Đồ án phân tích thực phẩm: Tìm hiểu các kỹ thuật kiểm soát chất lượng thành phẩm nước trái cây đóng chai (lon)

MỤC LỤC

LỜI MỞ 2 ĐẦU .................................................................................................

I. TỔNG QUAN VỀ NƯỚC TRÁI CÂY.............................................................3 3 ............................................................................................................ 1. Lịch sử

2. Khái niệm........................................................................................................4

3. Phân 6 loại .........................................................................................................

II. KỸ THUẬT KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG

NƯỚC TRÁI CÂY THÀNH PHẨM.................................................................7 1. Một số kỹ thuật kiểm soát chất lượng nguyên liệu trong sản xuất................7

1.1 Kỹ thuật kiểm soát chất lượng trái cây nguyên liệu.......................................7

1.2 Kỹ thuật kiểm soát chất lượng nước..............................................................9

1.3 Kỹ thuật kiểm soát chất lượng đường.........................................................14

1.4 Kỹ thuật kiểm soát chất lượng phụ gia........................................................17

2. Các kỹ thuật kiểm soát chất lượng nước trái cây thành 18 phẩm ....................

2.1 Phân tích cảm quan bằng phương pháp cho điểm......................................18

2.2 Phân tích các chỉ tiêu hóa lý của sản 22 phẩm .................................................

2.3 Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm..........................................77

III. KẾT 152 LUẬN ..................................................................................................

Tài liệu tham khảo.............................................................................................152

Phụ 155 Lục 1 .........................................................................................................

Phụ Lục 455 ......................................................................................................... 2

LỜI MỞ ĐẦU

Xu hướng nổi lên trong vài năm gần đây là sử dụng các loại nước trái cây và nước trái cây chứa sữa, để bổ sung dưỡng chất cho cơ thể. Việc tiêu thụ đầy đủ trái cây và rau đã trở thành một vấn đề đáng quan tâm trên toàn thế giới, đóng một vai trò quan trọng trong việc đạt được và duy trì sức khỏe tốt. Nghiên cứu đã chứng minh rằng các loại trái cây và rau quả có chứa các thành phần rất quan trọng, giúp giảm nguy cơ phát triển một số bệnh mãn tính. Những lợi ích cho sức khỏe của khoáng chất, vitamin và vi chất dinh dưỡng đã được biết đến từ lâu. Nước trái cây có chứa một loạt các vi chất dinh dưỡng, bao gồm cả số lượng đáng kể khoáng chất, như kali, canxi và magiê. Vitamin có một đặc biệt là rất cần thiết cho sức khỏe nhưng không được sản xuất bởi cơ thể.

Hiện nay, trên thị trường xuất hiện ngày càng nhiều các loại nước trái cây đóng chai (lon), nó đang dần chiếm ưu thế so với các loại thức uống có gas. Theo kết quả nghiên cứu thị trường năm 2004, thị trường nước giải khát không gas tăng 10%/năm trong khi sản lượng nước ngọt có gas tăng 5%/năm. Cho thấy con người ngày càng quan tâm đến sức khỏe, ngày càng chú ý đến các sản phẩm từ thiên nhiên, đăc biệt là các loại nước trái cây và rau củ, là các sản phẩm chứa nhiều dưỡng chất, vitamin, vi chất dinh dưỡng…. Nhờ vào các ưu điểm trên mặt dinh dưỡng cũng như tiện lợi trong sử dụng mà các sản phẩm này ngày càng đa dạng, nhiều chủng loại, đưa đến cho người tiêu dùng nhiều sự lựa chọn. Câu hỏi đặt ra là làm như thế nào để sản phẩm đưa đến cho người tiêu dùng đạt chất lượng mà vẫn đảm bảo cho sức khỏe?? Thì việc kiểm soát chất lượng từ nguyên liệu đầu vào đến kiểm soát chất lượng thành phẩm là rất cần thiết.

Trong bài này chúng ta sẽ “Tìm hiểu các kỹ thuật kiểm soát chất lượng thành

phẩm nước trái cây đóng chai (lon)”.

Trong quá trình tìm hiểu và làm bài không tránh khỏi sai sót, rất mong quý

Thầy(Cô) và các bạn thông cảm, đóng góp ý kiến để bài làm được hoàn thiện hơn!

I. I.1. TỔNG QUAN VỀ NƯỚC TRÁI CÂY Lịch sử

Việc sản xuất nước trái cây thực ra đã có từ rất lâu, thậm chí có thể lâu đời hơn cả nghành nông nghiệp. Khi chín, hầu hết trái cây sẽ mềm dần đến một độ mà khi đó việc lưu trữ hay vận chuyển chúng sẽ tạo ra nhiều nước (tuy nhiên nước này thường lên men một phần). Phần nước có lẫn nhiều thịt quả này có thể tách dễ dàng ra khỏi hạt, vỏ... và thường thì chúng có mùi vị thơm ngon hơn những phần xác còn lại. Những người đi săn bắt hái lượm ngày xưa có thể dùng trực tiếp chúng hay thu nhặt trái cây đã chín mềm vào những thùng không bị rò rỉ để có thể sử dụng về sau. Viêc vận chuyển sớm muộn cũng sẽ tạo ra nước trái cây. Tuy nhiên vào những ngày trời lạnh, việc bảo quản có thể tốt hơn đến vài giờ trước khi bị lên men nên sẽ làm thay đổi đáng kể chất lượng nước trái cây.

Thông qua rất nhiều lần thử, con người đã học được cách tạo ra nước trái cây từ nhiều nguyên liệu khác nhau và quan trọng họ biết tránh được những trái cây nhìn bắt mắt nhưng lại chứa chất độc. Kĩ thuật làm công cụ lao động phát triển đã thúc đẩy việc làm ra những dụng cụ ngâm giầm trái cây và nước trái cây. Những dụng cụ để cất giữ thức ăn, kể cả để đựng nước đã được tạo ra từ nhiều nguồn vật liệu như dệt từ sợi thực vật, làm từ gỗ, đất sét, da hay ruột động vật...

Vì bản chất dễ bị háng của nước trái cây mà yêu cầu đặt ra là sử dụng trong vòng không quá 24h với trời ấm và lâu hơn nếu thời tiết lạnh hơn. Rất lạnh hay đóng băng là giải pháp thay thế duy nhất để điều chỉnh tính chất vi khuẩn bên trong nước trái cây. Sự lên men nước trái cây này là cơ sở cho sản xuất rượu, họ thấy rằng nước trái cây sau khi có bọt một cách bí ẩn đã có những tính chất rất khác ban đầu. Ngoài ra nếu lưu trữ thêm vài ngày nữa thì chúng sẽ chuyển dần sang chua thậm chí sẽ có mùi vị khó chịu và có váng. Thứ giấm nguyên thủy này đã từng được dùng làm chất bảo quả cho các trái cây và rau củ khác.

Với sự phát triển của nghành nông nghiệp (hơn 10 triệu năm trước), những vụ mùa trồng trọt đã gần như đáp ứng được nhu cầu lương thực, thậm chí họ có thể trồng những loại cây cho trái cây thích hợp với việc sản xuất nước trái cây nói riêng và thức uống nói chung. Nước trái cây sau khi ép nếu không dùng ngay sẽ bị lên men, điều này tiếp tục xảy ra cho đến khi những công nghệ bảo quản được ra đời. Thực ra khái niệm bảo quản ở đây là bảo quản trái cây dùng để sản xuất nước trái cây ở dạng nguyên thủy cho đến khi cần sản xuất nước trái cây. Thậm chí ngày nay việc bảo quản như thế là một trong những cách đơn giản nhất để đảm bảo cho chất lượng của nước trái cây.

I.2. Các khái niệm

Theo TCVN 7946-2008 ( tương đương với CODEX STAN 247-2005):

2.1 Nước quả (fruit juices):

Là dịch lỏng chưa bị lên men nhưng có thể lên men thu được từ phần ăn được của quả, còn lành lặn, có độ chín thích hợp và quả tươi hay quả được bảo quản trong điều kiện thích hợp kể cả phương pháp xử lý bề mặt sau thu hoạch được áp dụng theo các điều khoản thích hợp hiện hành.

Một vài loại nước quả có thể được xử lý cùng với hạt, hạt và vỏ, nhưng phần lớn không có trong nước quả, chỉ cho phép có một lượng nhỏ khi không thể loại bỏ bằng thực hành sản xuất tôt (GMP).

Nước quả đã xử lý thích hợp, cần được duy trì tính chất vật lý, hóa học, cảm quan và các đặc tính dinh dưỡng của nước quả tự nhiên. Nước quả có thể đục hay trong và có thể khôi phục lại1 các chất thơm và thành phần hương dể bay hơi từ cùng một loại quả bằng các biện pháp vật lý phù hợp. Có thể được bổ sung thịt quả và tế bào2 từ cùng một loại quả bằng những biện pháp vật lý thích hợp. Nước quả có thể thu được từ một loại quả. Nước quả hỗn hợp là loại thu được bằng cách trộn lẫn hai hoặc nhiều loại nước quả hoặc nước quả và puree từ các loại quả khác nhau.

Nước quả thu được theo cách sau:

­ Nước quả thu được trực tiếp bằng phương pháp chiết bằng biện pháp vật lý. ­ Nước quả thu được từ việc hoàn nguyên nước quả cô đặc cùng với nước. 2.2 Nước quả cô đặc:

Là sản phẩm phù hợp với thuật ngữ nêu trong 2.1, đã loại bỏ một lượng nước vừa đủ bằng biện pháp vật lý để làm tăng độ Brix đến giá trị ít nhất là 50 % cao hơn giá trị Brix đã được thiết lập đối với nước quả hoàn nguyên từ cùng một loại quả, như trong Phụ lục. Trong quá trình sản xuất nước quả cô đặc, sử dụng biện pháp thích hợp và có thể kết hợp đồng thời với khuếch tán tế bào hoặc thịt quả bằng nước miễn là các chất rắn của quả có thể chiết được bằng nước được cho vào nước quả ban đầu trước khi tiến hành cô đặc.

Nước quả cô đặc có thể khôi phục lại1 được chất thơm và các thành phần hương dễ bay hơi từ cùng một loại quả, bằng các biện pháp vật lý thích hợp. Có thể được bổ sung thịt quả và tế bào2 từ cùng một loại quả bằng biện pháp vật lý thích hợp.

2.3 Nước quả trích ly

Nước quả trích ly sản phẩm thu được bằng khuếch tán các thành phần sau đây

1 Cho phép bổ sung hương thơm và mùi vị để khôi phục lại của các thành phần này lên đến mức chuẩn từ cùng một loại quả. 2 Đối với cam quýt, thịt quả hoặc tế bào là các tép nước quả chứa bên trong vỏ quả.

với nước:

- toàn bộ thịt quả có nước nhưng không thể tách trực tiếp bằng biện pháp vật lý, hoặc

- toàn bộ quả đã khử nước.

Các sản phẩm đó có thể được cô đặc và hoàn nguyên.

Hàm lượng chất rắn của thành phẩm cần đáp ứng được bộ Brix tối thiểu đối với nước quả hoàn nguyên được qui định trong Phụ lục.

2.4 Puree quả sử dụng trong sản xuất nước quả và nectar

Puree quả trong sản xuất nước quả và nectar là sản phẩm chưa bị lên men nhưng có thể lên men thu được bằng biện pháp thích hợp, ví dụ bằng cách nghiền, xay, lọc phần có thể ăn được của quả hay phần vỏ quả mà chưa ép nước. Quả phải lành lặn, có độ chín thích hợp và tươi hoặc được bảo quản bằng các biện pháp vật lý hoặc áp dụng cách xử lý theo các điều khoản thích hợp hiện hành.

Puree quả có thể khôi phục lại1 được chất thơm và các thành phần hương dễ bay hơi từ cùng một loại quả và tất cả phải được thu lại bằng các biện pháp vật lý thích hợp. Có thể bổ sung thịt quả và tế bào2 từ cùng một loại quả bằng biện pháp vật lý thích hợp.

2.5 Puree quả cô đặc sử dụng trong sản xuất nước quả và nectar

Puree quả cô đặc được sử dụng trong sản xuất nước quả và nectar thu được bằng biện pháp vật lý để loại bỏ một lượng nước vừa đủ từ puree quả để làm tăng độ Brix tới giá trị ít nhất là 50 % cao hơn giá trị Brix đã được thiết lập đối với nước quả hoàn nguyên từ cùng một loại quả, như chỉ dẫn trong Phụ lục.

Puree quả cô đặc có thể khôi phục lại1 được chất thơm và các thành phần hương dễ bay hơi từ cùng một loại quả và tất cả phải được thu lại bằng các biện pháp vật lý thích hợp.

2.6 Nectar quả

Nectar quả chưa bị lên men nhưng có thể lên men bằng cách thêm nước, có bổ sung hoặc không bổ sung đường [Đường theo quy định của TCVN 7968:2008 (CODEX STAN 212-1999)], mật ong và/hoặc xirô [được quy định trong TCVN 7968:2008 (CODEX STAN 212-1999)], và/hoặc chất phụ gia tạo ngọt được liệt kê trong Tiêu chuẩn chung về phụ gia thực phẩm (GSFA). Tất cả các chất thơm, thành phần hương dễ bay hơi, thịt quả và tế bào2 phải được khôi phục lại cho cùng một loại quả và được thu lại bằng các biện pháp vật lý thích hợp bổ sung. Ngoài ra, sản phẩm phải đáp ứng các yêu cầu qui định đối với nectar quả nêu trong Phụ lục.

Nectar quả hỗn hợp thu được từ hai hay nhiều loại quả khác nhau.

I.3. Phân loại

Nước trái cây là nước được chiếc từ dịch trái cây, nên có giá trị dinh dưỡng cao do

đây là nơi tập trung các thành phần như glucid, acid hữu cơ, vitamin.

Người ta thường phân loại nước trái cây theo nhiều cách:

Dựa vào quy mô chế biến

­ Nước trái cây quy mô gia đình: là nước trái cây được chế biến tại gia đình nhằm mục đích giải khát và cung cấp một nguồn dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể như vitamin, khoáng, đường, bổ sung chất xơ... ngoài ra còn có tác dụng thanh nhiệt, tiêu hóa thức ăn, lợi tiểu...

Ưu điểm:

(cid:0) Giàu dinh dưỡng (cid:0) Có thể chế biến cho phù hợp với nhu cầu.

Nhược điểm:

(cid:0)

(cid:0) Hình thức về màu sắc không sinh động. Sản phẩm để lâu có thể bị lắng tạo cặn đối với loại nước ép.

(cid:0) Cần quan tâm đến vấn đề trái cây theo mùa để chọn loại trái cây cho phù hợp. ­ Nước trái cây quy mô công nghiệp: cũng như nước trái cây quy mô gia đình, sản xuất nước trái cây quy mô công nghiệp với mục đích giải khát, dinh dưỡng và chữa bệnh. Tuy nhiên về mặt dinh dưỡng thì thấp hơn do trong quá trình chế biến, một số chất dinh dưỡng đã mất đi nên nó được dùng chủ yếu với mục đích giải khát. Nước trái cây đóng chai(lon) rất tiện lợi, thích hợp cho cuộc sống bận rộn ngày nay.

Ưu điểm:

(cid:0)

(cid:0) Thuận tiện, tiết kiệm thời gian cho người sử dụng. Thích hợp cho nhiều đối tượng.

(cid:0) Giá thành tương đối rẻ. (cid:0)

(cid:0) Hình thức đa dạng, sinh động hấp dẫn. Tùy theo hướng đối tượng khách hàng.

(cid:0) Màu sắc, hương vị lôi cuốn.

Dựa vào phương pháp chế biến

­ Nước trái cây tự nhiên: là sản phẩm được chế biến từ một loại trái cây không pha thêm đường hoặc bất cứ phụ gia nào. Nước trái cây tự nhiên dùng để uống trực tiếp hoặc chế biến các loại nước ngọt, rượu mùi. Nước các loại quá chua khi uống phải thêm đường. Có 2 loại là nước ép và dịch quả nghiền (puree).

­ Nước trái cây hỗn hợp: là sản phẩm được chế biến từ hai hay nhiều loại quả pha trộn

với nhau. Lượng nước quả pha thêm không quá 35% so với nước quả chính.

­ Nước trái cây pha đường: là sản phẩm được chế biến bằng cách phối chế nước trái cây

tự nhiên với syrup.

­ Nước trái cây cô đặc: chế biến bằng cách cô đặc nước ép quả tự nhiên theo phương

pháp đun nóng (bốc hơi) hay phương pháp lạnh đông (tách nước đá).

Nước trái cây cô đặc có lợi đỡ tốn bao bì, kho hàng, vận chuyển và ít bị vi sinh vật làm háng.

Theo phương pháp bảo quản

­ Nước trái cây thanh trùng: là dạng sản phẩm được đóng vào bao bì kín và được thanh

trùng bằng nhiệt (có thể thanh trùng trước hoặc sau khi rót vào bao bì).

2

2

: là dạng nước trái cây được nạp khí CO để ức chế hoạt động ­ Nước trái cây nạp khí CO

của vi sinh vật.

Theo trạng thái sản phẩm

­ Nước trái cây dịch trong: loại này được chế biến bằng cách tách dịch bào ra khỏi mô quả

bằng phương pháp ép, sau đó được lắng lọc triệt để.

­ Nước trái cây dạng đục: loại này cũng chế biến bằng cách tách dịch bào ra khỏi mô quả

bằng phương pháp ép, sau đó được lắng lọc một phần.

Nước trái cây nghiền: dạng sản phẩm này được chế biến bằng cách nghiền mịn mô

quả cùng dịch bào rồi pha thêm đường, acid thực phẩm cùng 1 số phụ gia khác.

II.

CÁC KỸ THUẬT KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG NƯỚC TRÁI CÂY THÀNH PHẨM

Như đã nói ở đầu bài, để có được sản phẩm nước trái cây có chất lượng mà vẫn đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng thì việc kiểm soát chất lượng từ nguyên liệu đến thành phẩm là rất quan trọng. Trước khi đi kiểm soát chất lượng thành phẩm, em sẽ giới thiệu sơ qua một số các kỹ thuật kiểm soát chất lượng nguyên liệu trong sản xuất nước trái cây.

1. Một số phương pháp kiểm soát chất lượng nguyên liệu trong sản xuất 1.1 Kỹ thuật kiểm soát chất lượng trái cây nguyên liệu

Bảng 1: Một số tiêu chuẩn cho trái cây được chọn làm nguyên liệu

Yếu tố Tiêu chuẩn Ảnh hưởng

Độ chín Chín Chất lượng tối ưu

Độ cứng Mức độ thích hợp Hiệu suất và vị

Độ chua pH thích hợp Mùi vị, tỉ lệ đường/acid

Màu Đã phát triển đầy đủ Cảm quan của sản phẩm

Đồng đều nhau Thuận tiện cho chế biến Kích thước/hình dáng

Đã được phân tích trước Phương pháp chế biến và chất lượng Thành phần hóa học đặc trưng

Dư lượng thuốc trừ sâu Được kiểm soát theo pháp lý Sự an toàn và tính pháp lý của sản phẩm

Mức độ cho phép Giới hạn hợp lý Yếu tố lạ bên ngoài

Không có hoặc ít Sự an toàn và ổn định cho nước trái cây Số lượng vi sinh vật

lượng Dưới mức cho phép An toàn cho nước trái cây Hàm aflatoxin

Trái cây nguyên liệu thường được lựa chọn theo kinh nghiệm (cảm quan sản

phẩm). Nguyên liệu phải đồng đều về kích thước, hình dạng, màu sắc, độ chín.

Kích thước và độ lớn: nguyên liệu cần đạt được kích thước trung bình của giống phát triển bình thường, những cá thể có kích thước quá nhỏ hoặc quá to đều phải loại ra.

Độ chín: khi đưa vào sản xuất, nguyên liệu cần đạt đến giai đoạn chín toàn phần. Ở độ chín này, lượng dịch bào là nhiều nhất và các thành phần hóa học chứa trong dịch cũng nhiều nhất.

Mức độ nguyên vẹn: Trong thu hoạch, vận chuyển, bảo quản, nguyên liệu có thể bị xây xát, dập nát, thối rữa đó là nơi vi sinh vật xâm nhập và phát triển trên trái. Chính vì vậy, trước khi chế biến cần loại bỏ những trái bị thối rữa hoàn toàn, hoặc cắt bỏ những phần hỏng. Chỉ tiêu này chỉ có thể phân loại bằng thủ công.

­ Phân loại bằng thủ công

Lựa chọn nguyên liệu bằng tay trên băng tải vận chuyển, công nhân đứng dọc hai

bên băng tải và lựa chọn theo kinh nghiệm các chỉ tiêu nguyên liệu đã đặt ra.

Băng tải con lăn có khả năng lật mọi phía của quỹ đạo nhờ đó có thể đễ dàng phát hiện những vết hư.

Kích thước băng tải: 60-80cm.

Tốc độ băng tải: 0.12 – 0.15m/s

Nguyên liệu phải được dàn máng để lựa chọn không bỏ sót.

­ Phân loại bằng máy

Máy phân loại dựa vào kích thước và hình dạng:

Nguyên liệu theo băng tải lần lượt đi qua các cửa có kích thước thay đổi từ nhỏ đến lớn. kích thước này được xác định bằng khoảng cách giữa con lăn và băng tải. Nhờ vào chiều quay con lăn mà những quả có kích thước đúng kích thước cửa sẽ được đẩy ra ngoài máng hứng.

+ Máy phân loại dựa vào khối lượng: nhờ vào cân cảm ứng

Máy phân loại cỡ kiểu rây lắc: máy có nhiều tầng rây, có cỡ mắc khác nhau, tầng trên cùng mắc rộng nhất, tầng cuối cùng mắc nhỏ nhất. Hệ thống rây chuyển động bằng bộ phận chấn động. Máy này dùng để phân loại trái có kích thước nhỏ như mơ, mận,...

+ Máy phân loại cỡ kiểu trục tròn: bộ phận phân loại là những cặp trục hình côn, thường dùng để phân loại trái tròn như cam, chanh, bưởi...

Ngoài ra chất lượng trái cây còn được phân tích bằng các phương pháp hóa lý, vi sinh để xác định các chỉ tiêu chất lượng rau quả. Một số tiêu chuẩn nghành quy định phân tích rau quả như “10TCN 711:2006” và “10TCN 712:2006”.

1.2 Kỹ thuật kiểm soát chất lượng nước

Nước sử dụng để chế biến nước trái cây phải đáp ứng các yêu cầu theo QCVN 01:2009/BYT về chất lượng nước ăn uống được ban hành kèm theo Thông tư số 04/2009/TT-BYT ngày 17/6/2009 của Bộ trưởng Bộ Y tế.

Dưới đây là bảng giới hạn một số các chỉ tiêu quan trọng và các tiêu chuẩn, kỹ

thuật với các phương pháp xác định trong việc kiểm tra chất lượng nước:

1.

STT Tên chỉ tiêu Phương pháp thử Giới hạn tối đa cho Đơn vị Tiêu chuẩn áp dụng I. Chỉ tiêu cảm quan và thành phần vô cơ

2.

Màu sắc TCU 15 TCVN 6185:2008

3.

Mùi vị - Không có mùi, vị lạ

4.

Độ đục NTU 2 TCVN 6184:2008

5.

pH -

3

Trong khoảng 6,5-8,5 300 mg/l Độ cứng, tính theo CaCO TCVN 6185 - 1996 (ISO 7887 - 1985) hoặc SMEWW 2120 Cảm quan, hoặc SMEWW 2150 B và 2160 B TCVN 6184 - 1996 (ISO 7027 - 1990) hoặc SMEWW 2130 B TCVN 6492:1999 hoặc SMEWW 4500 - H+ TCVN 6224 - 1996 hoặc SMEWW 2340 C TCVN 6492:2011 TCVN 6224:1996

6.

7.

250 Hàm lượng Clorua mg/l TCVN 6194:1996

8.

mg/l 0,3

9.

mg/l 0,3 Hàm lượng Sắt tổng số (Fe2+ + Fe3+) Hàm lượng Mangan tổng số TCVN 6177:1996 TCVN 6002:1995 TCVN6194 - 1996 (ISO 9297 - 1989) hoặc SMEWW 4500 - TCVN 6177 - 1996 (ISO 6332 - 1988) hoặc SMEWW 3500 - TCVN 6002 - 1995 (ISO 6333 - 1986)

10.

Hàm lượng Nitrat mg/l 50 TCVN 6180:1996 TCVN 6180 - 1996 (ISO 7890 -1988)

11.

Hàm lượng Nitrit mg/l 3 TCVN 6178 - 1996 (ISO 6777-1984) TCVN 6178:1996

Hàm lượng Sunphát mg/l 250 TCVN 6200:1996 TCVN 6200 - 1996 (ISO9280 - 1990)

12.

số mg/l 2 Chỉ Pecmanganat TCVN 6186:1996 hoặc ISO 8467:1993 (E) TCVN 6186:1996

13.

II. Vi sinh vật

Coliform tổng số 0 TCVN 6187_1:200 9 TCVN 6187 - 1,2 :1996 (ISO 9308 - 1,2 - 1990) hoặc SMEWW 9222 Vi khuẩ n/10 0ml

14.

hoặc 0 E.coli Coliform chịu nhiệt TCVN 6187_1:200 9 TCVN6187 - 1,2 : 1996 (ISO 9308 - 1,2 - 1990) hoặc SMEWW 9222 Vi khuẩ n/10 0ml

1.2.1 Màu sắc (dựa theo TCVN 6185-2008):

a) Phương pháp trực quan: Nguyên tắc của phương pháp này là xác định cường độ màu nâu ánh vàng của mẫu bằng cách so sánh bằng mắt dựa vào một dãy các dung dịch so sánh hoặc với một dãy các kính chuẩn cố định.

Biểu thị màu sắc theo đơn vị mg/lít Pt3 tương ứng với cường độ màu theo các dung dịch so sánh.

b) Phương pháp trắc phổ: Nguyên tắc của phương pháp này là Mô tả đặc điểm về cường độ màu của mẫu nước bằng cách đo độ giảm cường độ (độ hấp thụ) của ánh sáng. Các màu khác nhau tạo ra độ hấp thụ cực đại ở các bước sóng khác nhau của bức xạ tới và bước sóng có độ hấp thụ cực đại phải được xác định trước khi đo độ giảm cường độ (độ hấp thụ) ở bước sóng đó. Theo tiêu chuẩn này, màu của nước được xác định bằng máy đo quang hoặc máy đo phổ tại ít nhất ba bước sóng khác nhau. Các bước sóng này được phân bố đều trên dải phổ nhìn thấy được.

(cid:0) (1) = 436 nm

(cid:0) (2) = 525 nm

(cid:0) (3) = 620 nm

Bước sóng (cid:0) (2) và (cid:0)

= 436 nm (Hg 436 nm) thường được sử dụng, trong khi (cid:0)  (3) có thể chênh lệch ít so với giá trị quy định ở trên, tùy thuộc vào loại kính lọc sử dụng. Để mô tả đặc điểm tốt hơn, có thể tiến hành các phép đo tại một số bước sóng gắn với độ hấp thụ cực đại.

3 Đơn vị chuẩn (của màu) mg/l : Màu sắc được tạo ra do dung dịch chứa 1mg platin trên 1 lít {( dưới

dạng hidro hexacloplatinat (IV)}, với sự có mặt của 2mg coban (II) clorua ngậm 6 phân tử nước trên

1 lít.

1.2.2 Xác định độ đục (dựa theo TCVN 6184:2008)

Độ đục là sự giảm độ trong của một chất lỏng do sự có mặt của các chất không tan.

Phép đo độ đục có thể bị sai lệch do sự có mặt của các chất hòa tan hấp thụ ánh sáng (các chất truyền màu). Tuy nhiên có thể hạn chế các ảnh hưởng đó bằng cách tiến hành đo ở các bước sóng lớn hơn 800 nm. Chỉ có màu xanh lam ở một số nơi nước bị ô nhiễm có ảnh hưởng nhẹ lên phép đo độ đục trong vùng phổ này. Các bọt khí có thể gây trở ngại cho phép đo nhưng ảnh hưởng này có thể hạn chế bằng cách xử lý mẫu cẩn thận.

a) Phương pháp do dùng ống thử độ trong: Ống thử độ trong bao gồm một ống thủy tinh không màu dài 800 mm (cid:0)  10 mm và đường kính trong 25 mm ± 1 mm có vạch chia là 10 mm. Vành chắn gắn khít để bảo vệ ống thử độ trong khỏi ánh sáng bên ngoài. Vật đánh dấu đặt bên dưới ống thử độ trong, gồm dấu in đen trên nền trắng (độ cao của ký tự 3,5 mm, đường nét độ rộng 0,35 mm); hoặc dấu thử (ví dụ như dấu chữ thập đen trên giấy trắng) được cung cấp cùng dụng cụ. Nguồn sáng không đổi đèn tungsten có hiệu điện thế thấp, công suất 3W dùng để chiếu sáng mẫu in hoặc dấu thử. Ống thử được đưa từ từ xuống mực nước mẫu tới khi dấu in hoặc dấu thử có thể thấy rõ từ phía trên. Đọc số đo chiều cao của cột chất lỏng trên ống thử chia độ và thu số liệu đem tính kết quả.

b) Đo bức xạ khuyết tán:

Nguyên tắc của phương pháp này là mẫu nước được nhuộm màu bởi các chất hòa tan tạo thành hệ đồng nhất và chỉ làm suy giảm bức xạ truyền qua mẫu. Mẫu nước chứa các chất không hòa tan suy giảm các bức xạ và hơn nữa các hạt không tan tạo ra bức xạ khuyếch tán không đồng đều ở mọi hướng. Sự khuyếch tán bức xạ do các hạt ảnh hưởng tới sự suy giảm bức xạ do vậy hệ số giảm phổ chung µ((cid:0) ) bằng tổng của hệ số khuyếch tán phổ s((cid:0) ) và hệ số hấp thụ phổ (cid:0) ((cid:0) ).

µ((cid:0) ) = s((cid:0) ) + (cid:0) ((cid:0) )

Để tìm được hệ số khuyếch tán phổ s((cid:0) ) cần biết hệ số hấp thụ phổ (cid:0) ((cid:0) ). Để xác định hệ số hấp thụ phổ của chất hòa tan, trong một số trường hợp có thể lọc loại bỏ các chất không tan, nhưng có thể gây nhiễu. Do vậy, cần phải báo cáo kết quả xác định độ đục trên cơ sở so sánh với chuẩn đã hiệu chuẩn.

Cường độ của bức xạ khuyếch tán phụ thuộc vào bước sóng của các bức xạ tới, góc đo và hình dạng, đặc tính quang học, kích cỡ hạt và sự phân bố hạt lơ lửng trong nước.

o

Khi đo độ suy giảm của bức xạ phát, giá trị đo được phụ thuộc vào góc mở (cid:0) của hiệu

ứng bức xạ nơi nhận.

. Góc (cid:0)  là góc o

Khi đo độ bức xạ khuyếch tán, giá trị đo phụ thuộc góc (cid:0)  và góc mở (cid:0) tạo bởi hướng của bức xạ tới và hướng của bức xạ khuyếch tán đã đo (xem hình 1).

Hình 1

Việc ứng dụng để đo nồng độ các chất không tan chỉ thực hiện được khi biết rõ các thông số trên. Nói chung các thông tin này là không có sẵn do đó nồng độ khối lượng của các hạt lơ lửng không thể tính được từ giá trị đo độ đục.

Chú thích 1: Sự so sánh giữa các dụng cụ chỉ có thể khi thiết bị được sử dụng phù hợp với tiêu chuẩn này và áp dụng nguyên tắc đo giống nhau;

Chú thích 2: Nếu đo độ đục Jackson là thiết bị tiêu chuẩn đầu tiên dùng đo độ đục. Nhìn chung, đơn vị đo độ đục Jackson (JTU) không thể đổi sang đơn vị đo độ đục khác.

1.2.3 Xác định giá trị pH (dựa vào TCVN 6492:2011)

Phép đo giá trị pH của nước rất quan trọng đối với nhiều loại mẫu. Giá trị pH cao và thấp độc trực tiếp hoặc gián tiếp đối với các loài sinh vật thủy sinh. Giá trị pH là thông số hữu ích nhất trong đánh giá các đặc tính ăn mòn của một môi trường nước. Do vậy, phép đo pH là quan trọng đối với việc vận hành hiệu quả và kiểm soát quá trình xử lý nước (ví dụ quá trình kết bông và khử trùng bằng clo), kiểm soát chì hòa tan trong nước uống và xử lý sinh học nước cống và quá trình thải nước cống.

Phương pháp điện cực đề cập trong tiêu chuẩn này được dựa trên phép đo sự chênh lệch thế của điện cực điện hóa khi một trong hai nửa điện cực là một điện cực đo và điện cực còn lại là điện cực so sánh. Thế của điện cực đo là một hàm số của ion hydro hoạt động của dung dịch đo.

Nguyên tắc của phương pháp này là xác định giá trị pH dựa trên việc đo hiệu điện thế của pin điện hóa khi dùng một pH-mét phù hợp. pH của mẫu cũng phụ thuộc vào nhiệt độ của trạng thái cân bằng điện giải. Do vậy, nhiệt độ của mẫu luôn luôn được ghi cùng với phép đo giá trị pH.

3

1.2.4 Xác định độ cứng, tính theo CaCO (dựa vào TCVN 6224:1996)

Nguyên tắc của phương pháp này là chuẩn độ tạo phức canxi và magiê với dung dịch nước của muối dinatri của EDTA ở pH 10. Dùng modan đen 11 làm chỉ thị. Chỉ thị này tạo hợp chất màu đỏ hoặc tím với ion canxi và magiê.

Trong quá trình chuẩn độ EDTA trước hết phản ứng với các ion canxi và magiê tự do, sau đó ở điểm tương đương phản ứng với các ion canxi và magiê đã liên kết với chất thỉ thị giải phóng chỉ thị và làm màu dung dịch đổi từ đỏ sang tím sang xanh.

Kết quả được thể hiện dưới dạng nồng độ. Nếu hàm lượng canxi được xác định riêng thì có thể tính nồng độ magiê.

1.2.5 Xác đinh clorua – phương pháp Mo (dựa theo TCVN 6194:1996)

Nguyên tắc của phương pháp này là phản ứng của ion clorua với ion bạc thêm vào tạo thành kết tủa bạc clorua không hòa tan. Việc thêm dù một lượng nhỏ ion bạc tạo thành cromat màu nâu đỏ với ion cromat được thêm làm chất chỉ thị. Phản ứng này được dùng để nhận biết điểm kết thúc. Độ pH được duy trì trong khoảng từ 5 đến 9,5 trong suốt quá trình lọc để chuẩn độ.

1.2.6 Xác định sắt bằng phương pháp trắc phổ dùng thuốc thử 1.10-phenantrolin

(dựa theo TCVN 6177:1996)

Nguyên tắc của phương pháp này là thêm dung dịch 1.10- phenantrolin vào lượng mẫu và đo độ hấp thu của phức chất màu da cam-đỏ ở bước sóng bằng 510 nm. Nếu xác định lượng sắt tổng hoặc tổng sắt hoà tan, them hydroxyl- amoni clorua dể khử sát (II) đến sắt (III). Nếu có sắt không tan, oxyt sắt hoặc phức chất sắt, cần phải xử lý sơ bộ để hoà tan các chất đó.

Phức chất sắt (II)- 1.10- phenantrolin bền trong khoảng pH từ 2.5 đến 9 và màu sắc tỷ lệ với hàm lượng Fe(II). Quan hệ giữa nồng độ sắt và độ hấp thu là tuyến tính với nồng độ sắt nhỏ hơn 5.0 mg/l. Độ hấp thu cao nhất khi đo ở l = 510 nm {hệ số hấp thu phân tử 11x103l (mol.cm)}

1.2.7 Xác định mangan – phương pháp trắc quang dùng fomaldoxim (dựa theo TCVN 6002:1995)

Nguyên tắc: Thêm dung dịch fomaldoxim vào mẫu thử và đo quang phức màu đỏ da cam ở bước sóng khoảng 450nm. Nếu mangan tồn tại dưới dạng huyền phù hoặc liên kết với các hợp chất hữu cơ, cần phải xử lý trước để chuyển mangan thành dạng phản ứng được với fomaldoxim. Phức chất mangan fomaldoxim bền ở pH giữa 9,5 và 10,5 và cường độ màu tỷ lệ với lượng mangan có trong dung dịch. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ đạt tới nồng độ mangan 5mg/l. Hấp thụ cực đại ở khoảng 450nm (hệ số hấp thụ mol là 11 x 103l/mol.cm).

1.2.8 Xác định Nitrat – phương pháp trắc phổ dùng axit sunfosalixilic (dựa theo TCVN 6180:1996)

Nguyên tắc: Đo phổ của hợp chất màu vàng được hình thành bởi phản ứng của axit sunfosalixylic (được hình thành do việc thêm natri salixylat và axit sunfuric vào mẫu) với nitrat và tiếp theo xử lý với kiềm. Dinatri dihidro etylendinitrilotetraaxetat (EDTANa) được thêm vào với kiềm để tránh kết tủa các muối canxi và magie. Natri nitrua được thêm vào để khắc phục sự nhiễu của nitrit.

1.2.9 Xác định Nitrit – phương pháp trắc phổ hấp thụ phân tử (dựa theo TCVN 6178:1996)

Nguyên tắc: Phản ứng của nitrit trong mẫu thử với thuốc thử 4 -aminobenzen sufonamid với sự có mặt của axit octhophosphoric ở pH bằng 1.9 để tạo muối diazo, mà muối này sẽ tạo thuốc nhuộm màu hồng với N-(1 naphtyl)- 1.2 diamonietan

dihidroclorua (được thêm vào bằngthuốc thử 4 - aminobenzen sufonamid. Đo độ hấp thu ở 540 nm.

1.2.10 Xác định sunfat – phương pháp trọng lượng sử dụng Bari clorua (dựa theo TCVN 6200:1996)

Nguyên tắc: Axit hoá mẫu bằng axit clohidric bằng cách đun sôi với dung dịch bari clorua ít nhất 20 phút để tăng sự kết tủa bari sunfat lọc qua phễu lọc thuỷ tinh xốp, rửa hết clorua khỏi kết tủa, sấy ở 1050C và cân lại khi đã nguội. Sự tăng khối lượng của phễu do kết tủa bari sunfat được tạo thành do phản ứng của ion bari và ion sunfat có trong mẫu.

1.2.11 Xác định chỉ số Pemanganat (dựa vào TCVN 6186:1996)

Nguyên tắc: Đun nóng mẫu thử trong nồi cách thủy với một lượng kali pemanganat và axit sunfuric đã biết trong khoảng thời gian nhất định (10 phút). Khử phần pemanganat bằng chất có khả năng oxi hóa trong mẫu và xác định lượng pemanganat đã dùng bằng việc thêm dung dịch oxalat dư, sau đó chuẩn độ với pemanganat.

1.2.12 Phát hiện và đếm Escherichia coli và Coliform – phương pháp lọc màng (dựa theo TCVN 6187-1:2009)

Phương pháp này dựa trên sự lọc qua màng và gồm hai phần là Phép thử Tiêu chuẩn làm đối chứng và Phép thử Nhanh tùy chọn có thể tiến hành song song như sau. Phép thử Tiêu chuẩn gồm việc ủ màng trong môi trường chọn lọc sau đó lấy đặc trưng sinh hóa của các khuẩn lạc dương tính lactoza điển hình để phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform và E. coli trong hai ngày đến ba ngày. Phép thử Nhanh gồm hai bước ủ cho phép phát hiện và đếm E. coli trong vòng (21 ± 3) h. Nếu hai cách thử này được tiến hành song song thì kết quả cuối cùng E. coli là cao hơn.

1.3 Kỹ thuật kiểm soát chất lượng đường

Đường sử dụng trong chế biến nước trái cây phải đáp ứng phù hợp với tiêu chuẩn TCVN 7968:2008 (tương đương với CODEX STAN 212:1999). Đường cần được chế biến và xử lý theo các điều khoản thích hợp của TCVN 5603:2008 (CAC/RCP 1-1969, Rev.4 - 2003) Quy phạm thực hành về những nguyên tắc chung đối với vệ sinh thực phẩm và các Quy phạm thực hành vệ sinh và Quy phạm thực hành khác có liên quan.

Bảng 2: Tiêu chuẩn đường (Theo Codex)

Tên chỉ tiêu Yêu cầu

Màu sắc Trắng

Mùi Không có mùi lạ

Vị Ngọt thuần khiết

Hàm lượng chất khô Lớn hơn 99,7%

2

SO Không vượt quá 15 mg/kg

Hàm lượng các ion kim loại Không tồn tại

­ Mức tối đa cho phép đối với lưu huỳnh dioxit trong thành phẩm như sau:

Đường

Mức tối đa cho phép (mg/kg) 15 Đường trắng

15 Đường bột

15 Dextroza khan

15 Dextroza ngậm một phân tử nước

15 Dextroza bột

15 Fructoza

20 Đường trắng mịn

20 Đường nâu mịn

20 Xirô glucoza

20 Xirô glucoza khô

150

400

Xirô glucoza khô được dùng để sản xuất bánh kẹo có đường Xirô glucoza được dùng để sản xuất bánh kẹo có đường Lactoza Không

70 Đường trắng đồn điền hoặc đường trắng nghiền

20 Đường thô mía

(cid:0) ­  Các chất chống đông vón sau đây được phép sử dụng trong đường bột và dextroza bột với mức tối đa 1,5 % khối lượng đơn lẻ hoặc kết hợp, với điều kiện là không có mặt của tinh bột. Canxi phosphat, hoá trị 3

(cid:0) Magiê cacbonat (cid:0)

(cid:0)

Silic dioxit, không kết tinh (silica gel đã khử nước) Canxi silicat (cid:0) Magiê trisilicat (cid:0)

(cid:0) Natri aluminosilicat Canxi aluminosilicat

Đường bột và dextroza bột có thể có hàm lượng tinh bột lên đến 5% nếu không sử dụng chất chống đông vón.

Đường mía thô không được chứa kim loại nặng với các lượng có thể gây nguy hại đến sức khoẻ con người.

Một số các phương pháp xác định các chỉ tiêu trong việc kiểm soát chất lượng đường:

1.3.1

2

mức tối đa 70 mg/kg Tiêu chuẩn TCVN 7270:2003 về các yêu cầu vệ sinh dành cho đường trắng và đường tinh luyện đã đưa ra các yêu cầu vệ sinh và các phương pháp thử các chỉ tiêu quan trọng của đường như sau: ­ Yêu cầu vệ sinh: Dư lượng SO

­ Các chất nhiễm bẩn: Asen (As) 1 mg/kg, Đồng (Cu) 2 mg/kg, Chì (Pb) 0,5 mg/kg ­ Vi sinh vật

Tên chỉ tiêu Yêu cầu

1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, CFU/10g, không lớn hơn 200

2. Nấm men, CFU/10 g, không lớn hơn 10

3. Nấm mốc, CFU/10g, không lớn hơn 10

­ Phương pháp thử

2

(cid:0) Xác định SO , theo TCVN 6329 : 2001 được thay bằng TCVN 6329:2008: Nguyên tắc

Màu của phức chất sulrt/rosanilin được đo ở bước sóng gần 560 nm sau khi phản ứng với formaldehyd.

(cid:0) Xác định asen trong sản phẩm đường tinh luyện bằng phương pháp so màu, theo TCVN 7274 : 2003: Nguyên tắc phương pháp này dựa trên sự hình thành phức chất màu ở dạng asenua hydro khi asen được sục vào dung dịch bạc dietyldithiocacbamat trong pyridin. Dung dịch mẫu được xử lý bằng hydro mới chế theo phương pháp Gutzeit tạo thành hydro sunfua và asen hydrua. Hydrua sunfua được hấp thụ bằng chì axetat và asen hydrua được cuốn theo dòng khí hydro khi cho sục vào dung dịch bạc dietyldithiocacbamat trong pyridin để tạo thành phức chất màu đỏ.

(cid:0) Xác định asen và chì trong đường trắng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên

tử, theo TCVN 7275:2003

Nguyên tắc: Mẫu được phân hủy ướt để loại bỏ chất hữu cơ có trong mẫu. Dung dịch này sau đó được phân tích bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử Graphit đốt nóng (HGA AAS) sử dụng bước sóng 193,7 nm đối với asen và bước sóng 283,3 nm đối với chì, có hiệu chỉnh nên cho từng trường hợp. Đối với asen, sử dụng niken nitrat làm chất đệm để loại bỏ các chất gây nhiễu trong giai đoạn nguyên tử hóa và trong trường hợp xác định chì thì sử dụng amoni dihydro phosphat. Hiệu chuẩn bằng cách so sánh trực tiếp với các chuẩn.

(cid:0) Xác định chì trong sản phẩm đường bằng phương pháp so màu, theo TCVN 7276 :

2003

+ Đối với đường trắng: Chì được chiết trực tiếp ra khỏi dung dịch đã chuẩn bị bằng cách lắc tròn với dung dịch của dithizon trong clorofom và gạn bỏ phần nước. Dithizon tạo phức chất với chì, có thể hòa tan trong dung dịch clorofom cho màu đỏ đặc biệt. Có thể chiết hết từ pha nước khi pH trong khoảng từ 9 đến 11,5. Thêm amoni xitrat và kali xyanua để tránh sự gây nhiễu từ các ion khác. Sự phối màu cuối cùng được tiến hành bằng cách thêm lượng chì đã biết vào dung dịch trắng dithizon. + Đối với đường thô: Do các hợp chất hữu cơ tạo nhũ dithizon trong clorofom, dẫn đến khó tách pha nước và clorofom. Loại các thành phần hữu cơ bằng cách tro hóa đường, sau khi thêm magiê nitrat ở nhiệt độ không quá 5000C.

+ Đối với các sản phẩm đường hạng thấp: Nên tiến hành tro hóa ướt, vì các phương pháp tro hóa khô không thuận tiện đối với phép phân tích thông thường. Qui trình này cần phải sử dụng hỗn hợp axit sulphuric/axit percloric/axit nitric và đặc biệt thích hợp với các sản phẩm ở dạng lỏng. Khi có mặt canxi thì tốt nhất là sử dụng qui trình hai-axit đã hơi cải biến sử dụng axit nitric và axit percloric.

(cid:0)

(cid:0)

(cid:0) Định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí, theo ICUMSA GS2/3-41 : 1998; Định lượng nấm men, theo ICUMSA GS/2/3-47 : 1998; Định lượng nấm mốc, theo ICUMSA GS/2/3-47 : 1998

(cid:0) Xác định đồng trong sản phẩm đường bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

theo AOAC 971.20

1.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng chất khô trong đường và xiro (dựa theo

TCVN 7964:2008).

Tiêu chuẩn này qui định hai phương pháp xác định hàm lượng chất khô trong

đường và trong xi rô: phương pháp đo tỷ trọng và phương pháp đo khúc xạ.

1.3.3 Phương pháp xác định độ tro dẫn điện trong các sản phẩm đường tinh

luyện (dựa theo TCVN 7965:2009).

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định độ tro dẫn điện đối với đường trắng

và các loại đường chuyên dụng.

Độ tro dẫn điện trong các dung dịch có độ dẫn đện thấp (nồng độ 28 g/100 g) cho biết nồng độ muối hòa tan đã ion hóa có mặt trong dung dịch.

Nguyên tắc: Xác định độ dẫn điện riêng của dung dịch đường trắng ở nồng độ 28 g/100g. Sử dụng hệ số quy ước để tính độ tro tương đương.

1.3.4 Xác định chất không tan trong đường trắng bằng phương pháp lọc qua

màng (dựa theo TCVN 7273:2003)

Nguyên tắc: Đường thử nghiệm được hòa tan trong nước nóng và lọc qua màng lọc có cỡ lỗ 8.0 (cid:0) m. Màng lọc và chất không tan giữ lại trên màng được rửa sạch, sấy khô và cân. Hàm lượng chất không tan được tính từ phần khối lượng tăng thêm của màng lọc.

1.4 Kỹ thuật kiểm soát chất lượng phụ gia

Gồm các hương liệu, các chất ổn định, chống oxy hóa... Việc sử dụng phụ gia thực phẩm như “con dao hai lưỡi”, nó giúp cho giá trị của sản phẩm tăng lên, trên giá trị thực của nó, giá trị cảm quan tăng, sản phẩm trở nên bắt mắt với người tiêu dùng. Nhưng nếu sử dụng không đúng, quá liều lượng cũng ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe cũng như tổn thất cho nhà sản xuất về mặt kinh tế, uy tín thương hiệu. Vì vậy nên sử dụng chúng có cân nhắc kỹ lưỡng, hợp lý và hiệu quả. Cần tuân thủ theo các quy định của nhà nước, tránh lạm dụng không cần thiết ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Một số loại phụ gia thường được sử dụng trong chế biến nước trái cây:

­ Chất điều chỉnh độ chua: Tùy loại nguyên liệu mà sử dụng chất điều chỉnh độ chua khác

nhau, và thường được sử dụng nhất là acid citric.

Acid citric thường có nhiều trong rau quả với hàm lượng khá cao, đặc biệt là trong các loại quả có múi. Acid citric có vị chua dịu nên thường được sử dụng trong điều chỉnh vị của sản phẩm. Quá trình bổ sung acid citric nhằm làm giảm vị ngọt gắt của đường, đồng thời làm tăng vị chua hài hòa cho sản phẩm, kích thích tiêu hóa, hạn chế sự phát triển của một số loài vi sinh vật, góp phần hạn chế sự oxy hóa làm tăng thêm mùi vị cho sản phẩm. Các loại nước trái cây như nước chanh, cam có được vị thơm là nhờ vai trò của ion citrate trong acid citric. Mặt khác acid citric “phối hợp” với các chất chống oxy hóa (acid ascorbic) ngăn chặn sự oxy hóa, ngăn chặn sự mất màu, hương vị của sản phẩm, như một chất bảo quản sản phẩm tránh vi sinh vật gây hư hỏng (hạ thấp pH).

­ Chất chống oxy hóa: thường sử dụng acid ascorbic ­ Các chất dinh dưỡng bổ sung: vitamin, khoáng...

Ngoài ra còn có các chất tạo màu, hương liệu, chất nhũ hóa... được đưa vào nhằm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm.

2. Các kỹ thuật kiểm soát chất lượng nước trái cây thành phẩm

Chất lượng một thực phẩm được đánh giá dựa trên nhiều chỉ tiêu khác nhau. Và việc phân loại các chỉ tiêu chất lượng thực phẩm, dựa trên cơ sở khoa học của phương pháp phân tích người ta chia thành 3 nhóm chính: cảm quan, hóa lý và sinh học.

2.1 Phân tích cảm quan bằng phương pháp cho điểm (dựa theo TCVN

3216:1994) 1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng cho các loại đồ hộp rau quả gồm nước quả ép, nước quả

2) Lấy mẫu

nghiền, đồ hộp quả và rau quả dầm dấm.

(dựa theo TCVN 4409-87) (cid:0) Phương pháp lấy mẫu

­ Số lượng mẫu cần lấy để kiểm tra dạng bên ngoài và độ kín bao bì theo TCVN 2600 –

78, với bậc kiểm tra 2 và AQL là 6,5%.

­ Số đơn vị bao gói được chỉ định để lấy mẫu ban đầu quy định trong bảng 3.

Bảng 3

Cỡ lô Số đơn vị bao gói cần lấy

2%, không ít hơn 5. Dưới 500 đơn vị bao gói

Trên 500 đơn vị bao gói

10 và thêm 1% số đơn vị bao gói đã trừ đi 500.

­ Số lượng đơn vị sản phẩm được lấy ra từ mỗi đơn vị bao gói để thành lập mẫu riêng quy

định trong bảng 4.

Bảng 4

Khối lượng tịnh của một đơn vị sản phẩm (g) Số đơn vị sản phẩm lấy từ 1 đơn vị bao gói

12 Dưới 500

8 Từ 500 đến 1000

5 Trên 1000 đến 3000

2 Trên 3000

­ Số lượng mẫu trung bình và trung bình thí nghiệm theo quy định trong bảng 5.

Bảng 5

Số lượng đơn vị sản phẩm cần lấy

Khối lượng tịnh của 1 đơn vị sản phẩm (g)

cảm

Kiểm hoá lý Kiểm VSV Kiểm quan Mẫu lưu Tổng số

Dưới 50 10 3 7 7 27

Từ 50 đến 200 5 3 5 5 18

Trên 200 đến 300 3 3 5 3 14

300 đến 2 3 4 3 12

Trên 1000 1 1 2 2 6

Trên 1000

­ Trường hợp gửi mẫu trung bình đến nơi khác để phân tích thì mẫu phải được bao gói cẩn thận, kẹp chì hoặc niêm phong và kèm nhãn có nội dung sau:

+ Tên cơ sở sản xuất;

+ Tên và hạng sản phẩm;

+ Ngày sản xuất;

+ Khối lượng lô hàng và cỡ lô;

+ Số lượng mẫu;

+ Ngày lấy mẫu;

+ Họ tên người lấy mẫu;

+ Chỉ tiêu cần xác định.

3) Dụng cụ thử cảm

­ Cơ quan đánh giá và phân tích trọng tài do các bên hữu quan thỏa thuận. ­ Thời gian bảo quản mẫu lưu đựng trong bao bì hộp sắt tráng thiếc, thủy tinh, polyme…

quan

không quá 6 tháng. ­ Cốc thủy tinh không màu có dung tích 2000ml, 1000ml và 100ml. ­ Dao bằng thép không rỉ hoặc bằng thép mạ.

4) Số lượng mẫu thử cảm quan:

­ Thìa, dĩa bằng thép không rỉ hoặc bằng nhôm. ­ Đũa khuấy thủy tinh. ­ Khay men trắng hoặc đĩa sứ trắng. ­ Khăn bông sạch.

Trong một buổi không quá 15 mẫu. Sau khi cảm quan 7-8

5) Chuẩn bị mẫu thử và tiến hành

mẫu phải nghỉ giải lao 10-15 phút.

thử

Những sản phẩm đồng bộ như đồ hộp, nước quả ép, nước quả nghiền hộp phải được làm sạch bằng cách lau khô, lắc nhẹ theo chiều đứng của hộp. Mở 1/3 miệng hộp và chuyển mẫu sang cốc có dung tích thích hợp, trộn đều mẫu. Từ mẫu đó lấy khoảng 50ml cho vào cốc có dung tích 100ml và tiến hành đánh giá mùi vị, trạng thái sản phẩm.

6) Bảng điểm

Bảng 6: bảng cho điểm các chỉ tiêu cảm quan trong đồ hộp nước quả ép.

Chỉ tiêu Yêu cầu

Điểm Hệ số quan trọng

Màu sắc tự nhiên, rất đặc trưng của sản phẩm 5 Màu sắc Màu sắc tự nhiên đặc trưng của sản phẩm 4 1,0 Màu sắc tự nhiên, tương đối đặc trưng của sản phẩm 3

Hơi biến màu, không đặc trưng 2

Mùi vị rất đặc trưng 5 Mùi vị Mùi vị đặc trưng 4 2,0 Mùi vị tương đối đặc trưng 3

Mùi vị không đặc trưng 2

Có lẫn bột quả, khi khuấy nhẹ phân tán đều 5 Hình thái Có lẫn bột quả, vón nhẹ, khi khuấy nhẹ phân tán đều 4 1,0 Vón nhẹ, lắc ít tan 3

Vón cục, lắc không tan 2

Bảng 7: bảng cho điểm các chỉ tiêu cảm quan trong đồ hộp nước nghiền.

Yêu cầu Chỉ tiêu

Điểm Hệ số quan trọng

Màu sắc tự nhiên, rất đặc trưng 5 Màu sắc Màu sắc tự nhiên, đặc trưng 4 1,0 Màu sắc tự nhiên, tương đối đặc trưng 3

Màu sắc hơi biến màu, không đặc trưng 2

Mùi vị rất đặc trưng 5 Mùi vị Mùi vị đặc trưng 4 2,0 Mùi vị tương đối đặc trưng 3

Mùi vị không đặc trưng, có mùi vị lạ 2

Rất đặc trưng, dạng sánh đồng nhất 5 Hình thái Đặc trưng, dạng hơi sánh đồng nhất 4 1,0 3 Dạng đặc hay loãng, nhưng vẫn trong giới hạn cho phép

7) Khi tiến hành cho điểm

2 Không phù hợp đối với yêu cầu sản phẩm.

nếu người thử nếm cảm thấy không thỏa mãn với điểm

8) Đánh giá kết

nguyên (chẵn) về một trong hai phía thì có thể cho điểm lẻ (2,5; 3,5; 4,5). quả

8.1. Nếu có một thành viên cho một chỉ tiêu cảm quan điểm 2 thì việc kiểm tra nên tiến hành lại một lần nữa đối với chỉ tiêu nào đó để có ý kiến nhận xét được chính xác hơn. Khi hội đồng đã quyết định cho một chỉ tiêu nào đó điểm 2 thì sản phẩm đó bị đánh giá là sản phẩm kém.

8.2. Cách tính số điểm chung và nhận xét kết quả theo TCVN 3215-79

8.2.1. Tính điểm trung bình của các thành viên hội đồng đối với từng chỉ tiêu cảm quan, lấy chính xác đến 1 chữ số thập phân sau dấu phẩy. Sau đó đem nhân với hệ số quan trọng tương ứng của chỉ tiêu đó.

8.2.2. Tính tổng số điểm có trọng lượng của tất cả các chỉ tiêu cảm quan được số điểm chung.

Chú thích: Trong bảng 1, 2 chỉ miêu tả các mức điểm nguyên, phần thập phân sẽ được vận dụng theo kinh nghiệm và sự cảm nhận của người thử nếm, mức sai khác là 0,5 điểm.

Bảng8: bảng đánh giá phân loại chất lượng sản phẩm

Danh hiệu chất lượng Điểm chung Yêu cầu về điểm trung bình chưa trọng lượng đối với các chỉ tiêu

Loại tốt 18,6 – 20,0 Các chỉ tiêu quan trọng nhất lớn hơn hoặc bằng 4,8

Loại khá 15,2 – 18,5 Các chỉ tiêu quan trọng nhất lớn hơn hoặc bằng 3,8

Loại trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu lớn hơn hoặc bằng 2,8

7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu lớn hơn hoặc bằng 1,8 Loại kém – (không đạt mức chất lượng quy định trong tiêu chuẩn nhưng còn khả năng bán được)

4,0 – 7,1

0 – 3,9 Mỗi chỉ tiêu lớn hơn hoặc bằng 1,0 - Loại rất kém – (không có khả năng bán được nhưng sau khi tái chế thích hợp còn sử Loại hỏng – (không còn sử dụng được)

2.2 Phân tích các chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm 2.2.1 Xác định chì bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng lò

graphit sau khi đã phân hủy bằng vi sóng(dựa theo TCVN 8126:2009)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng kẽm, đồng và sắt trong thực phẩm bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa (FAAS) và xác định hàm lượng cadimi và chì trong thực phẩm bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng lò graphit (GFAAS), sau khi đã phân hủy bằng vi sóng.

Tiêu chuẩn này có thể áp dụng để xác định hàm lượng chì có trong thực phẩm với nồng độ lớn hơn hoặc bằng 0,1 mg/kg. Tiêu chuẩn này không áp dụng cho các loại thực phẩm có hàm lượng chất béo lớn hơn hoặc bằng 40 % và không áp dụng cho sữa bột.

2) Nguyên tắc

Các sản phẩm được phân hủy bằng axit nitric và hydro peroxit dưới áp suất cao trong lò vi sóng. Dung dịch thủy phân được pha loãng bằng nước. Chì được xác định bằng GFAAS.

3) Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã loại ion, có điện trở ≥ 18 M(cid:0) .cm.

3

3.1. Axit nitric đậm đặc (HNO ), 65% khối lượng.

3.2. Axit nitric (HNO ), 0,1 M 3

3

Pha loãng 7 ml HNO đậm đặc (3.1) bằng nước đến 1 lít.

3.3. Axit nitric (HNO ), 3 M 3

3

Pha loãng 200 ml HNO đậm đặc (3.1) bằng nước đến 1 lít.

3.4. Hydro peroxit (H O 2 ), 30 % khối lượng. 2

3.5. Dung dịch chuẩn gốc chì, 1 mg/kg.

CHÚ THÍCH: Có thể dung dung dịch chuẩn chì có bán sẵn loại dùng cho quang phổ hấp thụ nguyên tử.

Hòa tan 1,000 g chì với 7 ml axit nitric (3.1) trong bình định mức 1 000 ml (4.5) và pha loãng bằng nước đến vạch.

3.6. Dung dịch chuẩn làm việc cho phân tích GFAAS

Pha loãng dung dịch chuẩn gốc chì với axit nitric 0,1 M (3.2) để có dải chuẩn làm việc bao trùm khoảng tuyến tính của chì cần xác định.

4) Thiết bị, dụng cụ

CHÚ THÍCH: Tất cả các dụng cụ bằng thủy tinh và chất dẻo cần phải được rửa và làm sạch kỹ, ví dụ: rửa bằng axit nitric hoặc axit clohydric để tránh nhiễm bẩn kim loại.

a) Làm sạch các dụng cụ thủy tinh và chất dẻo: Trước tiên, rửa bằng nước và chất tẩy rửa, tiếp theo tráng dưới dòng nước chảy, tráng tiếp bằng nước cất, sau đó tráng bằng dung dịch axit nitric loãng [hòa tan 500 ml axit nitric đậm đặc (3.1) với 4500 ml nước cất]. Cuối cùng tráng 4 lần đến 5 lần bằng nước.

b) Làm sạch bình phân hủy Teflon: Tráng bình bằng axeton sau đó rửa bằng nước, cho axit nitric 0,1 M (3.2) vào bình và để ít nhất 30 min, tráng bằng nước và để khô bình.

Sử dụng các bình khác nhau cho các ứng dụng khác nhau, phụ thuộc vào nồng độ của các kim loại. Tuy nhiên, nếu dùng cùng một bình phân hủy cho các sản phẩm nhiễm bẩn nặng, ví dụ: bị đóng cặn thì các bình này cần phải làm sạch vài lần, ví dụ: đun nóng bình cùng với axit nitric đậm đặc (3.1). Thông thường, các thiết bị thường có các hướng dẫn cụ thể về quá trình làm sạch.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể là:

4.1. Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử: có đầu đốt không khí/axetylen hoặc đầu đốt nitơ oxit/axetylen dùng cho phân tích GFAAS sử dụng nhiệt điện, có hiệu chỉnh nền (phi hạt nhân) thích hợp.

Bảng 9: Các thông số của thiết bị dùng cho GRAAS

Kim loại Bước sóng Bước làm sạch Nhiệt độ (oC)/thời gian nm Bước tro hóa

Pb 283,3 650/15-10 Bước nguyên tử hóa 1900/0-4 2500

Cd 228,8 350/15-10 1200/0-4 2500

4.2. Đèn catot rỗng hoặc đèn phóng điện không điện cực, loại dùng cho chì, cadimi, kẽm, đồng và sắt.

4.3. Lò vi sóng, được thiết kế để dùng trong phòng thử nghiệm, thường xuyên kiểm tra công suất của lò vi sóng. Nếu hiệu quả đo không phù hợp với qui định thì phải điều chỉnh chương trình: Đổ đầy 1,000 ml nước (ở nhiệt độ phòng) vào cốc có mỏ bằng chất dẻo ). Đưa cốc có mỏ vào lò vi sóng và đun (polypropylen hoặc Teflon) và đo nhiệt độ (T b

nóng nước ở công suất tối đa trong 2 min. Lấy cốc ra, khuấy nước và đo nhiệt độ ( T ). a

Công suất, P, tính bằng wat, như sau:

P = 35 x (T ) - T b

a

4.4. Bình phân hủy Teflon, dung tích 100 ml, có khả năng chịu được áp suất tối thiểu là 1,4 MPa.

CẢNH BÁO - Các bình phân hủy phải được làm nguội ở thời gian thích hợp trước khi mở để tránh bị bỏng do hơi nóng.

4.5. Bình định mức, dung tích 25 ml đến 1 000 ml.

4.6. Phễu, bằng thủy tỉnh hoặc chất dẻo.

4.7. Chai bằng chất dẻo, ví dụ: chai làm bằng polystyren có nắp đậy kín, dung tích 50 ml đến 100 ml.

4.8. Tủ sấy hoặc thiết bị đống khô.

4.9. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

5) Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc

thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

6) Chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị mẫu thử theo các tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm.

6.1. Xử lý sơ bộ

Nếu sản phẩm khi phân tích ở dạng tươi thì tiến hành đồng hóa (xem 6.3) hoặc có thể được sấy khô (xem 6.2).

6.2. Sấy

Sấy đến khối lượng không đổi trong tủ sấy (4.8) ở 105 oC, hoặc trong thiết bị đông khô. Việc đông khô thường thích hợp hơn vì nó làm cho sản phẩm ít bị rắn lại và dễ đồng hóa. Nếu kết quả cuối cùng tính theo khối lượng tươi thì cân phần mẫu thử trước và sau khi sấy để thu được độ ẩm.

6.3. Đồng hóa

Để đồng hóa sản phẩm phải dùng thiết bị không nhiễm bẩn. Kiểm tra các kim loại bị thôi ra nếu các dụng cụ đồng hóa có các phần kim loại.

7) Cách tiến hành

7.1. Phân hủy

Dùng cân (4.9), cân từ 0,2 g đến 0,5 g mẫu thử dạng khô, chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình phân hủy (4.4). Nếu dùng mẫu thử dạng ướt thì khối lượng tối đa không vượt quá 2 g và hàm lượng chất khô không được vượt quá 0,5 g. Ví dụ: nếu sản phẩm có hàm lượng nước 50% thì lấy tối đa 1 g (chất khô bằng 0,5 g). Nếu sản phẩm có hàm lượng nước 95 % thì lấy 2 g (chất khô nhỏ hơn 0,5 g).

CHÚ Ý: Nếu phân hủy các sản phẩm chứa hàm lượng chất rắn quá lớn chưa biết rõ thì có thể sẽ làm thủng màng an toàn của bình phân hủy.

Thêm 5 ml axit nitric (3.1) và 2 ml hydro peroxit (3.4) vào bình phân hủy. Đậy nắp, đặt bình vào giá đỡ rồi đưa vào lò vi sóng (4.3) rồi đóng cửa lò. Đặt chương trình của lò theo các thông số trong Bảng 1 và bắt đầu phân hủy.

Bảng 10 - Các thông số chương trình đối với lò vi sóng

Công suất Khoảng thời gian Bước

1 W 250 min 3

2 630 5

3 500 22

4 0 15

Chương trình vận hành của lò có hiệu lực khi 12 bình được phân hủy đồng thời. Nếu chỉ có một số bình được phân hủy, thì các bình còn lại phải được làm đầy với thuốc thử trắng. Khi dùng một lò vi sóng khác có chương trình khác với các thông số nêu trên thì có thể cần phải sử dụng một chương trình thời gian/công suất có khác đôi chút.

Lấy các bình phân hủy ra khỏi lò vi sóng (4.3) và để nguội hoàn toàn trước khi mở chúng. Mở bình phân hủy, tráng nắp đậy và thành bình bên trong. Chuyển dung dịch này sang bình định mức 25 ml (4.5) và pha loãng đến vạch bằng nước đã loại ion. Sau đó, chuyển dung dịch sang bình chất dẻo. Xử lý mẫu trắng giống mẫu thử. Đối với mỗi mẻ cần thực hiện một phép thử trắng.

7.2. Pha loãng

Nếu dung dịch thử cần được pha loãng tiếp (do nồng độ kim loại cao) thì pha loãng với axit nitric 3 M (3.3), để duy trì cùng một nồng độ axit thấp trước khi xác định kim loại bằng máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử (4.1).

Nồng độ axit cao sẽ không thích hợp về môi trường và làm suy giảm tín hiệu phân tích. Giảm nồng độ axit bằng cách pha loãng một nửa dung dịch thử với axit nitric 0,1 M (3.2) và một nửa dung dịch chuẩn với axit nitric 3 M (3.3). Khi đó dung dịch thử và dung

dịch chuẩn sẽ có cùng một nồng độ axit. Nồng độ axit thích hợp rất quan trọng khi sử dụng đường hiệu chuẩn.

7.3. Đo quang phổ hấp thụ nguyên tử

Sử dụng kỹ thuật đo GFAAS để xác định hàm lượng chì cần tìm. Chương trình nhiệt độ hỗn hợp khí, bước sóng và các thông số thiết bị khác thích hợp nhất đối với mỗi loại kim loại thì xem sổ tay được cung cấp cùng thiết bị. Luôn sử dụng hiệu chỉnh nền.

Các phép đo phải nằm trong dải tuyến tính khi sử dụng phương pháp thêm chuẩn. Đường chuẩn này gồm ít nhất là ba điểm, trong đó có ít nhất 2 điểm chuẩn. Nồng độ của chất chuẩn cao nhất cần phải gấp 3 lần đến 5 lần nồng độ dung dịch thử. Nồng độ của chất chuẩn thấp hơn nên ở khoảng một nửa nồng đồ chất chuẩn cao nhất. Phương pháp thêm chuẩn được đơn giản hóa là sử dụng đường chuẩn phù hợp với chất nền, có thể áp dụng cho các sản phẩm có cùng chất nền: Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được trộn và được sử dụng để tạo đường bổ sung chuẩn. Đường này được tạo song song từ gốc tọa độ và được sử dụng như đường chuẩn cho các phép thử và có cùng một tỷ lệ pha loãng. Như vậy đường chuẩn phù hợp với chất nền và dung dịch thử sẽ có cùng nồng độ chất nền. Trong các thiết bị hiện đại nhất, chức năng này được cài sẵn trong phần mềm.

7.4 Kỹ thuật GFAAS

Kỹ thuật này thường được dùng để xác định chì và cadimi trong thực phẩm. Sử dụng các cuvet nhiệt phân có đế. Vì phương pháp này tạo ra dải pha loãng phân tích khá rộng, nên phương pháp này có thể dùng để xác định đồng.

Nên sử dụng phương pháp thêm chuẩn hoặc các chuẩn phù hợp với chất nền, trừ khi không cần thiết (nghĩa là không có sự khác nhau đáng kể giữa độ dốc của đường hiệu chuẩn của dung dịch chuẩn làm việc tinh khiết và đường bổ sung chuẩn của mẫu thử). Khi sử dụng phương pháp thêm chuẩn thì các phép đo phải nằm trong dải tuyến tính.

Đặt chương trình cho bộ lấy mẫu tự động để phân phối một thể tích mà có thể cho độ hấp thụ càng lớn càng tốt nằm trong dải tuyến tính và tạo ra độ hấp thụ nền không lớn hơn 0,5 đơn vị. Việc bơm nhiều có thể tăng độ hấp thụ ở nồng độ rất thấp. Đánh giá mỗi chất nền mới bằng cách dùng đồ thị sử dụng tro hóa và nguyên tử hóa nhằm tối ưu hóa các thông số của lò graphit.

8) Tính và biểu thị kết quả

(a (cid:0)  b)d

Tính nồng độ của chì trong mẫu thử, C, biểu thị bằng miligam trên kilôgam (mg/kg), theo công thức (1):

f

C (cid:0)

25

m

(1) (cid:0)

trong đó:

a là nồng độ trong dung dịch thử, tính bằng miligam trên lit (mg/l); b là nồng độ trung bình trong dung dịch trắng, tính bằng miligam trên lit (mg/l);

d là hệ số pha loãng; f

m là khối lượng của mẫu thử, tính bằng gam (g).

Nếu giá trị (a - b) thấp hơn giới hạn phát hiện (DL) thì (a-b) được thay bằng DL để tính giới hạn phát hiện trong mẫu thử.

f

Nếu dung dịch thử đã được pha loãng, thì phải tính cả hệ số pha loãng (d ).

FW

Nếu phần mẫu thử được làm khô và tính kết quả dựa trên khối lượng tươi thì nồng độ của kim loại trong mẫu thử, C , biểu thị bằng (mg/kg), tính được theo công thức (2):

FW (cid:0)

(2) C

C (cid:0) 100 (cid:0) W 100

trong đó:

C là nồng độ của kim loại trong mẫu thử đã làm khô, tính bằng miligam trên kilôgam (mg/kg), tính theo công thức (1);

W là hàm lượng nước của phần mẫu thử, tính bằng phần trăm (%), tính theo công thức (3);

(3) (cid:0)  Wd Wf

W (cid:0)   (cid:0) 100

Wf

trong đó:

f

W là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

d

W là khối lượng của phần mẫu thử sau khi sấy, tính bằng gam (g).

Khi tiến hành phép thử lặp lại thì lấy kết quả trung bình đến 3 chữ số có nghĩa.

9) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

e) kết quả thử nghiệm thu được, hoặc nếu thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

2.2.2 Xác định hàm lượng thiếc bằng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử

1) Phạm vi áp

ngọn lửa (dựa theo TCVN 7769:2007) dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng thiếc trong sản phẩm rau, quả có dải nồng độ từ 10 mg/kg đến 500 mg/kg, bằng đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa. Đây là phương pháp nhanh, đặc biệt thích hợp cho phép xác định thông thường đối với thiếc trong rau quả đóng hợp bị thôi nhiễm từ vỏ hộp. Phương pháp có thể được áp dụng với lượng mẫu thử có hàm lượng chất khô tổng số tối đa là 30%. Sản phẩm có hàm lượng chất khô tổng số cao hơn có thể phân tích được bằng cách sử dụng lượng mẫu nhỏ hơn, sau khi pha loãng tương ứng với nước đã khử ion.

2) Nguyên Sản phẩm rau, quả được thủy phân trong axit clohydric ở 80 oC, và xác định hàm

tắc

3) Thuốc

lượng thiếc bằng đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa.

thử

Các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích và nước được sử dụng là nước cất hoặc nước đã loại ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có qui định khác.

20

3.1. Axit clohydric, đậm đặc (p = 1,19 g/ml).

3.2. Axit clohydric, loãng (c = 6 mol/l).

Pha loãng 50 ml axit clohydric đậm đặc (3.1) bằng nước tới 100 ml.

4) Thiết bị, dụng

3.3. Thiếc, dung dịch chuẩn tương đương với 1,0 mg thiếc trên mililit.

cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể sau:

4.1. Máy nghiền cơ, có lớp lót và các lưỡi dao được phủ polytetrafloroetylen (PTFE).

4.2. Hộp ổn nhiệt, hoặc thiết bị khác có thể tăng nhiệt nhanh và kiểm soát được nhiệt độ. Nhiệt độ yêu cầu chính xác là ± 3 oC.

4.3. Máy đo phổ hấp thụ nguyên tử, có một đầu đốt khí nitơ oxit/axetylen (5 cm), thích hợp để đo ở bước sóng 235,5 nm.

4.4. Đèn thiếc, đèn catốt rỗng hoặc đèn phóng điện không điện cực (EDL).

CHÚ THÍCH: Khi sử dụng đèn EDL thì giới hạn phát hiện của phương pháp sẽ thấp đi nhiều.

4.5. Giấy lọc, Schleicher và Schull 589/1 (dải đen)4 hoặc loại tương đương.

4 Schleicher và Schull 589/ (dải đen) là một ví dụ về sản phẩm thương mại thích hợp có sẵn. Thông tin này chỉ đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm đó.

4.6. Cân phân tích.

5) Lấy

mẫu

6) Cách tiến

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

hành

6.1. Chuẩn bị mẫu thử

Trộn kỹ mẫu phòng thử nghiệm. Nếu cần, trước hết loại bỏ hạt, vỏ cứng của hạt và cho mẫu phòng thử nghiệm qua máy nghiền cơ (4.1).

Cho sản phẩm lạnh đông hoặc lạnh đông sâu tan băng trong bình kín và chuyển toàn bộ nước tan ra vào máy trộn.

6.2. Phần mẫu thử

Cân 5 g mẫu thử (6.1), chính xác tới 0,001 g, cho vào ống thủy tinh thích hợp đối với hộp ổn nhiệt (4.2) hoặc cho trực tiếp vào bình định mức 50 ml.

6.3. Phân hủy

Thêm 10 ml axit clohydric loãng (3.2). Ủ mẫu trong hộp ổn nhiệt trong 60 phút hoặc trong bể ổn nhiệt đã gia nhiệt trước tới 80 oC ± 3 oC. Trong khi gia nhiệt, khuấy hỗn hợp khoảng từ ba lần đến bốn lần.

Chuyển mẫu thử vào bình định mức 50 ml, sau khi để nguội cho thêm nước đến vạch. Lọc mẫu qua giấy lọc (4.5). Dịch lọc đã chuẩn bị sẵn để đo phổ hấp thụ nguyên tử. Nên xác định trong khoảng từ 5 h đến 6 h hoặc giữ dịch chiết trong bình nhựa có gắn xi.

6.4. Phép thử trắng

Tiến hành phép thử thử trắng bằng cách chuyển 10 ml axit clohydric loãng (3.2) vào ống thủy tinh hoặc bình định mức và sử dụng quá trình phân hủy (6.3) như đối với phần mẫu thử (6.2).

6.5. Xác định

6.5.1. Dựng đường chuẩn

Pha loãng dung dịch thiếc chuẩn (3.3) bằng cách thêm 10 ml axit clohydric đậm đặc (3.1) trên 100 ml, để thu được loạt dung dịch chuẩn thích hợp có nồng độ trong dải từ 3,0 mg/l đến 200 mg/l khi sử dụng đèn catốt rỗng, và trong dải từ 1,0 mg/l đến 200 mg/l khi sử dụng đèn EDL.

Bật ngọn lửa khí nitơ oxit/axetylen của máy đo phổ hấp thụ nguyên tử (4.3) theo hướng dẫn sử dụng của thiết bị và điều chỉnh dòng khí để nhận được dải đỏ khoảng 2 cm trên đầu đốt.

Phun lần lượt từng dung dịch này vào ngọn lửa của máy đo phổ (4.3). Sử dụng hỗn hợp của axit clohydric loãng và nước (tỷ lệ 1:9) làm mẫu trắng.

Ghi lại các giá trị độ hấp thụ tương ứng và vẽ đường chuẩn (độ hấp thụ dựa vào nồng độ thiếc tính theo miligam trên lít).

6.5.2. Đo phổ

Đặt dụng cụ đo vào điều kiện tối ưu đã được đặt trước, sử dụng ngọn lửa khí nitơ oxit/axetylen và bước sóng cộng hưởng 235,5 nm.

Phun vào ngọn lửa máy đo phổ (4.3) dung dịch mẫu thử (6.3) và dung dịch mẫu trắng (6.4). Ghi lại độ hấp thụ tương ứng.

7) Tính toán

Hàm lượng thiếc trong mẫu, w, biểu thị bằng miligam trên kilogam sản phẩm, được tính theo công thức sau đây:

50 w (cid:0) ( p (cid:0)  pb ) (cid:0) m

trong đó

p là nồng độ thiếc của dung dịch thử đọc được từ đường chuẩn, tính bằng miligam trên lít;

b

p là nồng độ thiếc của dung dịch trắng đọc được từ đường chuẩn, tính bằng miligam

trên lít;

8) Báo cáo thử

m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam.

nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm đã dùng cùng với viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.

2.2.3 Xác định hàm lượng thiếc bằng phương pháp quang phổ hấp thụ

nguyên tử (dựa theo TCVN 7788:2007)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng thiếc trong thực phẩm

đóng hộp bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử.

2) Nguyên tắc

2

Phần mẫu thử được phân hủy bằng axit nitric, rồi phân hủy tiếp bằng axit clohydric và được pha loãng. Dung dịch kali clorua được bổ sung vào mẫu và các chất chuẩn để giảm sự gây nhiễu của dụng cụ. Hàm lượng thiếc được xác định bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử ở bước sóng 235,5 nm với ngọn lửa oxi hóa N O-C H 2 . 2

3) Thuốc thử

Các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích và nước được sử dụng

phải là nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có qui định khác.

3

3.1. Axit nitric đậm đặc (HNO ), không chứa thiếc

Để kiểm tra độ tinh khiết: pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:4 (theo thể tích) và hút vào máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử. Dung dịch này chỉ thích hợp cho phép phân tích khi tín hiệu cho thấy không có mặt của thiếc trong dung dịch.

3.2. Dung dịch thiếc chuẩn

3.2.1. Dung dịch thiếc gốc, nồng độ 1 mg/ml

Hòa tan 1,000 g thiếc vào khoảng 200 ml dung dịch axit clohydric đậm đặc (3.4), thêm khoảng 200 ml nước, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi pha loãng bằng nước đến 1000 ml.

3.2.2. Dung dịch thiếc làm việc, chứa hàm lượng thiếc tương ứng là 0 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 150 μg/ml và 200 μg/ml.

Cho vào năm bình định mức 100 ml (4.1), mỗi bình 10 ml axit clohydric đậm đặc (3.4), 1,0 ml dung dịch kali clorua (3.3), và 0 ml, 5 ml, 10 ml, 15 ml hoặc 20 ml dung dịch thiếc gốc (3.2.1). Pha loãng bằng nước đến vạch.

3.3. Dung dịch kali clorua (KCl), 10 mg/ml

Hòa tan 1,91 g kali clorua trong nước đựng trong bình định mức 100 ml (4.1) và pha loãng bằng nước đến vạch.

3.4. Axit clohydric đậm đặc (HCl).

4) Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể là:

4.1. Bình định mức một vạch, 100 ml.

O-C 4.2. Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử, có hiệu chỉnh nền liên tục và đầu đốt ngọn lửa khí N 2 H 2 . 2

4.3. Tủ hút.

4.4. Giấy lọc, loại trung bình.

4.5. Chai polyetylen hoặc polypropylen, có nắp vặn.

4.6. Bình Erlenmeyer, dung tích 250 ml.

5) Cách tiến hành

5.1. Chuẩn bị mẫu thử

Cân chính xác phần mẫu thử đến ± 0,01 g với các lượng như sau: 30 g đến 40 g nước quả ép hoặc đồ uống, 20 g đối với thực phẩm có hàm lượng nước từ 50 % đến 75 % và từ 5 g đến 10 g thực phẩm dạng rắn hoặc nửa rắn, cho vào bình Erlenmeyer (4.6). Giới hạn hàm lượng chất béo hoặc hàm lượng dầu khoảng từ 2 g đến 4 g và chất hữu cơ tổng số đến khoảng 5 g. Sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 120 oC.

Nếu thời gian kết thúc giai đoạn phân hủy mẫu trong cùng một ngày thì không cần bổ sung axit nitric (3.1) vào phần mẫu thử. Thêm 30 ml axit nitric (3.1) vào bình định mức (4.1) và gia nhiệt nhẹ trong tủ hút (4.3) trong vòng 15 min để bắt đầu phân hủy mẫu, tránh tạo quá nhiều bọt. Đun nhẹ cho đến khi dịch thủy phân còn lại khoảng từ 3 ml đến 6 ml hoặc cho đến khi mẫu chỉ vừa khô đến đáy bình. Không để mẫu bị cháy. Lấy bình cầu ra khỏi nguồn nhiệt. Tiến hành ngay, kể cả hai bình cầu rỗng để dùng cho phép thử trắng đối với thuốc thử, như sau: cho 25 ml axit clohydric (3.4) và gia nhiệt nhẹ khoảng 15 min cho đến khi hết khí clo bốc ra. Tăng nhiệt và để sôi cho đến khi còn lại từ 10 ml đến 15 ml, sử dụng bình cầu tương tự chứa 15 ml nước để ước lượng thể tích. Thêm khoảng 40 ml nước, xoay bình và rót vào bình định mức 100 ml (4.1), tráng rửa bình bằng 10 ml nước. Khi có mặt axit clohydric trong dịch thủy phân thì phần mẫu thử có thể phải để qua đêm hoặc lâu hơn.

Dùng pipet lấy 1,0 ml dung dịch kali clorua (3.3) cho vào từng bình định mức. Để nguội đến nhiệt độ phòng và pha loãng bằng nước đến vạch, bổ sung thêm một lượng nước bù cho thể tích chất béo trong bình cầu. Trộn kỹ và lọc khoảng 30 ml đến 50 ml qua giấy lọc khô loại trung bình (4.4) cho vào chai polyetylen hoặc polypropylen khô (4.5). Không lọc mẫu trắng. Đậy kín chai cho đến khi phân tích. Dung dịch này có thể ổn định trong vài tháng.

5.2. Xác định

2

CẢNH BÁO: Vì bản chất dễ gây nổ của các loại khí, nên cần chú ý khi bật lửa và sử O để duy dụng ngọn lửa. Có thể cần phải sử dụng băng đo nhiệt trên bộ điều chỉnh N

trì tốc độ khí ổn định.

2

Sử dụng 200 μg/ml chất chuẩn và đường chuẩn thiếc ở bước sóng 235,5 nm, tối ưu hóa điều kiện của máy đo quang phổ, đầu đốt và ngọn lửa theo chỉ dẫn của nhà sản để có được ngọn lửa oxi O hoặc giảm tốc độ dòng C xuất. Rồi tăng tốc độ dòng N 2 H 2

hóa; phần lửa đỏ cần cao hơn rãnh đầu đốt khoảng 4 mm. Điều này làm giảm độ nhạy nhưng làm tăng độ chụm đến (0 ± 0,0004) A đối với phép thử trắng và (0,201 ± 0,001) A đối với chất chuẩn 100 μg/ml. Kiểm tra định kỳ độ nhạy của chất chuẩn; nếu độ nhạy giảm quá 20 % thì tắt ngọn lửa và làm sạch rãnh đốt cẩn thận.

Chỉnh máy đo quang phổ về zero (0) trong khi hút nước nhưng không chỉnh về zero (0) sau các lần xác định; tự động chỉnh về zero sẽ làm giảm độ chụm. Hút nước trước và sau mỗi lần hút mẫu, chất chuẩn và dung dịch trắng. Lấy ba số đọc mỗi lần cách nhau 5 s đối với mỗi dung dịch, lấy trung bình và đối chứng tất cả số đo độ hấp thụ với độ hấp thụ của nước.

Ghi lại độ hấp thụ A của các chất chuẩn, dựng đường chuẩn và kiểm tra bằng mắt đối với các chất chuẩn không chính xác. Hai kết quả độ hấp thụ trắng đã hiệu chỉnh với chất chuẩn 50 μg/ml không được lệch quá 3 % so với độ hấp thụ trắng đã hiệu chỉnh đối với chất chuẩn 100 μg/ml.

Dùng 50 μg/ml chất chuẩn để cố định dung dịch trắng chuẩn, sử dụng tỷ lệ độ hấp thụ A. Tính nồng độ của dung dịch trắng chuẩn, C , được biểu thị bằng μg/ml, sử dụng 1

công thức sau đây:

o

o

C /(A' - A )] x 50 (μg/ml) = [A 1

trong đó

o

A và A' tương ứng với số đọc của mẫu trắng và trung bình các số đọc đối với dung

dịch chuẩn 50 μg/ml.

Để thu được các nồng độ đúng, cần bổ sung dung dịch nồng độ trắng chuẩn vào dung dịch nồng độ chuẩn danh định.

Đo độ hấp thụ A của các mẫu trắng như đã thực hiện đối với mẫu trắng chuẩn và tính:

o

Nồng độ mẫu trắng (μg/ml) = (A /A') x nồng độ đúng của dung dịch chuẩn 50 μg/ml

trong đó

o

A và A' tương ứng với số đọc của mẫu trắng và dung dịch chuẩn 50 μg/ml.

Tính nồng độ trung bình của dung dịch mẫu trắng, B.

Xác định nồng độ của dung dịch thử bằng một trong hai qui trình sau đây:

, như sau: 1) Đo độ hấp thụ của các dung dịch thử (tối đa 3 dung dịch) và dung dịch chuẩn 50 μg/ml (hoặc dung dịch chuẩn 100 μg/ml tùy thuộc vào nồng độ dung dịch thử), cố định các dung dịch thử với dung dịch chuẩn. Tính nồng độ dung dịch thử trắng đã hiệu chỉnh, C 2

C (μg/ml) = (A/A') x nồng độ đúng của dung dịch chuẩn) - B 2

trong đó

A và A' tương ứng với số đọc của mẫu thử và dung dịch chuẩn.

Khi không yêu cầu đến độ chính xác cao hoặc khi đường chuẩn quá cong, thì sử dụng qui trình b) sau khi đã khẳng định rằng độ nhạy và đường nền không bị thay đổi trong suốt quá trình thử nghiệm.

2) Hiệu chuẩn sử dụng mẫu trắng và các dung dịch chuẩn 50 μg/ml, 100 μg/ml và 150 μg/ml. Cho chạy mẫu trắng và các dung dịch mẫu thử, sau đó sử dụng bộ xử lý vi phân của thiết bị hoặc đường chuẩn để tính nồng độ dung dịch. Tính trung bình nồng độ của

mẫu trắng B. Tính nồng độ dung dịch mẫu trắng đã hiệu chỉnh (μg/ml) bằng cách lấy các nồng độ dung dịch trừ đi giá trị B.

6) Tính kết quả

(cid:0)  C2 (cid:0) 100

X (cid:0)

C1

m

Hàm lượng thiếc có trong phần mẫu thử, X, tính bằng mg/kg, sử dụng công thức sau đây:

trong đó

1

C là nồng độ của mẫu trắng chuẩn, tính bằng microgam trên mililít;

2

C là nồng độ của dung dịch đã hiệu chỉnh, tính bằng microgam trên mililít;

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam.

7) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

- các kết quả thử nghiệm thu được.

2.2.4 Xác định hàm lượng axit ascorbic

a) phương pháp chuẩn (dựa vào TCVN 6427-1:1998). 1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp chuẩn để xác định hàm lượng axit ascorbic và dehidroascorbic được kết hợp trong rau quả và sản phẩm rau quả, bằng cách dùng phổ kế huỳnh quang phân tử.

2) Nguyên tắc

Chuyển đổi axit ascorbic thành axit dehidroascorbic bằng than hoạt tính.

Phản ứng của axit dehidroascorbic với o-phenylendiamin (OPDA) cho hợp chất huỳnh quang theo phản ứng sau đây:

(-Oxo-2 4 H-3-(1,2-dihidroxyetyl) furo[3,4-b] quinoxalin)

3

Khi kiểm tra sự có mặt của axit boric, việc tạo thành phức chất H – axit BO 3

dehidroascorbic ngăn cản phản ứng với OPDA. Do vậy, bất kỳ ảnh hưởng huỳnh quang nào cũng phải được tính đến trong khi tính kết quả.

Chú thích – Hàm lượng axit dehidroascorbic đơn lẻ ban đầu có thể được xác định bỏ qua bước sử dụng than hoạt tính. Sau đó có thể bằng phép trừ đi để tính hàm lượng axit ascorbic đơn lẻ ban đầu.

3) Thuốc thử và vật liệu

Sử dụng tất cả các thuốc thử loại phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

3

­ Dung dịch O-Phenylendiamin dihidroclorua (C H 6 N 8 .2HCl), 0,2g/l. (Chuẩn bị 2 dung dịch này ngay trước khi sử dụng). COONa.3H O), 500g/l. 2 ­ Dung dịch natri axetat ngậm ba phân tử nước (CH ­ Dung dịch axit boric/natri axetat.

3

3 này ngay trước khi sử dụng).

) trong 100ml dung dịch natri axetat (Chuẩn bị dung dịch Hòa tan 3g axit boric (H BO

­ Axit ascorbic, dung dịch chuẩn 1 g/l.

Cân 50mg axit ascorbic chính xác đến 0,01mg, trước đó đã khử nước trong bình hút ẩm tránh ánh sáng. Chuyển sang bình định mức dung tích 50ml và thêm dung dịch chiết cho đến vạch (3.5) trước khi sử dụng.

­ Dung dịch chiết 1) Axit metaphotphoric/axit axetic

Cho 30g axit metaphotphoric (HPO ) vào cốc hoặc sang bình nón dung tích 1 000ml có 3

3

chứa 80ml axit axetic bằng (CH COOH) và khoảng 500ml nước. Đun nóng và khuấy

nhẹ cho đến khi tan hết.

Để dung dịch nguội. Chuyển toàn bộ sang bình đựng mức dung tích 1000ml và thêm nước cho đến vạch.

Hoặc

2) Axit metaphotphoric/metanola

Trộn ba thể tích dung dịch axit metaphotphoric 4% (m/m) với 1 thể tích metanola.

3

Chú thích – Axit metaphotphoric có bán sẵn với hàm lượng HPO từ 40% đến 44%

­ Than hoạt tính

Cân 200g than hoạt tính và thêm vào 1 lít axit clohidric 10% .

Đun đến sôi, sau đó lọc qua bộ lọc thủy tinh xốp có độ xốp p 40 (từ 16μm đến 40μm ). Cho “bánh” cacbon vào cốc có mỏ. Thêm 1 lít nước, lắc và lọc kỹ qua bộ lọc thủy tinh xốp. Lặp lại 3 lần thao tác rửa với nước và lọc.

Cho phần cặn vào tủ sấy đặt ở nhiệt độ 1150C±50C và để 12h (thí dụ như để qua đêm).

4) Thiết bị

Sử dụng thiết bị thí nghiệm thông thường và thiết bị đặc biệt như:

­ Máy nghiền cơ học. ­ Máy li tâm. ­ Que khuấy, để dùng với bình nón và ống nghiệm. ­ Phổ kế huỳnh quang phân tử. Bước sóng kích thích và phát xạ tối ưu cho mẫu phân tích phải được xác định trước và phụ thuộc vào dụng cụ sử dụng. Nó được gắn với đèn phát quang phổ liên tục.

hành ­ Bình nón có dung tích thích hợp. ­ Bình định mức, dung tích 100ml. ­ Ống nghiệm, có đường kính 10mm. ­ Pipet, có dung tích thích hợp. ­ Giấy lọc. 5) Cách tiến ­ Chuẩn bị mẫu thử

Nghiền trộn kỹ mẫu thí nghiệm. Nếu cần, trước tiên loại bỏ các hạt và các vách cứng của khoang chứa hạt và cho mẫu thí nghiệm vào máy nghiền cơ học. Để cho sản phẩm đông lạnh tan giá trong bình đậy kín và đồng thời đổ chất lỏng đã tan vào mẫu thí nghiệm trước khi nghiền trộn.

­ Phần mẫu thử

Lấy một lượng mẫu thử, cân chính xác đến 0,1mg, cho vào bình nón sao cho sau khi pha loãng bằng dung dịch chiết, hàm lượng axit ascorbic và axit dehidroascorbic dự kiến trong khoảng 0-50mg/l.

­ Chuẩn bị dung dịch thử

3) Cho một lượng xác định dung dịch chiết vào phần mẫu thử sao cho hàm lượng axit ascorbic và axit dehidroascorbic dự kiến trong khoảng 0-50mg/l. Khuấy trong 30 phút và chạy ly tâm. Chỉnh pH đến 1,2 bằng một thể tích dung dịch chiết đã đong.

Lấy 100ml dung dịch này và cho thêm 1 g than hoạt tính. Trộn kỹ, sau đó lọc qua giấy lọc, loại bỏ vài mililit dịch lọc đầu tiên.

4) Dùng pipet, lấy 5ml dung dịch natri axetat và 5ml dịch lọc cho vào định mức dung tích 100ml. Trộn và thêm nước cho đến vạch. ­ Thử đối chiếu

Dùng pipet lấy 5ml dung dịch axit boric/natri axetat và 5 ml dịch lọc cho vào bình định mức dung tích 100 ml. Để 15 phút, thỉnh thoảng lắc trộn sau đó thêm nước cho đến vạch.

­ Xác định

Cho 2 ml dung dịch thử vào ống nghiệm và cho 2 ml dung dịch thử đối chiếu vào ống nghiệm khác.

Thêm 5 ml dung dịch O-Phenylendiamin dihidroclorua vào mỗi ống nghiệm, tránh ánh sáng chiếu vào. Dùng khe khuấy khuấy kỹ, sau đó để trong bóng tối 30 phút cho phản ứng xảy ra.

Tiến hành đo cả hai ống bằng phổ kế huỳnh quang phân tử đã được hiệu chỉnh trước, dùng đèn công suất tối thiểu. Lấy số đọc được của dung dịch thử trừ đi số đọc của dung dịch thử đối chiếu.

­ Đồ thị chuẩn

5) Dùng pipet lấy 2ml và 5ml dung dịch chuẩn cho vào hai bình định mức dung tích 100ml. Cho dung dịch chiết đến vạch. Hai dung dịch này chứa 20mg và 50mg axit ascorbic trong 1 lít.

Thêm vào mỗi dung dịch này 1 g than hoạt tính. Khuấy trộn kỹ, sau đó lọc qua giấy lọc, loại bỏ vài mililit dịch lọc đầu tiên.

6) Lặp lại các thao tác trên với cả hai dung dịch hiệu chuẩn, thay 5 ml dịch lọc bằng 5 ml của mỗi dung dịch hiệu chuẩn.

Dựng đồ thị chuẩn theo số đo quang phổ và nồng độ của cả hai dung dịch hiệu chuẩn và tính bằng miligam trên lít.

Vẽ đồ thị chuẩn đi qua gốc tọa độ và hai điểm thu được.

­ Số lần xác định

Tiến hành hai lần xác định trên cùng mẫu thử.

6) Biểu thị kết quả

Hàm lượng axit ascorbic và axit dehidroascorbic, biểu thị bằng miligam trên 100g sản phẩm, được tính theo công thức sau:

cV 10m 0

trong đó

0

m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam;

V là thể tích của dung dịch chiết thêm vào, tính bằng mililit;

c là nồng độ của axit ascorbic và axit dehidroascorbic có trong phần mẫu thử đọc từ đồ thị chuẩn và được hiệu chỉnh theo dung dịch thử đối chiếu, tính bằng miligam trên lít.

7) Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng và kết quả thử nghiệm thu được. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

Báo cáo kết quả cũng bao gồm tất cả các thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

b) Phương pháp thông thường (dựa theo TCVN 6427-2:1998). 1) Phạm vi áp dụng.

Phần này của tiêu chuẩn quy định hai phương pháp thông thường để xác định hàm

lượng axit ascorbic5 trong rau quả và các sản phẩm từ rau quả.

Phương pháp A: phương pháp chuẩn độ bằng 2,6 diclorophenolindophenol.

Phương pháp B: phương pháp đo quang phổ với 2,6 diclorophenolindophenol sau khi chiết bằng xylen.

Phương pháp A chỉ áp dụng khi không có một số chất gây nhiễm.

Phương pháp B có thể áp dụng cho các sản phẩm từ rau quả trong những đoạn dung dịch có màu mạnh.

Phương pháp đo phổ 2,6 diclophenolindophenol sau khi chiết với xylen

2) Nguyên tắc

Chiết axit ascorbic từ phần mẫu thử bằng dung dịch axit oxalic hoặc dung dịch axit metaphotphoric/ axit axetic. Khử từ từ thuốc nhuộm mầu 2,6 diclorophenolindophenol bằng axit ascorbic, chiết lượng thuốc nhuộm mầu dư bằng xylen và xác định lượng dư này bằng phương pháp đo phổ ở bước sóng 500nm.

3) Thuốc thử

Tất cả các thuốc thử phải là loại phân tích. Sử dụng nước cất hoặc nước có độ tinh

khiết tương đương.

3.2. Dung dịch chiết

Dùng dung dịch axit oxalic 2% (m/m), hoặc dung dịch axit metaphotphoric/axit axetic được chuẩn bị như sau:

5 axit ascorbic được xác định theo axit dehidroascorbic

Hòa tan 15g axit metaphotphoric trong 40ml axit axetic băng và 200ml nước trong một bình định mức dung tích 500ml thêm nước cho tới vạch và lọc ngay qua giấy lọc cho vào một chai thủy tinh.

Dung dịch này có thể bảo quản được trong tủ lạnh từ 7 đến 10 ngày.

3.2 Natri axetat/axit axetic, dung dịch đệm, pH 4,0.

Cho 300g natri axetat khan vào 700ml nước và 1000ml axit axetic băng.

3.3 2,6 diclorophenolindophenol, dung dịch thuốc nhuộm.

Hòa tan 50mg muối natri của 2,6 diclorophenolindophenol trong 150ml nước nóng (50-600C) chứa 42mg natri hydro cacbonat trong bình định mức dung tích 200ml thêm nước đến vạch và lọc. Bảo quản dung dịch này trong chai màu nâu sẫm và để trong tủ lạnh. Vì dung dịch này bị phân hủy theo thời gian nên phải pha dung dịch mới theo định kỳ.

3.4 Axit ascorbic, dung dịch chuẩn 1g/l

Cân 50mg axit ascorbic, cân chính xác đến 0,01mg được bảo quản trong bình

hút ẩm, cho vào bình định mức dung tích 50ml và thêm dung dịch chiết cho tới vạch.

3.5 Xylen

Cảnh báo: xylen có tác dụng gây mê ở nồng độ cao cho nên tất cả các thao tác liên quan đến việc sử dụng xylen phải tiến hành trong tủ hút.

Kiểm tra độ tinh khiết của xylen như sau:

Cho axit ascorbic vào một lượng nhỏ thuốc nhuộm (3.3) cho đến khi dung dịch bị phai màu, lắc với 10ml xylen. Để trong 10 phút. Nếu có bất kỳ vết màu nào trong lớp xylen thì xylen đó phải được chưng cất.

Xylen sử dụng trong việc xác định này có thể được thu hồi bằng cách lắc với dung dịch natri hydroxit 20%( m/m) để trung hòa axit axetic, sau đó chưng cất lại.

4) Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị dụng cụ thí nghiệm thông thường, và

4.1 Cân phân tích.

4.2 Máy trộn.

4.3 Microburet có dung tích 2ml, 5ml và 10ml

4.4 Ống li tâm dung tích 25ml có nút thủy tinh.

4.5 Máy li tâm

4.6 Máy đo phổ, thích hợp để đo ở bước sóng 500nm.

5) Cách tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

Nếu cần, loại bỏ hạt và những vách cứng của khoang chứa hạt rồi trộn kỹ mẫu.

Lọc và tiến hành xác định đối với dịch lọc.

Để sản phẩm đông lạnh tan giá trong một bình kín và cho dịch tan chảy này vào sản phẩm trước khi nghiền trộn mẫu.

5.2 Phần mẫu thử

Cân từ 10g đến 100g mẫu chính xác đến 0,1mg.

5.3 Xác định

5.3.1 Chiết

Trộn phần mẫu thử với dung dịch chiết sao cho thể tích dịch chiết, tính bằng mililit gấp từ 1 đến 5 lần khối lượng phần mẫu thử tính bằng gam.

Lọc dung dịch, loại bỏ một vài mililit dịch lọc ban đầu.

Nồng độ axit ascorbic trong dung dịch thử này phải trong khoảng từ 0,05mg/l đến 0,5mg/ml.

5.3.2 Chuẩn hóa dung dịch thuốc nhuộm mầu

Pha loãng 5ml dung dịch axit ascorbic chuẩn với 5ml dung dịch chiết và chuẩn độ nhanh bằng dung dịch thuốc nhuộm mầu cho đến khi có màu hồng bền ít nhất trong 5 giây. Lặp lại quá trình này thêm hai lần, và ghi lại thể tích dung dịch thuốc nhuộm mầu đã sử dụng cho mỗi lần, chính xác đến 0,1ml.

Tiến hành như vậy đối với mẫu trắng, thay 5ml dung dịch axit ascorbic chuẩn bằng 5ml dung dịch chiết.

Lấy thể tích dung dịch thuốc nhuộm sử dụng cho ba lần chuẩn độ trừ đi kết quả của mẫu trắng và biểu thị nồng độ của dung dịch thuốc nhuộm mầu theo khối lượng, tính bằng miligam của axit ascorbic tương đương với 1,0ml dung dịch.

5.3.3 Khử

Dùng pipet lấy từ 1ml đến 5ml dung dịch thử cho vào một ống li tâm (4.4) và cho thêm một lượng tương đương dịch đệm. Thêm ngay một lượng dư thuốc nhuộm, lắc và thêm 10ml xylen. Đậy nút và lắc mạnh trong 6-10 giây. Ly tâm để tách riêng lớp xylen ở trên. Lấy ra cẩn thận lớp xylen ở trên và đổ đầy vào cuvet đo phổ.

5.3.4 Đo phổ

Đo độ hấp thụ của lớp xylen ở bước sóng 500nm.

5.4 Thử mẫu trắng.

Đo độ hấp thụ của xylen ở bước sóng 500nm

5.5 Chuẩn bị đồ thị chuẩn

Chuyển vào bốn ống li tâm mỗi ống cùng một lượng dung dịch chiết như dùng để xác định. Cho vào mỗi ống li tâm một lượng dung dịch đệm và thêm vào từng ống lần lượt 0,2ml, 0,4ml, 0,6ml và 0,8ml dung dịch thuốc nhuộm mầu.

Dùng pipet lấy từ 1ml đến 5ml dung dịch thử cho vào một ống li tâm và cho thêm một lượng tương đương dịch đệm. Thêm ngay một lượng dư thuốc nhuộm, lắc và thêm 10ml xylen. Đậy nút và lắc mạnh trong 6-10 giây. Ly tâm để tách riêng lớp xylen ở trên. Lấy ra cẩn thận lớp xylen ở trên và đổ đầy vào cuvet đo phổ.

Dựng đồ thị của độ hấp thụ tương ứng với thể tích dung dịch thuốc nhuộm đã cho vào.

5.6 Số lần xác định

Thực hiện hai lần xác định trên cùng mẫu thử.

6) Biểu thị kết quả

(V

m

0

1 (cid:0) 100

1 ) (cid:0) (cid:0)  V m 0

Hàm lượng axit ascorbic, tính bằng miligam trong 100g sản phẩm theo công thức:

trong đó:

0

m là khối lượng của phần mẫu thử lấy để xác định, tính bằng gam;

1

m là khối lượng axit ascorbic tương đương với 1,0ml dung dịch thuốc thử, tính bằng

miligam;

0

V là thể tích dung dịch thuốc nhuộm cho vào (3.3), tính bằng mililit;

1

V là thể tích thuốc nhuộm dư tương ứng với độ hấp thụ đo được trong 3.4.3.4, đọc từ

đồ thị chuẩn, tính bằng mililit.

7) Độ lặp lại

Chênh lệch giữa các kết quả của hai lần xác định, được thực hiện đồng thời hoặc liên tiếp nhanh bởi cùng một người phân tích trên cùng một mẫu thử, phải không vượt quá 3% giá trị trung bình.

8) Những lưu ý trong trình tự thử

­ Nếu sản phẩm chứa những sắc tố có thể chiết bằng xylen, hiệu chỉnh mẫu trắng

hydroquynon như sau:

Sau khi đo độ hấp thụ của lớp xylen, thêm 2 giọt dung dịch hydroquynon nửa bão hòa (được pha chế bằng cách thêm hai lần thể tích axeton cần thiết để đạt được một dung dịch hydroquynon bão hòa), lắc trộn, để trong 30 giây và đo lại độ hấp thụ lần nữa. Lấy độ hấp thụ ban đầu của lớp xylen trừ đi độ hấp thụ lần sau.

­ Nếu sản phẩm đã bị quá nhiệt hoặc được bảo quản quá lâu, hoặc, trong trường hợp,

những sản phẩm tự nhiên (ví dụ: nước nho tím đen), có thể xử lý bằng

formaldehyt để kiểm tra sự có mặt của những chất khử không liên quan đến axit ascorbic. Để thực hiện mục đích này, tiến hành mẫu đối chứng song song với mẫu xác định, tiến hành như trong 3.4 đến khi thêm dung dịch thuốc nhuộm. Trước khi thêm thuốc nhuộm mầu, cho vào dung dịch thử 1ml nước và cho vào dung dịch kiểm tra 1ml dung dịch formadehyt 40%. Để trong 10 phút rồi tiến hành xác định.

Từ đồ thị chuẩn xác định thể tích dung dịch thuốc nhuộm bị mất màu bởi những

chất gây nhiễu và hiệu chỉnh kết quả sao cho phù hợp.

9) Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả phải nêu phương pháp đã sử dụng và kết quả thu được. Cũng phải kể đến bất kỳ chi tiết nào không nêu trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi như tùy ý lựa chọn, cùng với những chi tiết bất thường nào ảnh hưởng đến kết quả.

Báo cáo kết quả phải bao gồm tất cả những thông tin cần thiết cho việc nhận biết hoàn toàn mẫu thử.

2.2.5 Xác định hàm lượng axit benzoic và các muối của nó (dựa vào TCVN

6428:2007). 1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng axit benzoic trong rau,

quả và sản phẩm rau quả.

Vì các axit clorơbenzoic là các chất chống oxi hóa nên phương pháp này không thể áp dụng khi có mặt axit p-clorobenzoic, vì phổ hấp thụ của axit này rất gần với phổ hấp thụ của axit benzoic. Phương pháp này cũng không thể sử dụng khi có mặt của axit xinamic, do oxi hóa axit cromic chuyển hóa thành axit benzoic.

CHÚ THÍCH Axit cromic được xác định theo axit benzoic trong phương pháp này nói chung chúng chỉ tồn tại ở dạng vết trong các loại rau và theo đó nó không ảnh hưởng đến kết quả thu được, ngoại trừ trong trường hợp vỏ cây quế có chứa một lượng lớn hơn.

2) Nguyên tắc

Mẫu thử được đồng hóa, sau đó được pha loãng và axit hóa phần mẫu thử. Axit benzoic được chiết bằng dietyl ete, rồi được chiết tiếp bằng kiềm và tinh chế bằng oxi hóa sử dụng kali dicromat đã axit hóa. Axit benzoic tinh sạch hòa tan trong dietyl ete được xác định bằng cách đo quang phổ.

3) Thuốc thử

Các thuốc thử được sử dụng phải thuộc loại phân tích và nước được sử dụng phải

là nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

2

3.1. Axit tartric [COOH(CHOH) COOH], dạng tinh thể.

3.2. Natri hydroxit (NaOH), dung dịch khoảng 1 mol/l.

3.3. Kali dicromat (K Cr 2 O 2 ), dung dịch chứa 33 g/l đến 34 g/l. 7

2

4

SO ), thu được bằng cách pha loãng 2 phần thể tích axit

20

3.4. Axit sulfuric loãng (H sulfuric đậm đặc ((cid:0) = 1,84 g/ml) với 1 phần thể tích nước.

2

3.5. Dietyl ete [(CH ) CH 3 O], mới chưng cất. 2

6

3.6. Axit benzoic (C COOH), dung dịch chuẩn trong dietyl ete chứa 0,100 g/l. H 5

3

3.7. Natri hydro cacbonat (NaHCO ), dạng tinh thể.

4) Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1. Bình định mức, dung tích 50 ml và 1000 ml.

4.2. Cốc có mỏ, dung tích 50 ml và 100 ml.

4.3. Pipet chia vạch, dung tích 10 ml, 20 ml và 50 ml.

4.4. Bình, dung tích 250 ml, có nút thủy tinh mài và làm từ thủy tinh bosilicat.

4.5. Phễu chiết, dung tích 100 ml và 500 ml.

4.6. Đĩa bay hơi, đường kính khoảng 10 cm.

4.7. Nồi cách thủy, có thể kiểm soát được ở nhiệt độ 70 oC đến 80 oC.

4.8. Bộ đồng hóa hoặc cối, thích hợp.

4.9. Máy đo quang phổ dùng cho xác định trong vùng cực tím, được trang bị một máy đo đơn sắc có thể đo chính xác đến 0,5 nm, có các cuvet silic với chiều dài đường quang là 10 mm hoặc 20 mm (tốt nhất là 20 mm để tăng độ nhạy), có nút thủy tinh mài.

4.10. Cân phân tích.

5) Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay

đổi trong quá trình bảo quản hoặc vận chuyển.

6) Cách tiến hành

6.1. Chuẩn bị mẫu thử

6.1.1. Sản phẩm dạng lỏng (ví dụ: nước ép quả, sản phẩm dạng lỏng có thịt quả, sirô)

Trộn kỹ mẫu phòng thử nghiệm.

6.1.2. Sản phẩm dạng sệt (ví dụ: mứt quả, mứt nhiễu)

Đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm sau khi đã trộn kỹ mẫu.

6.1.3. Sản phẩm dạng rắn (ví dụ: quả, rau)

Cắt một phần mẫu phòng thử nghiệm thành các miếng nhỏ và loại bỏ hạt, cuống và các phần non, nếu cần. Đồng hóa cẩn thận khoảng 40 g mẫu.

6.1.4. Sản phẩm lạnh đông hoặc lạnh đông sâu

Cho sản phẩm lạnh đông hoặc lạnh đông sâu tan băng trong bình kín, bỏ hạt, cuống và các phần non, nếu cần, rồi trộn nước tan ra với sản phẩm và tiến hành theo 6.2.1, 6.2.2 và 6.2.3.

6.2. Chuẩn bị phần mẫu thử

6.2.1. Sản phẩm dạng lỏng

Dùng pipet lấy 20 ml mẫu thử (6.1) không chứa các thành phần lơ lửng, pha loãng với khoảng 50 ml nước và chuyển vào phễu chiết 500 ml (phễu chiết A).

Phần mẫu thử cũng có thể được lấy theo khối lượng bằng cách cân khoảng 20 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g.

6.2.2. Sản phẩm dạng lỏng có thịt quả

Lấy 20 ml mẫu thử. Cho vào bộ đồng hóa hoặc cối và pha loãng bằng 20 ml nước. Sau khi gạn, lọc dịch lỏng thu được.

Tiến hành hai lần liên tiếp, cho 20 ml nước vào phần cặn và sau khi gạn, lọc dịch lỏng thu được.

Thu lấy dịch lọc trực tiếp vào phễu chiết 500 ml (phễu chiết A).

Có thể lấy mẫu thử theo khối lượng bằng cách cân khoảng 20 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g.

6.2.3. Sản phẩm dạng sệt hoặc rắn

Cân khoảng 10 g mẫu thử chính xác đến 0,01 g và dùng khoảng từ 30 ml đến 40 ml nước để chuyển hết mẫu vào bình 250 ml.

Cho khoảng 50 mg natri hydro cacbonat vào bình (xem chú thích). Lắc, sau đó đặt bình vào nồi cách thủy, duy trì nhiệt độ ở 70 oC đến 80 oC, và để yên trong 15 min đến 30 min. Lọc dịch chứa trong bình và tráng bình hai lần, mỗi lần sử dụng 15 ml đến 20 ml nước.

Thu toàn bộ dịch lọc vào phễu chiết 500 ml (phễu chiết A). Để nguội.

CHÚ THÍCH Việc bổ sung natri hydro cacbonat nhằm trung hòa axit benzoic do vết của nó có thể bị mất do quá trình bay hơi.

6.3. Chiết axit benzoic

CẢNH BÁO – Cần chú ý các nguy hiểm khi sử dụng dietyl ete, đây là hợp chất rất dễ cháy, nổ và nguy hiểm.

6.3.1. Cho 1g axit tartric vào phễu phân tách A có chứa phần mẫu thử đã pha loãng, thêm 60 ml dietyl ete và lắc kỹ.

Để cho dung dịch phân lớp, sau đó thu lớp ete trong phễu chiết 500 ml thứ hai (phễu chiết B).

Rửa pha lỏng trong phễu chiết thứ nhất (A) bằng 60 ml dietyl ete.

Để cho dung dịch phân lớp, sau đó thu lớp ete trong phễu chiết (B) có chứa lớp ete đầu tiên thu được.

Tiến hành tương tự với dịch chiết thứ ba với 30 ml dietyl ete và trộn lớp ete thu được với hai lớp ban đầu trong phễu chiết (B).

6.3.2. Chiết axit benzoic từ dung dịch ete bằng việc thêm lần lượt 10 ml và sau đó 5 ml dung dịch natri hydroxit (3.2), và tiếp theo là hai lần 10 ml nước. Sau mỗi lần thêm, lắc, rồi để phân lớp và thu pha lỏng.

Thu pha lỏng vào một đĩa bay hơi (4.6). Đặt đĩa vào nồi cách thủy (4.7) , giữ nhiệt ở 70 oC đến 80 oC cho đến khi thể tích dung dịch kiềm giảm xuống khoảng một nửa, để loại bỏ dietyl ete hòa tan còn dư.

6.4. Tinh chế axit benzoic

Sau khi để nguội, rót dịch trong đĩa vào bình 250 ml (4.4) có chứa hỗn hợp của axit sulfuric loãng (3.4) và 20 ml dung dịch kali dicromat (3.3). Đậy nắp bình và để yên ít nhất 1 h.

Các chất bảo quản khác thu được từ axit benzoic có thể xuất hiện. Trong trường hợp này, để yên bình ít nhất 3 h để ôxi hóa hoàn toàn ba axit hydroxybenzoic và tránh gây nhiễu phép xác định. Việc tăng thêm thời gian phản ứng không ảnh hưởng gì, do axit benzoic chịu được hỗn hợp ôxi hóa này.

Khi sản phẩm ban đầu cũng chứa axit sorbic, cần phải oxi hóa kéo dài đến 24 h để đảm bảo rằng đã phân hủy hoàn toàn axit này.

6.5. Chiết axit benzoic đã tinh chế

Chiết axit benzoic bằng cách xử lý dung dịch trên (6.4) hai lần với 20 ml đến 25 ml dietyl ete (3.5), thu dung dịch ete. Rửa dung dịch ete hai lần bằng vài mililit nước. Sau đó gạn thật cẩn thận, lọc qua giấy lọc khô và thu dịch lọc vào bình định mức 50 ml (4.1). Rửa giấy lọc với vài mililit dietyl ete, thêm dung môi rửa vừa đủ để pha loãng đến vạch.

6.6. Phương pháp xác định

Sử dụng máy đo quang phổ (4.9), đo độ hấp thụ của dung dịch ete (6.5) tương ứng với độ hấp thụ của dietyl ete tinh khiết ở bước sóng 267,5 nm, 272 nm và 276,5 nm (xem chú thích).

Độ hấp thụ tính theo axit benzoic trong công thức này đối với phương pháp so sánh ở bước sóng 272 nm là:

1   2

(cid:0) A

A  (cid:0)   2 A 3

Trong đó

1

A là độ hấp thụ ở 267,5 nm;

2

A là độ hấp thụ ở 272 nm;

3

A là độ hấp thụ ở 276,5 nm.

CHÚ THÍCH Kiểm tra phổ hấp thụ của dung dịch ete của axit benzoic đã tinh chế để nhận biết các tính chất của sản phẩm này qua sự có mặt của hai pic ở bước sóng 272 nm và 279 nm.

Axit benzoic đã chiết bằng dietyl ete được xác định bằng cách đo độ cao của các pic tương ứng ở bước sóng 272 nm đối với đường thẳng nối các điểm trên hệ trục tọa độ giữa bước sóng 267,5 nm và bước sóng 276,5 nm.

6.7. Số lần xác định

Tiến hành hai phép xác định trên cùng một mẫu thử (6.1).

6.8. Dựng đường chuẩn

Lấy lần lượt 5 ml, 7,5 ml, 10 ml, 12,5 ml, 15 ml và 20 ml dung dịch axit benzoic chuẩn (3.6) cho vào một dãy sáu bình định mức 50 ml (4.1). Pha loãng đến vạch bằng dietyl ete (3.5).

Dung dịch thu được chứa lần lượt 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg và 40 mg axit benzoic trên lít.

Vẽ đường cong mô tả các phép đo khác nhau theo hàm lượng aixt benzoic được chỉ ra ở trên, tính bằng miligam trên lít.

7) Tính toán và biểu thị kết quả

7.1. Phần mẫu thử lấy bằng pipet

50

Hàm lượng axit benzoic, tính bằng miligam trên lít sản phẩm, được tính theo công thức:

2,5m

m 2

2

20

(cid:0) (cid:0)

2

Trong đó m là khối lượng của axit benzoic đọc được từ đường chuẩn (6.8), tính bằng

miligam.

7.2. Phần mẫu thử lấy bằng cách cân

Hàm lượng axit benzoic, tính bằng miligam trên kilogam sản phẩm, theo công thức sau đây:

50

(cid:0)

m 2

1

Trong đó

1

m là khối lượng của phần mẫu thử (6.2), tính bằng gam;

2

m là khối lượng của axit benzoic đọc từ đường chuẩn (6.8), tính bằng miligam.

8) Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn không quá 5 % các trường hợp vượt quá 10 ml axit benzoic trên lít hoặc trên kilogam sản phẩm, tùy vào từng trường hợp cụ thể.

CHÚ THÍCH Phương pháp cho phép xác định lượng axit benzoic chính xác đến 2 mg khi sản phẩm chứa dưới 50 mg trên lít hoặc kilogam sản phẩm.

9) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) Phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) Mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) Kết quả thu được hoặc nếu đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

2.2.6 Xác định hàm lượng axit sorbic (dựa theo TCVN 7807:2007) 1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp tách chiết axit sorbic có trong rau, quả và sản phẩm rau, quả và hai kỹ thuật xác định lượng axit sorbic tách chiết được.

2) Nguyên tắc

Đồng hóa toàn bộ sản phẩm rồi tiến hành chưng cất cuốn theo hơi nước, nhằm tách lượng axit sorbic có trong phần mẫu thử. Xác định lượng axit sorbic có trong sản phẩm chưng cất thu được bằng kỹ thuật quang phổ trong miền cực tím hoặc đo màu hay đo

quang phổ của màu hồng tạo thành sau khi oxi hóa axit cromic và xử lý bằng axit barbituric.

3) Cách tiến hành

3.1. Chuẩn bị mẫu thử

3.1.1. Sản phẩm dạng lỏng (nước ép rau, quả; nước rau, quả nghiền; xirô) và sản phẩm dạng sệt (mứt quả)

Đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm sau khi đã trộn kỹ.

3.1.2. Sản phẩm dạng rắn (rau, quả)

Cắt sản phẩm thành những miếng nhỏ, loại bỏ hạt nếu có. Lấy khoảng 40 g sản phẩm và đồng hóa trong máy đồng hóa hoặc cối.

Đối với sản phẩm đông lạnh hoặc đông lạnh sâu thì tiến hành làm tan băng trong bình kín và gộp phần nước tan ra trong quá trình này với sản phẩm trước khi đồng hóa.

3.2. Phần mẫu thử

3.2.1. Sản phẩm dạng lỏng

Dùng pipet lấy 10 ml mẫu thử rồi chuyển vào thiết bị sục khí.

CHÚ THÍCH Phần mẫu thử có thể được lấy theo khối lượng bằng cách cân khoảng 10 g mẫu, chính xác đến 0,01 g.

3.2.2. Sản phẩm dạng sệt hoặc rắn

Cân khoảng 10 g sản phẩm, chính xác đến 0,01 g, rồi chuyển vào thiết bị sục khí, dùng một lượng nước tối thiểu để tráng hết phần mẫu thử sao cho hỗn hợp vừa đủ độ loãng.

CHÚ THÍCH Trong một số trường hợp, cần phải ngâm mẫu thử trong nước từ 1 h đến 2 h.

3.3. Chưng cất

Trong thiết bị sục khí đã có phần mẫu thử bổ sung 0,5 g axit tartric. Nối thiết bị sục khí với bình sinh hơi và với thiết bị ngưng tụ đồng thời cấp nhiệt cho bình sinh hơi và thiết bị sục khí. Tiến hành chưng cất, chú ý sao cho thể tích trong bình sục khí không tăng hay giảm quá 5 ml.

3.3.1. Sản phẩm dạng lỏng.

Thu sản phẩm chưng cất vào trong bình định mức 200 ml, dừng quá trình chưng cất khi sản phẩm chưng cất đạt mức 200 ml.

3.3.2. Sản phẩm dạng sệt hoặc rắn.

Thu lấy sản phẩm chưng cất vào bình định mức 500 ml, khi thể tích sản phẩm chưng cất thu được lớn hơn ít nhất 20 lần so với thể tích dung dịch chứa trong thiết bị sục khí,

thì dừng quá trình chưng cất. Đo thể tích của sản phẩm chưng cất thu được bằng ống đong.

3.4. Xác định bằng máy đo quang phổ trong vùng cực tím

3.4.1. Phương pháp xác định

3.4.1.1. Nếu trong sản phẩm ban đầu có chứa tinh dầu tỏi, hành hay tỏi tây, những tinh dầu này cũng hấp thụ ánh sáng và sẽ ảnh hưởng đến kết quả đo, đặc biệt đối với tỏi. Kiềm hóa sản phẩm chưng cất rồi cho bay hơi triệt để sẽ loại bỏ được tác động này6.

Khi trong sản phẩm chưng cất có những tinh dầu này, dùng pipet lấy 25 ml sản phẩm chưng cất cho vào một cái đĩa nhỏ. Kiềm hóa bằng cách bổ sung từ 1,5 ml đến 2 ml dung dịch canxi hydroxit, cho bay hơi đến khô trên nồi cách thủy và hòa lại bằng nước để có được thể tích ban đầu.

3.4.1.2. Tùy từng trường hợp, có thể dùng pipet lấy 10 ml sản phẩm chưng cất hoặc dung dịch tạo thành sau khi sấy khô cho vào bình nón 50 ml rồi bổ sung 10 ml dung dịch xúc tác đồng. Lắc nhanh, rồi để yên cho tiếp xúc không khí trong vài min.

CHÚ THÍCH Thể tích là 10 ml quy định trong trường hợp hàm lượng axit sorbic trong sản phẩm không vượt quá 200 mg trên lít hoặc trên kilogam. Với hàm lượng cao hơn thì chỉ lấy từ 2 ml đến 5 ml sản phẩm chưng cất rồi hòa loãng bằng nước để đạt đến thể tích 10 ml.

Đo độ hấp thụ của dung dịch bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 256 nm.

Lấy giá trị xác định được trừ đi giá trị đo được với dung dịch mẫu trắng.

Tiến hành phép thử trắng song song với phép xác định nhưng thay thế 10 ml dịch chưng cất bằng 10 ml nước.

3.4.3. Số lần xác định

Tiến hành hai phép xác định trên cùng một mẫu thử (3.1).

3.4.4. Dựng đường chuẩn

3.4.4.1. Dùng pipet cho vào một dãy sáu bình tam giác 50 ml, lần lượt như sau:

0 ml - 1 ml - 2 ml - 3 ml - 5 ml - 10 ml dung dịch axit sorbic chuẩn; để có được thể tích là 10ml cần thêm nước với các lượng sau đây:

10 ml - 9 ml - 8 ml - 7 ml - 5 ml - 0 ml. Dung dịch thu được có nồng độ tương ứng là 0 mg - 1 mg - 2 mg - 3 mg - 5 mg - 10 mg axit sorbic trên lít.

3.4.4.2. Thêm vào mỗi bình nón 10 ml dung dịch xúc tác đồng.

6 Quá trình bay hơi chỉ làm sấy khô chứ không làm phân hủy axit sorbic nếu dung dịch đủ độ kiềm.

Đo độ hấp thụ của các dung dịch bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 256 nm.

Lấy giá trị xác định được trừ đi giá trị đo được với dung dịch thử trắng (3.4.2).

3.4.4.3. Vẽ độ thị đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa độ hấp thụ của các dung dịch (3.4.4.2) và nồng độ axit sorbic của các dung dịch thu được từ 3.4.4.1, tính bằng miligam trên lít, nghĩa là trước khi bổ sung dung dịch xúc tác đồng.

3.5. Kỹ thuật B: Xác định bằng máy đo màu hay máy đo quang phổ ở bước sóng 532 nm

3.5.1. Phương pháp xác định

3.5.1.1. Nếu trong sản phẩm ban đầu có chứa etanol thì loại bỏ ra khỏi sản phẩm chưng cất theo phương pháp sau đây:

Dùng pipet lấy 25 ml sản phẩm chưng cất cho vào một cái đĩa nhỏ; kiềm hóa bằng cách bổ sung từ 1,5 ml đến 2 ml dung dịch canxi hydroxit, cho đĩa vào nồi cách thủy (4.3) bay hơi cho đến khi thể tích giảm còn một nửa, thường mất khoảng 30 min. Chuyển toàn bộ phần còn lại vào bình định mức 25 ml, dùng nước tráng sạch đĩa, thêm nước cho đến vạch rồi lắc đều.

3.5.1.2. Nếu trong sản phẩm ban đầu có chứa tinh dầu (trong trường hợp nước ép từ quả thuộc nhóm cam, quýt), loại bỏ tinh dầu khỏi sản phẩm chưng cất theo phương pháp đã được mô tả trong 3.5.1.1 nhưng kéo dài quá trình bay hơi cho đến khi thể tích dung dịch còn lại trên đĩa chỉ còn từ 1 ml đến 2 ml.

3.5.1.3. Nếu trong sản phẩm ban đầu có chứa tinh dầu tỏi, hành hoặc hành tây, tiến hành như đã mô tả trong 3.4.1.1.

CHÚ THÍCH Trong trường hợp của tinh dầu tỏi, ngay cả khi sản phẩm chưng cất đã được bay hơi kiệt thì tinh dầu tỏi vẫn còn sót và ảnh hưởng đến giá trị hấp thụ ánh sáng đo được của mẫu, sai lệch này tương đương với 1,5 mg axit sorbic trên kilogam.

3.5.1.4. Tùy trường hợp, có thể dùng pipet lấy 10 ml (xem chú thích dưới đây) sản phẩm chưng cất (3.3) hoặc dung dịch thu được sau khi xử lý (3.5.1.1, 3.5.1.2 hoặc 3.5.1.3) rồi chuyển vào bình định mức 25 ml.

CHÚ THÍCH Thể tích là 10 ml quy định trong trường hợp hàm lượng axit sorbic trong sản phẩm không vượt quá 200 mg trên lít hoặc trên kg. Với hàm lượng cao hơn thì chỉ lấy từ 2 ml đến 5 ml sản phẩm chưng cất rồi hòa loãng bằng nước để đạt đến thể tích 10 ml.

Bổ sung 4 ml dung dịch axit cromic-sulfuric và giữ bình trong nồi cách thủy trong vòng 10 min.

Cho thêm 4 ml dung dịch axit thiobarbituric và giữ bình trong nồi cách thủy thêm 20min nữa; màu hồng sẽ xuất hiện. Làm nguội bình trong bể nước đá và thêm nước cho đến vạch.

Trong vòng 30 min sau đó, đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch bằng máy đo màu hoặc máy đo quang phổ ở bước sóng 532 nm.

Lấy giá trị đo được trừ đi giá trị đo được với dung dịch thử trắng (3.5.2).

3.5.2. Phép thử trắng

Đo độ hấp thụ của thử trắng tương tự như của mẫu thử nhưng thay 10 ml sản phẩm chưng cất bằng 10 ml nước.

3.5.3. Số lần xác định

Tiến hành hai lần xác định trên cùng một mẫu thử.

3.5.4. Dựng đường chuẩn

3.5.4.1. Chuẩn bị dung dịch axit sorbic chuẩn nồng độ 2,0 mg/l bằng cách pha loãng 1 thể tích dung dịch chuẩn với 4 thể tích nước.

3.5.4.2. Dùng pipet cho vào một dãy sáu bình định mức 25 ml, lần lượt như sau:

0 ml - 2 ml - 4 ml - 6 ml - 8 ml - 10 ml dung dịch axit sorbic chuẩn (3.5.4.1); để có được thể tích 10 ml cần cho thêm nước với các lượng sau đây:

10 ml - 8 ml - 6 ml - 4 ml - 2 ml - 0 ml. Dung dịch thu được có nồng độ lần lượt là: 0 mg - 0,4 mg - 0,8 mg - 1,2 mg - 1,6 mg - 2,0 mg axit sorbic trên lít.

3.5.4.3. Thêm vào mỗi bình cầu 4 ml dung dịch axit cromic-sulfuric và giữ bình trên nồi cách thủy trong vòng 10 min.

Thêm 4 ml dung dịch axit thiobarbituric và giữ bình trên nồi cách thủy để thêm 20 min nữa; màu hồng sẽ xuất hiện. Làm nguội bình trong bể nước đá và thêm nước đến vạch.

Trong vòng 30 min sau đó, đo độ hấp thụ ánh sáng của các dung dịch bằng máy đo màu hoặc máy đo quang phổ ở bước sóng 532 nm.

Lấy các giá trị đo được trừ đi giá trị đo được trong phép thử trắng (3.5.2).

3.5.4.4. Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ axit sorbic, đơn vị miligam trên lít, của các dung dịch (5.5.4.3).

4) Biểu thị kết quả7

4.1. Phương pháp tính và công thức

4.1.1. Phần mẫu thử lấy theo thể tích

7 Trong nhiều sản phẩm từ thực vật có chứa một lượng nhỏ các hợp chất bay hơi, những hợp chất này có thể được chiết ra bởi các dung môi hữu cơ và chúng có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 256 nm hay gây nên phản ứng tạo màu trong kỹ thuật B (3.5). Vì vậy, kết quả cần được giải thích rõ (mặc dù mức độ sai lệch tương đối nhỏ, tương đương với nhỏ hơn 10 mg trên lít hay trên kilogam) và so sánh với kết quả phân tích trên các sản phẩm cùng loại và không chứa axit sorbic.

Hàm lượng axit sorbic tính theo miligam trên lít sản phẩm được tính theo công thức:

(cid:0)

m

200

1

V

1

Trong đó

1

m là khối lượng của axit sorbic tính được từ đường chuẩn (xem 3.4.4 hoặc 3.5.4), tính

bằng miligam trên lít sản phẩm chưng cất (3.3.1);

1

V là thể tích đã sử dụng trong 3.4.1.2 hoặc 3.5.1.4 (thường là 10 ml, nhưng cũng có

thể là 5 ml hoặc 2 ml), tính bằng mililit.

4.1.2. Phần mẫu thử lấy theo khối lượng

(cid:0) V (cid:0) 10 (cid:0) V

m 1  m 0

1

Hàm lượng axit sorbic, tính bằng miligam trên kilogam, được tính theo công thức sau đây:

Trong đó

0

m là khối lượng của phần mẫu thử (3.2.2), tính bằng gam;

1

m là khối lượng của axit sorbic tính được từ đường chuẩn (xem 3.4.4 hoặc 3.5.4), tính

bằng miligam trên lít sản phẩm chưng cất (3.3.2);

V là thể tích của sản phẩm chưng cất thu được, tính bằng mililit (xem 3.3.2);

1

V là thể tích đã sử dụng trong 3.4.1.2 hoặc 3.5.1.4 (thường là 10 ml, nhưng cũng có

thể là 5 ml hoặc 2 ml), tính bằng mililit.

4.2. Độ lặp lại

Chênh lệch giữa kết quả của hai phép xác định thực hiện đồng thời hoặc liên tiếp nhanh bởi cùng một người không được vượt quá 5 % giá trị trung bình tương đối.

5) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ phương pháp sử dụng và kết quả thu được. Báo cáo cũng phải nêu rõ mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Báo cáo thử nghiệm cũng phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

Hình vẽ - Sơ đồ thiết bị chưng cất bằng hơi nước (4.4)

2.2.7 Xác định chất rắn hòa tan – phương pháp khúc xạ (dựa vào TCVN

7771:2007)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định chất rắn hòa tan trong sản phẩm rau, quả bằng khúc xạ.

Phương pháp này có thể áp dụng riêng cho các sản phẩm dạng sệt, huyền phù và sản phẩm giàu đường. Nếu sản phẩm chứa các chất không hòa tan khác, kết quả có thể chỉ là tương đối; tuy nhiên, để thuận tiện thì có thể quy ước kết quả thu được bằng phương pháp này là hàm lượng chất rắn hòa tan.

tắc

2) Nguyên Chỉ số khúc xạ của dung dịch thử được xác định ở 20 0C ± 0,50C sử dụng máy đo khúc xạ. Chỉ số khúc xạ tương quan với lượng chất rắn hòa tan (biểu thị theo nồng độ sacaroza) sử dụng các bảng tỷ lệ khối lượng chất rắn hòa tan hoặc đọc trực tiếp trên máy đo khúc xạ.

3) Thuốc thử

Các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích. Nước sử dụng phải được cất hai lần trong thiết bị thủy tinh bosilicat hoặc tối thiểu là nước có độ tinh khiết tương đương.

4) Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1. Máy đo khúc xạ

Sử dụng một trong các loại sau đây:

4.1.1. Máy đo khúc xạ biểu thị chỉ số khúc xạ, được chia độ đến 0,001, cho phép đọc đến 0,0002.

Máy đo khúc xạ phải điều chỉnh sao cho đo được chỉ số khúc xạ của nước cất 1,3330 ở 20 0C ± 0,5 0C.

4.1.2. Máy đo khúc xạ biểu thị tỷ lệ khối lượng sacaroza, được chia độ đến 0,10%.

Máy đo khúc xạ này phải điều chỉnh sao cho đo được phần khối lượng của chất rắn hòa tan (sacaroza) của nước cất là 0 ở 20 0C ± 0,5 0C.

4.2. Tuần hoàn nước, để duy trì nhiệt độ lăng kính của máy đo khúc xạ (4.1.1 hoặc 4.1.2) không đổi trong nhiệt độ quy định 20 0C ± 0,5 0C (xem 7.1).

4.3. Cốc có mỏ, dung tích 250 ml.

5) Lấy mẫu

Điều quan trọng là mẫu thử gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và

không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

6) Cách tiến hành

6.1 Chuẩn bị mẫu thử

6.1.1. Sản phẩm dạng lỏng trong

Trộn kỹ mẫu phòng thử nghiệm và sử dụng trực tiếp để xác định.

6.1.2. Sản phẩm dạng bán sệt (purees, v.v…)

Trộn kỹ mẫu phòng thử nghiệm. Ép một phần của mẫu qua lưới thép được gấp tư, loại bỏ giọt dịch đầu tiên và dành phần còn lại của dịch lỏng để xác định.

6.1.3. Sản phẩm dạng sệt (jams, jelles v.v…)

Cân trừ bì một lượng thích hợp (đến 40 g) mẫu phòng thử nghiệm chính xác đến 0,01g và bổ sung khoảng từ 100 ml đến 150 ml nước. Đun nóng cốc đến sôi và để sôi nhẹ từ 2 min đến 3 min, khấy bằng đũa thủy tinh. Để nguội và trộn kỹ.

Sau 20 min, cân chính xác tới 0,01 g, sau đó lọc qua dụng cụ lọc có rãnh hoặc phễu Buchner vào một bình khô. Sử dụng dịch lọc để xác định.

6.1.4. Sản phẩm dạng đông lạnh

Sau khi làm tan bằng mẫu và nếu cần, loại bỏ hạt, vỏ cứng của hạt, trộn lẫn sản phẩm với nước tan băng và tiến hành tiếp theo như mô tả trong 6.1.2 hoặc 6.1.3.

6.1.5. Sản phẩm dạng khô

Cắt một phần mẫu phòng thử nghiệm thành các miếng nhỏ. Bỏ hạt, vỏ cứng của hạt, nếu cần, rồi trộn cẩn thận. Sau đó cân 10 g đến 20 g mẫu vào một bình có mỏ đã trừ bì, chính xác đến 0,01g. Thêm lượng nước gấp 5 đến 10 lần lượng mẫu và đặt vào bể

nước sôi trong 30 min, khuấy liên tục bằng đũa thủy tinh. Nếu cần, kéo dài thời gian gia nhiệt cho đến khi thu được hỗn hợp đồng nhất. Để nguội cốc và trộn kỹ.

Sau 20 min, cân chính xác tới 0,01g rồi lọc vào bình khô. Giữ lại dịch lọc để xác định.

Nếu dung dịch thử màu quá đậm để đọc trong máy đo khúc xạ thì pha loãng dung dịch thử với dung dịch đường đậm đặc; không được dùng nước để pha loãng. Trộn lượng dịch kiểm tra đã biết khối lượng với dịch đường tinh khiết có cùng nồng độ.

6.2. Xác định

Điều chỉnh sự tuần hoàn nước để vận hành tại nhiệt độ yêu cầu (giữa 15 0C và 25 0C) và cho nó chảy để nhiệt độ các lăng trụ của máy đo khúc xạ tới cùng nhiệt độ, nhiệt độ này sẽ được duy trì trong khoảng ± 0,5 0C trong suốt quá trình xác định.

Đưa dịch thử (6.1) tới nhiệt độ đo. Cho một lượng nhỏ dung dịch thử (khoảng từ 2 giọt đến 3 giọt) lên trên lăng trụ cố định của máy đo khúc xạ và điều chỉnh ngay lăng trụ di động. Chiếu sáng thích hợp trường quan sát. Việc sử dụng một đèn hơi natri cho phép thu được những kết quả chính xác hơn (đặc biệt là trong trường hợp những sản phẩm có màu và tối màu).

Đưa dải phân cách phần sáng và phần tối của bề mặt vào trường quan sát và tới điểm giao cắt của các phần. Đọc giá trị chỉ số khúc xạ hoặc phần khối lượng sacaroza tùy theo dụng cụ sử dụng.

7) Biểu thị kết quả

7.1. Hiệu chỉnh

7.1.1. Nếu việc xác định được tiến hành ở nhiệt độ khác với 20 0C ± 0,5 0C thì cần hiệu chỉnh như sau:

a) Đối với thang chỉ thị số khúc xạ áp dụng công thức sau đây: (cid:0) 0,0013 (t (cid:0)  20) (cid:0)

n

n

20  D

t D

20 là chỉ số khúc xạ ở 200C;

nt là chỉ số khúc xạ ở nhiệt độ xác định;

trong đó

t là nhiệt độ xác định, tính bằng độ C;

b) Đối với thang đo khối lượng sacaroza, thì hiệu chỉnh kết quả theo bảng A.1 (TCVN 7771:2007).

7.1.2. Nếu việc xác định được tiến hành cho các sản phẩm có bổ sung muối, thì hiệu chỉnh việc đọc máy đo khúc xạ, được biểu thị theo nồng độ sacoroza tại 20 0C ± 0,5 0C, đối với muối bổ sung bằng công thức sau đây:

S = (R - N) x 1,016

trong đó:

S là phần khối lượng chất rắn hòa tan, tính theo phần trăm, theo sacaroza, đã hiệu chỉnh đối với NaCl bổ sung;

R là số đọc trên máy đo khúc xạ của sacaroza, tính bằng phần trăm phần khối lượng;

N là lượng clorua tổng số biểu thị theo NaCl, tính bằng phần trăm phần khối lượng;

1,016 là hệ số hiệu chỉnh đối với muối bổ sung.

7.1.3. Nếu tiến hành đối với sản phẩm axit cao, như nước quả và nước quả cô đặc, thì hiệu chỉnh số đọc của máy đo khúc xạ, biểu thị theo khối lượng sacaroza ở 20 0C ± 0,5 0C, bằng cách thực hiện bổ sung sau đây vào số đọc khúc xạ:

0,012 + 0,193 x M - 0,0004 x M2

trong đó M là axit tổng số tính theo gam trên 100 g, ở pH = 8,1, biểu thị theo axit xitric khan. Các giá trị hiệu chỉnh cho công thức này được nêu trong bảng A.2 (TCVN 7771:2007).

7.2. Phương pháp tính

7.2.1. Máy đo khúc xạ với thang đo chỉ số khúc xạ

7.2.1.1. Từ bảng A.3, phần khối lượng của chất rắn hòa tan tương ứng với giá trị đọc được theo 6.2, hiệu chỉnh nếu cần theo 7.1.1 a). Trong trường hợp sản phẩm dạng lỏng hoặc bán sệt thì khối lượng chất rắn hòa tan bằng chính số đọc được. Nếu việc xác định được tiến hành với dịch pha loãng, thì phần khối lượng chất rắn hòa tan, tính theo phần trăm, được tính bằng công thức sau đây:

0

(P.m )/m 1

Trong đó

P là phần khối lượng chất rắn hòa tan trong dịch pha loãng, tính theo phần trăm;

0

m là khối lượng mẫu, tính bằng gam, trước khi pha loãng;

1

m là khối lượng mẫu, tính bằng gam, sau khi pha loãng.

7.2.1.2. Nếu tiến hành xác định đối với dịch có màu quá đậm (xem 6.1.5) đã được pha loãng với dung dịch đường đậm đặc, thì khối lượng chất rắn hòa tan; tính theo phần trăm, được tính bằng công thức sau đây:

[(m

D]

m

)C (cid:0)  m

w

B

B mw

(cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0)

trong đó:

w

m là khối lượng mẫu đã pha loãng với dịch đường, tính bằng gam;

B

m là khối lượng dung dịch đường đã sử dụng để pha loãng, tính bằng gam;

w

C là phần khối lượng chất rắn hòa tan trong hỗn hợp (m + m ), thu được từ chỉ số B

khúc xạ, tính bằng phần trăm;

D là phần khối lượng chất rắn hòa tan trong dung dịch đường tinh khiết, thu được từ chỉ số khúc xạ, tính bằng phần trăm.

Ghi kết quả đến một chữ số thập phân.

7.2.2. Máy đo khúc xạ thang đo sacaroza

Trong trường hợp sản phẩm dạng lỏng hoặc bán sệt, khối lượng chất rắn hòa tan, tính theo phần trăm theo sacaroza, sẽ bằng giá trị đọc được theo 7.1.1b). Nếu tiến hành trên dung dịch pha loãng, thì khối lượng chất rắn hòa tan được tính là trung bình cộng của công thức nêu trong 7.2.1.1 hoặc trong 7.2.1.2 đối với dung dịch có màu quá đậm pha loãng với dung dịch đường (xem 6.1.5).

Ghi kết quả tới một chữ số thập phân.

8) Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn không quá 5% trường hợp lớn hơn 0,5 g chất rắn hòa tan trên 100 g hoặc 100 ml sản phẩm.

9) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử nghiệm đã dùng cùng với viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- kết quả thu được;

- nếu đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

2.2.8 Xác định hàm lượng sunfua dioxit tổng số (dựa vào TCVN 6641:2000). 1) Phạm vi và lĩnh vực áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng sunfua dioxit tổng số

trong rau quả, sản phẩm rau quả, bất kể loại sunfua dioxit nào.

2) Nguyên

tắc

Axit hóa và làm nóng phần mẫu thử, sau đó tách cuốn sunfua dioxit qua luồng khí nitơ đã được giải phóng. Hấp thụ và oxi hóa sunfua dioxit bằng cách sục nó qua dung dịch hidro peroxit loãng trung tính. Sử dụng dung dịch chuẩn natri hidroxit để xác định axit sunfuric được tạo thành.

Kiểm tra việc xác định hàm lượng sunfua dioxit bằng cách cho bari sunfat kết tủa từ dung dịch được tạo thành và theo hai cách:

- Cân bari sunfat (phụ lục A của tiêu chuẩn này); hoặc

3) Thuốc

- Xác định nephelometric (phụ lục B của tiêu chuẩn này).

thử

Tất cả các thuốc thử phải thuộc loại phân tích. Nước sử dụng phải là nước cất hoặc nước ít nhất có độ tinh khiết tương đương, mới đun sôi.

3.1. Nitơ không chứa oxi.

3.2. Hidro peroxit dung dịch 9,1 g/l, không chứa ion sunfat.

3.3. Axit clohydric dung dịch 100g/l.

20

Pha loãng một thể tích axit clohidric đậm đặc, ρ = 1,19 g/ml với ba thể tích nước.

3.4. Dung dịch chỉ thị

Hòa tan 100 mg bromophenol xanh8 trong 100 ml etanola 20% (v/v).

3.5. Natri hidroxit không chứa ion sunfat; hoặc dung dịch thể tích chuẩn c(NaOH) = 0,1 mol/l9.

3.6. Natri hidroxit không chứa ion sunfat; dung dịch thể tích chuẩn c(NaOH) = 0,01 mol/l10.

3.7. Iod, dung dịch thể tích chuẩn c(1/2 l ) = 0,02 mol/l11. 2

3.8. Hồ tinh bột, dung dịch 5 g/l chứa 200 g natri clorua/lít làm chất bảo quản.

Duy trì dung dịch này ở điểm sôi 10 phút trong khi chuẩn bị.

3.9. Dung dịch kali metabisunphit/EDTA.

2

O 5 S 2

Hòa tan 1,20g kali metabisunphit (K ) và 0,20 g muối dinatri của axit etylendinitrilo- tetraaxetic12 trong một lít nước. Chuyển cẩn thận toàn bộ lượng dung dịch này sang bình định mức một vạch dung tích 1000 ml. Thêm nước cho đến vạch và lắc.

8 Chất chỉ thị này được chọn vì nó không gây nhiễu khi xác định bằng phương pháp đo độ đục. 9 Hitherto được biểu thị theo “dung dịch thể tích chuẩn 0,1 N”. 10 Hitherto được biểu thị theo “dung dịch thể tích chuẩn 0,01 N”. 11 Hitherto được biểu thị theo “dung dịch thể tích chuẩn 0,02 N”.

3.10. Sacaroza, dung dịch 100g/l.

12 Sản phẩm này để bảo vệ ion sunfit khỏi sự oxi hóa của không khí bởi tạo phức các vết ion đồng.

4) Thiết bị, dụng

cụ

Sử dụng thiết bị thí nghiệm thông thường và thiết bị đặc biệt như:

4.1. Ống đong.

4.2. Pipet.

4.3. Buret bán vi lượng, có dung tích 10 ml.

4.4. Buret có dung tích 25 ml.

4.5. Máy trộn.

4.6. Thiết bị tách cuốn hoặc thiết bị tương tự đảm bảo được việc đẩy và tách cuốn sunfua dioxit và sự hấp thụ của nó trong dung dịch hidroperoxit.

4.6.1. Cấu tạo của thiết bị

A: Bình cầu đáy tròn có dung tích lớn hơn hoặc bằng 250ml.

B: Bộ phận ngưng tụ hồi lưu ngược chiều có hiệu quả cao, có thể lắp khít với bình cầu (A).

C: Phễu nhỏ giọt, có thể lắp được vào bình cầu (A).

D: Đường nạp nitơ.

E và E’: 2 bộ sục khí được lắp khít với bộ phận ngưng tụ hồi lưu (B).

F: Đĩa, bằng lưới sắt hoặc bằng amiang, đường kính 150 mm, có 1 lỗ đường kính 40mm ở tâm. Đĩa này dùng để chống hiện tượng phát lửa, đặc biệt, những chất chiết được có trong sản phẩm.

Chú thích – Giữa các lần thử, nếu việc chưng chiết vẫn đảm bảo chậm và cẩn thận thì chỉ cần rửa bình cầu (A).

4.6.2. Thử nghiệm kiểm tra

Thiết bị phải thỏa mãn được ba thử nghiệm kiểm tra sau đây:

4.6.2.1. Cho 100ml nước và 5ml dung dịch axit clohidric (3.3) vào bình cầu (A). Đun nóng bình cầu cùng lúc cho dòng nitơ đi qua, khoảng 1h, nhờ các bộ sục khí (E và E’) mỗi bộ chứa 5ml nước và 0,1 ml dung dịch chỉ thị (3.4).

Các chất chứa trong mỗi bộ sục khí phải trung tính.

4.6.2.2. Cho 20ml dung dịch sacaroza (3.10) vào bình cầu (A). Đun nóng bình cầu cùng lúc cho dòng nitơ đi qua, khoảng 1 giờ.

Dung dịch sacaroza phải không mầu, và không được có kết tủa nâu sẫm đọng trên thành bình (thử này để kiểm tra cường độ đun nóng).

4.6.2.3. Tiến hành hai thao tác sau đây:

a) Dùng pipet (4.2) cho 20 ml dung dịch kali metabisunphit/EDTA (3.9) và 5 ml dung dịch axit clohidric (3.3) vào bình cầu (A). Tiến hành chiết và xác định sunfua dioxit trong những điều kiện giống như khi xác định chính thức, nhưng không cho thêm dung dịch axit clohidric.

b) Cho 20 ml dung dịch kali metabisunphit/EDTA (3.9), và thêm 5 ml dung dịch axit clohidric (3.3) và 1 ml dung dịch hồ tinh bột (3.8) vào bình nón dung tích 100ml.

Dùng buret (4.4) chứa dung dịch iot (3.7) chuẩn độ cho đến khi bắt đầu xuất hiện màu xanh da trời.

Hàm lượng sunfua dioxit xác định được trong mục a) phải nằm trong khoảng ±1% của hàm lượng xác định được trong mục b).

Không được tiến hành theo b) chậm quá 15 phút sau khi hoàn thành a) để tránh khả năng hàm lượng sunfua dioxit trong dung dịch metabisunphit bị thay đổi.

5) Cách tiến

4.7. Cân phân tích

hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

Loại bỏ hết hạt và khoang chứa hạt cứng nếu cần, và nghiền kỹ mẫu.

Để những sản phẩm đông lạnh hoặc đông lạnh sâu tan giá trong bình kín, và cho hết những chất lỏng được tạo ra trong quá trình tan giá vào mẫu trước khi nghiền.

5.2. Phần mẫu thử

Cân 10 đến 100 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, tùy theo hàm lượng sunfua dioxit dự đoán có trong mẫu, sao cho phần mẫu thử chứa không quá 10 mg sunfua dioxit; chuyển phần mẫu thử vào bình (A) của thiết bị tách cuốn.

5.3. Tiến hành tách cuốn

5.3.1. Cho vào mỗi bộ sục khí (E và E’) 3 ml13 dung dịch hidro peroxit (3.2) và 0,1 ml dung dịch chỉ thị (3.4), và trung hòa dung dịch hidro peroxit bằng dung dịch natri hidroxit 0,01 mol/l (3.6).

5.3.2. Nối phễu nhỏ giọt (C), phần ngưng tụ hồi lưu (B) và các bộ sục khí (E và E’) với bình (A); mở cho luồng khí nitơ thổi hết không khí ra khỏi bình (A) và toàn bộ dụng cụ.

5.3.3. Cho 100 ml nước và 5 ml dung dịch axit clohidric (3.3) vào phễu nhỏ giọt (C).

5.3.4. Để cho dung dịch axit clohidric đã pha loãng chứa trong phễu nhỏ giọt (C) chảy vào bình (A) (nếu cần tạm thời đóng luồng khí nitơ lại).

13 Lượng này theo lý thuyết là đủ để oxy hóa 51 mg sunfua dioxyt, nhưng cần có một lượng dư

5.3.5. Đun sôi từ từ các chất chứa trong bình, và duy trì điểm sôi, cho luồng khí nitơ lưu thông đều liên tục để có một đến hai bọt khí/s trong khoảng 30 phút.

5.4. Chuẩn độ

Chuyển các chất từ bộ sục khí thứ hai (E’) vào bộ thứ nhất và chuẩn độ axit sunfuaric được tạo ra bằng dung dịch natri hidroxit 0,01 mol/l (3.6) hoặc 0,1 mol/l (3.5) tùy theo hàm lượng sunfua dioxit dự đoán.

5.5. Kiểm tra

5.5.1. Nếu thể tích V của dung dịch natri hidroxit 0,01 mol/l vượt quá 10ml (hoặc 1 ml trong trường hợp dung dịch natri hidroxit 0,1 mol/l) thì tiến hành xác định khối lượng lại như qui định trong phụ lục A.

5.5.2. Nếu thể tích V nhỏ hơn 10 ml thì tiến hành xác định độ đục như qui định trong phụ lục B.

Nếu thể tích V nhỏ hơn 5 ml thì chỉ được dùng phương pháp đo độ đục. Đối với phần mẫu thử 100g, giới hạn 5 ml này tương ứng với hàm lượng sunfua dioxit 16mg/kg.

Cao hơn giới hạn này thì chỉ cần phương pháp xác định chuẩn độ axit.

5.6. Số lần xác định

6) Biểu thị kết

Tiến hành hai lần xác định trên cùng mẫu thử (5.1).

quả

6.1 Phương pháp tính và công thức

V

0,32(cid:0)

320(cid:0)

V (cid:0) 103 (cid:0) m

m

Hàm lượng sunfua dioxit, biểu thị bằng miligam trên 1 kg sản phẩm, được tính theo công thức sau14:

trong đó

m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam;

V là thể tích của dung dịch natri hidroxit 0,01 mol/l (3.6) dùng để chuẩn độ (5.4), tính bằng mililit;

0,32 là khối lượng của sunfua dioxit tương ứng với 1 ml dung dịch natri hidroxit 0,01 mol/l, tính bằng gam;

Lấy kết quả là trung bình cộng của hai lần xác định (5.6) với điều kiện đáp ứng được độ lặp lại (6.2).

6.2 Độ lặp lại

14 Nếu sử dụng dung dịch natri hidroxit 0,1 mol/l (3.5) thì thay hệ số 320 bằng 3200

Chênh lệch kết quả của hai lần xác định được tiến hành đồng thời hoặc kế tiếp nhau do một người phân tích, không được vượt quá ±5% giá trị trung bình.

7) Báo cáo kết

quả

Báo cáo kết quả phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng và kết quả thử nghiệm thu được. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có ảnh hưởng tới kết quả.

Báo cáo kết quả cũng bao gồm tất cả các thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử.

1) Phạm vi áp

2.2.9 Xác định độ axit (dựa vào TCVN 5483:2007) dụng

Tiêu chuẩn này quy định hai phương pháp xác định độ axit chuẩn độ được trong

các sản phẩm rau quả:

- Phương pháp chuẩn độ điện thế chuẩn;

- Phương pháp thông thường dùng chỉ thị màu.

Đối với một số sản phẩm có màu, có thể khó xác định điểm kết thúc chuẩn độ trong phương pháp thứ hai này và nên sử dụng phương pháp thứ nhất.

Việc xác định độ axit chuẩn độ được sẽ không có ý nghĩa trong trường hợp những sản phẩm đã bổ sung sulphua dioxit.

2) Nguyên ­ Phương pháp chuẩn độ điện thế: Chuẩn độ điện thế với dung dịch thể tích chuẩn

tắc

natri hydroxit. ­ Phương pháp thông thường: Chuẩn độ với dung dịch thể tích chuẩn natri

3) Thuốc

hydroxit dùng phenolphtalein làm chất chỉ thị. thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử phải thuộc loại phân tích. Nước được sử dụng phải là

nước cất hoặc nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

­ Natri hydroxi, dung dịch thể tích chuẩn, c(NaOH) = 0,1 mol/l15. ­ Dung dịch đệm, đã biết trước độ pH. ­ Phenolphtalein, 10 g/l dung dịch trong etanol 95 % (V/V). 4) Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

15 Trước đây biểu thị theo “dung dịch thể tích chuẩn 0,1 N”.

­ Máy đồng nhất hoặc chày và cối. ­ Pipet, dung tích 25 ml, 50 ml hoặc 100 ml. ­ Bình nón, có thể lắp vừa với bộ ngưng đối lưu (4.7). ­ Bình định mức, dung tích 250 ml. ­ Cốc có mỏ, dung tích 250 ml có máy khuấy từ hoặc máy khuấy cơ. ­ Buret, dung tích 50 ml. ­ Bộ ngưng đối lưu. ­ Cân phân tích, độ chính xác 0,01 g. ­ Máy đo pH, chính xác tới 0,05 đơn vị pH. ­ Nồi cách thủy. mẫu 5) Lấy

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị

hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

6) Cách tiến

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu cho sản phẩm rau quả, thì các bên có liên quan tự thỏa thuận về vấn đề này.

hành

+ Phương pháp chuẩn độ điện thế (phương pháp chuẩn)

­ Kiểm định pH-mét: Kiểm tra độ chính xác của pH-mét bằng các dung dịch đệm. ­ Phần mẫu thử: Dùng pipet lấy 25 ml, 50 ml hoặc 100 ml mẫu thử đã pha loãng tùy theo lượng axit dự kiến, cho vào cốc có mỏ kèm theo máy khuấy. ­ Xác định: Bật máy khuấy và nhanh chóng dùng buret thêm một lượng dung dịch

0,2. Sau đó, thêm từ từ cho tới pH bằng natri hydroxit cho tới khi pH đạt 7 (cid:0) 8,1 (cid:0) 0,2.

+ Phương pháp dùng chỉ thị màu (Phương pháp thông thường)

­ Phần mẫu thử: Dùng pipet lấy 25 ml, 50 ml hoặc 100 ml mẫu thử đã pha loãng tùy theo lượng axit dự kiến, cho vào cốc có mỏ kèm theo máy khuấy.

7) Biểu thị kết ­ Phương pháp tính toán cho mẫu thử nghiệm lấy theo thể tích.

­ Xác định: Thêm từ 0,25 ml đến 0,5 ml dung dịch phenolphtalein và vừa lắc vừa dùng buret chuẩn bằng dung dịch natri hydroxit cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây. quả

Độ axit chuẩn độ được biểu thị theo số milimol H*/100 ml sản phẩm, được tính theo

công thức sau đây:

1

250 (cid:0) (cid:0) V (cid:0) 100 c

0

0

c (cid:0) 1000V V V V

Trong đó

V là thể tích của mẫu thử, tính bằng mililit, cụ thể là 25 ml;

0

V là thể tích của phần mẫu thử, tính bằng mililit;

1

V là thể tích dung dịch natri hydroxit đã dùng để xác định, tính bằng mililit;

c là nồng độ chính xác của dung dịch natri hydroxit, tính bằng mol/lit.

Lấy kết quả đến một số thập phân.

­ Phương pháp tính toán cho mẫu thử nghiệm lấy theo khối lượng

Độ axit chuẩn độ được biểu thị theo số milimol H*/100 ml sản phẩm, được tính theo

công thức:

1

0

(cid:0) 250 m 100 V (cid:0) V c (cid:0)

Trong đó

0

V là thể tích của phần mẫu thử, tính

bằng mililit;

1

V là thể tích dung dịch natri hydroxit

đã dùng để xác định, tính bằng mililit;

c là nồng độ chính xác của dung dịch natri hydroxit, tính bằng mol/lit.

m

l

à

k

h

ố

i

l

ư

ợ

n

g

c

ủ

a

m k n

ẫ ế .

u t ­ Các phương pháp biểu thị khác

t q

h u

ử ả Cũng có thể biểu thị độ axit chuẩn độ được quy ước bằng gam axit trong 100 g hoặc 100 ml sản phẩm bằng cách nhân của công thức bởi một hệ số thích hợp cho từng loại axit (xem bảng 11).

,

đ

t ế

í n

B ả n g 1 1 n

Hệ số Axit h m

0,067 Axit malic ộ 0,045 Axit oxalic

b t 0,070 Axit xitric monohydrat

0,075 Axit tartaric ằ

0,049 Axit sunfuric n s 0,060 Axit axetic g ố 0,090 Axit lactic

8) Độ lặp

0,064 Axit xitric

lại g t

a h

m ậ

. p

L p

ấ h Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5% trong trường hợp lớn hơn 2% giá trị trung bình của hai kết quả.

9) Báo cáo thử

y â nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- Phương pháp thử đã sử dụng cùng với viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Mọi chi tiết thao tác không được quy định hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- (Các) kết quả thử nghiệm thu được;

- Nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại, thì ghi kết quả cuối cùng thu được.

2.2.10 Xác định ptulin trong nước táo trong, nước táo đục và puree bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có làm sạch phân đoạn lỏng/lỏng (dựa theo TCVN 8161:2009)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng patulin trong nước táo và puree táo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này đã được khảo nghiệm để xác định patulin qua phân tích các mẫu bị nhiễm tự nhiên và các mẫu đã được bổ sung lượng biết trước trong nước táo trong ở các mức từ 26 (cid:0) g/l đến 128 (cid:0) g/l, trong nước táo đục ở các mức từ 26 (cid:0) g/l đến 106 (cid:0) g/l và trong puree táo ở các mức từ 23 (cid:0) g/kg đến 121 (cid:0) g/kg.

2) Nguyên tắc

Nước táo đục và puree táo được xử lý bằng enzym pectinaza. Patulin được chiết ra khỏi nước táo hoặc puree đã được xử lý enzym bằng dung dịch etyl axetat. Dịch chiết bằng dung môi được làm sạch bằng chiết pha lỏng-lỏng với dung dịch natri cacbonat. Dịch chiết bằng etyl axetat được làm khô bằng natri sulfat khan. Sau khi cho bay hơi etyl axetat, patulin được định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tử ngoại (UV).

3) Thuốc thử

3.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, nước cất hoặc nước loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác. Dung môi phải có chất lượng dùng cho phân tích HPLC.

2

3.2. Dung dịch natri cabonat, nồng độ khối lượng (cid:0) (Na CO 15 ) (cid:0) 3

g/l. Hòa tan 1,5 g natri cacbonat trong 100 ml nước.

3.3. Axit axetic, nồng độ thể tích (cid:0) (CH 98 %. COOH) (cid:0) 3

3.4. Natri sulfat khan

3.5. Nước có pH = 4.

Dùng axit axetic để chỉnh pH của nước đến 4.

2

3.6. Etanol tuyệt đối, (cid:0) (CH OH) ≥ 99,7 %. CH 3

3.7. Etyl axetat

3.8. Axit percloric, (cid:0) (HClO ) = 60 %. 4

3.9. Axetonitril.

3.10. Dung dịch enzym endogalacturonaza, có hoạt độ điển hình 1400 U/g.

Đơn vị (U) là lượng enzym xúc tác giảm 20% độ nhớt của dung tịch pectin 1 % trong vòng 5 min ở pH 3,4 và 25 0C.

CHÚ THÍCH: Thực tế có các lượng bao gói 100 ml đến 200 ml.

3.11. Pha động của HPLC

Trộn 95 phần thể tích nước với 5 phần thể tích axetonitril (3.9) và 0,095 phần thể tích axit percloric (4.8) và khử khí.

3.12. Dung dịch gốc patulin

CẢNH BÁO: Patulin được nghi ngờ là chất gây đột biến và đã được ghi lại là có các đặc trưng về gây độc miễn dịch và gây độc về thần kinh. Luôn luôn phải mang găng tay, kính bảo vệ và tất cả các bước chuẩn bị mẫu, chất chuẩn phải được thực hiện trong tủ hút.

Hòa tan 5 mg patulin hoặc lượng chứa trong 1 ống (nếu patulin ở dạng màng) trong etyl axetat (3.7). Chuyển dung dịch sang bình định mức 25 ml và pha loãng bằng etyl axetat đến vạch để thu được dung dịch có chứa khoảng 200 (cid:0) g/ml patulin. Bảo quản dung dịch gốc trong tủ lạnh dưới 00C.

3.13. Dung dịch chuẩn patulin

l dung dịch gốc (3.12) đến khô bằng dòng nitơ và hòa tan ngay

Cho bay hơi 1000 (cid:0) trong 20 ml etanol (3.6) để thu được nồng độ khối lượng khoảng 10 (cid:0) g/ml patulin.

pat

Để xác định chính xác nồng độ, ghi lại đường hấp thụ ở bước sóng từ 250 nm đến 350 nm trong cuvet thạch anh 1 cm có etanol làm đối chứng. Xác định bước sóng có độ hấp thụ tối đa. Tính nồng độ khối lượng của patulin, (cid:0) , bằng microgam trên mililit, theo

(cid:0)

công thức:

A max

pat

x

M x100 (cid:0)  x (cid:0)

(cid:0)

Trong đó:

max

A là độ hấp thụ xác định được tại điểm tối đa của đường hấp thụ (ở đây: tại khoảng

276 nm);

(cid:0)  là hệ số hấp thụ mol tương đối của patulin trong etanol [ở đây: 1460 m2mol, như trong AOAC 1995, Natural Toxins, Patulin (các độc tố tự nhiên, patulin) 49.6.01.C(d)];

M là khối lượng phân tử tương đối của patulin (M = 154,12 g/mol);

(cid:0)   là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng centimet (cm).

Bảo quản dung dịch chuẩn trong tủ lạnh ở nhiệt độ dưới 0 0C. Các dung dịch có thể bền trong 2 tháng. Trước khi sử dụng, đưa các dung dịch này về nhiệt độ phòng để tránh nước bị lẫn vào do ngưng tụ.

3.14. Dung dịch chuẩn patulin hiệu chuẩn

Cho bay hơi 500 (cid:0) l dung dịch chuẩn (3.13) đến khô hoặc một lượng tương đương với 5 (cid:0) g patulin tuyệt đối, hòa tan trong 5 ml nước có pH 4 (3.5) để thu được patulin có nồng độ khối lượng 1 (cid:0) g/ml.

Dung dịch này có thể bảo quản được trong tủ lạnh ở 4 0C. Dung dịch này có thể bền ít nhất 8 tuần.

4) Thiết bị, dụng cụ

4.1. Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.2. Pipet, dung tích 5 ml, 1 ml, 200 (cid:0) l và 50 (cid:0) l có các đầu pipet thích hợp.

4.3. Cân phân tích

4.4. Máy đo quang phổ UV, hai chùm tia và ghi được ở bước sóng 250 nm đến 350 nm.

4.5. Cuvet thạch anh, chiều dài đường quang 1 cm.

4.6. Máy ly tâm, có gia tốc ly tâm 4500 g.

4.7. Ống ly tâm, dung tích 50 ml có nắp vặn chặt.

4.8. Máy cô quay, có nồi cách thủy để ở 40 0C.

4.9. Giấy lọc, có cỡ lỗ 20 (cid:0) m đến 25 (cid:0) m.

4.10. Bộ lọc bằng xyranh sử dụng một lần, có cỡ lỗ 0,2 (cid:0) m (tùy chọn).

Kiểm tra từng mẻ trước khi sử dụng để đảm bảo rằng patulin không bị hấp phụ trên bộ lọc.

4.11. Thiết bị HPLC, gồm:

4.11.1. Hệ thống bơm, hệ thống bơm van có vòng bơm 50 (cid:0) l.

4.11.2. Bơm đẳng dòng, không xung, có thể duy trì tốc độ 1 ml/min.

4.11.3. Detector UV, được gắn với cuvet dòng chảy được cài đặt ở 276 nm.

18

4.11.4. Cột HPLC pha đảo phân tích, ví dụ: cột C octyldecylsilane (ODS) (được nhồi

bằng cacbon 12% đến 17% được coi là thích hợp) có thể tách patulin ra khỏi các pic khác. Chiều cao tối đa đường lề pic chồng nhau phải nhỏ hơn 10 % của chiều cao pic tối đa (cần phải điều chỉnh pha động về phân giải đường nền). Nên sử dụng cột trước thích hợp.

4.11.5. Hệ thống dữ liệu

4.11.6. Van chuyển mạch hoặc bơm HPLC thứ hai, tùy chọn, để rửa cột phân tích giữa các lần bơm.

4.12. Bình cầu đáy tròn, dung tích 250 ml có khớp nối thủy tinh mài.

5) Cách tiến hành

5.1. Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1. Nước táo trong

Không cần chuẩn bị mẫu. Tiến hành theo 5.2 đến 5.4.

5.1.2. Nước táo đục

Chuyển 20 ml ± 0,1 ml nước táo đục sang ống ly tâm (4.7) và thêm 150 (cid:0) l dung dịch enzym (3.10). Vặn chặt nắp và lắc kỹ bình. Để qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc để 2 h ở 40 0C, sau đó cho ly tâm 5 min ở gia tốc 4500 g.

5.1.3. Puree táo

Cân 10 g mẫu thử puree, chính xác đến 0,1 g cho vào ống ly tâm (4.7), thêm 150 (cid:0) l dung dịch enzym (4.10) và 10 ml nước. Vặn chặt nắp và lắc bình bằng máy đồng hóa tùy thuộc vào mẫu, để trộn kỹ. Để qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc để 2 h ở 40 0C, sau đó cho ly tâm 5 min ở gia tốc 4500 g.

5.2. Chiết patulin

Dùng pipet lấy 10 ml nước táo trong hoặc nước táo đục đã chuẩn bị trong 5.1.2 cho vào phễu chiết 100 ml. Đối với puree táo thì dùng pipet lấy 10 ml mẫu đã chuẩn bị trong 5.1.3, tương đương với 5 g puree, cho vào phễu chiết 100 ml. Thêm 20 ml etyl axetat (3.7) và lắc trong 1 min. Để yên cho tách lớp rồi tách riêng hai pha này vào hai bình nón riêng rẽ. Chuyển phần nước vào lại phễu chiết và chiết lại lần hai bằng 20 ml etyl axetat. Lại để yên cho tách lớp rồi chuyển lớp nước phía dưới vào một bình nón rỗng và lớp phía trên vào bình nón có chứa sẵn lớp etyl axetat từ lần chiết thứ nhất. Lặp tại quy trình chiết này lần ba, nhưng sau khi tách lớp thì tháo bỏ lớp nước phía dưới. Gộp ba phần dịch chiết etyl axetat này vào phễu chiết. Tráng bình nón được dùng để đựng các dịch chiết etyl axetat bằng 5 ml etyl axetat mới và gộp nước rửa này vào dịch chiết etyl axetat trong phễu chiết.

5.3. Loại bỏ các hợp chất axit gây nhiễu

Cho 4 ml dung dịch natri cacbonat (3.2) vào phễu chiết đựng dịch chiết etyl axetat và lắc trong 30 s. Đợi cho tách lớp rồi tháo lớp nước phía dưới chảy sang bình nón. Rót lớp phía trên sang bình cầu đáy tròn (4.12) qua phễu chiết và giấy lọc (4.9) có chứa khoảng 15 g natri sulfat khan (3.4). Chuyển phần nước trở lại phễu chiết rồi tráng bình nón bằng khoảng 10 ml etyl axetat (3.7), cho nước tráng vào phễu chiết và lắc 30 s. Để yên cho tách lớp, tháo bỏ lớp nước phía dưới và cho lớp phía trên chảy qua natri sulfat

sang bình cầu đáy tròn (4.12). Tráng phễu chiết bằng 15 ml etyl axetat và cho qua natri sulfat vào bình cầu đáy tròn.

Thực hiện bước này trong vòng 3 min.

1

5.4. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Cho bay hơi dung dịch thu được trong 5.3 đến thể tích nhỏ (< 1 ml) trong chân không, sử dụng nồi cách thủy ở 40 0C. Chuyển lượng còn lại sau khi bay hơi sang một lọ thủy tinh. Tránh phía trong bình cầu đáy tròn bằng etyl axetat (3.7) để đảm bảo rằng chuyển được tất cả patulin sang lọ. Cho bay hơi dung dịch đến khô bằng dòng nitơ trên tấm gia nhiệt hoặc trên nồi cách thủy ở 400C. Hòa tan lại cặn bằng cách dùng pipet lấy 1 ml (V ) nước (500 (cid:0) l với mẫu puree) (3.5) cho vào lọ. Dùng máy trộn Vortex để hòa tan hoàn toàn mẫu. Chuyển dung dịch mẫu thử sang lọ nhỏ của HPLC. Lọc qua bộ lọc xyranh dùng một lần (4.10), nếu cần.

6) Quy trình thêm chuẩn

6.1. Nước táo trong

Dùng pipet lấy 10 ml nước táo trong không chứa patulin cho vào phễu chiết 100 ml. Dùng pipet lấy 50 (cid:0) l dung dịch chuẩn (3.13) hoặc một lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 (cid:0) l patulin tuyệt đối cho vào nước táo trong không chứa patulin. Đậy bình và lắc kỹ để trộn. Tiến hành như trong 5.2 đến 5.4.

6.2. Nước táo đục

Dùng pipet lấy 10 ml nước táo đục cho vào ống ly tâm. Dùng pipet lấy 50 (cid:0) l dung dịch chuẩn hoặc một lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 (cid:0) g patulin tuyệt đối cho vào nước táo đục không chứa patulin. Đậy bình và lắc kỹ để trộn. Tiến hành như trong 5.1.2.

6.3. Puree táo

Cân 10 g puree táo không chứa patulin, chính xác đến 0,1 g, cho vào ống ly tâm (4.7). Dùng pipet lấy 50 (cid:0) l dung dịch chuẩn (3.13) hoặc một lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 (cid:0) g putulin tuyệt đối cho vào puree táo không chứa patulin. Sau khi thêm, lắc kỹ để trộn dung dịch. Tiến hành như trong 5.1.3.

7) Xác định bằng HPLC

7.1. Đường chuẩn

7.1.1. Yêu cầu chung

Dựng đường chuẩn trong ngày phân tích.

7.1.2. Dung dịch hiệu chuẩn patulin dùng cho HPLC

Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn HPLC trong các bình định mức 2 ml riêng biệt theo Bảng 1. Dùng pipet để chuyển dung dịch chuẩn patulin để hiệu chuẩn (3.14). Pha loãng từng dung dịch chuẩn đến 2 ml bằng nước có pH 4 (3.5).

Bảng 12 - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn Nước (4.5) độ khối

Dung dịch chuẩn làm việc patulin 1000 Nồng lượng ((cid:0) g/ml) 0,50 1 ((cid:0) l) 1000

2 1200 800 0,40

3 1500 500 0,25

4 1800 200 0,10

5 1900 100 0,05

7.2. Các điều kiện vận hành của HPLC

Khi sử dụng cột quy định trong 4.11 và pha động quy định trong 3.11, thì cài đặt như sau là thích hợp:

Tốc độ dòng của pha động (cột): 1,0 ml/min;

Bước sóng của detector UV: 276 nm;

Thể tích bơm: 50 (cid:0) l.

8) Tính kết quả

PAT

Đọc từ đường chuẩn khối lượng patulin trong dung dịch mẫu thử đã bơm lên cột , bằng nanogam trên mililit HPLC, bằng nanogam. Tính phần khối lượng patulin, w

(hoặc gam đối với puree) theo công thức:

1

w

PAT (cid:0)

V1   x   x  m(cid:0) V

m

2

a

Trong đó:

a (ng);

m là khối lượng patulin trong dung dịch thử được bơm lên cột, tính bằng nanogam

2

V là thể tích phần dung dịch thử (5.4) được bơm lên cột, tính bằng mililit (ml);

1

1

1

V là thể tích dung dịch mẫu thử (5.4), (V = 1,0 ml đối với nước táo, V = 0,5ml đối với

puree) tính bằng mililit (ml);

m

m

(cid:0)

(cid:0)

m

là thể tích mẫu được chiết, tính bằng mililit đối với nước táo ( = 10 ml) hoặc gam

(cid:0)

đối với puree ( = 5 g).

Kết quả cuối cùng có thể được biểu thị bằng microgam trên lít (hoặc kilogam đối với puree) và tương đương với nanogam trên mililit (hoặc gam).

9) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc của mẫu, ký hiệu);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày lấy mẫu và phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu biết);

d) ngày phòng thử nghiệm nhận được mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) kết quả thử nghiệm thu được và đơn vị tính;

g) độ lặp lại đã được kiểm tra;

h) mọi chi tiết đặc biệt quan sát được trong khi thử nghiệm;

2.2.11 Xác định dư lượng N-metylcarbamat bằng phương pháp sắc kí lỏng

hiệu năng cao có làm sạch bằng chiết pha rắn (dựa theo TCVN 8171- 1:2009)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật N-

metylcarbamat trong ngũ cốc, rau và quả bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Phương pháp này đã được thẩm định thành công trong một nghiên cứu cộng tác về các hợp chất gốc của carbaryl, carbofuran, mathiocarb, methomyl, oxamyl và propoxur và về methiocarb sulfoxide trong ớt xanh và táo ở các mức từ 0,08 mg/kg đến 0,9 mg/kg.

Chưa có dữ liệu về hiệu năng của phương pháp trong xác định các chất chuyển hóa khác cho dù đã biết rằng phương pháp sẽ không thực hiện đối với oxamyl và methomyl oxim.

2) Nguyên tắc

Mẫu được đồng hóa với axeton, diclometan và dầu nhẹ và mẫu đã đồng hóa được ly tâm tạo ra hai lớp nổi phía trên. Lớp nước phía trên được cho bay hơi đến khô. Dịch chiết này cũng có thể được làm sạch bằng chiết pha rắn (SPE) sử dụng cột nhồi bằng silica được gắn aminopropyl. Trong dung dịch chiết, M-metylcarbamat được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo có thủy phân sau cột. Metylamin tạo thành được cho phản ứng với o-phthaldialdehyd và 2-mercaptoetanol và các dẫn xuất được phát hiện bằng detector huỳnh quang.

3) Thuốc thử

3.1. Yêu cầu chung

Thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, tốt nhất là loại dùng cho HPLC và phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật và nước được sử dụng để làm sạch dụng cụ thủy tinh phải là nước cất hoặc nước loại 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có qui định khác.

Ghi nhãn tất cả các vật chứa thuốc thử chuẩn với tên và độ tinh khiết của thuốc bảo vệ thực vật. Về tên hóa chất và cấu trúc, xem ISO 1750.

3.2. Các khía cạnh an toàn liên quan đến thuốc thử

CẢNH BÁO – Nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật gây độc bằng các đường tiếp xúc khác nhau, đặc biệt là ở dạng đậm đặc. Khi làm việc với các loại thuốc bảo vệ thực vật này, phải tuân thủ các cảnh báo về an toàn của nhà sản xuất.

Hơi của các dung môi rất độc. Một vài loại dung môi này dễ dàng hấp thụ qua da. Sử dụng tủ hút khói hiệu quả tốt để loại bỏ các dung môi này khi chúng ở dạng tự do.

3.3. Axeton.

3.4. Axit axetic.

3.5. Diclo metan.

3.6. Dầu nhẹ, dải sôi từ 40 oC đến 60 oC.

3.7. Metanol.

3.8. Axetonitril.

3.9. Hỗn hợp dung môi.

Hỗn hợp của axetonitril (3.8) và axit axetic (4.4) với tỷ lệ 99,9:0,1 (thể tích).

3.10. Chất chuẩn

Các loại thuốc bảo vệ thực vật N-metylcarbamat như aldicarb, bendiocarb, bufencarb, butocarboxim, carbonolat, carbaryl, carbofuran, cloethocarb, dithiocarb, ethidimuron, ethiofencarb, fenobucarb, isoprocarb, methiocarb, mathomyl, oxamyl, promecarb, propoxur, thiofanox, chất chuyển hóa 3-hydroxy-carbofuran và sulfoxide và các chất chuyển hóa của sulfon của aldicarb, butocarboxim, ethiofencarb, methiocarb và thiofanox.

3.11. Dung dịch gốc thuốc bảo vệ thực vật, p= 0,05 μg /ml

Hòa tan 10 mg chất chuẩn (3.11) trong 10 ml axetonitril (3.8) và pha loãng 100 μl dung dịch thu được đến 100 ml trong bình định mức bằng hỗn hợp dung môi (3.9) để cho dung dịch A (1 μg /ml). Trong một bình định mức thứ hai, pha loãng 5 ml dung dịch A

đến 100 ml bằng hỗn hợp của axetonitril (3.8) và nước (3.10) với tỷ lệ 20:80 (thể tích).

3.12. Dung dịch chuẩn thuốc bảo vệ thực vật

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn thích hợp bằng cách pha loãng các lượng thích hợp của các dung dịch gốc thuốc bảo vệ thực vật (3.11) với hỗn hợp của dung dịch chuẩn nội (3.2.1) và nước (4.10) với tỷ lệ 20:80 (thể tích).

3.13. Dung dịch hãm

Trộn 2 g etylen glycol với 8 ml axeton (3.3).

4) Thiết bị và dụng cụ

4.1. Yêu cầu chung

Tất cả các dụng cụ thủy tinh được sử dụng phải được rửa kỹ. Có thể sử dụng dung dịch tẩy rửa nóng, nhưng sau đó phải được tráng kỹ bằng nước cất và axeton trước khi làm khô.

Sử dụng thiết bị và dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường, cụ thể như sau:

4.2. Máy thái thực phẩm dạng nhỏ.

4.3. Bộ đồng hóa hoặc bộ trộn tốc độ cao.

4.4. Máy ly tâm, có các ống polytetrafluoroetylen dung tích 200 ml và có thể tạo ra tần số ít nhất ở 4 000 min-1

4.5. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 50 oC đến 60 oC .

4.6. Cột SPE, được nhồi bằng 100 mg silica liên kết aminopropyl, cỡ hạt 40 μm (ví dụ: Bond-Elut®) (tùy chọn).

4.7. Thiết bị rửa giải cột SPE (4.6) có bộ phận hút (tùy chọn).

CHÚ THÍCH Thiết bị rửa giải SPE tự động có bán sẵn trên thị trường.

4.8. Sắc ký lỏng hiệu năng cao, được trang bị:

4.8.1. Hệ thống bơm có van bơm sáu cổng với vòng lấy mẫu 100 μl , hệ thống sau cột (gồm cột phản ứng, chi tiết chữ T thể tích chết thấp và bơm thuốc thử không xung), detector huỳnh quang và bộ phận định lượng có hệ thống phân tích.

4.8.2. Cột bảo vệ HPLC, cột bằng thép không gỉ, dài 10 mm, đường kính trong 4,0 mm (ví dụ LiChroCART®, được nhồi bằng Superpher®16 60 RP-8 (cỡ hạt 4 μm ).

16 Bond-Elut® là tên thương mại của sản phẩm do Analytichem International, Harbor City, CA, USA, LiChroCART® cung cấp và Superspher® là tên thương mại của sản phẩm do Merck, Darmstadt, Germany cung cấp. Aminex là tên thương mại của sản phẩm do Bio-Rad, Hercules, CA, USA cung cấp. Các thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này còn CEN không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho các kết quả tương tự.

4.8.3. Cột phân tích HPLC, cột bằng thép không gỉ, dài 250 mm, đường kính trong 4,0 mm (ví dụ LiChroCART®, được nhồi bằng Superpher® 60 RP-8 (cỡ hạt 4 μm ).

4.8.4. Cột thủy phân sau cột, cột bằng thép không gỉ, dài 50 mm, đường kính trong 4,0 mm, được nhồi Amiex® A 27 (15 μm)

4.9. Thiết bị siêu âm.

4.10. Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 μm.

5) Lấy mẫu

Chuẩn bị mẫu phòng thử nghiệm theo phương pháp khuyến cáo chung cho việc lấy mẫu để thu được mẫu đại diện của sản phẩm cần phân tích.

6) Chuẩn bị mẫu thử

Khi có thể, tiến hành phân tích mẫu ngay khi được chuyển đến phòng thử nghiệm. Không phân tích mẫu phòng thử nghiệm khi mẫu đã bị hỏng.

Để phân tích, chỉ lấy phần mẫu phòng thử nghiệm áp dụng giới hạn dư lượng tối đa. Có thể không phải loại bỏ tiếp các phần của thực vật. Ghi lại các phần của thực vật đã loại bỏ. Mẫu đã chuẩn bị này là mẫu thử.

Nếu mẫu không thể phân tích ngay thì bảo quản ở 0 oC đến 5 oC không quá 3 ngày trước khi phân tích.

Tiến hành giảm mẫu phòng thử nghiệm theo cách sao cho thu được các phần đại diện (ví dụ: được chia bốn và chọn hai phần đối diện). Khi các mẫu thử là những đơn vị nhỏ (ví dụ như quả nhỏ, đậu đỗ, ngũ cốc) thì mẫu thử phải được trộn đều trước khi cân để lấy phần mẫu thử. Khi mẫu thử là các đơn vị lớn, thì lấy các phần hình nêm V (ví dụ: rau và quả lớn) hoặc các lát cắt ngang (ví dụ: dưa chuột) gồm cả vỏ.

Từ mỗi mẫu thử, lấy ra các phần có thể gây nhiễu đến qui trình phân tích. Trong trường hợp đối với quả có hạt thì loại bỏ hạt. Chú ý sao cho không loại bỏ phần thịt quả. Cơ sở để tính dư lượng là khối lượng ban đầu của mẫu thử ban đầu (cả hạt).

Nếu mẫu cần phải bảo quản quá 3 ngày thì mẫu phải được làm đông lạnh ở âm 18 oC hoặc thấp hơn. Để đảm bảo rằng ngay cả sau khi được rã đông có thể lấy được mẫu đại diện, thì chuẩn bị các phần của sản phẩm đủ cho một lần phân tích.

Cắt mẫu thử và cân các phần mẫu thử 15 g chính xác đến ± 1 %.

7) Cách tiến hành

7.1. Yêu cầu chung

Chuẩn bị mẫu trắng thuốc thử và các mẫu trắng chất nền và thực hiện các phép thử thu hồi thích hợp với các giới hạn dư lượng tối đa.

CHÚ THÍCH Người phân tích phải hiểu rõ về phương pháp trước khi bắt đầu phân tích.

7.2. Tách chiết

Đồng hóa 15 g (m) thử với 30 ml axeton (3.3) 30 s trong ống ly tâm (4.4). Thêm 30 ml diclometan (3.5) và 30 ml dầu nhẹ (3.6) và đồng hóa tiếp trong 30 s . Ly tâm ống 5 phút ở tốc độ 4000 min-1. Gạn lớp phía trên (hữu cơ) cho vào bình nón.

Chuyển từng phần 2 ml lớp này sang ống nghiệm và thêm 50 μl dung dịch hãm (3.25).

Cho bay hơi nhẹ dung môi đến gần khô.

7.3. Chiết pha rắn (tùy chọn)

Hút 1 ml diclometan (3.5) cho qua cột SPE (4.6) được gắn với thiết bị rửa giải thích hợp (4.7), rồi gạn bỏ dịch rửa giải. Hòa tan phần cặn thu được trong 7.2 bằng 1 ml diclometan. Cho dung dịch này vào ống SPE, dùng 0,5 ml diclometan để tráng và bắt đầu thu lấy dịch rửa giải cho vào ống nghiệm. Tiếp tục rửa giải bằng 1 ml hỗn hợp rửa giải SPE (3.20), thu lấy dịch rửa giải này vào cùng ống nghiệm và cho bay hơi nhẹ dung môi đến gần khô.

CHÚ THÍCH Bước làm sạch này loại bỏ đáng kể lượng chất chiết đồng thời ra khỏi chất nền và tránh các chất gây nhiễu lắng trên cột bảo vệ HPLC.

7.4. Đo HPLC

Hòa tan cặn thu được trong 7.2 hoặc 7.3 trong 1 ml dung dịch chuẩn nội (3.21) trên thiết bị siêu âm (4.9). Lọc dung dịch qua màng lọc (4.10) và bơm 100 μl lên hệ thống HPLC (4.8) có cột bảo vệ như ví dụ trong 4.8.2 và cột phân tích ví dụ trong 4.8.3.

Áp dụng ví dụ như chương trình gradient ba yếu tố sau đây, ở tốc độ dòng 0,75 ml/ phút:

75% pha động A và 25 % pha động B trong 5 phút, sau đó áp dụng tuyến tính từ 0 % pha động C đến 100 % pha động C trong 20 phút, cuối cùng 100 % pha động C trong 5 phút.

Cho dịch rửa giải từ cột phân tích HPLC qua cột phản ứng như trong 4.8.1. có chứa cột thủy phân sau cột như trong 4.8.4. Duy trì cột phản ứng ở 120 oC.

Để rửa giải cột thủy phân, thêm thuốc thử OPA (3.19) với tốc độ 0,1 ml/min qua chi tiết chữ T thể tích chết thấp.

Cho hỗn hợp đi qua detector huỳnh quang. Các bước sóng kích thích và phát xạ được cài đặt tương ứng 340 nm và 455 nm.

CHÚ THÍCH Có thể thay thế các điều kiện vận hành HPLC khác nếu chúng cho kết quả tương tự. Xem Phụ lục B về các điều kiện vận hành thay thế của HPLC.

8) Tính kết quả

Để nhận biết N-metylcarbamat có mặt, so sánh thời gian lưu của các pic thu được đối với các dung dịch mẫu thử thu được bằng cách trộn và pha loãng dung dịch gốc thuốc bảo vệ thực vật (3.11) thích hợp.

Để định lượng N-metylcarbamat đã nhận dạng, sử dụng các dung dịch chuẩn (4.12) của hợp chất này có các nồng độ thích hợp, ví dụ: 0,005 μg/mlđến 0,05 (cid:0) g/ml. Tiến hành theo 7.4. Trong sắc ký đồ, đo chiều cao pic (hoặc diện tích pic) thu được đối với hợp chất và trimethacarb chuẩn và tính thương số của hai giá trị này. Đối với đường chuẩn, đánh dấu các lượng của hợp chất có chứa trong 1 ml của từng dung dịch chuẩn trên trục hoành và các thương số thu được trên trục tung.

x

w (cid:0)

Đối với pic thu được của hợp chất đã nhận dạng từ dung dịch mẫu thử, tính thương số như được đề cập ở trên và đọc khối lượng trong dung dịch mẫu thử từ đường chuẩn. Tính phần khối lượng, w, bằng miligam trên kilogam mẫu thử, theo công thức:

m

(1)

trong đó:

X là khối lượng của hợp chất đọc được từ đường chuẩn, tính bằng microgam (μg );

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

9) Phép thử khẳng định

Cần tiến hành các phép thử khẳng định việc nhận dạng và định lượng các dư lượng thuốc bảo vệ thực vật quan sát được, đặc biệt là trong các trường hợp cho thấy vượt quá các mức giới hạn dư lượng tối đa (MRL).

Phương pháp cặp đôi sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là phương pháp điển hình để khẳng định việc nhận dạng và định lượng N-metylcarbamat. Đối với các hợp chất này mà không phân tích được bằng sắc ký khí, thì các kỹ thuật sử dụng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) hoặc sắc ký lỏng detector chuỗi diot quang (LC-DAD) là thích hợp.

10)Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- viện dẫn tiêu chuẩn này;

- kết quả thu được và đơn vị tính;

- ngày lấy mẫu và phương pháp lấy mẫu (nếu biết);

- ngày nhận mẫu;

- ngày thử nghiệm;

- mọi điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

- mọi chi tiết thao tác không được quy định trong phương pháp này hoặc tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

2.3 Phân tích các chỉ tiêu vi sinh trong sản phẩm 2.3.1 Định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trên

đĩa thạch Baird-Parker (dựa theo 4830-1:2005)

1) Phạm vị áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trên đĩa thạch có mặt trong các sản phẩm dùng cho con người hoặc thức ăn chăn nuôi, bằng cách đếm số khuẩn lạc thu được trên môi trường đặc (môi trường Baird-Parker) sau khi ủ trong điều kiện hiếu khí ở 35 (cid:0) C đến 37 (cid:0) C.

2) Nguyên tắc

2.1. Cấy lên bề mặt của môi trường cấy đặc chọn lọc, sử dụng hai đĩa, dùng một lượng mẫu thử quy định nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc với một lượng huyền phù ban đầu quy định nếu sản phẩm ở dạng khác.

Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu, dùng hai đĩa cho mỗi độ pha loãng.

2.2. Ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 35 (cid:0) C hoặc 37 (cid:0) C17 và kiểm tra sau 24h và 48h.

2.3. Tính số lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một mililit, hoặc trong một gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc điển hình và/ hoặc không điển hình trên các đĩa ở các bộ phận pha loãng đã chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và được khẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính.

3) Dịch pha loãng và môi trường cấy

3.1. Yêu cầu chung

Đối với thực hành trong phòng thí nghiệm, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

3.2. Dịch pha loãng

Xem TCVN 6507 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra.

3.3. Môi trường thạch Baird-Parker18

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng môi trường bán sẵn, trong trường hợp này phải theo đúng các chỉ dẫn của nhà sản xuất.

3.3.1. Môi trường cơ bản

17 Nhiệt độ được thỏa thuận giữa các bên có liên quan và được nêu trong báo cáo thử nghiệm. 18 Môi trường thạch là môi trường Baird-Packer có bổ sung sulfamezathin nếu nghi ngờ sự có mặt của Proteus.

3.3.1.1. Thành phần

Pepton từ casein 10,0 g

1,0 g Cao nấm men Cao 1) Phụ thuộc vào sức đông của thạch.

3.3.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 (cid:0) C, nếu cần.

Chuyển các lượng 100 ml môi trường vào các bình hoặc các lọ (4.5) có dung tích thích hợp.

Khử trùng môi trường 15 phút ở 121 (cid:0) C.

3.3.2. Dung dịch

3.3.2.1. Dung dịch kali telurit

3.3.2.1.1. Thành phần

2

Kali telurit 2) (K TeO 1,0 g ) Nước 3

2) Chỉ sử dụng kali telurit sẵn có phù hợp đối với phép thử này (xem 5.3.2.1.2).

100 ml

3.3.2.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan hoàn toàn kali telurit trong nước bằng cách đun nóng rất nhẹ.

Bột phải dễ tan. Nếu có mặt chất không hòa tan màu trắng trong nước thì loại bỏ bột đó.

Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 µm để khử trùng.

Dung dịch có thể được bảo quản tối đa một tháng ở nhiệt độ + 3 (cid:0) C ± 2 (cid:0) C.

Loại bỏ dung dịch, nếu có kết tủa màu trắng.

3.3.2.2. Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng (nồng độ khoảng 20 % hoặc theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất).

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng dung dịch bán sẵn, nếu có.

Sử dụng trứng gà tươi còn nguyên vẹn. Dùng bàn chải, rửa trứng trong dung dịch tẩy rửa. Tráng sạch dưới dạng nước chảy, sau đó khử trùng vỏ bằng cách ngâm trong etanol (70 % thể tích) trong 30 giây và để cho đến khô trong không khí, hoặc bằng cách phun cồn sau đó tiệt trùng bằng ngọn lửa.

Tiến hành ở điều kiện vô trùng, đập vỡ từng quả trứng và tách lỏng ra khỏi lòng trắng bằng cách chuyển lòng đỏ từ nửa vỏ quả này sang nửa vỏ quả còn lại nhiều lần. Cho lòng đỏ vào trong bình vô trùng (4.5) và thêm bốn phần thể tích nước vô trùng. Trộn kỹ. Đun nóng hỗn hợp này trong nồi cách thủy (4.4) đặt ở nhiệt độ 47 (cid:0) C trong 2 h và để ở nhiệt độ + 3(cid:0) C ± 2 (cid:0) C từ 18 h đến 24 h để tạo kết tủa. Trong điều kiện vô trùng, thu phần chất lỏng nổi phía trên và bình vô trùng để sử dụng.

Dịch nhũ tương này có thể bảo quản ở nhiệt độ + 3 (cid:0) C ± 2 (cid:0) C tối đa 72 h.

3.3.2.3.1. Thành phần

Sulfamezathin 0,2 g

10 ml

Dung dịch natri hydroxit, c (NaOH) = 0,1 mol/l 90 ml

Nước

3.3.2.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan sulfamezathin trong dung dịch natri hydroxit.

Pha loãng bằng nước đến 100 ml.

Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 µm để khử trùng.

Dung dịch có thể bảo quản tối đa một tháng ở nhiệt độ + 3 (cid:0) C ± 2 (cid:0) C.

3.3.3. Môi trường hoàn chỉnh

3.3.3.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (5.3.1) 100 ml

Dung dịch kali telurit (5.3.2.1) 1,0 ml

Nhũ tương lòng đỏ trứng (5.3.2.2) 5,0 ml

2,5 ml

Dung dịch sulfamezathin (5.3.2.1) (nếu cần)

3.3.3.2. Chuẩn bị

Làm tan chảy môi trường cơ bản, sau đó làm nguội trong nồi cách thủy (4.4) đến khoảng 47 (cid:0) C.

Dưới các điều kiện vô trùng, thêm hai dung dịch khác (3.3.2.1 và 3.3.2.2) và nếu cần (khi nghi ngờ có mặt loài Proteus trong mẫu thử) thì thêm dung dịch sulfamezathin (3.3.2.3), mỗi dung dịch khi thêm đều được làm ấm trước trong nồi cách thủy ở 47 (cid:0) C, lắc kỹ sau khi thêm từng dung dịch.

3.3.4. Chuẩn bị các đĩa thạch

Đổ một lượng thích hợp môi trường hoàn chỉnh (5.3.3) vào đĩa Petri vô trùng để thu được môi trường thạch dày khoảng 4 mm và để cho đặc lại.

Trước khi làm khô, các đĩa có thể được bảo quản đến 24 h ở nhiệt độ + 3 (cid:0) C ± 2 (cid:0) C.

CHÚ THÍCH: Đối với các đĩa sản xuất công nghiệp, cần tuân thủ các chỉ dẫn của nhà sản xuất về thời gian bảo quản.

Trước khi sử dụng, làm khô các đĩa, tốt nhất là mở nắp ra và úp bề mặt thạch xuống dưới, đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ từ 25 (cid:0) C đến 50 (cid:0) C, cho đến khi các giọt nước biến mất trên bề mặt của môi trường.

3.4. Môi trường canh thang não – tim (Brain-heart infusion broth)

3.4.1. Thành phần

Pepton từ mô tế bào động vật 10,0 g

Bột não bê 12,5 g

Bột tim bò 5,0 g

Glucoza 2,0 g

Natri clorua 5,0 g

4

Natri hydro phosphat, khan (Na ) 2,5 g HPO 2

1 000 ml Nước

3.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,4 ± 0,2 ở 25 (cid:0) C.

Chuyển các lượng môi trường cấy từ 5 ml đến 10 ml vào ống hoặc lọ (4.5) có dung tích thích hợp.

Khử trùng môi trường 15 phút ở 121 (cid:0) C.

3.5. Huyết tương thỏ

Sử dụng huyết tương thỏ khô có bán sẵn và hồi nước theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Nếu không sẵn có huyết tương thỏ khô, thì pha loãng một thể tích của huyết tương thỏ vô trùng tươi với ba thể tích nước vô trùng.

Nếu kali xitrat hoặc natri xitrat được sử dụng làm chất chống đông vón19 huyết tương, thì thêm dung dịch EDTA (axit etylenediaminetetraaxetic) để có được dung dịch 0,1 % EDTA trong huyết tương đã hồi nước hoặc huyết tương đã pha loãng.

Huyết tương đã hồi nước hoặc huyết tương đã pha loãng phải được dùng ngay, trừ khi có quy định của nhà sản xuất.

Trước khi sử dụng, kiểm tra từ mẻ huyết tương với các chủng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase và Staphylococci phản ứng âm tính với coagulase.

4) Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

CHÚ THÍCH: Có thể dùng dụng cụ thủy tinh sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp.

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm vi sinh vật thông thường và cụ thể là:

4.1 Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) và khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

(cid:0) C. (cid:0) C 37 1 ±

4.2. Tủ ấm, để duy trì môi trường đã cấy, các đĩa và ống ở trong dải nhiệt độ 35 (cid:0) C ± 1(cid:0) C hoặc 4.3. Tủ sấy hoặc tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ từ 25 (cid:0) C ± 1 (cid:0) C đến 50 (cid:0) C ± 1 (cid:0) C.

4.4. Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự, có thể duy trì được nhiệt độ ở 47 (cid:0) C ± 2 (cid:0) C.

4.5. Ống nghiệm, bình hoặc lọ có nắp vặn, có dung tích thích hợp để khử trùng, bảo quản môi trường cấy và ủ môi trường dạng lỏng; đặc biệt, các ống đựng dung dịch hồng cầu vô trùng, hoặc các lọ đáy tròn có kích thước khoảng 10 mm x 75 mm.

4.6. Đĩa Petri, vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo.

4.7. Que cấy thẳng và pipet Pasteur.

19 Đối với huyết tương đã oxalat hóa hoặc hêparin hóa thì không cần đến EDTA

4.8. Pipet chia độ xả hết, có dung tích danh định 1 ml, 2 ml và 10 ml, được chia vạch tương ứng 0,1 ml, 0,1 ml và 0,5 ml.

4.9. Dụng cụ dàn mẫu, vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo.

4.10. pH mét, có thể đọc chính xác đến 0,01 đơn vị pH ở 25 (cid:0) C, có thể đo chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH.

5) Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng, thì các bên có liên quan tự thỏa thuận về vấn đề này.

Điều quan trọng là phòng thí nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình bảo quản hoặc vận chuyển.

6) Chuẩn bị mẫu thử

Việc chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn riêng phù hợp với các sản phẩm tương ứng. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng, thì các bên có liên quan tự thỏa thuận về vấn đề này.

7) Cách tiến hành

7.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng phù hợp với sản phẩm liên quan.

7.2. Cấy

7.2.1. Dùng pipet vô trùng (4.8) chuyển vào hai đĩa thạch (3.3.4) mỗi đĩa 0,1 ml mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc 0,1 ml huyền phù ban đầu (độ pha loãng 10 -1) nếu sản phẩm ở dạng khác. Lặp lại trình tự này đối với độ pha loãng 10 -2 và các độ pha loãng thập phân tiếp theo nếu cần.

7.2.2. Đối với sản phẩm nhất định, tốt nhất để đếm Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase với số lượng thấp, thì các giới hạn phát hiện có thể tăng lên 10 lần bằng cách cấy 1,0 ml mẫu thử dạng lỏng, hoặc 1,0 ml huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt của một đĩa thạnh lớn (140 mm) hoặc lên bề mặt của ba đĩa thạch nhỏ (90 mm). Trong cả hai trường hợp, chuẩn bị mẫu kép bằng cách dùng hai đĩa to hoặc sáu đĩa nhỏ.

7.2.3. Sử dụng dụng cụ dàn mẫu (4.9) dàn chất cấy cẩn thận càng nhanh càng tốt, lên mặt đĩa thạch, cố gắng không chạm vào mép đĩa. Để các đĩa có nắp đậy cho đến khô trong khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng thử nghiệm.

7.3. Ủ

Lật ngược các đĩa đã được chuẩn bị theo 7.2.3 và ủ chúng trong 24 h ± 2 h sau đó ủ lại thêm 24 h ± 2 h trong tủ ấm (6.2) ở 35 (cid:0) C hoặc 37 (cid:0) C20.

20 Nhiệt độ này được các bên có liên quan thỏa thuận và được nêu rõ trong báo cáo thử nghiệm.

7.4. Chuẩn bị các đĩa và diễn giải

7.4.1. Sau khi ủ 24 h ± 2 h, đánh dấu vị trí của các khuẩn lạc điển hình có mặt (xem chú thích 1) dưới đáy của các đĩa.

Ủ lại tất cả các đĩa ở nhiệt độ 35 (cid:0) C hoặc 37 (cid:0) C thêm 24 h ± 2 h, và đánh dấu các khuẩn lạc điển hình mới. Đồng thời cũng đánh dấu cả các khuẩn lạc không điển hình có mặt (xem chú thích 1 của tiêu chuẩn này).

Chỉ lấy các đĩa (xem chú thích 2) có chứa tối đa 300 khuẩn lạc với 150 khuẩn lạc điển hình và/ hoặc không điển hình ở hai dung dịch kế tiếp nhau để định lượng. Một trong các đĩa phải chứa ít nhất 15 khuẩn lạc. Chọn để khẳng định (7.5) lượng A đã có (thường 5 khuẩn lạc điển hình, hoặc 5 khuẩn lạc không điển hình nếu chỉ có khuẩn lạc không điển hình, hoặc 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc không điển hình nếu cả hai loại đều có mặt ở mỗi đĩa).

Với sản phẩm dạng lỏng chưa pha loãng hoặc dung dịch pha loãng thấp nhất của các sản phẩm dạng khác, nếu có ít hơn 15 khuẩn lạc điển hình và/hoặc không điển hình có mặt trên các đĩa, có thể ước tính như mô tả trong 7.4.3 và 8.2.

CHÚ THÍCH 1: Các khuẩn lạc điển hình có màu đen hoặc màu xám, bóng và lồi (có đường kính từ 1 mm đến 1,5 mm sau khi ủ trong 24 h, và từ 1,5 mm đến 2,5 mm sau khi ủ 48 h) và được bao quanh bởi một vùng trong rõ rệt, cũng có thể là mờ từng phần. Sau khi ủ trong ít nhất 24 h, có thể xuất hiện một vòng màu trắng đục tiếp giáp với khuẩn lạc.

CHÚ THÍCH 2: Các khuẩn lạc không điển hình cùng kích cỡ như khuẩn lạc điển hình và có thể có một trong các trạng thái sau:

- các khuẩn lạc đen bóng có hoặc không viền trắng hẹp; không có vùng trong hoặc hầu như không nhìn thấy và không có vòng trắng đục hoặc rất khó nhìn thấy.

- các khuẩn lạc màu xám không có vùng trong.

Các khuẩn lạc không điển hình được hình thành chủ yếu bởi các chủng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase bị nhiễm bẩn trong các sản phẩm, ví dụ, các sản phẩm sữa, tôm và các bộ phận của vật nuôi. Chúng thường ít khi được hình thành bởi nhiễm các chủng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase bị nhiễm bẩn trong các sản phẩm khác.

CHÚ THÍCH 3: Các khuẩn lạc khác là tất cả các khuẩn lạc còn lại có khả năng có mặt trên các đĩa mà không cho thấy biểu hiện bên ngoài điển hình hoặc không điển hình như đã mô tả trong Chú thích 1 và Chú thích 2, và được coi là hệ vi khuẩn nền.

7.4.2. Nếu dàn 1,0 ml chất cấy lên ba đĩa (xem 7.2.2), thì xử lý các đĩa này giống nhau theo các quy trình đếm và khẳng định.

7.4.3. Để ước tính số lượng nhỏ Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase, thì giữ lại tất cả các đĩa có chứa chất khuẩn lạc điển hình và không điển hình. Chọn tất cả các khuẩn lạc để khẳng định nằm trong giới hạn đề ra ở trên.

7.5. Khẳng định (phép thử coagulase)

Từ mỗi khuẩn lạc đã chọn (7.4), dùng que cấy vô trùng (4.7) lấy một phần và chuyển vào ống hoặc lọ đựng môi trường canh thanh não – tim (3.4).

Ủ ở 35 (cid:0) C hoặc 37 (cid:0) C21 trong 24 h ± 2 h.

Bằng kỹ thuật vô trùng, lấy 0,1 ml mỗi dịch cấy cho vào 0,3 ml huyết tương thỏ (5.5) (trừ khi nhà sản xuất quy định các lượng khác) đựng trong các ống hoặc lọ đựng dung dịch hồng cầu vô trùng (quy định trong 4.5), và ủ ở nhiệt độ 35 (cid:0) C hoặc 37 (cid:0) C.

Nghiêng ống, kiểm tra sự kết dính của huyết tương sau khi ủ từ 4 h đến 6 h và nếu phép thử là âm tính, thì kiểm tra lại sau khi ủ 24 h, hoặc kiểm tra theo thời gian ủ được nhà sản xuất quy định.

Nếu thể tích kết dính chiếm hơn một nửa thể tích ban đầu của chất lỏng, thì phép thử coagulase là dương tính.

Để kiểm tra âm tính, đối với mỗi mẻ huyết tương, thêm 0,1 ml môi trường canh thanh não-tim vô trùng (3.4) vào một lượng huyết tương thỏ (3.5) đã khuyến cáo và ủ nhưng không cấy. Phép thử hợp lệ khi kiểm tra huyết tương cho thấy không có dấu hiệu kết dính.

8) Biểu thị kết quả

8.1. Trường hợp chung

8.1.1. Tính số lượng a của Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đã nhận dạng trên mỗi đĩa đã chọn

Trên mỗi đĩa, tính số lượng a các Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đã được nhận dạng, theo công thức:

c

c

nc

bc a (cid:0) A (cid:0) bnc xc  xc A

Trong đó

c

A là số lượng khuẩn lạc điển hình đã qua phép thử coagulase (7.5);

nc

A là số lượng khuẩn lạc không điển hình đã qua phép thử coagulase (7.5);

c

b là số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase;

nc

b là số lượng khuẩn lạc không điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với

coagulase;

c

c là tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa (7.4);

nc

c là tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy trên đĩa (7.4);

21 Nhiệt độ được thỏa thuận giữa các bên có liên quan và được nêu trong báo cáo thử nghiệm.

8.1.2. Tính số lượng N Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đã được nhận dạng có mặt trong phần mẫu thử

Đối với các đĩa có chứa tối đa 300 khuẩn lạc, có 150 khuẩn lạc điển hình và/ hoặc không điển hình ở hai độ pha loãng liên tiếp, thì tính số lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đối với mỗi đĩa theo quy định trong 8.1.1 và tính số N Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase được nhận biết có mặt trong mẫu thử, là trung bình thu được từ hai độ loãng liên tiếp, bằng công thức sau:

(cid:0)     a

N (cid:0) (cid:0)

V (n

1

2 )d

0,1n

(cid:0) a là tổng số khuẩn lạc Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đã nhận biết trên tất cả các đĩa đã chọn.

Trong đó:

V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

1

n là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất;

2

n là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai;

d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn (huyền phù ban đầu là một độ pha loãng).

Làm tròn các kết quả đã tính đến hai chữ số có nghĩa.

Báo cáo kết quả theo số Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (đối với sản phẩm ở dạng khác), được biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân 10x, trong đó x là lũy thừa tương ứng của 10.

8.1.3. Ví dụ

Số đếm của sản phẩm sau khi cấy 0,1 ml sản phẩm đã cho các kết quả sau:

- đối với độ pha loãng thứ nhất đã chọn (10-2): 65 khuẩn lạc điển hình, 85 khuẩn lạc điển hình và không có khuẩn lạc không điển hình;

- đối với độ pha loãng thứ hai đã chọn (10-3): 3 khuẩn lạc điển hình, 7 khuẩn lạc điển hình và không có khuẩn lạc không điển hình.

Số lượng được cấy đâm sâu như sau:

- từ 65 khuẩn lạc, 5 khuẩn lạc được cấy đâm sâu và cả 5 khuẩn lạc đã cho phản ứng dương tính với coagulase, nên a = 65.

- từ 85 khuẩn lạc, 5 khuẩn lạc được cấy đâm sâu, 3 trong số đó đã cho phản ứng dương tính với coagulase, nên a = 51.

- từ 3 khuẩn lạc, tất cả 3 khuẩn lạc được cấy đâm sau và đã cho phản ứng dương tính với coagulase, nên a = 3.

- từ 7 khuẩn lạc, 5 khuẩn lạc được cấy đâm sâu và cả 5 đã cho phản ứng dương tính với coagulase, nên a = 7.

57 272 65 (cid:0) 51 (cid:0) 3 (cid:0)

(cid:0) 2

N (cid:0) 7 (cid:0) 0,22 (cid:0) 10

Kết quả sau khi được làm tròn là 5,7 x 104

9) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

- tất cả thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- nhiệt độ ủ đã sử dụng;

- mọi chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc xem như tùy ý lựa chọn, cũng như bất kỳ chi tiết bất thường mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

- các kết quả thu được.

2.3.2 Định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính coagulase trên đĩa thạch Fibrinogen huyết tương thỏ (dựa theo TCVN 4830-2:2005).

1.3.1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trên đĩa thạch có trong các sản phẩm dùng cho con người hoặc thức ăn chăn nuôi, bằng cách tính các khuẩn lạc thu được trên môi trường đặc (môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ) sau khi ủ trong điều kiện hiếu khí ở 35 oC hoặc 37 oC.

1.3.2) Nguyên tắc

2.1 Chuẩn bị hai đĩa rót môi trường thạch chọn lọc fibrinogen huyết tương thỏ, với một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc với một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu sản phẩm ở dạng khác.

Trong cùng một điều kiện, cấy các dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu, dùng hai đĩa cho một độ pha loãng.

2.2 Ủ các đĩa ở 35 oC hoặc 37 oC22 trong 18 h đến 24 h, và ủ thêm 24 h, nếu cần.

2.3 Từ số lượng các khuẩn lạc điển hình trên đĩa Petri, tính số lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong 1 mililit, hoặc trong 1 gam mẫu thử.

1.3.3) Dịch pha loãng và môi trường cấy

3.1 Yêu cầu chung

22 Nhiệt độ được thỏa thuận giữa các bên có liên quan và được nêu trong báo cáo thử nghiệm.

Đối với thực hành trong phòng thử nghiệm, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

3.2 Dịch pha loãng

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra.

3.3 Môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng môi trường bán sẵn phù hợp với yêu cầu của tiêu chuẩn này. Tuy nhiên, cần xem xét các thay đổi về điều kiện thực nghiệm đối với các sản phẩm dạng này, đối với từng lô dung dịch fibrinogen bovin/ huyết tương thỏ nên được thử nghiệm trước khi sử dụng, bằng cách kiểm tra dương tính và âm tính.

3.3.1 Môi trường cơ bản

Chuẩn bị môi trường cơ bản theo 5.3.1 của TCVN 4830-1: 2005 (ISO 6888-1 : 1999), ngoại trừ việc phân phối môi trường cơ bản từng lượng 90 ml vào bình hoặc lọ.

3.3.2 Dung dịch

3.3.2.1 Dung dịch kali telurit

Chuẩn bị dung dịch dung dịch kali telurit theo 5.3.2.1 của TCVN 4830-1 : 2005 (ISO 6888-1 : 1999).

3.3.2.2 Dung dịch fibrinogen bovin

3.3.2.2.1 Thành phần

5g đến 7g3) Fibrinogen bovin

Nước vô trùng 100 ml

3) Tùy thuộc vào độ tinh khiết của fĩbrinogen bovin

3.3.2.2.2 Chuẩn bị

Hoà tan fibrinogen bovin trong nước ở điều kiện vô trùng ngay trước khi sử dụng.

3.3.2.3 Dung dịch ức chế tripsin và huyết tương thỏ

3.3.2.3.1 Thành phần

30 ml

Huyết tương thỏ có EDTA dùng cho coagulase (huyết tương coagulase EDTA)

Chất ức chế trypsin 30 mg

3.3.2.3.2 Chuẩn bị

Ngay trước khi sử dụng, hoà tan các thành phần trong nước dưới các điều kiện vô trùng.

3.3.3 Môi trường hoàn chỉnh

3.3.3.1 Thành phần

Môi trường cơ bản (3.3.1) 90 ml

Dung dịch kali telurit (3.3.2.1) 0,25 ml

Dung dịch fibrinogen bovin (3.3.2.2) 7,5 ml

Dung dịch ức chế tripsin và huyết tương thỏ (3.3.2.3) 2,5 ml

3.3.3.2 Chuẩn bị

Làm tan chảy môi truờng cơ bản, sau đó làm nguội trong nồi cách thuỷ (4.3) đến khoảng 48 oC (cid:0) 1 oC.

Dưới các điều kiện vô trùng, thêm ba dung dịch còn lại đã được làm ấm trước đến 48 oC (cid:0)  1 oC trong nồi cách thuỷ. Trộn kỹ sau mỗi lần thêm bằng cách xoay tròn để hạn chế tối đa việc tạo bọt.

Sử dụng môi trường hoàn chỉnh ngay sau khi chuẩn bị, để tránh việc tạo kết tủa của huyết tương.

CẢNH BÁO - Nếu sử dụng dung dịch bovin fibrinogen/ huyết tương thỏ bán sẵn, thì tuân thủ nghiêm ngặt các chỉ dẫn của nhà sản xuất khi chuẩn bị dung dịch này và môi trường hoàn chỉnh (đặc biệt là nhiệt độ của môi trường cơ bản). Ngược lại, có thể làm mất hoàn toàn hoạt tính môi trường.

3.4 Chuẩn bị các đĩa thạch

Xem 5.3.4 của TCVN 4830-1: 2005 (ISO 6888-1 : 1999).

1.3.4) Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng các thiết bị dùng một lần thay cho dụng cụ thuỷ tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp.

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh vật thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể là:

4.1 Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) và khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

Xem TCVN 6404 (ISO 7218)

4.2 Tủ ấm, để duy trì nhiệt độ của môi trường đã cấy, các đĩa và ống trong dải nhiệt độ 35 oC (cid:0) 1 oC hoặc 37 oC (cid:0) 1 oC.

4.3 Nồi cách thuỷ, hoặc thiết bị tương tự, có thể duy trì được ở nhiệt độ 48 oC (cid:0) 1 oC.

4.4 Đĩa Petri, vô trùng, bằng thuỷ tinh hoặc chất dẻo.

4.5 Pipet chia độ xả hết, có dung tích danh định 1 ml, 2 ml và 10 ml, được chia vạch 0,1 ml, 0,1 ml và 0,5 ml tương ứng.

1.3.5) Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng, thì các bên có liên quan tự thoả thuận về vấn đề này.

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình bảo quản hoặc vận chuyển.

1.3.6) Chuẩn bị mẫu thử

Việc chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn riêng phù hợp với sản phẩm tương ứng. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng, thì các bên có liên quan tự thoả thuận về vấn đề này.

1.3.7) Cách tiến hành

7.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng phù hợp với sản phẩm liên quan.

7.2 Cấy và ủ

7.2.1 Lấy 2 đĩa Petri vô trùng (4.4). Dùng pipet vô trùng (4.5) chuyển vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử sản phẩm dạng lỏng, hoặc 0,1 ml huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác. Lấy hai đĩa Petri vô trùng khác và chuyển vào mỗi đĩa 1 ml dịch pha loãng thập phân thứ nhất.

Lặp lại trình tự này với các độ pha loãng liên tiếp, sử dụng pipet mới vô trùng đối với mỗi dung dịch pha loãng thập phân.

7.2.2 Rót ngay vào từng đĩa Petri (7.2.1) môi trường hoàn chỉnh vừa chuẩn bị (3.3.3) dày khoảng 3 mm (không giữ môi trường này ở dạng lỏng).

Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường và để cho đông đặc lại bằng cách đặt đĩa Petri lên trên mặt phẳng nằm ngang.

7.2.3 Sau khi đông đặc hoàn toàn, lật ngược các đĩa này và đặt chúng vào tủ ấm (4.2) để ở 35 oC hoặc 37 oC 2)23 từ 18 h đến 24 h. Ủ lại từ 18 h đến 24 h, nếu cần.

23 Nhiệt độ được thỏa thuận giữa các bên có liên quan và được nêu trong báo cáo thử nghiệm

7.3 Đếm khuẩn lạc

Sau khi kết thúc giai đoạn ủ (xem 7.2.3), Staphylococci hình thành khuẩn lạc nhỏ màu đen hoặc màu xám hoặc thậm chí màu trắng được bao quanh bởi vòng sáng kết tủa dấu hiệu cho hoạt tính coagulase. Khi bắt đầu ủ, các khuẩn lạc Proteus có thể cho thấy vẻ bên ngoài giống với các khuẩn lạc Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase. Tuy nhiên, sau khi ủ 24 h hoặc 48 h, chúng có thể phát triển thành khuẩn lạc mọc rộng có màu nâu đậm hoặc nâu nhạt do đó có thể phân biệt được với vi khuẩn staphyloccocci.

Đếm các khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa.

CHÚ THÍCH: Vì thạch fibrinogen huyết tương thỏ được dựa vào phản ứng coagulase, nên không cần thử khẳng định hoạt tính này.

1.3.8) Biểu thị kết quả

8.1 Trường hợp chung

Chọn các đĩa chứa tối đa 300 khuẩn lạc, có 100 khuẩn lạc điển hình ở hai độ pha loãng liên tiếp. Mỗi đĩa chứa ít nhất 15 khuẩn lạc điển hình.

1

2 )d

Tính số lượng N Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase có trong một mililit hoặc trong một gam sản phẩm là số trung bình của hai độ pha loãng liên tiếp, sử dụng công thức sau: (cid:0) C N = (cid:0) V (n 0,1n

trong đó

C

(cid:0) là tổng số các khuẩn lạc staphylococcal điển hình trên tất cả các đĩa đã chọn;

V là thể tích chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

1

n là số lượng các đĩa đã chọn ở độ pha loãng thứ nhất;

2

n là số lượng các đĩa đã chọn ở độ pha loãng thứ hai;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất đã chọn (huyền phù ban đầu là một độ pha loãng),

Làm tròn các kết quả tính được đến hai chữ số có nghĩa.

Lấy kết quả là số lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm ở dạng khác), được biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân 10x, trong đó x là luỹ thừa tương ứng của 10.

VÍ DỤ

Số đếm của sản phẩm sau khi cấy 0,1 ml sản phẩm cho các kết quả sau:

- Đối với độ pha loãng thứ nhất đã chọn (10-2): 66 khuẩn lạc điển hình và 54 khuẩn lạc điển hình;

- Đối với độ pha loãng thứ hai đã chọn (10-3): 4 khuẩn lạc điển hình và 7 khuẩn lạc điển hình.

66 (cid:0) 54 (cid:0) 4 (cid:0) 7 N = (cid:0) 5

955 (cid:0) 2 2,2(cid:0) 10

Kết quả sau khi được làm tròn là 6,0 x 103.

8.2 Ước tính các số lượng nhỏ

8.2.1 Nếu hai đĩa, tương ứng với mẫu thử (nếu các sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (nếu các sản phẩm ở dạng khác), mỗi đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc thì báo cáo các kết quả như sau:

a) Đối với các sản phẩm dạng lỏng, số Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase được ước tính trong một mililit:

C N = 2

trong đó: C là tổng số các khuẩn lạc Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đếm được (7.3) trên hai đĩa đã chọn:

b) Đối với các sản phẩm ở dạng khác, Staphylococci có phản ứng dương tinh với coagulase được ước tính trong một gam:

C N = 2xd

trong đó

C là tổng số các khuẩn lạc Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đếm được (7.3) trên hai đĩa đã chọn

d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu.

8.2.2 Nếu hai đĩa, tương ứng với mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) không chứa bất kỳ một khuẩn lạc staphylococcal nào có phản ứng dương tính với coagulase thì báo cáo kết quả như sau:

- Ít hơn 1 Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong 1 mililit (sản phẩm dạng lỏng);

- Ít hơn 1/d Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam (sản phẩm dạng khác), trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu.

1.3.9) Báo cáo kết quả

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

- Tất cả thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Nhiệt độ ủ đã sử dụng;

- Mọi chi tiết không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc xem như tuỳ ý lựa chọn, cũng như bất kỳ chi tiết bất thường mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử:

- Các kết quả thu được.

2.3.3 Định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính coagulase trên đĩa thạch, phát hiện và dùng kỹ thuật đếm có xác suất lớn nhất (MNP) để đếm số lượng nhỏ. (dựa theo TCVN 4830-3:2005)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp phát hiện và định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trên đĩa thạch bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN). Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:

- Các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn chăn nuôi, và

- Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.

Tiêu chuẩn này được khuyến cáo áp dụng cho các sản phẩm khi ước tính tính Staphylococci có mặt trong sản phẩm với số lượng nhỏ, ví dụ như các sản phẩm khô. Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase ban đầu là các Stapylococcus aureus nhưng Stapylococcus intermedius và một số chủng của Stapylococcus hyicus cũng sinh ra coagulase.

2) Nguyên tắc

2.1 Phương pháp phát hiện

2.1.1 Cấy lên môi trường chọn lọc một lượng mẫu thử qui định, nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù qui định ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác .

2.1.2 Ủ các ống trong môi trường kỵ khí ở 37 oC từ 24 h đến 48 h. Sự có mặt của Staphylococci giả định có phản ứng dương tính với coagulase được chỉ thị bởi sự khử kali telurit.

CHÚ THÍCH: Trong tiêu chuẩn này, môi trường kỵ khí thu được bằng cách rót thạch hoặc paraffin đậy lên phía trên mỗi ống, nhưng cũng có một cách khác là ủ các ống này trong bình hoặc trong tủ ấm trong các điều kiện kỵ khí.

2.1.3 Cấy lên bề mặt môi trường Baird-Parker đặc chọn lọc các khuẩn lạc lấy từ các ống dương tính giả định (4.1.2) sau 24 h và tất cả các ống còn lại sau 48 h.

2.1.4. Tất cả các ống được cấy ở 37 oC từ 24 h đến 48 h. Sự có mặt của Staphylococci giả định có phản ứng dương tính với coagulase được chỉ thị bởi sự khử kali telurit và phản ứng với lòng đỏ trứng.

2.1.5 Các khuẩn lạc điển hình và/hoặc không điển hình được khẳng định bằng phản ứng với coagulase.

2.1.6 Cách khác, có thể cấy lên bề mặt thạch fibrinogen huyết tương thỏ, sau khi ủ ấm thích hợp, sự có mặt của Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase được chỉ thị bởi các khuẩn lạc cho thấy có phản ứng với fibrinogen huyết tương thỏ đặc trưng.

2.1.7 Kết quả là "có mặt" hay "không có mặt" Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong x g hay x ml sản phẩm.

2.2 Phương pháp định lượng

2.2.1 Các dãy dung dịch pha loãng sản phẩm được cấy vào môi trường cấy lỏng chọn lọc.

2.2.2 Các ống được ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37 oC từ 24 h đến 48 h. Sự có mặt của Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase giả định được chỉ thị bởi sự khử kali telurit.

CHÚ THÍCH: Trong tiêu chuẩn này, môi trường kỵ khí thu được bằng cách rót thạch hoặc paraffin đậy lên phía trên mỗi ống, nhưng cũng có một cách khác là ủ các ống này trong bình hoặc trong tủ ấm trong các điều kiện kỵ khí.

2.2.3 Cấy lên bề mặt môi trường Baird-Parker đặc chọn lọc các khuẩn lạc lấy từ các ống dương tính giả định (4.2.2) sau 24 h và tất cả các ống còn lại sau 48 h.

2.2.4 Ủ các ống này ở 37 oC từ 24 h đến 48 h. Sự có mặt của Staphylococci giả định có phản ứng dương tính với coagulase được chỉ thị bởi sự khử kali telurit và phản ứng với lòng đỏ trứng.

2.2.5 Các khuẩn lạc điển hình và/hoặc không điển hình được khẳng định bằng phản ứng với coagulase.

2.2.6 Cách khác, có thể cấy lên bề mặt thạch fibrinogen huyết tương thỏ, sau khi ủ ấm thích hợp, sự có mặt của Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase được chỉ thị bởi các khuẩn lạc cho thấy có phản ứng với fibrinogen huyết tương thỏ đặc trưng.

2.2.7 Số có xác suất lớn nhất của Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam hay trong một mililit sản phẩm tính được bằng cách đối chiếu với các bảng số có xác suất lớn nhất cho các độ pha loãng khẳng định (4 2.5 hoăc 4.2.6)

3) Dịch pha loãng và môi trường cấy

Đối với phòng thử nghiệm, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

Các hóa chất được sử dụng để chuẩn bị môi trường cấy và thuốc thử phải có chất lượng tinh khiết phân tích.

3.1 Dịch pha loãng

Xem phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887), hoặc TCVN 6263 (ISO 8261), hoặc tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra.

3.2 Môi trường Giolitti và Cantoni cải biến

3.2.1 Môi trường cơ bản

3.2.1.1 Thành phần

trường nồng

Môi trường nồng độ đơn Môi độ kép

20,0 g 10,0 g Pepton từ casein

10,0 g 5,0 g Cao thịt

10,0 g 5,0 g Cao men

10,0 g 5,0 g Liti clorua

40,0 g 20,0 g Mannitol

10,0 g 5,0 g Natri clorua

2,4 g 1,2 g Glyxin

6,0 g 3,0 g Natri pyruvat

1,0 g 2,0 g

Polyoxyetylen sorbitan mono-oleat (Tween 80)

Nước 1 000 ml 1 000 ml

3.2.1.2 Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần trong nước, bằng cách đun nóng và khuấy, nếu cần, để thu được dung dịch hoà tan hoàn toàn. Làm nguội đến nhiệt độ phòng và chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH cuối cùng là 6,9 (cid:0) 0,2, nếu cần.

Phân phối môi trường với các lượng thích hợp vào các ống nghiệm có kích thước phù hợp (ví dụ: đối với môi trường nồng độ đơn, dùng ống 16 mm x 160 mm, đối với môi trường nồng độ kép thì dùng ống 20 mm x 200 mm).

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121oC.

3.2.2 Dung dịch kali telurit

3.2.2.1 Thành phần

Kali telurit24 (K ) 1,0 g TeO 3 2

Nước 100 ml

3.2.2.2 Chuẩn bị

Hoà tan kali telurit trong nước bằng cách đun nóng rất nhẹ.

Bột phải dễ tan. Nếu có mặt chất không tan màu trắng trong nước; thì loại bỏ kali telurit.

Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 (cid:0) m để khử trùng.

Dung dịch có thể bảo quản được tối đa một tháng ở nhiệt độ 3oC (cid:0) 2oC.

Loại bỏ dung dịch nếu có kết tủa màu trắng.

3.2.3 Môi trường hoàn chỉnh

Ngay trước khi sử dụng, đun nóng môi trường cơ bản (3.2.1) 15 phút ở 100 oC để đuổi hết không khí.

Làm nguội đến nhiệt độ từ 44 oC đến 47 oC và bằng kỹ thuật vô trùng cho thêm vào mỗi ống dung dịch kali telurit (3.2.2): 0,1 ml đối với môi trưòng nồng độ đơn và 0,2 ml đối với môi trường nồng độ kép.

3.2.4 Thử tính năng để đảm bảo chất lượng môi trường cấy

Để xác định tính chọn lọc và năng suất, xem ISO/TS 11133-1. Bảng 1 cho thấy chuẩn cứ thử nghiệm tính năng của môi trường Giolitti và Cantoni cải biến.

Bảng 1 - Chuẩn cứ thử nghiệm tính năng của môi trường Giolitti và Cantoni cải biến

Các chủng kiểm tra Chuẩn cứ Chức năng Chế độ ủ Môi trường chuẩn Phương pháp kiểm tra

Năng suất Bán định lượng 37 oC trong 48 h > 10 khuẩn lạc, trên môi trường chọn lọc

24 Chỉ sử dụng kali telurit phù hợp đối với phép thử này.

Staphylococcus aureus ATCC 6538 P hoặc Staphylococcus aureus ATCC 25923 cộng với chủng cạnh tranh (E.coli ATCC 8732 hoặc 25922), hoặc chủng tương tự được đăng ký trong các bộ khác

TSA Bán định lượng 37oC trong 48h Escherichia coli ATCC 25922 hoặc 8739 hoặc chủng tương tự được đăng ký trong các bộ khác Tính chọn loc

Không mọc trên môi trường không chọn lọc

3.3 Môi trường thạch (20 g/l)

3.3.1 Thành phần

15 g đến 20 g25 Thạch

Nước 1 000 ml

3.3.2 Chuẩn bị

Hoà tan thạch trong nước bằng cách đun sôi và khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121oC.

Làm nguội đến nhiệt độ

từ 44 oC đến 47 oC trước khi sử dụng. Rót vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp. Bảo quản theo TCVN 6404 (ISO 7218).

3.4 Môi trường thạch Baird-Parker

3.4.1 Thành phần và chuẩn bị

Xem 5.3 của TCVN 4830-1 : 2005 (ISO 6888-1 : 1999, with amendment 1: 2003).

3.4.2 Thử tính năng để đảm bảo chất lượng môi trường cấy

Để xác định tính chọn lọc và năng suất, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các chuẩn cứ, xem Bảng B.1 của ISO/TS 11133-2.

3.5 Môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ.

3.5.1 Thành phần và chuẩn bị

Xem 5.3 của TCVN 4830-2 : 2005 (ISO 6888-2: 1999, with amendment 1: 2003).

3.5.2 Thử tính năng để đảm bảo chất lượng môi trường cấy

25 Tùy thuộc vào sức đông của thạch

Để xác định tính chọn lọc và năng suất, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các chuẩn cứ, xem Bảng B.1 của ISO/TS 11133-2.

3.6 Môi trường canh thang não – tim (Brain-heart infusion broth)

3.6.1 Thành phần và chuẩn bị

Xem 5.4 của TCVN 4830-1 : 2005 (ISO 6888-1: 1999, with amendment 1 : 2003).

3.6.2 Thử tính năng để đảm bảo chất lượng môi trường cấy

Để xác định tính chọn lọc và năng suất, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các chuẩn cứ, xem Bảng B.4 của ISO/TS 11133-2.

3.7 Huyết tương thỏ

Xem 5.5 của TCVN 4830-1 : 2005 (ISO 6888-1: 1999, with amendment 1: 2003).

4) Thiết bị và dụng cụ

CHÚ THÍCH: Có thể dùng dụng cụ thuỷ tinh sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể là:

4.1 Tủ ấm, có thể hoạt động ở 37 oC (cid:0) 1 oC.

4.2 Tủ sấy hoặc lò sấy, được thông gió bằng đối lưu, có thể duy trì nhiệt độ từ 37 oC đến 55 oC. Có thể sử dụng tủ quạt gió.

4.3 Đĩa Petri, vô trùng.

4.4 Que cấy vòng, bằng platin-iridi, niken-crôm hoặc chất dẻo, đường kính khoảng 3 mm, hoặc các que cấy vòng 10 (cid:0) l vô trùng sử dụng một lần và các kim cấy sâu bằng chất liệu tương tự.

4.5 Ống nghiệm, có dung tích thích hợp (ví dụ: 16 mm x 160 mm, 20 mm x 200 mm và 10 mm x 75 mm).

4.6 Pipet chia độ, có dung tích danh định 1 ml, được chia vạch 0,1 ml và có lỗ xả với đường kính hợp lý.

4.7 Nồi cách thủy, có thể hoạt động ở nhiệt độ từ 44 oC đến 47 oC và ở 37 oC.

4.8 Dao, để cắt thạch.

4.9 Bình kỵ khí. mẫu 5) Lấy

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng, thì các bên có liên quan tự thoả thuận về vấn đề này.

6) Chuẩn bị mẫu thử

Việc chuẩn bị mẫu thử theo các phần thích hợp của TCVN 6507 (ISO 6887), hoặc TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn riêng cho sản phẩm tương ứng. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng thì các bên liên quan tự thoả thuận với nhau về vấn đề này.

7) Cách tiến hành

7.1 Phương pháp phát hiện

7.1.1 Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu

Xem các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) tuỳ thuộc vào sản phẩm có liên quan hoặc TCVN 6263 (ISO 8261).

Để chuẩn bị huyền phù ban đầu, cho 1 ml hoặc 1 g sản phẩm vào 9 ml hoặc 9 g môi trường Giolitti và Cantoni cải biến nồng độ đơn (3.2) hoặc 10 ml hoặc 10 g vào 10 ml hoặc 10 g môi trường Giolitti và Cantoni cải biến nồng độ kép. Đối với các thể tích lớn hơn của các phần mẫu thử, thêm x ml hoặc x g vào 9 x ml hoặc 9 x g môi trường Giolitti và Cantoni cải biến nồng độ đơn đã được đuổi khí và đã được bổ sung kali telurit, và có thể tích không khí nhỏ nhất trong bình hoặc trong vật chứa. Rót cẩn thận thạch (3.3) hoặc paraffin phủ lên trên môi trường, được làm nguội đến nhiệt độ từ 44 oC đến 47 oC và cho đông đặc lại để tạo thành lớp hàn kín.

7.1.2 Tăng sinh

Ủ (xem 4.1) dung dịch huyền phù ban đầu (7.1.1) trong 24 h (cid:0)  2 h ở 37 oC. Nếu bị đen hoặc có kết tủa đen thì cấy truyền như trong 7.1.3. Nếu không hiện màu đen thì ủ tiếp 24 h (cid:0)  2 h và cấy truyền như trong 7.1.3 (kể cả xuất hiện hoặc không xuất hiện màu đen hoặc kết tủa đen).

7.1.3 Cấy truyền từ các ống tăng sinh

Bằng cách vô trùng, tháo bỏ lớp thạch hoặc paraffin phía trên, sử dụng dao vô trùng (4.8) để cắt thành bốn phần theo chiều dọc. Nếu cần, chèn dao vào sát thành theo đường cong của ống thuỷ tinh để tách lớp phủ này. Lắc mạnh ống để lớp phủ vỡ thành mảnh nhỏ rơi xuống đáy ống và đảm bảo còn nguyên huyền phù dịch cấy.

Dùng que cấy vòng vô trùng (4.4), lấy một vòng đầy từng môi trường chọn lọc dàn lên bề mặt các đĩa thạch Baird Parker (3.4) riêng biệt hoặc các đĩa thạch fibrinogen huyết tương thỏ (3.5) để thu được các khuẩn lạc phân lập.

2

Lật ngược các đĩa đã chuẩn bị và đặt chúng vào tủ ấm (4.1) để ở 37 oC trong 24 h (cid:0) h và 48 h (cid:0) 2 h.

7.2 Phương pháp định lượng

7.2.1 Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu

Xem các phần thích hợp của TCVN 6507 (ISO 6887) tuỳ thuộc vào sản phẩm có liên quan hoặc TCVN 6263 (ISO 8261).

7.2.2 Cấy

Lấy ba ống môi trường nồng độ kép, đã đuổi khí và đã bổ sung kali telurit (3.2.3). Chuyển vào mỗi ống 10 ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 10 ml dung dịch pha loãng ban đầu (tức là 1 g mẫu) của các sản phẩm dạng khác.

Lấy ba ống môi trường nồng độ đơn, đã đuổi khí và bổ sung kali telurit (3.2.3). Chuyển vào mỗi ống 1 ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 1 ml dung dịch pha loãng ban đầu (tức là 0,1 g mẫu) của các sản phẩm dạng khác.

Đối với mỗi độ pha loãng tiếp theo (tức là 10 -1, 10-2 và 10-3 đối với sản phẩm dạng lỏng hoặc 10-2, 10-3 hoặc 10-4 đối với các sản phẩm dạng khác), tiến hành như mô tả ở trên, sử dụng pipet vô trùng mới cho mỗi độ pha loãng.

Chuẩn bị đủ một số lượng các dung dịch pha loãng để đảm bảo rằng độ pha loãng cuối cùng đủ để cho ba kết quả âm tính.

Trộn cẩn thận chất cấy và môi trường, trong mỗi trường hợp tránh để lẫn không khí vào.

Cẩn thận rót một lớp thạch (5.3), đã được làm nguội đến nhiệt độ từ 44 oC đến 47 oC lên trên môi trường trong mỗi ống đã cấy và để cho đặc lại tạo thành lớp hàn kín.

7.2.3. Ủ

Ủ (xem 6.1) các ống nghiệm đựng môi trường nồng độ kép và môi trường nồng độ đơn (7.2.2) đã cấy, ở 37 oC trong 24 h (cid:0)  2 h. Cấy truyền các ống nghiệm cho thấy bị đen hoặc có kết tủa đen như đã chỉ ra trong 9.5.

Ủ tiếp các ống còn lại trong 24 h ± 2 h và cấy truyền tất cả các ống như trong 7.1.3 (kể cả các ống có kết tủa đen hoặc không có kết tủa đen sau 48 h ± 2 h).

7.3 Chọn đĩa vả giải thích kết quả

7.2.4. Cấy truyền

7.3.1 Môi trường thạch Baird-Parker

7.3.1.1 Chọn các khuẩn lạc

Sau khi ủ các đĩa (7.1.3 hoặc 7.2.4) 24 h, đánh dấu vào đáy các đĩa các vị trí của bất kỳ khuẩn lạc điển hình nào có mặt.

CHÚ THÍCH 1: Các khuẩn lạc điển hình có màu đen hoặc màu xám, bóng và lồi (đường kính từ 1 mm đến 1,5 mm sau khi ủ trong 24 h, và có đường kính từ 1,5 mm đến 2,5 mm sau khi ủ 48 h) và được bao quanh bằng một vùng trong rõ rệt, cũng có thể là mờ từng phần. Sau khi ủ trong ít nhất 24 h, có thể xuất hiện một vòng màu trắng đục tiếp giáp với khuẩn lạc .

CHÚ THÍCH 2: Các khuẩn lạc không điển hình cùng kích cỡ như khuẩn lạc điển hình và có thể có một trong các hình thái sau.

a) Các khuẩn lạc đen bóng có hoặc không có rìa trắng hẹp; không có vùng trong hoặc hầu như không nhìn thấy và không có vòng trắng đục hoặc rất khó nhìn thấy.

b) Các khuẩn lạc màu xám không có vùng trong.

Các khuẩn lạc không điển hình được hình thành chủ yếu do các chủng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase nhiễm vào sản phẩm, ví dụ: các sản phẩm sữa, tôm và các bộ phận của vật nuôi. Chúng thường ít khi được hình thành do các chủng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase bị nhiễm trong các sản phẩm khác.

CHÚ THÍCH 3: Các khuẩn lạc khác là tất cả các khuẩn lạc còn lại có khả năng có mặt trên các đĩa mà không cho thấy biểu hiện bên ngoài điển hình hoặc không điển hình như đã mô tả trong Chú thích 1 và Chú thích 2, và được coi là hệ vi khuẩn nền.

Ủ lại (xem 4.1) tất cả các đĩa ở 37 oC thêm 24 h + 2 h và đánh dấu bất kỳ khuẩn lạc điển hình nào mới. Đồng thời cũng đánh dấu bất kỳ khuẩn lạc không điển hình nào có mặt.

7.3.1.2 Khẳng định

Từ bề mặt của mỗi khuẩn lạc đã chọn (7.3.1.1), dùng kim cấy vô trùng lấy một phần và chuyển vào ống hoặc lọ đựng môi trường canh thang não-tim (3.6).

Ủ (xem 4.1) ở 37 oC trong 24 h ± 2 h.

Bằng kỹ thuật vô trùng, lấy 0,1 ml chủng cấy cho vào 0,3 ml huyết tương thỏ (3.7) (trừ khi nhà sản xuất qui định các lượng khác) đựng trong các ống vô trùng có kích thước thích hợp (ví dụ 10 mm x 75 mm)

Nghiêng ống, kiểm tra sự kết dính của huyết tương sau khi ủ từ 4 h đến 6 h, và nếu phép thử là âm tính thì kiểm tra lại sau khi ủ 24 h (cid:0)  h, hoặc kiểm tra theo thời gian ủ được nhà sản xuất qui định.

Các phép thử coagulase được coi là dương tính nếu các chủng cấy sinh ra tại ít nhất các phản ứng coagulase 3 + theo hướng dẫn đánh dấu (kẻ vạch) trong Hình 1. Các phản ứng từ 1+ đến 2+ được coi là trung gian.

Về kiểm tra âm tính, đối với mỗi mẻ huyết tương, thêm 0,1 ml môi trường canh thang não-tim vô trùng (3.6) vào một lượng huyết tương thỏ (3.7) đã được khuyến cáo và ủ nhưng không cấy. Việc kiểm tra huyết tương không có dấu hiệu nào của sự kết dính thì phép thử là hợp lệ.

Đánh dấu dương tính mỗi ống có ít nhất một khuẩn lạc được khẳng định là dương tính với coagulase.

- âm tính: không có bằng chứng hình thành

fibrrin. 1 + dương tính: kết dính nhỏ không có tổ

chức

2 + dương tính: kết dính nhỏ có tổ chức

3 + dương tính: kết dính nhiều có tổ chức

4 + dương tính: toàn bộ kết dính và không dịch chuyển khi ống bị lật ngược

Hình 1 - Đánh dấu các phản ứng thử nghiệm với coagulase

7.3.2 Môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ

Sau khi ủ 24 h ± 2 h, và ủ tiếp 24 h nếu cần, Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase hình thành các khuẩn lạc nhỏ màu đen hoặc màu xám (hoặc thậm chí màu trắng) được bao quanh bởi vòng sáng kết tủa dấu hiệu cho hoạt tính coagulase. Khi bắt đầu ủ, các khuẩn lạc Proteus, có thể cho thấy vẻ bên ngoài giống với các khuẩn lạc Staphylococci có phản úng dương tính với coagulase. Tuy nhiên sau khi ủ 24 h hoặc 48 h chúng có thể phát triển thành khuẩn lạc mọc rộng có màu nâu đậm hoặc nâu nhạt do đó có thể phân biệt được với vi khuẩn Staphylococci.

Phép thử là dương tính khi có mặt ít nhất một khuẩn lạc chỉ thị hoạt tính coagulase được thấy

CHÚ THÍCH: Vi thạch fibrinogen huyết tương thỏ được dựa trên phản ứng coagulase, nên không cần thiết phải khẳng định hoạt tính này.

8) Biểu thị kết quả

8.1 Phương pháp phát hiện

Theo giải thích các kết quả, ghi lại sự có mặt hoặc không có mặt Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong phần mẫu thử, theo khối lượng tính bằng gam hoặc theo thể tích tính bằng mililit của mẫu thử.

8.2 Phương pháp định lượng

8.2.1 Chọn các độ pha loãng

CHÚ THÍCH: Huyền phù ban đầu và mẫu thử, nếu ở dạng lỏng được coi là dung dịch pha loãng.

Đối với mỗi độ pha loãng đã được cấy vào môi trường cấy lỏng chọn lọc (7.1.2 và 7.2.2), ghi lại số lượng ống nghiệm cho thấy có mặt Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đã được khẳng định bằng phép thử thạch Baird-Parker (9.3.1) hoặc sự có mặt các khuẩn lạc với các phản ứng dương tính với coagulase trên môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ (7.3.2). Chỉ rõ đó là các ống dương tính.

Chọn ba độ pha loãng liên tiếp theo 9.4 của TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996) và xác định chỉ số có xác suất lớn nhất (MPN) [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]

8.2.2 Tính toán

Xem 9.4 của TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996).

9) Độ chụm

Như đã biết, các sai lệch lớn trong các kết quả có thể xảy ra với kỹ thuật MPN. Các giới hạn tin cậy qui định được dựa hoàn toàn trên sự phân bố ngẫu nhiên các kết quả. Các nguyên nhân gây ra sai lệch khác đôi khi có thể rất quan trọng, nhưng không đề cập trong kỹ thuật MPN. Để tính đến các ảnh hưởng này, sử dụng các phạm trù trong bảng B.2 của TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996). Chúng tổng kết các tổ hợp ống theo khả năng xuất hiện của chúng.

CHÚ THÍCH: Môt nghiên cứu cộng tác quốc tế trên các mẫu sữa khô cho thấy, sử dụng kỹ thuật MPN giống như mô tả trong tiêu chuẩn này, thì trong 75 % các trường hợp chênh lệch giữa các kết quả của hai phép thử độc lập nhỏ hơn 1,25 lần so với trung bình cộng của hai kết quả. Chênh lệch lớn nhất quan sát được giữa các kết quả của hai phép thử độc lập là 1.94 lần so với trung bình cộng của hai kết quả.

10) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

a) Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử,

b) Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) Phương pháp thử nghiệm đã dùng (phương pháp phát hiện hoặc phương pháp định lượng; môi trường đã sử dụng), viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) Mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tuỳ ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thu được, chỉ rõ phương pháp biểu thị đã sử dụng.

2.3.4 Phát hiện và định lượng Coliform bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn

nhất (dựa theo TCVN 4882:2007)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các hướng dẫn chung để phát hiện và định lượng Coliform.

Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:

- các sản phẩm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, và

- các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm.

Việc định lượng được thực hiện bằng cách tính số có xác suất lớn nhất (MPN) sau khi ủ trong môi trường lỏng ở 30 oC hoặc 37 oC.

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ này cần được thỏa thuận giữa các bên có liên quan. Trong trường hợp đối với sữa và sản phẩm sữa, thì nhiệt độ ủ là 30 oC.

Phương pháp định lượng này có thể sử dụng khi số lượng khuẩn lạc cần tìm dự kiến từ 1 đến 100 trên mililit hoặc trên gam mẫu thử.

Điểm hạn chế khi áp dụng của tiêu chuẩn này là kết quả có độ dao động lớn. Thông tin trong điều 11 đưa ra hướng dẫn về khả năng áp dụng của phương pháp và về việc diễn giải kết quả.

2) Nguyên tắc

2.1 Phát hiện Coliform

2.1.1 Cấy phần mẫu thử vào ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc và ủ 24 h hoặc 48 h ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận).

2.1.2 Khi ống thu được trong 2.1.1 cho thấy có màu đục và/hoặc sinh khí thì cấy tiếp vào ống đựng môi trường khẳng định và ủ ở 30 oC hoặc 37 oC trong 24 h hoặc 48 h (theo thỏa thuận).

2.1.3 Sau khi kiểm tra ống thu được trong 2.1.2 mà cho thấy đục và hình thành khí thì khẳng định sự có mặt của Coliform

2.2 Đếm bằng kỹ thuật MPN

2.2.1 Cấy vào bộ ba ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng nồng độ kép một lượng mẫu thử xác định nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng hoặc với một lượng huyền phù ban đầu xác định nếu các sản phẩm ở dạng khác.

2.2.2 Cấy vào bộ ba ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng nồng độ đơn một lượng mẫu thử xác định nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng hoặc với một lượng huyền phù ban đầu xác định nếu các sản phẩm ở dạng khác. Sau đó, trong cùng điều kiện, cấy các ống tiếp theo chứa môi trường với các dịch pha loãng thập phân của phần mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.

2.2.3 Ủ ấm ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) các ống chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép trong 24 h và các ống chứa môi trường nồng độ đơn 24 h hoặc 48 h và sau đó kiểm tra sự sinh khí hoặc sự mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí trong các ống này.

2.2.4 Từ các ống chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép và các ống chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn có sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc sinh khí, các dịch cấy để cấy vào một loạt các ống chứa môi trường khẳng định.

2.2.5 Ủ ấm các ống trong 4.2.4 ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h hoặc 48 h, và sau đó kiểm tra các loạt ống này về sự sinh khí.

2.2.6 Tính số có xác suất lớn nhất của Coliform có trong 1 mililit hoặc trong 1 gam mẫu (tức là số MPN) từ số ống có sinh khí trong loạt ống thử mới (2.2.5). Dùng bảng để xác định số có xác suất lớn nhất.

3) Môi trường nuôi cấy và dung dịch pha loãng

3.1 Khái quát

Xem TCVN 6404 (ISO 7218), ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2 về cách chuẩn bị, pha chế và tính năng thử nghiệm của môi trường.

3.2 Dịch pha loãng

Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm nghiệm.

3.3 Môi trường tăng sinh chọn lọc: Canh thang tryptoza lauryl sulfat

3.3.1 Thành phần

a) Môi trường nồng độ kép 40 g b) Môi trường nồng độ đơn 20 g

12

22

11

Dịch thủy phân protein sữa và protein động vật bằng enzym Lactoza (C .H O H 10 g 5 g O) 2

4

Dikali hydro phosphat (K ) 5,5 g 2,75 g HPO 2

2

4

Kali dihydro phosphat (KH PO ) 5,5 g 2,75 g

Natri clorua 10 g 5 g

Natri lauryl sulfat 0,2 g 0,1 g

Nước 1 000 ml 1 000 ml

3.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần khác nhau hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 oC, nếu cần.

Phân phối từng lượng môi trường 10 ml vào các ống có kích thước 16 mm x 160 mm (4.4) chứa ống Durham (4.5) đối với môi trường nồng độ đơn, và vào các ống nghiệm có kích thước 20 mm x 200 mm (6,4) [không chứa các ống Durham (4.5)] đối với môi trường nồng độ kép.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 oC. Các ống Durham không được chứa các bọt khí sau khi khử trùng.

3.3.3 Kiểm tra tính năng về đảm bảo chất lượng môi trường cấy

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Kiểm tra tính năng đối với canh thang tryptoza lauryl sulfat theo ISO/TS 11133-2 : 2003, Bảng B.1.

3.4 Môi trường khẳng định: Canh thang mật lactoza lục sáng (lactose bile brilliant green broth)

3.4.1 Thành phần

10 g

12

22

11

Dịch thủy phân casein bằng enzym Lactoza (C .H O H 10 g O) 2

Mật bò khô 20 g

Lục sáng 0,0133 g

Nước 1 000 ml

3.4.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng nhẹ, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 oC, nếu cần.

Phân phối từng lượng môi trường 10 ml vào các ống có kích thước 16 mm x 160 mm (4.4) có ống Durham (4.5).

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 oC. Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi khử trùng.

3.4.3 Kiểm tra tính năng về đảm bảo chất lượng môi trường cấy

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Kiểm tra tính năng đối với canh thang mật lactoza lục sáng theo Bảng B.1 của ISO/TS 11133-2 : 2003.

4) Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm vi sinh [TCVN 6263 (ISO 8261)] và cụ thể như sau:

4.1 Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

4.2 Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 30 oC ± 1 oC hoặc 37 oC ± 1 oC.

4.3 Vòng que cấy, bằng platin/iridi hoặc niken/crom có đường kính khoảng 3 mm hoặc vòng que cấy sử dụng một lần.

4.4 Các ống nghiệm, có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm và 20 mm x 200 mm.

4.5 Ống Durham, phù hợp để dùng với các ống nghiệm có kích thước 16 mm x 160 mm (4.4).

4.6 Pipet xả hết, có dung tích danh định 1 ml và 10 ml.

4.7 Máy đo pH, chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 oC.

5) Lấy mẫu

Lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm liên quan. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau vấn đề này.

6) Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau vấn đề này.

7) Cách tiến hành

7.1 Phương pháp phát hiện

7.1.1 Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu

Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm liên quan.

7.1.2 Cấy và ủ

7.1.2.1 Tùy thuộc vào giới hạn phát hiện yêu cầu, mà lấy x ml mẫu thử dạng lỏng hoặc x ml huyền phù ban đầu nếu mẫu thử ở dạng khác, chuyển vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép khi 1 ml < x < 10 ml, hoặc vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn [5.3.1 b)] khi x ≤ 1 ml.

7.1.2.2 Để ống môi trường nồng độ kép (7.1.2.1) trong tủ ấm (4.2) ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h.

7.1.2.3 Để ống môi trường nồng độ đơn (7.1.2.1) trong tủ ấm (4.2) ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h hoặc nếu ở giai đoạn này mà không thấy có sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí thì ủ tiếp 24 h ± 2 h.

7.1.3 Phép thử khẳng định

7.1.3.1 Dùng vòng que cấy (4.3) lấy cấy dịch thu được trong 7.1.2.2 cấy vào ống môi trường thử khẳng định (3.4). Đặt vào tủ ấm (4.2) ở nhiệt độ 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h, nếu không sinh khí ở giai đoạn này thì ủ trong 48 h ± 2 h.

7.1.3.2 Tiến hành theo cùng một trình tự như trong 7.1.3.1 đối với các ống đã được ủ ấm trong 7.1.2.3 có biểu hiện sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí, khi quan sát thấy một trong các biểu hiện đó (tức là sau 24 h ± 2 h hoặc sau 48 h ± 2 h).

7.1.4 Diễn giải kết quả

Ống nghiệm thu được trong 7.1.3.1 hoặc 7.1.3.2 cho thấy sinh khí sau 24 h ± 2 h và 48 h ± 2 h được coi là dương tính.

7.2 Phương pháp định lượng (MPN)

7.2.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm liên quan.

Chuẩn bị một số độ pha loãng đủ để đảm bảo rằng các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính.

7.2.2 Cấy và ủ

7.2.2.1 Thông thường lấy một tổ hợp ba ống đối với mỗi độ pha loãng. Tuy nhiên, đối với một số sản phẩm và/hoặc các kết quả yêu cầu có độ chính xác lớn hơn, mà có thể cần thiết phải cấy một loạt nhiều hơn ba ống (ví dụ: năm ống). Đối với các trường hợp này, để tính MPN xem các bảng liên quan trong TCVN 6404 (ISO 7218).

7.2.2.2 Lấy ba ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép. Dùng pipet vô trùng (4.6) chuyển 10 ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 10 ml huyền phù ban đầu, nếu là các sản phẩm ở dạng khác vào từng ống trên.

7.2.2.3 Lấy ba ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn. Dùng pipet vô trùng (4.6) chuyển 1 ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu, nếu là các sản phẩm ở dạng khác vào từng ống nghiệm nói trên.

7.2.2.4 Đối với mỗi độ pha loãng tiếp theo, tiếp tục như mô tả trong 7.2.2.3. Sử dụng mỗi pipet vô trùng cho mỗi độ pha loãng. Trộn kỹ dịch cấy với môi trường.

7.2.2.5 Để ống môi trường nồng độ kép (7.2.2.2) trong tủ ấm (6.2) ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h.

7.2.2.6 Để ống môi trường nồng độ đơn (7.2.2.3 và 9.2.2.4) trong tủ ấm (4.2) ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h, hoặc nếu ở giai đoạn này mà không thấy sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí thì ủ tiếp 24 h ± 2 h.

7.2.3 Phép thử khẳng định

7.2.3.1 Dùng que cấy vòng (4.3) cấy dịch cấy thu được trong 7.2.2.5 vào ống môi trường thử khẳng định (3.4). Đặt vào tủ ấm (4.2) ở nhiệt độ 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h, nếu không sinh khí ở giai đoạn này thì ủ tiếp 24 h ± 2 h.

7.2.3.2 Tiến hành theo cùng một trình tự như trong 7.2.3.1 đối với các ống đã được ủ ấm từ 7.2.2.6 có biểu hiện sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí, khi quan sát lần thứ nhất (tức là sau 24 h ± 2 h hoặc sau 48 h ± 2 h).

7.2.4 Diễn giải kết quả

Đối với mỗi độ pha loãng, đếm tổng số các ống quan sát thấy có sinh khí trong 7.2.3 (các ống dương tính) sau 24 h ± 2 h và sau 48 h ± 2 h (nếu có).

8) Tính và biểu thị kết quả

Theo các kết quả diễn giải (xem 7.1.4), chỉ rõ sự có mặt hay không có mặt Coliform trong phần mẫu thử x g hoặc x ml của sản phẩm [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính đối với mỗi độ pha loãng. Xem [TCVN 6404 (ISO 7218)].

9) Độ chụm

Với kỹ thuật MPN có thể cho kết quả với dao động lớn, do đó hết sức thận trọng khi sử dụng kết quả thu được bằng phương pháp này.

Giới hạn tin cậy được nêu trong TCVN 6404 (ISO 7218).

10) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mục đích của phép thử và nhiệt độ ủ đã sử dụng;

- tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

- các kết quả thử nghiệm thu được.

2.3.5 Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch với kỹ thuật đếm

khuẩn lạc ở 300C (dựa theo TCVN 4884:2005)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch bằng cách đếm khuẩn lạc phát triển trong môi trường đặc sau khi ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30 °C. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho các sản phẩm dùng cho người hoặc thức ăn chăn nuôi.

Khả năng áp dụng của tiêu chuẩn này bị hạn chế khi kiểm tra các thực phẩm và thức ăn chăn nuôi đã lên men. Để kiểm tra các thực phẩm và thức ăn chăn nuôi đã lên men thì các môi trường và/hoặc các điều kiện ủ khác có thể thích hợp hơn.

2) Nguyên tắc

2.1. Chuẩn bị hai đĩa rót sử dụng môi trường cấy qui định và một lượng mẫu thử qui định, nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc dùng một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác.

Chuẩn bị các cặp đĩa rót khác, trong cùng một điều kiện, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.

2.2. Ủ trong điều kiện hiếu khí các đĩa ở 30 °C trong 72 h .

2.3. Tính số lượng vi sinh vật trong một mililit hoặc trong một gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc thu được trên các đĩa đã chọn.

3) Môi trường cấy và dịch pha loãng

Đối với thực hành trong phòng thử nghiệm, xem TCVN 6404 (ISO 7218) và ISO/TS 11133-1.

3.1. Dịch pha loãng

Xem các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887).

3.2. Môi trường thạch để đếm đĩa (PCA)

3.2.1. Thành phần

Pepton từ casein 5,0 g

Cao nấm men 2,5 g

1,0 g

Glucoza, dạng khan (C ) O H 6 6 12 Thạch3) 9 g đến 18 g

3) Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

Nước 1 000 ml

Khi kiểm tra các sản phẩm sữa, cho 1,0 g bột sữa gầy vào một lít môi trường cấy. Bột sữa gầy không được chứa các chất gây ức chế.

3.2.2. Chuẩn bị

3.2.2.1. Chuẩn bị từ môi trường hoàn chỉnh khô loại thương mại

Theo chỉ dẫn của nhà sản xuất và thêm bột sữa gầy (xem 3.2.1), nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

3.2.2.2. Chuẩn bị từ các thành phần cơ bản khô

Hòa tan các thành phần trong nước, theo thứ tự sau: cao nấm men, pepton từ casein, glucoza và bột sữa gầy, nếu cần. Đun nóng nước để hoà tan nhanh hơn.

Thêm thạch và đun đến sôi, thỉnh thoảng khuấy cho đến khi tan hết thạch .

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

3.2.2.3. Phân phối, khử trùng và bảo quản

Phân phối môi trường vào các ống nghiệm (4.8), với các lượng từ 12 ml đến 15 ml vào mỗi ống hoặc bình hoặc chai (4.8) có dung tích không quá 500 ml.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C.

Nếu môi trường được sử dụng ngay thì làm nguội trong nồi cách thủy (4.5) đến nhiệt độ từ 44 °C đến 47 oC trước khi sử dụng. Nếu không dùng ngay thì bảo quản nơi tối ở nhiệt độ 3 oC (cid:0)  2 oC không quá 3 tháng dưới các điều kiện không làm thay đổi thành phần và đặc tính của nó.

Ngay trước khi kiểm tra vi sinh vật, để tránh chậm trễ khi rót môi trường, nên làm tan chảy hoàn toàn môi trường để nguội trong nồi cách thủy (4.5) đến nhiệt độ từ 44 oC đến 47 °C trước khi sử dụng.

Để kiểm tra nhiệt độ của thạch, nên đặt một nhiệt kế vào một dung dịch kiểm soát thạch 15 g /I đựng trong vật chứa riêng biệt giống hệt như được sử dụng cho môi trường. Nhiệt độ dung dịch kiểm soát cũng cần qua các bước đun nóng và làm nguội giống như đối với môi trường.

3.2.3. Kiểm tra tính năng của môi trường cấy về sự đảm bảo chất lượng

Để kiểm tra tính năng của môi trường, xem ISO/TS 11133-1.

3.3. Môi trường phủ

3.3.1. Thành phần

Thạch 4) 12 g đến 18 g

4) Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

Nước 1 000 ml

3.2. Chuẩn bị

Cho thạch vào nước và đun đến sôi, thường xuyên khuấy cho đến khi tan hết thạch, hoặc dùng hơi nước trong khoảng 30 phút.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

3.3.3. Phân phối, khử trùng và bảo quản

Phân phối vào các ống nghiệm (4.8) hoặc bình hoặc chai (4.8) có dung tích thích hợp, mỗi ống 4 ml.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C.

Nếu môi trường được sử dụng ngay thì làm nguội trong nồi cách thủy (4.5) đến nhiệt độ từ 44 oC đến 47oC trước khi sử dụng. Nếu không dùng ngay, thì bảo quản nơi tối ở nhiệt độ 3 °C (cid:0)  2 °C không quá 6 tháng dưới các điều kiện không làm thay đổi thành phần và đặc tính của nó.

Ngay trước khi kiểm tra vi sinh vật, để tránh chậm trễ khi rót môi trường, nên làm tan chảy hoàn toàn môi trường rồi để nguội trong nồi cách thủy (4.5) đến nhiệt độ từ 44 °C đến 47 °C trước khi sử dụng

4) Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ thủy tinh sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp.

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể là:

4.1. Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

4.2. Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 30 °C ± 1 °C.

4.3. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

4.4. Pipet, có dung tích danh định 1 ml.

4.5. Nồi cách thủy, có thể hoạt động ở 44 °C đến 47 °C.

4.6. Thiết bị đếm khuẩn lạc, ví dụ: có thể sử dụng bộ chiếu sáng với phông tối, được gắn với kính lúp có độ phóng đại thích hợp khoảng 1,5 x và bộ đếm cơ học hoặc điện tử số.

4.7. pH mét, có độ chính xác ± 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.

4.8. Ống nghiệm, bình hoặc chai có dung tích thích hợp và không lớn hơn 500 ml.

5) Lấy mẫu

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng thì các bên liên quan tự thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

6) Chuẩn bị mẫu thử

Việc chuẩn bị mẫu thử theo các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) hoặc TCVN 6263 (ISO 8261) và tiêu chuẩn riêng tương ứng với sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng thì các bên liên quan tự thoả thuận với nhau về vấn đề này.

7) Cách tiến hành

7.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Xem các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) và tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm.

7.2. Cấy và ủ

7.2.1. Lấy hai đĩa Petri vô trùng (4.3). Dùng pipet vô trùng (4.4) cho vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử nếu sản phẩm là chất lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác (độ pha loãng 10-1).

7.2.2. Lấy hai đĩa Petri vô trùng (4.3) khác. Dùng pipet vô trùng (4.4) cho vào mỗi đĩa 1 ml dịch pha loãng 10-1 (nếu sản phẩm là chất lỏng) hoặc 1 ml dung dịch pha loãng 10 -2 (nếu các sản phẩm ở dạng khác).

7.2.3. Lặp lại trình tự này với các dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet mới vô trùng đối với mỗi dung dịch pha loãng thập phân, nếu cần.

7.2.4. Nếu thích hợp và nếu có thể, chỉ chọn các bước pha loãng tới hạn (ít nhất hai dung dịch pha loãng thập phân liên tiếp) để cấy các đĩa Petri sao cho thu được số đếm từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên mỗi đĩa petri.

7.2.5. Rót vào mỗi đĩa Petri khoảng từ 12 ml đến 15 ml môi trường thạch đếm đĩa (3.2) ở 44 °C đến 47 °C. Thời gian từ khi chuẩn bị xong huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha loãng 10-1 nếu sản phẩm là chất lỏng) đến khi rót môi trường (3.2) vào các đĩa không được vượt quá 45 phút.

7.2.6. Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa Petri và để cho hỗn hợp đông đặc lại bằng cách đặt các đĩa Petri trên bề mặt nằm ngang, mát.

7.2.7. Sau khi đông đặc hoàn toàn và chỉ khi nào nghi ngờ sản phẩm cần kiểm tra có chứa các vi sinh vật mà khuẩn lạc của chúng có thể mọc lan trên khắp bề mặt của môi trường, thì rót khoảng 4 ml môi trường phủ (3.3) ở 44 °C đến 47 °C lên bề mặt môi trường đã cấy mẫu. Để cho đông đặc như mô tả ở trên.

7.2.8. Lật ngược các đĩa đã cấy mẫu và đặt vào tủ ấm (6.2) ở 30 °C (cid:0)

(cid:0) 1 °C trong 72 h  3 h. Không xếp chồng cao quá sáu đĩa. Các chồng đĩa cần được tách khỏi nhau và

cách xa thành và nóc tủ.

7.3. Đếm khuẩn lạc

7.3.1. Sau giai đoạn ủ qui định (7.2.8), đếm các khuẩn lạc trên các đĩa (8.1) sử dụng dụng cụ đếm khuẩn lạc (4.6), nếu cần. Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu. Điều quan trọng là các khuẩn lạc chính phải được đếm và tránh đếm nhầm với các hạt không hòa tan hoặc chất kết tủa trên đĩa. Kiểm tra cẩn thận các khuẩn lạc nghi ngờ, khi cần nên dùng kính lúp có độ khuyếch đại lớn hơn để phân biệt các khuẩn lạc với tạp chất lạ.

7.3.2. Các khuẩn lạc mọc lan rộng được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu ít hợp một phần tư đĩa mọc dày lan rộng, thì đếm các khuẩn lạc trên phần đĩa còn lại và tính số tương ứng cho cả đĩa. Nếu quá một phần tư đĩa bị mọc dầy lan rộng thì loại bỏ đĩa và không đếm.

8) Biểu thị kết quả

8.1. Phương pháp tính

Xem phần sửa đổi 1 của ISO 7218 : 1996.

8.2. Độ chụm

8.2.1. Yêu cầu chung

Các dữ liệu về độ chụm đã được đánh giá đối với các đĩa chứa nhiều hơn 15 khuẩn lạc và ít hơn 300 khuẩn lạc. Dữ liệu về độ chụm phụ thuộc vào sự liên kết hệ vi sinh vật và các chất nền của mẫu. Các dữ liệu này thu được từ các nghiên cứu cộng tác và có giá trị đối với sữa nguyên liệu và sữa thanh trùng. Chúng có thể được dùng làm các số ước tính khi cần xác định số khuẩn lạc có trong sản phẩm khác.

8.2.2. Độ lặp lại

10

Chệnh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng, phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời của các vi sinh vật có trong một lít (tương ứng với 1,8 trên gian ngắn, tính theo log

thang danh định số vi sinh vật trong một lít) không được lớn hơn giới hạn lặp lại r = 0,25.

CHÚ THÍCH: Giới hạn lặp lại này thu được từ các nghiên cứu cộng tác trên sữa nguyên liệu và sữa tiệt trùng và có thể được sử dụng cho các sản phẩm như thế.

8.2.3. Độ tái lập

10

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, tính theo của các vi sinh vật có trong một lít (tương ứng với 2,8 trên thang danh định số vi log

sinh vật trong một lít) không được lớn hơn giới hạn tái lập R = 0,45 .

CHÚ THÍCH. Giới hạn tái lập này thu được từ các nghiên cứu cộng tác trên sữa nguyên liệu và sữa tiệt trùng và có thể được sử dụng cho các sản phẩm như thế.

8.3. Giải thích các kết quả thử nghiệm

Trong các ví dụ dưới đây. đã xem xét đến số liệu về độ chụm trung bình, mức xác suất là 95 % và phân tích một mẫu. Trong thực tế thì thường sử dụng trung bình của vài mẫu. Các con số được tính bằng số vi sinh vật trong một lít.

a) Các điều kiện lặp lại

Kết quả thứ nhất: 105 = 100 000

10

Chênh lệch giữa kết quả thứ nhất và kết quả thứ hai không được lớn hơn 0,25 log

các đơn vị.

Kết quả thứ hai: log 104,75 = 56 000 hoặc

log 105,25 = 178 000

Chênh lệch giữa kết quả thứ nhất và thứ hai có thể được chấp nhận nếu kết quả thứ hai không thấp hơn 56 000 hoặc không cao hơn 178 000.

b) Các điều kiện tái lập

Các kết quả thu được trong phòng thử nghiệm thứ nhất (trung bình của phép xác định kép): 105 = 100 000.

10

Chênh lệch giữa kết quả thứ nhất và thứ hai thu được trong phòng thử nghiệm thứ hai không được lớn hơn 0,45 log của các đơn vị:

Các kết quả thứ hai: log 104,55 = 36 000 hoặc

log 105,45 = 280 000

Chênh lệch giữa các kết quả thu được bởi phòng thử nghiệm thứ nhất và thứ hai có thể chấp nhận được nếu phòng thử nghiệm thứ hai thu được kết quả không thấp hơn 36 000 và không cao hơn 280 000.

Phụ lục A cho thấy cách tính và cách sử dụng sai lệch tới hạn (CD) để giải thích các kết quả.

8.4. Giới hạn tin cậy

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

9) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả:

e) kết quả thử nghiệm thu được.

2.3.6 Định lượng Clostridium perfringens trên đĩa thạch bằng kỹ thuật đếm

khuẩn lạc (dựa theo TCVN 4991:2005)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Clostridium perfringens có khả

năng mọc trên đĩa thạch. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:

- các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn cho động vật, và

- các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.

2) Nguyên tắc

2.1. Các đĩa Petri được cấy một lượng mẫu thử qui định, nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác.

Đối với các đĩa Petri khác, trong cùng một điều kiện, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.

Rót môi trường chọn lọc (kỹ thuật rót đĩa) và sau đó phủ lên trên bằng chính môi trường này.

2.2. Ủ trong điều kiện kỵ khí các đĩa ở 37 °C trong 20 h ± 2 h.

2.3. Định lượng các khuẩn lạc điển hình.

2.4. Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình và tính số lượng C.perfringens có trong một gam hoặc một mililit mẫu.

3) Dịch pha loãng, môi trường cấy và thuốc thử

Xem TCVN 6404 (ISO 7218), ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2 để chuẩn bị và kiểm tra tính năng môi trường cấy.

3.1. Dịch pha loãng

Xem phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) hoặc TCVN 6263 (ISO 8261).

3.2. Môi trường thạch sunfit xycloserin (SC)

CHÚ THÍCH: Loại thạch này được chỉ rõ từ đầu “TSC không chứa lòng đỏ trứng”.

3.2.1. Môi trường cơ bản

3.2.1.1. Thành phần

Pepton từ protein 15,0 g

Pepton từ đậu tương 5,0 g

Cao nấm men 5,0 g

2

Dinatri disunfit (Na S 1,0 g O 2 ), dạng khan 5

Amoni sắt (III) xitrat a 1,0 g

9,0 g đến 18,0 g b Thạch

a Thuốc thử này phải chứa ít nhất 15 % (phần khối lượng) sắt.

b Tuỳ thuộc vào sức đông của thạch.

Nước 1 000 ml

3.2.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,6 ± 0,2 ở 25 °C. Phân phối môi trường cơ bản vào các bình hoặc chai có

dung tích thích hợp. Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C. Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C. Môi trường chỉ được sử dụng trong vòng 2 tuần sau khi chuẩn bị.

Trong một số trường hợp (xem 9.4.3.1), có thể cần phải chuẩn bị các đĩa môi trường cơ bản thạch SC để khẳng định với môi trường nitrat để thử tính di động (5.5) và môi trường lactoza-gelatin (5.8). Đối với mục đích này, chuyển các phần khoảng 15 ml môi trường cơ bản (đã được làm tan chảy và được làm nguội đến khoảng 44 °C đến 47 °C trong nồi cách thủy (6.10)] sang các đĩa Petri và để cho đông đặc lại. Làm khô đĩa (xem TCVN 6404 (ISO 7218) ngay trước khi sử dụng.

3.2.2. Dung dịch D-Xycloserin

3.2.2.1. Thành phần

D-Xycloserin a 4,0 g

a Chỉ sử dụng bột tinh thể trắng.

Nước 100 ml

3.2.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan D-xycloserin trong nước và lọc dung dịch để khử trùng.

Bảo quản trong tủ lạnh ở 3 °C ± 2 °C.

Môi trường chỉ được sử dụng trong vòng 4 tuần sau khi chuẩn bị.

3.2.3. Môi trường hoàn chỉnh

Ngay trước khi sử dụng trong phương pháp rót đĩa (xem 9.2), cứ 100 ml môi trường cơ bản tan chảy vô trùng (5.2.1) đã được làm nguội đến 44 °C đến 47 °C thì thêm 1 ml dung dịch D-xycloserin (5.2.2).

3.2.4. Thử tính năng để đảm bảo chất lượng môi trường SC

Để xác định tính chọn lọc và năng suất, xem ISO/TS 11133-1. Để kiểm tra tính năng, xem ISO/TS 11133-2 : 2003, Bảng B.1 [xem TS(C)].

3.3. Môi trường thioglycolat lỏng

3.3.1. Thành phần

Pepton từ casein 15,0 g

L-Xystin 0,5 g

D-Glucoza 5,5 g

Cao nấm men 5,0 g

Natri clorua 2,5 g

thioglycolat 0,5 g

0,5 g đến 2,0 g a Natri (mercaptoaxetat) Thạch

Resazurin 0,001 g

a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

Nước 1 000 ml

3.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,1 (cid:0) 0,2 ở 25 oC.

Phân phối các phần 10 ml vào các ống nghiệm và khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121 oC.

Trước khi sử dụng, môi trường này phải được khử khí.

3.3.3. Thử tính năng để đảm bảo chất lượng môi trường thioglycolat

Để xác định tính chọn lọc và năng suất, xem ISO/TS 11133-1. Để kiểm tra tính năng, xem ISO/TS 11133-2 : 2003, Bảng B.4.

3.4. Môi trường lactoza sunfit (LS) (tuỳ chọn)

3.4.1. Môi trường cơ bàn

3.4.1.1. Thành phần

5,0 g Pepton từ casein

2,5 g Cao nấm men

2,5 g Natri clorua

10 g Lactoza

0,3 g L-Xystin hydroclorua

Nước 1 000 ml

3.4.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi (nếu cần). Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,1 ± 0,2 ở 25 °C.

Phân phối vào các ống nghiệm có ống Durham (6.7) mỗi ống 8 ml môi trường và khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C .

Môi trường này có thể bảo quản đến 4 tuần ở 3 °C ± 2 °C .

3.4.2. Dung dịch dinatri disunfit

3.4.2.1. Thành phẩn

2

Dinatri disunfit (Na ), S 2 O 5 1,2 g

100 ml dạng khan Nước

3.4.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan dinatri disunfit trong nước và lọc để khử trùng.

Sử dụng dung dịch trong ngày

3.4.3. Dung dịch amoni sắt (III) xitrat

3.4.3.1. Thành phần

Amoni sắt (III) xitrat 1 g

Nước 100 ml

3.4.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan amoni sắt (III) xitrat trong nước và lọc để khử trùng.

Sử dụng dung dịch trong ngày.

3.4.4. Môi trường hoàn chỉnh

Nếu môi trường không sử dụng trong ngày chuẩn bị, thì ngay trước khi kết thúc chuẩn bị, khử khí môi trường bằng cách đun nóng và làm nguội nhanh. Nếu môi trường đựng trong các chai có nắp vặn thì nới lỏng nắp trước khi gia nhiệt và vặn chặt lại ngay trước khi làm nguội.

Cứ 8 ml môi trường cơ bản (5.4.1) thì bổ sung 0,5 ml dung dịch dinatri disunfit (5.4.2) và 0,5 ml dung dịch amoni sắt (III) xitrat (5.4.3).

Sử dụng dung dịch hoàn chỉnh trong ngày.

3.5. Môi trường nitrat để thử tính di động (tuỳ chọn)

3.5.1. Thành phấn

Pepton từ casein 5,0 g

Cao thịt 3,0 g

Galactoza 5,0 g

Glyxerol 5,0 g

Kali nitrat (KNO 1,0 g ) 3

2,5 g Dinatri

hidro octophosphat

Thạch 1,0 g đến 5,0 g a

a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

Nước 1 000 ml

3.5.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 °C

Chuyển môi trường vào các ống cấy, với các lượng 10 ml và khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C. Nếu không sử dụng trong ngày thì bảo quản trong tủ lạnh ở 5 °C ± 3 °C. Chỉ ngay trước khi sử dụng, làm nóng trên nồi cách thủy hoặc bằng hơi nuớc trong 15 phút và làm nguội nhanh đến nhiệt độ ủ.

Môi trường chỉ được sử dụng trong vòng 4 tuần sau khi chuẩn bị.

3.6. Thuốc thử để phát hiện nitrit (tùy chọn)

3.6.1. Dung dịch axit 5-Amino-2-naphthalenesunfonic (5-2-ANSA)

Hòa tan 0,1 g 5-2-ANSA trong 100 ml dung dịch axit axetic 15 % (phần khối lượng). Lọc qua giấy lọc.

Bảo quản trong chai màu nâu có nắp đậy kín (tốt nhất là loại ống nhỏ giọt quả bóp) ở 5 °C ± 3 °C.

3.6.2. Dung dịch axit sunfanilic

Hòa tan 0,4 g axit sunfanilic trong 100 ml dung dịch axit axetic 15 % (phần khối lượng). Lọc qua giấy lọc.

Bảo quản trong chai màu nâu có nắp đậy kín (tốt nhất là loại ống nhỏ giọt quả bóp) ở 5 °C ± 3 °C.

3.6.3. Chuẩn bị thuốc thử hoàn chỉnh

Trước khi sử dụng, trộn lẫn hai dung dịch (5.6.1 và 5.6.2) với các lượng bằng nhau. Loại bỏ ngay thuốc thử không sử dụng.

3.7. Bụi kẽm (tùy chọn).

3.8. Môi trường lactoza-gelatin (tùy chọn)

3.8.1. Thành phần

Pepton từ casein 15,0 g

Cao nấm men 10,0 g

Lactoza 10,0 g

Gelatin 120,0 g

Phenol đỏ 0,05 g

Nước 1 000 ml

3.8.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước, trừ lactoza và phenol đỏ. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,5 (cid:0) 0,2 ở 25 °C.

Bổ sung tiếp lactoza và phenol đỏ, phân phối vào các ống nghiệm các lượng 10 ml và khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C. Nếu không sử dụng trong ngày thì bảo quản trong tủ lạnh ở 5 °C (cid:0) 3 °C.

Ngay trước khi sử dụng, đun nóng trong nồi cách thủy hoặc thổi bằng hơi nước trong 15 phút và làm nguội nhanh đến nhiệt độ ủ.

Môi trường chỉ được sử dụng trong vòng 3 tuần sau khi chuẩn bị.

4) Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể là:

4.1. Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

4.2. Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 37 °C ± 1 °C.

4.3. Bình không khí cải biến, hoặc các dụng cụ thích hợp khác để cấy kỵ khí.

4.4. pH mét, có thể đọc chính xác đến ± 0,01 đơn vị pH ở 25 °C, có thể cho các phép đo chính xác đến 0,1 đơn vị pH.

4.5. Que cấy vòng, bằng platin-iridi hoặc niken-crôm, đường kính khoảng 3 mm, và các kim cấy sâu bằng cùng vật liệu hoặc các que cấy vòng và kim cấy vô trùng sử dụng một lần có chất lượng tương đương.

4.6. Dụng cụ lọc, để khử trùng các dung dịch.

4.7. Ống nghiệm, bình hoặc chai có dung tích thích hợp, cụ thể là các ống nghiệm 16 mm x 160 mm có các ông Durham lộn ngược, ví dụ: dài 35 mm và đường kính 7 mm.

4.8. Pipet hoặc micropipet chia độ xả hết, có dung tích danh định 1 ml và 10 ml, được chia vạch 0,1 ml và 0,5 ml tương ứng.

4.9. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo có đường kính 90 mm đến 100 mm.

4.10. Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự có thể hoạt động ở 44 oC đến 47 oC và ở 46 oC (cid:0) 0,5 oC

4.11. Bầu cao su, để sử dụng với pipet chia độ khi phân phối các thành phần của thuốc thử phát hiện nitrit (nếu cần).

5) Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng thì các bên liên quan tự thoả thuận với nhau về vấn đề này.

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

6) Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6507-2 (ISO 6887-2), TCVN 6507-3 (ISO 6887-3), TCVN 6507-4 (ISO 6887-4) hoặc TCVN 6263 (ISO 8261).

7) Cách tiến hành

7.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Xem các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) và tiêu chuẩn riêng liên quan tới sản phẩm.

7.2. Cấy và ủ (kỹ thuật rót đĩa)

Dùng pipet vô trùng (4.8) cho vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu cho vào chính giữa hai đĩa Petri trống (4.9).

Rót vào mỗi đĩa 10 ml đến 15 ml thạch SC (3.2.3), được duy trì ở 44 °C đến 47 °C trong nồi cách thủy (4.10) và trộn đều chất cấy bằng cách xoay nhẹ từng đĩa. Khi môi trường đã đông đặc lại thì phủ kín thêm một lớp dày 10 ml của cùng loại thạch SC.

Để cho đông đặc lại. Đặt các đĩa vào các bình môi trường cải biến hoặc các vật đựng thích hợp khác (4.3) và ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 37 °C trong 20 h ± 2 h. Thời gian ủ kéo dài có thể làm cho các đĩa bị quá đen.

Tiến hành qui trình tương tự đối với các dung dịch pha loãng đã chuẩn bị (xem 7.1).

7.3. Đếm và chọn các khuẩn lạc

Sau giai đoạn ủ qui định (7.2), chọn tất cả các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc. Từ các đĩa này, chọn các đĩa đại diện cho các độ pha loãng liên tiếp, nếu có thể.

Đếm các khuẩn lạc điển hình của C.perfringens trên mỗi đĩa.

Chọn năm khuẩn lạc điển hình và khẳng định chúng sử dụng một trong các kỹ thuật mô tả trong 7.4.2 và 7.4.3.

7.4. Khẳng định sinh hoá

7.4.1. Yêu cầu chung

Chọn một trong hai kỹ thuật thử khẳng định như mô tả trong 7.4.2 và 7.4.3.

Có thể sử dụng loại có bán sẵn nếu phù hợp với TCVN 6404 (ISO 7218).

7.4.2. Kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường LS

CHÚ THÍCH: Phản ứng thu được trong môi trường lactoza sunfit (3.4) khi ủ ở 46 °C là rất đặc trưng cho C.perfringens và C.absonum. Do đó, không cần phải khẳng định sự thuần khiết của các khuẩn lạc màu đen được lấy từ môi trường thạch trước khi cấy vào môi trường thioglycolat và cấy truyền vào môi trường thạch lactoza sunfit nữa.

7.4.2.1. Cấy và ủ

Cấy từng khuẩn lạc đã chọn (xem 7.3) vào môi trường thioglycollat lỏng (3.3). Ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37 °C trong 18 h đến 24 h.

Sau khi ủ, dùng pipet vô trùng chuyển ngay 5 giọt dịch cấy trong môi trường thioglycolat sang môi trường LS. Ủ trong các điều kiện hiếu khí ở 46 °C trong 18 h đến 24 h trong nồi cách thủy (4.10).

7.4.2.2. Giải thích kết quả

Kiểm tra các ống nghiệm đựng môi trường LS về việc sinh khí và có xuất hiện màu đen (kết tủa của sắt sunfit). Các ống Durham có phần bọt khí chiếm hơn một phần tư chiều dài ống và các ống có kết tủa màu đen được coi là dương tính.

Trong trường hợp có nghi ngờ, khi ống Durham trong môi trường bị đen có phấn bọt khí chiếm ít hơn một phần tư chiều dài ống thì dùng pipet vô trùng chuyển ngay 5 giọt đã được phát triển trước trong môi trường LS (7.4 2.1) vào ống khác đựng môi trường LS. Ủ trong nồi cách thủy (4.10) đến 46 °C trong 18 h đến 24 h. Kiểm tra ống này như mô tả ở trên.

Vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch SC và được khẳng định dương tính với môi trường LS được coi là C.perfringens. Trong các trường hợp khác, các ống được coi là âm tính.

7.4.3. Kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường nitrat để thử tính di động và môi trường lactoza-gelatin

7.4.3.1. Yêu cầu chung

Kỹ thuật khẳng định này đòi hỏi các khuẩn lạc điển hình phân lập tốt. Nếu không phải như thế (nghĩa là bề mặt của các đĩa bị mọc quá dày và không thể chọn các khuẩn lạc

điển hình phân lập tốt), thì cấy năm khuẩn lạc điển hình vào môi trường thioglycollat lỏng (3.3) đã khử khí trước.

Ủ trong các điều kiện kỵ khí ỏ 37 °C trong 18 h đến 24 h. Cấy ria các khuẩn lạc lên các đĩa thạch cơ bản SC (xem 3.2.1.2) và phủ kín thêm 10 ml thạch cơ bản SC.

Để cho đông đặc và ủ kỵ khí ở 37 °C trong 18 h đến 24 h. Chọn từ mỗi đĩa ít nhất một khuẩn lạc điển hình và phân lập tốt. Nếu cần, lặp lại quá trình cấy ria và cấy trên các đĩa môi trường thạch cơ bản SC cho đến khi thu được các khuẩn lạc đen điển hình phân lập tốt.

Khẳng định khuẩn lạc này như mô tả trong 7.4.3.2, 7.4.3.3 và 7.4.3.4.

7.4.3.2. Cấy và đọc trên môi trường nitrat để thử tính di động

Cấy đâm sâu từng khuẩn lạc chọn lọc (xem 7.3) sang môi trường nitrat để thử tính di động (3.5) mới khử khí.

Ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 37 °C trong 24 h. Kiểm tra ống môi trường nitrat để thử tính di động đối với loại mọc dọc theo đường cấy đâm sâu. Tính di động là bằng chứng phát triển lan rộng vào môi trường cách xa đường cấy đâm sâu.

Kiểm tra sự có mặt của nitrit bằng cách dùng pipet chia độ (4.8) và bầu bóp cao su (4.11) lấy từ 0,2 ml đến 0,5 ml thuốc thử phát hiện nitrit (3.6) cho vào từng ống môi trường nitrat để thử tính di động

CẢNH BÁO - Vì các lý do sức khoẻ, phép thử này phải tiến hành trong tủ hút.

Sự hình thành màu đỏ khẳng định sự khử nitrat về nitrit. Nếu màu không hình thành màu đỏ trong 15 phút, thì thêm một lượng nhỏ bụi kẽm (3.7) và để yên 10 phút. Nếu màu đỏ hình thành sau khi thêm bụi kẽm thì đã không xảy ra sự khử nitrat về nitrit.

7.4.3.3. Cấy và đọc trên môi trường lactoza-gelatin

Cấy từng khuẩn lạc đã chọn (xem 7.3) vào môi trường lactoza-gelatin (3.8) vừa mới khử khí. Ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 37 °C trong 24 h.

Kiểm tra các ống nghiệm đựng môi trường lactoza-gelatin về việc sinh khí và có xuất hiện màu vàng (do hình thành axit) cho thấy sự lên men lactoza. Làm lạnh các ống 1 h ở 5 oC và kiểm tra sự hóa lỏng gelatin. Nếu môi trường đã đông đặc thì ủ lại thêm 24 h để kiểm tra lại sự hóa lỏng gelatin.

7.4.3.4. Giải thích kết quả

Các vi khuẩn sinh ra các khuẩn lạc màu đen trong môi trường SC mà không di động, thường khử nitrat thành nitrit, sinh axit và sinh khí từ lactoza và hoá lỏng gelatin trong vòng 48 h được coi là C.perfringens. Các chủng cho phản ứng yếu đối với nitrit (tức là có màu hồng) phải được loại bỏ, vì C.perfringens luôn luôn phản ứng mạnh và phản ứng tức thì.

8) Biểu thị kết quả

8.1. Phương pháp tính

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

8.2. Độ chụm

8.2.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các dữ liệu về phương pháp được mô tả trong tiêu chuẩn này dựa trên các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm. Chi tiết về phép thử này được nêu trong Phụ lục A của tiêu chuẩn này. Các giá trị giới hạn lặp lại và tái lập được xác định sử dụng ba vật liệu chuẩn và ba loại thực phẩm ở các mức độ nhiễm bẩn khác nhau.

Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các chất nền khác với qui định ở trên.

8.2.2. Độ lặp lại

10

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập đơn lẻ (được chuyển ) (số lượng C.perfringens trong một gam hoặc trong một mililit) hoặc tỷ số của về log

giá trị cao và giá trị thấp của hai kết quả thử nghiệm trên thang danh định, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại (r).

Như biểu thị chung của giới hạn lặp lại (r), các giá trị sau đây có thể được sử dụng khi kiểm tra các mẫu thực phẩm nói chung. Các giá trị này đối với r là trung bình chung đối với tất cả các chất nền được xem xét trong phép thử liên phòng thử nghiệm:

10

r = 0,21 để khẳng định môi trường LS hoặc 0,25 để khẳng định MN/LG (được biểu thị theo sự chênh lệch giữa các kết quả thử nghiệm được chuyển thành log ) hoặc

r = 1,67 để khẳng định môi trường LS hoặc 1,8 để khẳng định MN/LG (được biểu thị theo tỷ số giữa hai kết quả thử nghiệm cao hơn và thấp hơn)

Đối với các vật liệu chuẩn (xem bảng A.4), các giá trị sau đây có thể được sử dụng:

10

r = 0,13 để khẳng định môi trường LS hoặc 0,12 để khẳng định MN/LG (được biểu thị theo sự chênh lệch giữa các kết quả thử nghiệm được chuyển thành log ) hoặc

r = 1,3 để khẳng định môi trường LS hoặc để khẳng định MN/LG (được biểu thị theo tỷ số giữa hai kết quả thử nghiệm cao hơn và thấp hơn).

VÍ DỤ: Kết quả thử nghiệm thứ nhất là 10 000 hoặc 1,0 x 10 4 C.perfringens giả định quan sát được, có trong một gam thực phẩm. Dưới các điều kiện lặp lại, thì tỷ số giữa kết quả thử cao hơn và kết quả thử thấp hơn không được quá 1,9. Nên kết quả thử thứ hai phải nằm trong khoảng từ 5 263 (= 10 000/1,9) đến 19 000 (10 000 x 1,9) C.perfringens giả định trong một gam.

8.2.3. Độ tái lập

10

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ (được chuyển về log )

(số lượng C.perfringens trong một gam hoặc trong một mililít) hoặc tỷ số tuyệt đối của hai kết quả thử nghiệm trên thang danh định, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập (R).

Như một chỉ thị của giới hạn tái lập (R), các giá trị trong Bảng 1 có thể được sử dụng đối với các loại thực phẩm khác nhau và các vật liệu chuẩn cần thử nghiệm. Các giá trị này là các trung bình của các giá trị thu được trong thử liên phòng thử nghiệm ở các mức khác nhau26

Bảng - Các ví dụ về các giá trị R

Khẳng định LS Khẳng định MN và LG

Loại mẫu

b R

b R

R (log)a R (log)a

Phomat 0,26 1,8 0,31 2,1

Thịt 0,55 3,5 0,52 3,3

0,65 4,5 0,72 5,3 Thức ăn chăn nuôi dạng khô

Vật liệu chuẩn 0,27 1,9 0,29 1,9

10

a R (log) là giới hạn tái lập được biểu thị theo sự chênh lệch giữa các kết quả thử nghiệm được chuyển thành log .

b R là giới hạn tái lập được biểu thị theo tỷ số giữa các kết quả thử nghiệm.

VÍ DỤ 1: Kết quả thu được trong phòng thử nghiệm thứ nhất là 10 000 hoặc 1,0 x 10 4 C.perfringens trong một gam phomat. Dưới các điều kiện tái lập, thì tỷ số giữa kết quả cao hơn và thấp hơn không được quá 2,1. Vì vậy kết quả thử trong phòng thử nghiệm thứ hai phải từ 4 761 (= 10 000/2,1) và 21 000 (10 000 x 2,1) C.perfringens giả định trong một gam.

10

VÍ DỤ 2: Hơn nữa, phòng thử nghiệm cần biết mức tối đa để có thể vẫn còn phù hợp 5). Về điều này, giá trị R (0,31 với giới hạn đã định (ví dụ, giới hạn là 100 000 hoặc log

10 giữa các kết quả thử nghiệm. Do đó, các kết quả đến log

trên thang log đối với phomat) cần phải nhân với hệ số 0,59. Giá trị 0,18 (0,31 x 0,59) là hoặc 1,52 (100,18) là tỷ số chênh lệch giữa các kết quả thử nghiệm chuyển sang log

10

10

10

5,18 (log 5 + log 0,18)

26 Trong phép thử liên phòng thử nghiệm này, các giá trị và độ tái lập thay đổi qua nhiều giữa các mẫu để có thể biểu thị như 1

hoặc 152 000 (100 000 x 1,52) không cho thấy sự không phù hợp với giới hạn. Hệ số

0,59 phản ánh thực tế rằng phép thử có khoảng lệch 95 % được dùng để thử nghiệm cho dù giới hạn bị vượt quá. Hệ số 0,59 thu được bằng công thức sau:

0,59 (cid:0) 1,64

1,96 (cid:0) 2

9) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tùy chọn cùng với các chi tiết của sự cố bất kỳ nào mà có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được, hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

2.3.7 Định lượng Coliform bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc (dựa theo TCVN

6848:2007)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các hướng dẫn chung về định lượng Coliform. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:

- thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, và

- các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm.

bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc sau khi ủ ở 30 (cid:0) C hoặc 37 (cid:0) C.

CHÚ THÍCH Nhiệt độ này cần được thỏa thuận giữa các bên có liên quan. Trong trường hợp đối với sữa và sản phẩm sữa, thì nhiệt độ ủ là 30(cid:0) C.

Kỹ thuật này được khuyến cáo sử dụng khi số lượng khuẩn lạc cần tìm dự kiến lớn hơn 100 trên mililit hoặc trên gam mẫu thử.

2) Nguyên tắc

2.1. Chuẩn bị hai môi trường đặc chọn lọc, và lấy một lượng mẫu thử theo quy định nếu là sản phẩm ban đầu là chất lỏng, hoặc lấy một lượng huyền phù ban đầu theo quy định nếu các sản phẩm ở dạng khác.

Chuẩn bị các cặp đĩa môi trường chọn lọc khác trong cùng một điều kiện, dùng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.

2.2. Ủ các đĩa này ở 30 (cid:0) C hoặc 37 (cid:0) C (như thỏa thuận) trong 24 h.

2.3. Đếm các khuẩn lạc đặc trưng và nếu cần, số khuẩn lạc được khẳng định bằng lên men lactoza.

2.4. Số Coliform có trong 1 mililit hoặc trong 1 gam mẫu thử được tính từ số khuẩn lạc đặc trưng thu được trên các đĩa được chọn [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

3) Môi trường nuôi cấy và dịch pha loãng

3.1. Khái quát

Xem TCVN 6404 (ISO 7218), ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2 về việc chuẩn bị, pha chế và thử tính năng của môi trường cấy.

3.2. Dịch pha loãng

Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra.

3.3. Môi trường đặc chọn lọc: Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể (VRBL)

3.3.1. Thành phần

7 g Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym

Cao men 3 g

12

22

11

Lactoza (C H O .H 10 g O) 2

Natri clorua 5 g

Muối mật (bile salts) 1,5 g

Đỏ trung tính 0,03 g

Tím tinh thể 0,002 g

12 g đến 18 ga Thạch

Nước 1 000 ml

a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

3.3.2. Chuẩn bị

Tiến hành như sau để giữ được tính chọn lọc và đặc trưng của môi trường.

Trộn kỹ các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước và để yên vài phút. Chỉnh pH sao cho sau khi đun sôi pH bằng 7,4 ± 0,2 ở 25 (cid:0) C. Đun đến sôi và thỉnh thoảng khuấy cho tan hết.

Giữ sôi trong 2 phút. Làm nguội ngay môi trường trong nồi cách thủy (6.5) ở nhiệt độ 44 (cid:0) C đến 47 (cid:0) C.

Để tránh làm quá nhiệt, không đun môi trường quá lâu cũng như không đun lại. Do đó, không khử trùng trong nồi áp lực và cần kiểm tra độ vô trùng của môi trường tại thời điểm sử dụng (xem 9.2.2).

Sử dụng môi trường trong vòng 4 h sau khi chuẩn bị.

3.3.3. Kiểm tra tính năng về đảm bảo chất lượng môi trường cấy

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Kiểm tra tính năng đối với thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể (VRBL) theo ISO/TS 11133- 2:2003, Bảng B.1.

3.4. Môi trường khẳng định: Canh thang mật lactoza lục sáng

3.4.1. Thành phần

Dịch thủy phân casein bằng emzym 10 g

12

22

11

Lactoza (C H O .H 10 g O) 2

Mật bò khô 20 g

Lục sáng (Brilliant green) 0,0133 g

Nước 1 000 ml

3.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng nhẹ, nếu cần, trên nồi cách thủy (4.5). Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,2 ở 25 (cid:0) C, nếu cần.

Chuyển 10 ml môi trường vào từng ống nghiệm (6.7) chứa các ống Durham (6.8). Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (4.1) ở 121 (cid:0) C. Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi khử trùng.

4) Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thử nghiệm vi sinh [Xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể sau:

4.1. Thiết bị để thanh trùng khô (tủ sấy) hoặc để thanh trùng ướt (nồi hấp áp lực)

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

4.2. Tủ ấm, có thể hoạt động ở 30 (cid:0) C ± 1 (cid:0) C hoặc 37 (cid:0) C ± 1(cid:0) C.

4.3. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

4.4. Pipet xả hết, có dung tích danh định 1 ml.

4.5. Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự có khả năng hoạt động từ 44 (cid:0) C đến 47 (cid:0) C hoặc ở 100 (cid:0) C.

4.6. Thiết bị đếm khuẩn lạc, gồm một nguồn chiếu sáng và dụng cụ đếm cơ học hoặc điện tử.

4.7. Ống nghiệm, kích thước khoảng 16 mm x 160 mm.

4.8. Ống Durham, có kích thước phù hợp với ống nghiệm (4.7).

4.9. Bình hoặc chai, để đun sôi và bảo quản môi trường cấy.

4.10. pH met, chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 (cid:0) C.

4.11. Que cấy vòng, bằng platin-iridi hoặc niken-crom, đường kính khoảng 3 mm, hoặc loại vòng cấy dùng một lần.

5) Lấy mẫu

Lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm tương ứng. Nếu không có các tiêu chuẩn như vậy thì các bên liên quan cần thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

6) Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu theo TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể thì các bên liên quan thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

7) Cách tiến hành

7.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng

Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng đầu tiên) và các dung dịch pha loãng tiếp theo TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra.

7.2. Cấy và ủ ấm mẫu

7.2.1. Chuẩn bị hai đĩa đối với sản phẩm dạng lỏng và/hoặc đối với mỗi bộ pha loãng đã chọn. Dùng pipet vô trùng (4.4) cho vào tâm của mỗi đĩa 1 ml của mẫu thử nếu là sản phẩm lỏng hoặc của các dung dịch pha loãng thích hợp. Sử dụng một pipet vô trùng cho mỗi dung dịch pha loãng.

7.2.2. Rót khoảng 15 ml môi trường VRBL (3.3) ở 44 (cid:0) C đến 47 (cid:0) C vào mỗi đĩa Petri. Thời gian tính từ khi kết thúc khâu chuẩn bị huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha loãng 1/10 nếu là sản phẩm lỏng) đến thời điểm rót môi trường vào đĩa không vượt quá 15 phút.

Trộn đều dịch cấy với môi trường và để cho hỗn hợp đông đặc lại bằng cách đặt đĩa Petri ở một mặt phẳng ngang, mát.

Đồng thời chuẩn bị một đĩa kiểm tra với 15 ml môi trường để kiểm tra độ vô trùng.

7.2.3. Sau khi đông đặc hoàn toàn, rót khoảng 4 ml môi trường VRBL (3.3) ở 44 (cid:0) C đến 47 (cid:0) C lên bề mặt của môi trường cấy. Để cho đông lại như mô tả ở trên.

7.2.4. Lật ngược các đĩa đã cấy và để vào tủ ấm (4.2) ở 30 (cid:0) C hoặc 37 (cid:0) C (như thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h.

7.3. Đếm các khuẩn lạc

Sau thời gian ủ quy định (xem 7.2.4), nếu có thể, chọn các đĩa Petri có từ 10 khuẩn lạc trở lên đến 150 khuẩn lạc. Dùng thiết bị đếm khuẩn lạc (4.6) để đếm các khuẩn lạc màu đỏ ánh tía có đường kính 0,5 mm hoặc lớn hơn (đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh). Các khuẩn lạc này được coi là các Coliform điển hình và không cần phải thử khẳng định tiếp.

Đối với các chi tiết về kỹ thuật đếm khuẩn lạc, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

Cũng đếm và khẳng định các khuẩn lạc điển hình (ví dụ kích cỡ nhỏ hơn), và tất cả các khuẩn lạc có nguồn gốc từ các sản phẩm sữa và có chứa đường không phải là lactoza, ngay sau khi ủ theo 7.4. Việc chuyển hóa đường không phải là đường lactoza có thể làm cho khuẩn lạc có hình dạng nhìn tương tự như Coliform điển hình.

CHÚ THÍCH Vẻ bề ngoài của vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh các khuẩn lạc phụ thuộc vào loại Coliform và chất lượng của môi trường.

7.4. Khẳng định

Cấy năm khuẩn lạc của từng loại không điển hình, nếu sẵn có, cho vào các ống nghiệm canh thang mật lactoza lục sáng (3.4). Ủ các ống nghiệm này trong tủ ấm (4.2) đặt ở 30 (cid:0) C hoặc 37 (cid:0) C (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h. Các ống Durham cho thấy có sinh khí thì được coi là có chứa Coliform. Lấy kết quả đếm trong phép tính (điều 10).

8) Biểu thị kết quả

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

9) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

- tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

- các kết quả thử nghiệm thu được;

- nếu độ lặp lại được kiểm tra, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

2.3.8 Phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza

(dựa theo TCVN 7924-1:2008)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính β- glucuronidaza trong phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi. Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đếm khuẩn lạc sau giai đoạn phục hồi sử dụng các màng lọc và ủ ở 44 °C trên môi trường đặc có chứa thành phần tạo sắc để phát hiện enzym β- glucuronidaza.

CẢNH BÁO – Một số chủng Escherichia coli không phát triển được ở 44 °C và cụ thể là các Escherichia coli âm tính β-glucuronidaza như Escherichia coli O157 sẽ không phát hiện được.

2) Nguyên tắc

2.1 Cấy một lượng xác định của mẫu thử hoặc một lượng xác định của huyền phù ban đầu lên các màng xenluloza được phủ trên thạch glutamat khoáng cải biến (MMGA), sau đó ủ ở 37 °C trong 4 h.

Sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu cấy vào hai đĩa đối với mỗi độ pha loãng, trong cùng một điều kiện.

2.2 Để phân lập, chuyển các màng từ giai đoạn phục hồi trên MMGA sang thạch trypton-mật-glucuronid (TBX), rồi ủ ở 44 °C trong 18 h đến 24 h.

2.3 Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) của Escherichia coli dương tính β- glucuronidaza trên gam hoặc trên mililit mẫu được tính từ số lượng CFU có màu xanh điển hình (xem điều 10).

3) Dịch pha loãng và môi trường cấy

Đối với các phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007)

3.1 Dịch pha loãng

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần xác định.

3.2 Môi trường cấy

3.2.1 Môi trường phục hồi: Thạch glutamat khoáng cải biến (MMGA)

3.2.1.1 Thành phần

Natri glutamat 6,35 g

Lactoza 10,0 g

0,25 g Natri

0,02 g focmat

b Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

L-(-)- 0,02 g a Hàm lượng sắt ít nhất là 15 % (phần khối lượng).

3.2.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan amoni clorua trong nước. Cho thêm các thành phần khác vào và đun đến sôi.

Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 6,7 ± 0,2, ở 25 °C.

Chuyển các lượng đến 500 ml môi trường này sang các vật chứa thích hợp (4.10).

Khử trùng 10 min ở nhiệt độ 115 °C trong nồi hấp áp lực (4.1).

3.2.1.3 Chuẩn bị các đĩa thạch

Rót các lượng từ 12 ml đến 15 ml môi trường này vào các đĩa Petri vô trùng (4.11) và để cho đông đặc.

Làm khô các đĩa thạch [xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007)]. Các đĩa này có thể bảo quản được đến 5 ngày ở 3 °C ± 2 °C.

Các đĩa thạch cần phải đủ khô để hơi nước không xuất hiện trong 15 min khi dàn dịch cấy (1 ml).

3.2.2 Môi trường chọn lọc: Thạch trypton-mật-glucuronid (TBX)

3.2.2.1 Thành phần

Sản phầm thủy phân casein bằng enzym 20,0 g

Muối mật No.3 1,5 g

144 µmol a 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-

Axit glucuronid (BCIG) 3 ml

b Dimetyl sulfoxit là rất độc khi hít hoặc tiếp xúc phải. Cần sử dụng trong tủ hút khói. Vì độc tính đó nên nhà sản xuất khuyến cáo dùng dung dịch pha loãng.

c Phụ thuộc vào sức đông của thạch.

Dimetyl sulfoxit (DMSO)b a Ví dụ: 0,075 g muối xyclohexylamoni.

3.2.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan BCIG trong dimetyl sulfoxit hoặc trong dung dịch loãng theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Hòa tan tất cả các thành phần trên trong nước và đun đến sôi.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Khử trùng 15 min ở nhiệt độ 121 °C trong nồi hấp áp lực (4.1).

3.2.2.3 Chuẩn bị các đĩa thạch

Tiến hành theo 5.2.1.3.

4) Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007)] và cụ thể như sau:

4.1 Thiết bị khử trùng khô (tủ) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

4.2 Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 °C ± 1 °C và 44 °C ± 1 °C.

4.3 Tủ sấy hoặc buồng sấy thông gió, có thể duy trì nhiệt độ từ 25 °C ± 1 °C đến 50 °C ± 1 °C, hoặc tủ thổi không khí.

4.4 Tủ lạnh (dùng để bảo quản môi trường đã chuẩn bị), có thể duy trì nhiệt độ ở 3 °C ± 2 °C.

4.5 Màng vô trùng hoặc không gây ức chế, bằng xenlulo axetat hoặc este hỗn hợp của xenlulo, có cỡ lỗ từ 0,45 µm đến 1,2 µm hoặc đường kính 82 mm.

4.6 Bộ kẹp đầu tù, vô trùng, dài khoảng 12 cm.

4.7 Máy đo pH, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH.

Ngưỡng đo tối thiểu là 0,01 đơn vị pH. Máy đo pH được gắn với hệ thống cân bằng nhiệt bằng tay hoặc tự động.

4.8 Pipet xả hết (đầu thổi), miệng rộng và dung tích danh định 1 ml, được chia vạch 0,1 ml.

4.9 Ống đong, có dung tích thích hợp để chuẩn bị môi trường.

4.10 Bình, ống nghiệm hoặc chai, có dung tích thích hợp để khử trùng và bảo quản môi trường cấy.

4.11 Đĩa petri, đường kính khoảng 90 mm.

4.12 Bộ dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, ví dụ: que bằng thủy tinh, đường kính khoảng 3,5 mm, dài 20 cm được uốn vuông góc tại một đầu dài khoảng 3 cm và đầu cuối được làm nhẵn bằng cách đốt nóng.

5) Lấy mẫu

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này.

6) Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thỏa thuận về vấn đến này.

7) Cách tiến hành

7.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng tiếp theo

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần xác định.

7.2 Phục hồi

7.2.1 Dùng bộ kẹp đầu tù vô trùng (4.6), đặt màng xenlulo axetat (4.5) lên bề mặt khô của hai đĩa thạch MMGA (3.2.1.3), chú ý không để lẫn bọt khí vào trong màng lọc. Dùng bộ dàn mẫu vô trùng (4.12) để dàn phẳng màng, nếu cần.

Dùng pipet vô trùng (4.8), lấy 1 ml mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu cho vào giữa màng. Dùng bộ dàn mẫu vô trùng, dàn đều dịch cấy trên khắp bề mặt màng, tránh để tràn khỏi màng.

7.2.2 Lặp lại quy trình trong 7.2.1 với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần, dùng pipet vô trùng khác và que dàn mẫu vô trùng khác cho mỗi dung dịch pha loãng.

7.2.3 Để các đĩa đã cấy theo phương nằm ngang ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 min cho đến khi dịch cấy đã ngấm sâu vào trong thạch. Ủ ấm các đĩa này 4 h ± 1 h trong tủ ấm (6.2) ở nhiệt độ 37 °C với màng/mặt thạch hướng lên trên.

7.3 Chuyển sang môi trường chọn lọc và ủ ấm

7.3.1 Sau khi phục hồi, dùng bộ kẹp vô trùng (4.6), chuyển sang các màng từ MMGA (môi trường phục hồi) sang các đĩa thạch đựng môi trường TBX (3.2.2.3).

CẢNH BÁO – Màng ẩm ướt sẽ dính vào bề mặt thạch. Tránh để lẫn bọt khí. Không sử dụng bộ dàn mẫu.

7.3.2 Ủ ấm các đĩa này từ 18 h đến 24 h trong tủ ấm (4.2) ở nhiệt độ 44 °C và không quá 45 °C, với màng/mặt thạch hướng lên trên. Không chồng các đĩa quá ba lớp.

7.4 Đếm các đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU)

Sau giai đoạn ủ ấm quy định (7.3.2), đếm các CFU điển hình của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên mỗi đĩa thạch chứa ít hơn 150 CFU điển hình và ít hơn 300 CFU tổng số (điển hình và không điển hình)

Nếu dịch cấy không thể tách riêng và không thể quan sát được các khuẩn lạc điển hình, thì các đĩa chứa 0 CFU điển hình cần được xem xét theo các phương pháp tính khác nhau như trong điều 10.

8) Biểu thị kết quả

8.1 Yêu cầu chung

Việc tính toán trong 8.2 cần tính đến các trường hợp thường gặp nhất khi tiến hành theo thực hành phòng thử nghiệm tốt. Cũng có một số trường hợp đặc biệt nhưng cũng hiếm khi xảy ra (ví dụ như số lượng CFU rất khác nhau giữa hai đĩa từ cùng một dung dịch pha loãng, hoặc các tỷ lệ khác nhau nhiều từ một hệ số pha loãng giữa các đĩa từ hai độ pha loãng liên tiếp). Các kết quả đếm cần được người phân tích có năng lực kiểm tra, giải thích và kết quả đó cũng có thể bị loại bỏ.

8.2 Tính toán

Để có kết quả đúng, cần đếm các CFU điển hình trên ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh điển hình.

Tính N, số lượng CFU của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có mặt trong mẫu thử trên mililit hoặc trên gam sản phẩm bằng công thức (1):

(

a       (cid:0)

V(cid:0) 0,1

d

(cid:0) (1) N =

n1  n2) (cid:0)

trong đó

Σa là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại sau hai độ pha loãng liên tiếp, có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh;

1

n là số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ nhất;

V thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

2

n là số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ hai;

d hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại [d=1 trong trường hợp (các mẫu ở dạng lỏng) mẫu thử được cấy trực tiếp].

Làm tròn các kết quả đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007)].

Lấy kết quả là số lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trên gam (sản phẩm dạng khác) được biểu thị theo số nguyên đến hai chữ số có nghĩa (dưới 100) hoặc theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân lũy thừa của 10.

8.3 Ước tính các số lượng nhỏ

E

8.3.1 Nếu có hai đĩa [của mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc của huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) hoặc của độ pha loãng thứ nhất được cấy hoặc được giữ lại] số CFU của Escherichia coli dương tính β- chứa ít hơn 15 CFU điển hình, thì tính N

glucuronidaza có mặt trong mẫu thử là trung bình của đĩa song song theo công thức (2):

E

(2) N = (cid:0) c   n (cid:0)

V (cid:0) d

Trong đó

Σc là tổng các CFU điển hình đếm được trên hai đĩa;

V thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

n là số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n = 2);

d hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại [d = 1 trong trường hợp (các mẫu ở dạng lỏng) khi mẫu thử được cấy trực tiếp].

Làm tròn các kết quả đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007)].

Biểu thị kết quả như sau:

E

- số lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza ước tính trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm dạng khác): N = Y.

8.3.2 Nếu hai đĩa [của mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) hoặc từ độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại] không chứa CFU điển hình nào, thì biểu thị kết quả như sau:

- ít hơn 1/d Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trong mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong gam (sản phẩm dạng khác);

Trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu hoặc độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại [d = 1 khi sử dụng sản phẩm dạng lỏng (mẫu thử) không cần pha loãng].

1

8.3.3 Nếu tất cả các CFU điển hình hoặc không điển hình trên hai đĩa ở độ pha loãng chứa nhiều hơn 300 CFU màu xanh có thể nhìn thấy, hoặc nếu trên hai đĩa thứ nhất d

2

ở độ pha loãng tiếp theo d chứa ít hơn 300 khuẩn lạc, không có CFU điển hình nào

cần đếm, thì biểu thị kết quả như sau:

2

- ít hơn 1/d và nhiều hơn 1/d , Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có trong 1

một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm dạng khác);

1

2

1

Trong đó d và d là các hệ số pha loãng tương ứng với các dung dịch pha loãng d và

d . 2

1

8.3.4 Nếu tất cả các CFU điển hình hoặc không điển hình trên hai đĩa ở độ pha loãng chứa nhiều hơn 300, không có CFU điển hình có thể nhìn thấy, hoặc nếu thứ nhất d

2

trên hai đĩa ở độ pha loãng tiếp theo d chứa ít hơn 300 khuẩn lạc, không có CFU điển

hình cần đếm, thì biểu thị kết quả như sau:

2

- ít hơn 1/d các CFU của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có trong một

mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm dạng khác);

2

Trong đó d là các hệ số pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng d . 2

8.4 Phương pháp tính toán: Các trường hợp đặc biệt

1

8.4.1 Trong trường hợp, trên hai đĩa ở đọ pha loãng d chứa lớn hơn 150 CFU điển

2

hình, trên hai đĩa ở độ pha loãng tiếp theo d chứa ít hơn 15 CFU điển hình.

1

- nếu số lượng CFU điển hình trên từng đĩa ở độ pha loãng d nằm trong khoảng từ

150 đến 167 (giới hạn trên của khoảng tin cậy đối với giá trị trung bình bằng 150 CFU), thì sử dụng phương pháp tính đối với trường hợp chung (8.2);

1

- nếu số lượng CFU điển hình trên từng đĩa ở độ pha loãng d nhiều hơn 167 (giới hạn

2

trên của khoảng tin cậy đối với giá trị trung bình bằng 150 CFU), thì chỉ tính đến kết quả của số đếm của độ pha loãng d và thực hiện tiếp với đếm số lượng nhỏ (8.3).

8.4.2 Trong trường hợp, số đếm các CFU điển hình trên mỗi đĩa đối với tất cả các dộ pha loãng đã được cấy có nhiều hơn 150, thì biểu thị kết quả như sau:

- nhiều hơn 150/d Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có trong mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc gam (sản phẩm dạng khác).

Trong đó d là hệ số pha loãng của dung dịch pha loãng đã cấy sau cùng.

8.4.3 Trong trường hợp chỉ có hai đĩa từ độ pha loãng thất nhất (nồng đồ cao nhất) chứa ít hơn 150 CFU điển hình, thì tính số N’ các Escherichia coli dương tính β- glucuronidaza có mặt trong mẫu thử là trung bình số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa, sử dụng công thức (3):

(3) (cid:0)

N = c   n (cid:0) V (cid:0) d

trong đó

Σc là tổng số khuẩn lạc điển hình đếm được trên hai đĩa, có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu là 15 CFU điển hình;

V là thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

n là số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n = 2);

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng được giữ lại.

Làm tròn kết quả đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007)].

8.5 Các giới hạn tin cậy

Xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007).

9) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- tất cả các điều kiện thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

- kết quả thử nghiệm thu được, nêu rõ phương pháp biểu thị đã sử dụng; và

- nếu đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

2.3.9 Phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza

(dựa theo TCVN 7924-2:2008)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính β- glucuronidaza trong thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi. Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44 oC trên môi trường đặc có chứa thành phần tạo sắc để phát hiện enzym β-glucuronidaza.

CẢNH BÁO - Một số chủng Escherichia coli không phát triển được ở 44 oC và cụ thể là các Escherichia coli âm tính β-glucuronidaza như Escherichia coli O157 sẽ không phát hiện được.

2) Nguyên tắc

bcác đĩa kép chứa môi trường trypton-mật-glucuronid (TBX).

Sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu cấy vào hai đĩa cho mỗi dung dịch pha loãng, trong cùng một điều kiện.

Các đĩa này được ủ ở 44 oC ± 1 oC trong 18 h đến 24 h rồi kiểm tra để phát hiện sự có mặt của các khuẩn lạc đặc trưng được coi là Escherichia coli dương tính β- glucuronidaza.

2.2 Tính số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên gam hoặc trên mililit mẫu (xem điều 10).

3) Dịch pha loãng và môi trường cấy

Đối với các phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

3.1 Dịch pha loãng

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần xác định.

3.2 Môi trường nuôi cấy: Thạch trypton-mật-glucuronid (TBX)

3.2.1 Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym 20,0 g

Muối mật No.3 1,5 g

144 μmola Axit 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG)

3 ml Dimetyl sulfoxit (DMSO)b

9 g đến 18 gc Thạch

1 000 ml Nước

3.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan BCIG trong dimety sulfoxit hoặc trong dung dịch loãng theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Hòa tan tất cả các thành phần trên trong nước và đun đến sôi.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 7,2 ± 0,2 ở 25 oC, nếu cần.

Khử trùng môi trường 15 min ở nhiệt độ 121 oC trong nồi hấp áp lực. Làm nguội ngay môi trường trên nồi cách thủy (4.3) đến khoảng từ 44 oC đến 47 oC.

4) Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau.

4.1 Thiết bị khử trùng khô (tủ) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

4.2 Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 44 oC ± 1 oC.

4.3 Nồi cách thủy, có thể duy trì được nhiệt độ từ 44 oC đến 47 oC.

4.4 Bình, ống nghiệm hoặc chai, có dung tích thích hợp.

4.5 Pipet hoặc micropipet, xả hết (đầu thổi), miệng rộng và có dung tích danh định từ 1 ml đến 10 ml, được chia vạch 0,1 ml đến 0,5 ml tương ứng.

4.6 Đĩa Petri, đường kính khoảng 90 mm.

4.7 Máy đo pH, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH.

Ngưỡng đo tối thiểu của máy đo pH phải là 0,01 đơn vị pH. Máy đo pH có thể được gắn với hệ thống cân bằng nhiệt tự động hoặc điều chỉnh bằng tay.

5) Lấy mẫu

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này.

6) Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này.

7) Cách tiến hành

7.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng tiếp theo

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần xác định.

7.2 Cấy và ủ

7.2.1 Dùng pipet hoặc micropipet vô trùng (4.5) chuyển 1 ml mẫu thử (nếu mẫu thử ở dạng lỏng) hoặc 1 ml dịch pha loãng ban đầu (10-1) (nếu sản phẩm ở dạng khác) vào đĩa Petri vô trùng (4.6).

Cấy vào hai đĩa ở mỗi độ pha loãng.

Lặp lại quy trình trên cho các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, sử dụng một pipet mới vô trùng cho mỗi độ pha loãng, nếu cần.

7.2.2 Rót vào mỗi đĩa Petri khoảng 15 ml môi trường TBX (3.2) mà trước đó đã được làm nguội đến khoảng từ 44 oC đến 47 oC trên nồi cách thủy (4.3).

Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường và để yên cho hỗn hợp đông lại, để các đĩa Petri trên mặt phẳng mát nằm ngang.

Thời gian tính từ khi phân phối dịch cấy vào đĩa đến khi rót môi trường không được quá 15 min.

7.2.3 Lật ngược các đĩa (7.2.2) và để vào tủ ấm (4.2) để ở 44 oC trong khoảng từ 18 h đến 24 h. Tổng thời gian ủ không được quá 24 h.

CẢNH BÁO - Nếu nghi ngờ có mặt các tế bào bị ức chế thì ủ giai đoạn đầu khoảng 4 h ở 37 oC sau đó tăng nhiệt độ lên 44 oC ủ trong khoảng từ 18 h đến 24 h. Nhiệt độ ủ không được vượt quá 45 oC.

7.3 Đếm các đơn vị hình thành khuẩn lạc.

Sau giai đoạn ủ ấm quy định (7.2.3), đếm các CFU điển hình của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên mỗi đĩa thạch chứa ít hơn 150 CFU điển hình và ít hơn 300 CFU tổng số (điển hình và không điển hình).

Nếu dịch cấy không thể tách riêng và không thể quan sát được các khuẩn lạc điển hình, thì các đĩa chứa 0 CFU điển hình cần được xem xét theo các phương pháp tính khác nhau như trong điều 10.

8) Biểu thị kết quả

8.1 Yêu cầu chung

Việc tính toán trong 10.2 cần tính đến các trường hợp thường gặp nhất khi tiến hành theo thực hành phòng thí nghiệm tốt. Cũng có một số trường hợp đặc biệt nhưng cũng hiếm khi xảy ra (ví dụ như số lượng CFU rất khác nhau giữa hai đĩa từ cùng một dung dịch pha loãng, hoặc các tỷ lệ khác nhau nhiều từ một hệ số pha loãng giữa các đĩa từ

hai độ pha loãng liên tiếp). Các kết quả đếm cần được người phân tích có năng lực kiểm tra, giải thích và kết quả đó cũng có thể bị loại bỏ.

8.2 Tính toán

Để có kết quả đúng, cần đếm các CFU điển hình trên ít nhất một đĩa chứa ít nhất 15 CFU màu xanh điển hình.

N (cid:0)

Tính N, số lượng CFU của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có mặt trong mẫu thử trên mililit hoặc trên gam sản phẩm từ hai độ pha loãng liên tiếp sử dụng công thức (1):

a

V (cid:0)

0,1n

1

2

(cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0)  (cid:0) n (1)  d

a là tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại sau hai độ pha

trong đó:

(cid:0)

loãng liên tiếp có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh;

1

n là số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ nhất;

V thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

2

n là số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ hai;

d hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại [d = 1 trong trường hợp (các mẫu ở dạng lỏng) khi mẫu thử được cấy trực tiếp]

Làm tròn các kết quả đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

Lấy kết quả là số lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trên gam (sản phẩm dạng khác) được biểu thị theo số nguyên đến hai chữ số có nghĩa (dưới 100) hoặc theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân lũy thừa của 10.

8.3 Ước tính các số lượng nhỏ

8.3.1 Nếu có hai đĩa [của mẫu thử (nếu sản phẩm ở dạng lỏng) hoặc của huyền phù ban đầu (nếu sản phẩm ở dạng khác) hoặc của độ pha loãng thứ nhất được cấy hoặc , số CFU của Escherichia coli được giữ lại] chứa ít hơn 15 CFU màu xanh, thì tính N E

N (cid:0) E

V (cid:0) n(cid:0)

d

dương tính β-glucuronidaza có mặt trong mẫu thử là trung bình của hai đĩa song song theo công thức (2): (cid:0) c (2)

trong đó

c là tổng các CFU màu xanh điển hình đếm được trên hai đĩa;

(cid:0)

V thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

n là số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n = 2);

d hệ số pha loãng tương ứng với dung dịch huyền phù ban đầu hoặc độ pha loãng thứ nhất được cấy hoặc được giữ lại [d = 1 trong trường hợp (sản phẩm dạng lỏng) khi mẫu thử được cấy trực tiếp].

Làm tròn các kết quả đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]

Biểu thị kết quả như sau:

E

- số lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza ước tính trong một mililit (đối với sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một miligam (sản phẩm dạng khác): N = Y.

8.3.2 Nếu hai đĩa của mẫu thử [(sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) của độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại] không chứa bất kỳ CFU màu xanh nào, thì biểu thị kết quả như sau:

- ít hơn 1/d Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trong mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong gam (sản phẩm dạng khác);

trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu hoặc độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại [d = 1] trong trường hợp (sản phẩm dạng lỏng) mẫu thử được cấy trực tiếp.

1

8.3.3 Nếu tất cả các CFU điển hình hoặc không điển hình trên hai đĩa ở độ pha loãng chứa nhiều hơn 300, có CFU màu xanh có thể nhìn thấy, hoặc nếu trên hai thứ nhất d

2

đĩa ở độ pha loãng tiếp theo d chứa ít hơn 300 khuẩn lạc, không có CFU màu xanh

nào cần đếm, thì biểu thị kết quả như sau:

1

2

- ít hơn 1/d và nhiều hơn 1/d Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có trong

một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm dạng khác);

1

2

1

trong đó d và d là các hệ số pha loãng tương ứng với các dung dịch pha loãng d và

d . 2

1

8.3.4 Nếu tất cả các CFU điển hình hoặc không điển hình trên hai đĩa ở độ pha loãng chứa nhiều hơn 300, không có CFU màu xanh có thể nhìn thấy, hoặc nếu thứ nhất d

2

trên hai đĩa ở độ pha loãng tiếp theo d chứa ít hơn 300 khuẩn lạc, không có CFU màu

xanh cần đếm, thì biểu thị kết quả như sau:

2

- ít hơn 1/d các CFU của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có trong một

mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm dạng khác);

2

2

trong đó d là các hệ số pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng d .

8.4 Phương pháp tính: Các trường hợp đặc biệt

1

8.4.1 Trong trường hợp trên hai đĩa ở độ pha loãng d chứa nhiều hơn 150 CFU màu

2

xanh, trên hai đĩa ở độ pha loãng tiếp theo d chứa ít hơn 15 CFU màu xanh:

1

- nếu số lượng CFU màu xanh trên từng đĩa ở độ pha loãng d nằm trong khoảng từ

150 đến 167 (giới hạn trên của khoảng tin cậy đối với giá trị trung bình bằng 150), thì sử dụng phương pháp tính đối với trường hợp chung (8.2).

1

- nếu số lượng CFU màu xanh trên từng đĩa ở độ pha loãng d nhiều hơn 167 (giới hạn

2

trên của khoảng tin cậy đối với giá trị trung bình bằng 150 CFU), thì chỉ tính đến kết quả của số đếm của độ pha loãng d và thực hiện tiếp với việc đếm số lượng nhỏ (8.3).

8.4.2 Trong trường hợp số đếm CFU màu xanh trên mỗi đĩa đối với tất cả các độ pha loãng đã cấy có nhiều hơn 150, thì biểu thị kết quả như sau:

- nhiều hơn 150/d Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có trong mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc gam (sản phẩm dạng khác).

trong đó d là hệ số pha loãng của dung dịch pha loãng đã cấy sau cùng.

8.4.3 Trong trường hợp chỉ có hai đĩa ở độ pha loãng thấp nhất (nồng độ cao nhất) chứa ít hơn 150 CFU điển hình, thì tính số N' các Escherichia coli dương tính β- glucuronidaza có mặt trong mẫu thử là trung bình số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa, sử dụng công thức (3):

N' (cid:0)

V (cid:0) n(cid:0)

d

(cid:0) c (3)

c là tổng số khuẩn lạc màu xanh đếm được trên hai đĩa, có ít nhất một đĩa chứa tối

trong đó

(cid:0)

thiểu là 15 CFU điển hình;

V là thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

N là số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n = 2);

D là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng được giữ lại.

Làm tròn kết quả đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

8.5 Các giới hạn tin cậy

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

9) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được, nêu rõ phương pháp biểu thị đã sử dụng; và

- nếu đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

2.3.10 Phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính (cid:0) -glucuronidaza

(dựa theo TCVN 7924-3:2008)

1) Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính β- glucuronidaza bằng kỹ thuật cấy trong môi trường lỏng và tính số có xác suất lớn nhất (MPN) sau khi được ủ ở 37ºC rồi ủ tiếp ở 44ºC.

Tiêu chuẩn có thể áp dụng cho:

- các sản phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi, và

- các mẫu môi trường trong khu vực chế biến thực phẩm và vận chuyển thực phẩm.

Phương pháp này thích hợp để định lượng các tế bào Escherichia coli mà có thể đã trải giai đoạn làm mất nước, đông lạnh, tiếp xúc với môi trường mặn (như nước biển) hoặc bị hư hại do các chất tẩy rửa như các sản phẩm chứa clo.

Sự hạn chế áp dụng của phương pháp này là do tính nhạy của phương pháp với độ dao động lớn. Phương pháp này được áp dụng và các kết quả được diễn giải theo thông tin nêu trong điều 11.

CẢNH BÁO – Một số chủng Escherichia coli không phát triển được ở 44ºC và cụ thể là các Escherichia coli âm tính β-glucuronidaza như Escherichia coli O157 và một số chủng E.coli gây bệnh khác bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này sẽ không phát hiện được.

2) Nguyên tắc

2.1. Cấy một lượng xác định của mẫu thử nếu sản phẩm ban đầu dạng lỏng, hoặc với một lượng xác định của huyền phù ban đầu trong trường hợp sản phẩm dạng khác vào ba ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ kép.

2.2. Cấy một lượng xác định của mẫu thử nếu sản phẩm ban đầu dạng lỏng, hoặc với một lượng xác định của huyền phù ban đầu trong trường hợp sản phẩm dạng khác vào ba ống nghiệm chưa môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ đơn.

Sau đó, cấy các lượng xác định của các dung dịch mẫu thử pha loãng thập phân hoặc huyền phù ban đầu vào môi trường tăng sinh lỏng nồng độ đơn trong cùng điều kiện trên.

2.3. Nuôi ấm các ống nghiệm chứa môi trường nồng độ kép và nồng độ đơn ở 37ºC trong 24h. Kiểm tra các ống này về sự sinh axit và cho thấy lên men lactoza.

2.4. Từ mỗi ống đựng môi trường tăng sinh chọn lọc cho thấy có tạo thành axit sẽ được cấy truyền vào môi trường thạch trypton-mật-glucuronid.

2.5. Thạch trypton-mật-glucuronid được ủ ở 44ºC trong khoảng từ 20h đến 24 h. Xác định trên môi trường thạch trypton-mật-glucuronid sự có mặt các khuẩn lạc màu xanh hoặc màu xanh da trời, chứng tỏ có mặt Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza.

2.6. Số có xác xuất lớn nhất Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] được xác định theo số ống đựng môi trường tăng sinh chọn lọc được cấy truyền có sinh các khuẩn lạc màu xanh hoặc màu xanh da trời trên thạch mật glucuronid.

3) Dịch pha loãng và môi trường cấy

Đối với các phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

3.1. Dịch pha loãng

Xem các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) hoặc TCVN 6263 (ISO 8261).

3.2. Môi trường cấy

3.2.1. Môi trường glutamat khoáng cải biến (môi trường tăng sinh chọn lọc)

3.2.1.1. Thành phần

Môi Môi

độ độ

a) trường nồng kép b) trường nồng đơn

Natri glutamat 12,7 g 6,35 g

Lactoza 20,0 g 10,0 g

0,5 g 0,25 g Natri focmat

L-xystin 0,04 g 0,02 g

0,048 g 0,024 g L-(-)-axit aspactic

0,04 g 0,02 g L(+)-arginin

Thiamin 0,002 g 0,001 g

Axit nicotinic 0,002 g 0,001 g

Axit pantothenic 0,002 g 0,001 g

0,2 g 0,1 g ngậm bảy phân tử nước

Magie (MgSO sunfat O) 2 .7H 4 0,01 g 0,02 g

Sắt (III) amoni xytrat 0,01 g 0,02 g

Canxi clorua ngậm hai phân tử nước (CaCl .2H 2 O) 2

4

1,8 g 0,9 g Dikali hydro phosphat (K ) HPO 2

0,02 g 0,01 g Bromocresol tía

5,0 g 2,5 g Amoni clorua

1000 ml 1000 ml Nước

3.2.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan amoni clorua trong nước. Bổ sung các thành phần, hoặc môi trường hoàn chỉnh khô còn lại, đun nóng nếu cần.

Để tăng thời gian bảo quản của môi trường khô, có thể thêm natri glutamat một cách riêng rẽ.

Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 6,7 ± 0,1 ở 25ºC.

Phân phối môi trường này theo từng lượng 10 ml vào các ống nghiệm có kích thước 16 mm x 160 mm (6.6) trong trường hợp môi trường nồng độ đơn và phân phối vào các

ống nghiệm có kích thước 18 mm x 180 mm hoặc 20 mm x 200 mm (6.6) trong trường hợp môi trường nồng độ kép.

Khử trùng 10 min ở nhiệt độ 116ºC trong nồi hấp áp lực (6.1). Cách khác có thể đun nóng ở 100ºC trong 30 min trong ba ngày liên tiếp.

3.2.2. Thạch trypton-mật-glucuronid (môi trường chọn lọc thứ hai)

3.2.2.1. Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym 20,0 g

Muối mật No.3 1,5 g

114 µmola

Axit-5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG) 3 ml

Dimetyl sulfoxit (DMSO)b 9 g tới 18 g c

Thạch 1000 ml

Nước

3.2.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan BCIG trong dimetyl sulfoxit. Hòa tan tất cả các thành phần trên trong nước và đun đến sôi.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 7,2 ± 0,2 ở 25ºC, nếu cần.

Khử trùng môi trường 15 min ở nhiệt độ 121ºC trong nồi hấp áp lực (6.1).

3.2.2.3. Chuẩn bị các đĩa thạch

Rót các lượng từ 12 ml đến 15 ml môi trường tan chảy vào các đĩa Petri vô trùng (6.9) và để cho đông đặc.

Làm khô các đĩa thạch (4.3) [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]. Các đĩa này có thể bảo quản được đến 5 ngày ở 5ºC ± 3ºC.

Các đĩa thạch cần phải đủ khô để hơi nước không xuất hiện trong 15 min khi dàn dịch cấy.

3.2.3. Kiểm tra hiệu quả của việc đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy.

Về định nghĩa tính chọn lọc và hiệu năng, xem ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2. Đối với các phép thử về hiệu quả môi trường glutamate khoáng cải biến và thạch trypton mật glucuronid, xem bảng 13 và bảng14.

Bảng 13 – Kiểm tra hiệu năng của môi trường glutamat khoáng cải biến

Chức năng Ủ Tiêu chí

Chủng kiểm chứng Phản ứng đặc trưng

Phương pháp kiểm chứng

E.Coli ATCC năng 37ºC/24h định Sinh axit

Khả phát triển Bán lượng

Chuyển sang màu vàng 25922 hoặc 8739

chọn 37ºC/24h Định lượng -

Tính lọc Không phát triển

E.faecalis ATCC 29212 hoặc 19433

Bảng 14 – Kiểm tra hiệu năng của môi trường thạch trypton mật glucuronid

Chức năng Ủ Tiêu chí

Chủng kiểm chứng Phản ứng đặc trưng

Phương pháp kiểm chứng

E.Coli ATCC năng Định lượng triển

Khả phát triển 44ºC/20h đến 24h Phát tốt (2) hoặc

25922 8739

E.Coli NCTC Định lượng triển

Phát tốt (2)

Các khuẩn lạc có màu xanh đến xanh da trời Các khuẩn lạc có màu xanh đến xanh da trời - chọn 37ºC/24h Định lượng

Tính lọc Không phát triển

13216 (dương tính yếu β- glucuronidaza) E.faecalis ATCC 29212 hoặc 19433

4) Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần để thay thế cho dụng cụ sử dụng nhiều lần nếu có các yêu cầu tương tự.

Sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể là:

4.1. Thiết bị khử trùng khô (tủ) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

Xem TCVN 6404 (ISO 7218)

4.2. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37ºC ± 1ºC và 44ºC ± 1ºC

4.3. Tủ sấy hoặc buồng sấy thông gió, có thể duy trì nhiệt độ từ 25ºC ± 1ºC đến 50ºC ± 1ºC, hoặc tủ thổi không khí.

4.4. Tủ lạnh (dùng để bảo quản môi trường đã chuẩn bị), có thể duy trì nhiệt độ ở 5ºC ± 3ºC.

4.5. Máy đo pH, có độ phân giải 0,01 đơn vị pH, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25ºC.

Máy đo pH có thể được gắn với hệ thống cân bằng nhiệt tự động hoặc bằng tay.

4.6. Ống nghiệm, có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm và 18 mm x 180 mm hoặc 20 mm x 200 mm.

4.7. Pipet xả hết, có dung tích danh định 1 ml và 10 ml, được chia vạch 0,1 ml.

4.8. Vòng lấy mẫu, bằng platin/iridi hoặc niken/crom, đường kính khoảng 3 mm, hoặc các vòng lấy mẫu vô trùng sử dụng một lần dung tích 10 µl.

4.9. Đĩa Petri, đường kính khoảng 90 mm.

5) Lấy mẫu

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này.

6) Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này.

7) Cách tiến hành

7.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Xem các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần xác định.

Pha đủ số lượng các độ pha loãng để đảm bảo rằng tất cả các ống nghiệm ứng với độ pha loãng cuối cùng cho kết quả âm tính.

7.2. Cấy môi trường tăng sinh chọn lọc

7.2.1. Về nguyên tắc chung, theo quy trình cần ba ống cho mỗi độ pha loãng. Đối với động vật nhuyễn thể có vỏ tươi sống hoặc các sản phẩm đặc biệt khác và/hoặc khi yêu cầu độ chính xác cao hơn của kết quả thì cần cấy năm ống cho mỗi độ pha loãng.

7.2.2. Lấy ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép [3.2.1.1 a)]. Dùng pipet vô trùng (4.7) cho vào mỗi ống 10 ml mẫu thử ở dạng lỏng, hoặc 10 ml huyền phù ban đầu trong trường hợp mẫu thử ở dạng khác.

7.2.3. Lấy ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ hơn [3.2.1.1 b)]. Dùng một pipet vô trùng mới (4.7) cho vào mỗi ống 1 ml mẫu thử ở dạng lỏng, hoặc 1 ml huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng đầu tiên) khi mẫu thử ở dạng khác.

7.2.4. Đối với mỗi một dung dịch pha loãng tiếp theo (10 -1 hoặc 10-2 tùy theo mẫu thử), thì tiến hành theo 9.2.3. Sử dụng một pipet vô trùng mới cho mỗi độ pha loãng. Trộn kỹ dịch cấy với môi trường.

7.3. Nuôi ấm

Ủ các ống nghiệm chứa môi trường chọn lọc nồng độ kép đã cấy trong 7.2.2 và các ống chứa môi trường chọn lọc nồng độ đơn đã cấy trong 7.2.3 đến 7.2.4 trong tủ ấm (4.2) ở 37ºC trong 24 h ± 2 h.

7.4. Cấy truyền

Từ mỗi ống đã ủ theo 7.3 cho thấy có axit, có màu vàng, thì cấy truyền một vòng cấy (4.8) vào đĩa thạch trypton mật glucuronid (3.2.2) và ria cấy để thu được các khuẩn lạc tách biệt rõ.

7.5. Ủ lần hai

Ủ các đĩa đã cấy theo 7.4 từ 20 h đến 24 h trong tủ ấm (4.2) ở 44ºC. Không chồng cao quá ba đĩa.

7.6. Kiểm tra các đĩa

Sau thời gian ủ quy định (9.5), kiểm tra các đĩa về sự có mặt các khuẩn lạc có màu tối hoặc màu xanh nhạt hoặc màu xanh da trời, điều này chứng tỏ rằng có mặt Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza.

7.7. Diễn giải kết quả

Các ống chứa môi trường tăng sinh nồng độ đơn hoặc nồng độ kép được ủ theo 9.3, sau khi cấy truyền (7.4) và ủ lần hai (7.5) cho thấy có các khuẩn lạc màu xanh hoặc màu xanh da trời trên môi trường thạch chọn lọc được coi là ống dương tính.

Đếm số ống dương tính đối với mỗi độ pha loãng.

8) Biểu thị kết quả

Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính với mỗi độ pha loãng.

Xem TCVN 6404 (ISO 7218)

9) Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) tất cả các chi tiết về điều kiện thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được, hoặc nếu đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

III. KẾT LUẬN

Một số chỉ tiêu chất lượng nước trái cây có thể thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau, tùy theo điều kiện cơ sở vật chất sẵn có tại phòng thí nghiệm của nhà sản xuất mà người ta lựa chọn phương án phù hợp. Ví dụ chỉ tiêu màu sắc, mùi vị được xếp vào loại các chỉ tiêu cảm quan và thường được thực hiện phân tích bằng các phép thử cảm quan, tuy nhiên nó cũng có thể được phân tích bằng các phương pháp hóa lý hiện đại(máy so màu,...). Để sản phẩm đảm bảo cho sức khỏe mà vẫn đạt được chất lượng tối ưu thì ngoài việc kiểm soát chất lượng từ nguyên liệu đến thành phẩm thì cần nắm vững các quy tắc quy định chung về sản xuất, vệ sinh thực phẩm. Do thời gian có hạn nên việc tìm hiểu các kỹ thuật kiểm soát chất lượng nguyên liệu chưa tốt, nếu có thể thì cần thiết phải tìm hiểu kỹ phần này. Ngoài ra, để có một sản phẩm chất lượng, chiến lược, cạnh tranh trên thị trường đa dạng loại hàng hóa này thì vấn đề bao bì sản phẩm cũng đáng được quan tâm.

Lần đầu tiên thực hiện bài đồ án này nên không tránh khỏi sai sót, kính mong quý

Thầy(cô) và bạn đọc thông cảm, góp ý giúp kiến thức em được hoàn thiện hơn.

Tài liệu tham khảo:

[1]. Lê Văn Việt Mẫn, Công nghệ chế biến thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học Quốc

gia thành phố Hồ Chí Minh, năm 2011.

[2]. Lê Văn Việt Mẫn, Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học

Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, năm 2010.

[3]. Hoàng Minh Châu, Cơ sở hóa học phân tích, Nhà xuất bản khoa học và kỹ

thuật, năm 2002.

[4]. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước-thực phẩm và

mỹ phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, năm 2012.

[5]. QCVN 6-2:2010/BYT, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm đồ uống không cồn, năm 2010.

[6]. TCVN 7946:2008, Tiêu chuẩn quốc gia về nước quả và nectar, năm 2008.

Và một số các tiêu chuẩn Việt Nam được trình bày ở phần Phụ Lục.

Phụ Lục 1

Một số tiêu chuẩn Việt Nam về kiểm soát chất lượng nước trái cây được trích dẫn:

1. QCVN 6-2 : 2010/BYT TCVN 7946 : 2008 2. TCVN 8126 : 2009 3. TCVN 7769 : 2007 4. TCVN 7788 : 2007 5. TCVN 6427-1 : 1998 6. TCVN 6427-2 :1998 7. TCVN 6428 : 2008 8. TCVN 7807 : 2007 9. TCVN 7771 : 2007 10. TCVN 6641 : 2000 11. TCVN 5483 : 2007 12. TCVN 8161 : 2009 13. TCVN 8171-1 : 2009 14. TCVN 4830-1 : 2005 15. TCVN 4830-2 : 2005 16. TCVN 4830-3 : 2005 17. TCVN 4882 : 2007 18. TCVN 4884 : 2005 19. TCVN 4991 : 2005 20. TCVN 6848 : 2007 21. TCVN 7924-1 : 2008 22. TCVN 7924-2 : 2008 23. TCVN 7924-3 : 2008 24. TCVN 3215 : 1979 25. TCVN 3216 : 1994 26. TCVN 4409 :1987 27. 10TCN 711 : 2006 28. 10TCN 712 : 2006 29.

Phụ Lục 2

Một số tiêu chuẩn CODEX và AOAC về kiểm soát chất lượng nước trái cây được trích dẫn:

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. CODEX STAN 247-2005 (bản tiếng Anh và bản dịch tiếng Việt) CODEX STAN 212-1999 (bản tiếng Anh và bản dịch tiếng Việt) AOAC 920_149 (bản tiếng Anh và bản dịch tiếng Việt) AOAC 940_26 (bản tiếng Anh và bản dịch tiếng Việt) AOAC 967_21 (bản tiếng Anh và bản dịch tiếng Việt) AOAC 968_20 (bản tiếng Anh và bản dịch tiếng Việt) AOAC 968_30 (bản tiếng Anh và bản dịch tiếng Việt) AOAC 981_09 (bản tiếng Anh và bản dịch tiếng Việt) AOAC 982_21 (bản tiếng Anh và bản dịch tiếng Việt)

10. AOAC 986_13(bản tiếng Anh và bản dịch tiếng Việt)