ liÒu cao nhÊt g©y chÕt 0%. Chuét ®−îc theo dâi t×nh tr¹ng chung

trong suèt 7 ngµy vµ tû lÖ chÕt trong 72 giê cña tõng l« sau khi uèng thuèc.

3.1.1.4.2 X¸c ®Þnh ®éc tÝnh b¸n tr−êng diÔn

C¸c thá cña mçi thÝ nghiÖm ®Òu ®−îc chia thµnh 3 l«, mçi l« 10 con

- L« chøng: uèng dung m«i lµ dÇu h−íng d−¬ng 1 ml/ kg/ ngµy

- L« trÞ 1: uèng ChÕ phÈm CT víi liÒu 3 mg/ kg/ ngµy (t−¬ng ®−¬ng víi

liÒu dïng dù kiÕn cho ng−êi)

- L« trÞ 2: uèng ChÕ phÈm CT liÒu 9 mg/ kg/ ngµy (gÊp 3 lÇn liÒu dïng

dù kiÕn cho ng−êi).

- L« trÞ 3: uèng hîp chÊt 1 liÒu 3 mg/ kg/ ngµy (t−¬ng ®−¬ng liÒu dïng

dù kiÕn cho ng−êi).

- L« trÞ 4: uèng hîp chÊt 1 liÒu 9 mg/ kg/ ngµy (gÊp 3 lÇn liÒu dïng dù

kiÕn cho ng−êi).

TÊt c¶ c¸c thá ®−îc uèng trong 4 tuÇn liÒn, mçi ngµy 1 lÇn vµo buæi

s¸ng, víi l−îng h»ng ®Þnh 1 ml/ kg.

C¸c chØ tiªu theo dâi tr−íc vµ trong qu¸ tr×nh nghiªn cøu:

- T×nh tr¹ng chung, thÓ träng cña thá

- §¸nh gi¸ chøc phËn t¹o m¸u th«ng qua c¸c chØ sè: sè l−îng hång cÇu,

hµm l−îng hemoglobin, hematocrit, sè l−îng b¹ch cÇu, c«ng thøc b¹ch cÇu vµ

sè l−îng tiÓu cÇu.

- §¸nh gi¸ chøc n¨ng gan th«ng qua ®Þnh l−îng mét sè enzym vµ chÊt

chuyÓn hãa trong m¸u: ALT, AST, bilirubin toµn phÇn, protein toµn phÇn,

albumin vµ cholesterol.

- §¸nh gi¸ chøc n¨ng thËn b»ng ®Þnh l−îng creatinin huyÕt thanh

TÊt c¶ c¸c xÐt nghiÖm trªn ®−îc ®¸nh gi¸ t¹i 3 thêi ®iÓm: tr−íc uèng

thuèc, sau 2 tuÇn vµ 4 tuÇn uèng thuèc. Sau 4 tuÇn uèng thuèc giÕt 30% sè thá

®Ó kiÓm tra m« bÖnh häc, sè cßn l¹i ngõng uèng thuèc vµ nu«i thªm 2 tuÇn

n÷a, sau ®ã kiÓm tra l¹i c¸c th«ng sè trªn ®Ó ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng phôc håi cña

thá (nÕu thuèc cã ®éc tÝnh) hoÆc kh¶ n¨ng g©y ®éc tÝnh chËm cña thuèc.

- M« bÖnh häc: sau 4 tuÇn uèng thuèc vµ sau khi ngõng uèng thuèc 2

tuÇn, thá ®−îc mæ ®Ó quan s¸t ®¹i thÓ toµn bé c¸c c¬ quan. KiÓm tra ngÉu

nhiªn cÊu tróc vi thÓ gan, thËn cña thá ë mçi l« sau 4 tuÇn uèng thuèc vµ sau

khi ngõng uèng thuèc 2 tuÇn.

XÐt nghiÖm vi thÓ ®−îc lµm t¹i Bé m«n Gi¶i phÉu bÖnh, Tr−êng

§HYHN do PGS TS TrÇn V¨n Hîp chñ tr×.

3.1.1.5 Xö lý sè liÖu

C¸c sè liÖu nghiªn cøu ®−îc xö lý thèng kª theo ph−¬ng ph¸p t-test

Student vµ test “tr−íc-sau” (Avant-Apres).

Sù kh¸c biÖt cã ý nghÜa khi p < 0,05.

3.1.2 KÕt qu¶ nghiªn cøu

3.1.2.1 §éc tÝnh cÊp trªn chuét nh¾t tr¾ng

Chuét nh¾t tr¾ng c¶ 2 gièng nÆng 18- 22g ®−îc uèng hîp chÊt 1 vµ ChÕ

phÈm CT víi liÒu t¨ng dÇn tõ 50 mg/ kg ®Õn 500 mg/ kg trong cïng mét thÓ

tÝch.

Theo dâi chuét trong 72 giê ë ®iÒu kiÖn phßng thÝ nghiªm thÊy sau khi

uèng thuèc chuét ë c¸c l« ho¹t ®éng b×nh th−êng, ¨n uèng tèt, kh«ng thÊy

chuét nµo cã biÓu hiÖn ngé ®éc. Kh«ng cã chuét nµo chÕt ë tÊt c¶ c¸c l«

nghiªn cøu (sau 4 giê uèng thuèc chuét ®i ph©n h¬i láng, sau ®ã ph©n b×nh

th−êng).

3.1.2.2 §éc tÝnh b¸n tr−êng diÔn

3.1.2.2.1 T×nh tr¹ng chung vµ sù thay ®æi thÓ träng cña thá

- T×nh tr¹ng chung: Trong suèt thêi gian thùc nghiÖm, thá ë c¶ 5 l« ho¹t

®éng b×nh th−êng, nhanh nhÑn, ¨n uèng tèt, l«ng m−ît, ph©n kh«. Kh«ng thÊy

biÓu hiÖn bÊt th−êng ë c¶ 5 l« thá trong suèt thêi gian nghiªn cøu.

- Thay ®æi thÓ träng thá: TiÕn hµnh c©n thá tr−íc, trong vµ sau khi thÝ

nghiÖm, kÕt qu¶ ®−îc ghi l¹i ë B¶ng 3.1.

B¶ng 3.1: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn thÓ träng thá

C©n nÆng (kg)

p (t- test Student)

Thêi gian

L« trÞ 1 ( n= 10)

L« chøng (n = 10) 2,39± 0,32 2,23± 0,25

L« trÞ 2 ( n= 10) 2,16± 0,16

L« trÞ 3 ( n= 10) 2,27± 0,17

L« trÞ 4 ( n= 10) 2,24± 0,25 > 0,05

2,52± 0,11 2,31± 0,12

2,27± 0,15

2,54± 0,18

2,55± 0,21 > 0,05

> 0,05

< 0,05

2,64± 0,09 2,51± 0,15

2,42± 0,14

2,63± 0,20

2,65± 0,19 > 0,05

< 0,05

Tr−íc uèngthuèc Sau 2 tuÇn uèng thuèc p (tr−íc- sau) Sau 4 tuÇn uèng thuèc p ( tr−íc- sau)

KÕt qu¶ cho thÊy sau 2- 4 tuÇn uèng thuèc, träng l−îng thá ë c¸c l«

dïng ho¹t chÊt ent-kauran ditecpenoit vµ l« chøng ®Òu t¨ng so víi tr−íc khi

nghiªn cøu. Kh«ng cã sù kh¸c biÖt vÒ møc ®é gia t¨ng träng l−îng thá gi÷a l«

chøng vµ c¸c l« dïng thuèc (p> 0,05).

3.1.2.2.2 §¸nh gi¸ chøc n¨ng t¹o m¸u

3.1.2.2.2.1 Sè l−îng hång cÇu

DiÔn biÕn vÒ sè l−îng hång cÇu thá qua 4 tuÇn dïng thuèc ®−îc tr×nh

bµy trong B¶ng 3.2:

B¶ng 3.2: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn sè l−îng hång cÇu trong m¸u thá

p (t-test Student)

Thêi gian

L« trÞ 1 ( n= 10)

L« chøng (n = 10) 4,79± 0,32 4,83± 0,74

Sè l−îng hång cÇu (triÖu/ mm3) L« trÞ 3 ( n= 10) 4,21± 0,39

L« trÞ 2 ( n= 10) 5,14± 0,51

L« trÞ 4 ( n= 10) 4,73± 0,44 > 0,05

4,71± 0,58 5,15± 0,25

5,28± 0,42

4,31± 0,51

4,94± 0,38 > 0,05

> 0,05

4,77± 0,38 4,94± 0,41

5,37± 0,39 4,43± 0,39 4,96± 0,39 > 0,05

> 0,05

Tr−íc uèngthuèc Sau 2 tuÇn uèngthuèc p (tr−íc- sau) Sau 4 tuÇn uèng thuèc p ( tr−íc- sau)

KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy víi liÒu 3 mg/ kg/ ngµy vµ 9 mg/ kg/ ngµy

hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT kh«ng ¶nh h−ëng tíi sè l−îng hång cÇu thá so

víi tr−íc dïng thuèc vµ so víi l« chøng (p > 0,05).

3.1.2.2.2.2 Hµm l−îng huyÕt s¾c tè

KÕt qu¶ ®Þnh l−îng huyÕt s¾c tè ®−îc ghi trong B¶ng 3.3:

HuyÕt s¾c tè (g/ dL)

Thêi gian

(t-

p test Student

L« trÞ 2 ( n= 10)

L« trÞ 1 ( n= 10)

L« chøng L« trÞ 3 (n = 10) ( n= 10) 9,85 ± 0,21 10,00±1,59 11,00±1,02 8,48±0,77

L« trÞ 4 ( n= 10) 9,75 ± 0,68 > 0,05

10,04±0,77 11,00±0,77

11,20±0,85 9,23± 1,20 10,21±0,69 > 0,05

> 0,05

11,57±2,81 10,70±1,13 11,40±1,01 9,20± 1,09 10,21±0,97 > 0,05

> 0,05

B¶ng 3.3: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn hµm l−îng huyÕt s¾c tè trong m¸u thá

Tr−íc uèngthuèc Sau 2 tuÇn uèngthuèc (tr−íc- p sau) Sau 4 tuÇn uèngthuèc p ( tr−íc- sau)

Qua nghiªn cøu chóng t«i thÊy sau 4 tuÇn uèng thuèc, hµm l−îng huyÕt

s¾c tè ë c¶ 4 l« thá dïng ho¹t chÊt ent-kauran ditecpenoit kh«ng cã g× thay

®æi so víi tr−íc dïng thuèc vµ so víi l« chøng (p > 0,05).

3.1.2.2.2.3 Hematocrit

Hematocrit (%)

p (t- test Student)

B¶ng 3.4: ¶nh h−ëng cña hîp ch©t 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn hematocrit trong m¸u thá

L« chøng (n = 10) 34,0 ± 2,7

L« trÞ 1 ( n= 10) 30,6 ± 4,8

L« trÞ 2 ( n= 10) 32,1 ± 4,4

L« trÞ 3 ( n= 10) 28,7 ± 2,9

L« trÞ 4 ( n= 10) 29,6 ± 1,8 > 0,05

32,8 ± 2,4

32,6 ± 1,9

32,2 ± 2,4

28,6 ± 3,4

31,4 ± 2,2 > 0,05

> 0,05

32,3 ± 2,4

31,5± 2,88 33,6 ± 2,8

30,9 ± 2,4

31,3 ± 2,5 > 0,05

> 0,05

Thêi gian

Tr−íc uèngthuèc Sau 2 tuÇn uèng thuèc (tr−íc- p sau) Sau 4 tuÇn uèng thuèc p ( tr−íc- sau)

KÕt qu¶ tr×nh bµy ë B¶ng 3.4 cho thÊy hematocrit kh«ng thay ®æi ë 4 l«

thá dïng ho¹t chÊt ent-kauran ditecpenoit liÒu 3 mg/ kg/24 giê vµ 9 mg/ kg/24

giê.

3.1.2.2.2.4 Sè l−îng b¹ch cÇu

Sè l−îng b¹ch cÇu cña thá qua 4 tuÇn uèng thuèc ®−îc ghi ë B¶ng 3.5:

p (t- test Student)

Thêi gian

L« trÞ 1 ( n= 10)

L« chøng (n = 10) 5,09± 1,13 5,55 ± 1,7

Sè l−îng b¹ch cÇu (ngh×n/ mm3) L« trÞ 3 ( n= 10) 4,50± 1,19

L« trÞ 2 ( n= 10) 5,18± 1,87

L« trÞ 4 ( n= 10) 4,34± 1,63 > 0,05

6,09± 1,41 5,97± 1,82 5,46± 1,22

4,48± 1,01

4,64± 1,27 > 0,05

> 0,05

5,33± 0,88 4,76± 1,64

5,56± 1,41

4,16± 0,87

4,72± 0,67 > 0,05

> 0,05

B¶ng 3.5: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn sè l−îng b¹ch cÇu trong m¸u thá

Tr−íc uèngthuèc Sau 2 tuÇn uèng thuèc p (trø¬c- sau) Sau 4 tuÇn uèng thuèc p ( tr−íc- sau)

KÕt qu¶ cña b¶ng 3.5 cho thÊy sau 4 tuÇn uèng thuèc, sè l−îng b¹ch

cÇu cña thá uèng ho¹t chÊt ent-kauran ditecpenoit thay ®æi kh«ng cã ý nghÜa

so víi tr−íc khi dïng thuèc vµ so víi l« chøng (p > 0,05).

3.1.2.2.2.5 C«ng thøc b¹ch cÇu

Sau 4 tuÇn uèng thuèc, c«ng thøc b¹ch cÇu cña thá ®−îc ghi ë B¶ng 3.6:

Sè l−îng b¹ch cÇu (ngh×n/ mm3)

Thêi gian

p (t- test Student)

Thµnh phÇn

Tr−íc uèng

Lympho

> 0,05

thuèc

Trung tÝnh

Sau 2 tuÇn

Lympho

> 0,05

uèng thuèc

Trung tÝnh

L« chøng (n = 10) 88,4± 7,2 12,6± 7,9 88,8± 6,3 11,2± 6,2

L« trÞ 1 ( n= 10) 91,4± 4,1 8,6 ± 4,1 91,6± 5,9 9,1 ± 6,5

L« trÞ 2 ( n= 10) 85,2± 9,8 14,8± 9,7 91,0± 7,3 9,0 ± 7,3

L« trÞ 3 ( n= 10) 89,2± 4,9 9,8 ± 3,4 89,2± 5,4 10,8± 5,4

L« trÞ 4 ( n= 10) 88,7± 7,8 11,3± 7,7 88,1± 4,7 11,9± 4,7

p (tr−íc-

> 0,05

sau)

Sau 4 tuÇn

Lympho

> 0,05

uèng thuèc

Trung tÝnh

89,4± 5,3 10,2± 5,6

92,8± 3,8 7,2 ± 3,7

90,3± 3,6 9,5 ± 3,3

91,0± 6,1 8,0 ± 3,7

89,8± 5,8 10,2± 5,7

p (tr−íc-

> 0,05

B¶ng 3.6: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn c«ng thøc b¹ch cÇu trong m¸u thá

sau) Ghi chó: Trung tÝnh = B¹ch cÇu trung tÝnh

KÕt qu¶ cho thÊy tû lÖ b¹ch cÇu lympho vµ ®a nh©n trung tÝnh thay ®æi

kh«ng cã ý nghÜa ë 4 l« thá dïng thuèc (p> 0,05).

3.1.2.2.2.6 Sè l−îng tiÓu cÇu

C¸c kÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 3.7.

p (t- test Student)

B¶ng 3.7: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn sè l−îng tiÓu cÇu trong m¸u thá

L« trÞ 1 ( n= 10)

L« chøng (n = 10) 231 ± 69,7 256 ± 90,6

Sè l−îng tiÓu cÇu (ngh×n/ mm3) L« trÞ 3 ( n= 10) 231 ± 47,5

L« trÞ 2 ( n= 10) 251 ± 70,7

L« trÞ 4 ( n= 10) 245 ± 39,0 > 0,05

242 ± 51,2 233 ± 51,3

220 ± 88,3

229 ± 21,2

253 ± 27,3 > 0,05

> 0,05

208 ± 32,2 213 ± 44,7

209 ± 62,8

244 ± 29,9

269 ± 25,5 > 0,05

> 0,05

Tr−íc uèngthuèc Sau 2 tuÇn uèng thuèc p (tr−íc- sau) Sau 4 tuÇn uèng thuèc p ( tr−íc- sau)

Thêi gian

Sau 4 tuÇn uèng thuèc, sè l−îng tiÓu cÇu cña thá kh«ng cã sù thay ®æi

®¸ng kÓ ë c¶ 2 liÒu 3mg/ kg/ 24 giê vµ 9mg/ kg/ 24 giê.

3.1.2.2.3 §¸nh gi¸ chøc n¨ng gan

Thêi gian

p (t- test Student)

Ho¹t ®é AST (UI/ L) L« trÞ 2 ( n= 10)

L« trÞ 1 ( n= 10)

L« trÞ 3 ( n= 10)

L« trÞ 4 ( n= 10)

> 0,05

54,4 ± 6,4

52,5 ± 6,4

48,5 ± 9,3

49,8 ± 5,9

> 0,05

46,1 ± 4,9

52,5 ± 6,1

46,2 ± 4,4

49,2 ± 3,0

> 0,05

50,3 ± 7,3

53,8 ± 9,4

43,6 ± 5,4

47,9 ± 4,3

> 0,05

50,1 ± 5,7

52,1 ± 4,5

52,2 ± 5,4

45,9 ± 4,3

49,5 ± 3,0

> 0,05

L« chøng (n = 10) Tr−íc uèng thuèc 50,9 ± 5,2 Sau 2 tuÇn uèng thuèc 49,4 ± 4,3 p (tr−íc- sau) Sau 4 tuÇn uèng thuèc 51,8 ± 7,9 p (tr−íc- sau) Sau ngõng thuèc 2 tuÇn p (tr−íc- sau)

B¶ng 3.8: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn ho¹t ®é AST trong m¸u thá

Thêi gian

p (t- test Student)

L« chøng (n = 10)

Ho¹t ®é ALT (UI/ L) L« trÞ 2 ( n= 10)

L« trÞ 1 ( n= 10)

L« trÞ 3 ( n= 10)

L« trÞ 4 ( n= 10)

> 0,05

65,8 ± 6,5

72,0 ± 6,1

66,9 ± 6,9

64,2 ± 6,8

66,4 ± 8,5

> 0,05

65,9 ± 4,9

66,5 ± 9,0

68,4 ± 9,6

65,4 ± 4,3

67,3 ± 5,1

> 0,05

66,4 ± 6,4

66,9 ± 7,9

67,9 ± 8,4

64,9 ± 5,4

67,5 ± 5,5

> 0,05

65,2 ±8,1

64,6 ± 4,2

62,7 ± 5,3

63,3 ± 4,8

> 0,05

Tr−íc uèng thuèc Sau 2 tuÇn uèng thuèc p (tr−íc- sau) Sau 4 tuÇn uèng thuèc p (tr−íc- sau) Sau ngõng thuèc 2 tuÇn 64,4 ± 6,4 p (tr−íc- > 0,05 sau)

B¶ng 3.9: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn ho¹t ®é ALT trong m¸u thá

Thêi gian

p (t- test Student)

L« chøng (n = 10)

L« trÞ 1 ( n= 10)

L« trÞ 3 ( n= 10)

L« trÞ 4 ( n= 10)

> 0,05

12,2 ± 0,6

12,0 ± 0,6

12,4 ± 0,4

12,3 ± 0,3

12,1 ± 0,5

> 0,05

12,2 ± 0,5

12,1 ± 0,5

12,3 ± 0,3

12,3 ± 0,4

12,4 ± 0,7

> 0,05

12,2 ± 0,3

12,3 ± 0,3

12,4 ± 0,4

12,3 ± 0,3

12,4 ± 0,6

> 0,05

12,1 ± 0,2

12,2 ± 0,5

12,3 ± 0,3

12,3 ± 0,2

> 0,05

Tr−íc uèng thuèc Sau 2 tuÇn uèng thuèc p (tr−íc- sau) Sau 4 tuÇn uèng thuèc p (tr−íc- sau) Sau ngõng thuèc 2 tuÇn 12,1 ± 1,2 p (tr−íc- > 0,05 sau)

B¶ng 3.10: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn hµm l−îng bilirubin toµn phÇn trong m¸u thá Bilirubin toµn phÇn (mmol/ L) L« trÞ 2 ( n= 10)

Thêi gian

p (t- test Student)

L« chøng (n = 10)

Protein toµn phÇn (g/L) L« trÞ 2 ( n= 10)

L« trÞ 1 ( n= 10)

L« trÞ 3 ( n= 10)

L« trÞ 4 ( n= 10)

> 0,05

61,5 ± 3,8

60,5 ± 4,9

62,5 ± 5,4

69,1 ± 2,6

69,0 ± 2,7

> 0,05

61,2 ± 3,5

62,0 ± 4,2

62,9 ± 4,9

67,2 ± 2,0

67,1 ± 2,1

(tr−íc-

> 0,05

61,6 ± 1,9

61,5 ± 2,7

61,4 ± 5,6

66,7 ± 2,5

67,1 ± 2,2

(tr−íc-

> 0,05

59,2 ± 7,6

61,7 ± 3,0

61,2 ± 2,8

69,8 ± 2,1

69,0 ± 2,5

(tr−íc-

> 0,05

Tr−íc uèng thuèc Sau 2 tuÇn uèng thuèc p sau) Sau 4 tuÇn uèng thuèc p sau) Sau ngõng 2 thuèc tuÇn p sau)

B¶ng 3.11: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn hµm l−îng protein toµn phÇn trong m¸u thá

Thêi gian

p (t- test Student)

L« chøng (n = 10)

Cholesterol (mmol/ L) L« trÞ 2 ( n= 10)

L« trÞ 3 ( n= 10)

L« trÞ 1 ( n= 10)

L« trÞ 4 ( n= 10)

> 0,05

2,57± 0,25 2,60± 0,27

2,99± 0,46

1,88± 0,13

1,90± 0,26

> 0,05

2,56± 0,28 2,60± 0,23

1,95± 0,11

1,89± 0,20

2,88 ± 0,45

> 0,05

2,27± 0,43 2,69± 0,52

1,98± 0,14

2,08± 0,26

2,73 ± 0,73

> 0,05

2,33± 0,21 2,68± 0,42

2,00± 0,16

2,08± 0,36

2,70 ± 0,44

> 0,05

Tr−íc uèng thuèc Sau 2 tuÇn uèng thuèc p (tr−íc- sau) Sau 4 tuÇn uèng thuèc p (tr−íc- sau) Sau ngõng thuèc 2 tuÇn p (tr−íc- sau)

B¶ng 3.12: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn hµm l−îng cholesterol trong m¸u thá

Thêi gian

p (t- test Student)

L« chøng (n = 10)

L« trÞ 1 ( n= 10)

Albumin (g/L) L« trÞ 2 ( n= 10)

L« trÞ 3 ( n= 10)

L« trÞ 4 ( n= 10)

> 0,05

5,10± 0,08 5,07± 0,07

5,10± 0,05

5,06± 0,14

5,06± 0,09

> 0,05

5,12± 0,06 5,12± 0,09

5,02± 0,09

5,05± 0,08

> 0,05

Tr−íc uèng thuèc Sau 2 tuÇn uèng thuèc p (tr−íc- sau)

B¶ng 3.13: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn hµm l−îng albumin trong m¸u thá

> 0,05

5,06± 0,07 5,09± 0,11

5,06± 0,10

5,03± 0,06

5,06± 0,11

> 0,05

5,13± 0,06 5,10± 0,08

5,17± 0,15

5,00± 0,10

5,00± 0,12

> 0,05

Sau 4 tuÇn uèng thuèc p (tr−íc- sau) Sau ngõng thuèc 2 tuÇn p ( tr−íc- sau)

KÕt qu¶ ë c¸c b¶ng 3.8, 3.9, 3.10, 3.11, 3.12 vµ 3.13 cho thÊy sau 2 ®Õn

4 tuÇn uèng ho¹t chÊt ent-kauran ditecpenoit tÊt c¶ c¸c xÐt nghiÖm ®¸nh gi¸

chøc n¨ng gan (AST, ALT, bilirubin toµn phÇn, protein toµn phÇn, cholesterol

vµ albumin ë c¸c l« trÞ 1 vµ 3 (uèng ho¹t chÊt liÒu 3 mg/ kg/ 24 giê) vµ ë c¸c

l« trÞ 2 vµ4 (uèng ho¹t chÊt liÒu 9 mg/ kg/24 giê) ®Òu kh«ng cã sù kh¸c biÖt cã

ý nghÜa thèng kª so víi l« chøng vµ so s¸nh gi÷a 2 thêi ®iÓm tr−íc vµ sau khi

uèng thuèc (p> 0,05).

3.1.2.2.4 §¸nh gi¸ chøc n¨ng thËn

§Ó theo dâi ¶nh h−ëng cña thuèc tíi chøc n¨ng läc cña cÇu thËn, ®·

tiÕn hµnh ®Þnh l−îng creatinin trong huyÕt thanh (B¶ng 3.14).

Thêi gian

p (t- test Student)

L« chøng (n = 10)

L« trÞ 1 ( n= 10)

Creatinin (mg/dL) L« trÞ 2 ( n= 10)

L« trÞ 3 ( n= 10)

L« trÞ 4 ( n= 10)

> 0,05

1,05± 0,05

1,04± 0,05

1,03± 0,04

1,06± 0,05 1,05± 0,05

> 0,05

1,04± 0,05 1,04± 0,05

1,02± 0,04

1,03± 0,04

1,03± 0,05

> 0,05

1,02± 0,04 1,05± 0,05

1,02± 0,04

1,06± 0,05

1,03± 0,04

> 0,05

1,07± 0,05 1,04± 0,04

1,03± 0,06

1,04± 0,05

Tr−íc uèng thuèc Sau 2 tuÇn uèng thuèc p (tr−íc- sau) Sau 4 tuÇn uèng thuèc p ( tr−íc- sau) Sau ngõng thuèc 2 tuÇn

B¶ng 3.14: ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT ®Õn hµm l−îng creatinin trong m¸u thá

> 0,05

p ( tr−íc- sau)

KÕt qu¶ ®−îc ghi l¹i trªn B¶ng 3.14 cho thÊy: sau 2 ®Õn 4 tuÇn uèng

thuèc ë c¶ c¸c l« trÞ 1 vµ 2 (uèng ChÕ phÈm CT) vµ c¸c l« trÞ 3 vµ 4 (uèng hîp

chÊt 1 ), l−îng creatinin trong m¸u thá kh«ng cã sù thay ®æi kh¸c biÖt so víi

l« chøng vµ so s¸nh gi÷a hai thêi ®iÓm tr−íc vµ sau khi uèng thuèc (p> 0,05).

3.1.2.2.5 Thay ®æi vÒ m« bÖnh häc

3.1.2.2.5.1 §¹i thÓ

Trªn tÊt c¶ c¸c thá thùc nghiÖm (4 l« dïng thuèc vµ l« chøng) kh«ng

quan s¸t thÊy cã sù thay ®æi bÖnh lý nµo vÒ mÆt ®¹i thÓ cña c¸c c¬ quan tim,

phæi, gan, l¸ch, tuþ, thËn vµ hÖ thèng tiªu ho¸.

3.1.2.2.5.2. Vi thÓ

* H×nh th¸i vi thÓ gan

H×nh th¸i vi thÓ gan sau 4 tuÇn uèng thuèc:

- L« chøng: 2/3 mÉu bÖnh phÈm lµm xÐt nghiÖm vi thÓ cã tÕ bµo gan

b×nh th−êng, kh«ng tho¸i hãa, kh«ng ho¹i tö. TÜnh m¹ch trung t©m vµ xoang

m¹ch kh«ng xung huyÕt. Kho¶ng cöa kh«ng cã x©m nhËp viªm. Cã 1/3 mÉu

bÖnh phÈm cã h×nh ¶nh tho¸i hãa h¹t nhÑ ë mét sè tÕ bµo gan.

- L« trÞ 1 uèng ChÕ phÈm CT liÒu 3mg/ kg/ 24 giê: 2/3 mÉu bÖnh phÈm

cã h×nh ¶nh vi thÓ tÕ bµo gan hoµn toµn b×nh th−êng. Kho¶ng cöa kh«ng cã

x©m nhËp tÕ bµo lympho. TÜnh m¹ch trung t©m kh«ng xung huyÕt. Cã 1/3 mÉu

bÖnh phÈm cã tho¸i hãa h¹t, tho¸i hãa hèc nhÑ tÕ bµo gan quanh tÜnh m¹ch

trung t©m, kho¶ng cöa cã x©m nhËp viªm m¹n nhÑ.

- L« trÞ 2 uèng ChÕ phÈm CT liÒu 9 mg/ kg/ 24 giê: c¸c tiÓu thuú gan

cã cÊu tróc b×nh th−êng, kho¶ng cöa kh«ng viªm, xoang m¹ch kh«ng xung

huyÕt. Kh«ng cã tho¸i hãa ho¹i tö tÕ bµo gan.

- L« trÞ 3 uèng hîp chÊt 1 liÒu 3 mg/ kg/ 24 giê: 2/3 mÉu bÖnh phÈm tÕ

bµo gan kh«ng cã tho¸i hãa ho¹i tö. C¸c xoang m¹ch vµ tÜnh m¹ch trung t©m

kh«ng xung huyÕt. Cã 1/3 mÉu bÖnh phÈm cã h×nh ¶nh tho¸i hãa h¹t nhÑ ë

mét sè tÕ bµo gan.

- L« trÞ 4 uèng hîp chÊt 1 liÒu 9 mg/ kg/ 24 giê: c¸c tÕ bµo gan kh«ng

cã tho¸i hãa, ho¹i tö. TÜnh m¹ch trung t©m vµ xoang m¹ch kh«ng xung huyÕt.

Kho¶ng cöa kh«ng viªm.

1. TÜnh m¹ch trung t©m tiÓu thuú

2: TÕ bµo gan

HE × 100: nhuém Hematoxylin- Eosin, ®é phãng ®¹i 100 lÇn

¶nh 3.1: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« chøng (HE × 100)

¶nh 3.2: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« chøng (HE × 250) → tÕ bµo gan bÞ tho¸i hãa h¹t nhÑ

1.kho¶ng cöa

2: TÕ bµo gan

¶nh 3.3: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« trÞ 1 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 100)

¶nh 3.4: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« trÞ 1 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 400) → tÕ bµo gan bÞ tho¸i hãa h¹t, tho¸i hãa hèc nhÑ

1. TÜnh m¹ch trung t©m tiÓu thuú

2. TÕ bµo gan

¶nh 3.5: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« trÞ 2 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 250)

1. Kho¶ng cöa

2. TÕ bµo gan

¶nh 3.6: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« trÞ 3 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 100)

¶nh 3.7: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« trÞ 3 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 400) → tÕ bµo gan bÞ tho¸i hãa h¹t nhÑ

1. TÜnh m¹ch trung t©m tiÓu thuú

2. TÕ bµo gan

¶nh 3.8: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« trÞ 4 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 250)

H×nh th¸i vi thÓ gan sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn:

- L« chøng: tÕ bµo gan b×nh th−êng, kh«ng cã tho¸i hãa ho¹i tö. Xoang

m¹ch vµ tÜnh m¹ch trung t©m kh«ng xung huyÕt. 2/3 mÉu bÖnh phÈm cã

kho¶ng cöa cã x©m nhËp viªm m¹n nhÑ.

- L« trÞ 1: uèng ChÕ phÈm CT liÒu 3 mg/ kg/ 24 giê: 1/3 mÉu bÖnh

phÈm tÕ bµo gan cã cÊu tróc b×nh th−êng. Cã 2/3 mÉu bÖnh phÈm tÕ bµo gan

cã tho¸i hãa h¹t nhÑ, c¸c xoang m¹ch xung huyÕt.

- L« trÞ 2: uèng ChÕ phÈm CT liÒu 9 mg/ kg/ 24 giê: gan trong giíi h¹n

b×nh th−êng, kh«ng cã tho¸i hãa ho¹i tö. C¸c xoang m¹ch kh«ng xung huyÕt.

- L« trÞ 3: uèng hîp chÊt 1 liÒu 3 mg/ kg/ 24 giê: tÕ bµo gan cã cÊu tróc

b×nh th−êng, kh«ng tho¸i hãa ho¹i tö. Kh«ng xung huyÕt tÜnh m¹ch trung t©m

vµ c¸c xoang m¹ch.

- L« trÞ 4: uèng hîp chÊt 1 liÒu 9 mg/ kg/ 24 giê: 1/3 mÉu bÖnh phÈm tÕ

bµo gan trong giíi h¹n b×nh th−êng. Cã 2/3 mÉu bÖnh phÈm nhu m« gan cã

mét sè æ ho¹i tö tÕ bµo x©m nhËp viªm, tÕ bµo ngoµi vïng ho¹i tö cã tho¸i hãa

h¹t, hèc nhá ®ång ®Òu.

1. Kho¶ng cöa

2. TÕ bµo gan

¶nh 3.9: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« chøng sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn (HE × 100)

¶nh 3.10: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« chøng sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn (HE × 250) → kho¶ng cöa cã x©m nhËp viªm m¹n nhÑ

¶nh 3.11: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« trÞ 1 sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn

1. TÜnh m¹ch trung t©m tiÓu thuú

2. TÕ bµo gan

100

(HE × 100)

¶nh 3.12: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« trÞ 1 sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn (HE × 400) → tÕ bµo gan cã tho¸i hãa h¹t nhÑ

1. Kho¶ng cöa

2. TÕ bµo gan

101

¶nh 3.13: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« trÞ 2 sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn (HE × 100)

¶nh 3.14: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« trÞ 3 sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn (HE × 100) 1. TÜnh m¹ch trung t©m tiÓu 2. TÕ bµo gan

1. TÜnh m¹ch trung t©m tiÓu thuú

2. TÕ bµo gan

102

¶nh 3.15: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« trÞ 4 sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn (HE × 250)

* H×nh th¸i vi thÓ thËn H×nh th¸i vi thÓ thËn sau 4 tuÇn uèng thuèc

¶nh 3.16: H×nh th¸i vi thÓ gan thá l« trÞ 4 sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn → Tho¸i hãa h¹t, hèc nhá

- L« chøng: thËn cã cÊu tróc b×nh th−êng, cÇu thËn kh«ng xung huyÕt.

CÇu thËn vµ èng thËn kh«ng cã tæn th−¬ng. M« kÏ kh«ng xung huyÕt, kh«ng

viªm, khoang Bowman kh«ng cã dÞch, kh«ng cã hång cÇu.

- L« trÞ 1 uèng ChÕ phÈm CT liÒu 3 mg/ kg/ 24 giê: cÇu thËn b×nh

th−êng, èng thËn kh«ng cã tho¸i hãa long tÕ bµo. M« kÏ c¸c m¹ch xung huyÕt

nhÑ.

- L« trÞ 2 uèng ChÕ phÈm CT liÒu 9 mg/ kg/ 24 giê: cÇu thËn vµ èng

thËn kh«ng cã tæn th−¬ng. M« kÏ kh«ng xung huyÕt, kh«ng viªm.

- L« trÞ 3 uèng hîp chÊt 1 liÒu 3 mg/ kg/ 24 giê: cÇu thËn kh«ng xung

huyÕt. C¸c èng thËn kh«ng cã tho¸i hãa tÕ bµo, trong lßng kh«ng cã trô

103

albumin. 1/3 mÉu bÖnh phÈm m« kÏ cã mét sè æ viªm m¹n.

- L« trÞ 4 uèng hîp chÊt 1 liÒu 9 mg/ kg/ 24 giê: 2/3 mÉu bÖnh phÈm

cÇu thËn cã cÊu tróc b×nh th−êng, c¸c èng thËn kh«ng cã tæn th−¬ng; m« kÏ

kh«ng xung huyÕt, kh«ng viªm. Cã 1/3 mÉu bÖnh phÈm c¸c cÇu thËn xung

huyÕt nhÑ, kho¶ng Bowman hÑp, ë trong lßng mét sè èng thËn cã trô albumin,

m« kÏ r¶i r¸c cã æ viªm m¹n tÝnh.

1. TiÓu cÇu thËn

2. èng thËn

¶nh 3.17: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« chøng (HE × 100)

105

1. TiÓu cÇu thËn

2. èng thËn

¶nh 3.18: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 1 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 100)

¶nh 3.19: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 1 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 250) → M« kÏ xung huyÕt nhÑ

106

¶nh 3.20: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 2 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 100)

1. TiÓu cÇu thËn

2. èng thËn

1. TiÓu cÇu thËn

2. èng thËn

¶nh 3.21: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 3 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 250)

107

1. TiÓu cÇu thËn

2. èng thËn

¶nh 3.22: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 4 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 250)

¶nh 3.23: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 3 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 250) → cÇu thËn xung huyÕt nhÑ

108

¶nh 3.24: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 4 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 250) → èng thËn cã trô albumin

¶nh 3.25: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 4 sau 4 tuÇn uèng thuèc (HE × 250) → viªm thËn kÏ æ r¶i r¸c H×nh th¸i vi thÓ thËn sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn:

- L« chøng: cÊu tróc vi thÓ thËn b×nh th−êng. 1/3 mÉu bÖnh phÈm cã

109

1/2 sè cÇu thËn cã t¨ng sinh tÕ bµo mao m¹ch, khoang Bowman rÊt hÑp. èng

thËn trong lßng cã trô albumin vµ trô h¹t.

- L« trÞ 1 uèng ChÕ phÈm CT liÒu 3 mg/ kg/ 24 giê: thËn cã cÊu tróc

b×nh th−êng, cÇu thËn vµ èng thËn kh«ng cã tæn th−¬ng. 1/3 mÉu bÖnh phÈm

m« kÏ xung huyÕt nhÑ, kh«ng cã viªm.

- L« trÞ 2 uèng ChÕ phÈm CT liÒu 9 mg/ kg/ 24 giê: 1/3 mÉu bÖnh

phÈm cÇu thËn vµ èng thËn kh«ng cã tæn th−¬ng, m« kÏ kh«ng x©m nhËp

viªm, kh«ng xung huyÕt. 1/3 mÉu bÖnh phÈm cã viªm thËn m¹n tÝnh, nhiÒu

cÇu thËn teo, èng thËn tÕ bµo tho¸i hãa, lßng èng thËn cã c¸c h×nh trô. M« kÏ

t¨ng sinh liªn kÕt x¬, x©m nhËp viªm m¹n tõng æ r¶i r¸c. 1/3 mÉu bÖnh phÈm

cã viªm thËn kÏ æ r¶i r¸c m¹n tÝnh.

- L« trÞ 3 uèng hîp chÊt 1 liÒu 3 mg/ kg/ 24 giê: cÊu tróc vi thÓ cña

thËn b×nh th−êng, èng thËn kh«ng cã tæn th−¬ng, lßng èng thËn kh«ng cã h×nh

trô. M« kÏ kh«ng viªm.

- L« trÞ 4 uèng hîp chÊt 1 liÒu 9 mg/ kg/ 24 giê: 1/3 mÉu bÖnh phÈm

thËn trong giíi h¹n b×nh th−êng, cÇu thËn kÝch th−íc ®Òu, èng thËn tÕ bµo

kh«ng tho¸i hãa, m« kÏ kh«ng xung huyÕt. 2/3 mÉu bÖnh phÈm cã xung huyÕt

cÇu thËn vµ m« kÏ, khoang Bowman hÑp.

110

1. TiÒu cÇu thËn

2. èng thËn

¶nh 3.26: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« chøng (HE × 250)

¶nh 3.27: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« chøng (HE × 250) Trô h¹t, trô albumin cña èng thËn

111

1. TiÒu cÇu thËn

2. èng thËn

¶nh 3.28: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 1 sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn (HE × 250)

¶nh 3.29: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 2 sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn (HE × 250) → cÇu thËn teo, t¨ng sinh x¬ liªn kÕt vµ viªm

112

¶nh 3.30: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 2 sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn (HE × 250) → Viªm thËn kÏ æ r¶i r¸c

1. TiÒu cÇu thËn

2. èng thËn

¶nh 3.31: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 3 sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn (HE × 250)

113

¶nh 3.32: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 4 sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn (HE × 250) → Xung huyÕt cÇu thËn

¶nh 3.33: H×nh th¸i vi thÓ thËn thá l« trÞ 4 sau ngõng uèng thuèc 2 tuÇn (HE × 250) → Xung huyÕt m« kÏ cña thËn

114

3.1.3 KÕt luËn

3.1.3.1 VÒ ®éc tÝnh cÊp

ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 theo ®−êng uèng gÊp 500 lÇn liÒu dïng dù

kiÕn cho ng−êi kh«ng cã chuét nµo chÕt nªn kh«ng tÝnh ®−îc LD50.

3.1.3.2 VÒ ®éc tÝnh b¸n tr−êng diÔn

ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 víi liÒu 3 mg/kg thÓ träng thá/24 giê

(t−¬ng ®−¬ng víi liÒu dïng dù kiÕn cho ng−êi) vµ 9 mg/kg thÓ träng thá/24

giê (gÊp 3 lÇn liÒu dïng dù kiÕn cho ng−êi) uèng liªn tôc trong 4 tuÇn, kÕt qu¶

cho thÊy:

- C¶ ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 ®Òu kh«ng g©y ¶nh h−ëng xÊu ®Õn

t×nh tr¹ng chung, träng l−îng cña thá.

- Kh«ng lµm thay ®æi kÕt qu¶ c¸c xÐt nghiÖm ®¸nh gi¸ chøc n¨ng t¹o

m¸u (sè l−îng hång cÇu, hµm l−îng hemoglobin, hematocrit, sè l−îng b¹ch

cÇu, c«ng thøc b¹ch cÇu vµ sè l−îng tiÓu cÇu).

- Kh«ng lµm thay ®æi kÕt qu¶ c¸c xÐt nghiÖm ®¸nh gi¸ chøc n¨ng gan

(AST, ALT, bilirubin toµn phÇn, protein toµn phÇn, albumin, cholesterol) vµ

chøc n¨ng thËn (creatinin).

- Kh«ng g©y tæn th−¬ng râ rµng vÒ mÆt h×nh th¸i khi quan s¸t ®¹i thÓ

c¸c c¬ quan vµ vi thÓ gan, thËn cña thá. 1/3 mÉu bÖnh phÈm ë 2 l« thá uèng

ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 liÒu 3 mg/kg/24 giê cã tho¸i hãa h¹t, tho¸i hãa

hèc nhÑ ë mét sè tÕ bµo gan. ë l« thá uèng hîp chÊt 1 9 mg/kg/24 giê 1/3

mÉu bÖnh phÈm c¸c cÇu thËn xung huyÕt nhÑ, khoang Bowman hÑp, cã trô

albumin ë lßng mét sè èng thËn, m« kÏ r¶i r¸c cã æ viªm m¹n tÝnh.

Tuy nhiªn, trong thùc tÕ chóng t«i vÉn gÆp c¸c d¹ng tæn th−¬ng nµy ë tÕ

bµo gan vµ thËn trªn thá l« chøng dïng n−íc cÊt. Theo c¸c chuyªn gia m«

bÖnh häc ®©y lµ nh÷ng tæn th−¬ng nhÑ cã thÓ phôc håi ®−îc, do c¸c yÕu tè

kh¸c kh«ng ph¶i do thuèc. Sau khi ngõng uèng ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1

hai tuÇn, sè thá cßn l¹i ë c¸c l« ®−îc lµm l¹i c¸c xÐt nghiÖm ®¸nh gi¸ chøc

115

n¨ng gan vµ chøc n¨ng thËn, ®ång thêi kiÓm tra l¹i m« bÖnh häc vÒ ®¹i thÓ c¸c

c¬ quan vµ vi thÓ cña gan, thËn thá; kÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy c¸c xÐt

nghiÖm ®¸nh gi¸ chøc n¨ng gan vµ thËn kh«ng cã sù kh¸c biÖt nµo so víi

tr−íc khi dïng thuèc. Cã mét sè tæn th−¬ng nhÑ ë gan vµ thËn thá uèng hîp

chÊt 1 liÒu 9 mg/kg/24 giê.

3.2 kh¶o s¸t ¶nh h−ëng tíi vËt liÖu di truyÒn ë sóc vËt thÝ

nghiÖm Cña ent-kauran ditecpenoit tõ c©y khæ s©m b¾c

bé*)

3.2.1 Môc tiªu

§¸nh gi¸ ¶nh h−ëng cña hîp chÊt ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-

18-yl axetat (1), ho¹t chÊt ent-kauran ditecpenoit chñ yÕu tõ c©y khæ s©m B¾c

Bé ®Õn nhiÔm s¾c thÓ tuû x−¬ng vµ tinh hoµn chuét nh¾t tr¾ng so víi nhãm

chøng.

3.2.2 Thuèc vµ ®éng vËt thùc nghiÖm

3.2.2.1 Thuèc

§èi t−îng ®−îc thö (thuèc) lµ hîp chÊt ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-

yl axetat (1), gäi t¾t lµ hîp chÊt 1 hoÆc 1 tõ c©y khæ s©m B¾c Bé do GS TSKH

Phan Tèng S¬n vµ céng sù, Khoa Hãa häc, Tr−êng §¹i häc Khoa häc tù

nhiªn, §¹i häc Quèc gia Hµ Néi s¶n xuÊt vµ cung cÊp d−íi d¹ng bét tinh thÓ.

Dung m«i dïng pha thuèc lµ dÇu h−íng d−¬ng.

*)ViÖc kh¶o s¸t ¶nh h−ëng tíi vËt liÖu di truyÒn ë sóc vËt thÝ nghiÖm cña ent-kauran

ditecpenoit tõ c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc thùc hiÖn t¹i Bé m«n Y Sinh häc – Di truyÒn,

Tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi d−íi sù chØ ®¹o cña PGS TS TrÇn ThÞ Thanh H−¬ng.

______________________

116

3.2.2.2 §éng vËt thùc nghiÖm

Chuét nh¾t tr¾ng (Mus musculus) träng l−îng 25g ± 2g do ViÖn VÖ sinh

dÞch tÔ Trung −¬ng cung cÊp. C¸c chuét ®−îc chia ngÉu nhiªn thµnh nhãm thö

nghiÖm uèng thuèc vµ nhãm chøng. C¸c chuét ®−îc nu«i trong ®iÒu kiÖn

phßng thÝ nghiÖm, chÕ ®é nu«i, ¨n, uèng theo ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung -

−¬ng.

Thêi gian ph©n tÝch nhiÔm s¾c thÓ tõ tuû x−¬ng; nhiÔm s¾c thÓ tinh

hoµn, sau khi uèng thuèc 20 ngµy.

Nhãm nghiªn cøu nhiÔm s¾c thÓ tuû gåm 12 con (6 con ®ùc, 6 con c¸i).

Nhãm nghiªn cøu tinh hoµn gåm 12 con ®ùc.

V× vËy sè l−îng mçi nhãm nghiªn cøu nh− sau:

Nhãm chøng: 18 con

6 con c¸i

12 con ®ùc

Nhãm liÒu ®iÒu trÞ: 18 con

6 con c¸i

12 con ®ùc

Nhãm liÒu ®iÒu trÞ x 3: 18 con

6 con c¸i

12 con ®ùc

3.2.3 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

§¸nh gi¸ ¶nh h−ëng cña ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat

(1) tõ c©y khæ s©m B¾c Bé ®Õn nhiÔm s¾c thÓ tuû x−¬ng vµ tinh hoµn

- LiÒu ®iÒu trÞ, liÒu ®iÒu trÞ x 3 ®−îc x¸c ®Þnh theo kÕt qu¶ nghiªn cøu

117

d−îc lý cña ®Ò tµi.

- Thêi gian uèng thuèc: theo quy tr×nh nghiªn cøu thêi gian uèng thuèc

kÐo dµi:

Víi liÒu ®iÒu trÞ; liÒu ®iÒu trÞ x3 ®· ®−îc x¸c ®Þnh; sö dông ®èi t−îng lµ

chuét nh¾t tr¾ng, chóng t«i ®· x¸c ®Þnh thêi gian uèng thuèc lµ 20 ngµy.

Sau khi uèng thuèc liÒu cuèi cïng 24 giê, chóng t«i tiÕn hµnh lµm tiªu

b¶n NST vµ ph©n tÝch NST

Nhãm chøng uèng dÇu h−íng d−¬ng víi qui tr×nh t−¬ng tù. DÇu h−íng

d−¬ng lµ thùc phÈm an toµn, dïng lµm dung m«i ®Ó pha dung dÞch thuèc.

3.2.3.1 Kü thuËt lµm tiªu b¶n

- Chuét c¸i: lµm tiªu b¶n nhiÔm s¾c thÓ tõ tÕ bµo tuû x−¬ng.

- Chuét ®ùc: lµm tiªu b¶n nhiÔm s¾c thÓ tõ tÕ bµo tuû x−¬ng vµ tinh

hoµn.

- Kü thuËt lµm tiªu b¶n nhiÔm s¾c thÓ tõ tÕ bµo tuû x−¬ng theo ph−¬ng

ph¸p cña Ford (1972).

- Kü thuËt lµm tiªu b¶n nhiÔm s¾c thÓ tõ dßng tinh theo ph−¬ng ph¸p

cña Evans (1975).

3.2.3.2 Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸

C¸c tiªu chuÈn ph©n tÝch sè l−îng, cÊu tróc nhiÔm s¾c thÓ theo tiªu chuÈn

quèc tÕ.

3.2.3.2.1 Ph©n tÝch nhiÔm s¾c thÓ tõ tÕ bµo tuû x−¬ng

NhiÔm s¾c thÓ tõ tÕ bµo tuû x−¬ng chuét ®−îc ph©n tÝch d−íi kÝnh hiÓn

vi víi ®é phãng ®¹i 1.000 lÇn.

50 kú gi÷a nguyªn nhiÔm (Metaphase)/ 1 con chuét. C¸c kú gi÷a ®¹t tiªu

chuÈn ph©n tÝch.

118

C¸c chØ sè ph©n tÝch:

- Sè l−îng: ë chuét Mus musculus 2n = 40

+ §a béi: 3n, 4n

+ LÖch béi: 2n ± 1

+ L−ìng béi: 2n

- CÊu tróc: c¸c d¹ng rèi lo¹n cÊu tróc

+ Chromatid (nhiÔm s¾c tö): gap, ®øt, trao ®æi nhiÔm s¾c tö…

+ NhiÔm s¾c thÓ: iso gap, ®øt kÐp, ®o¹n kh«ng t©m, m¶nh nhá

(minut), ring (cã t©m, kh«ng t©m), bÊt th−êng cÊu tróc nhiÔm s¾c thÓ

kh¸c.

- C¸c rèi lo¹n côm:

+ C¸c rèi lo¹n nhoÌ, n¸t côm.

- C¸c ®¬n tæn th−¬ng: 1 tÕ bµo cã 1 tæn th−¬ng.

- C¸c ®a tæn th−¬ng: trong 1 tÕ bµo cã nhiÒu tæn th−¬ng.

3.2.3.2.2 §¸nh gi¸ ®ét biÕn nhiÔm s¾c thÓ tõ tinh hoµn chuét

Tiªu b¶n nhiÔm s¾c thÓ ®−îc ®¸nh gi¸ víi ®é phãng ®¹i kÝnh hiÓn vi 1000

lÇn, ph©n tÝch > 50 nhiÔm s¾c thÓ ë giai ®o¹n Diakinesis – Metaphase ®¹t tiªu

chuÈn ph©n tÝch cña tinh bµo I / 1 chuét.

C¸c chØ sè ph©n tÝch:

- Rèi lo¹n sè l−îng:

+ §a béi: 3n, 4n

+ LÖch béi: 2n ± 1

+ L−ìng béi: 2n = 20

- Rèi lo¹n cÊu tróc:

119

+ ThÓ ®¬n trÞ nhiÔm s¾c thÓ th−êng.

+ ThÓ ®¬n trÞ nhiÔm s¾c thÓ X, Y.

+ C¸c rèi lo¹n cÊu tróc nhiÔm s¾c thÓ - chromatid.

- C¸c rèi lo¹n côm nhiÔm s¾c thÓ.

- §¬n tæn th−¬ng - ®a tæn th−¬ng.

3.2.4 KÕt qu¶

§¸nh gi¸ ¶nh h−ëng cña ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat

(1) tõ c©y khæ s©m B¾c Bé ®Õn nhiÔm s¾c thÓ tuû xư¬ng vµ tinh hoµn

C¸c chØ sè ph©n tÝch NST (ë phÇn ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu ®· tr×nh bµy)

®Òu ®ưîc ®¸nh gi¸ ë mçi chuét thùc nghiÖm; mçi nhãm thùc nghiÖm. KÕt qu¶

thu ®−îc nh− sau:

Qua kÕt qu¶ ph©n tÝch NST ë tuû, ë tinh hoµn thÊy r»ng: c¸c rèi lo¹n sè

l−îng NST, cÊu tróc chromatid, cÊu tróc NST, rèi lo¹n ®¬n trÞ ë c¸c nhãm

nghiªn cøu, chØ gÆp c¸c d¹ng tæn th−¬ng trong c¸c B¶ng 3.15 – 3.18 ®· nªu,

kh«ng gÆp c¸c d¹ng tæn thư¬ng do cÊu tróc l¹i NST: NST hai t©m, chuyÓn

®o¹n..., hÇu hÕt c¸c rèi lo¹n lµ d¹ng ®¬n tæn thư¬ng.

3.2.4.1 Ph©n tÝch sè l−îng NST tuû

120

B¶ng 3.15: So s¸nh ®ét biÕn sè l−îng nhiÔm s¾c thÓ tuû - nhãm chøng - liÒu ®iÒu trÞ - liÒu ®iÒu trÞ x 3. Thêi gian uèng thuèc kÐo dµi 20 ngµy

Sè tÕ

Sè mÉu

bµo

Tªn nhãm

nghiªn

®a béi

<40

40 >40

quan

cøu

s¸t

576

Chøng

600

96%

570

®iÒu trÞ

600

95%

0,33%

0,67%

582

®iÒu trÞ x 3

600

2,33%

97 %

0,67 %

p > 0,05

So s¸nh chøng vµ ®iÒu trÞ

p > 0,05

So s¸nh chøng vµ ®iÒu trÞ x3

p > 0,05

So s¸nh ®iÒu trÞ vµ ®iÒu trÞ x 3

p > 0,05

Qua kÕt qu¶ cña B¶ng 3.15, so s¸nh ®ét biÕn sè l−îng (lÖch béi, l−ìng

béi, ®a béi NST) NST tuû nhãm chøng, liÒu ®iÒu trÞ, liÒu ®iÒu trÞ x3; thêi gian

uèng thuèc 20 ngµy, sù kh¸c biÖt gi÷a c¸c nhãm kh«ng cã ý nghÜa thèng kª.

121

3.2.4.2 Ph©n tÝch cÊu tróc NST tuû

B¶ng 3.16: So s¸nh ®ét biÕn cÊu tróc NST tuû nhãm chøng – liÒu ®iÒu trÞ – liÒu ®iÒu trÞ x3. Thêi gian uèng thuèc 20 ngµy

Sè tÕ

NhiÔm

bµo

Sè mÉu

Rl CôM

Chromatid

Tªn nhãm

s¾c thÓ

nghiªn cøu

quan

s¸t

Chøng

600

2,67%

0,67%

®iÒu trÞ

600

3,33%

1,66%

®iÒu trÞ

600

2,67%

0,67 %

p > 0,05

So s¸nh chøng vµ ®iÒu trÞ

p > 0,05

So s¸nh chøng vµ ®iÒu trÞ x 3

p > 0,05

So s¸nh ®iÒu trÞ vµ ®iÒu trÞ x 3

B¶ng 3.16 so s¸nh ®ét biÕn cÊu tróc NST tuû nhãm chøng, liÒu ®iÒu trÞ,

liÒu ®iÒu trÞ x3, thêi gian 20 ngµy, chóng t«i thÊy r»ng: sù kh¸c biÖt gi÷a c¸c

nhãm kh«ng cã ý nghÜa thèng kª.

KÕt luËn: So s¸nh ®ét biÕn sè l−îng vµ cÊu tróc chromatid – NST ë tuû,

nhãm chøng, liÒu ®iÒu trÞ, liÒu ®iÒu trÞ x3 thêi gian uèng thuèc 20 ngµy; sù

kh¸c biÖt gi÷a c¸c nhãm kh«ng cã ý nghÜa thèng kª. Tuy nhiªn ë liÒu ®iÒu trÞ

x3 cã hiÖn t−îng rèi lo¹n côm NST (nhoÌ NST) víi tû lÖ 0,67%, nhưng kh«ng

cã ý nghÜa thèng kª.

122

3.2.4.3 Ph©n tÝch sè l−îng NST Tinh hoµn

B¶ng 3.17: So s¸nh ®ét biÕn sè lưîng NST tinh hoµn nhãm chøng – liÒu ®iÒu trÞ – liÒu ®iÒu trÞ x3. Thêi gian sö uèng thuèc 20 ngµy

Sè mÉu

Sè tÕ bµo

Tªn

®a béi

nghiªn

<40

40 >40

quan s¸t

nhãm

cøu

570

Chøng

600

4,33%

0 %

0,67%

95%

568

®iÒu trÞ

600

2,67%

94,67%

0,83%

1,83%

562

®iÒu trÞ

600

4,67%

93,67%

1,66%

p > 0,05

So s¸nh chøng vµ ®iÒu trÞ

p > 0,05

So s¸nh chøng vµ ®iÒu trÞ x3

p > 0,05

So s¸nh ®iÒu trÞ vµ ®iÒu trÞ x3

B¶ng 3.17 so s¸nh ®ét biÕn sè lưîng NST tinh hoµn nhãm chøng, liÒu

®iÒu trÞ vµ liÒu ®iÒu trÞ x3, thêi gian uèng thuèc 20 ngµy tû lÖ ®a béi ë nhãm

®iÒu trÞ vµ ®iÒu trÞ x3 cao h¬n nhãm chøng nh−ng sù kh¸c biÖt gi÷a c¸c nhãm

nghiªn cøu kh«ng cã ý nghÜa thèng kª.

123

3.2.4.4 Ph©n tÝch cÊu tróc NST tinh hoµn

B¶ng 3.18: So s¸nh ®ét biÕn cÊu tróc NST tinh hoµn nhãm chøng – ®iÒu trÞ – ®iÒu trÞ x 3 Thêi gian sö uèng thuèc 20 ngµy

Rl

Sè tÕ

®¬n

Tæng

Sè mÉu

®¬n trÞ

Rl

Rèi lo¹n

Tªn

cÊu

bµo

trÞ

®¬n

nghiªn

th−êng

CôM

chromatid

tróc

quan

nhãm

XY

trÞ

cøu

nst

s¸t

600

Chøng

®iÒu

600

trÞ

®iÒu

600

trÞ x3

1,33%

5,33%

p > 0,05

So s¸nh chøng vµ ®iÒu trÞ

p > 0,05

So s¸nh chøng vµ ®iÒu trÞ x 3

p < 0,01

p > 0,05

So s¸nh ®iÒu trÞ vµ ®iÒu trÞ x3

p < 0,01

p > 0,05

B¶ng 3.18 so s¸nh ®ét biÕn cÊu tróc chromatid-NST tinh hoµn nhãm

chøng, liÒu ®iÒu trÞ, liÒu ®iÒu trÞ x3, thêi gian uèng thuèc 20 ngµy, thÊy r»ng:

tû lÖ ®¬n trÞ XY ë nhãm liÒu ®iÒu trÞ x3 thÊp h¬n cã ý nghÜa thèng kª so víi

nhãm chøng vµ liÒu ®iÒu trÞ, nh−ng sù kh¸c biÖt cña tû lÖ tæng ®¬n trÞ cña c¶ 3

nhãm kh«ng cã ý nghÜa thèng kª. Ngoµi rèi lo¹n ®¬n trÞ kh«ng thÊy rèi lo¹n

cÊu tróc chromatid, NST, rèi lo¹n côm.

KÕt luËn: Sù kh¸c biÖt ®ét biÕn sè l−îng, cÊu tróc NST, ë tinh hoµn nhãm

chøng, liÒu ®iÒu trÞ, liÒu ®iÒu trÞ x3 thêi gian uèng thuèc 20 ngµy gi÷a c¸c nhãm

124

nghiªn cøu kh«ng cã ý nghÜa thèng kª.

3.2.5 KÕt luËn chung

¶nh h−ëng cña ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) tõ

c©y khæ s©m B¾c Bé ®Õn sè l−îng vµ cÊu tróc nhiÔm s¾c thÓ tuû x−¬ng vµ tinh

hoµn chuét nh¾t tr¾ng ë liÒu ®iÒu trÞ, liÒu ®iÒu trÞ x3 thêi gian uèng thuèc 20

ngµy so víi nhãm chøng, sù kh¸c biÖt gi÷a c¸c nhãm kh«ng cã ý nghÜa thèng

kª.

125

Mét sè h×nh ¶nh ph©n tÝch nhiÔm s¾c thÓ

tõ tuû x−¬ng vµ tinh hoµn chuét nh¾t

H×nh ¶nh ph©n tÝch nhiÔm s¾c thÓ tõ tuû x−¬ng

1. NhiÔm s¾c thÓ kú gi÷a: Kh«ng cã rèi lo¹n sè l−îng, cÊu tróc nhiÔm s¾c thÓ

¶nh 3.34 2. Rèi lo¹n sè l−îng nhiÔm s¾c thÓ: §a béi

¶nh 3.35

126

3. Rèi lo¹n cÊu tróc nhiÔm s¾c thÓ:

a) §øt nhiÔm s¾c thÓ

¶nh 3.36 ¶nh 3.37

b) Minut

¶nh 3.38

127

4. Rèi lo¹n côm nhiÔm s¾c thÓ: nhoÌ nhiÔm s¾c thÓ

¶nh 3.39

H×nh ¶nh ph©n tÝch nhiÔm s¾c thÓ tõ tinh hoµn

1. NhiÔm s¾c thÓ kú gi÷a: Kh«ng cã rèi lo¹n sè l−îng, cÊu tróc nhiÔm s¾c thÓ

¶nh 3.40 ¶nh 3.41

128

2. Rèi lo¹n sè l−îng nhiÔm s¾c thÓ: §a béi ¶nh 3.42 ¶nh 3.43

3. Rèi lo¹n cÊu tróc nhiÔm s¾c thÓ:

a) §¬n trÞ nhiÔm s¾c thÓ th−êng

¶nh 3.44

b) §¬n trÞ nhiÔm s¾c thÓ XY

129

¶nh 3.45

¶nh 3.46

130

Ch−¬ng 4

Thö ho¹t tÝnh ®éc h¹i tÕ bµo ung th−, Vµ nghiªn cøu T¸c dông chèng ung th− trªn ®éng vËt thùc nghiÖm 4.1 kh¶o s¸t ho¹t tÝnh kh¸ng u trùc tiÕp trªn c¸c dßng tÕ bµo Ung th− ng−êi nu«i cÊy in vitro cña ent-kauran Ditecpenoit tõ c©y khæ s©m B¾c Bé*) 4.1.1 Môc tiªu

Chøng minh ®−îc kh¶ n¨ng chèng ung th− cña ent-kauran ditecpenoit

tõ c©y khæ s©m B¾c bé (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) th«ng

qua thö nghiÖm g©y ®éc tÕ bµo trªn c¸c dßng tÕ bµo ung th− ng−êi nu«i cÊy in

vitro.

4.1.2 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu vµ kü thuËt sö dông

Nghiªn cøu ®−îc tiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p cña Likhitwitayawuid vµ

céng sù, 1993 ®ang ®−îc ¸p dông t¹i ViÖn Nghiªn cøu ung th− Quèc gia Hoa

Kú (NCI) [1], dùa trªn ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy tÕ bµo ung th− in vitro cña

Geran vµ céng sù, 1972 [2]; Pezutto vµ céng sù, 1983 [3]; vµ Skehan vµ céng

sù 1990 [4]. Ph−¬ng ph¸p nµy ®· ®−îc Phßng thÝ nghiÖm thö ho¹t tÝnh sinh

häc, ViÖn ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn triÓn khai ¸p dông tõ n¨m 1996

[5]. Trªn c¬ së ®ã Phßng thÝ nghiÖm thö ho¹t tÝnh sinh häc ®−îc x©y dùng ®Ó

phôc vô viÖc sµng läc ho¹t tÝnh cña dù ¸n ®iÒu tra c©y thuèc rõng quèc gia

Cóc ph−¬ng cña ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn vµ Khoa D−îc,

*)ViÖc thö ho¹t tÝnh kh¸ng u trùc tiÕp trªn c¸c dßng tÕ bµo ung th− ng−êi nu«i cÊy in vitro

cña ent-kauran ditecpenoit tõ c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc thùc hiÖn t¹i Phßng thÝ nghiÖm thö

ho¹t tÝnh sinh häc, ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn d−íi sù chØ ®¹o cña TS Lª Mai

H−¬ng.

______________________

131

Tr−êng §¹i häc Tæng hîp Illinois, Hoa Kú d−íi sù tµi trî cña quÜ John

Catherine vµ Mac. Arthur b¾t ®Çu tõ n¨m 1994. C¸c kÜ thuËt sµng läc ho¹t tÝnh

còng ®−îc ®µo t¹o vµ chuyÓn giao tõ Khoa Y d−îc häc, Tr−êng §¹i häc Tæng

hîp Illinois trªn c¬ së hîp t¸c trªn.

Dßng tÕ bµo Trong c«ng tr×nh nµy chóng t«i ®· tiÕn hµnh thö nghiÖm trªn 3 dßng tÕ bµo ung th− ng−êi ®Ó ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng u thùc nghiÖm cho c¸c ent- kauran ditecpenoit tõ c©y khæ s©m B¾c Bé. C¸c dßng tÕ bµo bao gåm: Dßng Lu : Lung cancer - ung th− phæi Dßng RD : Rhabdosarcoma – ung th− mµng tim Dßng Hep- G2: Hepatocellular carcinoma

Dßng tÕ bµo ®−îc gi÷ trong Nit¬ láng, ®¸nh thøc vµ duy tr× trong c¸c

m«i tr−êng dinh d−ìng MEME, Eagle hoÆc DEME cã bæ sung huyÕt thanh

bª t−¬i 7-10%.

TÕ bµo nu«i cÊy trong c¸c ®iÒu kiÖn tiªu chuÈn ( 5% CO2; ®é Èm 98%; nhiÖt ®é æn ®Þnh ë 37oC v« trïng tuyÖt ®èi) cho ph¸t triÓn tíi pha log (®¹t 60- 70% dé ph¸t triÓn cùc ®¹i), thay m«i tr−êng s¹ch ®Ó ho¹t ho¸ tÕ bµo tõ 18-24 giê, lóc ®ã tÕ bµo ®· s½n sµng cho tiÕn hµnh thÝ nghiÖm.

MÉu thÝ nghiÖm

Hoµ mÉu thÝ nghiÖm vµo dung dÞch DMSO 100% (4mg/ml) cho b−íc

sµng läc s¬ bé.

Pha 10 thang nång ®é cho b−íc 2 ®Ó tÝnh gi¸ trÞ IC50. MÉu chøng Dïng chÊt chuÈn cã kh¶ n¨ng diÖt tÕ bµo, ch¼ng h¹n; Elipitine hoÆc

Colchicine pha trong DMSO víi nång ®é 0.01mM.

Nhá vµo mçi giÕng 10µl mÉu pha. TiÕn hµnh

TÕ bµo ®−îc xö lý TrÝpsin 0,1% cho t¸ch khái ®¸y b×nh. Hoµ dung dÞch huyÒn phï tÕ bµo b»ng m«i tr−êng s¹ch, röa vµ ®Õm sè l−îng, pha tÕ bµo víi nång ®é tõ 3x104 tÕ bµo/ml ®Õn 4x104 tÕ bµo/ml.

132

Thªm vµo c¸c giÕng ®· cã chÊt chuÈn bÞ s½n ë trªn 190 µl dung dÞch

huyÒn phï tÕ bµo.

PhiÕn ®−îc ñ trong tñ CO2 thªm 3 ngµy. KÕt thóc thÝ nghiÖm TÕ bµo khi ñ 3 ngµy ®−îc cè ®Þnh b»ng dung dÞch TCA l¹nh (30-50%). Röa, ®Ó kh«, nhuém SRB 0,4% trong axit axetic 1% vµ röa l¹i b»ng axit axetic 1% ®Ó lo¹i mÇu thõa; ®Ó kh«, hoµ l¹i b»ng dung dÞch ®Öm Tris base 10mM.

§äc trªn m¸y ELISA ë b−íc sãng 495-515mm.

Chó ý: Lu«n ph¶i cã phiÕn ®èi chøng OD (ngµy 0) ®Ó lµm ®èi chøng cho l−îng tÕ bµo ë thêi ®iÓm b¾t ®Çu thÝ nghiÖm. VÒ ®èi chøng ©m: Gi¸ trÞ OD cña DMSO 10% ®Ó lµm ®èi chøng cho gi¸ trÞ cña l−îng tÕ bµo khi kÕt thóc thÝ nghiÖm. C¸ch cè ®Þnh vµ nhuém nh− trªn.

Sµng läc s¬ cÊp t×m gi¸ trÞ CS (cell survival)

- Gi¸ trÞ CS: lµ kh¶ n¨ng sèng sãt cña tÕ bµo ë nång ®é nµo ®ã cña chÊt thö tÝnh theo % so víi ®èi chøng, mÉu nµo cho gi¸ trÞ CS ≤ 50% ë nång

®é mÉu 20 µg/ml ®èi víi mÉu th« vµ 4 µg/ml ®èi víi mÉu tinh khiÕt ®−îc ®¸nh gi¸ lµ cã ho¹t tÝnh. Dùa trªn kÕt qu¶ ®o ®−îc cña chøng OD (ngµy 0), DMSO 10% vµ so s¸nh víi gi¸ trÞ OD khi trén mÉu ®Ó t×m gi¸ trÞ CS(%) theo c«ng thøc:

OD (mÉu) – OD (ngµy 0) x 100

CS% = OD (DMSO) – OD (ngµy 0)

CS % ®−îc tÝnh to¸n theo c«ng thøc ®é lÖch tiªu chuÈn cña Ducan lÊy gi¸ trÞ

2 σ = Σ (x - x ) i n - 1

trung b×nh víi ®é lÖch tiªu chuÈn σ.

133

1 3 2

1- Chøng ©m tÝnh: DMSO+ tÕ bµo

2- MÉu ©m tÝnh: MÉu + tÕ bµo

3 - MÉu d−¬ng tÝnh: MÉu + tÕ bµo

Dßng tÕ bµo ®−îc gi÷ trong Nit¬ láng, ®¸nh thøc vµ duy tr× trong c¸c m«i tr−êng dinh d−ìng cã bæ sung huyÕt thanh bª t−¬i 7-10%. C¸c mÉu ®−îc chän läc ®· cã kÕt qu¶ g©y ®éc tÕ bµo d−¬ng tÝnh. Hoµ mÉu thÝ nghiÖm vµo dung dÞch DMSO 100% (4 – 10 mg/ml) vµ sau ®ã pha d¶i nång ®é nh− trong thö nghiÖm ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo. TÕ bµo nu«i cÊy cho ph¸t triÓn tíi møc 60-70%, thay m«i tr−êng s¹ch ®Ó ho¹t ho¸ tÕ bµo tõ 18-24 giê, lóc ®ã tÕ bµo ®· s½n sµng ®Ó ®Ó thùc hiÖn thÝ nghiÖm. TÕ bµo ®−îc xö lý TrÝpsin 0,1% cho t¸ch khái ®¸y b×nh. Hoµ dung dÞch huyÒn phï tÕ bµo b»ng m«i tr−êng s¹ch, röa vµ ®Õm sè l−îng, pha tÕ bµo nång ®é tõ 3x104 tÕ bµo/ml ®Õn 4x104 tÕ bµo/ml.

- Thªm vµo c¸c giÕng ®· cã chÊt chuÈn bÞ s½n ë trªn 190 µl dung dÞch

huyÒn phï tÕ bµo. - PhiÕn ®−îc ñ trong tñ CO2 - Quan s¸t sù thay ®æi vi cÊu tróc tÕ bµo d−íi kÝnh hiÓn vi soi ng−îc theo thêi gian vµ chôp ¶nh sau 24h; 48h vµ 72h. 4.1.3 Néi dung nghiªn cøu

- Nu«i cÊy, duy tr× c¸c dßng tÕ bµo. - Thö ho¹t tÝnh c¸c mÉu do Chñ nhiÖm ®Ò tµi §T§L-2005/05 cung cÊp, ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng sèng sãt cña tÕ bµo CS % vµ ®¸nh gi¸ nång ®éc g©y øc chÕ ph¸t triÓn tÕ bµo IC50.

135

- Quan s¸t thay ®æi h×nh th¸i tÕ bµo do t¸c ®éng cña chÊt thö d−íi kÝnh hiÓn vi vµ chôp ¶nh.

4.1.4 KÕt qu¶ vµ nhËn xÐt

KÕt qu¶ vµ nhËn xÐt:

B¶ng 4.1: C¸c sè liÖu gi¸ trÞ CS50 = % tÕ bµo sèng sãt , tÝnh to¸n theo c«ng thøc ®é lÖch tiªu chuÈn cña Ducan lÊy gi¸ trÞ trung b×nh - Sè liÖu vÒ gi¸ trÞ IC50 c¸c chÊt cã ho¹t tÝnh trªn ch¬ng tr×nh phÇn mÒm Table curve cña Mü

Ký hiÖu mÉu

KÕt luËn

Dßng tÕ bµo Cell survival (%)

Dßng tÕ bµo Gi¸ trÞ IC50 (µg/ml)

DMSO

KX§

100,0±0,0

§èi chøng ©m tÝnh §èi chøng d−¬ng tÝnh D−¬ng tÝnh c¶ 3 dßng D−¬ng tÝnh c¶ 3 dßng D−¬ng tÝnh c¶ 3 dßng D−¬ng tÝnh c¶ 3 dßng D−¬ng tÝnh c¶ 3 dßng D−¬ng tÝnh c¶ 3 dßng

0,19 0,196 0,25 0,31 0,13 0,23 0,35

0,25 0,154 0,26 0,188 0,26 0,2 0,3

0,1 0,65 0,71 0,64 0,66 0,72 0,63

Ellipithine CHU K1 K§ N1.2 L2 GOP1a

0,36±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0

1,7±0,2 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0

1,5±0,5 0,0±0,5 1,91±0,7 0,0±0,1 0,0±0,2 0,0±0,8 0,0±0,2

Ghi chó: B¶ng 4.1 nªu kÕt qu¶ thö cña mét sè mÉu s¶n phÈm ®¹i diÖn ®−îc thu nhËn tõ mét sè mÎ chiÕt t¸ch kh¸c nhau: CHU: MÉu ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) dïng lµm chuÈn (xem Môc 2.4.1). K1, K§, N1.2: lµ c¸c mÉu s¶n phÈm ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1), tøc ho¹t chÊt 1, ®¹i diÖn cña §Ò tµi. L2, GOP1a: lµ c¸c mÉu ChÕ ph¶m CT-2005, tøc ChÕ phÈm giµu ho¹t chÊt 1, ®¹i diÖn cña §Ò tµi.

136

KÕt luËn chung

C¶ 06 mÉu ®¹i diÖn ®Òu cã ho¹t tÝnh m¹nh g©y ®éc c¶ 3 dßng tÕ bµo thö

nghiÖm ë gi¸ trÞ IC50 thÊp (B¶ng 4.1).

Sù thay ®æi vi cÊu tróc tÕ bµo lµ rÊt râ rÖt phô thuéc vµo nång ®é cña

chÊt thö.

Tµi liÖu tham kh¶o

1. Likhitwitaywuid, K.; Angerhof, C. K.; Cordell, G. A.; Pezutto, J. M.,

J. Nat. Prod., 1993, 1, 30-38.

2. Geran, R. I.; Greeberg, N. H.; McDonald, M. M.; Schmacher, A. M.;

and Abbott, B. J., Cancer Chemother., 1972, 3, 1-103.

3. Pezzuto, J. M.; Antosiak, S. K.; Messmer, W. M.; Stalor, M. M.; and

Honig, G. R., Chem. Biol. Interactions, 1983, 43, 323-339.

4. Skehan, P.; Storeng, R.; Scudiero, D.; Monks, A.; McMahon, J.;

Vistica, D.; Warren, J. T.; Bokesch, H.; Kenney, S.; and Boyd, M.

R., J. Natl. Cancer Inst., 1990, 82, 1107-1112.

5. Lª Mai H−¬ng, Hoµng Thanh H−¬ng, TrÇn ThÞ Hång Hµ, Lª ThÞ

Xu©n, TuyÓn tËp b¸o c¸o khoa häc, Héi nghÞ Khoa häc nh÷ng vÊn

®Ò c¬ b¶n trong khoa häc sù sèng, HuÕ, 25-26/7/2003, tr. 927-929.

137

H×nh ¶nh vÒ sù thay ®æi vÒ h×nh th¸i vi cÊu tróc tÕ bµo d−íi t¸c ®éng cña

chÊt thö

Dßng tÕ bµo Hep-G2, mÉu CT pha ë c¸c nång ®é kh¸c nhau

¶nh 4.1

1. §èi chøng ©m ( TÕ bµo + DMSO)

2. §èi chøng d−¬ng ( TÕ bµo + elipthicine)

¶nh 4.2

138

- Nång ®é cao nhÊt: ( TÕ bµo + CT- 5 µg/ml)

3. MÉu CT pha ë c¸c nång ®é gi¶m dÇn

- Nång ®é ( TÕ bµo + CT-1 µg/ml)

- Nång ®é ( TÕ bµo + CT- 0,2 µg/ml)

- Nång ®é ( TÕ bµo +

CT- 0,04 µg/ml)

139

- Nång ®é thÊp nhÊt ( TÕ bµo + CT- 0,008 µg/ml)

140

4.2 nghiªn cøu t¸c dông chèng vµ dù phßng ung th− trªn ®éng VËt thùc nghiÖm cña ent-kauran Ditecpenoit tõ c©y khæ s©m B¾c Bé*) 4.2.1 §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

4.2.1.1 Thuèc

C¸c ®èi t−îng ®−îc thö (thuèc) lµ hîp chÊt ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-

en-18-yl axetat (1), gäi t¾t lµ hîp chÊt 1 hoÆc 1, vµ ChÕ phÈm CT-2005, gäi

t¾t lµ ChÕ phÈm CT hoÆc CT, do GS TSKH Phan Tèng S¬n vµ céng sù, Khoa

Hãa häc, Tr−êng §¹i häc Khoa häc tù nhiªn, §¹i häc Quèc gia Hµ Néi s¶n

xuÊt vµ cung cÊp d−íi d¹ng bét tinh thÓ ®ãng trong lä 100 g. Ph¶i pha lo·ng

tr−íc khi dïng trong dÇu h−íng d−¬ng víi nång ®é 2,5 mg/ml hoÆc 5 mg/ml,

pH 7-8. Dung dÞch ®· pha ph¶i che s¸ng vµ gi÷ ë nhiÖt ®é phßng.

4.2.1.2 §éng vËt thùc nghiÖm

Trªn 400 chuét nh¾t tr¾ng thuÇn chñng dßng BALB/c, 6-8 tuÇn tuæi,

träng l−îng tõ 20-25 gam, ®−îc nu«i ë nhiÖt ®é 20-220 C, víi n−íc uèng v«

khuÈn vµ thøc ¨n theo tiªu chuÈn. §éng vËt sau khi g©y ung th− ®−îc chia

thµnh c¸c nhãm:

* Nhãm ®èi chøng kh«ng ®iÒu trÞ

* Nhãm ®iÒu trÞ b»ng hîp chÊt 1 liÒu 10 mg/kg vµ hîp chÊt 1 liÒu 20

mg/kg

* Nhãm ®iÒu trÞ dù phßng b»ng hîp chÊt 1 liÒu 20 mg/kg

* Nhãm ®iÒu trÞ b»ng ChÕ phÈm CT liÒu 20 mg/kg

*)ViÖc thö t¸c dông chèng vµ dù phßng ung th− trªn ®éng vËt thùc nghiÖm cña ent-kauran

ditecpenoit tõ c©y khæ s©m B¾c Bé ®−îc thùc hiÖn t¹i Bé m«n M« ph«i, Häc viÖn Qu©n Y

d−íi sù chØ ®¹o cña GS TS TrÇn V¨n Hanh.

141

__________________

* Nhãm theo dâi ®êi sèng sau ®iÒu trÞ b»ng hîp chÊt 1 10 mg/kg vµ b»ng

ChÕ phÈm CT 20 mg/kg.

Dßng tÕ bµo ung th− sarcoma 180 nhËn tõ ViÖn nghiªn cøu ung th− thùc

nghiÖm,Tr−êng §¹i häc Y Semmelweis, Hungary. C¸c tÕ bµo nµy ®−îc

cÊy chuyÓn trong æ bông chuét nh¾t BALB/c hoÆc b¶o qu¶n trong nit¬

láng.

4.2.1.3 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

• Ph−¬ng ph¸p ®iÒu tra c¾t ngang vµ m« t¶

• Ph−¬ng ph¸p thùc nghiÖm trªn m« h×nh ung th− thùc nghiÖm.

4.2.1.4 Kü thuËt nghiªn cøu

T¹o m« h×nh ung th− thùc nghiÖm trªn chuét

Tiªm vµo æ bông mçi chuét nh¾t tr¾ng thuÇn chñng 5×106 tÕ bµo

sarcoma 180 (Theo Lapis K., 1979 vµ TrÇn V¨n Hanh, 1982). Sau khi ®−îc

tiªm tÕ bµo sarcoma 180, bông chuét to dÇn do c¸c tÕ bµo ung th− ph¸t triÓn

thµnh khèi u cã nhiÒu dÞch, cßn gäi lµ u b¸ng (Ascites tumor). §©y lµ mét m«

h×nh thùc nghiÖm æn ®Þnh vµ tin cËy. Quan s¸t vµ ghi nhËn t×nh tr¹ng toµn th©n

vµ t¹i vïng g©y u, tiÕn hµnh c©n träng l−îng chuét ba ngµy mét lÇn.

Quan s¸t diÔn biÕn toµn th©n vµ thêi gian sèng cña chuét mang u

Theo dâi t×nh tr¹ng toµn th©n c¸c ®éng vËt mang u tr−íc vµ sau ®iÒu trÞ

dùa trªn c¸c chØ tiªu: møc ®é ho¹t ®éng, hµnh vi, xï l«ng, suy kiÖt, Øa láng.

Ghi nhËn, so s¸nh thêi gian sèng trung b×nh cña c¸c chuét mang u. Thêi

gian sèng kÐo dµi sau ®iÒu trÞ theo c«ng thøc cña Nowak K. vµ céng sù (1978)

Thêi gian sèng nhãm ®iÒu trÞ − Thêi gian sèng nhãm chøng

Thêi gian sèng kÐo dµi = × 100%

Thêi gian sèng nhãm chøng

142

nh− sau:

Quan s¸t ®¹i thÓ, ®o träng l−îng, thÓ tÝch dÞch b¸ng vµ ®Õm nèt di

c¨n

Quan s¸t c¸c biÕn ®æi ®¹i thÓ tr−íc vµ sau ®iÒu trÞ. T¹i c¸c thêi ®iÓm 3, 7,

10 vµ 12 ngµy sau g©y u tiÕn hµnh giÕt ®éng vËt mang u b»ng c¸ch kÐo ®øt cét

sèng cæ, mæ lÊy dÞch u vµ tÝnh träng l−îng, thÓ tÝch dÞch b¸ng.

Ho¹t tÝnh chèng ung th− cña thuèc theo c«ng thøc cña Geran R. I.

(1972):

Ho¹t tÝnh chèng u (%) = × 100%

Träng l−îng trung b×nh u nhãm chøng

Träng l−îng trung b×nh u nhãm ®iÒu trÞ

Ho¹t tÝnh chèng ung th− ph¶i nhá h¬n 42% (gi¶m trªn 75% träng l−îng

u) th× ph−¬ng ph¸p ®iÒu trÞ ung th− ®ã míi ®−îc coi lµ cã hiÖu qu¶.

ThÓ tÝch u nhãm chøng − ThÓ tÝch u nhãm ®iÒu trÞ Tû lÖ øc chÕ (G) = × 100% ThÓ tÝch u nhãm chøng

Tû lÖ øc chÕ ph¸t triÓn khèi u (G: growth delay) theo Nowak K. (1978) :

TrÞ liÖu chèng u cã hiÖu lùc râ rÖt nÕu tû lÖ øc chÕ (G) trªn 75%.

§Õm tÕ bµo ung th− trong dÞch b¸ng ®−îc pha lo·ng 200 lÇn, trªn buång

®Õm tÕ bµo Neubauer. Tõ mËt ®é tÕ bµo u sÏ tÝnh ®−îc tæng sè tÕ bµo ung th−

cã trong u b¸ng.

§¸nh gi¸ t¸c dông h¹n chÕ di c¨n xa cña thuèc ë thêi ®iÓm 3, 7, 10 vµ

12 ngµy b»ng c¸ch lÊy c¸c c¬ quan gan, phæi, l¸ch, tuyÕn øc ®Ó c©n träng

l−îng b»ng c©n ph©n tÝch (Tanita, NhËt b¶n) víi sai sè 0,1 mg vµ ®Õm sè nèt

di c¨n ë nh÷ng c¬ quan nµy d−íi kÝnh lóp phãng ®¹i 50 lÇn.

§¸nh gi¸ biÕn ®æi trªn tiªu b¶n tÕ bµo u nhuém Maygrunwald-

Giemsa

TiÕn hµnh lÊy tÕ bµo sarcoma 180 ®èi chøng hoÆc sau ®iÒu trÞ lµm tiªu

b¶n dµn, nhuém b»ng Maygrunwald-Giemsa nh»m nghiªn cøu biÕn ®æi vi thÓ

cña tÕ bµo. §äc kÕt qu¶ trªn kÝnh hiÓn vi g¾n camera vµ m¸y ¶nh Olympus IX

143

70 (NhËt b¶n), phãng ®¹i 800 lÇn.

§¸nh gi¸ t¸c dông h¹n chÕ u ph¸t triÓn

Dùa vµo ®êi sèng chuét mang u, thÓ tÝch, träng l−îng dÞch u b¸ng vµ tæng

sè tÕ bµo trong dÞch u b¸ng; biÕn ®æi vi thÓ cña tÕ bµo u, gan, phæi, l¸ch, tuyÕn

øc, h¹ch.

4.2.1.5 Xö lý sè liÖu vµ ph©n tÝch c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu

B»ng ch−¬ng tr×nh IPSS ch¹y trong m«i tr−êng Window XP.

4.2.2 KÕt qu¶ nghiªn cøu

4.2.2.1 KÕt qu¶ t¹o m« h×nh thùc nghiÖm u b¸ng sarcoma 180 trªn chuét

200 chuét nh¾t BALB/c sau khi tiªm 5×106 tÕ bµo sarcoma 180 vµo phóc

m¹c ®Òu cã khèi ung th− ph¸t triÓn trong æ bông víi träng l−îng, thÓ tÝch vµ

tæng sè tÕ bµo cña khèi ung th− nµy t¨ng dÇn theo thêi gian (B¶ng 4.2).

B¶ng 4.2: BiÕn ®æi träng l−îng, thÓ tÝch, vµ tæng sè tÕ bµo sarcoma 180 cña

Tæng sè tÕ bµo u

Thêi ®iÓm sau

Träng l−îng

ThÓ tÝch

(triÖu)

g©y u

u b¸ng (g)

u b¸ng (mm3)

Ngµy thø 1

0,1

Ngµy thø 4

1,48 ± 0,41

1,02 ± 0,08

Ngµy thø 7

206

2,16 ± 0,55

2,35 ± 0,52

Ngµy thø 10

313

3,72 ± 0,95

3,86 ± 1,07

Ngµy thø 12

408

2,65 ± 1,75

2,96 ± 1,23

u b¸ng sarcoma 180

Chuét mang u th−êng suy kiÖt, xï l«ng, Øa ch¶y, liÖt vµ chÕt vµo ngµy 13-

20 sau khi tiªm tÕ bµo ung th− do di c¨n ë nhiÒu c¬ quan nh− gan, phæi, h¹ch,

l¸ch.

4.2.2.2 Nghiªn cøu t¸c dông chèng ung th− cña hîp chÊt 1 víi liÒu 10

mg/kg

KÕt qu¶ nghiªn cøu cña chóng t«i cho thÊy dïng c¸c liÒu 2,5 mg, 5mg

144

vµ 7,5 mg/kg, hîp chÊt 1 kh«ng cã t¸c dông h¹n chÕ sù ph¸t triÓn ung th−

sarcoma 180, thÓ hiÖn kh«ng kh¸c biÖt thÓ tÝch, träng l−îng u b¸ng so víi

nhãm ®èi chøng. Sau ®ã, chóng t«i tiÕp tôc nghiªn cøu hîp chÊt 1 liÒu 10

mg/kg, c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu ®−îc tr×nh bµy trong phÇn d−íi ®©y.

4.2.2.2.1 BiÕn ®æi träng l−îng vµ thÓ tÝch cña khèi u b¸ng sau ®iÒu trÞ

Nhãm uèng 1: 10 mg/kg (n=24)

Nhãm ®èi chøng (n=24)

Thêi

®iÓm sau

Träng l−îng

Ho¹t tÝnh

Träng l−îng

Ho¹t tÝnh

g©y u

(g)

Chèng u (%)

(g)

chèng u (%)

3 ngµy

(-)

0,97 ± 0,1

0,83 ± 0,06

7 ngµy

1,51 ± 0,27

1,28 ± 0,31*

(-)

10 ngµy

1,41 ± 0,44

1,55 ± 0,55

(-)

12 ngµy

(-)

2,56 ± 0,33

2,12 ± 0,67

B¶ng 4.3: BiÕn ®æi träng l−îng u b¸ng vµ ho¹t tÝnh chèng u sau ®iÒu trÞ

Ghi chó *: kh¸c ®èi chøng víi P< 0,05; (-): ho¹t tÝnh chèng u > 42%

Thêi ®iÓm sau g©y u

Nhãm ®èi chøng (n=24)

3 ngµy

0,61 ± 0,21

7ngµy

1,7 ± 0,6

10 ngµy

2,85 ± 0,74

12 ngµy

ThÓ tÝch u vµ GD ThÓ tÝch (mm3) GD ThÓ tÝch (mm3) GD ThÓ tÝch (mm3) GD ThÓ tÝch (mm3) GD

2,9 ± 0,2

Nhãm uèng 1: 10 mg/kg (n=24) 0,73 ± 0,1 (-) 1,28 ± 0,47 * (-) 2,6 ± 0,7 (-) 3,06 ± 0,6 (-)

B¶ng 4.4: BiÕn ®æi thÓ tÝch vµ tû lÖ øc chÕ u ph¸t triÓn (GD) sau ®iÒu trÞ

Ghi chó *: kh¸c chøng víi P< 0,05; (-): kh«ng øc chÕ u ph¸t triÓn.

B¶ng 4.3 vµ b¶ng 4.4 cho thÊy ë nhãm chøng träng l−îng, thÓ tÝch u

t¨ng dÇn theo thêi gian. §iÒu trÞ b»ng hîp chÊt 1 liÒu 10 mg/kg ®· lµm

gi¶m träng l−îng vµ thÓ tÝch u b¸ng ë ngµy thø 7 sau g©y u. KÕt qu¶

nghiªn cøu ë c¸c thêi ®iÓm kh¸c hîp chÊt 1 kh«ng lµm gi¶m träng l−îng,

145

thÓ tÝch khèi u b¸ng.

4.2.2.2.2 BiÕn ®æi mËt ®é, tæng sè tÕ bµo sarcoma 180 cña u b¸ng sau

®iÒu trÞ

Nhãm uèng 1: 10 mg/kg (n=24)

Nhãm ®èi chøng (n=24)

Thêi ®iÓm

MËt ®é TB

Tæng sè TB

MËt ®é TB

Tæng sè TB

sau g©y u

(triÖu/ml)

3 ngµy

5,1 ± 1,8

31,1 ± 10,7

5,3 ± 4,5

38,6 ± 5,3

7 ngµy

11,8 ± 3,3

206,3 ± 70,8

12,6 ± 5,1

161,2 ± 59,2 *

10 ngµy

11 ± 6,2

313, 5 ± 81,4

12,6 ± 5,8

327,6 ± 88,2

12 ngµy

14,1 ± 9,5

408,7 ± 28,2

18,1 ± 5,6

553,8 ± 108,6

B¶ng 4.5: BiÕn ®æi mËt ®é, tæng sè tÕ bµo sarcoma 180 sau ®iÒu trÞ

Ghi chó *: kh¸c ®èi chøng víi p< 0,05

Qua b¶ng 4.5 cã thÓ thÊy ë nhãm chøng mËt ®é, tæng sè tÕ bµo sarcoma

180 cña u b¸ng t¨ng dÇn theo thêi gian. §iÒu trÞ b»ng hîp chÊt 1 liÒu 10

(víi p< 0,05, xem ë trªn). Hîp chÊt 1 liÒu 10 mg/kg lµm tæng sè tÕ bµo

sarcoma 180 ë u b¸ng gi¶m so víi nhãm chøng ë thêi ®iÓm 7 ngµy.

4.2.2.2.3 BiÕn ®æi träng l−îng vµ nèt di c¨n ë c¸c c¬ quan sau ®iÒu trÞ

Nhãm uèng 1: 10 mg/kg (n=24)

Nhãm ®èi chøng (n=24)

Thêi ®iÓm

Träng l−îng

Sè nèt

Träng l−îng

Sè nèt

sau g©y u

(g)

Di c¨n

(g)

di c¨n

3 ngµy

1,1 ± 0,17

1,8 ± 0,7

1,2 ± 0,2

0,6 ± 0,5*

7 ngµy

1,3 ± 0,2

4,5 ± 1,7

1,43 ± 0,2

2,7 ± 0,8**

10 ngµy

1,32 ± 0,19

5,6 ± 2,6

1,29 ± 0,16

4,0 ± 2,28*

12 ngµy

1,15 ± 0,21

6,6 ± 2,1

1,28 ± 0,11

5,4 ± 0,8

B¶ng 4.6: BiÕn ®æi träng l−îng vµ nèt di c¨n ë gan sau ®iÒu trÞ

146

Ghi chó **: kh¸c ®èi chøng víi P< 0,01; *: kh¸c chøng víi P< 0,05

Nhãm uèng 1: 10 mg/kg (n=24)

Nhãm ®èi chøng (n=24)

Thêi ®iÓm

Träng l−îng

Sè nèt

Träng l−îng

Sè nèt

sau g©y u

(g)

di c¨n

(g)

di c¨n

3 ngµy

0,16 ± 0,01

2,6 ± 0,5

0,14 ± 0,03

1,2 ± 0,7**

7 ngµy

0,18 ± 0,02

8,5 ± 1,7

0,2 ± 0,04

5,5 ± 3,3**

10 ngµy

0,14 ± 0,03

7,3 ± 2,5

0,14 ± 0,01

6,4 ± 1,5*

12 ngµy

0,14 ± 0,01

10 ± 3,16

0,14 ± 0,02

8 ± 1,4**

B¶ng 4.7: BiÕn ®æi träng l−îng vµ nèt di c¨n ë phæi sau ®iÒu trÞ

Ghi chó **: kh¸c ®èi chøng víi P< 0,01; *: kh¸c chøng víi P< 0,05

Nhãm uèng 1: 10 mg/kg (n=24)

Nhãm ®èi chøng (n=24)

Thêi ®iÓm

Träng l−îng

Sè nèt

Träng l−îng

Sè nèt

sau g©y u

(g)

Di c¨n

(g)

di c¨n

3 ngµy

0,12 ± 0,02

1,1 ± 0,4

0,13 ± 0,03

0,6 ± 0,5

7 ngµy

0,16 ± 0,03

3,1 ± 0,7

0,18 ± 0,05

1,8 ± 0,48**

10 ngµy

0,13 ± 0,01

3,6 ± 0,5

0,13 ± 0,04

2,8 ± 0,7*

12 ngµy

0,17 ± 0,02

4,16 ± 2,1

0,11 ± 0,01

2,8 ± 0,4**

B¶ng 4.8: BiÕn ®æi träng l−îng vµ nèt di c¨n ë l¸ch sau ®iÒu trÞ

Ghi chó **: kh¸c ®èi chøng víi P< 0,01; *: kh¸c chøng víi P< 0,05

Nhãm uèng 1: 10 mg/kg (n=24)

Nhãm ®èi chøng (n=24)

Thêi ®iÓm

TuyÕn øc

H¹ch b¹ch

TuyÕn øc

H¹ch b¹ch huyÕt

sau g©y u

(g)

huyÕt (g)

(g)

3 ngµy

0,08 ± 0,01

0,016 ± 0,008

0,07 ± 0,01

0,02 ± 0,01

7 ngµy

0,1 ± 0,01

0,02 ± 0,001

0,11 ± 0,08

0,02 ± 0,001

10 ngµy

0,08 ± 0,03

0,018 ± 0,004

0,09 ± 0,05

0,016 ± 0,005

12 ngµy

0,07 ± 0,02

0,018 ± 0,003

0,06 ± 0,014

0,018 ± 0,004

B¶ng 4.9: BiÕn ®æi träng l−îng tuyÕn øc vµ h¹ch b¹ch huyÕt sau ®iÒu trÞ

147

Ghi chó **: kh¸c ®èi chøng víi P< 0,01; *: kh¸c chøng víi P< 0,05

Qua c¸c b¶ng 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 vµ quan s¸t vi thÓ cho thÊy ë chuét

mang u b¸ng sarcoma 180 sau uèng hîp chÊt 1 víi liÒu 10 mg/kg ®·

gi¶m di c¨n vµo gan, phæi, l¸ch so víi nhãm chøng. Tuy nhiªn, träng

l−îng gan, phæi, l¸ch, tuyÕn øc vµ h¹ch b¹ch huyÕt cña chuét mang u

sau ®iÒu trÞ b»ng hîp chÊt 1 víi liÒu 10 mg/kg kh«ng kh¸c biÖt so víi

nhãm chøng.

4.2.2.2.4 Thêi gian sèng cña chuét mang u b¸ng sarcoma 180 sau ®iÒu trÞ

Nhãm nghiªn cøu (n=25)

Sèng trung b×nh (ngµy) Sèng kÐo dµi (%)

Nhãm ®èi chøng

18,67 ± 4,0

Nhãm uèng 1 10 mg/kg

15 %

21,53 ± 5,1

B¶ng 4.10: Thêi gian sèng trung b×nh cña chuét mang u sau ®iÒu trÞ

Ghi chó *: kh¸c biÖt nhãm chøng víi p< 0,05

4.2.2.3 Nghiªn cøu t¸c dông chèng vµ dù phßng ung th− cña hîp chÊt 1 víi liÒu 20 mg/kg

KÕt qu¶ ®iÒu trÞ b»ng hîp chÊt 1 víi liÒu 20 mg/kg (gÊp ®«i liÒu ban

®Çu, xem môc 2.2) hoÆc uèng dù phßng hîp chÊt 1 víi liÒu 20 mg/kg tr−íc

®©y.

Ghi chó: chuét ®−îc chia thµnh ba nhãm: (a) nhãm chøng (tøc nhãm

®èi chøng kh«ng ®iÒu trÞ), (b) nhãm ®iÒu trÞ, vµ (c) nhãm ®iÒu trÞ dù phßng,

còng gäi lµ nhãm dù phßng (tøc nhãm uèng thuèc dù phßng hµng ngµy liªn

148

4.2.2.3.1 BiÕn ®æi träng l−îng vµ thÓ tÝch cña u b¸ng sau ®iÒu trÞ

Nhãm ®iÒu trÞ

Nhãm dù phßng

b»ng 1:

Nhãm chøng (n=24) 0,96 ± 0,43

2,1 ± 0,86

4,6 ± 0,81

Träng l−îng vµ ho¹t tÝnh chèng u Träng l−îng (g) Ho¹t tÝnh (%) Träng l−îng (g) Ho¹t tÝnh (%) Träng l−îng (g) Ho¹t tÝnh (%) Träng l−îng (g) Ho¹t tÝnh (%)

3 Ngµy 7 Ngµy 10 ngµy 12 ngµy

6,17 ± 1,47

20 mg/kg (n=24) 1,48 ± 0,41 (-) 2,16 ± 0,55 (-) 3,72 ± 0,95 (-) 4,6 ± 0,9 (-)

20 mg/kg (n=24) 0,75 ± 0,24 (-) 1,58 ± 0,47 * (-) 2,76 ± 0,7** (-) 4,76 ± 0,9 (-)

B¶ng 4.11: BiÕn ®æi träng l−îng u b¸ng vµ ho¹t tÝnh chèng u sau ®iÒu trÞ

Nhãm ®iÒu trÞ

Nhãm dù phßng b»ng 1:

ThÓ tÝch u vµ GD

Nhãm chøng (n=24)

1,16 ± 0,15

2,25 ± 0,92

4,74 ± 0,69

3 Ngµy 7 Ngµy 10 Ngµy 12 Ngµy

ThÓ tÝch (mm3) GD ThÓ tÝch (mm3) GD ThÓ tÝch (mm3) GD ThÓ tÝch (mm3) GD

5,03 ± 1,26

b»ng 1: 20 mg/kg (n=24) 0,7 ± 0,08* (-) 2,35± 0,52 (-) 3,86 ± 1,07 (-) 4,05 ± 0,78 (-)

20 mg/kg (n=24) 0,9 ± 0,18 (-) 1,63 ± 0,26* (-) 2,1 ± 0,61** (-) 4,63 ± 0,7 (-)

Ghi chó *: kh¸c ®èi chøng víi p< 0,05; *: kh¸c ®èi chøng víi p< 0,01; (-): ho¹t tÝnh chèng u > 42% B¶ng 4.12: BiÕn ®æi thÓ tÝch, tû lÖ øc chÕ u ph¸t triÓn (GD) sau ®iÒu trÞ

Ghi chó *: kh¸c chøng víi p< 0,05; *: kh¸c ®èi chøng víi p< 0,01;

(-): kh«ng øc chÕ u ph¸t triÓn.

Sè liÖu trong c¸c B¶ng 4.11 vµ 4.12 cho thÊy ®iÒu trÞ b»ng hîp chÊt 1 víi

liÒu 20 mg/kg lµm gi¶m râ rÖt träng l−îng, thÓ tÝch u b¸ng ë ngµy thø 3 sau

®· gi¶m träng l−îng, thÓ tÝch u b¸ng râ rÖt ë ngµy thø 7 vµ ngµy thø 10 sau

g©y u.

149

4.2.2.3.2 BiÕn ®æi mËt ®é, tæng sè tÕ bµo sarcoma 180 cña u sau ®iÒu trÞ

Nhãm ®iÒu trÞ

Nhãm dù phßng

b»ng 1:

Nhãm chøng (n=24)

6,1 ± 1,6

b»ng 1: 20 mg/kg (n=24) 4,16 ± 1,47

20 mg/kg (n=24) 7,6 ± 3,9

MËt ®é, tæng sè tÕ bµo sarcoma 180 MËt ®é(triÖu/ml)

Tæng sè (triÖu)

3 Ngµy

70,7 ± 9,15

29,12 ± 4,16**

68,4 ± 13,6

13,8 ± 2,2

12,1 ± 1,9

12,3 ± 3,5

MËt ®é(triÖu/ml)

Tæng sè (triÖu)

7 Ngµy

310,5 ± 96,6

284,3 ± 62,9

200,4 ± 31,9*

18,4 ± 3,1

16,6 ± 2,4

20,6 ± 2,3

MËt ®é(triÖu/ml)

Tæng sè (triÖu)

10 Ngµy

772,1 ± 126

640,7 ± 177

432,6 ± 125 *

21,6 ± 1,52

18,1 ± 5,6

17,6 ± 6,8

MËt ®é(triÖu/ml)

Tæng sè (triÖu)

12 Ngµy

903,9 ±195

733 ± 141,1

814,8 ± 123

B¶ng 4.13: BiÕn ®æi mËt ®é, tæng sè tÕ bµo sarcoma 180 sau ®iÒu trÞ

Ghi chó *: kh¸c ®èi chøng víi p< 0,05

B¶ng 4.13 cho thÊy ë nhãm chøng mËt ®é, tæng sè tÕ bµo sarcoma 180

cña u b¸ng t¨ng dÇn theo thêi gian. §iÒu trÞ b»ng hîp chÊt 1 víi liÒu 20

mg/kg chØ lµm gi¶m tæng sè tÕ bµo sarcoma 180 trong u b¸ng ë ngµy thø 3

phßng b»ng hîp chÊt 1 víi liÒu 20 mg/kg ®· lµm gi¶m tæng sè tÕ bµo

víi nhãm ®èi chøng kh«ng ®iÒu trÞ.

4.2.2.3.3 BiÕn ®æi träng l−îng vµ nèt di c¨n ë c¸c c¬ quan sau ®iÒu trÞ

Nhãm ®iÒu trÞ

Nhãm dù phßng

Träng l−îng, sè

b»ng 1:

nèt di c¨n ë gan

Nhãm chøng (n=24)

1,55 ± 0,2

20 mg/kg (n=24) 1,38 ± 0,36

Träng l−îng (g)

20 mg/kg (n=24) 1,41 ± 0,32

Nèt di c¨n

3 ngµy

0 **

0,4 ± 0,17

0,83 ± 0,35

Träng l−îng (g)

1,57 ± 0,28

1,5 ± 0,2

1,29 ± 0,37

7 ngµy

Nèt di c¨n

150

B¶ng 4.14: BiÕn ®æi träng l−îng vµ nèt di c¨n ë gan sau ®iÒu trÞ

4,6 ± 1,8

2,16 ± 0,82*

3,3 ± 0,5**

1,74 ± 0,21

1,37 ± 0,17

1,8 ± 0,6

Träng l−îng (g)

Nèt di c¨n

10 ngµy

4,8 ± 1,3

3,4 ± 0,89

3,7 ± 1,1

1,55 ± 0,11

1,32 ± 0,23

1,98 ± 0,48

Träng l−îng (g)

Nèt di c¨n

12 ngµy

8,1 ± 3,4

4,4 ± 1,1**

2,6 ± 0,57***

Ghi chó ***: kh¸c ®èi chøng víi p< 0,001; **: kh¸c ®èi chøng víi p<

0,01; *: kh¸c chøng víi p< 0,05

Qua c¸c B¶ng 4.14, 4.15, 4.16, 4.17 vµ quan s¸t vi thÓ cho thÊy ë chuét

mang u b¸ng sarcoma 180 sau ®iÒu trÞ hoÆc uèng dù phßng b»ng 1 víi liÒu 20

mg/kg ®Òu gi¶m di c¨n vµo gan, phæi, l¸ch so víi nhãm ®èi chøng kh«ng ®iÒu

l−îng gan, l¸ch, phæi, tuyÕn øc vµ h¹ch b¹ch huyÕt cña chuét mang u sau ®iÒu

trÞ hoÆc uèng dù phßng b»ng 1 20 mg/kg kh«ng kh¸c biÖt so víi nhãm chøng.

Nhãm ®iÒu trÞ

Nhãm dù phßng

Träng l−îng, sè

b»ng 1:

nèt di c¨n ë phæi

Nhãm ®èi chøng (n=24) 0,17 ± 0,02

20 mg/kg (n=24) 0,13 ± 0,02

20 mg/kg (n=24) 0,13 ± 0,05

Träng l−îng (g)

Nèt di c¨n

3 ngµy

1,4 ± 0,5

0,5 ± 0,38*

1,83 ± 0,53

0,16 ± 0,03

0,16 ± 0,02

0,19 ± 0,03

Träng l−îng (g)

Nèt di c¨n

7 ngµy

7,3 ± 2,8

3,5 ± 1,04**

3,3 ± 1,0**

0,17 ± 0,03

0,18 ± 0,02

0,17 ± 0,05

Träng l−îng (g)

10 ngµy

Nèt di c¨n

3,0 ± 0,5

4,4 ± 0,89

3,0 ± 1,17

0,15 ± 0,01

0,14 ± 0,02

Träng l−îng (g)

Nèt di c¨n

12 ngµy

15 ± 3,9

3,8 ± 0,8***

3,6 ± 0,5***

B¶ng 4.15: BiÕn ®æi träng l−îng vµ nèt di c¨n ë phæi sau ®iÒu trÞ

151

Ghi chó **: kh¸c ®èi chøng víi p< 0,01; *: kh¸c chøng víi p< 0,05

Nhãm ®iÒu trÞ

Nhãm dù phßng

Träng l−îng, sè

b»ng 1:

nèt di c¨n ë l¸ch

Nhãm chøng (n=24)

20 mg/kg (n=24) 0,14 ± 0,04

0,14 ± 0,03

Träng l−îng (g)

b»ng 1: 20 mg/kg (n=24) 0,12 ± 0,01

Nèt di c¨n

3 Ngµy

0,83 ± 0,25

0,2 ± 0,01

0,13 ± 0,05

0,17 ± 0,02

0,18 ± 0,05

Träng l−îng (g)

Nèt di c¨n

7 Ngµy

2,25 ± 0,95

0,83 ± 0,28**

1,8 ± 0,48**

0,16 ± 0,02

0,15 ± 0,02

0,15 ± 0,04

Träng l−îng (g)

Nèt di c¨n

10 Ngµy

3,5 ± 0,79

1,4 ± 0,47**

1,1 ± 0,24**

0,15 ± 0,03

0,17 ± 0,03

Träng l−îng (g)

Nèt di c¨n

12 Ngµy

4,3 ± 1,3

2,1 ± 0,54***

1,33 ± 0,24***

B¶ng 4.16: BiÕn ®æi träng l−îng vµ nèt di c¨n ë l¸ch sau ®iÒu trÞ

Ghi chó ***: kh¸c ®èi chøng víi p< 0,001; **: kh¸c ®èi chøng víi p<

0,01; *: kh¸c chøng víi p< 0,05

Nhãm ®iÒu trÞ

Nhãm dù phßng

Träng l−îng

b»ng 1:

tuyÕn øc, h¹ch

Nhãm chøng (n=24)

0,09 ± 0,004

20 mg/kg (n=24) 0,07 ± 0,01

20 mg/kg (n=24) 0,08 ± 0,003

TuyÕn øc (g)

H¹ch BH (g)

3 Ngµy

0,016 ± 0,008

0,02 ± 0,001

0,12 ± 0,001

0,10 ± 0,008

0,09 ± 0,003

TuyÕn øc (g)

H¹ch BH (g)

7 Ngµy

0,018 ± 0,001

0,02 ± 0,001

0,018 ± 0,004

0,09 ± 0,003

0,09 ± 0,005

0,08 ± 0,004

TuyÕn øc (g)

H¹ch BH (g)

10 Ngµy

0,017 ± 0,003

0,02 ± 0,005

0,016 ± 0,005

0,08 ± 0,002

0,06 ± 0,014

0,07 ± 0,003

TuyÕn øc (g)

12 Ngµy

H¹ch BH (g)

0,02 ± 0,003

0,017 ± 0,004

0,02 ± 0,001

B¶ng 4.17: BiÕn ®æi träng l−îng tuyÕn øc vµ h¹ch b¹ch huyÕt (BH) sau ®iÒu trÞ

152

Ghi chó **: kh¸c ®èi chøng víi P< 0,01; *: kh¸c chøng víi P< 0,05

B¶ng 4.18: Thêi gian sèng trung b×nh cña chuét mang u sau ®iÒu trÞ

Nhãm nghiªn cøu (n =25)

Sèng trung b×nh (ngµy)

Nhãm ®iÒu trÞ b»ng 1: 20 mg/kg

21,64 ± 3,0

Nhãm dù phßng b»ng 1: 20 mg/kg

22,37 ± 5,6

B¶ng 4.18 cho thÊy thêi gian sèng trung b×nh cña chuét ë nhãm ®−îc

®iÒu trÞ b»ng hîp chÊt 1 víi liÒu 20 mg/kg so víi nhãm ®−îc uèng thuèc dù

liÒu 20 mg/kg.

4.2.2.4 Nghiªn cøu t¸c dông chèng ung th− cña ChÕ phÈm CT víi liÒu 20 mg/kg

KÕt qu¶ ®iÒu trÞ b»ng ChÕ phÈm CT víi liÒu 20 mg/kg trªn c¸c chuét

4.2.2.4.1 BiÕn ®æi träng l−îng vµ thÓ tÝch cña u b¸ng sau ®iÒu trÞ

Nhãm uèng CT 20 mg/kg (n=24)

Nhãm ®èi chøng (n=24)

Thêi ®iÓm

Träng l−îng

Ho¹t tÝnh

Träng l−îng

Ho¹t tÝnh

sau g©y u

(g)

chèng u (%)

(g)

chèng u (%)

3 ngµy

(-)

0,56 ± 0,12

0,68 ± 0,05

7 ngµy

(-)

0,74 ± 0,29

0,99 ± 0,33

10 ngµy

(-)

1,88 ± 1,26

2,41± 0,46

12 ngµy

(-)

1,48 ± 0,4

2,4 ± 1,67

B¶ng 4.19: BiÕn ®æi träng l−îng u b¸ng vµ ho¹t tÝnh chèng u sau ®iÒu trÞ

Ghi chó (-): ho¹t tÝnh chèng u > 42%

Sè liÖu trong c¸c B¶ng 4.19 vµ 4.20 cho thÊy chuét mang u b¸ng

sarcoma 180 ®−îc ®iÒu trÞ b»ng ChÕ phÈm CT víi liÒu 20 mg/kg kh«ng gi¶m

153

®· gi¶m râ rÖt râ so víi nhãm chøng kh«ng ®iÒu trÞ.

Nhãm ®èi chøng (n=24)

0,52 ± 0,16

1,74 ± 0,32

1,95 ± 1,2

ThÓ tÝch u vµ GD ThÓ tÝch (mm3) GD ThÓ tÝch (mm3) GD ThÓ tÝch (mm3) GD ThÓ tÝch (mm3) GD

3,0 ± 1,27

Nhãm uèng CT 20 mg/kg (n=24) 0,78 ± 0,14 (-) 1,4 ± 0,4 * (-) 2,5 ± 0,53 (-) 1,6 ± 0,61 ** (-)

B¶ng 4.20: BiÕn ®æi thÓ tÝch vµ tû lÖ øc chÕ u ph¸t triÓn (GD) sau ®iÒu trÞ

Ghi chó *: kh¸c chøng víi p< 0,05; **: kh¸c chøng víi p< 0,01;

(-): kh«ng øc chÕ u ph¸t triÓn

4.2.2.4.2 BiÕn ®æi mËt ®é, tæng sè tÕ bµo sarcoma 180 cña u sau ®iÒu trÞ

Nhãm uèng CT 20 mg/kg (n=24)

Nhãm ®èi chøng (n=24)

Thêi ®iÓm

MËt ®é TB

Tæng sè TB

MËt ®é TB

Tæng sè TB

sau g©y u

(triÖu/ml)

3 ngµy

4,4 ± 1,14

22,8 ± 5,7

3,2 ± 1,1*

24,9 ± 4,4

7 ngµy

12,6 ± 8,9

219,3 ± 40,3

6,4 ± 3,9*

89,6 ± 25,6 *

10 ngµy

21,7 ± 2,2

423,1 ± 216

18,2 ± 3,04*

455,2 ± 96,4

12 ngµy

15,5 ± 9,6

465 ± 196,8

8,5 ± 5,36

236,4 ± 51,8**

B¶ng 4.21: BiÕn ®æi mËt ®é, tæng sè tÕ bµo sarcoma 180 sau ®iÒu trÞ

Ghi chó *: kh¸c ®èi chøng víi P< 0,05; **: kh¸c chøng víi p< 0,01

B¶ng 4.21 cho thÊy ®iÒu trÞ b»ng ChÕ phÈm CT víi liÒu 20 mg/kg ®·

lµm gi¶m mËt ®é tÕ bµo sarcoma 180 trong u b¸ng (víi p< 0,05) so víi

nhãm ®èi chøng. Trong khi ®ã, ®iÒu trÞ b»ng ChÕ phÈm CT víi liÒu 20

mg/kg chØ lµm gi¶m tæng sè tÕ bµo sarcoma 180 trong u b¸ng ë ngµy thø 7

154

4.2.2.4.3 BiÕn ®æi träng l−îng vµ nèt di c¨n ë c¸c c¬ quan sau ®iÒu trÞ

Nhãm uèng CT 20 mg/kg (n=24)

Nhãm ®èi chøng (n=24)

Thêi ®iÓm

Träng l−îng

Sè nèt

Träng l−îng

Sè nèt

sau g©y u

(g)

di c¨n

(g)

di c¨n

3 ngµy

1,49 ± 0,15

1,35 ± 0,26

7 ngµy

1,29 ± 0,25

2,4 ± 1,34

1,26 ± 0,14

0,4 ± 0,24**

10 ngµy

1,57 ± 0,1

5,5 ± 0,57

1,83 ± 0,23

4,5 ± 1,2*

12 ngµy

1,59 ± 0,16

6,5 ± 4,3

1,33 ± 0,56

6,5 ± 3,29

B¶ng 4.22: BiÕn ®æi träng l−îng vµ nèt di c¨n ë gan sau ®iÒu trÞ

Ghi chó **: kh¸c ®èi chøng víi P< 0,01; *: kh¸c chøng víi P< 0,05

Nhãm uèng CT 20 mg/kg (n=24)

Nhãm ®èi chøng (n=24)

Thêi ®iÓm

Träng l−îng

Sè nèt

Träng l−îng

Sè nèt

sau g©y u

(g)

Di c¨n

(g)

di c¨n

3 ngµy

0,17 ± 0,03

0,15 ± 0,03

7 ngµy

0,2 ± 0,02

3,8 ± 1,8

0,19 ± 0,02

2,4 ± 0,8*

10 ngµy

0,21 ± 0,01

8,25 ± 5,3

0,18 ± 0,02

4,25 ± 0,5**

12 ngµy

0,14 ± 0,01

5,5 ± 3,53

0,14 ± 0,02

7,1 ± 3,07

B¶ng 4.23: BiÕn ®æi träng l−îng vµ nèt di c¨n ë phæi sau ®iÒu trÞ

Ghi chó **: kh¸c ®èi chøng víi P< 0,01; *: kh¸c chøng víi P< 0,05

Qua c¸c B¶ng 4.22, 4.23, 4.24 vµ quan s¸t vi thÓ cho thÊy ë chuét

mang u b¸ng sarcom 180 sau ®iÒu trÞ b»ng ChÕ phÈm CT víi liÒu 20

mg/kg ®Òu gi¶m di c¨n vµo gan, phæi, so víi nhãm ®èi chøng kh«ng ®iÒu

träng l−îng gan, phæi, l¸ch, tuyÕn øc vµ h¹ch b¹ch huyÕt cña chuét mang

u sau ®iÒu trÞ b»ng ChÕ phÈm CT víi liÒu 20 mg/kg kh«ng kh¸c biÖt so

155

víi nhãm chøng.

Nhãm uèng CT 20 mg/kg (n=24)

Nhãm ®èi chøng (n=24)

Thêi ®iÓm

Träng l−îng

Sè nèt

Träng l−îng

Sè nèt

sau g©y u

(g)

Di c¨n

(g)

di c¨n

3 ngµy

0,13 ± 0,04

1,1 ± 0,4

0,1 ± 0,03

7 ngµy

0,17 ± 0,01

1,1 ± 0,47

0,17 ± 0,04

1,1 ± 0,58

10 ngµy

0,17 ± 0,02

2,5 ± 1,43

0,18 ± 0,04

2,67 ± 0,57

12 ngµy

0,25 ± 0,02

3,1 ± 1,41

0,14 ± 0,01

4,5 ± 2,94

B¶ng 4.24: BiÕn ®æi träng l−îng vµ nèt di c¨n ë l¸ch sau ®iÒu trÞ

Ghi chó *: kh¸c chøng víi P< 0,05

Nhãm uèng CT 20 mg/kg (n=24)

Nhãm ®èi chøng (n=24)

Thêi ®iÓm

TuyÕn øc

H¹ch b¹ch huyÕt

TuyÕn øc

H¹ch b¹ch huyÕt

sau g©y u

(g)

3 ngµy

0,1 ± 0,02

0,016 ± 0,004

0,09 ± 0,01

0,014 ± 0,005

7 ngµy

0,05 ±0,002

0,02 ± 0,003

0,07 ± 0,01

0,02 ± 0,004

10 ngµy

0,05 ±0,005

0,017 ± 0,005

0,05 ± 0,016

0,015 ± 0,002

12 ngµy

0,04 ± 0,01

0,015 ± 0,007

0,05 ± 0,028

0,018 ± 0,004

B¶ng 4.25: BiÕn ®æi träng l−îng tuyÕn øc vµ h¹ch b¹ch huyÕt sau ®iÒu trÞ

Ghi chó. *: kh¸c chøng víi P< 0,05

4.2.2.4.4 Thêi gian sèng cña chuét mang u b¸ng sarcoma 180 sau ®iÒu trÞ

Nhãm nghiªn cøu (n=25)

Sèng trung b×nh (ngµy)

Sèng kÐo dµi (%)

Nhãm ®èi chøng

16,23 ± 3,0

Nhãm uèng CT 20 mg/kg

19 %

19,31 ± 4,2 *

B¶ng 4.26: Thêi gian sèng trung b×nh cña chuét mang u sau ®iÒu trÞ

156

Ghi chó *: kh¸c biÖt nhãm chøng víi p< 0,05

B¶ng 4.26 cho thÊy ChÕ phÈm CT víi liÒu 20 mg/ kg kÐo dµi ®êi sèng

cña ®éng vËt mang u b¸ng sarcoma 180 thªm 19 % so víi nhãm chøng kh«ng

®iÒu trÞ.

4.2.3 KÕt luËn

Trong c«ng tr×nh nghiªn cøu nµy, ®Ó thö t¸c dông chèng vµ dù phßng

ung th− cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT m« h×nh thùc nghiÖm sö dông dßng

c¬ thÓ chuét thuÇn chñng BALB/c ®Ó cã thÓ ®¸nh gi¸ hiÖu qu¶ cña thö nghiÖm

®iÒu trÞ mét c¸ch chÝnh x¸c vµ cã tÝnh t−¬ng quan chÆt chÏ víi kÕt qu¶ ®iÒu trÞ

T¸c dông chèng vµ dù phßng ung th− thùc nghiÖm cña hîp chÊt

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) vµ cña ChÕ phÈm

CT giµu ho¹t chÊt 1

• ®iÒu trÞ b»ng hîp chÊt 1 theo ®−êng uèng víi liÒu 10 mg/kg trªn chuét

mang u b¸ng sarcoma 180 ®· lµm gi¶m träng l−îng, thÓ tÝch u b¸ng vµ

0,05), h¹n chÕ di c¨n ung th− ë gan, phæi, l¸ch so víi nhãm ®èi chøng

kh«ng ®iÒu trÞ.

• ®iÒu trÞ b»ng hîp chÊt 1 theo ®−êng uèng víi liÒu 20 mg/kg trªn chuét

mang u b¸ng sarcoma 180 ®· lµm gi¶m träng l−îng, thÓ tÝch u b¸ng vµ

0,05), h¹n chÕ di c¨n ung th− ë gan, phæi, l¸ch so víi nhãm ®èi chøng

kh«ng ®iÒu trÞ.

• ®iÒu trÞ dù phßng b»ng hîp chÊt 1 theo ®−êng uèng víi liÒu 20 mg/kg

157

m¹nh träng l−îng, thÓ tÝch u b¸ng vµ tæng sè tÕ bµo sarcoma 180 trong u

gan, phæi, l¸ch so víi nhãm ®èi chøng kh«ng ®iÒu trÞ, nhÊt lµ ë ngµy thø

• ®iÒu trÞ b»ng ChÕ phÈm CT theo ®−êng uèng víi liÒu 20 mg/kg trªn

12 sau g©y u.

chuét mang u b¸ng sarcoma 180 ®· lµm gi¶m râ rÖt thÓ tÝch u b¸ng vµ

p< 0,05), h¹n chÕ di c¨n ung th− ë gan, phæi so víi nhãm ®èi chøng

kh«ng ®iÒu trÞ.

KÕt qu¶ thö trªn ®éng vËt thùc nghiÖm nªu ë trªn ®· cho thÊy hîp

chÊt ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) vµ ChÕ phÈm CT

giµu ho¹t chÊt 1 cã t¸c dông h¹n chÕ râ rÖt sù ph¸t triÓn ung th−. §Æc biÖt

do lµ c¸c s¶n phÈm thiªn nhiªn cã ®éc tÝnh thÊp, hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm

CT cã t¸c dông h¹n chÕ sù di c¨n cña ung th−. KÕt hîp víi c¸c ho¹t tÝnh

NF-кB, hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT thÝch hîp ®Ó sö dông lµm thuèc hç trî

(chemotherapeutic agents), lµm thuèc chèng ung th− ë giai ®o¹n sím hoÆc

chemopreventive agents).

ViÖc sö dông hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT trong ®iÒu trÞ cã thªm

thuËn lîi, do c¸c s¶n phÈm nµy cã ®éc tÝnh thÊp (xem Ch−¬ng 3).

liÒu luîng 10 mg/kg vµ 20 mg/kg thÓ träng chuét nh¾t cã t¸c dông h¹n chÕ

sù ph¸t triÓn ung th− thùc nghiÖm Sarcoma 180 in vivo vµ nÕu uèng tr−íc

C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu ®¹t ®−îc lµ c¬ së ®Ó t¹o ra c¸c thuèc hç trî

mét th¸ng th× cã t¸c dông dù phßng.

158

®iÒu trÞ ung th− vµ dù phßng ung th− míi tõ hîp chÊt ent-7β-hydroxy-15-

oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) vµ ChÕ phÈm CT giµu ho¹t chÊt 1 ®−îc

159

Euphorbiaceae).

¶nh

4.3: H×nh ¶nh vi thÓ cña c¸c tÕ bµo ung th− dßng sarcoma 180 dïng ®Ó g©y u b¸ng trªn chuét BALB/c. Nhuém MayGrunwald - Giemsa, x 800

160

¶nh 4.4:TÕ bµo sarcoma 180 h×nh cÇu, bµo t−¬ng (1) réng víi Ýt l−íi néi bµo, ribosome vµ ty thÓ, nh©n lín, cã h¹t nh©n (2), chÊt nhiÔm s¾c (3) n»m r¶i r¸c. HiÓn vi ®iÖn tö truyÒn qua, x 6.800

¶nh 4.6: TiÕn hµnh lÊy gan, l¸ch, phæi, h¹ch, tuyÕn øc cña chuét mang u

161

¶nh 4.7: Gan nhãm chøng sau g©y u 7 ngµy. Cã ®¸m tÕ bµo ung th− di c¨n, c¸c tÕ bµo gan gi÷a tiÓu thïy bÞ tho¸i ho¸. Nhuém HE, x 400

162

¶nh 4.8: Gan nhãm uèng 1: 20 mg/kg, sau g©y u 7 ngµy. Kh«ng thÊy di c¨n ung th−, c¸c tÕ bµo gan kh«ng bÞ tho¸i ho¸. Nhuém HE, x 400

163

¶nh 4.10: H¹ch b¹ch huyÕt nhãm uèng 1: 20mg/kg, sau g©y u 7 ngµy. Kh«ng thÊy di c¨n ung th−, c¸c nang lympho t¨ng sinh. Nhuém HE, x 400

¶nh 4.11: TuyÕn øc nhãm chøng sau g©y u 7 ngµy. NhiÒu tÕ bµo vâng biÓu m« tho¸i hãa. Kh«ng thÊy di c¨n ung th−. Nhuém HE, x 400

164

¶nh 4.12: TuyÕn øc nhãm uèng 1: 20mg/kg, sau g©y u 7 ngµy. Kh«ng thÊy di c¨n ung th−, c¸c Thymocyte t¨ng sinh ë vïng trung t©m tiÓu thïy. Nhuém HE, x 400

165

¶nh 4.13: Phæi nhãm chøng sau g©y u 10 ngµy. NhiÒu ®¸m tÕ bµo ung th− di c¨n ë v¸ch gian phÕ nang, x©m lÊn vµo m¹ch m¸u. Nhuém HE, x 400.

Ch−¬ng 5

5.1 §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

5.1.1 Thuèc

C¸c ®èi t−îng ®−îc thö (thuèc) lµ hîp chÊt ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-

16-en-18-yl axetat (1), gäi t¾t lµ hîp chÊt 1 hoÆc 1, vµ ChÕ phÈm CT-2005,

gäi t¾t lµ ChÕ phÈm CT hoÆc CT, do GS TSKH Phan Tèng S¬n vµ céng sù,

Khoa Hãa häc, Tr−êng §¹i häc Khoa häc tù nhiªn, §¹i häc Quèc gia Hµ Néi

s¶n xuÊt vµ cung cÊp d−íi d¹ng bét tinh thÓ. Dung m«i dïng lµm chøng lµ dÇu

h−íng d−¬ng.

5.1.2 §éng vËt thùc nghiÖm

- Chuét nh¾t tr¾ng (Mus musculus) chñng Swiss, thuÇn chñng, c¶ 2

gièng, tuæi 6 tuÇn, träng l−îng 20±2 gam do ViÖn VÖ sinh dÞch tÔ cung cÊp.

§éng vËt ®−îc nu«i trong ®iÒu kiÖn ®Çy ®ñ thøc ¨n vµ n−íc uèng tõ 3-7

ngµy tr−íc khi nghiªn cøu vµ trong suèt thêi gian nghiªn cøu.

5.1.3 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

5.1.3.1 Nghiªn cøu t¸c dông gi¶m ®au

*)ViÖc thö t¸c dông chèng viªm ë sóc vËt thùc nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh t¹i Bé m«n D−îc lý, Tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi d−íi sù chØ ®¹o cña GS TS §µo V¨n Phan.

166

_____________________

Chuét nh¾t tr¾ng ®−îc chia ngÉu nhiªn thµnh 6 l«, mçi l« 10 con:

- L« 1 (chøng): uèng dÇu h−íng d−¬ng 0,1 ml/10g.

- L« 2: tiªm morphin 7,5 mg/kg.

- L« 3: uèng ChÕ phÈm CT (12 mg/kg).

- L« 4: uèng ChÕ phÈm CT (24 mg/kg).

- L« 5: uèng hîp chÊt 1 (12 mg/kg).

- L« 6: uèng hîp chÊt 1 (24 mg/kg).

Koster)

Chuét nh¾t tr¾ng ®−îc chia ngÉu nhiªn thµnh 6 l« nh− trªn, mçi l« 10

con, l« 2 uèng aspirin 0,05 mg/kg.

Sau khi uèng thuèc thö 60 phót, tiªm mµng bông axit axetic 1%- 0,2

ml/con, ®Õm sè lÇn quÆn ®au cña chuét trong tõng 5 phót mét ®Õn phót thø 25.

5.1.3.2 Nghiªn cøu t¸c dông chèng viªm

5.1.3.2.1 T¸c dông chèng viªm cÊp

Chuét cèng tr¾ng c¶ 2 gièng, khoÎ m¹nh, nÆng tõ 160-180g ®−îc chia

ngÉu nhiªn thµnh 7 l«, mçi l« 10 con.

- L« 1: uèng dÇu h−íng d−¬ng (1 ml/0,1 kg).

167

- L« 2: uèng Indomethacin (2,5 mg/kg).

- L« 3: uèng prednisolon (5 mg/kg).

- L« 4: uèng ChÕ phÈm CT (7 mg/kg).

- L« 5: uèng ChÕ phÈm CT (14 mg/kg).

- L« 6: uèng hîp chÊt 1 (7 mg/kg).

- L« 7: uèng hîp chÊt 1 (14 mg/kg).

Vt – V0

∆V% = × 100

Thùc nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh trªn chuét cèng tr¾ng c¶ 2 gièng, nÆng

tõ 160-180g, chia ngÉu nhiªn lµm 6 l« nh− trªn, mçi l« 10 con. Mét giê

sau khi uèng thuèc thö, chuét ®−îc tiªm mµng bông dung dÞch

(carrageenin 0,05g + formaldehyd 1,5 ml + n−íc cÊt võa ®ñ 100 ml) víi

thÓ tÝch 2 ml/chuét.

Sau khi tiªm carrageenin 24 giê, mæ khoang mµng bông ®Ó hót dÞch vµ

168

®Õm sè l−îng b¹ch cÇu trong dÞch tiÕt.

T¸c dông chèng xuÊt tiÕt ®−îc ®¸nh gi¸ th«ng qua thÓ tÝch dÞch rØ viªm

vµ sè l−îng b¹ch cÇu trong dÞch rØ viªm.

5.1.3.2.2 T¸c dông chèng viªm m¹n tÝnh

Chuét cèng tr¾ng nÆng tõ 160-180g, ®−îc chia ngÉu nhiªn thµnh 7 l«

nh− trªn, mçi l« 10 con. Cho chuét uèng thuèc (ho¹t chÊt ent-kauran

ditecpenoit) vµo mçi buæi s¸ng trong 5 ngµy liÒn. LÇn thø nhÊt cho chuét uèng

ngay tr−íc khi cÊy sîi amiant nÆng 30 mg ®· tiÖt khuÈn ë 1600C trong 2 giê

1%). ChiÒu ngµy thø 5 giÕt chuét, bãc t¸ch khèi u, ®Æt vµo tñ sÊy 560C trong

trõ träng l−îng viªn sîi amiant) gi÷a l« thö thuèc vµ l« chøng. T¸c dông

chèng viªm ®−îc biÓu thÞ b»ng tû lÖ % gi¶m träng l−îng khèi u.

5.1.3.3 Nghiªn cøu t¸c dông b¶o vÖ d¹ dµy

5.1.3.3.1 T¸c dông b¶o vÖ d¹ dµy trªn m« h×nh th¾t m«n vÞ

Nghiªn cøu t¸c dông b¶o vÖ d¹ dµy cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT

theo m« h×nh th¾t m«n vÞ cña Shay c¶i tiÕn.

Chuét cèng tr¾ng träng l−îng 160-180g chia ngÉu nhiªn thµnh c¸c l« :

- L« 1: uèng dÇu h−íng d−¬ng 1 ml/0,1 kg.

- L« 2: uèng omeprazol 10 mg/kg

- L« 3: uèng ChÕ phÈm CT (7 mg/kg).

- L« 4: uèng ChÕ phÈm CT (14 mg/kg).

- L« 5: uèng hîp chÊt 1 (7 mg/kg).

- L« 6: uèng hîp chÊt 1 (14 mg/kg).

169

Chuét ®−îc uèng thuèc thö hoÆc dÇu h−íng d−¬ng liªn tôc 4 ngµy.

Ngµy thø 5 sau khi ®· ®Ó chuét nhÞn ¨n 24 giê, mæ bông, th¾t m«n vÞ sau ®ã

®ãng thµnh bông l¹i. 20 giê sau mæ bông c¾t d¹ dµy, ®o thÓ tÝch dÞch vÞ, x¸c

®Þnh pH cña dÞch vÞ vµ sè æ loÐt.

Indomethacin

Chuét cèng tr¾ng ®−îc chia ngÉu nhiªn thµnh c¸c l« nh− trªn, mçi l« 10

con, l« 2 uèng misoprostol 100 µg/kg.

Sau khi nhÞn ¨n 24 giê nh−ng vÉn cho uèng n−íc ®Çy ®ñ, cho chuét ë

uèng Indomethacin liÒu 30 mg/kg chuét. Sau 6 giê, giÕt chuét, c¾t d¹ dµy ®Ó

®¸nh gi¸ tæn th−¬ng d¹ dµy: sè l−îng æ loÐt vµ ®é dµi trung b×nh æ loÐt.

5.1.3.4 Nghiªn cøu sù ¶nh h−ëng cña hîp chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT trªn

tim vµ huyÕt ¸p

liÒu 0,02g/kg thÓ träng. Ghi nhÞp tim, ®iÖn tim vµ huyÕt ¸p ®éng m¹ch ®ïi qua

Thuèc thö ®−îc ®−a theo ®−êng uèng. Theo dâi sù thay ®æi huyÕt ¸p, nhÞp tim

vµ ®iÖn tim 30 phót/lÇn tõ sau khi uèng thuèc liªn tôc trong 5 giê.

5.1.3.5 Thö t¸c dông kh¸ng khuÈn in vitro

Ho¹t tÝnh kh¸ng vi sinh vËt kiÓm ®Þnh ®−îc nghiªn cøu theo ph−¬ng

ph¸p cña Vanden Berghe vµ Vlietink.

Nghiªn cøu ®−îc tiÕn hµnh trªn phiÕn vi l−îng 96 giÕng, c¸c chñng vi

sinh vËt kiÓm ®Þnh lµ Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus

subtilis, Staphylococcus aureus, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum,

Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans.

170

- ChuÈn bÞ vi sinh vËt: vi khuÈn ®−îc duy tr× trong m«i tr−êng Trypcase

soya broth, nÊm trong m«i tr−êng Sabauraud dextrose broth. C¸c chñng kiÓm

®Þnh ®ù¬c ho¹t hãa tr−íc khi thö nghiÖm trong m«i tr−êng dinh d−ìng dÞch

thÓ (24 giê ®èi víi vi khuÈn, 48 giê ®èi víi vi nÊm). Sau ®ã ®−îc pha lo·ng tíi

nång ®é 0,5 ®¬n vÞ Mc Land (kho¶ng 108 vi sinh vËt/ml) ®Ó tiÕn hµnh thÝ

nghiÖm.

- ChuÈn bÞ mÉu thö:

. MÉu thö ®−îc hßa tan trong dung dÞch DMSO 100% b»ng m¸y Vortex

víi nång ®é 4 mg/ml.

. Tõ dung dÞch gèc nhá sang phiÕn vi l−îng 96 giÕng, mçi giÕng 10 µl

mÉu.

. Nhá vµo mçi giÕng ®· cã mÉu s½n 190 µl vi sinh vËt ®· ho¹t hãa.

- §èi chøng d−¬ng:

D·y 1: m«i tr−êng

D·y 2: Vi sinh vËt kiÓm ®Þnh + kh¸ng sinh

- §Ó trong tñ Êm 37oC/24 giê cho vi khuÈn; 30oC/48 giê cho vi nÊm.

- §äc kÕt qu¶: khi nh×n b»ng m¾t th−êng thÊy chøng d−¬ng trong suèt,

5.1.4 Xö lý sè liÖu

C¸c sè liÖu nghiªn cøu ®−îc xö lý b»ng ph−¬ng ph¸p thèng kª y sinh

häc theo thuËt to¸n t-test Student vµ test tr−íc-sau sù kh¸c biÖt cã ý nghÜa

thèng kª khi p < 0,05.

5.2 KÕt qu¶ nghiªn cøu

5.2.1 T¸c dông gi¶m ®au

171

L« thö

Thuèc dïng vµ liÒu l−îng

p so víi morphin

Thêi gian ph¶n øng sau 1 giê uèng thuèc

Thêi gian ph¶n øng sau 4 giê uèng thuèc

Thêi gian ph¶n øng tr−íc uèng thuèc

13,06 ± 0,63

12,82 ± 1,14

13,63 ± 0,98

< 0,05

11,70 ± 0,87

21,06 ± 1,15***

15,32 ± 1,54

> 0,05

11,47 ± 0,86

13,82 ± 0,96

15,68 ± 0,91**

> 0,05

12,74 ± 1,26

15,35 ± 0,63

18,93± 0,97***

< 0,05

12,08 ± 0,55

13,93 ± 1,21

17,63 ± 1,37**

< 0,05

12,44 ± 0,95

14,97 ± 0,59

18,75 ± 1,02***

DÇu h−íng d−¬ng 10 ml/ kg Morphin 7,5 mg/ kg ChÕ phÈm CT 12 mg/ kg ChÕ phÈm CT 24 mg/ kg Hîp chÊt 1 12 mg/ kg Hîp chÊt 1 24 mg/ kg

* p< 0,05

** p< 0,01

*** p< 0,001 so víi nhãm chøng ë cïng thêi ®iÓm

KÕt qu¶ nghiªn cøu ë B¶ng 5.1 cho thÊy ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1

víi liÒu 12- 24 mg/kg ®· lµm cho chuét gi¶m ph¶n øng víi nhiÖt ®é, kÐo dµi

thêi gian ph¶n øng cña chuét râ rÖt so víi tr−íc uèng thuèc vµ so víi chøng.

T¸c dông nµy râ rÖt nhÊt ë giê thø 4 sau khi chuét uèng thuèc.

B¶ng 5.2: ¶nh h−ëng cña thuèc nghiªn cøu lªn ph¶n øng ®au do axit axetic

Sè c¬n quÆn ®au trung b×nh trong tõng kho¶ng thêi gian 5 phót

n

L«

Thuèc thö Vµ liÒu dïng

0-5 phót

>5-10 phót

>10-15phót

>15-20phót

>20-25phót

4,6 ± 0,5

19,6 ± 1,6

15,7 ± 1,1

11,3 ± 0,6

7,1 ± 1,2

3,7 ± 0,5

14,7 ± 2,5*

11,2 ± 0,9*

7,7 ± 1,1**

4,2 ± 0,4

4,0 ± 0,7

11,1 ± 1,3***

9,1 ± 1,2**

6,4 ± 0,8*** 3,6 ± 0,5*

4,0 ± 0,8

11,8 ± 1,3***

8,6 ± 0,9*** 6,2 ± 0,8*** 2,5± 0,4**

4,0 ± 0,7

11,1 ± 1,3***

6,5 ± 0,7*

5,7 ± 0,7*

3,6± 0,5**

3,3 ± 0,5

14,5 ± 1,2***

6,5 ± 1,0*

6,3 ± 0,6*

3,8 ± 0,6**

DÇu h−íng d−¬ng 10 ml/ kg Aspirin 0,05 g/ kg ChÕ phÈm CT 12 mg/ kg ChÕ phÈm CT 24 mg/ kg Hîp chÊt 1 12 mg/ kg Hîp chÊt 1 24 mg/ kg

* p, 0,05

** p< 0,01

*** p< 0,001 so víi nhãm chøng ë cïng thêi ®iÓm

KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 cã t¸c dông gi¶m

172

axit axetic, t¸c dông nµy râ rÖt nhÊt ë phót thø 6 ®Õn 20. ChÕ phÈm CT vµ

hîp chÊt 1 liÒu 12 mg/kg cã t¸c dông gi¶m ®au t−¬ng tù aspirin 0,05g/kg.

5.2.2 T¸c dông chèng viªm

5.2.2.1 T¸c dông chèng viªm cÊp

B¶ng 5.3: ¶nh h−ëng cña ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 lªn ph¶n øng viªm cÊp ë chuét cèng tr¾ng

L«

n

Thuèc thö vµ liÒu dïng

Sau 2 giê

Sau 4 giê

Sau 6 giê

Sau 8 giê

Sau 24 giê

58,9 ± 7,6

55,8 ± 7,1

51,5 ± 5,6

10,3 ± 5,6

10 45,8 ± 6,2

38,9 ± 4,3** 35,3 ± 4,7**

-0,6 ± 1,8**

10 13,3 ± 4,6** 35,4 ± 7,5**

36,4 ± 4,2*** 26,7 ± 4,6***

-3,5 ± 2,6**

10 14,1 ± 2,7** 44,1 ± 5,6**

46,7 ± 10,8

36,7 ± 9,3** 28,4 ± 7,8**

-2,8 ± 7,2***

10 29,9 ± 11,0

10 32,5 ± 7,3

50,1 ± 4,4

39,3 ± 6,8*

37,9 ± 6,8

4,3 ± 4,7

-1,9 ± 2,1***

10 34,6 ± 8,0 *

54,7 ± 7,6 *

39,6 ± 8,8** 33,2 ± 9,3***

-13,2 ± 2,7***

10 19,9 ± 6,3** 29,5 ± 5,6***

25,2 ± 7,4*** 15,1 ± 7,2***

DÇu h−íng d−¬ng 10 ml/ kg Indomethacin 2,5 mg/ kg Prednisolon 5 mg/ kg ChÕ phÈm CT 7 mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hîp chÊt 1 7 mg/ kg Hîp chÊt 1 14 mg/ kg

* p< 0,05

** p< 0,01

*** p< 0,001 so víi nhãm chøng ë cïng thêi ®iÓm

Qua nghiªn cøu chóng t«i thÊy hîp chÊt 1 cã t¸c dông lµm gi¶m phï viªm

t−¬ng ®−¬ng víi Indomethacin 2,5 mg/kg vµ prednisolon 5 mg/kg, tuy nhiªn t¸c

dông øc chÕ viªm cña hîp chÊt 1 m¹nh nhÊt ë thêi ®iÓm 8 giê, cßn Indomethacin

B¶ng 5.4: ¶nh h−ëng cña ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 trªn thÓ tÝch dÞch rØ viªm

L«

n

Thuèc thö vµ liÒu l−îng

p so víi l« chøng

Sè l−îng dÞch trung b×nh (ml)

p so víi Indomethacin vµ prednisolon

% gi¸ trÞ TB lµm gi¶m thÓ tÝch dÞch so víi

173

l« chøng

38,41 < 0,05

29,98 < 0,05

58,55 < 0,01 < 0,05

65,34 < 0,01 < 0,05

63,24 < 0,01 < 0,05

DÇu h−íng d−¬ng 10 ml/ kg Indomethacin 2,5 mg/ kg Prednisolon 5 mg/ kg ChÕ phÈm CT 7 mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hîp chÊt 1 7 mg/ kg Hîp chÊt 1 14 mg/ kg

10 4,27 ± 0,51 10 2,63 ± 0,25 10 2,99 ± 0,35 10 1,77 ± 0,24 10 1,48 ± 0,35 10 1,57 ± 0,43 10 1,09 ± 0,24

74,48 < 0,001 < 0,05

B¶ng 5.5: ¶nh h−ëng cña ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 trªn sè l−îng b¹ch cÇu trong dÞch rØ viªm

N

L«

p so víi l« chøng

Thuèc thö vµ liÒu l−îng

Sè l−îng b¹ch cÇu (ngh×n/ mm3)

p so víi Indomethacin vµ prednisolon

9,63 ± 1,82

< 0,05

7,11 ± 2,12

< 0,05

6,10 ± 1,69

> 0,05

7,51 ± 2,59

< 0,01

> 0,05

6,28 ± 1,66

> 0,05

7,91 ± 2,36

< 0,01

> 0,05

6,06 ± 1,98

DÇu h−íng d−¬ng 10ml/ kg Indomethacin 2,5 mg/ kg Prednisolon 5 mg/ kg ChÕ phÈm CT 7 mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hîp chÊt 1 7 mg/ kg Hîp chÊt 1 14 mg/ kg

KÕt qu¶ nghiªn cøu trªn c¸c B¶ng 5.4 vµ 5.5 cho thÊy ChÕ phÈm CT vµ

hîp chÊt 1 cã t¸c dông chèng viªm cÊp râ rÖt, lµm gi¶m l−îng dÞch rØ viªm

58,55% - 74,48% so víi l« chøng (p< 0,05). T¸c dông nµy cña ChÕ phÈm CT

vµ hîp chÊt 1 m¹nh h¬n Indomethacin vµ prednisolon.

Ngoµi ra, ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 liÒu 14 mg/kg cßn lµm gi¶m sè

l−îng b¹ch cÇu trong dÞch rØ viªm so víi l« chøng (p< 0,05).

174

5.2.2.2 T¸c dông chèng viªm m¹n tÝnh

B¶ng 5.6: Träng l−îng trung b×nh u h¹t sau khi dïng thuèc

L«

n

Thuèc thö vµ liÒu l−îng

Tû lÖ % gi¶m träng l−îng u

p so víi l« chøng

Träng l−îng trung b×nh cña u h¹t (mg)

p so víi Indomethacin vµ prednisolon

208 ± 27

102 ± 7 50,97 < 0,01

118 ± 7 43,27 < 0,05

169 ± 16 18,75 > 0,05 > 0,05

116 ± 10 44,24 < 0,01 > 0,05

128 ± 7 38,77 < 0,05 > 0,05

DÇu h−íng d−¬ng 10 ml/ kg Indomethacin 2,5 mg/ kg Prednisolon 5 mg/ kg ChÕ phÈm CT 7 mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hîp chÊt 1 7 mg/ kg Hîp chÊt 1 14 mg/ kg

B¶ng 5.6 cho thÊy víi liÒu 7 mg/kg ChÕ phÈm CT lµm gi¶m 18,75% träng

l−îng u h¹t, víi liÒu 14 mg/kg ChÕ phÈm CT lµm gi¶m 44,24% träng lù¬ng u h¹t so

víi l« chøng. Hîp chÊt 1 cã t¸c dông chèng viªm m¹n tÝnh râ rÖt, lµm gi¶m 38,77-

42,31% träng l−îng u h¹t thùc nghiÖm. T¸c dông nµy cña hîp chÊt 1 liÒu 14 mg/kg

t−¬ng ®−¬ng víi indomethacin 2,5 mg/kg vµ prednisolon 5 mg/kg (p> 0,05).

120 ± 11 42,31 < 0,01 > 0,05

5.2.3 T¸c dông b¶o vÖ d¹ dµy

5.2.3.1 Trªn m« h×nh th¾t m«n vÞ

B¶ng 5.7: ¶nh h−ëng cña ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 ®Õn thÓ tÝch

dÞch vÞ toµn phÇn

n

L«

ThÓ tÝch dÞch vÞ (ml)

% gi¶m so víi l« chøng

p so víi l« chøng

p so víi omeprazol

11,79 ± 1,69

4,29 ± 0,84 63,62 < 0,01

7,86 ± 0,64 33,34 < 0,05 < 0,05

5,86 ± 1,67 50,3 < 0,05 > 0,05

8,71 ± 2,69 26,13 > 0,05 < 0,05

6,71 ± 0,81 43,09 < 0,05 < 0,05

Thuèc thö vµ liÒu l−îng DÇu h−íng d−¬ng 10 ml/ kg Omeprazol 10mg/ kg ChÕ phÈm CT 7 mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hîp chÊt 1 7 mg/ kg Hîp chÊt 1 14 mg/ kg

175

KÕt qu¶ ë B¶ng 5.7 cho thÊy omeprazol 10 mg/kg lµm thÓ tÝch dÞch vÞ

gi¶m 63,62% so víi l« chøng (p < 0,01). Trong khi ®ã ChÕ phÈm CT 14

mg/kg vµ hîp chÊt 1 14 mg/kg chØ lµm gi¶m thÓ tÝch dÞch vÞ t−¬ng øng lµ

50,%% vµ 43,09% so víi l« chøng.

B¶ng 5.8: ¶nh h−ëng cña ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 trªn pH cña dÞch vÞ

L«

N

pH cña dÞch vÞ

% thay ®æi pH dÞch vÞ

p so víi l« chøng

2,32 ± 0,17

< 0,05 3,22 ± 0,37 ↑ 38,79

> 0,05 2,18 ± 0,32 ↓ 6,04

< 0,001 3,90 ± 0,31 ↑ 68,83

> 0,05 2,00 ± 0,11 ↓ 13,79

< 0,05 1,90 ± 0,10 ↓ 18,11

Thuèc thö vµ liÒu l−îng DÇu h−íng d−¬ng 10 ml/ kg Omeprazol 10 mg/ kg ChÕ phÈm CT 7 mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hîp chÊt 1 7 mg/ kg Hîp chÊt 1 14 mg/ kg

KÕt qu¶ ë B¶ng 5.8 cho thÊy ChÕ phÈm CT víi liÒu 14 mg/kg lµm t¨ng

pH dÞch vÞ lªn 68,83% so víi l« chøng, m¹nh h¬n omeprazol 10 mg/kg. Tuy

nhiªn hîp chÊt 1 l¹i cã xu h−íng lµm gi¶m pH dÞch vÞ (gi¶m 18,11% so víi l«

chøng).

B¶ng 5.9: ¶nh h−ëng cña ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 trªn sè æ loÐt cña d¹ dµy

Sè æ loÐt ë d¹ dµy

L« N Thuèc thö vµ liÒu l−îng p so víi l« chøng

2,14 ± 0,83

< 0,05 0,00 ± 0,00

< 0,05 0,29 ± 0,20

< 0,05 0,00 ± 2,63

> 0,05 0,57 ± 0,62

DÇu h−íng d−¬ng 10 ml/ kg Omeprazol 10 mg/ kg ChÕ phÈm CT 7 mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hîp chÊt 1 7 mg/ kg Hîp chÊt 1 14 mg/ kg

176

< 0,05 0,00 ± 0,00

KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy hîp chÊt 1 liÒu 14 mg/kg lµm gi¶m râ rÖt

sè æ loÐt cña chuét so víi l« chøng, t¸c dông nµy t−¬ng ®−¬ng víi omeprazol

10 mg/kg.

B¶ng 5.10: ¶nh h−ëng cña ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 trªn sè æ loÐt cña d¹ dµy

Sè æ loÐt ë d¹ dµy

N L« Thuèc thö vµ liÒu l−îng p so víi l« chøng

10,63 ± 4,31

< 0,05 5,83 ± 2,13

> 0,05 7,66 ± 5,09

= 0,05 7,00 ± 2,61

> 0,05 7,00 ± 2,78

DÇu h−íng d−¬ng 10 ml/ kg Misoprostol 100 µg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg ChÕ phÈm CT 20 mg/ kg Hîp chÊt 1 14 mg/ kg Hîp chÊt 1 20 mg/ kg

= 0,05 6,50 ± 3,51

KÕt qu¶ nghiªn cøu ®−îc ghi l¹i trªn B¶ng 5.10 cho thÊy: misoprostol

liÒu100 µg/kg lµm gi¶m râ rÖt sè æ loÐt ë d¹ dµy chuét so víi l« chøng (p<

0,05). ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 cã xu h−íng lµm gi¶m sè æ loÐt ë d¹ dµy

chuét thùc nghiÖm, song sù kh¸c biÖt ch−a cã ý nghÜa thèng kª.

B¶ng 5.11: ¶nh h−ëng cña ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 trªn ®é dµi trung b×nh æ loÐt d¹ dµy

L« n §é dµi TB cña æ loÐt (mm) Thuèc thö vµ liÒu l−îng p so víi chøng

25,75 ± 14,48

< 0,05 11,37 ± 5,06

< 0,05 13,77 ± 5,52

DÇu h−íng d−¬ng 10 ml/ kg Misoprostol 100 µg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg ChÕ phÈm CT 20 mg/ kg 5 Hîp chÊt 1

< 0,05 14,22 ± 5,39

177

> 0,05 16,87 ± 10,50

14 mg/ kg Hîp chÊt 1 20 mg/ kg

< 0,05 9,43 ± 5,69

KÕt qu¶ thùc nghiÖm cho thÊy ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 víi liÒu 20

mg/kg lµm gi¶m râ rÖt ®é dµi trung b×nh æ loÐt d¹ dµy chuét so víi l« chøng,

t¸c dông nµy t−¬ng ®−¬ng víi misoprostol 100 µg/kg.

5.2.4 T¸c dông trªn huyÕt ¸p vµ nhÞp tim chã

B¶ng 5.12: ¶nh h−ëng cña ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 lªn huyÕt ¸p trung b×nh cña chã

HA t¹i c¸c thêi ®iÓm sau uèng thuèc (mmHg)

Thuèc thö

n

LiÒu dïng

HA tr−íc uèng thuèc (mmHg)

30 phót

60 phót

90 phót

120 phót

180 phót

240 phót

300 phót

360 phót

420 phót

480 phót

1 ml/ kg

107,3 ± 6,0

4mg/ kg

112,0 ± 7,6

DÇu h−íng d−¬ng ChÕ phÈm CT

Hîp chÊt 1

4 mg/ kg

107,3 ± 6,6

100 ± 1 115 ± 8 116 ± 2

123 ± 16 109 ± 6 105 ± 9

120 ± 13 108 ± 5 112 ± 3

106 ± 6 112 ± 9 108 ± 11

109 ± 7 115 ± 12 105 ± 2

104 ± 3 113 ± 12 111 ± 1

122 ± 16 109 ± 10 113 ± 4

103 ± 3 107 ± 6 102 ± 5

121 ± 15 106 ± 6 102 ± 0,3

109 ± 6 107 ± 7 103 ± 2

B¶ng 5.13: ¶nh h−ëng cña ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 lªn nhÞp tim chã

NhÞp tim t¹i c¸c thêi ®iÓm sau uèng thuèc (lÇn/ phót)

n

Thuèc thö

LiÒu dïng

30 phót

60 phót

90 phót

120 phót

180 phót

240 phót

300 phót

360 phót

420 phót

480 phót

NhÞp tim/ phót tríc uèng thuèc

1 ml/ kg

170 ± 2

4mg/ kg

171 ± 2

DÇu h−íng d−¬ng ChÕ phÈm CT

183 ± 3

Hîp chÊt 1

171 ±1 170 ± 1 172 ± 8

170 ±1 174 ± 5 186 ±11

171 ± 1 169 ± 2 183 ± 2

175 ± 4 180 ± 6 174 ±10

177 ± 5 178 ±10 183 ± 7

176 ± 2 180 ±13 180 ± 8

185 ± 7 181 ±11 176 ± 7

179 ± 4 181 ±12 181 ±14

175 ± 1 184 ±13 181 ± 4

180 ± 4 184 ±13 188 ± 1

4 mg/ kg

KÕt qu¶ ghi l¹i trªn c¸c B¶ng 5.12 vµ 5.13 cho thÊy ChÕ phÈm CT vµ

hîp chÊt 1 víi liÒu 4 mg/kg thÓ träng kh«ng lµm thay ®æi huyÕt ¸p vµ nhÞp tim

chã mét c¸ch cã ý nghÜa thèng kª trong suèt thêi gian theo dâi (5 giê) so víi

tr−íc khi uèng thuèc vµ so víi chã uèng dung m«i lµ dÇu h−íng d−¬ng.

178

5.2.5 T¸c dông kh¸ng khuÈn in vitro

B¶ng 5.14: KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh kh¸ng sinh víi vi sinh vËt kiÓm ®Þnh

Nång ®é øc chÕ tèi thiÓu (MIC: µg/ ml)

NÊm mèc NÊm men

Thuèc thö

Vi khuÈn Gr (+) Vi khuÈn Gr (-)

E. coli P. aeruginosa

B. subtilis

S. aureus Asp. niger F. oxysporum S. cerevisiae

C. albicans

(-) 50 (-) 25 50 (-) (-) 50

(-) 50 (-) 25 50 (-) (-) 50 ChÕ phÈm CT Hîp chÊt 1

(-) : kh«ng cã t¸c dông kh¸ng vi sinh vËt

Qua B¶ng 5.14 thÊy ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 ®Òu cã ho¹t tÝnh kh¸ng

4 vi sinh vËt kiÓm ®Þnh lµ E. coli, B. subtilis, Asp. niger vµ F. oxysporum.

5.3 KÕt luËn

Qua kÕt qu¶ nghiªn cøu thùc nghiÖm, chóng t«i rót ra mét sè kÕt luËn

- ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 víi liÒu uèng 12-24 mg/kg chuét nh¾t

cã t¸c dông gi¶m ®au theo c¬ chÕ trung −¬ng vµ ngo¹i biªn.

- ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 cã t¸c dông chèng viªm cÊp, gi¶m ph¶n

øng phï viªm, gi¶m l−îng dÞch rØ viªm vµ l−îng b¹ch cÇu trong dÞch

rØ viªm thùc nghiÖm trªn chuét cèng.

- ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 cã t¸c dông chèng viªm m¹n tÝnh, øc

chuét cèng.

- Trªn chuét cèng, víi liÒu uèng 14 mg/kg ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt

1 lµm gi¶m thÓ tÝch dÞch vÞ, gi¶m sè æ loÐt vµ ®é dµi trung b×nh cña

179

vÕt loÐt d¹ dµy.

- ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 kh«ng ¶nh h−ëng ®Õn huyÕt ¸p vµ nhÞp

tim ë chã víi liÒu uèng 4 mg/kg.

- C¶ ChÕ phÈm CT vµ hîp chÊt 1 ®Òu cã ho¹t tÝnh kh¸ng E. coli, B.

subtilis, Asp. niger vµ F. oxysporum in vitro.

Tãm l¹i, vÒ t¸c dông d−îc lý, hîp chÊt ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-

nghiªn cøu sö dông cho c¸c tr−êng hîp viªm cÊp tÝnh (nh− viªm c¬, viªm d¹

dµy, viªm xuÊt tiÕt) vµ viªm m¹n tÝnh (nh− viªm x−¬ng khíp).

hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1)

20 CH3

H 18 CH3COOCH2 CH3

(1)

C«ng thøc hãa häc:

Tªn khoa häc: ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat

180

(b»ng tiÕng Anh: ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetate)

NhiÖt ®é nãng ch¶y: 132-135OC

TÝnh chÊt: Tinh thÓ h×nh kim mµu tr¾ng, kh«ng mïi. DÔ tan trong cloroform;

tan ®−îc trong axeton; khã tan trong n-hexan; thùc tÕ kh«ng tan trong n−íc.

Tan ®−îc trong dÇu bÐo thùc vËt, nh− dÇu h−íng d−¬ng, dÇu l¹c.

Kh«ng lÉn t¹p chÊt v« c¬.

§Æc ®iÓm phæ vµ s¾c ký ; ®é tinh khiÕt :

Phæ hång ngo¹i (IR): phï hîp víi phæ cña s¶n phÈm 1 chuÈn (xem Phô lôc)

Phæ khèi l−îng (EI-MS): phï hîp víi phæ cña s¶n phÈm 1 chuÈn (x. Phô lôc)

Phæ céng huëng tõ proton (1H-NMR): phï hîp víi phæ cña s¶n phÈm 1

chuÈn (xem Phô lôc)

Phæ céng h−ëng tõ carbon-13 (13C-NMR): phï hîp víi phæ cña s¶n phÈm 1

chuÈn (xem Phô lôc)

aluminium sheets Silica gel 60F254 (bÒ dµy cña líp silica gel lµ 0,20 mm) cña h·ng Merck, CHLB §øc. MÉu ph©n tÝch (1 mg) ®−îc hoµ tan trong cloroform

(1 ml), vµ 3 µl dung dÞch thö ®−îc ®−a lªn b¶n máng. HÖ dung m«i ch¹y s¾c

ký lµ n-hexan/etyl axetat 1/1 (v/v). HiÖn vÖt chÊt trªn s¾c ký ®å TLC b»ng

c¸ch phun thuèc hiÖn vanilin/H2SO4 ®Æc 1%, sau ®ã h¬ nãng b¶n máng ë 100OC (ho¹t chÊt ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) cho mµu

tÝm hång), vµ b»ng thuèc thö Dragendorff-Munier (ho¹t chÊt ent-7β-hydroxy-

15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) cho mµu da cam).

Trªn s¾c ký ®å TLC, s¶n phÈm ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl

axetat (1) xuÊt hiÖn d−íi d¹ng mét vÖt trßn duy nhÊt, víi gi¸ trÞ Rf 0,53.

ThiÕt bÞ HPLC AGILENT TECHNOLOGY víi Photodiode Array Detector

1100 DAD. Cét t¸ch cã kÝch th−íc 250 x 4,6 mm; chÊt nhåi cét lµ ODS-18, cì

181

h¹t 5 µm. Pha ®éng lµ hÖ dung m«i gradient MeOH (lo¹i cho HPLC)/H2O, b¾t

®Çu tõ 20% MeOH (v/v) ®Õn 100% MeOH trong 25 phót, sau cïng lµ 100%

MeOH trong 5 phót. Tèc ®é dßng: 1 ml/phót. ThÓ tÝch b¬m mÉu: 10 µl.

Ph¸t hiÖn chÊt b»ng detector DAD ®−îc ®Æt ë c¸c b−íc sãng 210 vµ 240 nm.

MÉu thö ®−îc pha ë nång ®é 5 mg/ml MeOH (lo¹i cho HPLC). Trªn s¾c ký ®å

HPLC cña s¶n phÈm ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) xuÊt

hiÖn mét pic chÝnh ë tR 27,086 phót (xem Phô lôc).

S¶n phÈm ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) thùc tÕ lµ hoµn

toµn tinh khiÕt (1H-NMR, TLC, HPLC).

TÝnh chÊt: ChÕ phÈm CT-2005 cã mµu tr¾ng, kh«ng mïi. DÔ tan trong

cloroform; tan ®−îc trong axeton; khã tan trong n-hexan; thùc tÕ kh«ng tan

trong n−íc. Tan ®−îc trong dÇu bÐo thùc vËt, nh− dÇu h−íng d−¬ng, dÇu l¹c.

Kh«ng lÉn t¹p chÊt v« c¬.

Thµnh phÇn ho¸ häc : ChÕ phÈm CT-2005 chøa chñ yÕu ho¹t chÊt ent-7β-

hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) (chiÕm 86 mol% cña hçn hîp),

ngoµi ra cßn chøa 2 ent-kauran ditecpenoit phô kh¸c lµ ent-1α,14α-diaxetoxy-

7β-hydroxykaur-16-en-15-on vµ ent-1α,7β-diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-

en-15-on (mçi chÊt chiÕm 7 mol% cña hçn hîp) (1H-NMR).

Phæ céng huëng tõ proton (1H-NMR): phï hîp víi phæ cña ChÕ phÈm CT-

2005 chuÈn (xem Phô lôc), so s¸nh phæ nµy víi phæ 1H-NMR cña c¸c mÉu

thµnh phÇn cña ChÕ phÈm CT-2005 (xem ë trªn). KÕt qu¶ nµy còng phï hîp

víi c¸c kh¶o s¸t TLC vµ HPLC.

Ph©n tÝch s¾c ký líp máng (TLC): Víi thuèc hiÖn vanilin/H2SO4 ®Æc 1% trªn s¾c ký ®å TLC cña ChÕ phÈm CT-2005 xuÊt hiÖn ba vÖt trßn mµu tÝm hång

gÇn nhau víi c¸c gi¸ trÞ Rf 0,44 ; 0,53 (cña ho¹t chÊt chñ yÕu 1) ; vµ 0,60.

182

cña ChÕ phÈm CT-2005 chuÈn (xem Phô lôc). Trªn s¾c ký ®å HPLC cña ChÕ

phÈm CT-2005 cã ba hîp chÊt chÝnh ®−îc röa gi¶i ra ë tR 22,599 phót (ent-

1α,14α-diaxetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-on), 23,301 phót (ent-1α,7β-

diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-on), vµ 27,133 phót (ho¹t chÊt chñ yÕu

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1)). HPLC profile nµy cã thÓ

®−îc sö dông vµo viÖc tiªu chuÈn hãa ChÕ phÈm CT-2005 ®−îc s¶n xuÊt tõ

KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ

ditecpenoit (ho¹t chÊt ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat

(Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae); quy tr×nh nµy ®· ®−îc ¸p

s¶n xuÊt vµ cung cÊp luîng lín ho¹t chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT-2005 cho

c¸c nghiªn cøu ho¹t tÝnh sinh häc in vitro vµ trªn ®éng vËt thùc nghiÖm.

chøng trong kiÓm nghiÖm vµ trong kiÓm tra c¸c mÎ s¶n phÈm chiÕt

t¸ch.

3. §· tiÕn hµnh thö ®éc tÝnh cÊp vµ ®éc tÝnh b¸n tr−êng diÔn cña ho¹t chÊt

1 vµ ChÕ phÈm CT-2005. KÕt qu¶ cho thÊy: vÒ ®éc tÝnh cÊp, ho¹t chÊt

1 vµ ChÕ phÈm CT-2005 theo ®−êng uèng gÊp 500 lÇn liÒu dïng dù

kiÕn cho ng−êi kh«ng cã chuét nµo chÕt nªn kh«ng x¸c ®Þnh ®−îc LD50; vÒ ®éc tÝnh b¸n tr−êng diÔn, ë thá ho¹t chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT-2005

183

víi liÒu t−¬ng ®−¬ng víi gÊp ba lÇn liÒu dïng dù kiÕn cho ng−êi uèng

liªn tôc trong 4 tuÇn, t×nh tr¹ng chung, chøc phËn gan, thËn vµ t¹o huyÕt

kh«ng bÞ ¶nh h−ëng.

4. KÕt qu¶ b−íc ®Çu thùc hiÖn mét sè kh¶o s¸t ¶nh h−ëng tíi vËt liÖu di

truyÒn ë sóc vËt thÝ nghiÖm cho thÊy ¶nh h−ëng cña ho¹t chÊt ent-

kauran ditecpenoit 1 ®Õn sè l−îng vµ cÊu tróc nhiÔm s¾c thÓ tñy x−¬ng

vµ tinh hoµn cña chuét nh¾t tr¾ng ë liÒu ®iÒu trÞ vµ liÒu ®iÒu trÞ x 3 víi

thêi gian uèng thuèc 20 ngµy so víi nhãm chøng, sù kh¸c biÖt gi÷a c¸c

nhãm kh«ng cã ý nghÜa thèng kª.

5. KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh kh¸ng u trùc tiÕp trªn c¸c dßng tÕ bµo ung th−

ng−êi nu«i cÊy in vitro ®· cho thÊy c¸c mÉu cña ho¹t chÊt 1 vµ ChÕ

phÈm CT-2005 lÊy tõ c¸c mÎ chiÕt t¸ch kh¸c nhau ®Òu cã ho¹t tÝnh

cancer, RD – Rhabdosarcoma, vµ Hep-G2 – Hepatocellular carcinoma) ë gi¸ trÞ IC50 thÊp.

6. KÕt qu¶ thö t¸c dông chèng ung th− trªn ®éng vËt thùc nghiÖm cho thÊy

ho¹t chÊt 1 vµ ChÕ phÈm CT-2005 víi liÒu l−îng 10 mg/kg vµ 20

mg/kg thÓ träng chuét nh¾t cã t¸c dông h¹n chÕ sù ph¸t triÓn ung th−

thùc nghiÖm sarcoma 180 in vivo vµ nÕu uèng tr−íc mét th¸ng th× cã

t¸c dông dù phßng ung th−.

7. KÕt qu¶ thö trªn ®éng vËt thùc nghiÖm cho thÊy ho¹t chÊt 1 vµ ChÕ

phÈm CT-2005 cã c¸c t¸c dông râ rÖt gi¶m ®au; chèng viªm cÊp, chèng

viªm m¹n tÝnh; gi¶m thÓ tÝch dÞch vÞ, gi¶m sè æ loÐt vµ ®é dµi trung

b×nh cña vÕt loÐt d¹ dµy. VÒ t¸c dông d−îc lý, ho¹t chÊt 1 vµ ChÕ phÈm

CT-2005 cã thÓ ®−îc nghiªn cøu sö dông cho c¸c truêng hîp viªm cÊp

tÝnh nh− viªm c¬, viªm d¹ dµy, viªm xuÊt tiÕt; vµ viªm m¹n tÝnh nh−

viªm x−¬ng khíp.

§Ò tµi ®· ®¨ng ký 2 B»ng ®éc quyÒn s¸ng chÕ, ®µo t¹o 2 Th¹c sÜ Hãa häc,

vµ hoµn thµnh 4 bµi b¸o khoa häc ®Ó ®¨ng trªn c¸c T¹p chÝ khoa häc

184

chuyªn ngµnh.

Nh− vËy §Ò tµi §T§L-2005/05 ®· hoµn thµnh tèt vµ v−ît møc kÕ ho¹ch

®−îc giao. Quy tr×nh chiÕt t¸ch ®· ®−îc hoµn thiÖn ®Ó triÓn khai æn ®Þnh ë

nghiÖm ho¹t tÝnh sinh häc in vitro vµ nhÊt lµ trªn ®éng vËt thùc nghiÖm ®Òu

®· ®−îc thùc hiÖn víi c¶ ho¹t chÊt 1 lÉn ChÕ phÈm CT-2005 (kÕ ho¹ch §Ò

tµi chØ yªu cÇu thö víi ChÕ phÈm CT-2005), ®iÒu nµy ®ßi hái nhiÒu cè

g¾ng vÒ mÆt thö nghiÖm còng nh− vÒ mÆt s¶n xuÊt ®ñ l−îng ho¹t chÊt 1

vµ ChÕ phÈm CT-2005 cho c¸c nghiªn cøu, thö nghiÖm ho¹t tÝnh sinh häc.

§Ò nghÞ:

Víi c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu thu ®−îc, §Ò tµi §T§L-2005/05 ®· t¹o c¬

së ®Ó ph¸t triÓn d−îc phÈm t¹o ra c¸c thuèc chèng viªm, gi¶m ®au, b¶o vÖ

d¹ dµy, hç trî ®iÒu trÞ ung th− vµ dù phßng ung th− míi tõ ho¹t chÊt ent-

Euphorbiaceae). Chóng t«i kÝnh ®Ò nghÞ Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ xÐt

duyÖt vµ tµi trî kinh phÝ cho nghiªn cøu tiÕp vÊn ®Ò nµy ë Giai ®o¹n 2 ®Ó

®−a c¸c kÕt qu¶ cña Giai ®o¹n 1 võa qua vµo øng dông thùc tiÔn.

Cô thÓ, ë Giai ®o¹n 1 võa qua §Ò tµi ®· nghiªn cøu ®−îc quy tr×nh chiÕt

cÊp vµ ®éc tÝnh b¸n tr−êng diÔn, x¸c ®Þnh ho¹t tÝnh in vitro vµ trªn ®éng vËt

thùc nghiÖm, x¸c ®Þnh liÒu dïng dù kiÕn cho ng−êi). V× vËy, ®Ó ®−a c¸c kÕt

qu¶ nµy vµo øng dông, chóng t«i kÝnh ®Ò nghÞ Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ

xÐt duyÖt cho nghiªn cøu tiÕp vÊn ®Ò nµy ë Giai ®o¹n 2 víi c¸c néi dung

dông chèng viªm, gi¶m ®au, b¶o vÖ d¹ dµy, hç trî ®iÒu trÞ ung th− vµ dù

185

phßng ung th−.