CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG

Chia sẻ: Nguyễn Thị Thắm | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

356
lượt xem 57
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Các nhà chọn giống và sản xuất đã nhận ra giá trị của tính kháng bệnh đối với cây trồng từ đầu thế kỷ 19. Ngày nay, việc chọn tạo giống kháng dịch hại đã trở nên cực kỳ quan trọng do mức độ thâm canh ngày càng tăng và con người đã hiểu rõ các ảnh hưởng bất lợi đối với môi trường và sức khỏe của việc sử dụng biện pháp hóa học. Các kỹ thuật công nghệ sinh học đã giúp các nhà chọn giống kháng hiểu rõ cơ chế tương tác giữa cây và tác nhân gây bệnh, sự đa dạng...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG

CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG 1. Giới thiệu Các nhà chọn giống và sản xuất đã nhận ra giá trị c ủa tính kháng b ệnh đ ối v ới cây trồng từ đầu thế kỷ 19. Ngày nay, việc chọn tạo giống kháng dịch hại đã trở nên c ực kỳ quan trọng do mức độ thâm canh ngày càng tăng và con người đã hi ểu rõ các ảnh hưởng bất lợi đối với môi trường và sức khỏe của việc sử dụng biện pháp hóa học. Các kỹ thuật công nghệ sinh học đã giúp các nhà chọn gi ống kháng hiểu rõ c ơ ch ế tương tác giữa cây và tác nhân gây bệnh, sự đa dạng của quần thể tác nhân gây b ệnh cũng như bản chất các gen kháng bệnh của cây. Các ki ến th ức này là c ơ s ở khoa h ọc cho các chương trình chọn tạo giống kháng. Giống kháng bệnh luôn là một thành phần quan trọng c ủa b ất kỳ chi ến l ược phòng chống dịch nào; và một khi sẵn có, sử dụng giống kháng là bi ện pháp phòng ch ống hiệu quả nhất, rẻ tiền nhất đối với nông dân. Các bước chính đối với một chương trình chọn tạo giống kháng bao gồm 1. Xác định mức độ đa dạng của quần thể tác nhân gây bệnh 2. Xác định nguồn gen kháng 3. Lựa chọn gen kháng phù hợp 4. Chuyển gen vào giống cây ưu tú 5. Chọn lọc và đánh giá dòng/giống cây ưu tú mang gen kháng 6. Đánh giá trên qui mô đồng ruộng 7. Đăng ký và ứng dụng Các bước trên, về cơ bản cũng tương tự như các bước chọn tạo gi ống mang các tính trạng nông học. Các kỹ thuật lai và chuyển gien có thể tham kh ảo ở nhi ều giáo trình chọn giống và công nghệ sinh học. Dưới đây chỉ trình bày m ột số ch ủ đ ề ho ặc chú ý liên quan đến chọn tạo giống kháng bệnh. 2. Đa dạng của quần thể tác nhân gây bệnh 2.1. Đa dạng của tác nhân gây bệnh Các cá thể của loài tác nhân gây bệnh tại 1 vùng đ ịa lý th ường không đ ồng nh ất. Chúng có thể tồn tại dưới dạng các chủng (race, strain), type sinh h ọc (biotype), nòi sinh học (biovar, pathovar = pv.), dạng chuyên hóa (forma specialist = f.sp.)... Cần chú ý là các khái niệm race, strain....nêu trên là các khái niệm phân lo ại không chính th ức ở mức dưới loài và thường rất khác nhau cũng như không tương đương nhau gi ữa các nhóm/loài tác nhân gây bệnh (thường do các nhà khoa học nghiên cứu một nhóm/loài tác nhân nào đó qui định). Ngoài ra, dựa vào các nghiên c ứu phả hệ (phylogenetic), thường là các nghiên cứu phân tử, quần thể của tác nhân gây bệnh còn có thể được xếp vào các nhóm phả hệ khác nhau (phylogenetic group). 1
Các nhóm đa dạng trên có thể rất khác nhau về tính gây b ệnh/tính đ ộc trên m ột loài/giống cây ký chủ tương ứng. Do vậy, để tạo ra một giống cây kháng b ệnh áp dụng cho một vùng nào đó, đầu tiên, người ta cần phải biết được mức độ đa dạng của tác nhân gây bệnh. Một số ví dụ về mức độ đa dạng: 1. Nấm Pyricularia oryzae (bệnh đạo ôn lúa): xem chương 6 3. Nấm Fusarium oxysporum. Đây là loài nấm đa dạng, gây bệnh héo m ạch d ẫn trên rất nhiều loài thực vật có hoa. Loài này gồm khoảng 100 dạng chuyên hóa (formae speciales = số nhiều) căn cứ trên tính gây bệnh trên các loài cây tr ồng khác nhau. M ỗi dạng chuyên hóa lại có thể bao gồm các chủng khác nhau dựa trên tính gây b ệnh trên giống khác nhau. Ví dụ: Fusarium oxysporum f.sp. cubense gây hại trên các cây thuộc 2 h ọ Musaceae và Heliconeaceae (bộ Zingiberales). Dạng chuyên hóa này, căn cứ tính gây bệnh trên các giống chuối lại được chia thành 4 race là race 1, race 2, race 3 và race 4. Trong 4 race này, race 4 nhiễm chủ yếu trên các giống Cavendish (AAA) = nhóm chu ối tiêu, và l ại được chia tiếp thành race 4 nhiệt đới (tropical race 4) và race 4 c ận nhi ệt đ ới (subtropical race 4). 2.2. Các kỹ thuật dùng để nghiên cứu mức độ đa dạng của tác nhân gây bệnh là: 2.2.1. Sử dụng giống chỉ thị (khái niệm và ví dụ: xem chương 6) 2.2.2. Các phân tích phân tử Nhiều kỹ thuật phân tử có thể sử dụng để đánh giá mức độ đa dạng của tác nhân gây bệnh. Nguyên lý và ứng dụng của các kỹ thuật này có thể tham khảo ở nhi ều tài li ệu tiếng Việt, tiếng Anh và internet. Dưới đây là tóm tắt một số kỹ thuật phổ bi ến trong nghiên cứu đa dạng tác nhân gây bệnh cây. RAPD (random amplified polymorphic DNA). Kỹ thuật này dựa trên phản ứng PCR s ử dụng các mồi ngẫu nhiên. Các mồi ngẫu nhiên có kích th ước kho ảng kho ảng 10 nts do đó phản ứng PCR với các mồi này nhìn chung có Ta thấp (kho ảng 34-37 OC). Ưu diểm của kỹ thuật là đơn giản, không đòi hỏi biết trước thông tin về trình tự gien c ủa tác nhân gây bệnh và có thể đánh giá mức độ đa hình trên toàn bộ b ộ genome. M ức đ ộ đa hình hình thành do sai khác tại vị trí gắn mồi và c ả sai khác v ề đ ộ dài (m ất đo ạn, thêm đoạn) giữa 2 vị trí gắn mồi. Nhược điểm lớn nhất là điều kiện PCR thường khác nhau giữa các phòng thí nghiệm dẫn tới kết quả không thống nhất. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms). Kỹ thuật này gồm các bước chính sau. • Tinh chiết DNA của tác nhân gây bệnh. Vì bước tiếp theo là cắt bằng enzyme cắt giới hạn (RE = restriction enzyme) nên chất lượng DNA yêu cầu phải thật thuần khiết. • Cắt DNA bằng RE. 2
• Lai hóa (Southern blot) các sản phẩm cắt với dò (probe) đặc hiệu. Việc chọn lựa dò rất quan trọng đảm bảo sao cho các băng đa hình (polymorphism) hình thành đủ để phân biệt các mẫu. • Phân tích mức độ đa hình bằng phần mềm thích hợp. Ví dụ: Adhikari et al (1995): 308 mẫu Xoo thu thập từ nhi ều n ước châu Á đã đ ược đánh giá mức độ đa dạng bằng kỹ thuật RFLP. DNA vi khuẩn sau khi tinh chi ết đ ược cắt với EcoRI hoặc BamHI. Hai loại dò được sử dụng là (i) đoạn chứa nguyên tố lặp (repetitive element) và (ii) đoạn chứa gen AvrXa10. Kết quả phân tích cho th ấy các mẫu Xoo châu Á gồm 5 cụm, vừa phân bố độc lập theo qu ốc gia, v ừa có s ự di chuy ển giữa các nước. AFLP (Amplified Restriction Fragment Polymorphism). Đây là kỹ thuật kết hợp ưu điểm của RFLP và PCR. Sức mạnh của AFLP là khả năng ki ểm tra mức đ ộ đa hình trên toàn bộ bộ genome của tác nhân gây bệnh. Kỹ thuật gồm các bước chính sau: • Tinh chiết DNA của tác nhân gây bệnh. Vì bước tiếp theo là cắt bằng enzyme cắt giới hạn nên, giống như đối với kỹ thuật RFLP, chất lượng DNA là yêu cầu quan trong. • Cắt DNA bằng 2 RE, thường 1 ER có chuỗi cắt hiếm (như EcoRI) còn ER kia có chuỗi cắt phổ biến hơn. • Nối sản phẩm cắt với adaptor (chứa chuỗi ER). Sản phẩm nối là khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo. Trình tự adapter và trình tự của RE là trình tự găn mồi của bước tiếp theo. • PCR lần 1 (preselective amplification): sử dụng 2 mồi tiền chọn lọc. Trình tự mồi tiền chọn lọc là trình tự adapter + trình tự của RE + 1 nucleotid được thêm vào đầu 3’. Sản phẩm PCR lần 1 (hòa loãng) được sử dụng làm khuôn cho PCR lần 2. Chú ý: đối với một số protocol, mồi tiền chọn lọc có thể không chứa 1 nucleotid bổ sung. • PCR lần 2 (selective amplification): sử dụng 2 mồi chọn lọc. Trình tự mồi chọn lọc là trình tự mồi tiền chọn lọc + 2 nucleotid được thêm vào đầu 3’. Số lượng nucleotid (1,2,3) thêm vào đầu 3’ sẽ tăng mức độ chọn lọc đồng thời giảm số sản phẩm PCR tương ứng từ 4, 16 và 64 lần). Một trong 2 mồi chọn lọc thường được đánh dấu bức xạ hoặc huỳnh quang nhằm phân tích điện di tự động. Nhiều cặp mồi chọn lọc có thể được được sử dụng để đánh giá chính xác mức độ đa hình. • Sản phẩm PCR là các băng chung + các băng khác nhau giữa các mẫu. Các băng khác nhau này là các DNA đa hình hình và sẽ được đánh giá dùng phần mềm thích hợp. Ví dụ. Nguyễn Thị Ninh Thuận (2006): 114 mẫu P. oryzae thu thập tại miền Bắc đã được phân tích dùng kỹ thuật AFLP. RE sử dụng là EcoRI và MseI. M ồi ti ền s ử dụng là EcoRI primer (5’- GACTGCGTACCAATTC-3’, không chứa 1 nt bổ sung) và MSEI primer (5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’, cũng không chứa 1 nt bổ sung). 3
Tác giả sử dụng 8 cặp mồi chọn lọc để tạo ra 733 sản phẩm AFLP-PCR trong đó 160 sản phẩm là đa hình (xem thêm chương 6). Sequencing. Kỹ thuật giải trình tự hiện nay có thể được thực hiện dễ dàng tại nhi ều phòng thí nghiệm. Nghiên cứu phả hệ dựa vào chuỗi nucleotid hay aa thường phản ánh khá chính xác mối quan hệ cũng như mức độ đa dạng c ủa quần thể tác nhân gây b ệnh nếu chọn được vùng gen thích hợp. Hiện nay nhi ều loại vector dòng hóa thu ộc nhóm vector TA sẵn có trên thị trường tạo điều kiện cho việc dòng hóa nhanh chóng s ản phẩm PCR mà không cần phải xử lý enzym RE. Sản phẩm PCR cũng có thể được giải mã trực tiếp không cần dòng hóa. Ví dụ. Đối với các potyvirus (chi Potyvirus, họ Potyviridae), gen mã hóa vỏ protein (CP = Coat Protein) là gen thường được sử dụng nhi ều nhất cho mục đích phân lo ại và nghiên cứu đa dạng. Các nghiên cứu gần đây dựa vào trình t ự gen CP c ủa m ột s ố potyvirrus thu thập tại Việt Nam cho thấy Papaya ring spot virus (PRSV) gây bệnh đốm hình nhẫn đu đủ của Việt Nam (1) rất đa dạng, (2) chia thành c ụm mi ền Nam và miền Băc, (3) một số mẫu chia xẻ mức độ tương đồng cao v ới các chu ỗi có ngu ồn gốc nước ngoài như Philippin, Nhật Bản, Đài Loan. T ương t ự, trong s ố 13 potyvirrus được phân tích, các virus Bean common mosaic virus (BCMV), Sugarcane mosaic virus và Potatovirus Y (PVY) cũng có mức độ đa dạng rất cao. Hơn nữa, một số isolate BCMV và SCMV có vị trí nằm ở gốc của cây phả hệ (được phân tích với phần lớn các chuỗi sẵn có trên GenBank) còn cho thấy dường như Việt Nam là 1 trong những trung tâm đa dạng của 2 virus này. Mức độ đa dạng cao của 4 potyvirrus kể trên dẫn tới khó khăn đáng kể khi áp dụng các biện pháp phòng chống dựa trên tính đặc hi ệu trình t ự (chẳng hạn RNA silencing). 3. Xác định nguồn gen kháng 3.1. Sự đa dạng của thực vât Cây trồng ngày nay là kết quả của quá trình chọn lọc và nhân gi ống các d ạng/dòng cây vốn đã tiến hóa tự nhiên trên một hoặc nhiều vùng địa lý qua hàng tri ệu năm. S ự ti ến hóa của một loài cây từ tổ tiên hoang dại tới cây trồng ngày nay diễn ra chậm và, trong quá trình tiến hóa đã tạo ra vô số các biến dị mà nhiều số trong chúng vẫn t ồn t ại t ới ngày nay dưới dạng các loài hoang dại. Mặc dù nhiều loài hoang dại có thể không có ý nghĩa trong nông nghiệp nhưng sự đa dạng cũng như sự sống sót c ủa chúng khi đ ương đầu vói nhiều tác nhận gây bệnh chứng tỏ chúng mang các gen kháng chống lại các tác nhân gây bệnh này. Khi con người bắt đầu làm nông nghiệp, họ chọn một số dạng cây dại để tr ồng. Ở mỗi vùng, những cây thích ứng được với điều kiện thời tiết địa phương, cho năng suất và chất lượng tốt nhất cũng như chống chịu được sự tấn công c ủa d ịch h ại đặc tr ưng của địa phương tiếp tục được chọn lọc. Quá trình chọn lọc này có thể được xem nh ư dưới tác động của 3 yếu tố (i) tự nhiên, (ii) dịch hại và (iii) con ng ười. Hai y ếu t ố đ ầu loại bỏ những cá thể yếu đuối và mẫn cảm nhất còn yếu tố thứ 3 sẽ gi ữ l ại nh ững cá thể có năng suất tốt nhất trong số những cá thể sống sót. Vì quá trình ch ọn l ọc di ễn ra tương đối độc lập nên hậu quả laf có rất nhiều giống cây trồng mang đặc điểm chống chịu khác nhau trên thế giới. 4
Trong thế kỷ 20 và 21, con người đã tiến hành các chương trình ch ọn t ạo gi ống mang tính hệ thống hơn, dựa vào những kiến thức mới về ký sinh, cây trồng và t ương tác giữa chúng. Tuy nhiên xét về mức độ đa dạng của cây trồng, có th ể chia làm 2 giai đoạn. Lúc đầu, mức độ đa dạng của cây khá cao do các nhà chọn giống, trong quá trình tìm kiếm các gen các gen hữu ích (năng suất cao, chất l ượng t ốt, ch ống ch ịu d ịch h ại tốt, đồng nhất, thời gian sinh trưởng ngắn....) đã lai các gi ống có ngu ồn g ốc r ất khác nhau (địa phương, nhập nội, cây dại...) thậm chí gây đột biến nhân tạo và t ạo ra vô s ố các dòng/giống có kiểu gen khác nhau. Gần đây, mức độ đa dang c ủa cây có xu h ướng giảm vì các nhà chọn giống có xu hướng tổng hợp các gen tốt vào trong m ột số ít các giống và loại bỏ các giống không tốt. Trong nhiều trường hợp, các gi ống t ốt này l ại được trồng trên diện tích lớn. Khi các cây ký chủ đồng nhất v ề m ặt di truy ền, đ ặc biệt khi xét tới các gen kháng bệnh, được trồng trên m ột di ện tích l ớn, thì s ẽ có m ột khả năng lớn là một chủng tác nhân gây bệnh mới sẽ xuất hiện và tấn công các cây ký chủ này, dẫn tới một vụ dịch. Do đồng nhất về di truyền, tốc độ phát tri ển dịch b ệnh cao nhất, nhìn chung, bắt gặp ở các cây trồng nhân gi ống vô tính (Vd khoai tây, mía…); tốc độ trung bình bắt gặp ở các cây trồng tự thụ (Vd lạc…); và t ốc đ ộ th ấp nhất bắt gặp ở các cây giao phấn (Vd ngô…). Điều nay giải thích tại sao h ầu h ết các dịch bệnh trên các quần thể thực vật tự nhiên, vốn có ki ểu gen r ất không đ ồng nh ất, lại phát triển khá chậm 3.2. Nguồn gen kháng Nguồn gen kháng bệnh có chung ”bể gen” như đối với các gen qui đ ịnh các tính tr ạng di truyền khác. ”Bể gen” này có thể là các giống địa phương hiện trồng, giống nhập nội, giống địa phương cổ truyền, giống đã bị loại bỏ, các loài cây họ hàng hoang dại và cả các giống được gây đột biến nhân tạo. Thông thường, gen kháng bệnh có thể tìm thấy trên các cây sống sót tại n ơi có áp l ực bệnh cao hoặc nơi có bệnh nặng. Trong trường hợp không thể tìm thấy cây sống sót tại một nơi có bệnh nặng thì gen kháng có thể tìm ở loài cây t ương ứng tr ồng ở nơi khác hoặc tìm trên họ hàng hoang dại. Một khả năng nữa để tìm nguồn gen kháng là tìm trên cây tại trung tâm khởi nguyên của tác nhân gây bệnh vì nếu cây đã tồn tại lâu dài cùng với sự có mặt của bệnh thì chứng tỏ chúng phải mang gen kháng. T ương tự nguồn gen kháng cũng có thể tìm thấy tại trung tâm khởi nguyên của cây. Thuyết Vavilop về đồng tiến hóa ký sinh – ký chủ • Vùng khởi nguyên xuất sứ của một loài cây trồng là trung tâm hình thành phong phú nhất các loại, dạng, giống của loài cây trồng đó và cây dại. Nh ưng ở đó cũng là trung tâm hình thành đầy đủ nhất các loài, dạng, ch ủng, nòi c ủa ký sinh nh ờ có quá trình tiến hoá và chọn lọc tự nhiên gi ữa KS và KC đã di ễn ra ở đây lâu đ ời nhất • Tính đa dạng cây trồng và ký sinh ở vùng này thể hiện qua quá trình bi ến dị m ạnh mẽ nhất, nhờ đó xuất hiện và tích luỹ nhiều giống có tính kháng cao và đ ồng th ời xuất hiện và tích luỹ nhiều chủng ký sinh có tính độc cao. • Quan hệ ký sinh và ký chủ đó cũng luôn bi ến động song cũng đ ảm b ảo th ế cân bằng bền giữa ký sinh và ký chủ tạo thuận lợi cho sự phát triển của cả 2 phía. Phía 5
cây trồng có các đặc tính chống bệnh mới, đồng th ời t ạo cho ký sinh có đ ộc tính mới để vựot qua tính kháng của cây trồng đó. • Trong mối quan hệ đồng tiến hoá đó thì tiến hoá khởi đầu ch ỉ th ấy ở các loài cây ký chủ sau đó mới xuất hiện chủng ký sinh có tính đ ộc m ới để cùng t ồn t ại. V ậy chúng ta cần tìm kiếm nguồn gen kháng ở loài cây, giống cây ở vùng đ ịa lý, xu ất sứ khởi nguyên của chúng trên thế giới. Nguồn gen kháng đó là nguồn vật li ệu nguyên thuỷ có triển vọng nhất trong lai tạo chọn lọc gi ống có tính mi ễn d ịch và kháng sâu bệnh. 4. Lựa chọn gen kháng 4.1. Vai trò của tính kháng ngang và kháng dọc trong tạo giống kháng 4.1.1. Tính kháng dọc Tính kháng dọc thường do một hoặc một vài gen qui đ ịnh nên còn đ ược g ọi là tính kháng đơn gen. Các gen này điều khiển các bước/sự kiện quan trọng trong quá trình phát triển bệnh do đó còn được gọi là các gen kháng ch ủ. Ch ỉ c ần m ột ho ặc m ột vài gen kháng chủ đã có thể tạo ra tính kháng. Tính kháng dọc mang tính đ ặc hi ệu cao, nhằm vào một hoặc một số chủng tác nhân gây bệnh chỉ có thể chống được các chủng tương thích của tác nhân gây bệnh (nên còn được gọi là tính kháng đặc hi ệu ch ủng). Di truyền tính kháng dọc tuân theo qui luật di truyền Mendel và quan h ệ gi ữa gen ký chủ qui định tính kháng dọc và gen tương ứng của ký sinh là quan hệ gen-for-gen. Cây mang tính kháng dọc nhìn chung kháng hoàn toàn tác nhân gây b ệnh . Hơn nữa tính kháng dọc dễ thao tác hơn (phân lập, chuyển gen, đánh giá) trong các ch ương trình nhân giống nên thường được ưa thích hơn. Tính kháng dọc, mặc dù rất hiệu quả chống lại các chủng tương ứng c ủa tác nhân gây bệnh nhưng nhìn chung không bền vững. Tính kháng có thể bị m ất n ếu xu ất hi ện trong quần thể tác nhân gây bệnh các chủng mới không tương thích (từ n ơi khác t ới hoặc chủng bị kháng đột biến) có khả năng gây bệnh (xem thêm phần đ ồng ti ến hóa R-Avr chương 4). Tính kháng dọc, do vậy, có hiệu quả nhất khi: • Được tổng hợp vào cây hàng năm dễ nhân giống như cây cốc hạt nhỏ (lúa mỳ, lúa...). • Nhằm chống các loại tác nhân gây bệnh không sinh sản hoặc phát tán nhanh như nấm Fusarium, hoặc không đột biến nhanh như nấm Puccinia • Bao gồm các gen kháng chủ đủ ”mạnh” để bảo vệ hoàn toàn và lâu dài cây ký chủ. • Quần thể ký chủ không chỉ gồm 1 giống đồng nhất về di truyền được trồng trên một vùng rộng lớn. Nếu một hoặc nhiều điều kiện trên không đáp ứng được thì tính kháng d ọc s ẽ nhanh chóng bị phá vỡ. Ngoài ra, tính kháng dọc, vì mức độ kháng rất cao nên cũng tạo áp lực 6
chọn lọc lớn lên quần thể tác nhân gây bệnh dẫn tới dễ hình thành các ch ủng tác nhân gây bệnh mới. Vì tính kháng dọc dễ bị bẻ gẫy bởi một chủng tác nhân gây bệnh đ ộc m ới hình thành nên nhiều chiến lược đã được áp dụng để khắc phuch nhược điểm này chẳng h ạn như hỗn hợp giống hoặc tạo giống mang nhiều gen kháng chủ. Hỗn hợp giống (cultivar mixture). Trong trồng trọt, người ta có thể làm giảm sự phát triển của dịch bệnh bằng cách t ạo ra sự đa dạng di truyền của một loài cây trồng. Phương pháp đơn gi ản nhất đ ể t ạo ra sự đa dạng này là hỗn hợp giống (cultivar mixture). Hỗn h ợp gi ống là h ỗn h ợp các giống giống nhau về các đặc trưng nông học như thời gian sinh trưởng, phát tri ển, chất lượng và hình dạng hạt...nhưng khác nhau về gen kháng. Hỗn hợp giống không chống hoàn toàn được bệnh nhưng làm gi ảm đáng k ể t ốc đ ộ phát triển bệnh nhờ 4 cơ chế: (i) Khoảng cách giữa các cây mẫn cảm tăng dẫn tới giảm tốc độ phát tán. (ii) Tương tự, tạo ra rào cản vật lý là các cây của giống có tính kháng cao. (iii) Tạo tính kháng tạo được do chủng không độc gây ra. (iv) Thay đổi vi khí hậu theo hướng bất lợi cho bệnh. Vd. trong m ột thí nghi ệm h ỗn hợp giống giữa 1 lúa nếp (mẫn cảm với nấm đạo ôn, có chi ều cao cao h ơn 35-40 cm ) 1 giống lúa tẻ, số ngày với ẩm độ 100% vào 8 gi ờ sáng trên ru ộng thí nghi ệm đã gi ảm từ 20 ngày xuống còn khoảng 2 ngày và diện tích lá lúa n ếp bị phủ sương đã gi ảm t ừ 84% xuống 36% (Zhu et al. 2005). Kết quả TLB trên giống lúa nếp đã giảm 90%. Hỗn hợp giống đặc biệt có ý nghĩa đối với các bệnh hại phần trên m ặt đất đa chu kỳ. Ví dụ: tại TQ, đến năm 2000, >3000 ha lúa tại tỉnh Vân Nam áp d ụng ph ương pháp hỗn hợp giống để chống bệnh đạo ôn, TLB giảm 1 – 20 % . Tham khảo : http://199.86.26.56/education/AdvancedPlantPath/Topics/cultivarmixtures/ Tổng hợp nhiều gen kháng trong một giống. Người ta có thể lai các giống mang các gen kháng khác nhau để tạo ra giống chứa nhiều gen kháng. Thông th ường tính kháng của các giống mang nhiều gen kháng chủ thường khá b ền v ững vì tác nhân gây b ệnh không dễ đột biến đồng thời để bẻ gẫy nhiều gen kháng. Tuy nhiên, việc tạo gi ống mang nhiều gen kháng rất phức tạp. 4.1.2. Tính kháng ngang Tính kháng ngang thường do nhiều gen qui định (nên còn đ ược gọi là tính kháng đa gen), mỗi gen đóng góp một mức độ nhỏ vào tính kháng (nên còn đ ược gọi là tính kháng gen thứ). Tính kháng ngang di truyền theo qui luật di truyền số lượng (nên còn được gọi là tính kháng số lượng). Tính kháng ngang qui đinh tính kháng không hoàn toàn nh ưng b ền v ững. Tính kháng ngang không bị bẻ gẫy nhanh và bất thình lình như tính kháng d ọc. Tính kháng ngang liên quan đến nhiều quá trình dẫn tới phản ứng phòng thủ. Tính kháng ngang có m ặt khắp nơi, trên cả cây trồng lẫn cây dại, chống tất cả các ch ủng c ủa tác nhân gây b ệnh kể cả những chủng độc nhất (nên còn được gọi là tính kháng không đặc hiệu). 7
Tính kháng ngang (tính kháng cơ bản ) nhìn chung có mức độ kháng thấp và do đó tạo áp lực chọn lọc thấp lên quần thể tác nhân gây bệnh. Có thể tóm tắt tính kháng dọc và ngang Chỉ tiêu Giống kháng dọc Giống kháng ngang 1.Số lượng gen kháng 1 vài gen kháng (đơn gen) Nhiều gen kháng(đa gen) 2.Tính (chọn lọc) chuyên Rất chuyên tính Không chuyên tính tính của gen kháng 3.Mức độ kháng Thấp Cao 4.Tính ổn định Không bền vững ) Bền vững 5. Kháng đối với thành ít chủng Hầu hết các chủng trong phần chủng trong quần thể quần thể ký sinh ký sinh 6.Tác động của gen khángThúc đẩy sự phát sinh hình Không thúc đẩy sự phát vào quần thể ký sinh (ápthành các nòi, race mới sinh hình thành các nòi race lực chọn lọc) (chủng có độc tính cao mới (quần thể ký sinh ổn hơn) định lâu dài) 8.Phản ứng tự vệ Thường là phản ứng siêu Các phản ứng khác nhau nhạy 9.Di truyền Theo quy luạt di truyền Theo di truyền số lượng Mendel, phần lớn di truyền tính trội 10. Ảnh hưởng của ngoại Ít bị ảnh hưởng Dễ bị ảnh hưởng cảnh 4.2. Lựa chọn gen kháng Việc lựa chọn gen kháng hoặc yếu tố kháng căn cứ vào nhi ều yếu t ố, quan tr ọng nh ất là mức độ đa dạng của quần thể tác nhân gây bệnh, đặc tính gây b ệnh và tính đ ộc của quần thể tác nhân gây bệnh đặc biệt là của các chủng, nòi chi ếm ưu th ế. Ngoài ra các gen được lựa chọn nên có khả năng kháng phổ rộng. • Ví dụ 1. Đối với bệnh đạo ôn ở miền Bắc Việt Nam, các gen kháng Pi-1, Pi-2, Pi- 33, Pi-ta2, Pi-k nên được sử dụng để tạo giống kháng nấm đạo ôn. • Ví dụ 2. Đối với bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam, vì các race 5, 3 và 2 chiếm ứu thế trong quần thể vi khuẩn bạc lá nên các gen kháng xa5, Xa7 và Xa21 nên đ ược sử dụng. • Ví dụ 3. Đối với bệnh xoăn vàng lá cà chua do begomovirus, trong tr ường h ợp s ử dụng kỹ thuật kháng dựa vào RNA silencing, người ta nên chọn các vùng gen ho ặc gen bảo thủ cho cả chi begomovirus, chẳng hạn như đầu C c ủa gen CP ho ặc đ ầu N của gen Rep để tạo các cấu trúc RNA silencing chuyển vào cây cà chua. 8
5. Sử dụng marker phân tử trong chọn tạo giống kháng. Nhiều loại marker phân tử (phổ biến nhất là các marker dựa trên RFLP và PCR) có thể được sử dụng để (i) tìm kiếm gen kháng từ vật liệu khởi đầu (các dòng/gi ống cây trồng hoặc cây dại thu thập được) và để chọn lọc gi ống mang gen kháng t ạo đ ược thông qua lai giống hoặc chuyển gen bằng công nghệ sinh học. Việc kết hợp marker phân tử và các công cụ đánh giá truyền thống khác như lây nhiễm nhân tạo có thể tiết kiệm được rất nhiều thời gian và tiền bạc trong quá trình ch ọn tạo giống kháng. • Ví dụ 1. Đối với bệnh đạo ôn, Wang et al (2007) đã sử d ụng các c ặp m ồi đ ặc hi ệu gen Pi-ta để thử trên 141 mẫu lúa thu thập từ nhiều nơi trên thế giới. Trong số này, 20 mẫu lúa đã được xác định mang gen kháng trội Pi-ta, thu thập ch ủ y ếu ở các nước trồng lúa châu Á (trong đó có giống Tetep – một gi ống c ổ truyền c ủa Vi ệt Nam). • Ví dụ 2. Đối với bệnh bạc lá, Huang et al (1997) đã sử dụng các marker phân t ử dựa vào RFLP và PCR để qui tụ các gen kháng Xa4, xa5, xa13 và Xa21 vào các giống lúa. 6. Đánh giá tính kháng Đối với chọn tạo giống kháng bệnh, việc đánh giá tính kháng luôn là phần quan tr ọng cả trong quá trình chọn lọc cá thể mang gen kháng sau lai ho ặc chuyển gen và c ả trong quá trình tìm kiếm vật liệu khởi đầu. Đánh giá tính kháng đúng yêu cầu 3 yếu tố • Phương pháp lây nhiễm đúng • Điều kiện lây nhiễm đúng • Hệ thống tính điểm chính xác Cả 3 yếu tố trên rất khác nhau tùy thuộc đối tượng nghiên c ứu (c ả cây và tác nhân gây bệnh) • Ví dụ 1. Đối với bệnh bạc lá. Phương pháp lây nhiễm là dùng kéo nhúng vào dung dịch vi khuẩn và cắt trên đỉnh lá lúa. Phản ứng kháng nhiễm sẽ được đánh giá căn cứ chiều dài vết bệnh sau 18 ngày. • Ví dụ 2. Đối với bệnh xoăn vàng lá. Phương pháp lây nhiễm là sử dụng vector b ọ phấn hoặc dùng một kỹ thuật gọi là agroinoculation. Phản ứng kháng nhiễm sẽ được đánh giá dùng thang phân cấp thứ tự (dựa theo mức độ biểu hi ện tri ệu chứng) như trình bày ở bảng dưới 9
Thang phân cấp bệnh xoăn vàng ngọn cà chua Cấp Mô tả Không triệu chứng 0 Biến vàng rất nhẹ ở mép lá chét trên lá đỉnh 1 Biến vàng nhẹ và đỉnh lá chét cuốn nhẹ 2 Biến vàng nhiều, lá cuốn và cuốn và cng thành hình thía. Cây v ẫn 3 sinh trưởng Biến vàng và lùn rất dữ dội; lá cuốn và cong lại thành hình thìa rất 4 rõ. Cây ngừng sinh trưởng. 10