BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NẤM MỐC TỪ BÁNH MEN ĐỂ THU NHẬN ENZYME AMYLASE
Ngành:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện: ĐỒNG THỊ MINH THANH
Lớp: 11HSH02
MSSV: 1191111040
TP. Hồ Chí Minh, 2013
Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase
LỜI CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài xin cam đoan Đồ án tốt nghiệp “Nghiên cứu tìm hiểu về
enzym amylase, amylase nấm mốc và vi khuẩn” là công trình nghiên cứu thực sự của
cá nhân, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm, dưới sự
hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Thị Hoài Hương.
Người thực hiện đề tài xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.
TP.HCM, ngày tháng 9 năm 2013
Người thực hiện đề tài
Đồng Thị Minh Thanh
LỜI CẢM ƠN
Để thực hiện đề tài này, người thực hiện đề tài xin dành lời cảm ơn chân thành
nhất gởi đến TS. Nguyễn Thị Hoài Hương, đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình
học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Người thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa KhoaCông Nghệ Sinh Học – Môi
Trường Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh cùng các quý Thầy
Cô đã tận tình giảng dạy người thực hiện đề tài trong suốt khóa học.
- Lãnh đạo Trung tâm Khuyến nông – Khuyến ngư đã tạo điều kiện giúp đỡ
người thực hiện đề tài hoàn thành tốt trong suốt chương trình học và quá trình thực
hiện đề tài tốt nghiệp.
Cuối cùng, người thực hiện đề tài xin cảm ơn đến gia đình, các anh chị em
trong bộ phận xét nghiệm Trung tâm Khuyến Nông Khuyến Ngư đã động viên và giúp
đỡ người thực hiện đề tài trong suốt quá trình học tập và làm đề tài tốt nghiệp.
Người thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn Hội đồng chấm luận án đã phản
biện, đánh giá, góp ý, giúp đỡ người thực hiện đề tài hoàn thiện luận văn tốt nghiệp
này.
ii
Chân thành cảm ơn!
Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................
MỤC LỤC .......................................................................................................................i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH .................................................................................... v
PHẦN MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 4
1.1. Giới thiệu về enzym amylase nấm mốc ................................................................ 4
1.1.1. Khái niệm về enzyme amylase ....................................................................... 4
1.1.2. Phân loại ........................................................................................................ 5
1.2. enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi khuẩn ..................................................... 5
1.3. Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc: .................................................................... 9
1.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng ....................................................................................... 9
1.3.2. Độ ẩm ........................................................................................................... 12
1.3.3. Nhiệt độ ........................................................................................................ 12
1.3.4. pH ................................................................................................................. 13
1.4. Các phương pháp thu nhận enzyme amylase ...................................................... 13
1.4.1. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề mặt ................ 13
1.4.2. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp nuôi cấy chìm. ... 15
1.5. Ứng dụng của enzyme amylase .......................................................................... 16
1.5.1. Amylase trong công nghiệp rượu – bia ........................................................ 16
1.5.2. Trong sản xuất bánh mì ............................................................................... 17
1.5.3. Trong sản xuất mật, tinh bột, malto, gluco .................................................. 17
1.5.4. Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác ...................................... 18
1.5.5. Trong các ngành công nghiệp dệt, giấy ....................................................... 18
1.5.6. Trong chăn nuôi ........................................................................................... 19
1.5.7. Trong y học .................................................................................................. 19
i
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................... 20
2.1. Vật liệu ................................................................................................................ 20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 20
2.1.2. Vật liệu và hóa chất...................................................................................... 20
2.2. Phương pháp ....................................................................................................... 22
2.2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 22
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 22
2.3. Qui trình lên men bề mặt tạo Enzym Amylase .................................................. 28
2.3.1. Qui trình công nghệ lên men bề mặt ............................................................ 28
2.3.2. Xác định hoạt tính enzyme amylase theo Wohlgemuth ............................... 29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................... 31
3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có trong bánh men cơm rượu ................. 31
3.2. Kết quả quan sát hình thái nấm mốc ................................................................... 32
3.3. Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc và chọn
lọc chủng sản xuất enzyme amylase .......................................................................... 34
3.4 Kết quả thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy chìm
.................................................................................................................................... 36
3.4.1. Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................ 36
3.4.2. Xác định hoạt tính của enzyme Amylase ...................................................... 37
3.4.3. Kết quả xác định hoạt tính của enzyme Amylase ......................................... 37
3.5. Kết quả lên men bề mặt thu enzyme amylase ..................................................... 38
3.6. Kết quả xác định hoạt tính enzyme amylase sau kết tủa .................................... 42
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 47
4.1. Kết luận ............................................................................................................... 47
ii
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................. 47
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Ghi chú Kí hiệu Tên
MT Môi trường
PGA Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)
Chợ Động – Phan Rang– Ninh Thuận Nơi lấy mẫu CĐ
Chợ Lớn – Đường Thống Nhất – TP. Phan Rang Nơi lấy mẫu CL
Chợ Ninh Sơn– Ninh Thuận Nơi lấy mẫu NS
Chợ Kim Biên – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu KB
Chợ Long Bình – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu LB
Chợ Ninh Hải – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu NH
Chợ Thuận Nam – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu TN
Chợ Ninh Phước – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu NP
Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Động M1
Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Động M2
Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Lớn M3
Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Lớn M4
Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Sơn M5
Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Sơn M6
Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Kim Biên M7
Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Long Bình M8
Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Hải M9
M10 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Thuận Nam
M11 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Phước
iii
Dd Dung dịch
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các mẫu bánh men cơm rượu……………………………………………..20
Bảng 2.2: Thuốc thử Lugolc…………………………………………………………21
Bảng 2.3: Dung dịch đệm axetat pH 4,7……………………………………………..21
Bảng 2.4: Dung dịch tinh bột 1% ……………………………………………………21
Bảng 2.5: Môi trường PGA (Potato Glucose Agar) …………………………………21
Bảng 2.6: Môi trường thạch – tinh bột……………………………………….………22
Bảng 3.1: Các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu……………………31
Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm mốc đã phân lập từ bánh men cơm
rượu……………………………………………………………………………..…….32
Bảng 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men
cơm rượu…………………………………………………………………...…………34
Bảng 3.4: Bảng kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme……………...………38
Bảng 3.5: Xác định hoạt tính enzyme amylase thu được trong thời gian 2, 3, 4 ngày
lên men thể rắn…………………………………………………………………..……43
iv
Bảng 3.6: Thí nghiệm thủy phân tinh bột…………………………………….……....44
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 2.1: Môi trường PGA sau khi hấp……………………………………………...23
Hình 2.2: Đổ đĩa peptri……………………………………………………………….24
Hình 2.3: Môi trường nuôi cấy sau 48h………………………………………………24
Hình 2.4:Môi trường sau làm thuần…………………………………………………..24
Hinh 2.5. Cấy giữ giống………………………………………………………………25
Hình 2.6: Quy trình thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc…………………………27
Hình 2.7 : Quy trình công nghệ lên men bề mặt……………………………………...28
Hình 3.1: Khuẩn lạc của các chủng nấm mốc M2, M4, M7, M10…………………...32
Hình 3.2: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M3, M4, M9, M11…………..35
Hình 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M6, M7……………………...36
Hình 3.4: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme…………………………………….38
Hình 3.5: Môi trường nuôi cấy sau khi hấp…………………………………..………39
Hình 3.6: Cấy giống vào môi trường nuôi cấy………………………………………39
Hình 3.8: Thu dịch nuôi cấy………………………………………………………….40
Hình 3.9: Lọc dịch chiết……………………………………………………………...41
Hình 3.10: Chế phẩm enzyme amylase được tủa bằng cồn 960 lạnh………………....41
Hình 3.11: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 2 ngày nuôi cấy……………..42
Hình 3.12: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 3 ngày nuôi cấy……………..42
Hình 3.13: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 4 ngày nuôi cấy……………..43
v
Hình 3.14: Kết thúc thủy phân tinh bột gạo hồ hóa………………………………….45
PHẦN MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết và lý do hình thành đề tài.
Ngày nay, Amylase là một trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi
trong các ngành công nghiệp, đem lại những lợi ích kinh tế, đặc biệt là ngành công
nghiệp thực phẩm như công nghiệp sản xuất rượu bia, nước ép trái cây, bánh kẹo,
bánh mì...
Sản xuất enzyme Amylase từ bánh mem (cơm rượu) là một trong những đề
tài mang tính cấp thiết, bởi vì bánh men có chứa rất nhiều chủng có khả năng tạo ra
enzyme amylase như nấm men, nấm mốc ...đây là nguồn nguyên liệu dễ tìm và rẻ
tiền, là nguyên liệu truyền thống sản xuất rượu trắng đảm bảo sự an toàn cho người
tiêu dùng và enzyme amylase thu được từ nấm mốc có trong bánh men có những ưu
điểm ưu việt, vì vậy trong nội dung đồ án tốt nghiệp người thực hiện đề tài đã chọn
đề “Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase”
2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Vi sinh vật có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau. Đặc
điểm này có liên quan đến cơ thể đơn bào. Cơ thể đơn bào phải thực hiện tất cả
chức năng của sự sống, do đó chúng phải tạo ra nhiều loại enzyme khác nhau để
đảm bảo sự sống phát triển tốt. Nhiều vi sinh vật có khả năng tạo ra enzyme
amylase như: nấm mốc, vi khuẩn, nấm men, xạ khuẩn…Trong đó nấm mốc có khả
năng tạo ra enzym amylase nhiều hơn cả.
Nấm mốc còn được gọi là nấm sợi, tức là tất cả các mốc mọc trên thực phẩm,
trên chiếu, trên quần áo, trên sách vở … Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều
nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp khí hậu nóng ẩm.
Nấm mốc là vi sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp vì
quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật không
phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài, nguồn nguyên liệu làm môi trường nuôi cấy nấm
mốc rẻ tiền và dễ kiếm, tốc độ sinh sản của nấm mốc phát triển vật rất nhanh,
Enzyme thu nhận từ nấm mốc có hoạt tính rất cao, đồng thời trong một khoảng thời
1
gian ngắn, không những ta thu được lượng sinh khối lớn về enzyme nội bào mà còn
thu được một lượng đáng kể enzyme ngoại bào do nấm mốc tiết ra môi trường. Vì
thế, giá thành sản phẩm sẽ giảm và có thể sản xuất ở mọi nơi trên thế giới, mang lại
hiệu suất kinh tế cao.
3. Mục tiêu nghiên cứu, đối tượng:
Phân lập vi nấm enzyme amylase từ bánh men rượu và thử nghiệm các quy
trình lên men thu enzyme amylase, cụ thể:
+ Thu thập nguồn bánh men từ các vùng khác nhau, sau đó phân lập các
chủng nấm mốc từ các mẫu bánh men cơm rượu, tuyển chọn các chủng nấm mốc có
khả năng phân giải tinh bột, lấy chủng đó lên men thu enzym bằng phương pháp lên
men chìm, lên men bán rắn, lên men công nghiệp và ứng dụng chúng để thu nhận
enzyme amylase.
+ Xác định hoạt tính của enzyme amylase thu được và thử nghiệm khả năng
phân giải tinh bột của enzyme amylase nhằm góp phần tạo ra nguồn enzyme có giá
trị từ vi sinh vật.
+ Phạm vi và giới hạn của đề tài
Trong giới hạn của đề tài, người thực hiện đề tài chỉ tập chung tìm hiểu về
nguồn nấm mốc có trong bánh men để thu nhận enzyme trong quy mô phòng thí
nghiệm.
Do trang thiết bị máy móc tại phòng thí nghiệm không đầy đủ, chưa hiện đại
nên đồ án còn nhiều hạn chế, chỉ dừng lại ở bước thu sản phẩm bán tinh khiết.
4. Kết quả đạt được:
Đã Phân lập được 11 chủng nấm mốc từ bánh men cơm rượu ở 8 địa điểm
khác nhau, trong đó có 9 chủng nấm mốc đều có khả năng phân giải tinh bột bao
gồm các chủng: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 và 2 chủng không có
khả năng phân giải tinh bột là chủng M2, M6. Như vậy, 9 chủng nấm mốc có khả
năng tạo enzyme amylase, 2 chủng nấm mốc không có khả năng tạo enzyme
amylase.
- Đã tiến hành nuôi cấy chủng M4 để thu nhận được enzyme amylase bán
2
tinh khiết theo phương pháp nuôi cấy chìm.
- Từ 1 lít môi trường nuôi chủng M4 thu được 1,23 g chế phẩm enzyme
amylase bán tinh khiết.
- Đã tiến hành nuôi cấy chủng M4 để thu nhận được enzyme amylase bán
tinh khiết theo phương pháp lên men công nghiệp.
- Xác định enzym amylase có hoạt tính cao nhất thu được trong thời gian
nuôi cấy ở 3 ngày. Xác định khả năng phân giải tinh bột gạo của enzyme amylase
từ đó tính được nồng độ enzyme amylase cần để thủy phân hết 1g tinh bột gạo.
5. Cấu trúc đồ án:
Đồ án gồm các chương sau đây:
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Tìm hiểu về enzym amylase nấm mốc, enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi
khuẩn, các phương pháp thu nhận enzyme amylase và ứng dụng của enzyme
amylase...
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Các vật dụng và hóa chất để tiến hành thí nghiệm. Xác định đối tượng nghiên
cứu, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Mô tả phương pháp và qui trình lên men ,
xác định hoạt tính enzym amylase ...
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Các kết quả sau khi thực nghiệm như: kết quả quả phân lập các chủng nấm
mốc có trong bánh men cơm rượu, kết quả quan sát hình thái nấm mốc, kết quả xác
định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc và chọn lọc chủng sản
xuất enzyme amylase, kết quả thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc bằng phương
pháp nuôi cấy chìm, kết quả lên men bề mặt thu enzyme amylase, kết quả xác định
hoạt tính enzym amylase sau kết tủa...
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
3
Các kết luận và kiến nghị của đồ án.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về enzyme amylase nấm mốc
1.1.1. Khái niệm về enzyme amylase
Enzyme amylase là một trong số các enzyme được sử dụng rộng rãi nhất
trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Những nghiên cứu thực nghiệm
đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào
những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác
học người Nga,Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột
dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm và nhận thấy rằng trong malt có
chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. Năm 1833, hai nhà khoa học người
Pháp là Payen và Persor đã tách được chất phân giải tinh bột đó là từ đại mạch nảy
mầm. Các tác giả đã dùng rượu để kết tủa nó trong dung dịch chiết malt và thu được
enzyme ở dạng bột, đồng thời đặc tên là diaslase. Sau này theo đề nghị của Duclo,
enzyme phân giải tinh bột gọi là amylase.
Các enzyme amylase có trong nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn,
nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm. Bây giờ, người
ta thu chúng chủ yếu từ canh trường nấm mốc, vi khuẩn và một số loài nấm men.
Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các Enzyme
này thuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong
nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước.
Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và
dextrin hạn chế. Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin),
trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, xạ khuẩn,
nấm men và vi khuẩn. Đối với enzyme amylase có trong nấm mốc, khi nuôi nấm
mốc tạo enzyme amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình
tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tạo ra enzyme amylase trong tế bào hay
ngoài môi trường. Ở một số vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase
4
xảy ra song song với quá trình sinh trưởng, sự tạo ra enzyme amylase phụ thuộc
tuyến tính vào sự tăng sinh khối. Sự tạo thành enzyme amylase cực đại xảy ra sau
khi quần thể tế bào vi sinh vật đạt điểm sinh trưởng.
1.1.2. Phân loại
Amylase có thể thủy phân hạt tinh bột chưa hồ hóa cũng như hạt tinh bột đã
hồ hóa. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân
biệt amylase ra các loại sau: α-amylase, β-amylase, Glucoamylase…
Tốc độ phản ứng của Enzyme Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ
polyme hóa của cơ chất. Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính
chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau.
1.2. Enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi khuẩn
Trong thiên nhiên, enzyme amylase có ở hầu hết mọi vi sinh vật, thực vật và
động vật. Song chỉ có một số loài vi sinh vật và một số hạt thực vật mới là đối
tượng dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase, do chúng có khả năng
tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định.
Ngày nay do có ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật trở thành nguồn thu enzyme
chủ đạo. Người ta đã biết nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme
amylase. Những chủng vi sinh vật tạo nhiều enzyme amylase thường được phân lập
từ các nguồn tự nhiên, bởi các loài khác nhau và các chủng vi sinh vật khác nhau
cũng thường sản sinh ra nhiều enzyme khác nhau. Vi sinh vật tạo enzyme amylase
được dùng nhiền hơn cả là nấm mốc, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít
hơn.
- Để thu enzyme amylase người ta thường dùng các giống nấm mốc
Aspergillus, Rhizopus và một số loài của giống Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ α-
amylase và glucoamylase. Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida,
Saccharomyces, Endomycopis, Endomyces cũng tạo enzyme amylase.
- Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn enzyme amylase như Bacillus
subtilis, Bacillus polymyxa, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas
5
saccharophila, Bacillus circulans…
- Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài tạo enzyme amylase rất mạnh mẽ,
tuy nhiên cũng có một số tạo enzyme như xạ khuẩn ưa nhiệt.
Các enzyme amylase có trong nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn,
nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm. Bây giờ, người
ta thu chúng chủ yếu từ canh trường nấm mốc, vi khuẩn và một số loài nấm men.
Amylase có thể thủy phân hạt tinh bột chưa hồ hóa cũng như hạt tinh bột đã
hồ hóa. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân
biệt amylase ra các loại sau: α-amylase, β-amylase, glucoamylase… Các enzyme
amylase từ các nguồn khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng
cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân.
α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4 glucoside nằm ở phía
bên trong phân tử cơ chất: tinh bột, glycogen và polyose đồng loại một cách ngẫu
nhiên, không theo một trật tự nào cả. Vì thế người ta gọi nó là enzyme amylase nội
phân. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột
nguyên lành, song với tốc độ rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn. Ở giai
đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ 1 số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một
lượng lớn dextrin phân tử thấp độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh sang giai đoạn
thứ hai (giai đoạn đường hóa) các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thủy
phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị
thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới di và monosaccharide. Dưới tác dụng của
α-amylase, amylase bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc
glucose. Sau đó các polyglucose này lại bị phân cách tiếp tục nên các mạch
polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và
maltotriose, và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của
amylase chứa 13% glucose và 87% maltose.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
6
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-
amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho
màu với iodine và một ít maltose.
α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng.
Protein của các α-amylase có tính chất acid yếu và tính chất của globulin. Điểm
đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2-5,7. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzyme thì
α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Vì Ca tham gia vào sự hình thành và
ổn định cấu trúc bậc Bacilus subtilis của enzyme, duy trì cấu hình hoạt động của
enzyme. Canxi còn có tác dụng bảo đảm cho α-amylase có độ bền cực lớn đối với
các tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải protein.α-
amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. α-amylase bị kìm hãm bởi kim loại
nặng.
α-amylase của nấm mốc chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tích, còn
α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân hủy cả các hạt tinh bột nguyên vẹn lẫn hồ
tinh bột. Ở giai đoạn thủy phân cuối, tác dụng của α-amylase từ nấm mốc khác tác
dụng của α-amylase từ vi khuẩn. Dextrin do amylase vi khuẩn tạo ra có mạch dài
hơn dextrin do α-amylase của malt và nấm mốc tạo ra một số lần.
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không
giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5-4,8, của
đại mạch nảy mầm và thóc mầm là 5,3 và của vi khuẩn là 5,8-6,0. Độ bền đối với
tác dụng của axit cũng khác nhau.α-amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae bền
vững đối với axit tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bacilus subtilis.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúa tác của α-amylase từ các nguồn khác
nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm mốc rất nhạy đối với tác động của
nhiệt.Nhiệt độ tối thích của nó là 500C.Amylase của thóc mầm và của malt bền
nhiệt hơn và hoạt động tối thích ở 58-600C. Amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt
cao hơn cả. Nhiệt độ tối thích của nó là 70-750C . Amylase của nấm mốc bị vô hoạt
ở 700C, trong khi đó amylase vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 920C. Những khác
biệt về nhiệt độ và pH tối thích, mức độ thủy phân và đặc tính thủy phân của α-
7
amylase từ các nguồn khác nhau đang mở ra nhiều khả năng to lớn trong việc ứng
dụng chúng một cách thích hợp và đầy hiệu quả ở các giai đoạn khác nhau của quá
trình sản xuất.
β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucan trong tinh bột,
glucogen và polysaccharide đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu
không khử của mạch. Maltose tạo thành có cấu hình β, vì thế amylase này được gọi
là β-amylase.
Theo đặc tính tác dụng lên tinh bột, β-amylase không thủy phân hạt tinh bột
nguyên lành mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột.β-amylase phân giải 100% amylose
thành maltose và phân giải 54-58% amylopectin thành maltose. Quá trình thủy phân
amylopectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng. Khi gặp
liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì β-amylase ngừng
tác dụng. Phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-
1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin, α-dextrin cho màu tím đỏ của iodine. Độ
nhớt của dung dịch giảm chậm.
Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucan trong polysaccharide, tách
tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch. Glucoamylase có khả
năng xúc tác thủy phân đã liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucan. Glucoamylase là enzym
ngoại phân, nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose.Khi
thủy phân tinh bột cùng với glucose còn có thể tạo thành các α-oligosaccharide.
Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy
phân liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside.
Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen,
amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới glucose. Đa số
glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzyme “axit” . Thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng
pH 3,5-5,5. So với α-amylase, glucoamylase bền đối với axit hơn, nhưng lại kém
bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton không được bảo vệ bằng Ca2+.
Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng
nhất. Đa số các chế phẩm glucoamylase của nấm mốc, vi khuẩn, nấm men và của
8
mô động vật đều có pH hoạt động tối thích ở vùng axit trừ glucoamylase của
Saccharomyces italicus và một số mô động vật có pH hoạt động tối thích ở vùng
trung tính. Glucoamylase axit có pH hoạt động tối thích là 4,0-5,0; glucoamylase
trung tính pH tối thích là 6,0-7,5.
Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đã đặt nền móng cho việc sản xuất
các chế phẩm enzyme amylase để sử dụng trong sản xuất và đời sống. Những
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của enzyme amylase ngày càng được phát triển
mạnh mẽ hơn và đang mở ra những phương hướng mới, triển vọng mới to lớn hơn
đối với việc ứng dụng enzyme amylase rộng rãi trong các ngành công nghiệp.
1.3. Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc:
1.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng
Nấm mốc là sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ. Chúng chỉ có khả năng
thu nhận năng lượng từ môi trường bên ngoài nhờ quá trình oxy hóa hiếu khí hoặc
quá trình lên men kỵ khí các chất hữu cơ ngoại bào. Kiểu dinh dưỡng carbon hữu cơ
này được gọi là kiểu dinh dưỡng carbon dị dưỡng. mốc là những loài nấm có kiểu
carbon dị dưỡng thuộc loại hoại sinh, sử dụng các hợp chất hữu cơ để làm chất dinh
dưỡng.
a. Nguồn carbon:
Nấm mốc có thể sử dụng nguồn carbon rất khác nhau. Các loại thức ăn
carbon có thể dùng làm nguồn năng lượng và nguồn vật liệu xây dựng tế bào đối
với nấm mốc có thể kể đến các loại hydradecarbon (monosaccharide,
oligosaccharide, polysaccharide), các dẫn xuất của hydradecarbon, các loại rượu,
các loại axit hữu cơ, các loại axit amin, protein, lipid....Trong nhiều trường hợp nếu
có mặt trong môi trường vài nguồn carbon khác nhau, nấm mốc sẽ phát triển mạnh
mẽ hơn so với khi chỉ có riêng biệt từng loại một. Đối với các nguồn carbon phức
tạp (tinh bột, cenlulose,...) trước hết nấm mốc phải sinh ra các enzyme để phân hủy
các hợp chất này thành các hợp chất đơn phân tử sau đó mới đồng hóa được chúng.
b. Nguồn Nitơ:
Các loại nấm mốc khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với các nguồn
9
nitơ.Nấm mốc thường có khả năng sử dụng cả các nguồn nitơ hữu cơ lẫn các nguồn
nitơ vô cơ. Nhiều loại nấm mốc có khả năng đồng hóa cả muối amon lẫn nitrat. Đôi
+ mà ở độ
khi có những loại nấm mốc không phát triển được trên các môi trường chứa nguồn
+ trong
nitơ là muối amon nhưng nguyên nhân không phải ở bản thân gốc NH4
2- , Cl- ...) và làm hạ độ pH của
chua sinh lý do các muối amon tạo ra. Sau khi nấm mốc đồng hóa gốc NH4
2- , HPO4
môi trường sẽ tích lũy các anion vô cơ ( SO4
- trong môi trường sẽ tích lũy lại các cation
môi trường xuống. Ngược lại với các muối amon, nitrat là những muối có tính kiềm
sinh lý. Sau khi nấm đồng hóa gốc NO3
(Na+ , K+...) và làm tăng rõ rệt độ pH của môi trường.
Khả năng đồng hóa amon sunfat của nấm mốc sẽ tăng cường rõ rệt khi bổ
sung vào môi trường một ít axit hữu cơ ( acid lactic, acid malic...). Ngoài các nguồn
nitơ vô cơ, nhiều loài nấm mốc có thể sử dụng nguồn nitơ hữu cơ (protein, peptid,
acid amin, ...).
c. Các nguyên tố khoáng:
Nấm mốc cần các nguyên tố đa lượng như: S, P, K, Ca, Mg và Fe. Các
nguyên tố được nấm mốc đòi hỏi với những số lượng rất nhỏ được gọi là các
nguyên tố vi lượng như: Mn, Zn, Cu, Co, Ni, ...
Lượng chứa từng nguyên tố khoáng trong tế bào nấm mốc không những thay
đổi tùy thuộc vào từng loài nấm mốc mà còn phụ thuộc cả vào điều kiện nuôi cấy
chúng. Sau đây là vai trò các chất khoáng trong tế bào nấm mốc:
- Phospho: thường chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của nấm
mốc. Phospho tham gia vào cấu tạo của nhiều chất hữu cơ rất quan trọng trong tế
bào nấm mốc như: nucleoprotein, nucleotid, phosphoprotein, phosphatid... ).
- Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần của một số acid amin: cystin, cystein,
metionin. Lưu huỳnh cũng có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như acid lipoic,
biotin, coenzyme A ...
- Kali: có lượng khá lớn trong các tế bào nấm mốc, chúng tham gia vào quá
trình trao đổi glucid và có ảnh hưởng đến nhiều quá trình trao đổi chất khác của các
10
tế bào này.
- Magnesium: tham gia vào quá trình hoạt hóa khoảng 80 enzyme trong tế
bào. Có nghiên cứu cho biết việc thiếu Mg2+ dẫn đến việc ức chế quá trình hình
thành bào tử ở một số loài nấm mốc.
- Canxi: không tham gia các thành phần các chất hữu cơ trong tế bào nhưng
chúng rất cần thiết vì đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan
trọng trong tế bào (giữa các nucleotid, giữa protein và acid nucleic). Canxi còn có
ảnh hưởng đến sự hình thành các cấu trúc không gian ổn định của ribosome, nhân ...
- Sắt: tham gia vào kết cấu porphirin sắt của các hệ thống enzyme chuyển
vận electron. Sắt còn tham gia vào cấu trúc của các enzyme catalase, peroxidase.
d. Các chất sinh trưởng:
Cũng giống như đối với các loại vi sinh vật khác, nấm mốc có những quan hệ
rất khác nhau đối với các loại vitamin và các chất sinh trưởng khác. Việc một loài
nấm mốc không đòi hỏi một loại chất sinh trưởng nào đấy có thể do hoặc là chúng
tự tổng hợp ra được chất sinh trưởng này hoặc là trong quá trình trao đổi chất chúng
không cần tới loại coenzyme có chứa chất sinh trường này.
Người ta chia nấm mốc thành hai nhóm căn cứ vào mối quan hệ của chúng
đối với các chất sinh trưởng :
- Nhóm tự dưỡng chất sinh trưởng: có thể tự tổng hợp tất cả các chất sinh
trưởng cần thiết đối với hoạt động sống của chúng.
- Nhóm dị dưỡng chất sinh trưởng: cần phải được cung cấp một vài hoặc
nhiều chất sinh trưởng ở dạng có sẵn..
Nhu cầu về chất sinh trưởng của một loài nấm mốc có thể thay đổi tùy theo
điều kiện nuôi cấy, tùy theo tuổi giống. Phần lớn các vitamin nhóm B được các loài
nấm mốc sử dụng để tạo ra các enzyme cần thiết đối với hoạt động sống của chúng.
Nhiều loại vitamin tan trong lipid (A, D, E, K) được tìm thấy trong các lớp màng
sinh học, sự tồn tại và số lượng của các loại vitamin này trong môi trường có ảnh
11
hưởng rõ rệt đối với cấu trúc và đối với sự hoạt động của các lớp màng này.
1.3.2. Độ ẩm
Ngoài các chất dinh dưỡng nấm mốc cũng như tất cả sinh vật khác còn có
nhu cầu về nước cho các hoạt động sinh lý, sinh hóa của tế bào. Liên quan đến
lượng nước này là độ ẩm, bao gồm : hàm lượng nước của sản phẩm, độ ẩm tương
đối của không khí. Giữa hàm lượng nước của sản phẩm và độ ẩm của không khí ở
môi trường ngoài có mối liên quan (trao đổi qua lại).Chính mối liên quan dinh
dưỡng này không những ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm, mà còn ảnh
hưởng đến khả năng sử dụng nước của tế bào nấm mốc cho các quá trình sinh
trưởng, phát triển của chúng.
a. Hàm lượng nước của sản phẩm:
Nước trong các sản phẩm như: lương thực, thực phẩm, thuốc men, dược
liệu… gồm phần nước liên kết và phần nước không liên kết. Nấm mốc cũng như
các vi sinh vật khác chỉ sử dụng được phần nước tự do có trong sản phẩm, và cũng
chỉ phần nước này thực hiện sự trao đổi qua lại với nước có trong không khí.
b. Độ ẩm tương đối của không khí:
Mỗi loại nấm mốc thích ứng với một khoảng giá trị độ ẩm tương đối.Việc
giảm độ ẩm tương đối sẽ làm ngừng hoặc kéo dài thời gian nảy chồi của bào tử nấm
mốc.Nấm mốc sống trong môi trường có độ ẩm tương đối thấp, chúng có khả năng
thích nghi dần để có thể tiếp tục sinh trưởng, phát triển bình thường hoặc ở trạng
thái sống nghỉ. Ở độ ẩm tương đối thấp cùng với hàm lượng nước thấp trong sản
phẩm, tế bào nấm mốc đầu tiên mất nước tự do, sau mất nước liên kết. Tùy theo
lượng nước mất đi, nấm mốc chuyển sang trạng thái sống nghỉ hoặc bị chết. Phần
lớn nấm mốc không sinh trưởng, phát triển trong điều kiện độ ẩm tương đối của
không khí môi trường dưới 60%.
1.3.3. Nhiệt độ
Mỗi loài nấm mốc cũng có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển, sinh
trưởng.Phần lớn nấm mốc sinh trưởng, phát triển ở nhiệt độ 15-300C và cũng
thường có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu trong khoảng 20-250C tùy từng loài.Một số
12
rất nhỏ các loài nấm mốc có thể tăng trưởng ở các kho lạnh ở nhiệt độ -60C, thậm
chí ở -200C và một số ít loài khác có nhiệt độ tăng trưởng đến 500C. Căn cứ vào
nhiệt độ tăng trưởng, các loài nấm mốc được chia thành 5 nhóm: nhóm ưa nóng,
nhóm chịu nóng, nhóm ưa nhiệt trung bình, nhóm chịu lạnh, nhóm ưa lạnh.
1.3.4. pH
Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm
mốc đó là pH. Nấm mốc nảy mầm và sau đó tăng trưởng bình thường ở pH 7. Ở
môi trường kiềm hoặc axít, nấm mốc không hoặc tăng trưởng rất yếu.
1.4. Các phương pháp thu nhận enzyme amylase
1.4.1. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề mặt
Trong quá trình phát triển của vi sinh vật, enzyme luôn được tổng hợp để
tham gia vào quá trình đồng hóa và quá trình dị hóa. Trong thí nghiệm này chủ yếu
là thu nhận các chế phẩm enzyme thủy phân. Phần lớn các enzyme thủy phân là
enzyme cảm ứng. Do hoạt tính enzyme không chỉ biểu hiện ở khả năng thủy phân
của enzyme mà còn biểu hiện ở khả năng mà vi sinh vật tổng hợp ra nó trong những
điều kiện nuôi cấy nhất định.
Trong quá trình phát triển, vi sinh vật sẽ tạo ra nhiều loại enzyme khác nhau.
Các enzyme được tạo ra trong tế bào vi sinh vật và thoát ra khỏi tế bào để thực hiện
các phản ứng thủy phân ngoài tế bào được gọi là enzyme ngoại bào. Các enzyme
được tổng hợp trong tế bào vi sinh vật và thực hiện các phản ứng trong tế bào được
gọi là enzyme nội bào.
Thành phần chính của môi trường vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng
phương pháp bề mặt là cám mì, cám gạo. Đó là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là
thành phần duy nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật mà không cần phải bổ sung
thêm các chất khác nữa.
Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của các
enzyme amylase.Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%, nên dùng cám tốt,
cám mới không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độ không
quá 0,05%... Thành phần bổ sung được đưa vào môi trường có thể là chất làm xốp
13
môi trường hoặc làm giàu thêm chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng mà ở cám
không có đủ. Thành phần này thường là mầm mạch, trấu, mùn cưa… Cám và các
chất phụ gia chứa nhiều vi sinh vật khác cần phải thanh trùng để đảm bảo môi
trường không có vi sinh vật ngoại lai, cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 – 1,5 atm
trong vòng 4 - 6 giờ.
Độ ẩm tối thích của môi trường: trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối
thích của môi trường đối với Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus
oryzae là 58 – 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình
nuôi. Độ ẩm mà quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55%
thì kìm hãm sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như tạo enzyme amylase.
Chế độ thông khí có thể liên tục, gián đoạn tùy thuộc vào chiều dày của lớp
môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dãy khay. Ở giai đoạn sinh
trưởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4 – 5 lần thể tích không khí
trên một thể tích phòng trong một giờ, ở giai đoạn thứ hai là 30 – 60 thể tích không
khí trên thể tích phòng nuôi trong 1 giờ, giai đoạn ba giảm đi chỉ còn 10 – 12 thể
tích không khí.
Nhiệt độ nuôi: Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám chia làm
ba thời kỳ:
- Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10 – 11 giờ
đầu tiên, vi khuẩn 3 – 4 giờ). Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng
nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23 – 300C đối với nấm mốc.Độ
ẩm tương đối của không khí là 96 – 100%.
- Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi kéo dài trong 4 – 18 giờ. Ở giai đoạn
này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý lớn.Vì vậy cần phải
hạ nhiệt độ phòng nuôi khoảng 28 – 290C.
- Thời kỳ tạo enzyme amylase mạnh mẽ kéo dài từ 10 – 20 giờ. Trong thời
kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự tỏa nhiệt giảm mạnh.Các
enzyme amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Đối với đa số vi sinh vật ở giai đoạn này
nên hạ nhiệt độ xuống 3 – 40C so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh
14
trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28 – 300C.
Thời gian nuôi để có lượng enzyme amylase cực lớn: Tùy thuộc vào tính
chất sinh lý của chủng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme amylase mà có thể
ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là
hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực enzyme.Đa số nấm mốc
Aspergillus, sự tạo enzym amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu
sinh đính bào tử.
1.4.2. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp nuôi cấy
chìm.
Phương pháp nuôi cấy chìm là phương pháp vi sinh vật phát triển, sinh sản
và trao đổi chất trong lòng môi trường. Môi trường dùng trong nuôi cấy chìm là môi
trường lỏng.
Trong quá trình phát triển, sinh sản và trao đổi chất trong lòng môi trường
lỏng, vi sinh vật sẽ tổng hợp ra các enzyme thủy phân. Các enzyme thủy phân là các
enzyme hòa tan trong nước. Do đó việc thu nhận enzyme trong trường hợp này là
thu nhận dịch nuôi cấy. ( sau khi đã tách sinh khối và những thành phần không hòa
tan của môi trường).
Chế phẩm enzyme thô trong nuôi cấy chìm ở đây bao gồm enzyme đã hòa
tan trong nước, nước và các sản phẩm trao đổi chất hòa tan khác.
Môi trường dinh dưỡng: môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase là
có chất cảm ứng là tinh bột, dextrin hay maltose. Để tạo điều kiện cho vi sinh vật
phát triển tốt và sinh nhiều enzyme amylase người ta cho thêm vào môi trường các
loại nước chiết như nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước chiết đậu nành…
Độ axit của môi trường được xác định bởi thành phần và tính chất của các
muối vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi vi sinh vật,
pH của môi trường phụ thuộc vào tính chất của nguồn nitơ vô cơ . Nếu thêm vào
môi trường các muối ammonium thì khi vi sinh vật tiêu thụ ion ammonium, các
anion được giải phóng ra sẽ axit hóa môi trường. Vì thế cần phải thêm CaCO3 vào
15
để trung hòa hoặc duy trì giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp enzyme amylase.
Nhiệt độ nuôi: là một yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật và
sự tạo thành enzyme amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm mốc thuộc giống
Aspergillus là 30 – 320C, Bacillus subtilis là 370C.
Sục khí và khuấy trộn. Phần lớn vi sinh vật tạo enzyme amylase là những vi
sinh vật hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử
hòa tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng, vi sinh vật sử dụng oxy
phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hòa tan trong môi trường lỏng phải luôn
luôn được bổ sung. Vì thế việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới
sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase của vi
sinh vật. Chế độ sục khí đối với nấm mốc là 10 – 12m3 không khí vô trùng trên 1 m3
môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi khoảng 68 – 72 giờ.
1.5. Ứng dụng của enzyme amylase
Chế phẩm enzyme amylase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp - đặc
biệt là trong công nghiệp thực phẩm, sau đây là một số ứng dụng quan trọng của
enzyme amylase:
1.5.1. Amylase trong công nghiệp rượu – bia
Chế phẩm enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus
awamori, Aspergillus usamii, Aspergillus niger, Rhizopus delemar hoặc từ
Endomycopsis bispora, từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus được thay
thế malt làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu,bia từ nguyên liệu có
bột. Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật thay malt đã tiết kiệm được hàng
vạn tấn đại mạch loại tốt, giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản xuất.
Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu và đóng vai
trò quyết định trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường lên men, do vậy cần
chọn chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh nhiều glucoamylase. Trong sản xuất
rượu người ta thường dùng hỗn hợp canh trường bề mặt hay bề sâu của các nấm
mốc. Ở Việt Nam chúng ta dùng canh trường bề mặt của nấm mốc Aspergillus
16
oryzae, Aspergillus usamii, Aspergillus awamori và Rhizopus delemar để đường
hóa. Ở một số nước, ngoài enzyme amylase nấm mốc người ta còn sử dụng enzyme
amylase từ vi khuẩn, nấm men cũng cho kết quả đường hóa khá cao.
Chế phẩm enzyme amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus
chịu nhiệt độ cao, dùng trong giai đoạn dịch hóa tinh bột lúc đầu, trước khi đường
hóa rất tốt. Ở nhiệt độ 80-900C trong 10-15 phút α-amylase của vi khuẩn bị vô hoạt
một phần rất nhỏ.
Trong sản xuất bia, thường dùng Aspergillus oryzae và Bacillus subtilis để
đường hóa thay malt, là nguyên liệu khá đắt tiền và cần thiết trong sản xuất bia.
Dùng chế phẩm enzyme này người ta có thể thay từ 50 - 100% malt bằng đại mạch
không nảy mầm, thay thế 50 - 60% malt thì chất lượng bia tốt hơn. Khi dùng chế
phẩm enzyme vi sinh vật thay malt, cần bổ sung nguồn nguyên liệu có bột như các
loại ngũ cốc như: bắp, khôi, sắn, gạo, đại mạch không nảy mầm, tiểu mạch. Biện
pháp thay thế malt bằng chế phẩm enzyme như trên có ý nghĩa đặc biệt quan trọng
trong việc giảm giá đáng kể giá thành của sản phẩm, mà chất lượng bia vẫn bảo
đảm.
1.5.2. Trong sản xuất bánh mì
Trong sản xuất bánh mì người ta thường sử dụng chế phẩm enzyme amylase
của nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, hay của vi khuẩn, nhưng
chế phẩm từ nấm mốc áp dụng có hiệu quả và rộng rãi hơn.
Dùng với lượng 0,002 - 0,05% chế phẩm enzyme amylase so với bột nhão sẽ
tăng cường quá trình lên men bột, rút ngắn thời gian lên men xuống 20 - 30%, tăng
độ xốp 5 - 8%, tăng thể tích bánh lên men 15 - 25% màu sắc vỏ bánh đẹp hơn, ruột
bánh xốp và sáng màu hơn tăng hương vị thơm ngon của bánh. Khi làm bánh mì
ngọt, nếu thêm chế phẩm enzyme amylase vào bột, sẽ xảy ra quá trình thủy phân
bột thành đường, do đó giảm lượng đường tiêu tốn cho sản xuất.
1.5.3. Trong sản xuất mật, tinh bột, malto, gluco
Từ lâu các sản phẩm mật tinh bột như: mật gluco, mật malto… được sản xuất
17
bằng phương pháp thủy phân tinh bột bằng axit hay bằng malt. Ngày nay người ta
sử dụng rộng rãi chế phẩm enzyme amylase vi sinh vật trong sản xuất mật tinh bột,
gluco, malto từ nguyên liệu tinh bột.
Ở các nước tiên tiến khác, phương pháp dùng enzyme từ vi sinh vật trong
lĩnh vực này cũng đã được áp dụng có hiệu quả và phổ biến, hay phối hợp phương
pháp axit và enzyme. Trong sản xuất mật tinh bột, gluco, hai enzyme chủ yếu là
amylase và glucoamylase từ nấm mốc và vi khuẩn. Enzyme α-amylase để dịch hóa
tinh bột và tạo malto, còn glucoamylase dùng để đường hóa tạo gluco, chế phẩm
amylase cho sản xuất gluco được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus sublitis, Bacillus
mesentericus. Chế phẩm glucoamylase thường sản xuất từ nấm mốc: Aspergillus
niger, Aspergillus awamori, Rhizopus delamar, Mucor… hay từ một số nấm men
Saccharomyces, Endomycopsis…
1.5.4. Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác
Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác như bánh kẹo, nước giải
khát, đồ hộp, nước ép trái cây, tương … Chế phẩm enzyme amylase giúp cho quá
trình thủy phân tinh bột thành đường, làm trong các thành phần dạng lỏng, dễ cô
đặc, tăng lượng đường trong sản phẩm, giảm lượng đường tiêu tốn, tăng lượng
đường đơn giản dễ hấp thu cho người, đặc biệt là thức ăn cho trẻ em, giảm thời gian
nấu, chế biến …
Hiện nay người ta dùng hỗn hợp các enzyme: protease, amylase, pectinase
trong sản xuất các sản phẩm trên, tạo sản phẩm dễ tan, dễ tiêu hóa màu sắc đẹp, dễ
lọc, dễ cô đặc, rút ngắn thời gian sản xuất, giảm giá thành sản phẩm…
1.5.5. Trong các ngành công nghiệp dệt, giấy
Trong công nghiệp dệt, chế phẩm enzyme amylase của vi khuẩn Bacillus
subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus diastaticus, Bacillus amylosolvens… có
tính ưu việt chịu nhiệt cao, dùng trong rũ hồ vải, tạo điều kiện tốt dễ dàng khi
nhuộm, tẩy vải sau này. Ngoài ra người ta còn dùng chế phẩm enzyme amylase
18
trong sản xuất keo tinh bột cho công nghiệp giấy.
1.5.6. Trong chăn nuôi
Chế phẩm enzyme amylase được sử dụng riêng rẽ hay phối hợp với các
enzyme khác như: protease, cenlulase, pectinase … để sản xuất các loại thức ăn dễ
tiêu hóa, hấp thu trong chăn nuôi gia súc, gia cầm. Sử dụng thức ăn có chế phẩm
enzyme amylase sẽ làm tăng khả năng hấp thu, tiêu hóa do đó giảm lượng thức ăn,
tăng trọng nhanh, tăng khả năng sinh sản, chống bệnh tật…
1.5.7. Trong y học
Enzyme amylase cùng các enzyme khác, được dùng cho chữa bệnh do thiếu
enzyme, kém khả năng chuyển hóa chất, bệnh về tiêu hóa, tim, thần kinh …
Ngoài ra chế phẩm enzyme amylase dùng để điều chế môi trường nuôi vi sinh vật
19
phục vụ cho nghiên cứu khoa học, chuẩn trị bệnh.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các chủng nấm mốc phân lập từ các mẫu bánh men
cơm rượu ở các địa điểm khác nhau theo bảng 2.1:
Bảng 2.1: Các mẫu bánh men cơm rượu
STT Kí hiệu mẫu Nơi lấy mẫu
Chợ Động – Phan Rang– Ninh Thuận CĐ 1
Chợ Lớn – Đường Thống Nhất – TP. Phan Rang 2 CL
NS 3 Chợ Ninh Sơn– Ninh Thuận
KB 4 Chợ Kim Biên – Ninh Thuận
LB 5 Chợ Long Bình – Ninh Thuận
NH 6 Chợ Ninh Hải – Ninh Thuận
7 Chợ Thuận Nam – Ninh Thuận TN
8 Chợ Ninh Phước – Ninh Thuận NP
2.1.2. Vật liệu và hóa chất
2.1.2.1 Dụng cụ và thiết bị
Các dụng cụ thí nghiệm phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh như: ống
nghiệm, đĩa petri, que cấy, erlen ,tủ cấy,tủ ấm , nồi hấp, máy ly tâm Centrifuge
5430, máy sấy, máy lắc điều nhiệt.
2.1.2.2. Hóa chất
20
a. Thuốc thử Lugol
Bảng 2.2: Thuốc thử Lugol
Thành phần Số lượng
1 g I2
KI 2 g
Nước cất 300 ml
b. Dung dịch đệm axetat pH 4,7:
Bảng 2.3: Dung dịch đệm axetat pH 4,7
Thành phần Số lượng
Axetat 82 g
32,3 ml Axit CH3COOH
Nước cất 100 ml
c. Dung dịch tinh bột 1%:
Bảng 2.4: Dung dịch tinh bột 1%
Thành phần Số lượng
Tinh bột 1 g
Dung dịch đệm axetat 10ml
Nước cất 100 ml
2.1.2.3. Môi trường
a. Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)
Bảng 2.5: Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)
Thành phần Số lượng
Khoai tây 200g
Glucose 20g
Agar 20g
Nước cất 1000ml
Ph 6.5
21
b. Môi trường thạch – tinh bột
Bảng 2.6: Môi trường thạch – tinh bột
Thành phần Số lượng
0.5g KH2PO4
0.5g K2HPO4
0.2g MgSO4.7H2O
0.2g (NH4)2SO4
Tinh bột tan 10g
Agar 20g
Nước cất 1000ml
2.2. Phương pháp
2.2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng xét nghiệm bệnh tôm Ninh Thuận
Thời gian thực hiện: từ tháng 06/2013 – 09/2013.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phương pháp phân lập
Môi trường phân lập nấm mốc được sử dụng là môi trường PGA. Các chủng
nấm mốc được phân lập từ các mẫu bánh men cơm rượu. Bánh men được bẻ làm
đôi, lấy một ít bánh men ở giữa rải đều lên bề mặt đĩa petri chứa môi trường PGA,
sau đó đem để ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ. Sau khi nấm mốc mọc trên bề mặt
môi trường của đĩa petri. Dùng que cấy chuyển nấm mốc qua đĩa petri có chứa môi
trường PGA mới để làm thuần. Nấm mốc sau khi làm thuần được cấy vào ống
nghiệm và được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Chuẩn bị môi trường phân lập: PGA
- Cho 200g khoai tây cắt lát mỏng + 1000ml nước cất dun sôi trong thời gian
từ 20 đên 25 phút sau đó lọc thu dịch chiết khoai tây, tiếp tục + 20g agar + 20g
Glucose dun thêm 10 dến 15 phut cho đến khi agar tan hoàn toàn.
22
- Đổ vào mỗi erlen 200ml dịch môi trường sau đó đem đi hấp môi trường.
Hình 2.1: Môi trường PGA sau khi hấp
- Đổ đĩa peptri: được thực hiện trong điều kiện vô trùng với đèn cồn, đĩa sau
khi khô để ở nhiệt độ phòng 1 ngày sau đó kiểm tra chất lượng đĩa( đảm bảo không
bị nhiễm khuẩn).
23
Hình 2.2: Đổ đĩa peptri
- Bánh men được bẻ làm đôi, lấy một ít bánh men ở giữa rải đều lên bề mặt
đĩa petri chứa môi trường PGA.
- Để ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ.
Hình 2.3: Môi trường nuôi cấy sau 48 h
24
Hình 2.4: Môi trường sau làm thuần
- Cấy giữ giống vào ống nghiệm và bảo quản trong tủ lạnh ở 40C để dùng
cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hinh 2.5. Cấy giữ giống
2.2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái nấm mốc:
a. Quan sát khuẩn lạc nấm mốc: Cấy chủng nấm mốc lên môi trường PGA,
để ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sau đó quan sát và ghi nhận hình thái khuẩn lạc
nấm mốc trên đĩa như: màu sắc, hình dạng sợi nấm và đo kích thước khuẩn lạc.
b. Quan sát tế bào nấm mốc dưới kính hiển vi: Làm tiêu bản tế bào nấm mốc
trong xanh methylen, quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học.
2.2.2.3. Phương pháp xác định khả năng phân giải tinh bột:
Môi trường sử dụng để xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng
nấm mốc là môi trường thạch – tinh bột. Cấy chủng nấm mốc lên môi trường thạch
- tinh bột, để ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ. Sau đó, đổ dung dịch Lugol lên môi
trường thạch - tinh bột. Nếu có vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc thì chủng nấm
mốc có khả năng phân giải tinh bột, nếu không có vòng phân giải xung quanh khuẩn
lạc thì chủng nấm mốc không có khả năng phân giải tinh bột, dùng thước đo vòng
25
phân giải tinh bột và ghi nhận kết quả.
2.2.2.4. Phương pháp thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc
Sử dụng môi trường PGA không cho agar để nuôi cấy nấm mốc. Thu nhận
chế phẩm enzyme amylase theo phương pháp nuôi cấy chìm, như Hình 2.1.
Chuẩn bị 100ml môi trường trong erlen 250ml. Đem tiệt trùng ở 1210C trong
30 phút và để nguội. Cho 10ml nước cất đã vô trùng vào trong ống nghiệm giống
nấm mốc, khuấy nhẹ để các bào tử hòa trong nước. Đổ toàn bộ 10ml dịch trong ống
nghiệm này vào trong erlen 250ml có 100ml môi trường. Tất cả thao tác này được
thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Đặt các erlen này vào máy lắc có tốc độ 200 v/p nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ
phòng. Sau đó, đem ly tâm, thu lấy dịch. Dịch nuôi cấy này có chứa enzyme hòa
tan. Bảo quản dịch nuôi cấy này trong tủ lạnh 40C. Dùng 200ml cồn 960 lạnh đổ từ
từ vào 100ml dịch lọc enzyme đã làm lạnh, khuấy rất nhẹ để cồn hòa đều với dịch
enzyme. Sau đó, để hỗn hợp này vào tủ lạnh.Sau 24 giờ, hỗn hợp sẽ phân thành hai
lớp.
Đem ly tâm để thu enzyme dạng tủa. Enzyme dạng tủa này còn chứa nhiều
nước. Nước tồn tại trong đó sẽ làm giảm hoạt tính enzyme. Do đó, cần phải loại
nước bằng cách sấy ở nhiệt độ <400C, ta có chế phẩm enzyme amylase bán tinh
26
khiết.
100 ml MT PGA lỏng
Giống nấm mốc
Lắc 200v/p trong 48 giờ ở
t0 phòng
Ly tâm 6000v/p trong 5 phút
Thu dịch lỏng, bỏ cặn
Tủa bằng cồn 960 lạnh
Giữ lạnh ở 40C trong 24 giờ
Ly tâm ở 6000v/p trong 20 phút
Thu cặn, bỏ dịch
Sấy dưới 400C
Enzyme bán tinh khiết
27
Hình 2.6: Quy trình thu nhận enzym amylase từ nấm mốc
2.3. Qui trình lên men bề mặt tạo Enzym Amylase
2.3.1. Qui trình công nghệ lên men bề mặt
Hình 2.7: Qui trình công nghệ lên men bề mặt
Thuyết minh quy trình:
Bước 1: Chuẩn bị 10 g cám gạo và 16 ml dung dịch muối khoáng trung bình
MSM là dung dịch muối khoáng trong bài: ZnSO4x7H2O (6,2 mg), FeSO4x7H2O
(6,8mg), CuSO4 x 7H2O (0,8 mg) pha trong 1 lít nước cất điều chỉnh pH về 4,5.
Bước 2: Cho vào bình 250 ml sau đó điều chỉnh độ ẩm độ ẩm 55%. Thêm 5
g trấu, trộn đều. Đậy nút bông, Hấp tiệt trùng 1210 C (1 atm), 15 phút.
Bước 3: Cấy vào bình đã nguội 1ml huyền phù bào tử nấm, thực hiện lên
men trong vòng 4 ngày (96 h) ở nhiệt độ trong phòng nuôi cấy từ 23oC đến 30oC.
Giống có thể chuẩn bị trong ống thạch nghiêng, dùng 5 ml nước muối sinh lý có
28
0,1% Tween 80 để tạo huyển phù bào tử trong ống thạch nghiêng.
Bước 4: Sau 96 h lên men (thật ra phải làm mẫu để ở 48 h, 72 h và 96 h mỗi
chủng cho enzyme cực đại ở thời gian khác nhau. Thu nhận enzym, Thêm lượng
nước cất gấp 4 lần lượng mẫu trong bình tam giác trộn đều, lắc trong 60 phút.
Bước 5: Hỗn hợp này được lọc qua vải.
Bước 6: Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng, thu dịch
nổi
Bước 7: Lấy dịch nổi lọc qua giấy lọc ta thu được enzym là dịch trong.
- Sau đó xác định hoạt tính enzyme trong dịch trong và hàm lương protein
theo Wolhgemuth.
- Sau đó tủa enzyme bằng cồn lạnh (thể tích enzyme : thể tích cồn = 1:3), để
lạnh qua đêm, bỏ dịch trong phía trên, phần còn lại thu tủa bằng ly tâm 5000, 15
phút, thu tủa.
- Hòa tan kết tủa enzyme vào dung dịch đệm. Thử hoạt tính và protein,
2.3.2. Xác định hoạt tính enzym amylase theo Wohlgemuth
Ta thu được 3 mẫu enzym ( ở 48h,72h, 96h): lần lượt xác định hoạt tính
enzym của từng mẫu.
2.3.2.1. Dụng cụ và hoá chất
Dụng cụ và hoá chất cụ thể như sau: 11 ống nghiệm, Pipet 1ml (4 cái), tủ ấm,
NaCl 0.5%, tinh bột 0.5%, H2SO4 10%, Iod trong KI 3%
2.3.2.2. Tiến hành
Mẫu enzym thu được, lần lượt cho vào mỗi mẫu 2 ml nước cất hòa tan. Tiến
hành khảo sát hoạt tính amylase.
- Lấy 10 ống nghiệm đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Sau đó. Hút vào mỗi ống
nghiệm 1ml dung dịch NaCl 0.5% .
- Trong ống nghiệm số 1, cho vào 1ml dung dịch amylase và lắc kỹ . Sau đó ,
lấy 1ml từ ống nghiệm số 1 cho vào ống nghiệm số 2 , lắc kỹ và lặp lại cho tới ống
nghiệm số 10 thì hút 1ml và bỏ đi.
- Trong mỗi ống nghiệm cho vào 1ml dung dịch hồ tinh bột 0.5% lắc đều , để
29
vào tủ điều nhiệt ở 37ºC.
- Sau 30 phút lấy ra , thêm vào mỗi ống 1ml H2SO4 10% và 2 giọt Iod trong
KI 3% lắc đều.
- Sau đó ghi kết quả vào bảng.
- Lấy 1 ống nghiệm khác (ống số 11) cho vào 3ml nước cất , 2 giọt thuốc thử
Iod và so sánh với màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzyme
amylase thấp nhất thuỷ phân hoàn toàn tinh bột.
2.3.3. Thí nghiệm khả năng thủy phân bột gạo của enzym amylase
Pha 1 ml enzyme + 3 ml nước cất = 4 ml enzyme.
Chuẩn bị dung dịch tinh bột 10%: Cho 2 g bột gạo +16 ml H2O + 2 ml NaCl
0,5%, hồ hóa để nguội 40oC, chia thàng 4 ống:
Ống 1: 2 ml enzyme, ống 2: 1 ml enzyme + 1ml H2O, ống 3: 0,5 ml enzyme
+ 1,5 ml H2O, ống 4: 2ml H2O, đo pH ủ 40oC
Sau 30 phút hoặc 60 phút, thử màu bằng dung dịch iod, bằng cách nhỏ giọt
ra miếng sứ trắng, đối chứng, nhỏ giọt iod với nước cất. Theo dõi đến khi nào kết
30
thúc thủy phân.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có trong bánh men cơm rượu
Trong đồ án tốt nghiệp người thực hiện đề tài đã sử dụng bánh men rượu làm
nguồn phân lập là do: enzyme amylase thu được từ nấm mốc có trong bánh men có
hoạt lực phân hủy tinh bột có thể cao, đồng thời bánh men được sử dụng từ lâu đời
trong sản xuất rượu gạo truyền thống, an toàn sinh học.
Từ 8 mẫu bánh men lấy ở những địa điểm khác nhau, đã thực hiện phân lập
được 11 chủng nấm mốc theo Bảng 3.1:
Bảng 3.1: Các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu
STT Chủng Mẫu
1 M1 CĐ
2 M2 CĐ
3 M3 CL
4 M4 CL
5 M5 NS
6 M6 NS
7 M7 NH
8 M8 NP
9 M9 LB
10 M10 KL
11 M11 TN
Qua bảng trên thấy rằng từ các mẫu bánh men CĐ, CL và NS mỗi
mẫu đã phân lập được 2 chủng nấm mốc, riêng các mẫu bánh men NH, NP,
KL, TN, LB mỗi mẫu chỉ phân lập được 1 chủng nấm mốc. Dưới đây là một
31
số hình ảnh khuẩn lạc nấm mốc đã phân lập được:
a. Chủng M2 b. Chủng M4
c. Chủng M7 d. Chủng M10
Hình 3.1: Khuẩn lạc của các chủng nấm mốc M2, M4, M7, M10
3.2. Kết quả quan sát hình thái nấm mốc
Sau khi quan sát khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập được từ các
mẫu bánh men, đã ghi nhận một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc như ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm mốc đã phân lập từ bánh men
32
cơm rượu
Kích Tốc độ Hình dạng sợi STT Chủng thước (2 phát Màu sắc nấm ngày) triển
M1 7.7 cm Nhanh Trắng Dạng bông 1
M2 6 cm Nhanh Màu xám, viền trắng Dạng bông 2
M3 8.8 cm Nhanh Trắng Dạng bông 3
Dạng bông, dày M4 3.9 cm Vừa phải Trắng xám, nhạt 4 đặc
7.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 5 M5
6 cm Nhanh Màu xám, viền trắng Dạng bông 6 M6
9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 7 M7
9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 8 M8
9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 9 M9
10 M10 9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông
11 M11 9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông
Qua bảng trên cho thấy rằng, về đặc điểm hình dạng sợi nấm: đa số các
chủng nấm mốc phân lập được đều có dạng bông, riêng chủng nấm mốc M4 có
dạng bông dày đặc.
- Về màu sắc khuẩn lạc: các chủng nấm mốc M1, M3, M5, M7, M8, M9,
M10, M11 phân lập từ bánh men đều có màu trắng. Các chủng nấm mốc có màu
xám, viền trắng là M2 và M6.Riêng chủng nấm mốc M4 thì có màu trắng, xám
nhạt.
- Về kích thước khuẩn lạc nấm mốc trong 2 ngày sau khi cấy, có kích thước
từ 3,9 – 9, 5 cm.
33
- Tốc độ phát triển của các chủng nấm mốc phân lập được đều nhanh.
3.3. Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc và
chọn lọc chủng sản xuất enzyme amylase
Kết quả thí nghiệm xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm
mốc cho thấy 9 chủng: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 có khả năng tạo
vòng phân giải tinh bột và 2 chủng: M2, M6 không có khả năng tạo vòng phân giải
tinh bột.
Các chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột do đó chúng có khả năng
tạo ra enzyme amylase. Nấm mốc tạo ra enzyme amylase phân giải liên kết 1,4 –
glycoside ở giữa chuỗi tạo thành dextrin phân tử thấp. Dưới tác dụng của enzyme
amylase, tinh bột trong môi trường nhanh chóng bị mất khả năng tạo màu với dung
dịch iodine.
Như vậy, 9 chủng nấm mốc: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 có
khả năng tạo enzyme amylase và 2 chủng nấm mốc: M2, M6 không có khả năng tạo
enzyme amylase. Kết quả đo vòng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc theo
Bảng 3.3:
Bảng 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc phân lập từ bánh
men cơm rượu
STT Chủng Đường kính phân giải tinh bột (cm)
1 M1 1,85
2 M2 -
3 M3 2,25
4 M4 3,1
5 M5 1,55
6 M6 -
7 M7 1,25
8 M8 2,6
9 M9 2,75
10 M10 2,1
34
11 M11 2,23
Qua kết quả thí nghiệm khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc
đã cho thấy các chủng nấm mốc phân lập được từ bánh men có đường kính phân
giải từ 1,25 – 3,1 cm. Trong đó có 2 chủng nấm mốc không có khả năng phân giải
tinh bột là chủng M2 và M6. Khả năng phân giải tinh bột của chủng M4 là lớn nhất
có vòng phân giải là 3, 1 cm, trong khi đó chủng M7 có khả năng phân giải tinh bột
nhỏ nhất, vòng phân giải tinh bột là 1,25 cm. Chủng M4 được chọn lọc để sản xuất
enzyme amylase.
a. Chủng M4 b. Chủng M3
c. Chủng M9 d. Chủng M11
35
Hình 3.2: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M3, M4, M9, M11
e. Chủng M6 f. Chủng M7
Hình 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M6, M7
3.4 Kết quả thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc bằng phương pháp
nuôi cấy chìm
3.4.1. Điều kiện nuôi cấy
Quá trình nuôi cấy chìm phải đảm bảo ở nhiệt độ từ 23 đến 320 tốt nhất là
300 c ở nhiệt độ phòng, pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy là pH=7. Trong quá
trình cấy giống cần lưu ý là mọi thao tác đều phải tiến hành trong tủ cấy và cạnh
đèn cồn.
Chuẩn bị 100ml môi trường trong erlen 250ml. Đem tiệt trùng ở 1210C trong
30 phút và để nguội. Cho 10ml nước cất đã vô trùng vào trong ống nghiệm giống
nấm mốc, khuấy nhẹ để các bào tử hòa trong nước. Đổ toàn bộ 10ml dịch trong ống
nghiệm này vào trong erlen 250ml có 100ml môi trường.
Đặt các erlen này vào máy lắc có tốc độ 200 v/p nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ
phòng. Sau đó, đem ly tâm, thu lấy dịch. Dịch nuôi cấy này có chứa enzyme hòa
tan. Bảo quản dịch nuôi cấy này trong tủ lạnh 40C. Dùng 200ml cồn 960 lạnh đổ từ
36
từ vào 100ml dịch lọc enzyme đã làm lạnh, khuấy rất nhẹ để cồn hòa đều với dịch
enzyme. Sau đó, để hỗn hợp này vào tủ lạnh.Sau 24 giờ, hỗn hợp sẽ phân thành hai
lớp.
Đem ly tâm để thu enzyme dạng tủa. Enzyme dạng tủa này còn chứa nhiều
nước. Nước tồn tại trong đó sẽ làm giảm hoạt tính enzyme. Do đó, cần phải loại
nước bằng cách sấy ở nhiệt độ <400C, ta có chế phẩm enzyme amylase bán tinh
khiết.
3.4.2. Xác định hoạt tính của enzyme Amylase
Mẫu enzym thu được, cho vào mỗi mẫu 2 ml nước cất hòa tan. Tiến hành
khảo sát hoạt tính amylase.
- Lấy 10 ống nghiệm đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Sau đó, Hút vào mỗi ống
nghiệm 1ml dung dịch NaCl 0.5% .
- Trong ống nghiệm số 1, cho vào 1ml dung dịch amylase và lắc kỹ . Sau đó ,
lấy 1ml từ ống nghiệm số 1 cho vào ống nghiệm số 2 , lắc kỹ và lặp lại cho tới ống
nghiệm số 10 thì hút 1ml và bỏ đi.
- Trong mỗi ống nghiệm cho vào 1ml dung dịch hồ tinh bột 0.5% lắc đều , để
vào tủ điều nhiệt ở 37ºC.
- Sau 30 phút lấy ra, thêm vào mỗi ống 1ml H2SO4 10% và 2 giọt Iod trong
KI 3% lắc đều.
- Sau đó ghi kết quả vào bảng.
- Lấy 1 ống nghiệm khác (ống số 11) cho vào 3ml nước cất, 2 giọt thuốc thử
Iod và so sánh với màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzyme
amylase thấp nhất thuỷ phân hoàn toàn tinh bột.
3.4.3. Kết quả xác định hoạt tính của enzyme Amylase
Theo định nghĩa đơn vị hoạt tính theo Wohlgemuth là số lần pha loãng cực
đại enzyme để thủy phân hoàn toàn 1 ml tinh bột 0,5% trong thời gian 30 phút trong
điều kiện thí nghiệm là nhiệt độ = 370C, pH = 6. Vì enzyme kết tủa được hòa tan
trong nước cất, sau đó ½ lượng enzyme này mới được đưa vào xác định hoạt tính và
37
thể tích enzyme là 1 ml nên hoạt tính amylase (đơn vị Wohlgemuth) là :
A = 2n * 2 đơn vị/ml (Trong đó n là số thứ tự ống nghiệm có nồng độ enzym
thấp nhất hay độ pha loãng cao nhất để thủy phân hoàn toàn tinh bột trong điều kiện
thí nghiệm).
Hình 3.4: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme
Bảng 3.4: Bảng kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme
Ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
nghiệm
Độ pha 21 =2 22= 23=8 16 32 64 128 256 512 1024
loãng 4
Màu vàng Nâu Nâu Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh
nhạt đậm
Hoạt tính enzyme amylase thu được: A = 21 x 2 = 4 đơn vị/ml dịch enzyme
kết tủa.
3.5. Kết quả lên men bề mặt thu enzyme amylase
Dưới đây là một số hình ảnh trong quá trình lên men bề mặt thu nhận
38
enzyme amylase bán tinh khiết từ chủng nấm mốc.
Hình 3.5: Môi trường nuôi cấy sau khi hấp
39
Hình 3.6: Cấy giống vào môi trường nuôi cấy
Hình 3.7: Môi trường sau nuôi cấy
40
Hình 3.8: Thu dịch nuôi cấy
Hình 3.9: Lọc dịch chiết
41
Hình 3.10: Chế phẩm enzyme amylase được tủa bằng cồn 960 lạnh
3.6. Kết quả xác định hoạt tính enzym amylase sau kết tủa
Sau khi ly tâm bỏ dịch, kết tủa được hòa tan trong nước cất và sau đó xác
định hoạt tính bằng phương pháp Wohlgemuth để xác định thời gian thu enzyme
cực đại trong quá trình lên men thể rắn
Xác định hoạt tính enzyme amylase thu được trong thời gian nuôi cấy 2, 3, 4
ngày. Hình 3.11, 3.12, 3.13: Biểu diễn kết quả thử hoạt tính enzyme thu được bằng
nuôi cấy bề mặt sau 2, 3, 4 ngày.
Hình 3.11: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 2 ngày nuôi cấy
42
Hình 3.12: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 3 ngày nuôi cấy
Hình 3.13: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 4 ngày nuôi cấy
Theo định nghĩa đơn vị hoạt tính theo Wohlgemuth là số lần pha loãng cực
đại enzyme để thủy phân hoàn toàn 1 ml tinh bột 0,5% trong thời gian 30 phút trong
điều kiện thí nghiệm là nhiệt độ = 370C, pH = 6. Vì enzyme kết tủa được hòa tan
trong đệm, sau đó ½ lượng enzyme này mới được đưa vào xác định hoạt tính và thể
tích enzyme là 1 ml nên hoạt tính amylase (đơn vị Wohlgemuth) là :
A = 2n * 2 đơn vị/ml (Trong đó n là số thứ tự ống nghiệm có nồng độ enzym
thấp nhất hay độ pha loãng cao nhất để thủy phân hoàn toàn tinh bột trong điều kiện
thí nghiệm), ta có quả trong Bảng 3.5.
2 5 4 3 1 7 8 9 10
Ống nghiệm 6 Độ pha loãng 21 = 2 22 = 4 23=8 24=16 25=32 64 128 256 512 1024
Enzyme thu được sau 2 ngày lên men = hoạt tính = 0
Màu Tím Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh
xanh
Enzyme thu được sau 3 ngày lên men = 22 x 2 = 8 đơn vị/ml dịch enzyme kết tủa
Màu vàng vàng nâu Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh
Enzyme thu được sau 4 ngày lên men = 21 x 2 = 4/ml dịch enzyme kết tủa
Màu Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh
vàng Nâu Nâu đậm
Bảng 3.5: Xác định hoạt tính enzyme amylase thu được trong thời gian 2, 3, 4 ngày
43
lên men thể rắn
Vậy qua thí nghiệm trên ta thấy enzym thu được ở ngày thứ 3 có hoạt tính
mạnh nhất đạt 8 đơn vị/ ml enzyme kết tủa.
So sánh lên men chìm và lên men bề mặt
Chỉ tiêu so sánh Lên men chìm Lên men bề mặt
Môi trường PGA lỏng( khoai tây, Cám gạo, trấu, nước, muối
gluco, nước cất) trung tính
Mật độ giống 10 ml dịch bào tử nấm 1ml dich bào tử nấm
mốc
Nhiệt độ 300c 300c
pH 6,5 6,2
Oxy
Thời gian 48h 72h
Giá thành môi trường, 4000 vnd 2000 vnd
Giá thành giống bào tử 1000 vnd 1000 vnd
Giá thành năng lượng lên 4000 vnd 2000 vnd
men (tính cho tiệt trùng và
khuấy nếu cần)
Giá thành cồn kết tủa 6000 vnd 10000 vnd
Giá thành năng lượng sấy 2000 vnd 0 vnd
Tổng chi phí 17000 vnd 6000 vnd
Hoạt tính (đơn vi W/ml) 4 8
Thể tích enzymne kết tủa 200ml 500ml
(ml)
Hoạt tính tổng (đơn vị W) 4 đơn vị W/ ml x 2 ml 8 đơn vị W/ml x 2 ml
Giá thành enzyme 8/17000 16/6000
Năng suất enzyme (đơn vị 4 / 2 ngày 8/3 ngày
W/ml/ngày)
Từ bảng trên ta thấy sự khác biệt giữa 2 phương pháp lên men chìm và lên
44
men bán rắn: Lên men bán rắn phương pháp có nhiều ưu điểm hơn vì công nghệ
đơn giản, nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền và đặc biệt hơn cả là lượng enzyme thu được
nhiều hơn, chi phí thấp hơn so với phương pháp lên men chìm.
3.7. Kết quả thí nghiệm về khả năng phân giải bột gạo của enzym
amylase
Bố trí thí nghiệm thủy phân tính bột từ enzyme kết tủa còn lại với nồng độ
dung dịch tinh bột. Xác định khả năng thủy phân tinh bột của enzyme amylase, ta
có kết quả như Bảng 3.6:
Bảng 3.6: Thí nghiệm thủy phân tinh bột
Ống nghiệm 1 2 4 Đối chứng 3
Dd tinh bột (ml) 4 4 4 0 4
Lượng tinh bột trong 2g/20 ml 0,4 g 0,4 g 0,4 g 0,4 g
mẫu thủy phân x4 =0,4 g
Dd Enzyme(ml) 2 1 0 0 0,5
Nước cất (ml) 0 1 2 2 1,5
Hoạt tính enzyme 8 đơn 2 đơn vị 1 đơn 0 0
vị/ml/4 ml vị
x 2ml = 4
đv
Tỉ lệ enzyme/cơ chất 4 đơn vị/ 2 đơn vị 2,5
0,4 g = 10 /0,4 = 5 đơn
đơn vị/g đơn vị/g vị/g
Dd Lugol (giọt) 2 giọt 2 giọt 2 giọt 2 giọt 2 giọt
Màu vàng vàng Nâu Xanh Xanh
Tiến hành đo pH ở 4 ống ta đươc pH=6. Sau 30 phút hoặc 60 phút, thử màu
bằng dd iod (bằng cách nhỏ giọt ra miếng sứ trắng, đối chứng, nhỏ giọt iod với
45
nước cất. Theo dõi đến khi nào kết thúc thủy phân.
Ống 1 Ống 2 Ống 3 ống 4
Hình 3.14: Kết thúc thủy phân tinh bột gạo hồ hóa
Kết quả ta thấy ống 1 và ống 2 có màu vàng nhạt giống với màu của ống đối
chứng , điều đó cho thấy ống 1 và 2 thủy phân được hoàn toàn tinh bột. Theo dõi
thời gian kết thúc thủy phân ở phản ứng trên, như vậy với tỉ lệ enzyme cơ chất là 10
đơn vị Wohlgemuth/g cơ chất, thời gian thủy phân hoàn toàn ở nhiệt độ = 370 C, pH
46
= 6 là 30 phút.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Sau một thời gian tiến hành nghiên cứu và thực nghiệm, người thực hiện đề
tài đã:
- Phân lập được 11 chủng nấm mốc từ bánh men cơm rượu ở 8 địa điểm
khác nhau.
- Trong đó có 9 chủng nấm mốc đều có khả năng phân giải tinh bột bao gồm
các chủng: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 và 2 chủng không có khả
năng phân giải tinh bột là chủng M2, M6. Như vậy, 9 chủng nấm mốc có khả năng
tạo enzyme amylase, 2 chủng nấm mốc không có khả năng tạo enzyme amylase.
- Tiến hành nuôi cấy chủng M4 để thu nhận được enzyme amylase bán tinh
khiết theo phương pháp nuôi cấy chìm.
- Từ 1 lít môi trường nuôi chủng M4 thu được 1,23 g chế phẩm enzyme
amylase bán tinh khiết.
- Tiến hành nuôi cấy chủng M4 bằng phương pháp lên men, sau 3 ngày nuôi
cấy hoạt tính enzyme thu được là cực đại. Chế phẩm enzyme kết tủa có hoạt tính 8
đơn vị/ ml. Sử dụng enzyme trên thủy phân dung dịch tinh bột 10% với tỉ lệ enzyme
cơ chất là 10 đơn vị/g thời gian thủy phân hoàn toàn là 30 phút.
4.2. Kiến nghị
Do thời gian có hạn và điều kiện máy móc thiết bị còn hạn chế, người thực
hiện đề tài không thể tiến hành các nghiên cứu sâu hơn. Với những kết quả đạt
được, người thực hiện đề tài đề nghị:
- Tiến hành định danh các chủng đến loài.
- Nghiên cứu tối ưu quá trình sản xuất enzyme amylase để thu được lượng
enzyme tối đa, chất lượng với chi phí thấp.
- Nghiên cứu sản xuất enzyme amylase từ các chủng khác có khả năng phân
47
giải tinh bột ngoài chủng M4.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Nguyễn Văn Bá – Cao Ngọc Điệp – Nguyễn Văn Thành, Giáo trình môn Nấm
học, Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học – Trường ĐH Cần Thơ,
2005.
[2] Nguyễn Lân Dũng, Vi sinh học học, NXB Giáo Dục, số 04 – 2009/CXB/301 –
2117/GD.
[3] Bùi Xuân Đồng, Nguyên lý phòng chống nấm mốc và mycotoxin, NXB Khoa
học và Kỹ thuật Hà Nội, 2003
[4] Nguyễn Thị Hiền (Chủ Biên), Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên
men cổ truyền, NXB Khoa học và Kỹ thuật – ĐH Bách Khoa Hà Nội, 2006.
[5] Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên), Cao Cường – Nguyễn Ánh Tuyết – Lê Thị
Thủy Tiên – Tạ Thu Hằng – Huỳnh Ngọc Oanh – Nguyễn Thúy Hương – Phan Thị
Huyền, Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh Trường ĐH
Bách Khoa, 2004.
[6]Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên) – Phan Thị Huyền – Nguyễn Ánh Tuyết, Thí
nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB ĐH Quốc gia
TP. Hồ Chí Minh, 2006.
[7] Nguyễn Văn Mùi, Thực hành Hóa sinh học, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2000.
[8] Đồng Thị Thanh Thu, Sinh hóa ứng dụng (Trong công nghiệp thực phẩm và một
số lĩnh vực khác), NXB Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh Trường ĐH Khoa học
Tự nhiên, 2003.
[9].http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Mature_sporangium_of_a_Mucor_sp._
fungus _PHIL_3960_lores.jpg
[10].http://muivi.com/muivi/index.php?option=com_content&task=view&id=3087
&Itemid=431
48
[11].http://vi.wikipedia.org/wiki/N%E1%BA%A5m
