Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết củ cải trắng (Raphanus sativus L.)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU

VIỆN KỸ THUẬT - KINH TẾ BIỂN

B A R IA V U N G T A U UNIVERSITY

CAP Sa in t ia c q u e s

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

TỪ DỊCH CHIẾT CỦ CẢI TRẮNG

(Raphanus sativus L.)

: Th.s Phạm Thị Kim Ngọc Giáo viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện : Bùi Thị Hồng Loan

: DH13TP Lớp

Ngành : Công Nghệ Thực Phẩm

Vũng Tàu, 06/2017

VIỆN KỸ THUẬT - KINH TẾ BIỂN

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Họ và Tên: Bùi Thị Hồng Loan MSSV: 13030375

Lớp: DH13TP Ngành: Công nghệ Thực phẩm

Trình Độ Đào Tạo : Đại Học

Hệ Đào Tạo: Đại học chính quy

1. Tên đề tài: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng

(Raphanus sativus L.)

2. Ngày giao nhiệm vụ: 06/02/2016

3. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 10/06/2017

4. Họ và tên người hướng dẫn: Th.S Phạm Thị Kim Ngọc

Bà Rịa-Vũng Tàu, ngày 26 tháng 6 năm 2017

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

TRƯỞNG BỘ MÔN TRƯỞNG KHOA

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

Tôi cam đoan rằng tất cả những kết quả nghiên cứu được nêu trong đồ án này là

do tôi thực hiện, các ý tưởng tham khảo và những kết quả trích dẫn từ các công trình

khác đều được nêu rõ trong đồ án.

Vũng Tàu, năm 2017

Sinh viên thực hiện

Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học cho đến nay,

em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý thầy cô Trường Đại học Bà

Rịa Vũng Tàu, gia đình và bạn bè.

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu, quý

thầy cô trong ngành Công nghệ Thực phẩm - những người đã trực tiếp giảng dạy,

truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em, đó chính là những nền tảng cơ bản, là

những hành trang vô cùng quý giá để em có thể bước vào sự nghiệp trong tương lai.

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Phạm Thị Kim Ngọc. Cảm ơn cô đã

tận tình quan tâm, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án, đã giải đáp những

thắc mắc trong quá trình nghiên cứu.

Trong quá trình thực hiện đồ án này vì kiến thức thực tế em còn hạn chế và thời

gian thực hiện không nhiều nên sẽ không tránh khỏi sai sót. Kính mong nhận được sự

đóng góp ý kiến và nhận xét của quý thầy cô, các bạn để em có thể rút kinh nghiệm và

hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!

LỜI CAM ĐOAN.............................................................................................................

LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................

MỤC LỤC.......................................................................................................................I

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT........................................................................................ iii

DANH MỤC BẢNG..................................................................................................... iv

DANH MỤC HÌNH....................................................................................................... v

BẢNG PHỤ LỤC.......................................................................................................... vi

ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 2

1.1. Tổng quan về củ cải trắng...................................................................................... 2

1.1.1. Đặc điểm của cây và củ cải trắng.....................................................................2

1.1.2. Thành phần hóa học của củ cải trắng...............................................................3

1.1.2.1. Thành phần hóa học cơ bản.......................................................................3

1.1.2.2. Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng....................................................5

1.2.2.3. Tác dụng sinh học của củ cải trắng...........................................................6

1.2. Giới thiệu chung về khuẩn....................................................................................... 8

1.2.1. Bacillus cereus.................................................................................................. 8

1.2.2. Pseudomonas aeruginosa................................................................................10

1.2.3. Salmonella typhi..............................................................................................11

1.2.4. Staphylococcus aureus....................................................................................13

1.3. Giới thiệu chung về nấm mốc................................................................................14

1.3.1. Nấm mốc Aspergillus flavus............................................................................14

1.3.1.1. Phân loại [47]...........................................................................................14

1.3. L2. Đặc điểm của nấm Aspergillus flavus [43]..................................... 15

1.3.1.3. Hình thức sinh sản [43]...........................................................................16

1.3.1.4. Một số bệnh lý do nấm mốc Aspergillus flavus gây ra [43]....................16

1.3.2. Nấm mốc Fusarium solani [8]........................................................................17

1.3.2.1. Phân loại...................................................................................................17

1.3.2.2. Đặc điểm của nấm Fusarium solani [41]................................................17

1.3.2.3. Hình thức sinh sản....................................................................................18

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT

1.3.2.4. Một số bệnh lý do nấm mốc F. solani................................................... 19

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................20

2.1 Phương tiện nghiên cứu..........................................................................................20

2.1.1. Thời gian và địa điểm.....................................................................................20

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu.....................................................................................20

2.1.3. Phạm vi nghiên cứu........................................................................................20

2.1.4. Hóa chất sử dụng............................................................................................20

2.1.5. Thiết bị - Dụng cụ........................................................................................... 20

2.2.Nội dung và phương pháp nghiên cứu...................................................................21

2.2.1. Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 21

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 21

2.2.2.1. Phương pháp định tính các thành phần trong cao chiết...........................21

2.2.2.2. Chuẩn bị giống........................................................................................ 23

2.2.2.3. Chuẩn bị pha cao củ cải ở các nồng độ khác nhau..................................24

2.2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng...................................................24

2.2.2.5. Xử lý số liệu............................................................................................ 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 27

3.1. Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao củ cải trắng..................................27

3.2. Kết quả kháng khuẩn và nấm mốc của cao củ cải trắng........................................30

3.3.1. Kết quả kháng khuẩn...................................................................................... 30

3.3.2. Kết quả kháng nấm mốc................................................................................. 33

3.4. Bàn luận................................................................................................................35

KẾT LUẬN.................................................................................................................. 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................ 40

PHỤ LỤC..................................................................................................................... 45

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DMSO: Dimethyl sulfoxide - Hợp chất hữu cơ lưu huỳnh với công thức

(CH3)2SO

Rs-AFP1, Rs-AFP2 (Raphanus sativus antifungal peptide 1): peptide giàu

cysteine có khả năng ức chế sự phát triển của nấm.

MR: Methyl Red - Thử nghiệm Methyl Red

VP: Voges Proskauer - Thử nghiệm Voges Proskauer

MHA: Mueller Hinton Agar - Môi trường thạch Mueller Hinton

MIC: Minimal Inhibitory Concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu

TSB: Tryptone Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB

SDA: Sabouraud Dextrose Agar Môi trường dinh dương SDA

PDA: Potato Dextrose Agar Môi trường dinh dưỡng PDA

DNA: Acid deoxyribonucleic - Phân tử mang thông tin di truyền mã hóa cho

hoạt động sinh trưởng, phát triển, chuyên hóa chức năng và sinh sản của các sinh vật

và nhiều loài virus

RNA: Acid ribonucleic

rpm: tốc độ vòng/ phút

Am: thuốc kháng sinh Amipicillin

Ge: thuốc kháng sinh Gentamycin

Te: thuốc kháng sinh Tetracycline

Ter: thuốc kháng sinh Terbinafine

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong 100g củ cải trắng tươi..........................................4

Bảng 3.1. Kết quả định tính các hợp chất có trong mẫu cao củ cải trắng....................27

Bảng 3.2. Đường kính vòng kháng khuẩn của cao củ cải trắng (mm).........................30

Bảng 3.3. Đường kính vòng kháng nấm của cao củ cải trắng (mm)............................34

Hình 1.1. Cây và củ cải trắng.........................................................................................2

Hình 1.2. Hoa, lá và quả của cây cải c ủ ......................................................................... 3

Hình 1.3. Vi khuẩn B. cereus sau khi nhuộm Gram và khuẩn lạc trên môi trường thạch

TSB................................................................................................................................. 9

Hình 1.4. Vi khuẩn P. aeruginosa khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên

môi trường thạch TSB...................................................................................................11

Hình 1.5. Vi khuẩn S. typhi khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi

trường thạch TSB..........................................................................................................12

Hình 1.6. Vi khuẩn S. aureus khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi

trường thạch TSB..........................................................................................................14

Hình 1.7. Aspergillus flavus..........................................................................................15

Hình 1.8. Fusarium solani.............................................................................................17

Hình 1.9. Loài F. solani: A-B: đại bào tử; C-D: tiểu bào tử; E-G: bào tử đính trên môi

trường (Dương Minh,2010)...........................................................................................18

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu.......................................................................................... 21

Hình 2.2. Mô tả cách đo vòng tròn kháng khuẩn (Hudzicki, 2009)............................. 25

Hình 3.1. Khả năng kháng B. cereus của cao củ cải trắng........................................... 32

Hình 3.2. Khả năng kháng P. aeruginosa của cao củ cải trắng.................................... 33

Hình 3.3. Khả năng kháng S. aureus của cao củ cải trắng........................................... 33

Hình 3.4. Khả năng kháng S. typhi của cao củ cải trắng.............................................. 33

Hình 3.5. Khả năng kháng A. flavus của cao củ cải trắng............................................ 34

Hình 3.6. Khả năng kháng F. solani của cao củ cải trắng............................................ 34

Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện khả năng kháng khuẩn của cao củ cải trắng từ 4 chủng vi

khuẩn và nấm mốc khác nhau...................................................................................... 35

BẢNG PHỤ LỤC

Phụ lục A. Môi trường và kháng sinh...................................................................... 45

Phụ lục B. Kết quả nhuộm Gram của 4 chủng vi khuẩn khảo sát............................. 46

Phụ lục C. Đếm bào tử nấm mốc trên kính hiển v i..................................................46

Phụ lục D. Cao thành phẩm...................................................................................... 47

Phụ lục E. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số

liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Bacillus cereus....................................... 47

Phụ lục F. Phụ lục F. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ

cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Pseudomonas aeruginosa........49

Phụ lục G. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số

liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Staphylcoccus aureus............................. 51

Phụ lục H. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số

liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Salmonella Typhi....................................53

Phụ lục I. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu

thô đường kính vòng kháng nấm mốc trên A. flavus....................................................55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Củ cải trắng có tên khoa học là Raphanus sativus L., thuộc họ cải Brassicaceae,

là cây trồng hàng năm, dùng như một loại rau ăn củ ở Việt Nam và nhiều nước trên thế

giới.

Theo các tài liệu y học cổ truyền, củ cải trắng có vị ngọt hơi cay, đắng, tính bình,

không độc, có tác dụng long đờm, trừ viêm... được dùng trong chữa trị khá nhiều bệnh

đường hô hấp, ung thư, bệnh đường tiêu hóa. Ở nước ta, củ cải trắng là một loại rau củ

phổ biến, rẻ tiền, được trồng và sử dụng nhiều.

Một số nghiên cứu khoa học công bố gần đây ở nước ngoài cho thấy dịch chiết từ

củ cải trắng trồng ở 1 số nước khác nhau có khả năng khử các gốc tự do, làm giảm các

quá trình oxi hóa, vốn là nguyên nhân sâu xa gây ra nhiều loại bệnh tật ở người. Hoạt

tính kháng khuẩn của củ cải trắng cũng được đánh giá cao. Nước ép và dịch trích ly từ

củ cải trắng bằng các dung môi khác nhau (nước, methanol, etahnol, ethyl acetate, este

dầu hỏa) đã được xác định là có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn

và nấm mốc khác nhau. Tuy nhiên, hoạt tính của dịch chiết phụ thuộc vào giống và

đặc điểm nguồn gốc, điều kiện địa lý của vùng trồng.

Đó là lý do chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Khảo sát hoạt tính kháng

khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng (Raphanus sativus L.). Trong nghiên cứu này

của chúng tôi đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết thô của củ cải

trắng (Raphanus sativus L.) thu hái tại huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về củ cải trắng

1.1.1. Đặc điểm của cây và củ cải trắng

Củ cải trắng (white radish) là củ của cây cải củ, có tên khoa học là Raphanus

sativus L. thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ

Brassicales, họ Brassicaceae, chi Raphanus, loài sativus [22].

Củ cải trắng là tên gọi phổ biến ở Việt Nam. Ngoài ra , Raphanus sativus L.còn

có các tên gọi khác như Rettich (Đức), Daikon (Nhật), Hua piahs (Thái Lan), Lai fu

(Trung Quốc), Lobak beurem (Indonesia), Mu (Hàn Quốc), Muli (Ấn Độ) [22].

Củ cải được thuần hóa ở Châu Âu trong thời kì tiền La Mã. Những cư dân cổ đại

của Hy Lạp cho rằng các loại củ cải có giá trị nhất trong tất cả các loại cây trồng lấy

củ. Loại củ này được xem là một thực phẩm thông dụng ở Ai Cập trước khi các kim tự

tháp được xây dựng và củ cải cũng rất phổ biến ở thời Ý cổ đại. Chính Columbus và

những người đầu tiên khai hoang Châu Âu đã đem củ cải vào trồng trọt [16].

Củ cải được sử dụng như một loại thực phẩm trong bữa ăn của người Ai Cập cổ

vào khoảng 2700 - 2200 trước công nguyên, sau đó được trồng ở châu Âu vào thế kỉ

16 - 17 và châu Mỹ vào thế kỉ 20. Ở khu vực Đông Á, nhiều loại củ cải khác nhau đã

được phát hiện trồng ở Trung Quốc khoảng 2450 năm trước và ở Nhật Bản khoảng

1300 năm trước [20].

Cây củ cải là một loại cây cho củ hàng năm hoặc hai năm một lần. Loại cây này

được trồng chủ yếu để lấy củ do rễ củ chứa nhiều chất dinh dưỡng. Cây củ cải cao

khoảng 30 - 120 cm, có loại bề mặt láng nhẵn nhưng cũng có loại bề mặt sần sùi hoặc

có loại có lông cứng, mọc thẳng đứng vàcuống lá phân thành nhánh. Củ cải có nhiều

thịt, phình ra, có nhiều màu sắc như trắng, hồng, đỏ hoặc đen. Ngoài ra, hình dạng củ

cải có thể thuôn dài hoặc có dạng hình cầu [21].

Hình 1.1. Cây và củ cải trắng

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

Lá to có dạng hình đàn lia xẻ lá, có cuống, có lớp lông tơ mỏng láng bề mặt, rìa

lá có răng cưa. Lá non thường không phân nhánh và có răng cưa [21].

Hoa của cây củ cải có màu hơi đỏ tía hay màu hồng tới gần trắng với gân hoa

màu tím dài từ 1,5- 2 cm, đường gân nhỏ dần về phía cuống lá. Bên trong hoa còn có

chỉ nhị mảnh, bao phấn hình mũi tên nằm trong vòi nhụy và đầu nhụy. Quả cải thuộc

loại quả không nẻ, có dạng hình thoi phình to ở giữa và nhọn dần về hai đầu, khi bóp

nhẹ quả cải sẽ thấy một đường nứt xuất hiện và bên trong đó là các hạt cải. Một quả

cải cho được từ 2 đến 4 hạt cải. Hạt cải có dạng hình cầu hoặc hình trứng, kích thước

hạt khoảng 2,5 - 4 mm [21].

Củ cải có thể trồng quanh năm nhưng để thu được củ cải chất lượng tốt thì

thường trồng vào mùa xuân và đầu mùa thu. Thời gian nuôi trồng của củ cải từ khoảng

50 đến 90 ngày, phụ thuộc vào từng loại khác nhau và chất lượng sản phẩm khi thu

hoạch. Để thu hoạch một loại củ cải nặng 500 g thì thời gian thu hoạch khoảng 50 đến

60 ngày vào mùa hè và khoảng 70 đến 80 ngày vào mùa đông. Củ cải phát triển tốt ở

điều kiện nhiệt độ khoảng 20 - 250C, pH đất trồng tối ưu từ 6,0 - 6,5 cũng như cần

ánh sáng và nước với liều lượng thích hợp để tăng trưởng [22].

Hình 1.2. Hoa, lá và quả của cây cải củ

1.1.2. Thành phần hóa học của củ cải trắng

1.1.2.1. Thành phần hóa học cơ bản

Các thành phần hóa học cơ bản của 100 g củ cải trắng được nêu ở bảng 1.1.

Trong củ cải trắng, ngoài thành phần nước chiếm tỉ lệ cao thì protein chiếm tới 1,5%

khối lượng. Củ cải có chứa nhiều acid amin thiết yếu như lysine, methionine,

tryptophan, phenylalanine, threonine, valine,leucine, isoleucine, histidine,... cũng như

các acid béo như acid palmitic, acid oleic, acid linoleic, acid linolenic [40].

Củ cải trắng có hàm lượng lipid thấp. Lipid trong củ cải giúp tạo vị ngon cho củ.

Trong củ cải, glucid chiếm hàm lượng cao. Sucrose là một loại carbohydrate dự trữ

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT

quan trọng trong thực vật, đặc biệt trong các cơ quan lưu trữ như củ, rễ và hạt. Kích

thước củ cải càng lớn thì hàm lượng sucrose và glucose càng cao. Glucid trong củ cải

trắng bao gồm đường, tinh bột, pectin và xơ. Đường trong củ cải trắng chủ yếu là

glucose, một lượng nhỏ fructose, sucrose và pentosan. Tinh bột thay đổi tùy theo

giống, chiếm từ 0,2 - 0,5%. Xơ chiếm một lượng khoảng 1,5 % gồm chủ yếu là

cellulose và hemicellulose có trong phần vỏ, mô nâng đỡ và thành tế bào của củ cải

trắng, đóng vai trò tạo cấu trúc, chống lại các va chạm cơ học. Pectin chiếm khoảng

0,3%, chủ yếu tham gia vào cấu tạo của thành tế bào, tồn tại chủ yếu dưới dạng

calcium pectate. Ngoài ra, củ cải trắng còn nổi bật với hàm lượng lipid thấp, hàm

lượng vitamin và khoáng cao. Một số khoáng vi lượng cũng được tìm thấy trong củ cải

trắng như nhôm, bari, liti, mangan, silic, titan, flo và iod với hàm lượng tổng lên đến

18 pg/100 g [28, 30, 17].

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong 100g củ cải trắng tươi

STT Thành phần Đơn vị Hàm lượng

1 92,1 Nước G

Năng lượng 2 21 Kcal

3 Protein G 1,5

4 Lipid G 0,1

5 3,6 Glucid G

6 Chất xơ G 1,5

7 Tro 1,2 g

8 Đường tổng 2,5 g

9 Canxi 40 mg

10 Sắt mg 1,1

11 15 Magie mg

12 41 Phospho mg

13 242 Kali mg

14 Natri 10 mg

15 Đồng 150 pg

16 Vitamin C 30 mg

17 Vitamin B 1 0,06 mg

18 Vitamin B2 0,06 mg

19 Vitamin PP 0,5 mg

20 Vitamin B5 0,138 mg

21 Vitamin B6 0,046 mg

(Nguồn: National Nutrient Database for Standard).

1.1.2.2. Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng

Trong củ cải trắng có nhiều enzyme được tìm thấy như enzyme amylase,

invertase, ß-galactosidase, protease, cellulase, peroxidase. Enzyme invertase đóng vai

trò quan trọng trong việc thủy phân đường sucrose thành glucose và fructose ở thực

vật bậc cao, đặc biệt là ở các mô dự trữ. Sucrose là một sản phẩm ban đầu của phản

ứng quang hợp, chúng cũng được xem là cacbohydrate vận chuyển tự do trong các cơ

quan ở thực vật. Protease còn là enzyme quan trọng trong việc điều chỉnh lại sự lão

hóa ở cây [28].

Ngoài ra còn có các acid hữu cơ có lợi cho sức khỏe như acid malic, acid oxalic,

acid erythorbic có trong củ cải và acid erucic, acid linoleic, acid oleic có trong hạt củ

cải. Bên cạnh đó, trong củ cải còn có acid palmitic, acid stearic trong dịch trích ly

ether dầu hỏa từ hạt củ cải, acid glutamic trong củ cải muối chua [12].

Ở củ cải có nhiều acid phenolic như acid caffeic, acid p-coumaric, acid ferulic,

acid hydroxycinnamic, acid p-hydroxybenzoic, acid vanillic, acid salicylic, acid

gentisic, anthocyanin, pelargonidin, cyanidin. Trong củ cải trắng có các hợp chất

flavonoid như quercetin, kaempferol, myricetin, apigenin và luteolin. Ngoài ra, trong

củ cải còn có polysaccharides, proteoglycans, sắc tố, hợp chất có chứa lưu huỳnh,các

chất kháng khuẩn (saphanin và sulphoraphene), ß-carotene. Hàm lượng raphanusol A

và B trong củ cải trắng tăng khi có ánh sáng và giảm khi thiếu ánh sáng. Raphanusol A

và raphanusol B là chất ức chế sự tăng tưởng của cây trồng để cây củ cải không bị úa

vàng và hạt củ cải bị hư [12].

Ngành Công nghệ Thực phẩm

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

Mùi hăng của củ cải được tìm thấy bởi hợp chất glucosinolate. Ở củ cải tồn tại 4

loại glucosinolate là glucoraphenin, dehydroerucin, glucobrassicin và glucoerucin.

Glucosinolate trong củ cải giúp tăng lượng enzyme tham gia vào việc giải độc các chất

gây ung thư. Chất này có tiềm năng được sử dụng như một chất ngăn chặn sự lão hóa

[21].

I.2.2.3. Tác dụng sinh học của củ cải trắng

Rosa M.P. Gutierrez và Rosalinda L.Perez (2004) đã nghiên cứu về thành phần

các hợp chất có mặt trong củ cải trắng gồm: alkaloid và các hợp chất có nitơ,

coumarin, enzyme, glucosinolate, các acid hữu cơ, các hợp chất phenol... Nghiên cứu

cũng đã khẳng định nước ép từ củ cải trắng có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của vi

khuẩn G+, G" và nhiều loại nấm (E. Coli, Pseudomonas pyocyaneus, Salmonella typhi,

Bacillus subtilis, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae và Fusarium

culmorum...) do sự tồn tại của các peptide giàu cystein Rs-AFP1 và Rs-AFP2, các

protein RAP-1 (6,1 kDa) và RAP-2 (6,2 kDa), acid cafeic, acid ferulic, p-

hydroxybenzoic acid. Ngoài ra, cũng theo công bố này, củ cải còn có hoạt tính miễn

dịch, chống oxi hóa, chống ung thư, kháng virus,... [12].

Hirotaka Katsuzaki và cộng sự (2004) đã có nghiên cứu so sánh hoạt tính chống

oxi hóa của dịch chiết củ cải trắng bằng nước nóng và nước ở nhiệt độ bình thường.

Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết củ cải trắng

bằng nước nóng cao hơn dịch chiết bằng nước ở nhiệt độ bình thường. Hợp chất chống

oxi hóa được phân lập và xác định là L-tryptophan. Khi tiến hành nghiên cứu trên gan

chuột thì L-tryptophan chuyển hóa thành 5-hydroxyl tryptophan [14].

Narisa Kamkaen và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về khả năng ức chế enzyme

tyrosinase của 16 loại rau khác nhau ở Thái Lan, bao gồm củ cải trắng. Mẫu rau được

rửa sạch, cắt nhỏ, xay nhuyễn. Quá trình trích ly được thực hiện với các dung môi

hexan, ethyl acetate, methanol và propylen glycol 50% với tỉ lệ nguyên liệu: dung môi

là 1: 4, trích ly bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ. Dịch sau

trích ly được lọc loại bỏ bã. Pha loãng 5 lần dịch sau lọc để có dung dịch mẫu phân

tích. Khả năng ức chế Tyrosinase từ nấm được xác định bằng cách cho vào ống

nghiệm 20 pl tyrosinase 1000 U/ml, 20 pl dung dịch đệm phosphate 0,1 M (pH 6,8),

100 pl dịch mẫu và 20 pl dung dịch L-DOPA 0,85 mM. Ủ ở 250C trong 10 phút rồi đo

độ hấp thu ở 475 nm. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết hexan, ethyl acetate,

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT

methanol và propylen glycol 50% của củ cải trắng ức chế tyrosinase từ nấm ở các mức

lần lượt là 38,43; 68,73; 53,51 và 88,50 % [23].

R. Jakmatakul và cộng sự (2009) đã so sánh khả năng ức chế tyrosinase và hoạt

tính chống oxi hóa của dịch chiết methanol và nước ép từ củ cải trắng Thái Lan lạnh

đông chậm nhằm xác định tiềm năng làm trắng da và chống lão hóa trong các ứng

dụng mỹ phẩm. Kết quả nghiên cứu công bố cho thấy nước ép từ củ cải lạnh đông

chậm có hàm lượng các hợp chất phenolic, flavonoid và acis ascorbic cao hơn trong

dịch chiết methanol, khả năng khử các gốc tự do (DPPH, superoxide, oxi đơn) và ức

chế tyrosinase của nước ép cũng cao hơn so với dịch chiết methanol. Nghiên cứu cũng

đã xác định được giá trị IC50 cho khả năng ức chế tyrosinase của dịch chiết methanol

là 9,62 mg/ml và và của nước ép là 3,09 mg/ml. Do đó, tác giả cũng đề nghị về việc

xem xét hướng nghiên cứu sử dụng R.sativus vào công nghệ mỹ phẩm dưỡng da [25].

Syed Sultan Beevi và cộng sự (2010) khảo sát thành phần các hợp chất

polyphenol, khả năng chống oxi hóa và khử gốc tự do của lá và củ cải trắng Raphanus

sativus L. Lá và củ được tách riêng, rửa sạch, sấy khô và xay thành bột mịn, bảo quản

ở -200C đến khi phân tích. Bột sau đó được trích ly với các dung môi tinh khiết

(methanol, chloroform, acetone, ethyl acetate và hexan) 3 lần, mỗi lần 24 giờ ở nhiệt

độ phòng, tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1: 40 (g/ml). Dịch trích ly sau đó được gom

lại, cô giảm áp ở 400C thu cắn, cắn hòa tan lại vào methanol để dùng làm mẫu phân

tích xác định thành phần polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa. Kết quả cho thấy

trong lá và củ cải có các chất chống oxy hóa và có khả năng khử gốc tự do. Dịch chiết

methanol và acetone của lá củ cải trắng có tổng hàm lượng polyphenol lần lượt là

86,16 và 78,77 mg/g chất khô, có thể so sánh với trà xanh và trà đen. Phân tích HPLC-

DAD cho thấy sự hiện diện của catechin, acid syringic, acid vanillic, axit ferulic, acid

sinapic, o-coumaric acid, myricetin, và quercetin trong dịch chiết tất cả các dung môi

trên cả lá và củ, hàm lượng các chất trong lá cao hơn trong củ. Dịch chiết methanol từ

lá và củ cho thấy khả năng ức chế đáng kể acid linoleic peroxy và biểu thị hoạt động

khử ion kim loại. Cụ thể, IC50 khi khử gốc tự do DPPH lần lượt là 31 và 42 mg/ml, khi

khử superoxide là 23 và 52 mg/ml cho, khi khử hydrogen peroxide là 67 và 197

mg/ml, khi khử gốc NO'. 56 và 62 pg/ml, tương ứng [34].

S. Shukla và cộng sự (2011) đã khảo sát khả năng kháng khuẩn của nước ép từ củ

cải trắng Ân Độ. Củ cải tươi, rửa sạch, ép lấy nước, lọc loại bã và cô giảm áp ở 35 ±

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT

50C để thu cao. Cao này sau đó hòa tan lại vào nước ở các nồng độ xác định dùng khảo

sát hoạt tính kháng khuẩn. Các chủng vi sinh được khảo sát gồm S. aureus, E. coli, P.

aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis. Mẫu đối chứng là kháng

sinh ampicillin. Kết quả cho thấy nước ép từ củ cải trắng Ân Độ có khả năng ức chế sự

phát triển của cả 5 chủng vi sinh khảo sát, giá trị MIC xác định được dao động trong

khoảng 0,078 - 0,625 mg/ml, trong đó hiệu quả tác động lên 2 chủng E. coli và

Enterococcus faecalis là tương đương với ampicillin, và cao hơn ampicillin khi tác

động lên Klebsiella pneumoniae (MIC là 0,078 mg/ml so với 0,312 mg/ml của

ampicillin) [31].

K. Agarwal, R. Varma (2014) đã nghiên cứu về thành phần sinh hóa và khả năng

khử gốc tự do DPPH của củ cải trắng. Kết quả công bố cho thấy dịch chiết trong nước

nóng của củ cải trắng có khả năng khử gốc tự do DPPH ở mức 58,38% với nồng độ

200 ^g/ml, giá trị IC50 là 166,79 ^g/ml. Kết quả phân tích cho thấy trong dịch chiết có

sự tồn tại của alkaloid, flavonoid, glycoside, tannin, triterpenoid và steroid [19].

H. Caglar Kaymak và cộng sự (2015) đã so sánh hoạt tính kháng khuẩn in vitro

của củ cải trắng và củ cải đen ở Thổ Nhĩ Kì. Hai loại củ cải trắng và đen được trồng và

chăm sóc như nhau, thu hoạch sau 80 ngày gieo hạt được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô,

xay thành bột. Bột củ cải sau đó trích ly bằng phương pháp Soxhlet bằng dung môi

methanol trong 72 giờ, nhiệt độ không vượt quá nhiệt độ sôi của dung môi. Dịch chiết

sau đó đem lọc qua giấy Whatman No.1 rồi cô giảm áp thu cao. Cao này dùng khảo sát

hoạt tính kháng khuẩn. Hơn 100 giống vi sinh vật thuộc 52 loài khác nhau đã được

dùng nghiên cứu. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol của củ cải trắng và củ cải đen

có khả năng hạn chế sự phát triển của Arthrobacter atrocyaneus, Corynebacterium

ammoniagenes, Enterobacter hormaechei, Kocuria rosea, Neisseria subflava, Pantoea

agglomerans, Proteus vulgaris, Psychrobacter immobilis và Shigella dysenteriae.

Ngoài ra, dịch chiết methanol của củ cải trắng còn tác động lên Bacillus sphaericus và

Corynebacterium flavescen. Nhìn chung, củ cải trắng có phạm vi kháng khuẩn rộng và

mạnh hơn củ cải đen [13].

1.2. Giới thiệu chung về khuẩn

1.2.1. Bacillus cereus

Bacillus cereus (B. cereus) thuộc:

- Giới: Bacteria,

- Ngành: Firmicutes,

- Lớp: Bacilli,

- Bộ: Bacillales,

- Họ: Bacillaceae,

- Chi: Bacillus,

- Loài: cereus,

- Tên khoa học là Bacillus cereus.

B. cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng được

trong khoảng nhiệt độ từ 5 - 500C, tối ưu ở 35 - 400C, pH dao động từ 4,5 - 9,3, dễ tạo

bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại

thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô, .. ,)[44].

Nồng độ muối tối đa cho sự sinh trưởng của B. cereus là 7,5% (Rajkowski và

Bennett, 2003). Khi có oxy, B. cereus phát triển tối ưu nhưng chúng cũng có thể sống

ở điều kiện kỵ khí. Các tế bào B. cereus được nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ít chịu

được nhiệt và acid hơn các tế bào B. cereus nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí hoặc nửa

kỵ khí (Mols và cộng sự, 2009). Bào tử của B. cereus có khả năng chịu nhiệt khô hơn

nhiệt ẩm và thường chịu nhiệt lâu hơn trong các thực phẩm có chứa hoạt độ nước thấp

(Jenson và Moir, 2003).

B. cereus cho phản ứng dương tính với oxidase, catalase, lecithinase. Chúng lên

men glucose sinh acid trong điều kiện kỵ khí, khử nitrate tạo thành nitrite, dương tính

với thử nghiệm VP (Voges Proskauer), thủy phân được L-tyrosine, tăng trưởng được

trong 0,001% lysozyme. B. cereus không lên men được mannitol cũng như arabinose

[44].

Hình 1.3. Vi khuẩn B. cereus sau khi nhuộm Gram và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB.

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và

emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B. cereus khi thực phẩm

được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử

dụng. Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ trên 106 CFU/g đủ gây ngộ độc. Triệu chứng

ngộ độc phổ biến gây ra bởi B. cereus là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 4 - 16

giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12 - 24 giờ. Một dạng triệu chứng

ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau 1 - 5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn, không

bị tiêu chảy, kéo dài khoảng 24 giờ [44].

1.2.2. Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) thuộc:

- Giới: Bacteria,

- Ngành: Proteobacteria,

- Lớp: GammaProteobacteria,

- Bộ: Pseudomonadales,

- Họ: Pseudomonadaceae,

- Chi: Pseudomonas,

- Loài: aeruginosa,

- Tên khoa học là Pseudomonas aeruginosa.

P. aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc

tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một tiêm mao đơn cực. P. aeruginosa là vi

khuẩn hiếu khí bắt buộc nhưng chúng có thể phát triển trong môi trường kỵ khí nếu có

NO3- làm chất nhận điện tử, phát triển tối ưu ở 370C [44].

P. aeruginosa cho phản ứng dương tính với catalase, citrate, oxidase, urease

nhưng lại cho kết quả âm tính với các thử nghiệm MR (Methyl Red), VP (Voges

Proskauer) và indole. Ngoài ra, P. aeruginosa có khả năng khử nitrate thành nitrite,

hóa lỏng dung dịch có chứa gelatin. Chúng có khả năng thủy phân casein và tạo

enzyme lipase nhưng lại không thủy phân được tinh bột. P. aeruginosa cũng không có

khả năng lên men glucose và lactose để tạo acid [24].

Hình 1.4. Vi khuẩn P. aeruginosa khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB

Loài này hiện diện phổ biến trong đất, nước, bề mặt cơ thể động thực vật, là loài

vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên người. Sự nhiễm bệnh bắt đầu từ khi có những biến đổi

làm suy yếu hệ bảo vệ của tế bào chủ. P. aeruginosa có thể gây nhiều bệnh khác nhau

ở người: gây viêm màng trong tim ở những người có van tim giả; gây viêm đường hô

hấp ở những người có đường hô hấp hoặc hệ thống tự bảo vệ bị suy yếu; gây viêm

phổi ở những bệnh nhân có bệnh mãn tính về phổi và bị chứng sung huyết tim; gây

nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu ở những bệnh nhân suy giảm hệ thống miễn

dịch như AIDS, giảm bạch cầu trung tính, tiểu đường, bỏng nặng; gây viêm màng não

mủ và áp xe não; gây viêm tai; gây bệnh hóa sừng ở mắt ở những người có hệ thống

bảo vệ suy yếu; gây viêm tủy xương; gây nhiễm trùng da, mô mềm; ... P. aeruginosa

là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến, do đó là một loài gây bệnh nguy hiểm, chỉ có một số

ít các kháng sinh có tác dụng đối với giống Pseudomonas là fluoroquinolone,

gentamycin và imipenem [44].

1.2.3. Salmonella typhi

Salmonella typhi (S. typhi) thuộc:

- Giới: Bacteria,

- Ngành: Proteobacteria,

- Lớp: Gammaproteobacteria,

- Bộ: Enterobacteriales,

- Họ Enterobacteriaceae,

- Chi: Salmonella,

- Loài: enterica,

-Tên khoa học là Salmonella enterica serovar typhi.

S. typhi là loài vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động nhờ tiên mao, hiếu khí

hoặc kỵ khí tùy ý, không tạo bào tử. Vi khuẩn này sinh trưởng tốt nhất tại nhiệt độ

370C, là nhiệt độ cơ thể người, là nguyên nhân gây bệnh sốt thương hàn. S. typhi phát

triển tối ưu trong môi trường có pH trung tính nhưng khoảng pH phát triển của chúng

lại rất rộng (pH = 4 - 9). Khi pH thấp, oxy có tác dụng rất tốt đến sự phát triển của

chúng. S. typhi không có khả năng phát triển ở nồng độ muối cao [39, 41, 44].

S. typhi có khả năng lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men

saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giải ure, không có khả năng tách

nhóm amine từ tryptophan, hầu hết các chủng đều sinh H2S [44].

Hình 1.5. Vi khuẩn S. typhi khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi

trường thạch TSB

S. typhi gây ra sốt thương hàn. Vi khuẩn này theo thực phẩm vào đường tiêu hóa,

vào niêm mạc ruột đến hạch lympho và sinh sản, phát triển tại đây. Thời gian này là

thời gian ủ bệnh [41].

Sau khi phát triển với số lượng lớn, một số tự phân giải. Kết quả là các độc tố

được giải phóng và gây độc. Một số khác sẽ theo hệ lympho vào máu và gây nhiễm

khuẩn máu. Từ máu Salmonella đi đến khắp cơ thể gây ra những áp xe khu trú, thường

thấy nhất ở bọng đái, ống tiêu hóa [41].

Sau 10 - 14 ngày ủ bệnh, nhiệt độ cơ thể tăng và người cảm thấy lạnh. Nhiệt độ

tăng dần và giữ khoảng 39 - 400C trong hai tuần đầu. Cơ thể bệnh nhân suy nhược

nhanh chóng, ăn không ngon, mệt mỏi, gan và lá lách to dần, xuất huyết ngoài da,

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT

lượng bạch cầu giảm. Sau ba tuần, bệnh giảm dần. Sau hai tuần giảm bệnh, có 5 - 10%

trường hợp có thể tái phát [41].

1.2.4. Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus) thuộc:

- Giới: Eubacteria,

- Ngành: Firmicutes,

- Lớp: Bacilli,

- Bộ: Bacillales,

- Họ: Staphylococcaceae,

- Chi: Staphylococcus,

- Loài: aureus,

- Tên khoa học là Staphylococcus aureus.

S. aureus là loài vi khuẩn Gram dương, dạng hình cầu, là loại yếm khí tùy tiện.

Khi quan sát dưới kính hiển vi S. aureus trông giống như chùm nho. S.aureus có khả

năng phân hủy máu trên môi trường thạch. S. aureus không hình thành chuỗi dài,

không di động, không sinh bào tử [39].

Trên môi trường thông thường, S. aureus có thể sinh trưởng trong dải nhiệt độ 10

- 420C, pH 7,4 - 7,6. Vi khuẩn này hoạt động tốt nhất trong môi trường giàu oxy. S.

aureus có thể sinh trưởng trên nhiều môi trường thông thường, giàu dinh dưỡng, sữa,

gelatin hay thạch. Khi S. aureus sinh trưởng trên môi trường nuôi cấy có thạch tạo

thành các khuẩn lạc có đường kính 2 - 4 mm sau 24 giờ. Khuẩn lạc thường có hình

tròn, lồi, nhẵn trơn, mờ đục, bề mặt sáng. S. aureus khi sinh trưởng trên môi trường

thạch đặc trưng tạo thành các khuẩn lạc màu vàng nên được gọi là tụ cầu vàng [39].

S. aureus có phản ứng dương tính với enzyme catalase, có khả năng chuyển H2O2

thành nước và oxy. Đặc điểm này làm cho catalase trở thành phép thử hữu hiệu giúp

phân biệt các chủng Staphylococcus với Enterococcus. Một số lượng nhỏ các chủng S.

aureus có thể phân biệt với phần lớn Staphylococcus khác bằng cách thử phản ứng

phát hiện coagulase. S.aureus thường phản ứng dương tính (do tạo ra coagulase), gây

đông tụ, trong khi một số chủng lại có phản ứng âm tính [44].

Hình 1.6. Vi khuẩn S. aureus khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi

trường thạch TSB

S. aureus có phản ứng với ADNase (tạo vùng sáng trong trên môi trường dinh

dưỡng thạch), lipid (màu vàng và mùi ôi), phosphatease dương tính (có màu hồng), có

khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S.

aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa

đến 15% NaCl [39, 44].

Trong tự nhiên S. aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các

loài động vật máu nóng. S. aureus sản sinh một số loại độc tố đường ruột enterotoxin

bền nhiệt, không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa

các độc tố này, sau 4 - 6 giờ người bị ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa

kéo dài từ 6 - 8 giờ. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng

hợp, nước súp (ít khi được xử lý ở nhiệt độ cao hơn 400C) và các loại thủy sản, thực

phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loài vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu

thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến. Khoảng 20% dân số thường xuyên

mang theo S. aureus [39, 44].

.3. Giới thiệu chung vê nam mốc

1.3.1. Nấm mốc Aspergillus flavus

1.3.1.1. Phân loại [47]

Aspergillus flavus là một loại nấm thường có mặt trong môi trường và có thể gây

bệnh trên các loại ngũ cốc tích trữ trong thời gian dài. Chúng cũng có thể là tác nhân

gây bệnh cho người, liên quan đến bệnh aspergillosis của phổi và đôi khi gây bệnh trên

kết mạc, nấm tai, nhiễm trùng mũi hầu. Nhiều dòng nấm sinh ra một lượng lớn độc

tố aflatoxin, một trong những chất gây ung thư và gây độc cấp tính.

Hình 1.7. Aspergillus flavus

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Eurotiomycetes

Bộ: Eurotiales

Họ: Trichocomaceae

Chi: Aspergillus

Loài: A. flavus

1.3.1.2. Đặc điểm của nấm Aspergillus flavus [43]

Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài, có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy

loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5 pm, có khi đến 10 pm, thậm chí đến 1

mm. Chiều dài sợi nấm có thể tới vài chục cm. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo

kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân

nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm xù xì như bông. Trên môi trường đặc biệt và trên

một số hợp chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể

phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm.

Giống như các loài Aspergillus, A. flavus có một trên toàn thế giới. Điều này có

lẽ kết quả từ việc sản xuất của nhiều bào tử trong không khí, dễ dàng phân tán bởi các

chuyển động không khí và có thể do côn trùng. Thành phần không khí có ảnh hưởng

đến sự phát triển của nấm mốc. A. flavus phát triển tốt với hoạt độ nước từ 0,86 và

0,96.

Nhiệt độ thích hợp là 30-380C, tối đa là 44-470C, độ ẩm tương ứng để bảo từ nảy

mầm là 80%, độ ẩm thích hợp sinh sản vô tính là 86%.

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT

1.3.1.3. Hình thức sinh sản [43]

Nấm mốc sinh sản dưới hình thức: vô tính

Trong sinh sản vô tính: nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái

lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái. Nấm sinh sản vô

tính thể hiện qua 2 dạng là sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra

hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử. Bào tử đính (conidium) là các bào

tử không có túi bao bọc ở giống nấm Aspergillus, Pénicillium, ... Hình dạng, kích

thước, màu sắc và cách sắp xếp của bào tử đính thay đổi từ giống này sang giống khác

và được dùng làm tiêu chuẩn để phân loại nấm; cuống bào tử đính dạng bình có thể

không phân nhánh như ở Aspergillus hay dạng thẻ phân nhánh như ở Pénicillium. Bào

tử đính hình thành từ những cụm trên những cuống bào tử đính ở Trichoderma;

1.3.1.4. Một số bệnh lý do nấm mốc Aspergillus flavus gây ra [43]

Aspergillus flavus cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho thực vật và động vật,

trong đó có con người và vật nuôi. Nấm có thể nhiễm trên bắp, đậu phụng, cotton và

cây đậu. Nấm thường thấy dưới dạng các mảng nấm và có thể nhìn thấy được. Các

bệnh nhân nhiễm nấm A. flavus thường là suy giảm miễn dịch.

A. flavus là tác nhân đứng hàng thứ hai hay gặp nhiều nhất của nhóm nấm gây

bệnh aspergillosis, tác nhân đầu tiên là nấm Aspergillus Fumigatus. A. flavus có thể

xâm nhập vào các động mạch phổ hoặc não và gây tình trạng nhồi máu. Ngoài ra nó

còn sinh ra độc tố (aflatoxin) là một trong những tác nhân gây ung thư

(HCC_hepatocellular carcinoma). Sự phá hủy của nấm A. flavus đặc biệt thường hay

sinh aflatoxin, có thể gây viêm gan cấp, ung thư gan và gây suy giảm miễn dịch. Đồng

thời qua một số nghiên cứu tại các quốc gia cho thấy tỷ lệ ung thư gan có viêm gan

siêu vi đi kèm thì thường tỷ lệ nhiễm nấm cùng lúc cũng rất cao. Trong tự nhiên, A.

flavus có khả năng phát triển trên nhiều nguồn dinh dưỡng khác nhau. Đặc biệt chúng

sống trên các thực vật hoại sinh như mô thực vật và động vật bị chết trong đất. Vì lý

do này nên nó có thể tái sinh dinh dưỡng liên tục.

Trong một loạt ca bệnh được báo cáo về nấm A. flavus ở người, nhiều ca đưa đến

nhièu biến chứng nặng, thậm chí tử vong: viêm màng ngoài tim dẫn đến tử vong do A.

flavus trên bệnh nhân bị bạch cầu cấp, hoặc dị ứng viêm mũi xoang ở bệnh nhân ở

Qatar do A.flavus, hoặc bệnh nhân ghép gan bị viêm cơ do nấm A. flavus (Clinical

transplantation, 22: 2008, 508-510).

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

1.3.2. Nấm mốc Fusarium solani [8]

Bệnh héo vàng do nấm F. solani gây hại là một trong những bệnh nguy hiểm gây

thiệt hại lớn cho rau, củ, quả ở nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc, Mỹ, Anh, Ý,

Nam Phi, Ân Độ, Australia... Bệnh này có phạm vi kí chủ rộng, xuất hiện và gây hại

nhiều nơi nhất là vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.

1.3.2.1. Phân loại

Hình 1.8. Fusarium solani

Giới : Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Sordariomycetes

Bộ: Hypocreales

Họ: Nectriceae

Chi: Fusarium

Loài: F. solani

1.3.2.2. Đặc điểm của nấm Fusarium solani [41]

Giai đoạn hữu tính F.solani là Haematonectria heamatococca. Tuy nhiên, tên gọi này

thường ít thông dụng. Giai đoạn hữu tính hầu như không gây bệnh cho cây, dù từ môi

trường nuôi cấy.

___Ẩ___1- . __

^ \

o

o V

p

31 Cà

E

"

~-/

A

A 9

-—t-------»— 1---------—

í ị

Ị

'" T ■ ■ T—*------r—-

c

F

B O C X

Hình 1.9. Loài F. solani: A-B: đại bào tử; C-D: tiểu bào tử; E-G: bào tử đính trên môi trường (Dương Minh,2010)

Giai đoạn vô tính là F. solani thường ký sinh gây hại cây. Tiểu bào tử của F.

solani trong suốt, hình trụ, hay nêm (9-16 x 2-4pm), có thể có 1 vách ngăn. Đại bào tử

có thể có hoặc không có một vài chủng, hình trụ hoặc liềm (40-100 x 5-7,5pm),

thường có 3-5 hay 7 vách ngăn.

Nhiệt độ tối thiểu để sợi nấm phát triển và hình thành bào tử trong nuôi cấy là

280C. Bào tử áo là những bào tử có vách dày (10-11 x 8-9pm). Li et al, (1998) cho biết

ở loài F.solani f.sp. glycines nhiệt độ 300C giúp kích thích hình thành bào tử áo.

Thường bào tử áo có dạng đơn, đôi khi có dạng đôi chúng được hình thành từ phần

cuối, bên hông hay ở giữa của đại bào thì Fusarium có thể tồn tại trong đất dưới dạng

bào tử áo qua thời gian dài, bào tử áo có thể lưu tồn trong đất từ 15 đến 20 ngày. Bệnh

lây lan qua than rễ, đất bị nhiệm bệnh và truyền qua giống, ngoài sựu lây lan thứ cấp

của bệnh có thể được thực hiện qua nguồn nước và cơ giới Fusarium thường tấn công

cây trồng dễ dàng khi bị thiếu ánh sáng. Phơi nắng ở nhiệt độ cao sẽ làm giảm hiệu

quả của việc tiêm chủng F.solani.

Trên cây trồng, loài F. solani f.so.pisi (gây chết cây) phát triển tốt khi đất được

cung cấp thêm P, K, Mg hòa tan, C và N tổng số. Das (1991), cho biết khuẩn lạc của

F.solani sẽ phát triển kém khi hàm lượng K+ giảm dưới 3mM. Nếu thiếu Bo và Fe,

F.solani f.sp.phaseoli sẽ gia tăng mức gây hại lên trục hạ diệp của cây.

Ngược lại, Keawruang et al, (1989), bón thạch cao (CaSO4) và hàm lượng nước

tốt có thể làm giảm bệnh thối rễ do F.solani gây ra.

I.3.2.3. Hình thức sinh sản

Nấm F. solani sản sinh ra 3 loại bào tử vô tính đó là tiểu bào tử, đại bào tử và bào

tử hậu.

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

Các bào tử hậu thường có dạng hình tròn, có thành bào tử dày do các sợi nấm tạo

thành loại bào tử này thường có 3 đến 5 ngăn, chúng được sinh ra trong các đại bào tử

hoặc xen giữa các sợi nấm già [8, 47].

Tiểu bào tử là các bào tử có 3 hay 5 ngăn, có hình trứng, hình bầu dục, đây là

dạng bào tử có nhiều nhất và được sản sinh trong tất cả các điều kiện, thường được

sinh ra trong tất cả các điều kiện, thường được sinh ra trong các mạch dẫn của cây bị

bệnh.

Đại bào tử là các bào tử có từ 3 đến 5 ngăn. Đại bào tử có hình bán nguyệt, hình

lưỡi liềm. Đại bào tử có thể tồn lưu trong đất lâu đến 30 năm và nó chính là nguồn lan

truyền bệnh cho các năm sau và các cây khác.

I.3.2.4. Một số bệnh lý do nấm mốc F. solani

Nấm F. solani là loài nấm tồn tại chủ yếu trong đất, xâm nhiễm gây bệnh vào bên

trong bó mạch, chủ yếu thông qua bộ rễ do rễ làm nhiệm vụ hút nước và chất dinh

dưỡng nên nấm cũng theo con đường đó mà xâm nhập vào cây, sau khi xâm nhập gây

bệnh nấm làm cho bó mạch bị chuyển sang màu nâu xấm hoặc nâu đen, lá cây bị héo

do độc tố nấm tiết ra làm tắc bó mạch, dẫn đến mất chức năng quang hợp và cây bị

chết [8].

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương tiện nghiên cứu

2.1.1. Thời gian và địa điểm

Thời gian: 06/02/2017 đến 06/06/2017

Địa điểm: phòng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh trường Đại học Bà Rịa - Vũng

Tàu. Một phần nghiên cứu được thực hiện ở phòng F45 Viện Công nghệ Sinh học và

Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp TP.HCM.

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

Củ cải trắng được thu hái vào tháng 2 năm 2016 tại trang trại thuộc huyện Đức

Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam. Củ cải tươi sau khi thu hoạch được rửa sạch, cắt lát

dày 1-1,2 cm, sấy ở 500C đến khi còn 6 - 7% ẩm. Củ cải khô sau đó được xay nhỏ, lọt

qua sàng 40 mesh và trích ly bằng các dung môi khác nhau (nước, ethanol, methanol,

ethyl acetate, este dầu hỏa) thu được cao củ cải.

2.1.3. Phạm vi nghiên cứu

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ củ cải trắng bằng hệ dung môi

• Aspergillus flavus (VTCC-F-824)

• Fusarium solani (VTCC-F-827)

• Bacillus cereus (VTCC 1005)

• Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)

• Salmonella typhi (ATCC 6538)

• Staphylococcus aureus (ATCC 14028)

ethanol - nước trên các đối tượng:

2.1.4. Hóa chất sử dụng

Hóa chất sử dụng: môi trường SDA (Ân Độ) và môi trường PDA (Ân Độ), MHA

(Himedia, Ân Độ), TSB (Pháp).

2.1.5. Thiết bi - Dụng cụ

Máy ly tâm, máy đo pH, buồng đếm hồng cầu;

Micropipet;

Vortex; cân phân tích,

Nồi hấp tiệt trùng, tủ cấy, tủ hút, tủ lạnh, tủ sấy, kính hiển vi;

Và các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm.

2.2.Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Nội dung nghiên cứu

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.I. Phương pháp định tính các thành phần trong cao chiết

> Định tính alkaloids

Cân 2 g mẫu cao cho vào 20 ml dung dịch acid sulfuric 5% trong ethanol 50%.

Thêm 2 giọt dung dịch ammoniac đậm đặc và thêm một ít dung môi chloroform

vào rồi lắc nhẹ để trộn đều và hỗn hợp được đưa vào phễu chiết. Chờ một lúc để hỗn

hợp tách lớp rồi đem đi chiết thu được 2 lớp dịch riêng biệt rồi đem kiểm tra với thuốc

thử Dragendorf. Lần lượt cho 1 ml thuốc thử Dragendorf vào trong 2 lớp dịch được

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT

tách riêng biệt. Hỗn hợp nào hình thành kết tủa màu nâu đỏ chứng tỏ có sự hiện diện

của alkaloids [36].

> Định tính tannin

Lấy 2 g cao hòa tan trong 10 ml dung dịch cồn 50% rồi chia làm 3 phần bằng

nhau:

- Thử nghiệm FeCl3: Nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 vào phần thứ nhất, màu sắc

của mẫu chuyển sang màu xanh lam hoặc màu xanh đen đậm chứng tỏ mẫu có tồn tại

tannin [41].

- Thử nghiệm gelatin: Hòa tan một lượng nhỏ gelatin dạng hạt vào trong phần

thứ hai rồi lắc đều cho gelatin hòa tan hoàn toàn. Sau đó để yên hỗn hợp, nếu xuất hiện

kết tủa trắng lơ lửng bên trong chứng tỏ mẫu cao có sự hiện diện của tannin [36].

- Thử nghiệm chì acetate: Nhỏ 3 giọt dung dịch chì acetate vào phần thứ ba, lắc

đều cho đến khi thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt thì chứng tỏ có sự tồn tại của

tannin trong mẫu cao [36].

> Định tính anthraquinones

Cân 0,5 g mẫu cao hòa vào 5 ml dung môi chloroform và lắc đều trong vòng 5

phút. Tiến hành lọc hỗn hợp trên để thu được dịch trong rồi bổ sung thêm dung dịch

amoniac 10% với thể tích bằng với thể tích của dịch trong vừa lọc. Nếu ta thấy có xuất

hiện lớp nước màu đỏ hay hồng hoặc tím sau khi lắc đều chứng tỏ có sự hiện diện của

anthraquinones tự do có trong mẫu cao [36].

> Định tính saponin

- Thử nghiệm 1: Lấy 1g mẫu cao cho vào 2 ml dung dịch NaCl rồi lắc đều sau

đó hút 2 ml hỗn hợp cho vào ống nghiệm rồi thêm 3 giọt máu động vật bằng ống tiêm

rồi nhẹ nhàng đảo ngược ống (không tạo rung) và để yên trong 15 phút. Sự lắng xuống

của các tế bào hồng cầu chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong mẫu cao [36].

- Thử nghiệm 2: Cân 1 g mẫu cao rồi hòa tan trong 10 ml nước cất sau đó lắc

mạnh trong 30 giây và để yên hỗn hợp trong vòng 30 phút. Nếu có sự hình thành của

bọt khí không tan chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong mẫu cao [36].

> Định tính flavonoids

Cân 2 g mẫu cao hòa tan trong 10 ml nước cất rồi hút 3 ml hỗn hợp vào trong 2

ống nghiệm. Phương pháp này gồm thử nghiệm với dung dịch NaOH 10% và thử

nghiệm với dung dịch FeCl3 [36].

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

- Thử nghiệm NaOH 10%: Thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% vào 3 ml hỗn hợp

rồi lắc đều. Nếu thấy xuất hiện dung dịch màu vàng rồi chuyển sang không màu nếu

cho acid hydrochloric vào chứng tỏ có sự hiện diện của ílavonoids trong mẫu cao [36].

- Thử nghiệm FeCl3: Nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 vào 3 ml hỗn hợp rồi lắc đều.

Sự chuyển màu của dung dịch sang màu xanh đen chứng tỏ có tồn tại ílavonoids trong

mẫu cao [36].

2.2.2.2. Chuẩn bị giống

> Nấm mốc

Tiến hành giữ các giống nấm mốc trên môi trường thạch SDA trên đĩa Petri bằng

phương pháp cấy chấm góc. Đầu tiên pha môi trường thạch SDA (65 gam/lít), hấp khử

trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội xuống 40-500C rồi đem đi đổ đĩa Petri. Các đĩa

này được để ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ để kiểm tra môi trường không bị

nhiễm. Đĩa Petri sau 24 giờ sẽ được dùng để cấy chuyền các giống nấm mốc nhằm

mục đích giữ giống. Sau khi cấy các đĩa Petri được đem ủ trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ

thường và bảo quản trong 2 - 3 tuần ở nhiệt độ mát.

Để chuẩn bị thử nghiệm cấy nấm mốc qua môi trường thạch nghiêng, nuôi nấm

mốc trong 72 giờ ở nhiệt độ phòng. Thực hiện lấy bào tử nấm mốc: bơm 10 ml nước

muối sinh lý vào ống thạch nghiêng đã cấy nấm mốc, lắc ống nghiệm trên vortex với

tốc độ quay 3200 rpm thời gian 5 phút. Đổ lấy dịch huyền phù vào ống ly tâm và ly

tâm với tốc độ vòng 5000 rpm thời gian 10-15 phút. Đổ phần dịch bên trên thu lấy

phần cặn phía dưới. cặn này sẽ hòa tan vào dung dịch nước muối sinh lý để được mật

độ 5 x106 bào tử/ ml. Đây chính là dịch nấm mốc để nghiên cứu.

> Vi khuẩn

Bảo quản giống: vi khuẩn sau khi lấy về sẽ được cấy ria trên môi trường thạch

dinh dưỡng TSB, đem ủ ở 370C trong vòng 16 đến 24 giờ để chọn ra các khuẩn lạc đặc

trưng. Khi chọn được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch không bị nhiễm thì đem tăng

sinh chúng trong môi trường lỏng TSB rồi ủ ở 370C, lắc với tốc độ 100 rpm trong 10 -

12 giờ. Môi trường trở nên đục do có sự tăng sinh của vi sinh vật. Chuẩn bị sẵn

glycerol và effendorf đã được hấp tiệt trùng. Tiến hành bơm 400 pl dịch vi khuẩn nuôi

cấy vào effendorf rồi cho tiếp 600 pl glycerol rồi đem cho vào tủ lạnh đông sâu ở -

490C để giữ giống cho quá trình làm thí nghiệm.

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

Tăng sinh: vi khuẩn lấy ra từ tủ đông sâu cần được rã đông khoảng 2 tiếng bằng

cách hạ nhiệt độ từ từ xuống để tránh vi khuẩn sốc nhiệt gây chết. Để hoạt hóa vi

khuẩn tiến hành tăng sinh với 3 ml môi trường TSB cho 40 gl dịch vi khuẩn rồi 10 ml

môi trường với 0,5 ml dịch và 100 ml môi trường với 1 ml dịch, ở mỗi giai đoạn này

đều ủ ở 370C trong 100 rpm từ 10 - 12 giờ.

Thực hiện lấy tế bào vi khuẩn: huyền phù vi khuẩn sau đó được ly tâm trong 15

phút ở 5000 rpm để tách sinh khối ra khỏi môi trường rồi rửa sinh khối vi sinh vật

bằng 3 lần nước cất vô trùng và pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độ đục tương

đương 0,5 MC Farland. Huyền phù vi khuẩn này được dùng trong các khảo sát hoạt

tính kháng khuẩn.

2.2.2.3. Chuẩn bị pha cao củ cải ở các nồng độ khác nhau

Cao củ cải trắng được pha trong dung dịch DMSO 5% vô trùng với các nồng độ

1600, 800, 400, 200 và 100 mg/ml. Cao với các nồng độ khác nhau sau đó được cho

lên khoanh giấy (đường kính 6 mm) vô trùng. Các kháng sinh được sử dụng để đối

chứng là ampicillin (10 gg/đĩa), gentamycin (10 gg/đĩa), tetracycline (30 gg/đĩa) dùng

cho khuẩn và terbinaílne (1 mg/ml pha trong DMSO 5%) dùng cho mốc, chứng âm là

dung dịch DMSO 5% vô trùng.

2.2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng

Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết được xác định bằng phương

pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Hadacek và cộng sự (2000). Theo đó, hoạt tính

kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách đo bán kính vòng ức chế vi sinh

vật (BK) theo công thức BK (mm) = D - d với D là đường kính vòng vô khuẩn và d là

đường kính khoanh giấy kháng.

Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch có chứa các chủng vi

khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện

bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.

Cách tiến hành:

♦♦♦ Đối với nấm mốc

Pha môi trường PDA (39 g/l), hấp tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội đến

40 - 500C, thực hiện đổ đĩa Petri, ủ trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ thường để kiểm tra

môi trường không bị nhiễm.

Cho vào đĩa petri 100 pl dung dịch đã chuẩn bị ở mục 2.2.2.2, trang đều dịch

nấm mốc trên đĩa thạch, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy kháng sinh lên đĩa

thạch hoặc dùng dụng cụ để đặt khoanh giấy kháng sinh nhẹ nhàng lên đĩa thạch.

Mỗi đĩa petri được đặt 7 khoanh giấy

Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức

chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế.

- 5 đĩa giấy chứa 10 pl cao củ cải trắng với các nồng độ khác nhau.

- 1 đĩa chứng âm chứa 10 pl dung dịch DMSO 5% vô trùng.

- 1 đĩa giấy chứng dương là kháng sinh có nồng độ được trình bày ở mục 2.2.2.3.

Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh

giấy khuếch tán trên mặt thạch.

Lật ngược các đĩa thạch và ủ ấm ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 - 48 giờ.

♦♦♦ Đối với vi khuẩn

Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán

trên đĩa thạch. Cho vào mỗi đĩa Petri 25 ml môi trường MHA vô trùng (khoảng 40 -

500C) và 1 ml dịch vi khuẩn mật độ 1,5 x 106 CFU/ml, lắc đều, để yên khoảng 45 phút

cho môi trường đông đặc. Mỗi đĩa Petri được đặt 7 đĩa giấy, trong đó gồm:

- 5 đĩa giấy chứa 10 pl cao củ cải trắng với các nồng độ khác nhau đã trình bày ở

mục 2.2.2.4.

- 1 đĩa chứng âm chứa 10 pl dung dịch DMSO 5% vô trùng.

- 1 đĩa giấy chứng dương là kháng sinh có nồng độ như đã trình bày trong phần

2.2.2.3.

Mỗi nồng độ được tiến hành lặp lại 3 lần. Các đĩa được ủ ở 37oC trong vòng 16 -

Đ o đ ư ờ n g k ín h v ò n g k h á n g k h u ẩ n từ 2 đ iể m đ ố i x ứ n g n h a u trê n đ ư ờ n g trò n đi q u a tâ m c ủ a đ ĩa g iấ y

Đ ĩa g iấ y đ ặ t lên m ô i tr ư ờ n g c h ư a c ó v ò n g k h á n g k h u ẩ n x u n g q u a n h đ ĩa g iấ y d = 0 m m

Đ ĩa P etri c ó sẵ n m ô i trư ờ n g v à vi k h u ấ n

20 giờ. Đường kính vùng ức chế được đo bằng thước đo đơn vị mm [42].

Hình 2.2. Mô tả cách đo vòng tròn kháng khuẩn (Hudzicki, 2009)

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

2.2.2.5. Xử lý số liệu

Kết quả vòng kháng khuẩn đo được sẽ được tính từ trung bình của các lần lặp

lại, thể hiện theo dạng trung trình ± SD.

Kiểm tra sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phân tích ANOVA và LSD

trên phần mềm Statgraphics.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao củ cải trắng

Theo Kukum Agarwal và Rajana Varma (2014) trong củ cải có các nhóm chất

alkaloid, glycoside, triterpenoid và steroid nhưng không tìm thấy sự hiện diện của các

hợp chất carbohydrate, đường khử, flavonoid, tannin, hợp chất phenolic, saponin,

protein và acid amin. Tuy nhiên, G. Aruna, Venu G. Yerragunt, Akondi B. Raju

(2012) cũng đã nghiên cứu các hợp phần có tính chất dược lý trong củ cải trắng và đã

xác định được đó là các flavonoid, glycoside, alkaloid, saponin, tannin, polyphenol,

anthocyanin, glucosinolate và isothiocyante. Nghiên cứu của Safia Janiua, Maliha

Shahid, Fakhir-i-Abbas (2013) cũng cho thấy trong củ cải trắng tồn tại các hợp chất có

tác dụng chữa bệnh như tannin, saponin, flavonoid, phlobatannin, anthraquinone,

carbohydrate, đường khử, steroid, phytosterol, alkaloid, acid amin, terpenoid, cardiac

glycoside và chalcone [2, 18].

Để xác định sơ bộ thành phần các chất có trong mẫu củ cải khảo sát, chúng tôi

tiến hành định tính một số hợp chất có trong mẫu như đã trình bày ở phần 2.2.2.1. Kết

quả ghi nhận được thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả định tính các hợp chất có trong mẫu cao củ cải trắng

Thí nghiệm Kết quả Kết luận

1. Định tính alkaloid

+

2. Định tính tannin

+ Thử nghiệm FeCl3

+ Thử nghiệm chì acetate

+ Thử nghiệm gelatin

3. Định tính anthraquinones

4. Định tính saponin

Thử nghiệm 1

Thử nghiệm 2

5. Định tính ílavonoids

+ Thử nghiệm NaOH

+ Thử nghiệm FeCỈ3

Từ 5 thử nghiệm khảo sát định tính như trình bày, kết quả có 3 thử nghiệm đạt

dương tính:

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

- Alkaloids

- Tannin

- Flavonoids

Kết quả này tương tự với các nghiên cứu đã trình bày ở trên. Có 2 thử nghiệm

thu được kết quả âm tính là saponin và anthraquinones. Theo chúng tôi có thể là do sự

khác nhau về nguồn nguyên liệu, bởi thành phần của nguyên liệu chịu ảnh hưởng rất

nhiều của giống, đất đai, thổ nhưỡng, điều kiện chăm sóc, ...

Từ kết quả định tính xác định được trong củ cải trắng có hợp chất alkaloid,

tannin và flavonoid. Các hợp chất sinh học có khả năng kháng khuẩn nên theo chúng

tôi có lẽ sự kháng khuẩn của cao củ cải trắng là do các hợp chất này tạo ra.

3.2. Kết quả kháng khuẩn và nấm mốc của cao củ cải trắng

3.3.1. Kết quả kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của cao củ cải trắng đã được nghiên cứu ở các nồng độ

khác nhau (100; 200; 400; 800; 1600 mg/ml) chống lại 4 chủng vi khuẩn gây bệnh bao

gồm hai chủng Gram âm (Salmonella typhi - ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa

- ATCC 9027); và hai chủng Gram dương (Staphylococus aureus - ATCC 6538,

Bacillus cereus - VTCC 1005).

Khả năng kháng khuẩn được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển

của vi khuẩn được thể hiên qua đường kính kháng khuẩn được tạo ra trên đĩa Petri

được trình bày ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Đường kính vòng kháng khuẩn của cao củ cải trắng (mm)

Nồng độ STT B. cereus S. typhi P. aeruginosa S. aureus (mg/ml)

15,56c ± 0,88 13,67c ± 0,71 17,89b ± 0,60 16,78c ± 0,67 1 1600

15,00c ± 0,50 13,33c ± 0,87 15,00c ± 0,71 15,89d ± 0,60 2 800

13,89d ± 1,05 11,89d ± 1,27 12,22d ± 0,44 14,11e ± 0,33 3 400

12,67e ± 0,50 11,89d ± 1,27 10,67e ± 0,50 13,33f ± 0,50 4 200

9,89e ± 1,67 8,78f ± 0,67 11,56g ± 0,73 5 100 11,56f ± 0,88

8,67g ± 0,58 19,00a ± 0,00 9,67h ± 0,58 0 6 Ampicilin

16,67b ± 1,15 14,67b ± 0,58 21,00a ± 0,00 18,67b ± 1,15 7 Gentamycin

24,67a ± 1,15 19,00a ± 1,00 22,33a ± 0,58 0 8 Tetracycline

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

Trong cùng một cột, các số có chữ số mũ khác nhau thì khác nhau ở mức ý nghĩa a

= 0,05.

Theo bảng 3.2 khi đánh giá sơ bộ về khả năng kháng khuẩn của cao củ cải trắng

trên từng chủng vi khuẩn chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:

- Trên chủng vi khuẩn B. cereus khi khảo sát ở các nồng độ chúng tôi nhận thấy

ở hai nồng độ 1600 mg/ml và 800 mg/ml không có chênh lệch đáng kể và không khác

nhau ở mức ý nghĩa a = 0,05, kết quả lần lượt là 15,56 ± 0,88 mm và 15,00 ± 0,50

mm. Các nồng độ còn lại là 400 mg/ml, 200 mg/ml và 100 mg/ml kết quả thu được ở 3

nồng độ trên lần lượt là: 13,89 ± 1,05, 12,67± 0,50 và 11,56 ± 0,88 mm. Kết quả cho

thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao củ cải trắng đối với chủng B. cereus tương đối cao,

nhận thấy dịch chiết củ cải có khả năng kháng chủng này tốt kể cả ở nồng độ thấp.

- Trên chủng S. typhi khi khảo sát các nồng độ trên, chúng tôi nhận thấy rằng

hai nồng độ đầu là 1600 mg/ml và 800 mg/ml có kết quả ghi nhận lần lượt là 13,67 ±

0,71 mm và 13,33 ± 0,87 mm không khác nhau ở mức ý nghĩa a = 0,05. Mặt khác, ở

hai nồng độ tiếp theo là 400 mg/ml và 200 mg/ml hoàn toàn không khác nhau, kết quả

thu được ở cả hai nồng độ là 11,89 ± 1,27 mm. Và nồng độ cuối cùng là thấp nhất so

với các nồng độ trước với kết quả là 9,89 ± 1,67 mm. Qua kết quả trên, chúng tôi nhận

thấy đối với chủng S. typhi ở các nồng độ gần nhau thì khả năng kháng của cao củ cải

hầu hết cho ra kết quả tương đương nhau, ở nồng độ cuối kết quả thu được thấp hơn

nhiều. Hầu như với chủng này cao củ cải kháng yếu hơn so với chủng B. cereus.

- Trên chủng P. aeruginosa khi chúng tôi tiến hành khảo sát với 5 nồng độ trên,

nhận thấy ở tất cả các nồng độ đều có sự khác biệt nhau ở mức ý nghĩa a = 0,05. Cụ

thể ở nồng độ cao nhất và nồng độ thấp nhất thu được kết quả lần lượt là 17,89 ± 0,60

mm và 8,78 ± 0,67 mm, kết quả cho thấy hoạt tính cao củ cải giảm dần từ nồng độ cao

nhất đến nồng độ thấp nhất. Dựa theo kết quả ghi nhận được, chúng tôi nhận thấy với

chủng P. aeruginosa, cao củ cải ở nồng độ cao (1600 mg/ml) có khả năng kháng tốt và

càng dần về nồng độ thấp thì hoạt tính giảm dần và có xu hướng giảm đi một nửa so

với nồng độ cao nhất.

- Cuối cùng là chủng S. aureus, tương tự như chủng P. aeruginosa, chúng tôi

nhận thấy các nồng độ khảo sát có sự khác biệt nhau ở mức ý nghĩa a = 0,05. Mặc dù

chủng S. aureus có kết quả giảm dần từ nồng độ cao nhất đến nồng độ thấp nhất tương

tự như P. aeruginosa nhưng theo kết quả ghi nhận được ở nồng độ cao củ cải là 100

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT

mg/ml thì cao củ cải vẫn giữ được hoạt tính kháng tốt (11,56 ± 0,73 mm). So với hoạt

tính ở B. cereus đối với nồng độ 100 mg/ml thì cao củ cải có khả năng kháng tương

đương đối với hai chủng này.

Dựa trên kết quả thí nghiệm với DMSO 5%, các mẫu chứng âm không xuất hiện

vòng kháng khuẩn, điều này được khẳng định khi đa số các thí nghiệm về kháng khuẩn

đều dùng DMSO làm chứng âm [33]. DMSO không kháng khuẩn ở tất cả các dịch

chiết với các dung môi khác nhau. Vì vậy có thể kết luận rằng DMSO hòa tan đa số

các hợp chất và sử dụng làm chứng âm với khuẩn mà không ảnh hưởng đến kết quả

kháng khuẩn [29].

Cao củ cải trắng có khả năng ức chế sự phát triển của cả 4 chủng vi khuẩn thử

nghiệm. Mức độ kháng phụ thuộc nồng độ của cao sử dụng. Hiệu quả kháng của cao

củ cải tốt nhất trên P. aeruginosa và thấp nhất với S. typhi. Đối với S. aureus và B.

cereus, mức độ kháng không cao như P. aeruginosa, chỉ thấy được sự khác biệt rõ nét

ở nồng độ cao nhất (1600 mg/ml) và nồng độ thấp nhất (100 mg/ml), hầu như hoạt tính

kháng không giảm đáng kể khi so sánh với những nồng độ gần kề nhau. Tuy nhiên, khi

giảm nồng độ xuống còn 100 mg/ml thì vòng kháng khuẩn có đường kính ghi nhận

được ở hai chủng vi khuẩn S. aureus và B. cereus là khá cao và cao hơn cả P.

aeruginosa khi ở cùng nồng độ khảo sát thấp, kết quả thu được lần lượt của S. aureus,

B. cereus là 11,56 ± 0,73 mm; 11,56 ± 0,88 mm.

Ở nồng độ 1600 mg/ml, hiệu quả kháng của cao củ cải thấp hơn của tetracycline

mức 30 pg, tương đương với 10 pg gentamycin và cao hơn 10 pg ampicilin (trừ S.

typhi với vòng kháng đạt 19,00 ± 0,00 mm). Đặc biệt, với P. aeruginosa, hai kháng

sinh là ampicilin và tetracycline không có khả năng kháng với chủng này, nhưng cao

củ cải trắng lại có khả năng kháng tốt, nồng độ 100 mg/ml vẫn cho thấy vòng kháng

đạt 8,78 ± 0,67 mm.

Hình 3.1. Khả năng kháng B. cereus của cao củ cải trắng

Hình 3.2. Khả năng kháng P. aeruginosa của cao củ cải trắng

Hình 3.3. Khả năng kháng S. aureus của cao củ cải trắng

Hình 3.4. Khả năng kháng S. typhi của cao củ cải trắng

(1): chứng âm DMSO 5%, (2): 1600mg/ml, (3): 800 mg/ml, (4): 400 mg/ml,

(5): 200 mg/ml, (6): 100 mg/ml, (7): chứng dương gồm 3 loại (a) Ampicillin ,

(b) Gentamycin, (c) Tetracycline

3.3.2. Kết quả kháng nấm mốc

Hoạt tính kháng nấm của cao củ cải trắng đã được nghiên cứu ở các nồng độ

khác nhau (100; 200; 400; 800; 1600 mg/ml) chống lại chủng nấm mốc gây bệnh như

A. flavus và F. solani. Khả năng kháng nấm được xác định dựa trên khả năng ức chế

sự phát triển của nấm mốc được thể hiện qua đường kính kháng nấm được tạo ra trên

đĩa petri được trình bày ở bảng 3.3.

Hình 3.6. Khả năng kháng A. flavus của cao củ cải trắng

Hình 3.5. Khả năng kháng F. solani của cao củ cải trắng

(0): chứng âm DMSO 5%, (1): 1600mg/ml, (2): 800 mg/ml, (3): 400 mg/ml,

(4): 200 mg/ml, (5): 100 mg/ml, (tâm): chứng dương gồm loại (Ter) Terbinaíine

Bảng 3.3. Đường kính vòng kháng nấm của cao củ cải trắng (mm)

Hiệu số vòng kháng đối với các VSV kiểm định

D-d (mm) STT Nồng độ (mg/ml)

A. flavus F. solani

11,5b ± 0,84 0,0 1600 1

8,5c ± 0,84 0,0 800 2

6,83d ± 0,41 0,0 400 3

5,83f ± 0,41 0,0 200 4

0,0 0,0 100 5

39,33a ± 0,58 6

21,0 ± 1,73 Terbinafine ---------- -------------------------------- 7------ ---------7 -------------------------------- Trong cùng một cột, các số có chữ số mũ khác nhau thì khác nhau ở mức ý nghĩa a

= 0,05.

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

* Nhận xét

DMSO 5% là mẫu chứng âm không thể kháng mốc giống với khuẩn được trình bày

ở 3.3.1.

Loại thuốc kháng Terbinafine có thể kháng sinh hai loại nấm mốc A. flavus và F.

solani. Thuốc kháng sinh có hoạt tính kháng cao hơn và tốt hơn so với dịch chiết cao

của củ cải trắng.

Dịch cao chiết từ củ cải có hoạt tính kháng đối với chủng A. flavus nhưng không có

hoạt tính kháng đối với chủng F. solani.

• Với nồng đồ cao 1600 mg/ml và 800 mg/ml tôi nhận thấy rằng vòng kháng

sinh to,rõ ràng và có sự chênh lệch khá nhiều với kết quả lần lượt là 11,5 ± 0,84; 8,5 ±

0,84 mm và khác nhau ở mức độ ý nghĩa a = 0,05. Các nồng độ còn lại 400 mg/ml,

200 mg/ml và 100mg/ml có sự chênh lệch nhiều hơn và nhận thấy được sự khác biệt rõ

nét kết quả lần lượt là 6,83 ± 0,41; 5,83 ± 0,41; 0 mm. Nồng độ cao có thể kháng được

nấm mốc ở 200 mg/ml. Ở nồng độ 100 mg/ml thì cao của củ cải trắng không có hoạt

tính kháng. Vì khi nồng độ cao càng thấp thì hoạt tính kháng càng giảm. Ở nồng độ

200 mg/ml vẫn còn hoạt tính kháng.

Nồng độ dịch chiết củ cải trắng (mg/ml)

uA.flavus u p. aeruginosa kái s. aureus

Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện khả năng kháng khuẩn của cao củ cải trắng từ 4 chủng vi

khuẩn và nấm mốc khác nhau

3.4. Bàn luận

Các kháng sinh chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm gentamycin,

ampicillin và tetracycline, terbinafine.

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

Trong đó, gentamycin là một kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, có khả

năng kháng hiệu quả nhiều loại bệnh nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn Gram âm và

Gram dương gây ra. Cơ chế tác dụng của gentamycin là ức chế tổng hợp protein và

phá vỡ toàn bộ màng tế bào vi khuẩn. Gentamycin khuếch tán vào trong tế bào và

được vận chuyển qua màng tế bào chất nhờ năng lượng từ hệ thống vận chuyển

electron của một quá trình phụ thuộc vào O2. Pha vận chuyển này có thể bị ức chế bởi

các cation Ca2+, Mg2+, làm giảm pH và tăng áp lực thẩm thấu. Sau khi qua màng sẽ

được vận chuyển nhanh đến gắn với các tiểu đơn vị của ribosome làm giảm độ chính

xác của các RNA thông tin, dẫn đến kết hợp sai các acid amin trong chuỗi polypeptide

của vi khuẩn [7, 37].

Ampicillin là kháng sinh phổ rộng đầu tiên hoạt động chống lại vi khuẩn Gram

dương bao gồm Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, S. aureus và một

số loài Enterococcus. Hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram âm bao gồm Neisseria

meningitidis, Haemophilus influenzae và một số loài Enterobacteriaceae. Ampicillin

nằm trong nhóm penicillin kháng sinh P-lactam và là một phần của họ aminopenicillin

[3, 27]. Ampicillin hoạt động như một chất ức chế không thuận nghịch của enzyme

transpeptidase, là một enzyme cần thiết của vi khuẩn để tạo nên thành tế bào [1, 9].

Ampicillin ức chế giai đoạn cuối cùng của sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn trong sự

phân đôi tế bào, dẫn đến việc phân tách tế bào. Do đó, cơ chế của ampicillin là tác

động vào quá trình nhân lên của vi khuẩn, ức chế sự tổng hợp mucopeptide của màng

tế bào vi khuẩn [27, 1].

Tetracycline ức chế rất nhiều phản ứng enzyme thiết yếu cho các quá trình quan

trọng của tế bào vi khuẩn. Các phản ứng sinh hóa nhạy cảm nhất được ức chế là sự

tổng hợp các protein [7]. Tetracycline hoạt động bằng cách liên kết đặc hiệu với

ribosome 30S của vi khuẩn, ngăn sự gắn kết của aminoacyl tRNA với phức hợp RNA-

ribosome. Đồng thời tetracycline ức chế các bước khác của quá trình tổng hợp protein.

Tetracycline cũng có thể làm thay đổi màng tế bào chất và điều này là nguyên nhân

làm đảo lộn trật tự các nucleotide và các hợp chất khác ra khỏi tế bào. Do vậy mà

tetracycline không trực tiếp giết chết vi khuẩn mà thay vào đó ức chế màng tế bào của

vi khuẩn [26, 4].

Terbinafine có tác dụng là ảnh hưởng đến khả năng tạo chất hóa học là các sterol

của nấm. Các sterol là thành phần quan trọng của màng tế bào nấm và liên kết chúng

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT

với nhau. Sự ảnh hưởng này làm suy yếu màng tế bào. Terbinafine can thiệp chọn lọc

vào giai đoạn đầu của quá trình sinh tổng hợp ergosterol, dẫn đến sự thiếu hụt

ergosterol và làm tăng sự tích tụ nồng độ squalene trong nội tế bào và làm chết tế bào

nấm. Terbinafine phát huy tác dụng bằng cách ức chế squalene epoxidase trong màng

tế bào nấm [10].

Nói về khả năng kháng khuẩn và nấm của các hợp chất có nguồn gốc thực vật, đã

có nhiều nghiên cứu báo cáo về hoạt tính của các loại cây có khả năng kháng khuẩn và

nấm cao. Và khi so sánh với dịch chiết cao thô của củ cải trắng mà tôi nghiên cứu, tôi

nhận thấy rằng so với các loại cây khác, dịch chiết cao thô của củ cải có hoạt tính

tương đối cao. Mặc dù dịch chiết cao thô của củ cải không phải là loại cây có hoạt tính

kháng khuẩn và nấm cao nhất nhưng nó cũng được xem là một trong những loại cây

lấy củ có khả năng kháng và diệt khuẩn tốt. Cụ thể như sau:

- Zdenka Cvetni (2004), nghiên cứu về chiết xuất từ hạt bưởi có khả năng

kháng các vi khuẩn thử nghiệm. Chiết xuất ethanol cho thấy hoạt tính thấp (vùng ức

chế 10 - 12 mm) đối với các chủng vi khuẩn khảo nghiệm B. cereus, S. aureus. Kết

quả thu được cụ thể như sau: B. cereus 12 mm, S. aureus 10 - 12 mm. Riêng đối với

P. aeruginosa thì kết quả cho thấy chiết xuất từ hạt bưởi không có tác dụng đối với vi

khuẩn này. Nhìn chung, nghiên cứu này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất

tương đối thấp, so với nghiên cứu về cao củ cải trắng thì thấp hơn nhiều và cao củ cải

trắng còn có khả năng kháng được P.aeruginosa với kết quả kháng cao [9].

- Theo khảo sát của Võ Thị Mai Hương (2009) về hoạt tính kháng khuẩn của lá

muồng trâu được thử nghiệm với các chủng vi sinh vật cho thấy lá có khả năng kháng

khuẩn tương đối tốt. Đem dịch chiết này tiến hành thử nghiệm với các chủng vi khuẩn

được tuyển chọn (trong đó có S. aureus), kết quả cho thấy khả năng kháng của dịch

chiết này đối với S. aureus là 18,30 ± 0,75 mm. So với cao củ cải trắng ở nồng độ

1600 mg/ml là 16,78 ± 0,67 mm, cho thấy khả năng kháng của cao củ cải trắng so với

dịch chiết nguyên chất của lá muồng trâu không chênh lệch nhiều và tương đối cao

[45].

- Theo kết quả nghiên cứu của Faiyaz A và cộng sự (2012) từ hạt củ cải đối với

các chủng vi khuẩn gây bệnh như S. aureus, P. aeruginosa, S. typhi. Theo nghiên cứu

này thì hạt củ cải chiết xuất từ ethanol có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất và đường

kính nằm trong khoảng từ 12 - 21 mm. Đối với kết quả từ cao củ cải của chúng tôi đối

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT

với các chủng vi khuẩn thử nghiệm gồm S. aureus, P. aeruginosa, S. typhi thì đường

kính vòng kháng khuẩn ở nồng độ 1600 mg/ml lần lượt là 16,78 mm, 17,89 mm và

13,67 mm. Dựa vào kết quả trên, hoạt tính kháng khuẩn từ cao củ cải là tương đương

với chiết xuất từ hạt củ cải [11].

- Theo báo cáo của Jinxu Sun (2012) về quả mâm xôi nhằm xác định hoạt tính

kháng khuẩn của quả này với các chủngvi khuẩn. Kết quả thu được từ thử nghiệm trên

nhiều loại vi khuẩn như E.coli, S. aureus, B. subtiỉis,.. .Riêng với S. aureus thì đường

kính vòng kháng khuẩn theo báo cáo này đạt 13,50 mm. So với nồng độ cao 1600

mg/ml thì cao củ cải có hoạt tính cao hơn và đường kính vòng kháng khuẩn đạt đến

16,78 mm [32].

- Nghiên cứu của Hoàng Văn Tuấn (2013) cũng đã khẳng định dịch chiết giàu

ílavonoid từ cây diếp cá khi trích ly bằng ethanol với hàm ẩm 19,21% có tác dụng

kháng khuẩn trên 4 đối tượng nghiên cứu gồm B. subtilis 18 mm, E. coli 17 mm, P.

aeruginosa 14 mm, S. aureus 20 mm. So sánh với cao củ cải trắng của chúng tôi đối

với 2 chủng P. aeruginosa và S. aureus, chúng tôi nhận thấy cao củ cải trắng có hoạt

tính cao hơn ở P. aeruginosa và thấp hơn ở S. aureus so với dịch chiết từ cây diếp cá.

Và kết quả cao củ cải chúng tôi ghi nhận đường kính kháng khuẩn đối với P.

aeruginosa và S. aureus lần lượt là 17,89 mm và 16,78 mm [38].

Antara Sen (2004), nghiên cứu về chiết xuất từ lá Melia azedarach L có khả năng

kháng các vi khuẩn và nấm thử nghiệm. Chiết xuất ethanol, methanol, este dầu hỏa,

nước cho thấy hoạt tính cao (vùng ức chế 20 - 22 mm) đối với các chủng vi khuẩn

khảo nghiệm A. flavus. Kết quả thu được cụ thể lần lượt như sau: A. flavus 21,5 ± 0,32;

18,3 ± 0,54; 17,5 ± 0,56; 11,3 ± 0,41 mm. Nhìn chung, nghiên cứu này cho thấy hoạt

tính kháng khuẩn của chiết xuất tương đối cao, so với nghiên cứu về dịch chiết cao thô

của củ cải trắng thì tương đối cao hơn [5].

Qua nghiên cứu trên, nhận thấy rằng các thành phần trong cao củ cải trắng có

hoạt tính kháng khuẩn và nấm hiệu quả, là cơ sở cho việc nghiên cứu về các loại virus

và phân lập cũng như phân tích các hợp chất, thành phần có trong đó để ứng dụng vào

thực tiễn và các nghiên cứu y học, dịch tễ.

KẾT LUẬN

Qua thời gian thực hiện đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của

củ cải trắng (Raphanus sativus L.) ” chúng tôi thu được các kết quả như sau:

- Kết quả định tính cho thấy các hợp chất có trong cao củ cải trắng thu được bao

gồm: flavonoid, alkaloid và tannin.

- Kết quả khảo sát về hoạt tính của cao củ cải đối với các chủng vi khuẩn được

thử nghiệm cho thấy ở nồng độ cao 1600 mg/ml đạt đường kính vòng kháng khuẩn cao

nhất ở 4 loại chủng khuẩn và loại chủng mốc và ở nồng độ cao 100 mg/ml thì cao củ

cải trắng vẫn còn hoạt tính kháng. Ngoài ra, ở nồng độ 1600 mg/ml nhận thấy cao củ

cải có khả năng kháng tốt hơn kháng sinh ampicillin, tetracycline và tương đương với

hai loại kháng sinh còn lại là gentamycin, terbinafine.

Các kết quả trên sẽ là nghiên cứu tiền đề khi triển khai ứng dụng dịch chiết của

củ cải vào sản xuất, chế biến một số thực phẩm có hoạt tính kháng khuẩn hay bảo quản

thực phẩm theo hướng dùng các hợp chất sinh học tự nhiên, an toàn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

> Tài liệu bằng tiếng anh:

[1] . Adnan, S., Paterson, DL., Lipman, J., Roberts, JA., 2013,

‘Ampicillin/sulbactam: its potential use in treating infections in critically ill

patients’, International Journal of Antimicrobial Agents, Vol 42, No. 5, pp. 384-389.

[2] . Agarwal, Kumkum, Varma, Ranjana, 2014, ‘Radical Scavenging Ability and

Biochemical Screening of a Common Asian Vegetable - Raphanus sativus

L.’,Intemational Journal of Pharmaceutical. Sciences Review and Research, Vol. 27,

No. 1, pp. 127 - 134.

[3] . Akova, M., 2008, ‘Sulbactam-containing beta-lactamase inhibitor

combinations’, European Society of Clinical Microbiology and Infectious

Diseases,Vol.14, Suppl 1, pp. 185- 188.

[4] . Akul Mehta, 2011, Mechanism of Action of Tetracyclines, 27 May

2011,

[5] . Antara Sen và Amla Batra, 2012, ‘ Evaluation Of Antimicrobial Activity Of

Different Solvent Extracts Of Medicinal Plant: Melia Azedarach L .’, International

Journal Of Current Pharmaceutial Research, Vol. 4, pp. 975 - 7066.

[6] . Aruna, G., et al., 2012, 'Photochemistry and pharmacology of Raphanus

sativus’. International Journal of drug formulation and research, Vol. 3, Issue 1, pp. 43

- 52.

[7] . Begg, F.J., et al., 1995,‘Aminoglycosides - 50 years on’, British Journal of

Clinical Pharmacology, Vol. 39, No. 6, pp. 597 - 603.

[8] . CAB International, 2006. Crop Protection Compendium, 2006 Edition

Wallingford, UK: CaB International. www.cabicompendium.org/cpc,S'e/ec/e<7 texts for

Fusarium.

[9] . Cvetni, Zdenka, 2004, ‘Antimicrobial activity of grapefruit seed and pulp

ethanolic extract’, Acta Pharmaceutica, Vol. 54, No. 3, pp. 243 - 250.

[10] . C. J. Jessup et al., 2000, ‘An Evaluation Of The In Vitro Activity Of

Terbinafine’, Medied Mycology, Vol. 38, pp. 155 - 159.

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

[11] . Faiyaz, A., Izharul, H., Danish, K. Chishti, Haqeeq, A., 2012,

‘Antibacterial activity of Raphanus sativus Linn. Seed extract’, Global journal of

medical research, Vol. 12, Issue 11, Version 1.0, pp. 24 - 33.

[12] . Gutierrez, Rosa M.P., Perez, Rosalinda L., 2004, 'Raphanus sativus

(Radish): their chemistry and biology ’, The Scientific Word journal, Vol. 4, pp. 811 -

837.

[13] . H. Caglar Kaymak và Faika Yarali và Mesude Figen DONMEZ 2015, ‘The

Effects of Bio-priming with PGPR on Germination of Radish (Raphanus sativus L.)

Seeds under Saline Conditions’, Turkish Journal of Agriculture and Forestry, Vol. 33,

pp. 23 - 28.

[14] . Hirotaka Katsuzaki và Masnobu Ota, 2004, ' Chemistry and antioxidative

activity of hot water extract of Japanese radish (daikon) Article in BioFactors,

Vol. 21, pp. 211-400.

[15] . Hauser, Alan R.. 2013. Antibiotic Basics for Clinicians. Lippincott

Williams and Wikins, pp. 25-28.

[16] . Jones, L. J. L., Thorpe, J. P., Wallis, G. P., 1982, ' Genetic divergence in

four species of the genus Raphanus: Implications for the ancestry of the domestic

radish R. sativus’. J. Linnean Society, Vol. 18, No. 1, pp. 35 - 48.

[17] . Jahan, M.G.S., et al., 2014, ' Correlation between P-amylase activity and

starch content in different cultivars of radish (Raphanus sativus L.) ’, Biotechnology,

Vol. 9, No. 7, pp. 298 - 302.

[18] . Janiua, Safia., Shahid, Maliha., Fakhir-i-Abbas, 2013, ‘Phytochemical

nanlysis and in vitro antibacterial activity of root peel extract of Raphanus sativus

L.var niger’, Advancement in Medical plant research, Vol. 1, No. 1, pp. 1 - 7.

[19] . K. Agarwal, R. Varma , 2014, ‘ Wound Healing Biomaterials’, Functional

Biomaterials, Vol. 2.

[20] . Kole, C., 2007, ' Genome mapping and molecular breeding in plants’,

New York: Springer Berlin Heidelberg, Vol. 5: Vegetable.

[21] . Lim, T.K., 2015. Edible medicinal and non-medicinal plant. Springer

Dordrecht Heidelberg New York London, Vol. 9: Modified Stems, Roots, Bulbs, pp.

829 - 869.

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

[22] . Morgan, W., Midmore, D., 2003. Daikon in Australia. Rural industries

research and development corporation, pp. 2 - 4.

[23] . Narisa Kamkaen, Chantana Mekseepralard và Jenny Wilkinson, 2010,

‘Antimicrobial and Antioxidant Activities of Traditional Thai Herbal Remedies for

Aphthous Ulcers ‘, Phytotherapy Research, Vol. 24, pp. 31 - 51.

[24] . Ningthoujam, Debananda Singh, Ningthoujam, Shovarani, 2008, ‘Isolation

and Characterization of a Pseudomonas aeruginosa Strain DN1 Degrading p-

Nitrophenol’, Research Journal of Microbiology, Vol. 3, No. 5, pp. 345 - 351.

[25] . R. Jakmatakul, Rutt Suttisri và Parkpoom Tengamnuay, (2009),

‘Evaluation of antityrosinase and antioxidant activities of Raphanus sativus root:

Comparison between freeze-dried juice and methanolic extract’, Thai Journal of

Pharmaceutical Sciences, Vol. 33, pp. 22 - 33.

[26] . Rafal Klajn, 2002, Chemistry and chemical biology of tetracyclines,

12/12/2002,

[27] . Rafailidis, PI., Ioannidou, EN., Falagas, ME., 2007, ‘Ampicillin/Sulbactam

Current Status in Severe Bacterial Infections’, Drugs, Vol 67, No. 13, pp. 1829-1849.

[28] . Sarowar Jahan, M. G., et al., 2011, 'Screening of some enzyme and

nutrients in radish (Raphanus sativus L.) roof, Philippine Journal of Veterinary and

Animal Sciences, Vol. 37, pp. 89 - 100.

[29] . Senthilkumar, A., Venkatesalu, V.,2013, ‘Chemical constituents, in vitro

antioxidant and antimicrobial activities of essential oil from the fruit pulp of wood

apple’, Industrial Crops and Products, Vol. 46, pp. 66 - 72.

[30] . Singh, Preeti, Singh, Jaspal, 2013, 'Medical and therapeutic utilities of

Raphanus sativus’, International Journal of plant, animal and environmental Sciences,

Vol. 3, Issue 2, pp. 103 - 105.

[31] . Surekha Shukla et al., 2011,‘ Antimicrobial Efficacy Of Raphanus Sativus

Root Juice’, International Joural Of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol 3,

No 5, pp 89 - 92.

[32] . Sun, J., Zhu HX., Guo J., Xiao DG., 2012, ‘Antimicrobial action of

purified raspberry flavonoid’, African Journal of Biotechnology, Vol. 11, No. 11, pp.

2704 - 2710.

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

[33] . Su, Pai-Wei, Yang, Cheng-Hong, Yang, Jyh-Femg,Su, Pei-Yu, Chuang, Li-

Yeh, 2015, ‘Antibacterial Activities and Antibacterial Mechanism of Polygonum

cuspidatum Extracts against Nosocomial Drug-Resistant Pathogens’, Molecules

2015, Vol. 20, pp. 11119 - 11130.

[34] . Syed Sultan Beevi, Mangamoori Lakshmi Narasu và Bandi Boje Gowda,

2010, ‘Polyphenolics Profile, Antioxidant and Radical Scavenging Activity of Leaves

and Stem of Raphanus sativus L.’, Plant Foods for Human Nutrition, Vol. 65, pp. 8 -

17.

[35] . Thwani, Amina N. AL., Ghanima, Kais K., Taqi, Rami A., 2014, ‘Effect of

ethanol extract of Radish (Raphanus sativus L.) seeds and Lactobacillus acidophilus

on enteropathogenic Escherichia coli in vitro and in vio’, University of Baghdad, pp.

166 - 181.

[36] . Yusuf, A. Z., Zarik, A., Shemau, Z., Abdullahi, M., Halima, S. A.

‘Phytochemical analysis of the methanol leaves extract of Paullinia pinnata linn’,

Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, Vol. 6, No. 2, pp. 10 - 16.

[37] . Zembower, T.R., et al., 1998, ‘The utility of aminoglycosidesin an era of

energing durg resistance’, International Journal of Antimicrobial Agents, Vol. 10,

K rp 5. •

1 . y i • Ạ

• ^ i

Issue 2, pp. 95 - 105.

> Tài liệu bang tiêng việt:

[38] . Hoàng Văn Tuấn, Phạm Hương Sơn, Nguyễn Thị Hiền, ‘Nghiên cứu tách

chiết và xác định một số hoạt tính sinh học của dịch chiết flavonoid từ cây diếp cá

(Houttuynia cordata thunberg) thu hái tại Hà Nội’, Tạp chí sinh học 2013, Số

35(3se), trang 183 - 187.

[39] . Lê Thanh Bình. 2012. Cơ sở vi sinh vật học thực phẩm. Nhà xuất bản

Khoa học và kỹ thuật.

[40] . Nguyễn Công Khẩn, Hà Thị Anh Đào, 2007, 'Bảng thành phần thực

phẩm Việt Nam ’,Nhà xuất bản Y học, trang 103.

[41] . Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm. 2012. Vệ sinh và an toàn thực

phẩm. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. HCM.

[42] . Phạm Hùng Vân, Phạm Thái Bình. 2013.Kháng sinh — Đề kháng kháng

sinh — Kỹ thuật kháng sinh đồ. Các vấn đề cơ bản thường gặp .Nhà xuất bản Y học,

pp. 61 - 63.

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

[43] .Phan Thúy Hiền, 2009,‘Cẩm Nang Chuẩn Đoán Bệnh Cây Ở Việt

Nam ’,http://www.impeqn.org.vn/impeqn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1066

&ID=2551

[44] . Trần Linh Thước. 2013. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước,

thực phẩm và m ĩ phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam.

[45] . Võ Thị Mai Hương, 2009, ‘Thành phần hóa sinh và khả năng kháng

khuẩn của dịch chiết lá muồng trầu (Cassia Alata L.)’, Tạp chí Khoa học, Đại học

Huế, số 52, trang 45 - 52.

[46] . https://www.slideshare.net/toinguyen vn/cm-nang-chn-on-bnh-cy-vit-nam

[47] . https://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_flavus

PHỤ LỤC

Phụ lục A. Môi trường và kháng sinh

Hình phụ lục A1. Môi trường Mueller Hinton Agar (MHA), Tryptone Soya

Broth (TSB), Saubouraud Dextrose Agar (SDA), Potato Dextrose Agar (PDA)

Hình phụ lục A2. Đĩa giấy kháng sinh gentamycin (Ge), ampicillin (Am),

tetracycline (Te), terbinafine (Ter) của công ty Nam Khoa

Phụ lục B. Kết quả nhuộm Gram của 4 chủng vi khuẩn khảo sát

Hình phụ lục B1. Kết quả nhuộm Gram của B. cereus và P. aeruginosa

Hình phụ lục B.2. Kết quả nhuộm Gram của S. aureus và S. typhi

Phụ lục C. Đếm bào tử nấm mốc trên kính hiển vi

Hình phụ lục C.1. kết quả đếm bào tử của F. solani và A. flavus

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

Phụ lục D. Cao thành phẩm

Hình phụ lục D.1. Cao củ cải

Phụ lục E. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số

liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Bacillus cereus.

Summary Statistics for duong kinh vong khang

nong Coun Average Standard Coeff. o f Mini Maxi Ran Stnd.

do t deviation variation mum mum Skewness ge

100 9 11.5556 0.881917 7.63197% 10.0 13.0 3.0 -0.262158

1600 9 15.5556 0.881917 5.66947% 14.0 17.0 3.0 -0.262158

200 9 12.6667 0.5 3.94737% 12.0 13.0 1.0 -1.04978

400 9 13.8889 1.05409 7.58947% 13.0 16.0 3.0 1.34033

800 9 15.0 0.5 3.33333% 14.0 16.0 2.0 0.0

Am 3 8.66667 0.57735 6.66173% 8.0 9.0 1.0 -1.22474

3 16.6667 1.1547 6.9282% 16.0 18.0 2.0 1.22474 Ge

3 24.6667 1.1547 4.68122% 24.0 26.0 2.0 1.22474 Te

54 14.2222 3.30047 23.2064% 8.0 26.0 18 4.62781 Total

ANOVA Table for duong kinh vong khang by nong do

Source F-Ratio P-Value D f Mean Square Sum o f Squares

Between groups 546.0 78.0 114.51 0.0000 7

Within groups 31.3333 0.681159 46

Total (Corr.) 577.333 53

Stnd. error

nong do Count Mean (pooled s) Upper limit Lower limit

9 11.5556 0.275108 11.164 11.9471 100

9 15.5556 0.275108 15.164 15.9471 1600

9 12.6667 0.275108 12.2751 13.0582 200

9 13.8889 0.275108 13.4973 14.2805 400

9 15.0 0.275108 14.6084 15.3916 800

3 8.66667 0.476501 7.98845 9.34489 Am

3 16.6667 0.476501 15.9884 17.3449 Ge

3 24.6667 0.476501 23.9884 25.3449 Te

54 14.2222 Total

Multiple Range Tests for vong khang by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

Ampicillin 3 8.66667 X

9 11.5556 X 100

9 12.6667 X 200

9 13.8889 X 400

9 15.0 X 800

9 15.5556 X 1600

3 16.6667 X Gentamycin

3 24.6667 X Tetracycline

Dịch kháng Số lần lặp lại đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

khuẩn 4 5 6 7 8 9 1 2 3

15 15 16 15 17 14 16 16 16 1600 mg/ml

15 15 15 15 15 14 15 16 15 800 mg/ml

13 14 14 14 15 13 13 16 13 400 mg/ml

12 12 13 13 13 13 12 13 13 200 mg/ml

10 11 11 11 12 12 12 13 12 100 mg/ml

16 18 16 Gentamycin

9 8 9 Ampicillin

24 24 26 Tetracycline

Phu luc F. Phu luc F. Kết quả ANOVA, LSD về sư khác biêt ở từng nồng đô cao củ cải và số liêu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Pseudomonas aeruginosa.

Summary Statistics for duong kinh vong khang

Average Coeff. o f variation nong do Cou nt Standard deviation Mini mum Maxim um Stnd. skewness Ran ge

100 9 11.5556 0.881917 7.63197% 10.0 13.0 3.0 -0.262158

1600 9 15.5556 0.881917 5.66947% 14.0 17.0 3.0 -0.262158

200 9 12.6667 0.5 3.94737% 12.0 1.0 -1.04978 13.0

400 9 13.8889 1.05409 7.58947% 13.0 16.0 1.34033 3.0

800 9 15.0 0.5 3.33333% 14.0 16.0 0.0 2.0

Am 3 8.66667 0.57735 6.66173% 8.0 9.0 1.0 -1.22474

3 16.6667 1.1547 6.9282% 16.0 18.0 1.22474 2.0 Ge

3 24.6667 1.1547 4.68122% 24.0 26.0 1.22474 2.0 Te

54 14.2222 3.30047 23.2064% 8.0 26.0 4.62781 Total 18. 0

ANOVA Table for duong kinh vong khang by nong do

Source F-Ratio P-Value D f Sum o f Mean

Squares Square

Between groups 546.0 78.0 114.51 0.0000 7

Within groups 31.3333 0.681159 46

Total (Corr.) 577.333 53

Table of Means for vong khang by nong do with 95.0 percent LSD intervals

Stnd. error

nong do Count Mean (pooled s) Lower Upper limit

limit

9 100 11.5556 0.275108 11.164 11.9471

9 1600 15.5556 0.275108 15.164 15.9471

9 200 12.6667 0.275108 12.2751 13.0582

9 400 13.8889 0.275108 13.4973 14.2805

9 800 15.0 0.275108 14.6084 15.3916

3 Ampicillin 8.66667 0.476501 7.98845 9.34489

3 Gentamycin 16.6667 0.476501 15.9884 17.3449

3 24.6667 0.476501 23.9884 25.3449 Tetracycline

54 14.2222 Total

Multiple Range Tests for duong kinh vong khang by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean

Homogeneous Groups

Ampicillin 3 8.66667 X

100 9 11.5556 X

200 9 12.6667 X

400 9 13.8889 X

800 9 15.0 X

1600 9 15.5556 X

Gentamycin 3 16.6667 X

3 24.6667 X Tetracycline

Bảng số liệu thô về đường kính kháng khuẩn của cao củ cải trắng 3 loại thuốc

kháng (gentamycin, ampicillin và tetracycline)

Dịch kháng Số lần lặp lại đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

khuẩn 4 5 6 7 8 9 1 2 3

17 19 18 18 18 18 18 18 17 1600 mg/ml

14 14 15 16 16 15 15 15 15 800 mg/ml

12 12 12 12 12 12 13 12 13 400 mg/ml

11 11 10 10 11 10 11 11 11 200 mg/ml

9 9 9 7 9 9 9 9 9 100 mg/ml

21 21 21 Gentamycin

0 0 0 Amipicillin

0 0 0 Tetracycline

Phụ lục G. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Staphylcoccus aureus.

Summary Statistics for duong kinh vong khang

nong do Coeff. o f variation Coun t Averag e Standard deviation Minim um Maxi mum Stnd. skewness Ran ge

100 9 11.5556 0.726483 6.28687% 12.0 10.0 -1.83796 2.0

1600 9 16.7778 0.666667 3.97351% 18.0 16.0 0.311654 2.0

200 9 13.3333 0.5 3.75% 14.0 13.0 1.04978 1.0

400 9 14.1111 0.333333 2.3622% 15.0 14.0 3.67423 1.0

800 9 15.0 15.8889 0.600925 3.78205% 17.0 2.0 -0.0223967

Am 3 9.0 9.66667 0.57735 5.97259% 10.0 -1.22474 1.0

3 18.6667 1.1547 6.1859% 18.0 20.0 1.22474 2.0 Ge

3 22.3333 0.57735 2.58515% 22.0 23.0 1.22474 1.0 Te

54 14.7593 2.99645 20.3021% 9.0 23.0 1.89083 Total 14. 0

ANOVA Table for duong kinh vong khang by nong do

Source F-Ratio P-Value D f Sum o f Squares Mean Square

458.315 65.4735 171.56 0.0000 7 Between groups

Within groups 17.5556 0.381643 46

Total (Corr.) 475.87 53

Multiple Range Tests for duong kinh vong khang by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

X Ampicillin 3 9.66667

X 100 9 11.5556

X 200 9 13.3333

X 400 9 14.1111

X 800 9 15.8889

X 1600 9 16.7778

X Gentamycin 3 18.6667

X 3 22.3333 Tetracycline

Bảng số liệu thô về đường kính kháng khuẩn của cao củ cải trắng và 3 loại thuốc

kháng (gentamycin, ampicillin và tetracycline).

Số lần lặp lại đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Dịch kháng khuẩn 1 4 5 6 7 8 9 2 3

16 18 16 16 17 17 17 17 17 1600 mg/ml

15 16 15 16 16 16 17 16 16 800 mg/ml

14 14 14 14 14 14 14 14 15 400 mg/ml

14 13 13 13 13 13 13 14 14 200 mg/ml

11 12 12 10 12 12 12 12 11 100 mg/ml

20 18 18 Gentamycin

9 10 10 Amipicillin

22 22 23 Tetracycline

Phụ lục H. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Salmonella Typhi.

Summary Statistics for duong kinh vong khang

Average Cou nt Standard deviation Coeff. o f variation Minim um Maxim um nong do Stnd. skewness Ran ge

100 9 9.88889 1.16667 11.7978% 8.0 12.0 0.327483 4.0

1600 9 13.6667 0.707107 5.17395% 13.0 15.0 0.742307 2.0

200 9 10.5556 1.424 13.4905% 13.0 8.0 0.028613 5.0

400 9 11.8889 1.2693 10.6763% 3.0 -0.836565 13.0 10.0

800 9 13.3333 0.866025 6.49519% 15.0 12.0 0.808122 3.0

Am 3 19.0 0.0 0.0% 19.0 19.0 0.0

3 15.0 14.0 14.6667 0.57735 3.93648% 1.0 -1.22474 Ge

3 20.0 18.0 2.0 19.0 1.0 5.26316% 0.0 Te

54 12.8148 2.85548 22.2826% 8.0 20.0 2.3389 Total 12. 0

ANOVA Table for duong kinh vong khang by nong do

Source F-Ratio P-Value D f Sum o f Squares Mean Square

Between groups 379.481 54.2116 47.35 0.0000 7

Within groups 52.6667 1.14493 46

Total (Corr.) 432.148 53

Table of Means for vong khang by nong do with 95.0 percent LSD intervals

Stnd. error

nong do Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit

100 9 9.88889 0.356671 9.38123 10.3966

1600 9 13.6667 0.356671 13.159 14.1743

200 9 10.5556 0.356671 10.0479 11.0632

400 9 11.8889 0.356671 11.3812 12.3966

800 9 13.3333 0.356671 12.8257 13.841

Ampicillin 3 19.0 0.617772 18.1207 19.8793

Gentamycin 3 14.6667 0.617772 13.7874 15.546

3 19.0 0.617772 18.1207 19.8793 Tetracycline

54 12.8148 Total

Multiple Range Tests for duong kinh vong khang by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

X 100 9 9.88889

X 200 9 10.5556

X 400 9 11.8889

X 800 9 13.3333

X 1600 9 13.6667

X Gentamycin 3 14.6667

Ampicillin X 3 19.0

X 3 19.0 Tetracycline

Bảng số liệu thô về đường kính kháng khuẩn của cao củ cải trắng và 3 loại thuốc

kháng (gentamycin, ampicillin và tetracycline)

Dịch kháng Số lần lặp lại đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

khuẩn 4 1 2 3 5 6 7 8 9

13 14 14 13 13 14 14 13 15 1600 mg/ml

13 14 13 14 13 13 15 12 13 800 mg/ml

11 13 13 13 10 10 13 12 12 400 mg/ml

10 11 12 11 10 10 8 13 10 200 mg/ml

9 10 11 10 9 10 8 12 10 100 mg/ml

15 15 14 Gentamycin

19 19 19 Ampicillin

18 20 19 Tetracycline

Phụ lục I. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng nấm mốc trên A. flavus

Summary Statistics for duong kinh vong khang

Average Coun t Standard deviation Coeff. of variation Minim um Maxim um Stnd. skewness nong do Ran ge

5.83333 0.408248 6.99854% 5.0 6.0 1.0 -2.44949 1600 6

11.5 0.83666 7.2753% 11.0 13.0 1.53672 2.0 200 6

8.5 0.83666 9.84306% 7.0 9.0 -1.53672 2.0 400 6

6.83333 0.408248 5.97437% 6.0 7.0 -2.44949 1.0 800 6

39.3333 0.57735 1.46784% 39.0 40.0 1.22474 1.0 Ter 3

27 11.6296 10.2099 87.7922% 5.0 40.0 5.11384 Total 35. 0

ANOVA Table for duong kinh vong khang by nong do

Source F-Ratio P-Value D f Sum of Squares Mean Square

2700.96 4 675.241 1591.64 0.0000 Between groups

Within groups 9.33333 0.424242 22

Total (Corr.) 2710.3 26

Table of Means for duong kinh vong khang by nong do with 95.0 percent LSD

intervals

Stnd. error

nong do Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit

1600 6 5.83333 0.265908 5.44339 6.22327

200 6 11.5 0.265908 11.1101 11.8899

400 6 8.5 0.265908 8.11006 8.88994

800 6 6.83333 0.265908 6.44339 7.22327

Ter 3 39.3333 0.376051 38.7819 39.8848

27 11.6296 Total

Multiple Range Tests for duong kinh vong khang by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

1600 6 5.83333 X

800 6 6.83333 X

400 6 8.5 X

200 6 11.5 X

Ter 3 39.3333 X

Bảng số liệu thô về đường kính kháng nấm mốc của cao củ cải trắng và thuốc

kháng terbinafine

Số lần lặp lại đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Dịch kháng

khuẩn 1 2 3 4 5 6

11 11 11 11 12 13 1600 mg/ml

8 7 9 9 9 9 800 mg/ml

7 7 7 7 7 7 400 mg/ml

6 6 6 6 6 5 200 mg/ml

39 40 39 Ter