Cấy định lượng mẫu đàm

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

CAÁY ÑÒNH LÖÔÏNG MAÃU ÑAØM

Muïc tieâu

• Höôùng daãn laâm saøng cho ñuùng chæ ñònh caáy ñònh löôïng ñaøm maø khoâng phaûi quaù haïn cheá

hay quaù roäng khoâng caàn thieát vì bieát ñöôïc caùc chæ ñònh laâm saøng ñeå cho laøm xeùt nghieäm

• Thöïc hieän ñöôïc qui trình caáy ñònh löôïng maãu ñaøm trong phoøng thí nghieäm vi sinh laâm saøng

caáy ñònh löôïng maãu ñaøm.

• Trieån khai thöïc hieän ñöôïc xeùt nghieäm caáy ñònh löôïng maãu ñaøm taïi beänh vieän khi coù yeâu

cuûa mình.

caàu cuûa laâm saøng vi bieát vaø chuaån bi ñöôïc caùc phöông tieän caàn thieát vaø thích hôïp nhaát ñeå

thöïc hieän ñöôïc xeùt nghieäm naøy.

Chæ ñònh

Hieän nay coù moät xu höôùng môùi trong caáy ñaøm, ñoù laø caáy ñònh löôïng. Döïa vaøo keát quaû caáy

ñònh löôïng coù theå phaân bieät taùc nhaân naøo laø taùc nhaân thaät söï gaây beänh coù trong maãu ñaøm,

taùc nhaân naøo laø ngoaïi nhieãm vuøng haàu hoïng. Phöông phaùp caáy ñònh löôïng maãu ñaøm ñöôïc

chæ ñònh thoâng thöôøng nhaát laø treân caùc vieâm phoåi naëng hay treân caùc vieâm phoåi beänh vieän.

Treân vieâm phoåi coäng ñoàng thì khoâng nhaát thieát phaûi aùp duïng phöông phaùp naøy.

Thôøi ñieåm laáy maãu vaø caùch laáy maãu

Töông töï phöông phaùp caáy khoâng ñònh löôïng

Ñaùnh giaù maãu ñaøm

Tröôùc khi tieán haønh nuoâi caáy, maãu ñaøm cuõng ñöôïc ñaùnh giaù ñaïi theå vaø sau ñoù laø m moät pheát

nhuoäm Gram ñeå ñaùnh giaù vi theå nhö phöông phaùp caáy ñaøm khoâng ñònh löôïng.

Phöông phaùp caáy ñònh löôïng

Tröôùc heát laøm tan ñaøm trong dung dòch nöôùc muoái sinh lyù voâ truøng vöøa pha theâm NALC

(SPUTAPREP-QT kit cuûa Nam Khoa) vaø sau ñoù pha loaõng ñaøm. Tieán haønh nhö sau:

ƒ Trong moät tube 15ml voâ truøng naép xanh (loaïi Falcon) ñaõ chöùa 10ml nöôùc muoái sinh lyù voâ

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

truøng (NS), cho theâm vaøo 50mg NALC (N-Acetyl-L-Cysteine), töùc laø toaøn boä boät NALC

chöùa trong moät tube Eppendorf. Laéc nheï cho tan hoaøn toaøn. Dung dòch NS coù NALC naøy

chæ duøng trong ngaøy vaø ñuû cho 2 – 3 maãu. Luoân luoân baûo quaûn tube dung dòch NALC ñaõ

ƒ Laáy moät theå tích ñaøm caàn nuoâi caáy cho vaøo moät tube voâ truøng naép vaën chaët (hay loï voâ

pha trong tuû laïnh 4oC.

truøng naép ñoû). Theâm vaøo moät theå tích nhö vaäy dung dòch NS coù NALC vöøa môùi pha. Laéc

nheï cho ñeán khi ñaøm tan trong dung dòch naøy. Nhö vaäy chuùng ta ñaõ coù ñaøm ñaõ pha loaõng

1/2. Sau khi ñaøm tan hoaøn toaøn, pha loaõng tieáp maãu ñaøm naøy thaønh 1/10 trong nöôùc muoái

ƒ Tieán haønh caáy ñònh löôïng maãu ñaøm ñaõ pha loaõng 1/2 treân caùc hoäp thaïch maùu cöøu (BA),

sinh lyù voâ truøng. Nhö vaäy chuùng ta ñaõ coù ñaøm pha loaõng 1/20.

thaïch naâu maùu ngöïa coù bacitracin (CAHI) vaø thaïch MC baèng khuyeân caáy ñònh löôïng 10 ml

(0.01ml) vaø 1ml (0.001ml) hay duøng micropipette ñeå huùt 10ml vaø 1ml caáy leân maët thaïch. Vôùi

maãu ñaøm pha loaõng 1/20, duøng khuyeân caáy 1 ml hay duøng micropipette ñeå huùt 1 ml caáy leân

maët thaïch vaø cuõng treân 3 loaïi hoäp thaïch nhö treân. Phöông phaùp caáy ñònh löôïng treân maët

thaïch ñöôïc thöïc hieän nhö caáy ñònh löôïng nöôùc tieåu. Sau khi caáy, caùc hoäp thaïch BA vaø

CAHI ñöôïc uû trong khí tröôøng CO 2 coøn caùc hoä p thaïch MC ñöôïc uû trong khí tröôøng bình

thöôøng, nhieät ñoä uû laø 35-37 oC, thôøi gian uû qua ñeâm hay toái ña 24 giôø. Ñoïc keát quaû vaø ñònh

löôïng caùc loaïi vi khuaån moïc treân caùc hoäp thaïch nhö trong baûng 4 trình baøy sau:

Baûng 4: Caùch ñoïc keát quaû ñònh löôïng caùc loaïi vi khuaån trong maãu ñaøm döïa treân soá löôïng

caùc loaïi khuùm vi khuaån moïc treân caùc hoäp thaïch.

Hoäp thaïch Maãu ñaøm pha Voøng caáy ñònh Theå tích ñaøm Soá vi khuaån

loaõng ñöôïc caáy ñöôïc ñònh löôïng löôïng

1/2 1 5ml 10ml 2N x 102/ml

1/2 2 0.5ml 2N x 103/ml 1ml

1/20 3 0.05ml 2N x 104/ml 1ml

0.5ml

4.5ml NS voâ truøng

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

N laø soá khuùm cuûa moät loaïi vi

khuaån ñeám ñöôïc treân caùc hoäp

thaïch. Ñeå coù con soá ñònh löôïng

Ñaøm pha loaõng 1/2 trong dung dòch NALC

Ñaøm pha loaõng 1/20 trong NS hay PBS

cuûa moät loaïi vi khuaån thì chuùng ta

neân laáy soá trung bình cuûa caùc keát

10ml

MC1

BA1

CA1

quaû. Vd: ÖÙng vôùi caùc khuùm nghi

ngôø K. pneumoniae , keát quaû treân

1ml

hoäp thaïch MC1 laø 200 khuùm,

MC2

BA2

CA2

löôïng vi khuaån K. pneumoniae

trong 1ml ñaøm laø 40.000 CFU/ml

1ml

(2x200x102); treân hoäp thaïch MC2

MC3

BA3

CA3

laø 15, löôïng vi khuaån/ml ñaøm laø

30.000 CFU/ml (2x15x10 3); vaø

treân hoäp thaïch MC3 laø 3, löôïng vi Sô ñoà 9:

khuaån laø 60.000 CFU/ml CAÙCH PHA LOAÕNG VAØ CAÁY ÑÒNH LÖÔÏNG MAÃU ÑAØM TREÂN CAÙC HOÄP THAÏCH (2x3x103). Nhö vaäy, keát quaû cuoái

cuøng löôïng vi khuaån K. pneumoniae trong maãu ñaøm seõ ñöôïc tính laø (40.000 + 30.000 +

60.000)/3 = 43.333 CFU/ml. Neá u caùc hoäp thaïch 1 vaø 2 coù vi khuaån quaù nhieàu (> 200

khuùm), chuùng ta chæ neân ñeám soá khuùm treân hoäp thaïch 3.

Bieän luaän keát quaû

Caùc vi khuaån coù löôïng ‡ 1000 CFU/ml thì phaûi ñònh danh vaø khaùng sinh ñoà. Coù nghó laø tieán

haønh ñònh danh vaø khaùng sinh ñoà baát cöù khuùm vi khuaån naøo moïc ñöôïc treân hoäp thaïch 2 vaø

3 hay coù soá löôïng ‡ 5 khuùm treân hoäp thaïch 1. Traû lôøi laâm saøng caû keát quaû ñònh löôïng laø bao

nhieâu vi khuaån ñaõ ñònh danh vaø laøm khaùng sinh ñoà ñeå laâm saøng coù theå tuyø nghi söû duïng.

Caâu hoûi oân taäp

1. Cho bieát caùc chæ ñònh laâm saøng ñeå caáy ñònh löôïng maãu ñaøm.

2. Coù caàn ñaùnh giaù maãu ñaøm trong caáy ñònh löôïng khoâng?

3. Neâu cuï theå caùch caáy ñònh löôïng maãu ñaøm nhö theá naøo vaø veõ sô ñoà thöïc hieän.

4. Bieän luaän moät keát quaû caáy ñònh löôïng ñaøm.

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

CAÁY ÑÒNH LÖÔÏNG MAÃU ÑAØM – Caùc caâu hoûi thöôøng gaëp

ƒ Vieâm phoåi coäng ñoàng neáu laø nheï hay trung bình thì khoâng nhaát thieát phaûi caáy ñònh löôïng vì

Trong tröôøng hôïp vieâm phoåi coäng ñoàng, coù caàn thieát phaûi caáy ñònh löôïng maãu ñaøm?

caùc vi khuaån gaây beänh thöôøng laø H. influenzae, M. catarrhalis vaø S. pneumoniae. Caùc vi

khuaån naøy duø ñeàu coù theå laø vi khuaån thöôøng truù vuøng haàu hoïng nhöng khoù coù theå moïc ñöôïc

treân moâi tröôøng nuoâi caáy neáu chuùng ôû daïng thöôøng truù vì soá löôïng raát ít. Chính vì vaäy

chuùng ta chæ caàn ñaùnh giaù maãu ñaøm qua pheát nhuoäm Gram, neáu thaáy tin caäy thì tieán haønh

ƒ Ñoái vôùi vieâm phoåi coäng ñoàng naëng, caùc vieâm phoåi beänh vieän thì raát caàn thieát phaûi caáy ñònh

nuoâi caáy bình thöôøng chöù khoâng caàn caáy ñònh löôïng.

löôïng maãu ñaøm vì taùc nhaân vi khuaån gaây beänh thöôøng laø caùc tröïc khuaån Gram [-] deã moïc

hay laø tuï caàu maø ñaây laø caùc vi khuaån coù theå laø caùc vi khuaån taïm truù raát deã moïc treân caùc hoäp

thaïch phaân laäp duø soá löôïng vi khuaån hieän dieän ít trong maãu.

Khi tieán haønh caáy ñònh löôïng, coù caàn ñaùnh giaù maãu ñaøm tröôùc qua pheá nhuoäm Gram

ƒ Caáy ñònh löôïng nhaèm muïc ñích laø chæ baét caùc vi khuaån coù soá löôïng lôùn trong maãu ñaøm vì

khoâng?

ñaây môùi chính laø taùc nhaân gaây beänh thaät söï. Do vaäy veà nguyeân taéc khoâng nhaát thieát phaûi

ƒ Tuy nhieân vì qui trình caáy ñònh löôïng ngoaøi vieäc phaûi duøng boä thuoác thöû laøm tan ñaøm,

ñaùnh giaù maãu ñaøm tröôùc khi caáy ñònh löôïng.

chuùng ta coøn phaûi söû duïng soá löôïng hoäp thaïch phaân laäp nhieàu gaáp 3 laàn phöông phaùp caáy

khoâng ñònh löôïng, do vaäy raát caàn thieát phaûi ñaùnh giaù maãu ñaøm ñeå chæ tieáp tuïc qui trình caáy

ñònh löôïng khi maãu ñaøm ñöôïc ñaùnh giaù laø tin caäy hay tin caäy vöøa, nhôø vaäy chuùng ta coù theå

tieát kieäm vì khoâng phaûi tieán haønh caáy ñònh löôïng maãu khoâng tin caäy.

Coù khi naøo trong keát quaû caáy ñònh löôïng ñaøm cho keát quaû soá löôïng vi khuaån gaây beänh

treân 1.000 hay 10.000, maø keát quaû ñaùnh giaù ñaøm qua pheát nhuoäm Gram quan saùt ôû quang

ƒ Treân thöïc teá coù phoøng thí nghieäm caáy ñònh löôïng ñaøm cho keát quaû nhö treân. Tuy nhieân vôùi

tröôøng X100 laïi khoâng tin caäy khoâng?

nghieân cöùu maø chuùng toâi ñaõ tieán haønh taïi phoøng thí nghieäm cuûa mình thì 100% caùc maãu

khoâng tin caäy ñeàu cho keát quaû ñònh löôïng vôùi soá löôïng vi khuaån (öùng vôùi moãi loaïi)

<1.000CFU/ml.

ƒ Keát quaû naøy caøng khaúng ñònh laø khoâng neân caáy ñònh löôïng khi pheát nhuoäm Gram maãu ñaøm

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

quan saùt döôùi kính hieån vi vôùi quang tröôøng X100 cho thaáy coù >10 teá baøo bieåu moâ vaø <25

ƒ Do vaäy, coù leõ phoøng thí nghieäm naøy ñaõ quan nieäm sai veà caùch tính soá löôïng vi khuaån, thay

teá baøo baïch caàu.

vì laø soá löôïng cuûa töøng loaïi vi khuaån, hoï laïi tính soá löôïng cuûa taát caû caùc loaïi vi khuaån hieän

dieän trong maãu ñaøm.

Caáy ñònh löôïng ñaøm coù khaû thi khoâng vôùi ñieàu kieän hieän nay taïi caùc phoøng thí nghieäm vi

ƒ Tröôùc ñaây, khoù coù theå caáy ñònh löôïng ñaøm vì ñoøi hoûi phaûi coù thuoác thöû laøm tan ñaøm phaûi

sinh laâm saøng beänh vieän?

ñaët mua nöôùc ngoaøi vaø giaù thaønh khaù ñaét. Hieän nay boä thuoác thöû laøm tan ñaøm ñeå caáy ñònh

löôïng ñaøm ñaõ ñöôïc coâng ty Nam Khoa (ñaït ISO 9001:2000) nghieân cöùu thaønh coâng vaø saûn

xuaát trong nöôùc vôùi saûn phaåm mang teân SPUTAPREP-QT. Saûn phaåm naøy raát tieát kieäm vaø

ƒ Neáu ñöôïc trang bò SPUTAPREP-QT; vaø coù theâm caùc loaïi moâi tröôøng phaân laäp laø MC, BA

tieän duïng nhôø ñöôïc chia nhoû ñeå coù theå thöïc hieän treân toái thieåu 2 maãu ñaøm trong ngaøy.

maùu cöøu, CA giaøu XV (caùc moâi tröôøng naøy cuõng ñaõ ñöôïc coâng ty Nam Khoa saûn xuaát döôùi

daïng cheá saün hay saün saøng ñeå cheá); caùc phoøng thí nghieäm vi sinh laâm saøng beänh vieän hoaøn

toaøn coù theå caáy ñònh löôïng ñöôïc maãu ñaøm maø khoâng gaëp baát cöù khoù khaên hay trôû ngaïi gì.

ƒ Thaät ra caáy ñònh löôïng ñaøm coù theå chæ ñònh cho taát caû caùc tröôøng hôïp caáy ñaøm. Tuy nhieân

Khi naøo thì neân chæ ñònh caáy ñònh löôïng ñaøm?

nhö ñaõ noùi ôû treân, caáy ñònh löôïng ñaøm toán keùm gaáp 3 laàn hôn caáy khoâng ñònh löôïng. Do

vaäy, chuùng ta khoâng caàn thieát cho caáy ñònh löôïng ñoái vôùi caùc tröôøng hôïp vieâm phoåi coäng

ƒ Raát caàn thieát phaûi cho caáy ñònh löôïng ñaøm caùc tröôøng hôïp vieâm phoåi naëng, caùc tröôøng hôïp

ñoàng nheï vaø vöøa.

vieâm phoåi beänh vieän, caùc tröôøng hôïp vieâm phoåi naèm taïi caùc phoøng caáp cöùu vaø phoøng chaêm

ƒ Cuõng neân cho caáy ñònh löôïng khi khi quan saùt ñaïi theå caùc maãu ñaøm laáy ñöôïc thaáy coù laãn

soùc taêng cöôøng (ICU).

ƒ Moät nguyeân taéc maø chuùng toâi cho laø raát caàn thieát phaûi tuaân theo ñeå tieát kieän chi phí cho

nöôùc boït.

beänh nhaân vaø beänh vieän, ñoù laø khoâng caáy ñònh löôïng khi quan saùt vi theå maãu ñaøm qua pheát

nhuoäm Gram cho thaáy laø maãu hoaøn toaøn khoâng tin caäy.

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Saûn phaåm lieân quan: SPUTAPREP-QT – Boä thuoác thöû

laøm tan ñaøm ñeå caáy ñònh löôïng ñaøm

Nguyeân taéc hoaït ñoäng

Boä thuoác thöû hoaït ñoäng döïa treân nguyeân taéc duøng N-Acetyl-L-Cysteine (NALC) ñeå laøm tan

ñaøm vaø caùc nhaày nhôùt trong ñaøm, nhôø vaäy laøm ñoàng nhaát ñöôïc maãu ñeå coù theå tieán haønh caáy

ñònh löôïng, taùch chieát ñöôïc nucleic acid cuûa virus hay vi khuaån gaây beänh coù trong ñaøm ñeå laøm

thöû nghieäm PCR...

Thaønh phaàn thuoác thöû

SPUTAPREP-QT daønh cho 10 maãu ñaøm goàm caùc thaønh phaàn sau:

1. N-Acetyl-L-Cysteine (NALC): boät nguyeân chaát chöùa trong 5 tube Eppendorf nhoû, moãi tube

chöùa NALC ñuû duøng cho xöû lyù 2 maãu ñaøm.

2. Dung dòch nöôùc muoái sinh lyù voâ truøng: Chöùa trong tube 15ml naép vaën chaët, moãi tube chöùa

10ml nöôùc muoái sinh lyù voâ truøng.

Boä thuoác thöû SPUTAPREP-QT chöa duøng hay ngay sau khi duøng neân ñöôïc giöõ trong tuû laïnh

4oC cho ñeán ngaøy heát haïn ghi treân hoäp (2 naêm sau ngaøy saûn xuaát).

Phöông phaùp laøm tan ñaøm vôùi SPUTEPREP-QT

1. Trong moät tube 15ml voâ truøng naép xanh (loaïi Falcon) ñaõ chöùa 10ml nöôùc muoái sinh lyù voâ

truøng (NS), cho theâm vaøo 50mg NALC (N-Acetyl-L-Cysteine), töùc laø toaøn boä boät NALC

chöùa trong moät tube Eppendorf. Laéc nheï cho tan hoaøn toaøn. Dung dòch NS coù NALC naøy

chæ duøng trong ngaøy vaø ñuû cho 2 – 3 maãu. Luoân luoân baûo quaûn tube dung dòch NALC ñaõ

pha trong tuû laïnh 4oC.

2. Laáy moät theå tích ñaøm caàn nuoâi caáy cho vaøo moät tube voâ truøng naép vaën chaët (hay loï voâ

truøng naép ñoû). Theâm vaøo moät theå tích nhö vaäy dung dòch NS coù NALC vöøa môùi pha. Laéc

nheï cho ñeán khi ñaøm tan trong dung dòch naøy. Nhö vaäy chuùng ta ñaõ coù ñaøm ñaõ tan vaø ñöôïc

pha loaõng 1/2. Ñaøm ñaõ tan naøy saõn saøng cho qui trình caáy ñònh löôïng hay qui trình taùch

chieát nucleic acid cho PCR hay RT-PCR ñeå phaùt hieän caùc taùc nhaân vi khuaån hay virus gaây

beänh coù trong maãu ñaøm.

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Hình 28: Một số hình ảnh cấy ñònh lượng mẫu ñaøm treân maët thaïch phaân laäp: (A) thaïch naâu vôùi khuùm vi khuaån nghi ngôø M. catarrhalis, (B) thaïch naâu vôùi nhieàu khuùm vi khuaån nghi ngôø S. pneumoniae coù taïp nhieãm nhieàu vi khuaån haàu hoïng khaùc, ( C, D) thaïch maùu vôùi nhieàu khuùm vi khuaån nghi ngôø Streptococcus feacalis , (E) thaïch MC vôùi caùc khuùm vi khuaån nghi ngôø Acinetobacter.