Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp cơ sở: Khảo sát hoạt tính kháng phân bào In vitro của Gossypol và Plumbagin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH. KHOA SINH HỌC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ NĂM 2000-2001

ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN MÃ SỐ: CS 2000-15

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI T.S Dƣơng Thị Bạch Tuyết

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11 năm 2002

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH. KHOA SINH HỌC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ NĂM 2000-2001

ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN MÃ SỐ: CS 2000-15

Nhóm thực hiện: Dƣơng Thị Bạch Tuyết * Nguyễn Đăng Quân ** Phan Kim Ngọc ** Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng *

* Khoa Sinh học - Đại học Sƣ Phạm Tp. Hồ Chí Minh ** Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11 năm 2002

MỤC LỤC

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 2

I. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ BỆNH UNG THƢ ...................................................... 2 1. Bản chất của bệnh ung thƣ ............................................................................................. 2

2. Sự khác nhau của mỗi loại ung thƣ: ............................................................................... 2

3. Có thể phòng ngừa đƣợc nhiều loại ung thƣ .................................................................. 5

II. ĐẠI CƢƠNG VỀ CƠ CHẾ SINH BỆNH UNG THƢ ......................................................... 5 1. Đại cƣơng về khối u và lịch sử nghiên cứu ................................................................... 5

2. Tế bào ung thƣ ............................................................................................................... 6

3. Sơ lƣợc về cơ sở sinh học phân tử của ung thƣ ............................................................. 8

III. ĐẠI CƢƠNG VỀ THUỐC CHỮA UNG THƢ .................................................................. 9 1. Cơ chế tác động của thuốc chữa ung thƣ ....................................................................... 9

2. Sự kháng thuốc của tế bào ung thƣ ................................................................................ 9

3. Độc tính của các thuốc chữa ung thƣ ........................................................................... 10

IV. ĐẠI CƢƠNG VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ..................................................... 11 1. Đặc điểm của tế bào động vật ...................................................................................... 11

2. Môi trƣờng nuôi cây tế bào động vật ........................................................................... 12

PHẦN III: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP .............................................................................. 15

I. VẬT LIỆU ............................................................................................................................ 15 1. Gossypol ...................................................................................................................... 15

2. Plumbagin .................................................................................................................... 16

3. Các dòng tế bào ung thƣ .............................................................................................. 17

II. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................................................. 18 1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào: ...................................................................................... 18

2. Phƣơng pháp đếm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay): .................. 18

3. Phƣơng pháp MTT (MTT assay): ................................................................................ 19

4. Phƣơng pháp clonogenic (clonogenic assay): .............................................................. 20

5. Phƣơng pháp xử lý thống kê ........................................................................................ 20

PHẦN IV: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN ..................................................................................... 21

I. TÁC ĐỘNG CỦA GOSSYPOL LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2 ........................................... 21 II. TÁC ĐỘNG CỦA PLUMBAGIN LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2 ...................................... 23 PHẦN V: KẾT LUẬN ............................................................................................................. 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................... 28

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thƣ là một trong những bệnh phổ biến và có tỷ lệ gây tử vong cao trên thế giới

cũng nhƣ ở Việt Nam. Đây là dạng bệnh lý có liên quan đến hiện tƣợng rối loạn trong quá

trình điều hòa sự phân chia tế bào ở các mô trong cơ thể. Khối u hình thành do những tế bào

ung thƣ phân chia liên tục không đƣợc kiểm soát, ban đầu khối u định vị tại một mô nhƣng

sau đó tế bào ung thƣ có thể di căn khắp cơ thể, làm cơ thể suy kiệt và dẫn đến tử vong. Ung

thƣ hiện vẫn là vấn đề nan giải của Y học, ngƣời ta vẫn chƣa tìm ra hoạt chất hay phƣơng

pháp nào điều trị hữu hiệu tất cả các dạng ung thƣ.

Nghiên cứu về bệnh ung thƣ và cách chữa trị ung thƣ là lĩnh vực rất đƣợc quan tâm

trên thế giới. Đã có nhiều tổ chức, viện nghiên cứu ung thƣ đƣợc thành lập ở nhiều quốc gia

trên thế giới nhƣ: American Association Cancer Research, Australian Cancer Society, British

Association for Cancer Research, National Cancer Institute of Canada, European Association

for Cancer Research . . . Nhiều nghiên cứu về bệnh ung thƣ và cách chữa trị ung thƣ đƣợc

thực hiện trên thế giới và đã đạt đƣợc nhiều hiểu biết về cơ chế phân tử của sự phân bào, cơ

chế phân tử của bệnh ung thƣ, các phƣơng thức hữu hiệu để tiêu diệt hay ngăn cản sự phát

triển của tế bào ung thƣ và gần đây nhất là giải Nobel Sinh lý và Y học năm 2001 cũng là

những phát hiện liên quan đến các protein tham gia vào quá trình phân bào và ung thƣ.

Việt Nam là một nƣớc nhiệt đới với nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú, trong đó

có thể sẽ có nhiều cây thuốc với những hoạt chất kháng ung thƣ mạnh có thể ứng dụng vào

điều trị. Tuy nhiên, những nghiên cứu về hoạt chất kháng ung thƣ ở nƣớc ta không nhiều.

Trƣớc tình hình đó, việc phát triển những phƣơng pháp thử nghiệm nhằm xác định

hoạt tính kháng ung thƣ của các chất chiết xuất từ thực vật là cần thiết, từ đó nâng cao hiệu

quả sử dụng của nguồn tài nguyên cây thuốc Việt Nam và làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu

hơn. Để bƣớc đầu thực hiện mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng phân

bào của 2 hoạt chất gossypol và plumbagin có nguồn gốc từ cây thuốc dân gian đƣợc biết là

có khả năng kháng ung thƣ [11,13] trên hai dòng tế bào ung thƣ của ngƣời trong điều kiện in

vitro.

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ BỆNH UNG THƢ

1. Bản chất của bệnh ung thƣ

Ung thƣ là bệnh lý ác tính của tế bào. Khi bị kích thích bởi các tác nhân sinh ung thƣ,

tế bào tăng sinh vô hạn độ, vô tổ chức không tuân theo các cơ chế kiểm soát và phát triển của

cơ thể.

Đa số ngƣời bị ung thƣ hình thành các khối u. Khác với khối u lành tính (chỉ phát

triển tại cho thƣờng rất chậm, có vỏ bọc chung quanh), các khối u ác tính (ung thƣ) xâm lấn

vào các tổ chức lành xung quanh giống nhƣ hình "con cua" với các càng cua bám vào các tổ

chức lành trong cơ thể hoặc giống nhƣ rễ cây lan trong đất. Các tế bào của khối u ác tính có

khả năng di căn tới các hạch bạch huyết hay các tạng ở xa hình thành các khối u mới và cuối

cùng dẫn đến tử vong.

Đa số ung thƣ có biểu hiện mãn tính, có quá trình phát sinh và phát triển lâu dài qua

nhiều giai đoạn. Trừ một số nhỏ ung thƣ ở trẻ em có lẽ do đột biến gen ở giai đoạn bào thai,

còn phần lớn ung thƣ đều có giai đoạn tiềm tàng lâu dài, có khi hàng chục năm không có dấu

hiệu gì trƣớc khi phát hiện thấy dƣới dạng các khối u. Khi các khối u phát triển nhanh mới có

triệu chứng ung thƣ. Triệu chứng đau chỉ xuất hiện khi ung thƣ ở vào giai đoạn cuối.

2. Sự khác nhau của mỗi loại ung thƣ:

Ngƣời ta biết đƣợc có đến 200 loại ung thƣ khác nhau trên cơ thể ngƣời. Những loại

ung thƣ này tuy có những điểm giống nhau về bản chất nhƣng chúng có nhiều điểm khác

nhau nhƣ sau:

2.1. Khác nhau về nguyên nhân

Qua các nghiên cứu dịch tễ học của R.Doll và Petro trên 80% tác nhân sinh ung thƣ là

bắt nguồn từ môi trƣờng sống, trong đó có 2 tác nhân lớn nhất là: 35% do chế độ ăn uống gây

nhiều loại ung thƣ đƣờng tiêu hóa và khoảng 30% ung thƣ do thuốc lá (gây ung thƣ phổi, ung

thƣ đƣờng hô hấp trên . . .).

Các tác nhân khác gồm:

- Tia phóng xạ: có thể gây ung thƣ máu, ung thƣ tuyến giáp.

- Bức xạ tử ngoại: có thể gây ung thƣ da.

- Virus Epstein - Barr: gây ung thƣ vòm họng, u lympho ác tính.

- Virus viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV) dẫn đến ung thƣ gan . . .

- Các loại hóa chất đƣợc sử dụng trong công nghiệp, trong thực phẩm, trong chiến

tranh, các chất thải ra môi trƣờng nƣớc và không khí là tác nhân của nhiều loại ung thƣ khác

nhau.

2.2. Khác nhau về tiến triển

Ung thƣ thƣờng xuất phát từ 2 tổ chức chính của cơ thể:

- Từ các tế bào biểu mô của các tạng, các cơ quan (ung thƣ biểu mô: carcinoma)

- Từ các tế bào của tổ chức liên kết của cơ thể (sarcoma). Ung thƣ của cơ quan tạo

huyết (máu, hạch lympho) là một dạng đặc biệt của ung thƣ tể chức liên kết

(Hematosarcoma).

Mỗi loại ung thƣ có hƣớng tiến triển khác nhau. Trong từng loại, mỗi loại ung thƣ của

mỗi cá thể khác nhau, xu hƣớng tiến triển cũng rất khác nhau.

- Có loại ung thƣ tiến triển rất nhanh (ung thƣ máu, hạch, ung thƣ hắc tố, các ung thƣ

liên kết. . .).

- Có nhiều loại ung thƣ tiến triển chậm: ung thƣ da tế bào đáy, ung thƣ giáp trạng, ung

thƣ cổ tử cung . . .

- Loại ung thƣ biểu mô thƣờng di căn theo đƣờng bạch huyết đến các hạch khu vực.

- Loại ung thƣ liên kết (xƣơng, phần mềm) thƣờng di căn theo đƣờng máu tới các tạng

ở xa (vào gan, phổi, xƣơng).

Thông thƣờng ung thƣ càng ở giai đoạn muộn, càng hay có di căn ra hạch khu vực và

di căn xa nhƣng đôi khi có di căn rất sớm, thậm chí từ lúc chƣa phát hiện thấy u nguyên phát.

Tốc độ phát triển của ung thƣ cũng tùy thuộc vào từng giai đoạn của từng loại. Ở

những giai đoạn sớm (insitu, giai đoạn 1) ung thƣ thƣờng tiên triển lâu dài, chậm chạp, nhƣng

ở các giai đoạn muộn (giai đoạn 3,4) ung thƣ tiến triển thƣờng rất nhanh và gây tử vong.

Ung thƣ ở ngƣời càng trẻ, thƣờng tiến triển nhanh hơn ngƣời già.

2.3. Khác nhau về phƣơng pháp điều trị

Trong y văn có nói đến một tỷ lệ rất nhỏ ung thƣ tự khỏi (1/10.000). Có thể ở những

cơ thể cá biệt, có hệ thống miễn dịch tự điều chỉnh, tiêu diệt đƣợc các tế bào ung thƣ sau khi

đã phát sinh. Nhƣng trên căn bản nếu không điều trị thì chắc chắn bệnh nhân sẽ sớm dẫn đến

tử vong. Càng điều trị ung thƣ ở giai đoạn sớm, bệnh nhân càng có cơ may trị khỏi bệnh ung

thƣ. Ở những giai đoạn muộn hơn cũng cần điều trị để tạm thời ổn định hoặc kéo dài thời

gian sống hoặc giảm các triệu chứng của ung thƣ.

Mỗi loại ung thƣ, mỗi giai đoạn bệnh có phƣơng pháp điều trị khác nhau.

- Điều trị phẫu thuật: thƣờng áp dụng cho ung thƣ ở giai đoạn sớm chƣa có di căn.

- Điều trị tia xạ: thƣờng áp dụng cho những ung thƣ ở giai đoạn tƣơng đối muộn hơn.

Thƣờng phối hợp với phẫu thuật làm thu nhỏ bớt khối u để dễ mổ hoặc diệt những tế bào u tại

chỗ và hạch khu vực mà khi mổ nghi ngờ chƣa lấy hết hạch, hoặc áp dụng tia xạ cho ung thƣ

ở các vị trí không thể mổ đƣợc.

- Điều trị hóa chất: trƣớc đây áp dụng cho những loại ung thƣ có tính chất toàn thân

hay ở giai đoạn muộn, có di căn, nhƣng ngày nay số ung thƣ ở giai đoạn sớm (trên lâm sàng)

nhƣng tính chất ác tính cao, dễ di căn hoặc nghi có vi di căn (ung thƣ vú, tinh hoàn, buồng

trứng, ung thƣ rau . . . ) ngƣời ta cũng sử dụng hóa trị để phòng ngừa và nâng cao hiệu quả

điều trị.

- Điều trị miễn dịch: là 1 trong 2 phƣơng pháp điều trị toàn thân, còn đang đƣợc

nghiên cứu và có nhiều hy vọng. Có nhiều thử nghiệm đã áp dụng nhƣ điều trị kích thích

miễn dịch không đặc hiệu, điều trị bằng interferon, các lymphokin và gần đây là các nghiên

cứu dùng kháng thể đơn dòng đã điều trị một số bệnh ung thƣ có kết quả tốt.

2.4.Khác nhau về tiên lƣợng bệnh

Tiên lƣợng ung thƣ phụ thuộc rất nhiều yếu tố trên từng bệnh nhân. Những yếu tố

chính là:

- Giai đoạn ung thƣ: càng sớm tiên lƣợng càng tốt và ngƣợc lại.

- Loại ung thƣ: những ung thƣ ở bề mặt có tiên lƣợng tốt hơn (dễ phát hiện, dễ điều

trị) nhƣ ung thƣ da, ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ vú, ung thƣ giáp trạng, ung thƣ khoang

miệng, ung thƣ đại trực tràng . . .

Có những ung thƣ ở các tạng quan trọng khó phát hiện sớm, khó điều trị, tiên lƣợng

thƣờng xấu nhƣ ung thƣ phổi, gan, não, tụy, xƣơng . . .

- Tính ác tính của tế bào ung thƣ: cùng 1 loại ung thƣ, cùng giai đoạn lâm sàng nhƣng

độ ác tính của chúng khác nhau. Độ ác tính càng cao tiên lƣợng càng xấu.

- Thể trạng của ngƣời bị ung thƣ: ở ngƣời già ung thƣ thƣờng tiến triển chậm nhƣng

thể trạng yếu nên khó thực hiện đƣợc phác đồ điều trị 1 cách triệt để nên càng già yếu tiên

lƣợng càng xấu.

3. Có thể phòng ngừa đƣợc nhiều loại ung thƣ

Nhƣ trên đã đề cập đến tác nhân sinh ung thƣ chủ yếu là từ môi trƣờng bên ngoài (trên

80%). Tác nhân nội sinh rất ít (chỉ khoảng 1%). Vì vậy, phòng bệnh ung thƣ có hiệu quả khi

ngăn chặn tốt các tác nhân do môi trƣờng tác động vào đời sống con ngƣời nhƣ: ngừng hút

thuốc lá, chế độ dinh dƣỡng vệ sinh an toàn hợp lý, chống lạm dụng các hóa chất công

nghiệp, chống ô nhiễm môi trƣờng, phòng bệnh nghề nghiệp ... sẽ làm giảm tỷ lệ mắc ung

thƣ.

Một số loại bệnh ung thƣ có liên quan đến virus đã đƣợc ngƣời ta áp dụng vaccin để

phòng ung thƣ nhƣ vaccin phòng viêm gan B, và ngƣời ta đang nghiên cứu vaccin phòng

Esptein-Barr gây ung thƣ vòm họng và u lympho . . .

Ngoài ra các biện pháp điều trị tổn thƣơng tiền ung thƣ, các biện pháp sàng lọc phát

hiện sớm một số ung thƣ hay gặp (vú, cổ tử cung, khoang miệng, đại trực tràng . . .) đã thiết

thực làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, làm giảm tỷ lệ tử vong do ung thƣ. [1]

II. ĐẠI CƢƠNG VỀ CƠ CHẾ SINH BỆNH UNG THƢ 1. Đại cƣơng về khối u và lịch sử nghiên cứu

Nghiên cứu cơ chế sinh bệnh ung thƣ cần phải đi sâu tìm hiểu về quá trình sinh học

của tế bào ung thƣ và sinh học phân tử của ung thƣ.

1.1. Phân biệt u lành và u ác tính theo đặc tính sinh học

U lành tính U ác tính

Tế bào biệt hóa cao Ít biệt hóa

Hiếm có phân bào Luôn có phân bào

Phát triển chậm Phát triển nhanh

Không xâm lấn Xâm lấn lan rộng

Không có hoại tử Hay có hoại tử trung tâm

Có vỏ bọc Không có vỏ hoặc ranh giới

Rất ít tái phát Luôn tái phát

Không di căn Di căn

Ít ảnh hƣởng đến cơ thể Ảnh hƣởng nặng tới cơ thể

1.2. Một số mốc lịch sử nghiên cứu về ung thƣ

- Xƣơng hóa thạch của loại khủng long cách đây 60 triệu năm có thƣơng tổn ung thƣ.

- Xác ƣớp ngƣời Ai cập ở Gaza cách đây 5000 năm thấy có ung thƣ xƣơng và ung thƣ

bàng quang.

- Thời Hypocrates đã để lại một số bản viết tay mô tả 2 loại ung thƣ: loại sùi ra ngoài

nhiều chân nhƣ loài tôm cua gọi là carcinoma và loại phát triển sâu trong thịt gọi là sarcoma.

- 1846 R.Virchop (ngƣời Đức) mô tả tế bào ung thƣ máu và đƣa ra giả thuyết về

nguồn góc ung thƣ tế bào.

- 1953 J.Watson và F. Crick dƣa ra mô hình chuỗi xoắn kép phân tử DNA mô phỏng

các loại gen của tế bào. Công trình nhận giải Nobel Sinh học.

- 1979 Richard Doll lãnh đạo nhóm nghiên cứu nguyên nhân gây ung thƣ trên ngƣời

từ môi trƣờng sống. Trong đó ông và Petro nhấn mạnh vai trò quan trọng của hút thuốc, dinh

dƣỡng và các ung thƣ nghề nghiệp.

- 1981 Cesar Milstein đã phát triển kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng (nhận giải

Nobel 1987).

- 1981 S.D.Thomas đã thành công ghép tủy xƣơng trên ngƣời ứng dụng xạ trị toàn

thân và điều trị hóa chất mạnh trong bệnh bạch huyết cấp (nhận giải Nobel năm 1990).

2. Tế bào ung thƣ 2.1. Nguồn gốc tế bào ung thƣ

Có một số giả thuyết khác nhau nhằm giải thích các quan sát về quần thể tế bào ung

thƣ.

2.7.7. Thuyết đơn dòng tế bào

Là quan niệm kinh điển: khối u sinh ra từ 1 tế bào mẹ nhân lên.

Ví dụ: từ bệnh bạch cầu thể tủy trên phụ nữ da đen thấy tế bào đồng nhất thƣơng tổn

nhiễm sắc thể 10. Các tế bào ung thƣ đều tiết men Glucose-6-phosphate dehydrogenase.

2.7.2. Thuyết đa dòng tế bào

Khi quan sát về hình thái và chức năng ngƣời ta thấy:

- Tổ chức ung thƣ có nhiều loại tế bào nên chẩn đoán hình thái học dễ nhầm

lẫn.

- Về chức năng: nhiều chất chỉ điểm sinh học.

2.1.3. Thuyết về kém ổn định gen của tế bào ung thƣ

Có thể ban đầu là một dòng, do gen tế bào ung thƣ không ổn định nên có các tế bào

biến dị tạo nên hàng loạt các tế bào hỗn hợp.

Ví dụ: U lympho ác tính tế bào lớn, tế bào nhỏ. Các loại ung thƣ phổi thể hỗn hợp,

ung thƣ liên kết hỗn hợp.

2.2. Các đặc tính tế bào ung thƣ

- Hình thái học: tăng kích thƣớc nhân, tăng tỷ lệ nhân so với bào tƣơng, không còn ức

chế tiếp xúc.

- Chức năng:

+ Hai đặc tính tại cho: xâm lấn lan rộng, tế bào thoát mạch di chuyển và đi căn do

hiện tƣợng phân bào mạnh.

+ Tế bào biệt hóa thấp, không làm đƣợc chức năng bình thƣờng, nếu bị thiếu dƣỡng

chất dễ bị hoại tử nhất là vùng trung tâm u.

+ Đôi khi tiết ra những hoạt chất lạ mà qua đó ta có thể gián tiếp thấy đƣợc sự hiện

diện của tế bào ung thƣ khá đặc hiệu:

αFP: trong ung thƣ gan

CA125: trong ung thƣ buồng trứng

CA25: trong ung thƣ vú

CEA: trong ung thƣ đại trực tràng

HCG: trong ung thƣ nhau, ung thƣ tinh hoàn

β2Microglobulin, Belcezol: trong đa u tủy xƣơng.

3. Sơ lƣợc về cơ sở sinh học phân tử của ung thƣ 3.1. Phần quy định sinh sản tế bào là DNA của nhân tế bào

Trong ung thƣ việc thay đổi DNA dẫn đến sinh sản vô tổ chức là hậu quả của quá

trình đột biến gen, chứng cớ mạnh mẽ nhất là:

- Những chất gây đột biến gen tế bào chính là những tác động hoá lý gây ung

thƣ.

- Những tác động gây ung thƣ cũng gây nên đột biến gen.

3.2.Các gen gây ung thƣ (Oncogen)

Cho đến nay đã tìm ra trên 40 loại. Có 3 giả thuyết cho việc hình thành Oncogen.

- Oncogen là những gen để phát triển tế bào, hoạt hóa nhờ yếu tố tăng trƣởng (growth

factor). Do rối loạn cơ chế điều hành, yếu tố tăng trƣởng hoạt hóa mạnh kích thích Oncogen

sinh ung thƣ.

- Oncogen là những đoạn DNA bị thƣơng tổn bởi các tác nhân gây bệnh nhƣ hóa học,

sinh học, vật lý. Cơ thể đã sửa chữa những đoạn DNA này nhƣng không hoàn chỉnh, nên

cùng tác nhân gây ung thƣ, có ngƣời bị ung thƣ có ngƣời không bị ung thƣ.

- Oncogen là do các genome của virus đƣa vào cơ thể vì thấy các Oncogen này giống

với DNA của virus ví dụ: HPV (cổ tử cung, dƣơng vật), EBV (Burkitt) và HBV (ung thƣ

gan).

Một số gen gây ung thƣ

Gen Vị trí Sai lạc Loại ung thƣ

Hội chứng Gadner, ung thƣ trực tràng 5q Apc

Đa polip trực tràng 5q Khuyết đoạn Mcc

Ung thƣ đại tràng, hội chứng lynch 1p Raa

Ung thƣ đại tràng P53

Bạch cầu cấp lympho, ung thƣ buồng trứng 9q +(6; 14) Abl

U lympho Burkitt, ung thƣ nguyên bào thần kinh, 6q +(8; 14) Myl

bạch cầu cấp. 8q Myc

Ras 11p Khuyết đoạn U Wilm, carcinoma

Fms 5q Nhiều loại ung thƣ

p: Nhánh ngắn nhiễm sắc thể q: Nhánh dài nhiễm sắc thể +: Nối đoạn [1]

III. ĐẠI CƢƠNG VỀ THUỐC CHỮA UNG THƢ 1. Cơ chế tác động của thuốc chữa ung thƣ

Các thuốc chữa ung thƣ có tác động đến các giai đoạn khác nhau trong quá trình tổng

hợp acid nucleic (đặc biệt là DNA) cũng nhƣ quá trình tổng hợp protein ở các tế bào ung thƣ

vào các thời kỳ khác nhau của chu trình phân chia tế bào.

Ở các mô ung thƣ của ngƣời có khoảng 50% tế bào ở giai đoạn nghỉ không phân chia

(G0). Sự phân chia của tế bào có thể phân thành 4 giai đoạn:

- Giai đoạn G1 là thời kỳ sau gián phân. Thời gian của giai đoạn này rất khác nhau tùy

theo loại tế bào. Trong thời kỳ này tế bào sinh ra các protein cần cho tổng hợp DNA.

- Giai đoạn s là giai đoạn tổng hợp DNA.

- Giai đoạn G2 là giai đoạn tiền gián phân. Trong thời kỳ này xảy ra tổng hợp RNA và

các protein đặc hiệu của ung thƣ.

- Giai đoạn M là thời kỳ gián phân (thời kỳ phân chia tế bào). Giai đoạn này lại chia

thành prophase, metaphase, anaphase và telophase.

Các thuốc chữa ung thƣ không ảnh hƣởng đến giai đoạn nghỉ, mà chỉ tác động lên các

giai đoạn s, Gọ và M, thậm chí có thuốc chỉ tác động lên một kỳ nào đó của giai đoạn M mà

thôi.

2. Sự kháng thuốc của tế bào ung thƣ

Các tế bào ung thƣ có thể kháng lại các thuốc chữa ung thƣ cũng nhƣ vi khuẩn kháng

kháng sinh.

Cơ chế tế bào ung thƣ kháng thuốc có thể là:

- Làm giảm khả năng xâm nhập của thuốc vào các tổ chức ung thƣ.

- Làm giảm hoạt tính của thuốc do làm thay đổi các phân tử thuốc.

- Làm biến đổi các protein mục tiêu và các yếu tố cần cho thuốc tác động lên tế bào

ung thƣ.

- Làm tăng khả năng tổng hợp protein để vẫn đảm bảo phân chia tế bào mặc dù bị

thuốc tác động.

Sự kháng thuốc có thể đặc hiệu do một loại thuốc nhất định, nhƣng cũng nhƣ kháng

kháng sinh, các tế bào ung thƣ cũng có hiện tƣợng kháng chéo thuốc. Ví dụ: một dòng tế bào

ung thƣ đã kháng alcaloid của dừa cạn, cũng kháng cả anthracyclin. Hiện tƣợng này gọi là

kháng đa thuốc (multidrug resistance)

3. Độc tính của các thuốc chữa ung thƣ

Các thuốc chữa ung thƣ có tác dụng độc, ngăn cản sự phân chia các tế bào ung; thƣ,

nhƣng đồng thời cũng gây độc cả tế bào lành, do đó chúng thƣờng khá độc.

Tác dụng của thuốc chữa ung thƣ không đặc hiệu nhƣ các hóa trị liệu kháng khuẩn. Vì

vậy trong điều trị ung thƣ bằng hóa trị liệu thƣờng có nhiều tác dụng phụ có hại nhiều khi khá

nặng, đặc biệt là tác hại lên tủy xƣơng, trên các tế bào sinh sản, trên các niêm mạc, da, sự

phát triển của tóc, bào thai, trên khả năng sinh miễn dịch.

Một trong những cách hiện đại làm tăng tính đặc hiệu của thuốc chữa ung thƣ là gắn

chúng lên các kháng thể đơn dòng.

Các biểu hiện độc thƣờng là:

- Rối loạn tiêu hoá, buồn nôn và nôn mửa

- Rụng tóc

- Trên tủy xƣơng: làm yếu chức năng tủy, hạn chế tạo huyết cầu.

- Ảnh hƣởng xấu đến buồng trứng và tinh hoàn, dẫn đến vô sinh.

- Làm chậm tăng trƣởng và phát triển ở trẻ em.

- Gây ung thƣ thứ phát do dùng thuốc.

- Gây tổn thƣơng mạch máu và đau khi truyền thuốc tĩnh mạch hay sau khi điều trị

một thời gian.

- Rối loạn tính cách, hành vi.

- Sút cân, ngƣời yếu, không còn khả năng làm việc.

- Đã thấy thuốc gây quái thai trên động vật thí nghiệm. Vì vậy ngƣời đã dùng thuốc

chữa ung thƣ thì không nên có con nữa. [2]

IV. ĐẠI CƢƠNG VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 1. Đặc điểm của tế bào động vật 1.1. Tính cơ học yếu

Tế bào động vật không vách nhƣng kích thƣớc tế bào khá lớn (khoảng 10 μm) nên

tính bền cơ học yếu. Do đó khi nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi

khuấy trộn để tách tế bào, thao tác v.v... Trong trƣờng hợp việc nuôi cấy tế bào động vật cần

khuấy hay quay thì tốc độ không đƣợc quá 100rpm (vòng/phút).

Thời gian tiến hành các thao tác với tế bào động; vật cũng cố gắng sao cho ngắn nhất,

thời gian càng kéo dài, tế bào càng lỏng lẻo dễ vỡ. Trong bảo quản, di chuyển các mẫu tế bào

cũng cố gắng thật nhẹ nhàng.

1.2. Tăng trƣởng và phân chia chậm

Thời gian tăng gấp đôi số lƣợng của tế bào động vật trong điều kiện sinh lý là 20-40

giờ. Hiệu suất sản sinh các chất có hoạt tính sinh học của tế bào động vật rất thấp và chậm.

Do đó cần có thời gian dài và khối lƣợng tế bào lớn khi chúng ta muốn sản xuất chất có hoạt

tính từ tế bào động vật.

1.3. Cơ chế kìm hãm ngƣợc (negative feed-back)

Cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài môi trƣờng của một chất bởi sự gia tăng

nồng độ chất này trong môi trƣờng. Do đó, việc thay mới môi trƣờng sau một thời gian nuôi

cấy nhất định là rất cần thiết, nhằm tránh sự hoạt động của cơ chế kìm hãm ngƣợc này. Trong

phòng thí nghiệm, cơ chế ức chế ngƣợc còn có thể gây tổn thƣơng tế bào, thậm chí làm chết

hàng loạt.

1.4. Tính chất cần giá đỡ

Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào

động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Thông thƣờng tế bào tăng trƣởng

tốt khi sắn vào bề mặt rắn. Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành lớp đơn liên tục trên

bề mặt của dụng cụ nuôi. Tuy vậy, một số dòng tế bào nhƣ tế bào ung thƣ hoặc dòng tế bào

liên tục từ mô bình thƣờng, sau khi đƣợc thuần hóa, có thể sinh trƣởng và phân chia trong

trạng thái lơ lửng, không cần bám vào nền.

1.5. Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

Các tế bào động vật có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình thông qua quá trình dung

hợp 2 tế bào có nhân khác nhau tạo thành tế bào lai (hybridoma). Hoặc quá

trình biến nạp, ví dụ: chủng tế bào bình thƣờng có thể đƣợc cảm ứng thành tế bào có các tính

chất của tế bào ung thƣ thông qua quá trình biến nạp đƣợc thực hiện bởi một virus cảm ứng

ung thƣ hoặc bằng hóa chất.

1.6. Có thể đƣợc bảo quản lâu dài bằng phƣơng pháp lạnh sâu

Các dòng tế bào động vật có thể đƣợc bảo quản lạnh sâu -70°C trong một thời gian vô

định. Khi đƣợc giải đông và hoạt hóa, tế bào phục hồi lại khả năng tăng trƣởng và phân chia

nhƣ ban đầu.

1.7.Các đặc tính khác

Ngoài các đặc tính trên, tế bào động vật còn có các đặc điểm khác nhƣ kém thích nghi

với môi trƣờng, nhạy cảm với ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh,

hormon... để tăng trƣởng và phân chia.

2. Môi trƣờng nuôi cây tế bào động vật

Thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với môi

trƣờng nuôi cây vi sinh vật và tế bào thực vật. Trong các công trình đầu tiên về nuôi cây tế

bào động vật ngƣời ta dùng hỗn hợp dung dịch muôi sinh lý, huyết thanh và chiết phẩm phôi

gà làm môi trƣờng nuôi cấy. Do thành phần huyết thanh và chiết phẩm phôi gà rất rất phức

tạp, khó ổn định nên ngƣời ta dần dần quan tâm đến việc nghiên cứu chế tạo các môi trƣờng

tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh thành phần môi trƣờng và ổn định

môi trƣờng trong những lần nuôi cấy khác nhau.

Hiện nay, trừ những dòng tế bào đã thiết lập đƣợc thuần hóa với môi trƣờng tổng hợp

hoàn toàn, đa số các dòng tế bào đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng tổng hợp có bổ sung 5 -

10% huyết thanh (có dòng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh). Thông thƣờng huyết thanh

bê đƣợc sử dụng phổ biến hơn cả, nhƣng có một số loại tế bào cần phải sử dụng huyết thanh

bào thai bò (Fetal bovine serum: FBS).

Một vài loại môi trƣờng thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô động

vật:

- Môi trường EM (Basal Medium): đây là môi trƣờng cơ bản do H. Eagle thiết lập, khi

dùng phải bổ sung; 5-10% huyết thanh và amino acid, vitamin với chủng loại và số lƣợng tùy

loại tế bào. Thƣờng sử dụng nuôi cây tế bào Hela, tế bào L.

- Môi trường E'MEM (Eagle Minimum Essential Medium): còn gọi là môi trƣờng tối

thiểu, do H.Eagle thiết lập. Đây là môi trƣờng BM có chứa nồng độ cao

hơn các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5-10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào.

- Môi trường D'MEM (Dulbecco - Modified Eagle Medium) là môi trƣờng E'MEM do

Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp 2 lần và một số vitamin cao gấp

4 lần so với môi trƣờng khác để nuôi đƣợc nhiều loại tế bào hơn.

- Môi trường F10, F12: do R.G, Ham thiết lập dùng cho nguyên bào sợi, trong môi

trƣờng này huyết thanh thƣờng đƣợc thay bằng 20μg/ml albumin huyết thanh hoặc bằng 3.10-

7 M acid linoleic.

- Môi trường Iscove: do N.N.Iscove thiết lập trên cơ sở tiếp tục cải biến môi trƣờng

DMEM.

- Môi trường SA: do T.A. Mc.Coy thiết lập, thƣờng đƣợc dùng cho tế bào bệnh bạch

huyết.

- Môi trường RPMI-1640: đƣợc G.E. Moore thiết lập tại viện nghiên cứu Roswell Part

Memorial Institute, đƣợc dùng để nuôi tế bào và mô bạch huyết.

- Môi trường 199: do R,C.Parker thiết lập dùng để nuôi tế bào mô cơ phôi gà trong

sản xuất vaccin phòng bệnh bại liệt.

Trong hầu hết các loại môi trƣờng nuôi cấy tế bào động vật đều có mặt huyết thanh vì

nó có những vai trò quan trọng nhƣ sau:

- Cung cấp chất dinh dƣỡng quan trọng cho tế bào nhƣ các amino acid thiết yếu, tiền

chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lƣợng...

- Cung cấp các nhân tố tăng trƣởng, kích thích cho tế bào tăng trƣởng và phân

chia.

- Kích thích sự phục hồi các tổn thƣơng của tế bào khi cấy chuyền và các protein

trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzym gây tổn thƣơng tế bào.

- Cải thiện tính tan của các chất dinh dƣỡng.

- Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính

của tế bào lên giá đỡ.

- Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của

oxy.

Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật, tuy nhiên huyết thanh làm tăng

giá thành nuôi cấy lên rất nhiều (chiếm 90% giá thành của môi trƣờng nuôi cấy). Ngoài ra

huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasm và khó ổn định chất lƣợng của những lô môi

trƣờng khác nhau cũng nhƣ còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế

bào đặc biệt (do đó cần chọn loại huyết thanh phù hợp không chứa yếu tố ức chế đối với dòng

tế bào nuôi cấy). Vì các lý do đó mà nhiều nhà nghiên cứu đã xây dựng môi trƣờng nuôi cấy

tế bào động vật không dùng huyết thanh hay dùng với lƣợng thấp.

Có 2 phƣơng pháp điều chế môi trƣờng không có huyết thanh là phƣơng pháp của G.

Sato và phƣơng pháp của R.G. Ham. Cả 2 phƣơng pháp này đều thay huyết thanh bằng

những yếu tố khác nhƣ: kích thích tố, nhân tố tăng trƣởng, protein vận chuyển, nhân tố kết

dính và kéo dài, các chất dinh dƣỡng, khoáng ... [3]

PHẦN III: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP

I. VẬT LIỆU 1. Gossypol

Gossypol là một sắc tố vàng loại poliphenol trích từ hột của cây bông Gossypium hirsutum, họ Malvaceae, có nhiệt độ nóng chảy là 1820 C. Hàm lƣợng gossypol trong hạt

bông biến đổi từ 0.1 - 6.64% tùy theo giống.

Trong kỹ nghệ cây bông, gossypol đƣợc xem nhƣ là phế phẩm có độc tính và thƣờng

đƣợc khử từ đầu; hột sau khi loại dầu và khử gossypol thƣờng dùng làm thức ăn gia súc.

Nhƣng hiện nay, sossypol có tầm quan trọng đặc biệt. Vào năm 1950, một bác sĩ

Trung Hoa đã phát hiện có sự gia tăng bất thƣờng các cặp vợ chồng không có con trong vùng

dùng nhiều dầu bông còn chứa gossypol.

Những thí nghiệm trên động vật và sau đó trên con ngƣời cho thấy gossypol có tính

diệt tinh trùng.

Về cấu trúc hóa học gossypol gồm 2 đơn vị naptalen đối xứng mang 3 nhóm chức

phenol và 1 chức aldehid. Công thức nguyên C30H30O8, trọng lƣợng phân tử là 518.54, có nhiệt độ nóng chảy là 1820 C.

Tác dụng sinh học của gossypol:

Năm 1950, ngƣời ta phát hiện tác dụng lên tinh trùng của gossypol. Nhiều thử nghiệm

trên động vật sau đó cho thấy gossypol gây nên:

- Sự giảm bớt tính di động và số lƣợng của tinh trùng cùng với sự xuất hiện nhiều tinh

trùng dị dạng.

- Giảm thiểu sự sinh sản.

- Làm ngƣng trệ testosteron (kích khích tố nam).

Năm 1970, những thử nghiệm lâm sàng đã đƣợc thực hiện trên con ngƣời tại Trung

Quốc cũng cho thây kết quả tƣơng tự. Tuy nhiên, sau khi ngƣng dùng thuốc 3 tháng thì tinh

dịch của ngƣời trở lại bình thƣờng về mặt định tính và định lƣợng.

Ngoài ra gossypol còn có nhiều tác dụng khác nhƣ :

- Gây co rút ở các loài gặm nhấm.

- Kháng khuẩn.

- Tác dụng gây độc cho cơ thể: LD50 heo: 550 mg/Kg, LD50 chuột: 2200 mg/Kg. Hiện

tƣợng ngộ độc gossypol là sự uễ oãi, nôn mửa, tiêu chảy và khó thở dẫn đến chết vì ngạt thở.

[5]

Gossypol đƣợc thử nghiệm trên bệnh nhân bị ung thƣ thận (adrenocortical cancer) di

căn, kết quả là có 15% trƣờng hợp có đáp ứng. Nghiên cứu tác động của gossypol lên tế bào

ung thƣ vú của ngƣời nuôi cấy cho thấy gossypol có thể ức chế sự phân bào và thay đổi sự

biểu hiện của nhiều protein điều hòa chu trình tế bào (cell cycle). Một thử nghiệm trên bệnh

nhân hóa trị liệu chống ung thƣ vú di căn cho thấy gossypol, ở liều lƣợng phù hợp, có tác

động lên những protein điều hòa chu trình tế bào và tác dụng có lợi lên một số bệnh nhân.

[13]

2. Plumbagin

Plumbagin là tinh thể màu vàng cam, hình kim, nhiệt độ nóng chảy 77 -78oC, đƣợc

chiết xuất từ rễ cây bạch hoa xà Plumbago zeylanica, họ Plumbaginaceae.

Công thức phân tử :C11H8O3

Trọng lƣợng phân tử : 188,18

Tính chất hóa học của plumbagin:

- Không tan trong nƣớc.

- Tan tốt trong CHCl3, C6H6, AcOH, (CH3)2CO...

- Cho màu đỏ máu với FeCl3

- Kết tủa xanh lục với Cu(AcO)2 trong alcol.

Tác dụng sinh học của plumbagin:

- Tại Ấn Độ và Châu Phi plumbagin đƣợc sử dụng để trị các bệnh đƣờng tiêu hóa,

phong ghẻ.

- Plumbagin có tác dụng diệt khuẩn, nấm.

Plumbagin đƣợc sử dụng làm chất bảo quản đối với thức ăn và hoa quả.

- Plumbagin có tác dụng mạnh với nhiều loài vi khuẩn Gram (+) , vi khuẩn Gram (-),

nấm, vi khuẩn kháng acid. Ví dụ nhƣ: Staphylococcus aureus, Mycobacterium tubercuosis,

Escherichia coli. [4]

- Một số tài liệu cho thấy plumbagin có hoạt tính kháng ung thƣ. [11,12]

3. Các dòng tế bào ung thƣ 3.1. Dòng tế bào RD (Rhabdomyosarcoma)

Ký hiệu: ATCC CCL 136 RD (từ Catalogue of American Type Culture Collection,

ATCC).

Dòng tế bào RD đƣợc thiết lập bởi R.M. McAllister từ khối u cơ ở vùng chậu của một

bé gái 7 tuổi ngƣời Cap-ca (Caucasian) vào tháng 2 năm 1968. Các tế bào mọc thành những

lớp đơn trong môi trƣờng lỏng và tạo thành cụm tế bào (coloni) trên môi trƣờng E'MEM

Agar (Eagle'Minimum Essential Medium) bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (Fetal

Bovine Serum). Tế bào nuôi cấy có 2 dạng, dạng tế bào gần giống tế bào mô ung thƣ ban

đầu, và dạng tế bào trãi rộng có nhiều nhân. Tế bào có myoglobin và hoạt tính myosin-

ATPase. Dòng tế bào RD là dòng tế bào ung thƣ cơ đầu tiên của ngƣời đƣợc xác định đặc

tính và nghiên cứu chi tiết.

3.2. Dòng tế bào HEp2 (Epidermoid carcinoma)

Ký hiệu: ATCC CCL HEp2 (từ Catalogue of American Type Culture Collection,

ATCC).

Dòng tế bào HEp2 đã đƣợc thiết lập bởi A.E. Moore, L. Sabachewsky, và H.W.

Toolan vào năm 1952, từ những khối u tạo ra ở chuột vừa dứt sữa sau khi đựơc tiêm mô ung

thu biểu bì thanh quản của 1 ngƣời đàn ông ngƣời Cap-ca (Caucasian) 56 tuổi. Việc phân lập

in vitro đã đƣợc thực hiện ở nhiều phức hợp của nƣớc ối thai bò, dịch chiết phôi, huyết thanh

ngƣời và ngựa, và dung dịch muối cân bằng, những

tế bào giống biểu mô này phát triển tốt trong nhiều dạng môi trƣờng nuôi cấy. Đây là một

dòng tế bào khỏe mạnh có thể chống lại nhiệt độ, thiếu hụt dinh dƣỡng, và những thay đổi

môi trƣờng mà không mất khả năng sống.

II. PHƢƠNG PHÁP

1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào:

Tế bào đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng E'MEM (Eagle ' Minimum Essential Medium)

có thành phần nhƣ sau:

Bột E'MEM 4.72g

L-Glutamine 200mM 5 ml

7.5 ml NaHCO3 7.5%

HEPES 1M 10 ml

Amphotericin B 0.1% 125 μl

Penicillin 50.000 UI

Streptomycin 50 mg

Phenol đỏ 0.4% 1 ml

Huyết thanh

(Fetal bovine serum) 50 ml

Nƣớc cất đủ 500 ml

pH 7.2

Điều kiện nuôi cây: 37.5o C, 5% CO2.

2. Phƣơng pháp đếm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay):

Sau một thời gian nuôi cây trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào đƣợc tách

rời bằng dung dịch trypsin/EDTA và đƣợc cấy vào các giếng của đĩa 24 giếng; mỗi giếng

gồm 100μl dịch huyền phù tế bào (khoảng 100.000 tế bào) và 400μl môi trƣờng.

Tế bào đƣợc ủ ở 37.5°C trong 24 giờ. Sau đó môi trƣờng cũ đƣợc thay bằng môi

trƣờng chứa gossypol ở nồng độ 0.1μg/ml - 20μg/ml với cả 2 dòng tế bào hoặc

plumbagin ở nồng độ 0.1μg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1μg/ml -10μg/ml đôi

với dòng tế bào HEp2. Lô đối chứng đƣợc xử lý với môi trƣờng chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO. Các lô đƣợc ủ 72 giờ ở 37.50 C.

Sau thời gian ủ, tách rời tế bào trong mỗi giếng bằng dung dịch trypsin/EDTA, hòa tế

bào vào 500 μg/ml môi trƣờng và nhuộm bằng trypan blue 0,4% theo tỷ lệ 1:1 (dịch huyền

phù tế bào: thuốc nhuộm), Số lƣợng tế bào sống (tế bào không bắt màu xanh) đƣợc xác định

bằng buồng đếm hồng cầu. Khả năng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thƣ của hoạt

chất đƣợc tính theo công thức:

Tỷ lệ ức chế (%) = 100% Mật độ tế bào đối chứng - Mật độ tế bào thí nghiệm Mật độ tế bào đối chứng

[6]

3. Phƣơng pháp MTT (MTT assay):

Phƣơng pháp MTT dựa trên sự chuyển chất MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5

diphenyl tetrazolium bromide) thành MTT-formazan có màu xanh tím bởi enzyme hô hấp ở ti

thể của tế bào. Số lƣợng tế bào sống tỉ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị mật

độ quang OD570 của dung dịch.

Sau một thời gian nuôi cấy trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào đƣợc tách

rời bằng dung dịch trypsin/EDTA và đƣợc cấy vào các giếng của đĩa 96 giếng; mỗi giếng

gồm 100μl dịch huyền phù tế bào (khoảng 10.000 tế bào).

Tế bào đƣợc ủ ở 37.50 C trong 24 giờ. Sau đó môi trƣờng cũ đƣợc thay bằng môi

trƣờng chứa gossypol ở nồng độ 0.1μg/ml - 20μg/ml với cả 2 dòng tế bào hoặc plumbagin ở

nồng độ 0.1μg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1μg/ml -10μg/ml đối với dòng tế bào

HEp2. Lô đối chứng đƣợc xử lý với môi trƣờng chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO. Các lô đƣợc ủ 72 giờ ở 37.50 C.

Sau thời gian ủ, môi trƣờng xử lý đƣợc thay bằng môi trƣờng chứa 0.5 mg/ml MTT. Sau 4 giờ ở 37.50 C môi trƣờng chứa MTT đƣợc thay bằng hỗn hợp isopropanol-HCl

(0.04M). Đo OD570 của các lô thí nghiêm và đối chứng. Khả năng ức chế sự phát triển các

dòng tế bào ung thƣ của hoạt chất đƣợc tính theo công thức: [7,8,9,10]

Tỷ lệ ức chế (%) = 100% OD570đối chứng - OD570thí nghiệm OD570đối chứng

4. Phƣơng pháp clonogenic (clonogenic assay):

Phƣơng pháp clonogenic dùng để xác định tỷ lệ tế bào ung thƣ bị ức chế phân bào

dƣới tác động của hoạt chất.

5000 tế bào RD, hoặc 500 tế bào HEp2, đƣợc cây vào mỗi giếng của đĩa 24 giếng. Tế bào đƣợc ủ ở 37.50 C trong 24 giờ. Sau đó môi trƣờng cũ đƣợc thay bằng môi

trƣờng chứa gossypol ở nồng độ 0.1μg/ml - 20μg/ml với cả 2 dòng tế bào hoặc plumbagin ở

nồng độ 0.1μg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1μg/ml -10μg/ml đối với dòng tế bào

HEp2. Lô đối chứng đƣợc xử lý với môi trƣờng chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO. Các lô đƣợc ủ 72 giờ ở 37.50 C.

Sau thời gian ủ, số cụm (colony) tế bào hình thành trong mỗi giếng đƣợc đếm dƣới

kính hiển vi. Khả năng ức chế phân bào của hoạt chất đƣợc tính theo công thức:

Tỷ lệ ức chế (%) = × 100% Số colony đối chứng - Số colony thí nghiệm Số colony đối chứng

[9,10]

5. Phƣơng pháp xử lý thống kê

Số liệu thu đƣợc từ các thí nghiệm đƣợc xử lý thông kê bằng phần mềm MSTATC

của Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ.

PHẦN IV: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

I. TÁC ĐỘNG CỦA GOSSYPOL LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2

Bảng 1: Tác động của gossypol lên dòng tế bào RD

Nồng độ Tỷ lệ ức chế phân bào (%)

(μg/ml)

0.1

10 20 Trypan blue 18.72 ± 12.18 C 28.68 ± 23.76 C 72.89 ± 11.98 B 86.56 ± 10.51 AB 99.77 +0.68 A MTT 4.56 ±10.52 C 3.52 ±5.06 C 71.47 ± 16.86 B 78.68 ± 19.17 B 97.20 ± 2.7 A Clonogenic 21.98 ± 23.1 B 24.78 ±23.67B 95.72 ± 1.93 A 100 ± 0.0 A 100 ±0.0 A

LSD ∞=0.01 17.73 13.74 18.89

Biểu đồ 1: Tác dộng của gossypol lên RD

)

% ( ế h c c ứ ệ l

ỷ T

Nồng độ gossypol (ug/ml)

Kết quả ở bảng 1 và biểu đồ 1 cho thấy gossypol có tác động lên sự phát triển của tế

bào RD.

Ở nồng độ trên 20 μg/ml, gossypol giết chết hoàn toàn tế bào RD (không còn tế bào

sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue,

MTT và clonogenic.

Ở nồng độ 10-5μg/ml, gossypol ức chế khả năng phân bào của tế bào RD thể hiện qua

tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic gần nhƣ 100%, hay gần nhƣ không có

colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả

các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ gossypol này. Tuy nhiên, kết quả ở 2

thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào RD thấp hơn 100% (khoảng

70-80%), nhƣ vậy chứng tỏ các tế bào RD vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ gossypol 5-10

μg/ml.

Ở nồng độ thấp hơn 5μg/ml (1, 0.1μg/ml), gossypol cũng làm giảm số tế bào RD có

khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic

Bảng 2: Tác động của gossypol lên hai dòng tế bào HEp2 là khoảng trên 20%.

Tỷ lệ ức chế phân bào (%) Nồng độ (μg/ml)

0.1

20 Trypan blue 0.00 ± 18.51 D 16.83 ± 11.41 C 63.30 ± 23.83 B 88.90 ± 5.35 A 98.70 ±3.11 A MTT 0.00 ±4.88 C 0.00 ±6.81 C 72.14 ± 13.48 B 72.14 ± 10.02 B 89.10 ±8.62 A Clonogenic 10.85 ± 16.48 B 21.23 ±26.00 84.65 ±11.5 A 100 ±0.0 A 100 ±0.0 A

LSD ∞=0.01 18.65 10.06 18.73

Biểu đồ 2: Tác động của gosypol lên HEp2

)

% ( ế h c c ứ ệ l

ỷ T

Nồng độ gossypol (ug/ml)

Bảng 2 và biểu đồ 2 cho thấy tác động của gossypol lên tế bào HEp2.

Ở nồng độ trên 20 μg/ml, gossypol giết chết hoàn toàn tế bào HEp2 (không còn tế bào

sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue,

MTT và clonogenic.

Ở nồng độ 10 μg/ml, gossypol ức chế khả năng phân bào của tế bào HEp2 thể hiện

qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay gần nhƣ không có

colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả các tế bào đều không có khả

năng phân chia ở nồng độ gossypol này. Tuy nhiên, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và

MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn 100% (khoảng 70-80%), nhƣ vậy chứng

tỏ các tế bào HEp2 vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ gossypol 10 μg/ml.

Ở nồng độ 5μg/ml, gossypol cũng làm giảm số tế bào HEp2 có khả năng phân chia,

thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là khoảng 80 - 20%.

Ở nồng độ 0.1μg/ml, gossypol không có tác động đáng kể lên tế bào HEp2.

II. TÁC ĐỘNG CỦA PLUMBAGIN LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2

Bảng 3: Tác động của plumbagin lên dòng tế bào RD

Tỷ lệ ức chế phân bào (%) Nồng độ (μg/ml)

0.1

0.5

1.5

Trypan blue 57.96 ± 12.06 C 92.07 ±1.57 B 99.73 ±0.82 A 98.56 ±3.23 AB 100 ±0.0 A MTT 17.69 ± 21.27 C 71.46 ± 10.12 B 90.75 ±3.3 B 91.45 ± 2.11 A 95.26 ±3.03 A Clonogenic 71.19 ± 8.41 B 100 ±0.0 A 100 ±0.0 A 100 ±0.0 A 100 ±0.0 A 2

7.197 11.73 4.789 LSD α=0.01

Biểu đồ 3: Tác động của plumbagin lên RD

)

% ( ế h c c ứ ệ l

ỷ T

Nồng độ plumbagin (ug/ml)

Bảng 3 và biểu đồ 3 cho thấy tác động của plumbagin lên sự phát triển của tế bào RD.

Ở nồng độ từ 1 μg/ml trở lên, plumbagin giết chết gần nhƣ hoàn toàn tế bào RD

(không còn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử

nghiệm trypan blue, MTT và clonogenic.

Ở nồng độ 0.5 μg/ml, plumbagin ức chế khả năng phân bào của tế bào RD thể hiện

qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay gần nhƣ không có

colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả các tế bào đều không có khả

năng phân chia ở nồng độ plumbagin này, Tuy nhiên, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và

MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn 100% (khoảng 80-90%), nhƣ vậy chứng

tỏ một phần tế bào RD vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ plumbagin 0.5 μg/ml.

Ở nồng độ 0.1μg/ml, plumbagin vẫn có khả năng ức chế mạnh sự phân chia của tế bào

RD, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là hơn 70%.

Bảng 4: Tác động của plumbagin lên dòng tế bào HEp 2

Tỷ lệ ức chế phân bào (%) Nồng độ (μg/ml)

0.1

0.5

5 10

LSD α=0.01 Trypan blue 14.29 ± 14.14 C 23.59 ± 13.42 C 56.41 ±8.23 B 99.10 ±0.98 A 100 ±0.0 A 12.08 MTT 4.36 ±14.55 D 17.81 ± 19.49 C 65.07 ±9.64 B 85.38 ±6.34 A 94.59 ±3.94 A 12.53 Clonogenic 49.16 ±7.67 B 99.91 ±0.19 A 99.85 ±0.22 A 99.82 ±0.21 A 100 ±0.0 A 4.38

Biểu đồ 4: Tác động của plumbagin lên HEp2

)

% ( ế h c c ứ ệ l

ỷ T

Nồng độ plumbagin (ug/ml)

Bảng 4 và biểu đồ 4 cho thấy tác động của plumbagin lên sự phát triển của tế bào

HEp2.

Ở nồng độ trên 5 μg/ml, plumbagin giết chết hoàn toàn tế bào HEp2 (không còn tế

bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue, MTT và clonogenic.

Ở nồng độ trong khoảng 1-0.5 μg/ml, plumbagin ức chế khả năng phân bào của tế bào

HEp2 thể hiện qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay gần

nhƣ không có colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ

vậy tất cả các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ plumbagin này. Tuy nhiên,

kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn

100% (khoảng 20-60%), nhƣ vậy chứng tỏ các tế bào HEp2 vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ

gossypol 1 - 0.5 μg/ml.

Ở nồng độ 0. l μg/ml, plumbagin cũng làm giảm số tế bào HEp2 có khả năng phân

chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là khoảng 50%.

Nhƣ vậy:

Ở cả hai hoạt chất, chúng tôi đều tìm thấy một nồng độ mà ở đó tác động ức chế phân

bào rất mạnh. gần tƣơng; đƣơng với những nồng độ cao gấp 2, 3 lần nhƣng tính sây độc

(không làm chết tế bào) lại thấp hơn. Nồng độ đó là 5 μg/ml đối với gossypol và 0.5 μg/ml

đối với plumbagin trên cả hai dòng tế bào thử nghiệm. Điều này thể hiện rõ nhất trên tế bào

dòng HEp2 khi xử lý với plumbagin (biểu đồ 4).

Các kết quả thu nhận từ cả ba phƣơng pháp thử nghiệm đều phù hợp với nhau.

Phƣơng pháp nhuộm với trypan blue và MTT cho phép đánh giá tỉ lệ sống của tế bào sau khi

xử lý với hoạt chất còn khả năng phân bào thì đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp clonogenic.

Việc sử dụng phối hợp cả ba phƣơng pháp cho phép khẳng định kết quả, đồng thời đánh giá

một cách tƣơng đối toàn diện tác động của hoạt chất lên dòng tế bào ung thƣ.

PHẦN V: KẾT LUẬN

1. Gossypol và plumbagin đều có tác động lên sự phát triển của 2 dòng tế bào ung thƣ

RD và HEp2 ở điều kiện khảo sát. Tùy theo nồng độ tác động, gossypol và plumbagin có thể

giết chết hoàn toàn, ức chế phân bào hoàn toàn hay ức chế phân bào một phần tế bào ung thƣ.

2. Plumbagin có tính kháng phân bào mạnh hơn gossypol trên 2 dòng tế bào khảo sát.

Nồng độ plumbagin giết chết 100% tế bào RD là 2 μg/ml, HEp2 là 5 μg/ml trong khi với

gossypol nồng độ phải là 20 μg/ml.

3. Tế bào HEp2 ít nhạy cảm với hoạt chất hơn so với tế bào RD. Điều này cũng phù

hợp với đặc tính của tế bào HEp2 (phần HI, mục I)

4. Ba phƣơng pháp thử nghiệm sử dụng trong bài này cho phép đánh giá chính xác

các mức độ tác động của hoạt chất lên sự phát triển của tế bào.

Chúng tôi chân thành cảm ơn:

1. Phòng thí nghiệm Virus đƣờng ruột - Viện Pasteur TP.HCM đã cung cấp 2 dòng tế

bào ung thƣ và hổ trợ chúng tôi về kỹ thuật nuôi cây tế bào.

2. Tiến sỹ Nguyễn Kim Phi Phụng và cộng sự - Khoa Hóa học - ĐH Khoa học Tự

nhiên TP.HCM đã cung cấp cho chúng tôi các hoạt chất sử dụng trong đề tài.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Bá Đức, Bộ môn Ung thƣ - Đại học Y Hà Nội. Bài giảng Ung thƣ học. Nhà

xuất bản Y học, 2001.

2. Đỗ Trung Đàm. Thuốc chữa ung thƣ. Nhà xuất bản Y học, 1995.

3. Phan Kim Ngọc, Nguyễn Đăng Quân, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Nguyễn Kim Thiên

Nga, Đỗ Minh Sĩ, Trần Nguyễn Bích Châu. Giáo trình thực tập Công nghệ Sinh học Động vật

cơ sở. Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên.

4. Võ Hƣng Sơn. 1995. Cô lập plumbagin từ rễ cây bạch hoa xà Plumbago zeylanica

Linn, họ Plumbaginaceae. Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hoá học ĐH. Khoa học Tự nhiên

TP.HCM.

5. Trần Đệ Thăng. 1995. Khảo sát chất gossypol cô lập từ hột cây bông Gossypium

hirsutum, họ Malvaceae. Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hoá học ĐH. Khoa học Tự nhiên

TP.HCM.

6. World Health Organization. 1997. Manual for the virological investigation

of polio, Global programme for vaccines and immunization. 35-37.

7. Xin Lin, Wen Kui Li, Pei gen Xiao. 1999. Effects of Icariside II from Epimedium

koreanum on tumour cell lines in vitro. - Pharm. Pharmacol. Commun. 5:701-703.

8. K.V.Anis, G.Kuttan, R.Kuttan .1999. Role of Berberine as an adjuvant response

modifier during tumour therapy in mice. Pharm. Pharmacol. Commun. 5:697 - 700.

9. Keyong Ho Lee, Hee Sun Hong, Chi Ho Lee, Chang Han Kim. 2000. Induction of

apoptosis in human leukaemic cell lines K562, HL 60 and U 937 by Diethylhexylphthalate

isolated from Aloe vera Linne. J. Pharm.Pharmacol. 52: 1037- 1041.

10. Ana. M. Pintao, M. Salome S. Pais, Helen Coley, Lloyd R. Kelland, Ian R.

Judson. 1995. In vitro and in vivo antitumor activity of Benzyl Isothiocyanate: A natural

product from Tropaeolum majus. Planta Med. 61: 233-236.

11. Uma Devi, F.E. Solomon, A.C. Sharada. 1999. Plumbagin, a plant naphthoquinon

with antitumor and radiomodifying properties. Pharmaceutical biology. 3:231-236.

12. V. Elangovan, Nalini Ramamoorthy, S. Balasubramanian, N. Sekar, S.

Govindasamy - Studies on the antiproliferative effect of some naturally occurring

bioflavonoidal compounds against human carcinoma of larynx and sarcoma - 180

cell lines. - Indian Journal of Pharmacology 1994; 26: 266-269.

13. Clinical pharmacology and pharmacology of gossypol.

http://www.med.cornell.edu/gradschool/fac/reidenberg.html

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH. KHOA SINH HỌC BÁO CÁO TÓM TẮT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ NĂM 2000-2001

ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN MÃ SỐ: CS 2000-15

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI T.S Dƣơng Thị Bạch Tuyết

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11 năm 2002

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH. KHOA SINH HỌC BÁO CÁO TÓM TẮT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ NĂM 2000-2001

ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN MÃ SỐ: CS 2000-15

Nhóm thực hiện: Dƣơng Thị Bạch Tuyết(1) Nguyễn Đăng Quân (2) Phan Kim Ngọc(2) Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng(2)

(1) Khoa Sinh học - Đại học Sƣ Phạm Tp. Hồ Chí Minh (2) Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11 năm 2002

Ung thƣ là một trong những bệnh phổ biến và có tỷ lệ gây tử vong cao nên việc

nghiên cứu các phƣơng pháp điều trị bệnh ung thƣ đang rất đƣợc chú trọng trên thế giới. Một

trong những hƣớng nghiên cứu đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm hiện nay là những hoạt

chất thiên nhiên, đặc biệt là từ thực vật, có hoạt tính kháng ung thƣ.

Việt Nam là một nƣớc nhiệt đới với nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú, trong đó

có nhiều cây thuốc chứa các hoạt chất kháng ung thƣ mạnh có thể ứng dụng vào điều trị. Vì

vậy, việc phát triển những phƣơng pháp thử nghiệm nhằm xác định hoạt chất kháng ung thƣ

là cần thiết. Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành xây dựng các phƣơng pháp khảo sát hoạt

tính kháng phân bào của 2 hoạt chất gossypol và plumbagin có nguồn gốc từ cây thuốc dân

gian đƣợc biết là có khả năng kháng ung thƣ [11,13] trên hai dòng tế bào ung thƣ của ngƣời

trong điều kiện in vitro.

I. VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP:

1. Hoạt chất:

a. Gossypol:

Gossypol là một sắc tố vàng loại polyphenol có độc tính, đƣợc chiết xuất từ hạt cây

bông Gossypium hirsutum, họ Malvaceae, có nhiệt độ nóng chảy là 182°C. [5]

Công thức hóa học:

b. Plumbagin:

Plumbagin là tinh thể màu vàng cam, hình kim, nhiệt độ nóng chảy 77 - 78°C, đƣợc

chiết xuất từ rễ cây bạch hoa xà Plumbago zeylanica, họ Plumbaginaceae.[4] Công thức hóa

học:

Gossypol và plumbagin sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc TS. Nguyễn Kim Phi

Phụng và cộng sự, bộ môn Hoá hữu cơ, khoa Hóa, ĐH.Khoa học Tự nhiên TP.HCM cung

cấp.

2. Các dòng tế bào và điều kiện nuôi cấy:

Chúng tôi sử dụng hai dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời: dòng tế bào ung thƣ cơ RD

(Rhabdomyosarcoma) và dòng tế bào ung thƣ biểu bì HEp2 (Epidermoid carcinoma). Hai

dòng tế bào này đƣợc cung cấp bởi Viện Pasteur TP.HCM.

Tế bào đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng EMEM có chứa glutamine, penicillin,

streptomycine, HEPES, NaHCO3, phenol red, pH 7.2, bổ sung 10% huyết thanh phôi bò (FBS: Foetal Bovine Serum). Ủ ở 37,50 C

3. Phƣơng pháp nhuộm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay)

Sau một thời gian nuôi cấy, tế bào đƣợc tách bằng trypsin/EDTA và đƣợc cấy vào

plate 24 giếng; mỗi giếng gồm 100μl dịch huyền phù tế bào và 400μl môi trƣờng.

Tế bào đƣợc ủ ở 37,50C trong 24 giờ. Sau đó môi trƣờng cũ đƣợc thay bằng môi

trƣờng chứa gossypol với nồng độ 0,lμg/ml - 20μg/ml hoặc plumbagin với nồng độ 0,lμg/ml -

2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0,1μg/ml - 10μg/ml đối với dòng tế bào HEp2. Lô đối

chứng đƣợc xử lý với môi trƣờng chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO. Các lô đƣợc ủ 72 giờ ở 37,50C.

Tế bào đƣợc tách bằng trypsin/EDTA, đƣợc hòa vào 500 μl môi trƣờng và nhuộm

bằng trypan blue 0,4% theo tỷ lệ 1:1. Số lƣợng tế bào sống (tế bào không bắt màu) đƣợc xác

định bằng buồng đếm hồng cầu. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần. Khả năng ức chế sự phát

triển các dòng tế bào ung thƣ của hoạt chất đƣợc tính theo công thức:

Tỷ lệ ức chế (%) = 100 % Mật độ tế bào đối chứng - Mật độ tế bào thí nghiệm Mật độ tế bào đối chứng

[6]

4. Phƣơng pháp MTT (MTT assay):

Phƣơng pháp MTT dựa trên sự chuyển chất MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5

diphenyl tetrazolium bromide) thành MTT-formazan có màu xanh tím bởi enzyme hô hấp ở ti

thể của tế bào. Số lƣợng tế bào sống tỉ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị mật

độ quang (OD570 ) của dung dịch.

Tế bào đƣợc cấy vào plate 96 giếng. Các lô thí nghiệm và đối chứng đƣợc xử lý với

hoạt chất tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp trên.

Sau 72 giờ ở 37,50C, môi trƣờng xử lý đƣợc thay bằng môi trƣờng chứa 0,5 mg/ml MTT. Sau 4 giờ ở 37,50C môi trƣờng chứa MTT đƣợc thay bằng hỗn hợp isopropanol-HCl

(0,04M). Đo OD570 của các lô thí nghiệm và đối chứng. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần.

Khả năng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thƣ của hoạt chất đƣợc tính theo công

thức:

Tỷ lệ ức chế (%) = 100 % OD570đối chứng - OD570thí nghiệm OD570đối chứng

[7,8,9,10]

5. Phƣơng pháp clonogenic (clonegenic assay):

Phƣơng pháp clonogenic dùng để xác định tỷ lệ tế bào ung thƣ bị ức chế phân bào

dƣới tác động của hoạt chất.

5000 tế bào RD, hoặc 500 tế bào HEp2, đƣợc cấy vào mỗi giếng của plate 24 giếng.

Các lô thí nghiệm và đối chứng đƣợc xử lý với hoạt chất tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp

trên.

Sau 72 giờ ủ ở 37,50C, số cụm (colony) tế bào hình thành trong mỗi giếng đƣợc đếm

dƣới kính hiển vi. Khả năng ức chế phân bào của hoạt chất đƣợc tính theo công thức :

Tỷ lệ ức chế (%) = 100 % Số colony đối chứng - Số colony thí nghiệm Số colony đối chứng

[9,10]

6. Phƣơng pháp xử lý thống kê

Số liệu thu đƣợc từ các thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm MSTATC

của Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ.

II. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

1. Tác động của gossypol lên tế bào RD và HEp2

Bảng 1: Tác động của gossypol lên dòng tế bào RD

Tỷ lệ ức chế phân bào (%) Nồng độ

(μg/ml)

0.1

10 20

LSD ∞=0.01 Trypan blue 18.72 ± 12.18 C 28.68 ± 23.76 C 72.89 ± 11.98 B 86.56 ± 10.51 AB 99.77 ±0.68 A 17.73 MTT 4.56 ± 10.52 C 3.52 ± 5.06 C 71.47 ± 16.86 B 78.68 ± 19.17 B 97.20 ± 2.7 A 13.74 Clonogenic 21.98 ±23.1 B 24.78 ± 23.67 B 95.72 ± 1.93 A 100 ± 0.0 A 100 ± 0.0 A 18.89

Biểu đồ 1: Tác dộng của gossypol lên RD

)

% ( ế h c c ứ ệ l

ỷ T

Nồng độ gossypol (ug/ml)

Kết quả ở bảng 1 và biểu đồ 1 cho thấy gossypol có tác động lên sự phát triển của tế

bào RD.

Ở nồng độ trên 20 μg/ml, gossypol giết chết hoàn toàn tế bào RD (không còn tế bào

sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue,

MTT và clonogenic.

Ở nồng độ 10-5 μg/ml, gossypol ức chế khả năng phân bào của tế bào RD thể hiện

qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic gần nhƣ 100%, hay gần nhƣ không

có colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả các tế bào đều không có khả

năng phân chia ở nồng độ gossypol này. Tuy nhiên,

kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào RD thấp hơn

100% (khoảng 70-80%), nhƣ vậy chứng tỏ các tế bào RD vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ

gossypol 5-10 μg/ml.

Ở nồng độ thấp hơn 5μg/ml (1, 0.1μg/ml), gossypol cũng làm giảm số tế bào RD có

khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là khoảng

trên 20%.

Bảng 2: Tác động của gossypol lên hai dòng tế bào HEp2

Tỷ lệ ức chế phân bào (%) Nồng độ (μg/ml)

0.1

20 Trypan blue 0.00 ± 18.51 D 16.83 ±11.41 C 63.30 ±23.83 B 88.90 ± 5.35 A 98.70±3.11 A MTT 0.00 ± 4.88 C 0.00 ± 6.81 C 72.14+ 13.48 B 72.14 ± 10.02 B 89.10 + 8.62 A Clonogenic 10.85 ± 16.48 B 21.23 ±26.00 B 84.65 ±11.5 A 100 ± 0.0 A 100 ± 0.0 A

LSD ∞ = 0.01 18.65 10.06 18.73

Biểu đồ 2: Tác động của gosypol lên HEp2

)

% ( ế h c c ứ ệ l

ỷ T

Nồng độ gossypol (ug/ml)

Bảng 2 và biểu đồ 2 cho thấy tác động của gossypol lên tế bào HEp2.

Ở nồng độ trên 20 μg/ml, gossypol giết chết hoàn toàn tế bào HEp2 (không còn tế bào

sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue,

MTT và clonogenic.

Ở nồng độ 10 μg/ml, gossypol ức chế khả năng phân bào của tế bào HEp2 thể hiện

qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay gần nhƣ không có

colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả các tế bào đều không có khả

năng phân chia ở nồng độ gossypol này. Tuy nhiên, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và

MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn 100% (khoảng 70-80%), nhƣ vậy chứng

tỏ các tế bào HEp2 vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ gossypol 10 μg/ml.

Ở nồng độ 5-lμg/ml, gossypol cũng làm giảm số tế bào HEp2 có khả năng phân chia,

thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là khoảng 80 - 20%.

Ở nồng độ 0.1μg/ml, gossypol không có tác động đáng kể lên tế bào HEp2.

2. Tác động của plumbagin lên tế bào RD và HEp2

Bảng 3: Tác động của plumbagin lên dòng tế bào RD

Tỷ lệ ức chế phân bào (%) Nồng độ

(μg/ml)

0.1

0.5

1.5 2

Trypan blue 57.96 ± 12.06 C 92.07 ±1.57 B 99.73 ±0.82 A 98.56±3.23AB 100 ± 0.0 A 7.197 MTT 17.69 ± 21.27 C 71.46 ± 10.12 B 90.75 ± 3.3 B 91.45 ±2.11 A 95.26 ±3.03 A 11.73 Clonogenic 71.19 ±8.41 B 100 ± 0.0 A 100 ± 0.0 A 100 ± 0.0 A 100 ±0.0 A 4.789 LSD α=0.01

Biểu đồ 3: Tác động của plumbagin lên RD

)

% ( ế h c c ứ ệ l

ỷ T

Nồng độ plumbagin (ug/ml)

Bảng 3 và biểu đồ 3 cho thấy tác động của plumbagin lên sự phát triển của tế bào RD.

Ở nồng độ từ lμg/ml trở lên, plumbagin giết chết gần nhƣ hoàn toàn tế bào RD (không

còn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm

trypan blue, MTT và clonogenic.

Ở nồng độ 0.5 μg/ml, plumbagin ức chế khả năng phân bào của tế bào RD thể hiện

qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay gần nhƣ không có

colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả các tế bào đều không có khả

năng phân chia ở nồng độ plumbagin này. Tuy nhiên, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và

MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn 100% (khoảng 80-90%), nhƣ vậy chứng

tỏ một phần tế bào RD vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ plumbagin 0.5 μg/ml.

Ở nồng độ 0.1μg/ml, plumbagin vẫn có khả năng ức chế mạnh sự phân chia của tế bào

RD, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là hơn 70%.

Bảng 4: Tác động của plumbagin lên dòng tế bào HEp 2

Nồng độ Tỷ lệ ức chế phân bào (%)

(μg/ml)

0.1

0.5 1

LSD α = 0.01 Trypan blue 14.29 ± 14.14 C 23.59 ± 13.42 C 56.41 ±8.23 B 99.10 ±0.98 A 100 ±0.0 A 12.08 MTT 4.36 ±14.55 D 17.81 ± 19.49 C 65.07 ±9.64 B 85.38 ±6.34 A 94.59 ±3.94 A 12.53 Clonogenic 49.16 ±7.67 B 99.91 ±0.19 A 99.85 ± 0.22 A 99.82 ±0.21 A 100 ± 0.0 A 4.38

Biểu đồ 4: Tác động của plumbagin lên HEp2

)

% ( ế h c c ứ ệ l

ỷ T

Nồng độ plumbagin (ug/ml)

Bảng 4 và biểu đồ 4 cho thấy tác động của plumbagin lên sự phát triển của tế bào

HEp2.

Ở nồng độ trên 5 μg/ml, plumbagin giết chết hoàn toàn tế bào HEp2 (không còn tế

bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue,

MTT và clonogenic.

Ở nồng độ trong khoảng 1-0.5 μg/ml, plumbagin ức chế khả năng phân bào của tế bào

HEp2 thể hiện qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay gần

nhƣ không có colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ

vậy tất cả các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ plumbagin này. Tuy nhiên,

kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn

100% (khoảng 20-60%), nhƣ vậy chứng tỏ các tế bào HEp2 vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ

gossypol 1 - 0.5 μg/ml.

Ở nồng độ O.lμg/ml, plumbagin cũng làm giảm số tế bào HEp2 có khả năng phân

chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là khoảng 50%.

Nhƣ vậy:

Ở cả hai hoạt chất, chúng tôi đều tìm thấy một nồng độ mà ở đó tác động ức chế phân

bào rất mạnh, gần tƣơng đƣơng với những nồng độ cao gấp 2, 3 lần nhƣng tính gây độc

(không làm chết tế bào) lại thấp hơn. Nồng độ đó là 5 μg/ml đối với gossypol và 0.5 μg/ml

đối với plumbagin trên cả hai dòng tế bào thử nghiệm. Điều này thể hiện rõ nhất trên tế bào

dòng HEp2 khi xử lý với plumbagin (biểu đồ 4).

Các kết quả thu nhận từ cả ba phƣơng pháp thử nghiệm đều phù hợp với nhau.

Phƣơng pháp nhuộm với trypan blue và MTT cho phép đánh giá tỉ lệ sống của tế bào sau khi

xử lý với hoạt chất, còn khả năng phân bào thì đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp clonogenic.

Việc sử dụng phối hợp cả ba phƣơng pháp cho phép khẳng định kết quả, đồng thời đánh giá

một cách tƣơng đối toàn diện tác động của hoạt chất lên dòng tế bào ung thƣ.

III. KẾT LUẬN

1. Gossypol và plumbagin đều có tác động lên sự phát triển của 2 dòng tế bào ung thƣ

RD và HEp2 ở điều kiện khảo sát. Tùy theo nồng độ tác động, gossypol và plumbagin có thể

giết chết hoàn toàn, ức chế phân bào hoàn toàn hay ức chế phân bào một phần tế bào ung thƣ.

2. Plumbagin có tính kháng phân bào mạnh hơn gossypol trên 2 dòng tế bào khảo sát.

Nồng độ plumbagin giết chết 100% tế bào RD là 2μg/ml, HEp2 là 5μg/ml trong khi với

gossypol nồng độ phải là 20 μg/ml.

3. Tế bào HEp2 ít nhạy cảm với hoạt chất hơn so với tế bào RD. Điều này cũng phù

hợp với đặc tính của tế bào HEp2 (phần III, mục I)

4. Ba phƣơng pháp thử nghiệm sử dụng trong bài này cho phép đánh giá chính xác

các mức độ tác động của hoạt chất lên sự phát triển của tế bào.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Bá Đức, Bộ môn Ung thƣ - Đại học Y Hà Nội. Bài giảng Ung thƣ học. Nhà xuất

bản Y học, 2001.

2. Đỗ Trung Đàm. Thuốc chữa ung thƣ. Nhà xuất bản Y học, 1995.

3. Phan Kim Ngọc, Nguyễn Đăng Quân, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Nguyễn Kim Thiên Nga, Đỗ

Minh Sĩ, Trần Nguyễn Bích Châu. Giáo trình thực tập Công nghệ Sinh học Động vật

cơ sở. Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên.

4. Võ Hƣng Sơn. 1995. Cô lập plumbagin từ rễ cây bạch hoa xà Plumbago zeylanica Linn,

họ Plumbaginaceae. Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hoá học ĐH. Khoa học Tự nhiên

TP.HCM.

5. Trần Đệ Thăng. 1995. Khảo sát chất gossypol cô lập từ hột cây bông Gossypium hirsutum,

họ Malvaceae. Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hoá học ĐH. Khoa học Tự nhiên

TP.HCM.

6. World Health Organization. 1997. Manual for the virological investigation

of polio, Global programme for vaccines and immunization. 35-37.

7. Xin Lin, Wen Kui Li, Pei gen Xiao. 1999. Effects of Icariside II from Epimedium

koreanum on tumour cell lines in vitro. - Pharm. Pharmacol. Commun. 5:701-703.

8. K.V.Anis, G.Kuttan, R.Kuttan .1999. Role of Berberine as an adjuvant response modifier

during tumour therapy in mice. Pharm. Pharmacol. Commun. 5:697 - 700.

9. Keyong Ho Lee, Hee Sun Hong, Chi Ho Lee, Chang Han Kim. 2000. Induction of

apoptosis in human leukaemic cell lines K562, HL 60 and U 937 by

Diethylhexylphthalate isolated from Aloe vera Linne. J. Pharm.Pharmacol. 52: 1037

- 1041.

10. Ana. M. Pintao, M. Salome S. Pais, Helen Coley, Lloyd R. Kelland, Ian R. Judson. 1995.

In vitro and in vivo antitumor activity of Benzyl Isothiocyanate: A natural product

from Tropaeolum majus. Planta Med. 61: 233-236.

11.Uma Devi, F.E. Solomon, A.C. Sharada. 1999. Plumbagin, a plantnaphthoquinon with

antitumor and radiomodifying properties. Pharmaceutical biology. 3:231-236.

12. V. Elangovan, Nalini Ramamoorthy, S. Balasubramanian, N. Sekar, S.

Govindasamy - Studies on the antiproliferative effect of some naturally occurring

bioflavonoidal compounds against human carcinoma of larynx and sarcoma - 180

cell lines. - Indian Journal of Pharmacology 1994; 26: 266-269.

13. Clinical pharmacology and pharmacology of gossypol.

http://wwvv.med.cornell.edu/gradschool/fac/reidenberg.html.

Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp cơ sở: Khảo sát hoạt tính kháng phân bào In vitro của Gossypol và Plumbagin

Chủ đề: