intTypePromotion=1
ADSENSE

Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự sinh trưởng và phát triển của lan Oncidium sp. in vitro

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:73

4
lượt xem
0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm nghiên cứu và khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự sinh trưởng và phát triển của lan Oncidium sp. trong nhân giống in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự sinh trưởng và phát triển của lan Oncidium sp. in vitro

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM Ngành : Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phan Quốc Tâm Sinh viên thực hiện : Mai Duy Vinh MSSV: 107111227 Lớp: 07DSH02 TP. Hồ Chí Minh, năm 2012
  2. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm SVTH : Mai Duy Vinh Trang 1
  3. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.1. Sơ lược về hoa lan 1.1.1. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.1.1. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới Hoa lan được mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa, thị trường tiêu thụ hoa lan rộng khắp thế giới, mang lại lợi nhuận kinh tế cao cho nhiều nước. Thị trường tiêu thụ hoa lan của khối châu Âu rất hấp dẫn. Hình 1.1. Giàn treo lan Năm 2006 khối EU có sản lượng xuất khẩu hoa lan trên thế giới đạt 55 tỉ sản phẩm, mang lại giá trị kim ngạch xuất khẩu hoa lan là 73 tỉ EUR. Trong đó, Hà Lan là một quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu, do trồng trong nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm, đồng thời là đầu mối trung gian nhập khẩu hoa lan (37%) từ các nước khác trên thế giới. Năm 2006, Hà Lan xuất khẩu hoa lan chiếm 95% tổng sản lượng hoa lan trong khối EU... Mặc dù khối Châu Âu có sản lượng xuất khẩu hoa lan cao hơn so với các khối khác, nhưng do nhu cầu tiêu thụ lan trong khối EU cao nên trong năm 2006 sản lượng nhập khẩu hoa lan từ các nước lên tới trên 155 tỉ sản phẩm, giá trị kinh ngạch nhập khẩu đạt gần 90 tỉ EUR (International Statistics Flowers and Plants, 2007). Hoa lan hiện nay đang là mặt hàng xuất khẩu chiến lược, mang nguồn lợi kinh tế cho nhiều Quốc gia Châu Á. Thái Lan là nước xuất khẩu chủ yếu là hoa lan nhiệt đới, đặc biệt là Dendrobium, phổ biến nhất là Dendrobium . Sonia và Jumbo White. Ngoài ra cũng còn một số loài nổi tiếng khác như Aranda, Mokara, Oncidium và Vanda. Hơn 80% Dendrobium trên thị trường thế giới là từ Thái Lan. Chỉ với loại hoa lan chủ lực là Dendrobium, Thái Lan đạt doanh thu mỗi năm gần 600 triệu USD từ giá trị xuất khẩu loại hoa này. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 2
  4. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Giá trị xuất khẩu năm 2000 khoảng 1.765 triệu baht. Dendrobium được chọn là sản phẩm vô địch bởi vì sản phẩm của nó xuất khẩu liên tục trong năm. Hiện tại, Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về hoa lan. Nó trở thành niềm kiêu hãnh của người trồng hoa lan ở Thái Lan. Hiện nay Thái Lan có khoảng 24 triệu m2 trang trại trồng hoa lan. Đài loan là nước đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan Hồ Điệp bằng qui trình công nghệ cao, giá trị doanh thu từ xuất khẩu loại hoa này hàng năm khoảng 43 triệu USD. Trên thị trường thế giới, sản phẩm chủ yếu của hoa lan Hồ Điệp là hoa chậu, sản phẩm này có giá trị kinh tế cao gấp nhiều lần so với hoa Hồ Điệp cắt cành. Hàng năm, Đài Loan sản xuất được 36 triệu Phalaenopsis. Trong đó, 12 triệu hoa lan được xuất khẩu ra các nước như: 3 triệu đến Nhật Bản, 3 triệu đến Trung Quốc, 2,5 triệu tới Hoa Kì và 3,5 triệu cho các quốc gia khác. Trong tháng 6 năm 2004, Hoa Kì đã cung cấp giấy phép xuất khẩu Phalaenopsis cho Đài Loan trên thị trường Hoa Kì. 1.1.1.2 . Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam Diện tích trồng hoa ở Việt Nam hiện nay là 2500 ha nhưng hoa lan chỉ chiếm 5 – 6 %. Nước ta bắt đầu sản xuất và thương mại hoa lan tập trung khoảng 6 năm trở lại đây nhưng tốc độ phát triển khá nhanh. Chỉ riêng Tp.HCM diện tích vườn lan lên tới 80 ha, hoa lan đang mang lại thu nhập cao cho nhiều nông dân. Tuy nhiên, do cây giống trong nước không đủ cung cấp cho sản xuất, các nhà vườn nhập cây giống ồ ạt từ nước ngoài như Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc (Báo cáo điều tra thống kê của Sở NN&PTNT Tp.HCM, 2008). Theo thống kê của Sở NN & PTNT Tp.HCM trong năm 2003 doanh số kinh doanh hoa lan cây kiểng chỉ đạt 200 - 300 tỉ đồng nhưng đến năm 2005 đã tăng đến 600 - 700 tỉ đồng. Theo TS. Dương Hoa Xô – Trung tâm Công nghệ sinh học, đến nay đã hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho 7 nhóm giống hoa lan, có khả năng cung cấp 200.000 cây con hoa lan nuôi cấy mô thuộc các nhóm Mokara, Dendrobium, SVTH : Mai Duy Vinh Trang 3
  5. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Phaleanopsis, Catlleya. Năm 2007, đã cung cấp cho các nhà vườn khoảng 50.000 cây hoa lan nuôi cấy mô các loại. Năm 2008, sản xuất 100.000 cây giống hoa lan cấy mô, tập trung cho nhóm hoa lan cắt cành Mokara, Dendrobium và một số giống lan rừng quý. Đến 2009, chiếm lĩnh thị trường hoa Tết là những loại hoa mới là và cao cấp như tiểu quỳnh, lily, tulip, địa lan, hồ điệp… nhân giống bằng công nghệ in vitro. Hiện nay, rất nhiều loại hoa đã được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô tại Việt Nam, như lan Dendrobium, phalaenopsis, vanda, catlleya, Oncidium, vạn thọ Pháp, cúc Đài Loan, hoa salem, cẩm chướng, hoàng thảo, hoa đồng tiền nhập nội (các giống Tamara, Banesa, Caliente…). Thị trường tiêu thụ hoa trong nước ngày càng mở rộng, mỗi năm tiêu thụ hàng triệu cây hoa các loại, riêng hoa lan cũng gần 2 triệu cây. Đặc biệt Đà Lạt là nơi sản xuất hoa lan sớm nhất cả nước với nguồn cây giống phong phú săn tìm trong rừng sâu. Lâm Đồng dẫn đầu cả nước về nguồn lợi lan rừng với 101 chi và 396 loài, chiếm 55,3 % về chi và 76,5 % về loài lan rừng của Việt Nam. Không ít loài lan được phát hiện lần đầu tiên trên thế giới mang tên Đà Lạt, 10/12 loài lan quý của Việt Nam phân bố ở vùng rừng Lâm Đồng. Những năm sau 1980, Đà Lạt đã xuất khẩu số lượng lớn cành hoa sang các nước Đông Âu. Những năm gần đây, ngành sản xuất hoa lan ở Đà Lạt đã hồi sinh và phát triển mạnh mẽ nhờ ứng dụng kĩ thuật công nghệ cao và sản xuất. Với công nghệ hiện đại, đã giúp làm giảm chi phí trồng từ 40.000 - 70.00 đồng/gốc lan trước đây, xuống chỉ còn 4.000 - 7.000 đồng/gốc. Sử dụng công nghệ nuôi cấy mô, và đặc biệt bằng phương pháp gây vết thương kết hợp nuôi cấy lỏng. PGS.TS. Dương Tấn Nhựt và cộng sự ở Viện Sinh học Tây Nguyên đã nhân giống thành công Hồng hài - loài lan hài duy nhất trên thế giới có hương thơm, được Tổ chức Bảo vệ động thực vật hoang dã thế giới đưa vào danh mục thực vật cần bảo vệ bởi chỉ phân bố hẹp ở Việt Nam, khó sống, khó sinh sản. Theo PGS. TS.Dương Tấn Nhựt, thành phố Đà Lạt là cỗ máy điều hòa khổng lồ cho phép sản xuất địa lan trong tự nhiên theo hướng công nghiệp với chi phí sản SVTH : Mai Duy Vinh Trang 4
  6. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm xuất chỉ bằng 1/10 so với các quốc gia phải trồng lan trong nhà kính, có hệ thống điều hòa nhiệt độ. Lan Đà Lạt đã và đang mở rộng thị trường ra nhiều châu lục, trong đó có những thị trường khó tính như Mĩ, Nhật Bản, Đài Loan… Nhiều doanh nghiệp trong và ngoài nước đang tiến hành khảo sát lập trang trại sản xuất hoa lan quy mô lớn bởi tiềm năng, triển vọng đầu tư tại Đà Lạt là rất lớn so với Trung Quốc và các nước ASEAN khác. 1.1.2. Sơ lược về lan Oncidium Lan Vũ Nữ (Oncidium) là một loại lan gồm khoảng chừng 600 giống phân bố rộng rãi ở Nam Mỹ, với hình dạng và màu sắc hoa rất đẹp và đa dạng. Loại lan này có những củ bẹ to hoặc nhỏ, phía trên có 1 hoặc 2 lá. Hình 1.2. Lan vũ nữ đỏ Tùy theo từng giống, có loài có lá dầy và cứng, có loài dài và mềm. Dò hoa có loài dài như Onc. falcipetalum, Onc. carthagenense, Onc. divaricatum v.v… và cũng có những dò hoa ngắn như Onc. cheirophorum. Mỗi dò mang từ 30 đến 100 hoa và có nhiều giống hoa lớn đến 4-5 cm. Oncidium là giống Lan thích nghi được với biên độ sinh thái khá rộng, nhiệt độ thích hợp là từ 20 – 25 oC. 1.1.2.1. Phân loại Vị trí phân loại: Lan Oncidium thuộc: Giới : Phantae (Thực vật) Ngành : Angiospermatophyta (Hạt kín) Lớp : Monodicotyledonae (cây một lá mầm) Bộ : Asparagales Họ : Orchidaceae SVTH : Mai Duy Vinh Trang 5
  7. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Chi : Oncidium Loài : Oncidium sp. 1.1.2.2 Đặc điểm hình thái của lan Oncidium Oncidium có khoảng 750 loài phân bố rộng rãi nên đặc điểm hình thái đa dạng, với sự phân bố rộng rãi như vậy nên hoa của các loài lan thuộc giống Oncidium thường có nhiều màu sắc khác nhau. * Rễ Lan Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Oncidium phù hợp với nhiều điều kiện sống: rễ mảnh mai, thân rễ bò dài hay ngắn khi sống ở đất. Hình 1.3. Oncidium Red Thông thường rễ thường mọc dưới các nách lá cuối cùng đâm sâu xuống đất hay giá thể. Một vài loài Oncidium: Oncidium sphacelatum rễ mọc thành đám rối dày đặc . * Thân lan Oncidium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục). Thân lan có thể ngắn hay kéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá. Ở nhóm đa thân thì cây vừa có thân vừa có giả hành. Giả hành là nơi dự trữ chất dinh dưỡng và nước để nuôi cây. * Giả hành Giả hành là những đoạn phình, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cấy trong điều kiện khô SVTH : Mai Duy Vinh Trang 6
  8. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm hạn khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được, giả hành có nhiều hình dạng như: hình cầu, thuôn dài, hình trụ xếp chồng lên nhau * Lá Hình dạng và cấu trúc lá rất da dạng, lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng, dạng lá mềm mại, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vị trí sống của cây. Các lá mọc song song nhau và ôm lấy thân giả. * Hoa Hoa có vòng bao quanh và ba mảnh bao gồm ba cánh đài và ba cánh tràng. Ba cánh đài thường có dạng ba cánh hoa giống nhau hay cánh đài lưng dài hơn cánh đài bên. Các cánh đài dựng đứng hay trải ra. Ba cánh tràng có hai cánh bên rất giống với cánh đài, rời hay dính với cánh đài bên, cánh tràng giữa còn được gọi là cánh môi, có màu sắc biến đổi sặc sỡ, hấp dẫn côn trùng giúp hoa thụ phấn. Sự đa dạng về màu sắc và hình dạng có sự đóng góp của cánh môi rất lớn. Cánh môi có các dạng như nguyên chia thuỳ, khía răng, có tua viền hay chia thành các sợi mảnh. Những bông hoa của giống Oncidium có sắc thái của màu vàng với đốm nâu, có thể rất dài. Các cánh hoa thường xù trên các cạnh, như là môi . Môi là rất lớn, một phần ngăn chặn các cánh hoa và đài hoa nhỏ Một số hoa lan Oncidium là rất dài: Oncidum altissimum và của Oncidium baueri có thể phát triển lên một tầm cao 5 m, trong khi sarcodes Oncidum có thể đạt tới 3 m. * Trái Họ Orchidaceae đều có quả thuộc loại quả nang. Khi hạt chín, các nang bung ra chỉ còn đính lại với nhau ở đỉnh và gốc. Ở một số loài, khi quả chín không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi vỏ khi quả bị mục nát. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 7
  9. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm * Hạt Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt. Đôi khi đến 3 triệu hạt nên hạt có kích thước rất nhỏ (trước đây phong lan còn được xem là họ tử vi – microspermeae) nên phôi hạt chưa phân hoá. Sau 8 - 12 tháng, hạt chín và phát tán nhờ gió. Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp, hạt nảy mầm. 1.1.3. Đặc điểm sinh thái của lan Oncidium 1.1.3.1. Ánh sáng Oncidium là loài ưa ánh sáng nhưng không chịu được ánh sáng trực tiếp, những giống này có thể trồng dưới ánh đèn được. Những giống lá to và dày cần nhiều ánh sáng hơn là những giống lá nhỏ và mềm. Cường độ ánh sáng khoảng 50%. Ánh sáng yếu hơn cây vẫn phát triển tốt như thân, lá xanh đẹp, tuy nhiên cho hoa kém. Để cây ra hoa tốt cần 70% ánh sáng. 1.1.3.2. Nhiệt độ Về nhiệt độ thì cây phát triển rất tốt ở nhiệt độ 15 – 35oC đây là khoảng nhiệt độ trung bình và ấm, nếu giảm nhiệt độ xuống dưới 15oC một vài giờ cây không chết nhưng kéo dài cây sẽ không ra hoa, nếu nhiệt độ tăng quá cao cần tăng độ ẩm và tích cực thông thoáng gió. 1.1.3.3. Ẩm độ Cần ẩm độ trung bình 50 - 70%. Oncidium là cây cần ẩm độ cao, đặc biệt trong thời kỳ tăng vì vậy trong suốt mùa sinh trưởng cây cần được tưới 3 lần/ngày vào mùa khô, 2 lần/ngày trong mùa mưa. Mùa nghỉ (sau khi trổ hoa) chỉ cần tưới nước cho cây một lần/ngày để duy trì sự sống. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 8
  10. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.1.3.4. pH môi trường Độ PH của môi trường thích hợp cho mô phát triển, trong khoảng 4,8 - 5,5, thông thường biên độ pH trong khoảng 5 - 5,2 là tốt nhất. 1.1.3.5. Nước Nước rất quan trọng cho cây để tăng trưởng. Nếu thiếu nước cây sẽ không phát triển và có thể bị chết khô. Nhìn thấy thân cây hay lá cây bị nhăn nheo, là cây thiếu nước. Còn quá nhiều nước cây bị úng, thối rễ, là điều kiện tốt cho vi khuẩn, nấm xâm nhập làm cây chết. Nước giúp duy trì độ ẩm trong giai đoạn tăng trưởng. Nếu giữ khô ráo giữa các lần tưới nước sau giai đoạn tăng trưởng sẽ làm cây cứng cáp hơn. Chế độ nước tưới cần cung cấp cho cây là khoảng 2 - 3 ngày tưới một lần tùy thuộc vào điều kiện thời tiết từng ngày, từng mùa trong năm. Vào mùa đông trời rét cần giảm số lần tưới nước, nước tưới cũng cần phải sạch sẽ tránh nguồn nước ô nhiễm sẽ làm chết cây. 1.1.3.6. Giá thể Giá thể dùng trồng lan phải xốp, thoáng khí và không giữ nước quá lâu. Có thể sử dụng một loại giá thể hoăc trộn các giá thể với nhau như vỏ cây khô, đá núi lửa, xơ dừa hoặc đá. Để trồng lan Oncidium cần ẩm nhưng thoát nước tốt như than hoặc xơ dừa. 1.1.3.7. Phân bón Trong quá trình chăm sóc hoa cần bón phân cho hoa với các loại phân bón chủ yếu là: phân 20-20-20 và phân 30-10-10 và có thể phun một số loại phân bón lá hay chất kích thích sinh trưởng để điều khiển ra hoa. Vì cây có giả hành có khả năng dự trữ dinh dưỡng để nuôi cây. Có thể bón phân mỗi tuần 2 lần, cần tăng cường phân Kali. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 9
  11. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.1.3.8. Phòng trừ sâu bệnh hại Sâu bệnh hại chủ yếu trên nhóm lan vũ nữ: - Ốc: Phòng trừ bằng cách sử dụng Deadline 40 (nồng độ theo khuyến cáo), Dioto. - Bệnh thối mềm vi khuẩn: do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra. Vết bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều rộng của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám, sử dụng 1 trong 3 hỗn hợp: Saipan + Mexyl.MZ, Saipan + Alpine, Mexyl.MZ + Alpine. Tóm lại: Việc nuôi trồng và chăm sóc hoa lan không thể bỏ qua giai đoạn thay chậu. thường thay chậu vào mùa xuân khi cây còn non đã mọc được khoảng một gang tay đây là giai đoạn thay chậu tốt nhất, dùng vỏ cây loại nhỏ cho các giống cây có rễ nhỏ và những giống có rễ lớn dùng vỏ cây loại trung bình, nén chặt vỏ cây vào chậu trồng sao cho cây đứng thẳng, vững giữ độ ẩm cao và ngừng tưới nước đến khi cây ra rễ, một số loài lá cứng, dầy như Oncidium mule ears hay Oncidium amplitum…vv có thể buộc chặt chúng vào các vỏ cây và thân cây, sau một thời gian chúng bám vào thân cây và hút chất dinh dưỡng từ đó. Đối với loài lan vũ nữ hoa có thể nở vào tất cả các mùa trong năm, chúng ưa bóng mát nên tránh để ngoài trời. Công việc tưới phân và tưới nước phải được tiến hành vào buổi sáng sớm hoặc chiều mát nên tưới nước trước khoảng 15 phút sau đó mới tưới phân để cây hấp thụ tốt. Tưới đúng liều lượng nếu không cây sẽ chết hoặc rụng lá. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 10
  12. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.2. Nhân giống vô tính in vitro 1.2.1. Khái niệm Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng (Dương Công Kiên, 2003). Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường. Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ. Trước kia người ta thường dùng phương pháp nuôi cấy tế bào và mô thực vật để nghiên cứu về đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền và tác dụng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy (Dương Công Kiên, 2003). Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã hướng về những ứng dụng thực tiễn, vì nó liên hệ mật thiết với các giống cây trồng. 1.2.2. Lịch sử Những mốc chính trong lịch sử phát triển của công nghệ tế bào thực vật: - 1665, Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào. - 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào. - 1902, Haberlandt lần đầu thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm trong ống nghiệm nhưng không thành công. - 1922, Kotte (học trò của Haberlandt) và Robbins đã thành công trong việc lặp lại thí nghiệm của Haberlandt. - 1926, FW Went chứng minh trong lá bao mầm của lúa mạch có mặt các chất sinh trưởng. - 1934, White thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong thời gian dài. Kogl F và cộng sự xác định loại hormone thực vật đầu tiên là IAA. - 1939, Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng ở cà rốt và cây thuốc lá. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 11
  13. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm - 1940, Gautheret nghiên cứu sự hình thành chồi bất định trong nuôi cấy mô tế bào thượng tầng cây Ulmus. - 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cà rốt. Sau chiến tranh thế giới thứ hai, lĩnh vực này phát triển nhanh và nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng trong nông nghiệp được công bố. 1.2.3.Ưu điểm và hạn chế của vi nhân giống 1.2.3.1. Ưu điểm - Nâng cao chất lượng cây giống: loại trừ virus, nấm. Cây giống sạch bệnh được tạo ra thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc. - Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: từ một cây ưu việt bất kì đều có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền. - Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và các cơ quan khác nhau của cây như trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, chồi phát hoa… mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được. - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao, sản xuất được số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu cho những người trồng thương mại. Từ một cây trong vòng 2 - 3 năm có thể tạo thành hàng triệu cây. - Sản phẩm cây đồng nhất: vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp. - Tạo được dòng toàn cây cái (cây chà là) hay toàn cây đực (cây măng tây) theo mong muốn. - Tiết kiệm thời gian: mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống. - Dễ dàng vận chuyển. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 12
  14. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm - Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh, không phụ thuộc mùa vụ. Vì nhân giống được xem là công cụ tối ưu phục vụ cho công nghệ di truyền. Giảm được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu dự trữ lâu dài và chiếm ít không gian so với phương pháp nhân giống truyền thống. 1.2.3.2. Hạn chế - Hạn chế về chủng loại sản phẩm: nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm chưa được nhân nhanh. - Chi phí sản xuất cao, đòi hỏi trình độ khoa học kĩ thuật cao, chi phí cho công nhân thường chiếm khoảng 60% hoặc cao hơn trên tổng giá trị toàn sản phẩm. - Giá thành cao, cao hơn so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép, nhân giống bằng hạt… nên thường khó áp dụng để thương mại hóa. - Hiện tượng biến đổi kiểu hình: do hiện tượng biến dị tế bào soma. Tỉ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. - Quá trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm. 1.2.4. Các bước trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng - Tạo thể nhân giống in vitro - Nhân giống in vitro - Tái sinh thành cây hoàn chỉnh in vitro - Chuyển cây ra vườn ươm để thuần hóa - Nhân giống in vitro - Tạo cây con bầu đất - Đưa các cây ra đồng ruộng - Chọn lọc cây đầu dòng SVTH : Mai Duy Vinh Trang 13
  15. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm ♦ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Hình 1.4. Sơ đồ lát cắt dọc đỉnh sinh trưởng chồi lan Mẫu được nuôi cấy thường còn ở giai đoạn non, quá trình phân chia và phân hóa mạnh. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng. Ngoài ra, chồi đỉnh và chồi non của hạt mới nảy mầm cũng được sử dụng. Đỉnh sinh trưởng nhỏ được tách bằng kính lúp. Môi trường được sử dụng rộng rãi trong nhân giống hiện nay là môi trường MS. Đối với mẫu dễ bị hóa nâu môi trường thường được bổ sung than hoạt tính hay ngâm mẫu với hỗn hợp ascorbic acid và citric acid (25 - 150 mg/l). ♦ Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi (multiple shoot) và thể cắt (cutting) đốt ngoài ra còn có thể giò (protocorm). Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên có những cây trồng không có khả năng nhân giống người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo. Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sung Cytokinin, Auxin, GA3 và các chất hữu cơ khác. ♦ Nhân giống in vitro Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu SVTH : Mai Duy Vinh Trang 14
  16. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nuôi cấy kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh chóng. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn. ♦ Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra ngoài môi trường bên ngoài. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy ngoài tự nhiên, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Thường dung các chất thuộc nhóm auxin kích thích ra rễ. ♦ Chuyển cây in vitro ra vườn ươm Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ. Khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn, cây con dễ bị mất nước, mau bị héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, độ ẩm cao… Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm. Trong những ngày đầu cần được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước. Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện. Cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ. ♦ Nhân giống in vitro Cây con sau khi được chuyển ra luống ươm hay cấy vào bầu đất sau 7 - 10 ngày thì bắt đầu ra rễ. Sau đó được phun dinh dưỡng với hỗn hợp N, P, K (1g/l cho mỗi loại). Tuy nhiên do quá trình nhân giống in vitro có nhiều tốn kém thì cây con được sử dụng như là cây mẹ và được tiếp tục nhân giống trên luống ươm. Điều kiện nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng thái bằng cách điều kiện khống chế bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp… Hệ số nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng SVTH : Mai Duy Vinh Trang 15
  17. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm thái cân bằng, khống chế bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp… Hệ số nhân giống trên luống ươm càng cao giúp cho việc giảm giá thành càng có ý nghĩa. ♦ Cây con bầu đất Cây con từ ống nghiệm hay được nhân giống trên luống ươm được cấy trên luống đất 15 - 20 ngày cho cây ra rễ và phát triển khỏe, sau đó được cấy vào bầu đất (cây chuối). Bầu đất có cơ chất xốp đầy đủ chất dinh dưỡng tỉ lệ đất/phân là 1/1, ngoài ra hàng tuần được phun dinh dưỡng khoáng 1 - 2 lần/tuần thường dùng phân khoáng có tỉ lệ N - P - K: 20-20-20. Thời gian cây con ở giai đoạn bầu đất phụ thuộc đặc điểm cây trồng khoảng 20 ngày (khoai tây) đến 2,5 tháng (cây chuối). Cây bầu đất được đặt ở nơi có nhiều ánh sáng, độ ẩm cao, nhiệt độ không khí mát để cây phát triển nhanh và khỏe. ♦ Chọn lọc cây đầu dòng Là vấn đề quan trọng đối với cây ăn trái nhằm tạo ra một quần thể đồng đều có năng suất cao và ổn định. Những cây được chọn đầu dòng được đưa vào nhân giống trở lại bằng nuôi cấy mô. Hiện tại công nghiệp nhân giống được ứng dụng nhiều trong kinh tế để giải quyết nhu cầu về giống cho sản xuất, giống cho cây lâm nghiệp, trồng rừng, rau, ngũ cốc, cây ăn trái, hoa và cây dược liệu. 1.2.5. Các phương pháp nhân giống in vitro - Gieo hạt in vitro - Nhân giống bằng chồi nách - Nhân giống bằng chồi đỉnh - Nhân giống bằng chồi bất định - Nhân giống qua nuôi cấy mô sẹo - Nhân giống bằng các đoạn giả hành - Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn - Nuôi cấy tế bào trần (protoplast) SVTH : Mai Duy Vinh Trang 16
  18. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật 1.2.6.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy - Kiểu di truyền - Tuổi của cây - Tuổi của mô và cơ quan - Tình trạng sinh lí - Vị trí của mẫu cấy trên cây - Kích thước mẫu cấy - Vết thương - Phương pháp cấy Không có hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy. Về nguyên tắc, trừ những mô cấy đã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể làm mô cấy. Tuy nhiên, có thể nhận xét chung là các mô đang phát triển, thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh... khi đặt vào môi trường có chứa một lượng chất sinh trưởng thích hợp đều có khả năng phân chia và phân hóa. Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, trước tiên phải chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn. Tuy mang một lượng thông tin di truyền như nhau, các mô khác nhau trên cùng một cây có thể sinh trưởng và phát triển với khả năng tái sinh chồi, rễ hay cây hoàn chỉnh rất khác nhau. Vì vậy, khi khởi sự chọn giống, nhân giống một cây cụ thể bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật, trước hết cần thí nghiệm tìm hiểu phản ứng của các bộ phận khác nhau của cây trong nuôi cấy ở các nồng độ chất sinh trưởng khác nhau. Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng ổn định. Tùy vào các mục đích nghiên cứu mà có các chế độ chiếu sáng khác nhau, chẳng hạn quá trình tạo callus có thể cần bóng tối hoặc chiếu sáng nhưng quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết cần ánh sáng. Nhiệt độ phòng nuôi nên giữ ổn định bằng máy điều hòa nhiệt độ. Cường độ chiếu sáng khoảng 2000 - 3000 lux. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 17
  19. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm ♦ Một số điểm cần lưu ý - Các dụng cụ dùng cho thí nghiệm nuôi cấy mô sau khi tiệt trùng ở nồi khử trùng đều phải được tiệt trùng sau mỗi lần dùng đến bằng cách nhúng vào cồn 90o rồi hơ trên ngọn lửa đèn cồn. - Trước khi cấy, phải vệ sinh toàn bộ khu vực cấy bằng cồn 70o. - Nên để số mẫu cấy trong đĩa petri từ 4 - 5 mẫu, tránh để nhiều không kịp cấy sẽ bị khô. - Cồn dùng để đốt dụng cụ phải được thay sau mỗi đợt cấy. 1.2.6.2. Ảnh hưởng của môi trường Khi bắt đầu nuôi cấy mô và tế bào một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỉ lệ các chất dinh dưỡng. Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, xem các tác giả nuôi cấy mô trên cùng đối tượng ấy hoặc các đối tượng gần gũi về mặt phân loại đã dùng môi trường gì. Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường của các tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp. Trong hàng trăm môi trường do nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, nhiều mục đích khác nhau, có thể chia ra làm 3 loại: - Môi trường nghèo dinh dưỡng: Môi trường White, Knop, Knudson C. - Môi trường trung bình: Môi trường B5 của Gamborg. - Môi trường giàu dinh dưỡng: Môi trường Murashige và Linsmaier - Skoog. Vì vậy, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có tài liệu trước thì nên thăm dò so sánh ba loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu thích hợp với môi trường nào nhất. Hiện nay, môi trường MS được coi là môi trường thích hợp với nhiều loại cây. Vì vậy, người mới bắt đầu nuôi cấy thường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm ra được môi trường riêng của mình. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 18
  20. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.2.6.3. Đảm bảo điều kiện vô trùng ♦ Vô trùng mô nuôi cấy Mô nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn sào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân củ… Tùy theo sự tiếp xúc với điều kiện bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay nhiều vi khuẩn và nấm. Hầu như không thể vô trùng mô nuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong chứ không hạn chế ở bề mặt. Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các hóa chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lí, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẻ ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lí mô nuôi cấy trong vòng 30 giây trong cồn 70o sau đó mới xử lí trong dung dịch diệt khuẩn. Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để và có ảnh hưởng xấu ngay lên sự sinh trưởng của mô cấy. Trong thời gian xử lí, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận thực vật có nhiều bụi đất, trước khi xử lí nên rửa kĩ bằng xà phòng dưới dòng nước chảy. Khi xử lí xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3 - 5 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu. Tuy nhiên nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử, chắc sẽ đạt kết quả. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 19
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2