Đồ án tốt nghiệp: Tuyển chọn các chủng Trichoderma đối kháng nấm bệnh trên cây thanh long và tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG TRICHODERMA ĐỐI KHÁNG NẤM BỆNH TRÊN CÂY THANH LONG VÀ TĂNG CƯỜNG QUÁ TRÌNH Ủ COMPOST TỪ CÀNH THANH LONG

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HAI

Sinh viên thực hiện

: THÁI QUỐC ĐÔNG

MSSV: 1615101003 Lớp: 16HSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2018

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của chúng em dưới sự hướng dẫn của

tiến sĩ Nguyễn Thị Hai tại Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH của trường Đại học

Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.

Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới

bất kỳ hình thức nào.

TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm

THÁI QUỐC ĐÔNG

Sinh viên thực hiện

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã tạo điều kiện học tập để chúng

em có thành quả như ngày hôm nay.

Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh,

chúng em được các thầy cô trong Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH đã hết lòng

hướng dẫn và giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập tại trường, cũng như trong

quá trình thực hiện đồ án. Chúng em xin được gửi đến các Thầy Cô lời cảm ơn chân

thành nhất, nhờ có Thầy Cô đã trang bị kiến thức cho chúng em để có thể thực hiện

đồ án này. Chúng em cũng xin cảm ơn Thầy Cô trong phòng thí nghiệm và các bạn

cùng khóa đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để chúng em hoàn thành đồ án tốt

nghiệp.

Đặc biệt, chúng em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng

dẫn, chỉ bảo chúng em trong suốt quá trình thực hiện đồ án.

Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn các Thầy Cô trong hội đồng Phản Biện đã dành thời

gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này. Chúng em xin gửi đến Thầy Cô lời chúc

sức khỏe trân trọng nhất.

Trong quá trình làm đồ án, do kinh nghiệm còn thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên

có nhiều thiếu sót, mong các Thầy cô bỏ qua.

TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm

THÁI QUỐC ĐÔNG

Sinh viên thực hiện

MỤC LUC

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết đề tài ..................................................................................................... 1

2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................................... 1

3. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................... 1

4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 2

5. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................. 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3

1.1. Tình hình sản xuất thanh long ở Việt Nam .............................................................. 3

1.1.1. Tình hình trồng thanh long ở Việt Nam ................................................................ 3

1.1.2. Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long ........................................................... 4

1.2. Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh ............................................................................................................................ 4 long.

1.2.1. Phân loại nấm Neoscytalidium dimidiatum. .......................................................... 4

1.2.2. Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum ............................................... 5

1.3. Giới thiệu nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long. .............. 7

1.3.1. Phân loại ................................................................................................................ 7

1.3.2. Hình thức xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp ................................................ 8

1.4. Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm nâu và thán thư trên cây thanh long …10

1.5. Giới thiệu về nấm Trichoderma spp đối kháng với nấm bệnh. .............................. 11

1.5.1. Phân loại .............................................................................................................. 11

1.5.2. Các chủng nấm Trichoderma spp. ....................................................................... 11

1.5.3. Đặc điểm hình thái ............................................................................................... 14

1.5.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .................................................................................. 15

1.5.5. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của Trichoderma spp. ..................................... 16

1.5.6. Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma spp phòng trừ nấm gây bệnh….16

1.5.7. Một số nghiên cứu của nấm Trichoderma spp trên thế giới và ở Việt Nam. ...... 18

1.5.8. Ứng dụng Trichoderma trong nông nghiệp ......................................................... 19

1.6. Khái niệm về ủ compost và sử dụng xác bã hữu cơ để ủ compost ......................... 21

1.6.1. Định nghĩa compost ............................................................................................. 21

1.6.2. Cấu trúc và cơ chế phân giải cellulose ................................................................ 21

1.6.3. Các thông số quan trọng trong quá trình ủ compost. ........................................... 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 25

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ......................................................................... 25

2.2. Vật liệu ................................................................................................................... 25

2.2.1. Nguồn nấm đối kháng, nấm gây bệnh ................................................................. 25

2.2.2. Dụng cụ và thiết bị .............................................................................................. 25

2.2.3. Hóa chất ............................................................................................................... 25

2.3. Phương pháp nhiên cứu. ......................................................................................... 28

2.3.1. Quan sát khả năng sinh trưởng của Trichoderma ............................................... 30

2.3.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma spp . .......................................................................................................................... 30

2.3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh. .......................................................................................................................... 32

2.3.4. Thử nghiệm ủ compost cành thanh long của nấm Trichoderma spp ................. 34

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................... 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 38

3.1. Đặc điểm sinh trưởng nấm Trichoderma spp ......................................................... 38

3.2. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma .......................................................................................................................... 45 spp

3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng nấm Trichoderma spp ... .......................................................................................................................... 45

3.2.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng Trichoderma spp. ...... 47

3.3. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma spp với nấm bệnh .......................................................................................................................... 49

3.3.1. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum. .......................................................................................... 49

3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên thanh long. .................................................. 52

3.4. Thử nghiệm ủ compost từ cành thanh long của chủng nấm Trichoderma T3 ........ 54

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 57

4.1.Kết luận.................................................................................................................... 57

4.2.Kiến nghị ................................................................................................................. 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 58

PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 62

Phụ lục A: Bảng số liệu thô ......................................................................................... 62

A.1. Tốc độ sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. ......................... 62

A.2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 .......................................................................................................................... 63 ngày.

A.3. Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. .......................................................................................................................... 64

A.4. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 3 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 65

A.5. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 5 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 66

A.6. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 7 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 67

A.7. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 5 ngày. .......................................................................................................................... 68

A.8. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 7 ngày. .......................................................................................................................... 68

A.9. Hàm lượng C, N trong cành thanh long. ............................................................... 69

Phụ lục B: Số liệu xử lý ............................................................................................... 70

B.1. Tốc độ sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. ......................... 70

B.2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 .......................................................................................................................... 71 ngày.

B.3. Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. .......................................................................................................................... 73

B.4. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 3 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 74

B.5. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 5 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 76

B.6. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 7 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 78

B.7. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 5 ngày nuôi cấy. ............................................................................................................. 80

B.8. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 7 ngày nuôi cấy. ............................................................................................................. 81

Phụ lục C: Hình ảnh .................................................................................................... 82

C.1. Hình thái đại thể của các chủng nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA ................................................................................................................... 82

iii

C.2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) và chitinase (cm) sau 2 ngày nuôi cấy của các chủng Trichoderma spp. ................................................................................... 83

C.3. Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum. .................................................................................................................... 89

C.4. Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp .......................................................................................................................... 93

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma .......................................... 12

Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí .............. 24

Bảng 3.1 Đường kính tản nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy ......................... 38

Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng nấm Trichoderma spp 45

Bảng 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma sau 2NSC ... 47

Bảng 3.4 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum ..................................................................................................................... 49

Bảng 3.5 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma với nấm Colletotrichum sp. ....................................................................................................................................... 52

Bảng 3.6 Kết quả phân tích hàm lượng carbon, hàm lượng nitơ tổng của nguyên liệu ban đầu và 30 ngày sau ủ. .................................................................................................... 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái vi thể của Neoscytadium dimidiatum. ............................................... 5

Hình 1.2 Hình thái vi thể của Colletotrichum gleoesporioides ..................................... 7

Hình 1.3 Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum. ............................................... 11

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử cellulose ............................................................................. 22

Hình 3.1 Chủng nấm Trichoderma T22, T26 và T3 sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường

PDA. .............................................................................................................................. 45

Hình 3.2 Vòng phân giải enzyme cellulase của chủng Trichoderma

T3,T22,T26,TC6,TC15 ...................................................................................................... 47

Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma T3,T22,T7. ... 49

Hình 3.4. Đĩa nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ

trái qua). ......................................................................................................................... 51

Hình 3.5 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm Neoscytalidium

dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). ................................... 51

Hình 3.6 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T26 với nấm

Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). ......... 51

Hình 3.7 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T22 với nấm

Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). ......... 52

Hình 3.8 Đĩa nấm đối chứng Colletotrichum sp ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua)…53

Hình 3.9 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm

Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) ............................ 53

Hình 3.10 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T22 với nấm

Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) ............................ 54

Hình 3.11 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T26 với nấm

Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) ............................ 54

Hình 3.12 Thanh long trước khi ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm. ............ 55

Hình 3.13 Thanh long ở công thức đối chứng 30 ngày sau ủ: (a) đối chứng ; (b) công

thức thí nghiệm ............................................................................................................. 56

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CMC: Carboxymethyl cellulose

NT: nghiệm thức

ĐC: đối chứng

PDA: Potato D-glucose Agar

VSV: vi sinh vật

NSC: ngày sau cấy

vii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết đề tài

Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất châu Á và cũng là

nước xuất khẩu thanh long hàng đầu thế giới. Thanh long hiện đang được trồng tại các

vùng chuyên canh quy mô lớn như các tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang và Long An. Diện

tích ba tỉnh này chiếm 92% tổng diện tích cả nước. Trong đó, Bình Thuận là tỉnh có diện

tích trồng thanh long cao nhất nước. Theo số liệu mới nhất của sở Nông nghiệp và Phát

triển Nông thôn tỉnh Bình Thuận, tính đến ngày 31/12/2017, toàn tỉnh có khoảng 27.845

ha thanh long với sản lượng 696.125 tấn. Đi kèm với sự gia tăng về diện tích và sản

lượng thanh long là sự gia tăng về dịch bệnh và lượng phế thải từ cành thanh long. Trong

số các dịch bệnh hại trên thanh long, bệnh đốm nâu và bệnh thán thư là hai bệnh hại

chính gây ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của thanh long. Việc sử dụng thuốc

hóa học có hiệu quả thấp đối với bệnh, đặc biệt trong điều kiện mưa. Vì vậy các nhà

khoa học không ngừng tìm kiếm các tác nhân sinh học để quản lý bệnh hại thanh long.

Trong bộ sưu tập các chủng Trichoderma của phòng thí nghiệm Viện khoa học ứng

dụng, trường Đại học Công nghệ TP.HCM, có nhiều chủng có khả năng đối kháng cao

với bệnh đốm nâu (Nguyễn Thị Bích Tuyền, 2016). Tuy vậy, chưa có nghiên cứu đánh

giá nào trên bệnh thán thư. Vì vậy, để làm cơ sở chọn tạo các chủng tốt làm chế phẩm

trừ bệnh đốm nâu và thán thư (hai bệnh hại chính trên thanh long) cũng như hỗ trợ ủ

cành thanh long sinh viên tiến hành đề tài “Tuyển chọn các chủng Trichoderma đối

kháng nấm bệnh trên cây thanh long và tăng cường quá trình ủ compost từ cành

thanh long”.

2. Mục đích nghiên cứu

Tuyển chọn các chủng Trichoderma spp có khả năng đối kháng nấm bệnh trên phế

phẩm thanh long và chủng có khả năng sinh enzyme cellulase để tăng cường quá trình

ủ compost từ cành thanh long.

3. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định khả năng sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp.

Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng Trichoderma spp.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Xác định khả năng đối kháng với nấm bệnh Neoscytadium dimidiatum gây bệnh

đốm nâu trên cây thanh long.

Xác định khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên

cây thanh long.

Ứng dụng chủng nấm Trichoderma spp ủ compost.

4. Nội dung nghiên cứu

Đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng nấm Trichoderma spp.

Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào cellulase và chitinase của chủng nấm

Trichoderma spp.

Đánh giá khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu

trên thanh long của các chủng nấm Trichoderma spp trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Đánh giá khả năng đối kháng nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây

thanh long của các chủng nấm Trichoderma spp trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Xử lý các phế phẩm của cây thanh long bằng phương pháp ủ compost ở phạm vi

phòng thí nghiệm.

5. Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nấm đối kháng Trichoderma spp.

Nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long.

Nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long.

Phế phẩm thanh long lấy từ Bình Thuận.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình sản xuất thanh long ở Việt Nam

1.1.1. Tình hình trồng thanh long ở Việt Nam

Cây thanh long là cây ăn trái thuộc họ xương rồng, có nguồn gốc ở vùng sa mạc

thuộc Mexico và Columbia, thuộc nhóm cây nhiệt đới khô. Thanh long được người Pháp

mang đến Việt Nam từ thế kỷ 19, trồng rải rác trong sân vườn, đến thập niên 1980 mới

được trồng thương mại. Phần lớn thanh long được trồng ở Việt Nam là loài Hylocereus

undatus, có vỏ đỏ hay hồng/ruột trắng còn lại là loại ruột đỏ. Loại vỏ đỏ ruột trắng chiếm

95%, 5% còn lại là loại vỏ đỏ, ruột đỏ.

Mùa thanh long từ tháng 4 đến tháng 10, rộ nhất từ tháng 5 đến tháng 8. Nhiều

giống thanh long được lai tạo để tăng năng suất, chất lượng và phù hợp đất đai và khí

hậu từng vùng. Tại Viện Cây ăn quả Miền Nam hiện đang bảo tồn 20 giống thanh long

từ nguồn thu thập trong nước và du nhập từ nước ngoài cùng 40 giống thanh long lai,

phục vụ công tác nghiên cứu, bảo tồn gen, chọn tạo giống.

Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất châu Á và cũng là

nước xuất khẩu thanh long hàng đầu thế giới. Diện tích trồng thanh long ở Việt Nam

tăng khá nhanh từ 5.512 ha năm 2000 lên đến 35.665 ha diện tích trồng thanh long với

tổng sản lượng đạt khoảng 614.346 tấn vào năm 2014. Theo số liệu ước tính sơ bộ năm

2015, diện tích trồng mới gần 5.000 ha, sản lượng đạt khoảng 686.195 tấn.

Hiện tại, thanh long đã được trồng rộng rãi ở các tỉnh thành trên toàn quốc. Tuy

nhiên, diện tích tập trung lớn nhất là: Bình Thuận, Long An, Tiền Giang (3 tỉnh này đã

có hơn 37 ngàn ha) tiếp theo là Tây Ninh, Đồng Nai, một số tỉnh Tây Nguyên và các

tỉnh phía Bắc. Phát triển mạnh thành các vùng chuyên canh quy mô lớn tập trung ở các

tỉnh như Bình Thuận, Tiền Giang, và Long An. Diện tích thanh long của ba tỉnh này

chiếm 92% tổng diện tích và 96% sản lượng của cả nước, phần diện tích thanh long còn

lại phân bố ở một số tỉnh miền nam như Vĩnh Long, Trà Vinh, Tây Ninh, Bà Rịa – Vũng

Tàu và một số tỉnh Miền Bắc.

Bình Thuận là nơi có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất chiếm 63,2% diện

tích và 68,4% sản lượng cả nước, kế đến là Long An (chiếm 17,3% diện tích và 14,2%

sản lượng) và đứng thứ ba là Tiền Giang (chiếm 10,9% diện tích và 13,7% sản lượng).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.1.2. Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long

Thanh long là cây trồng có giá trị xuất khẩu cao của Việt Nam. Bình Thuận là tỉnh

có diện tích trồng thanh long nhiều nhất trong cả nước. Trong quá trình canh tác, nông

dân gặp khó khăn trong khâu đảm bảo vệ sinh môi trường. Một trong nhưng nguyên do

là sau lượng lớn cành thanh long, bông lép, trái thối sau khi được cắt tỉa không có chỗ

tiêu hủy. Như vậy, bình quân mỗi năm có từ 3 – 4 vụ nên lượng phế phẩm từ cây thanh

long lớn, nhiều hộ dân đã dùng biện pháp tủ dưới gốc thanh long, hoặc đổ đống ngay tại

vườn gây hôi thối, là nguồn phát sinh gây bệnh cho cây thanh long. Điều này vừa ảnh

hưởng đến môi trường, vừa không đảm bảo đúng quy trình sản xuất theo tiêu chuẩn

ViệtGAP (Theo thời báo Úc, 2017).

1.2. Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh

long.

1.2.1. Phân loại nấm Neoscytalydium dimidiatum.

Bệnh đốm trắng hay còn gọi là bệnh đốm nâu, tắc kè, bệnh ma là những tên gọi

khác nhau mà bà con nông dân trồng thanh long ở Bình Thuận, Tiền Giang và Long An

đặt cho một loại dịch hại mới phát sinh. Theo ghi nhận của Viện Nghiên cứu cây ăn quả

Miền Nam thì trên thực tế bệnh đốm trắng bệnh này đã xuất hiện rải rác đầu tiên vào

năm 2008 tại Bình Thuận và Tiền Giang và đến năm 2011 trở lại đây thì bệnh tấn công

mạnh và lây lan nhanh hơn.

Sau khi phân lập và định danh theo mô tả hình thái của Crous và cộng sự (2006),

xác định nguyên nhân gây bệnh đốm trắng là nấm Neoscytalidium dimidiatum. Kết quả

này tương tự như với các nghiên cứu ở Đài Loan (Chuang, et al. 2012) và ở Malaysia

(Masratul Hawa, et al. 2013).

Đặc điểm vị trí phân loại của nấm Neoscytalidium dimidiatum (Agrios, 2005;

Crous & Slippers, 2006).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Ngành: Ascomyta

Lớp: Dothideomycetes

Bộ: Botryosphaeriales

Họ: Botryosphaeceae

Chi: Neoscytalidium

Loài: Neoscytalidium dimidiatum

N.dimidiatum thuộc ngành nấm túi Hình 1.1 Hình thái vi thể của Neoscytadium dimidiatum. (nguồn internet) (Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh dưỡng

dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thường có một nhân,

đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo thành cơ thể

đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân. Vách tế bào cấu tạo bằng

chitin và glucan, đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất, trong nước, trên cạn,

thực vật, động vật, một số lại ký sinh gây bệnh trên thực vật, động vật, người gây nên

những thiệt hại lớn. Ascomyta sinh sản sinh dưỡng bằng sự chia đôi tế bào, nảy chồi,

đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản vô tính bằng bào tử đính (conidia)

và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Các bào tử khác tính (+,-) sợi nấm đơn bội, phân

nhánh thành hệ sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hình

thành sợi sinh túi đa bào, sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lưỡng bội

rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi. Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai đoạn: giai

đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch và giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội

chiếm ưu thế. Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở

lỗ và quả thể hở.

Cơ chế gây bệnh của nấm Neoscytalidium dimidiatum: Bào tử nấm nảy mầm trên

bề mặt tiếp xúc rồi xâm nhập vào trong mô gây hoại tử, bệnh gây hại trên thân cành và

quả thanh long.

1.2.2. Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum

1.2.2.1. Tình hình nghiên cứu nước ngoài

Theo báo cáo đầu tiên về nấm Neoscytalidium dimidiatum trên cây có múi tại Italya

(G. Polizzi et al, 2009) vào tháng 9 năm 2008 một căn bệnh mới đã được phát hiện và

chú ý ở phía Sicily, Italy trong vườn cây có múi, cam ngọt 2 tuổi đã xuất hiện một bệnh

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

mới với triệu chứng điển hình là chồi kém phát triển và thối trên thân, cành, gốc ghép,

vết thối chảy gôm.

Theo nghiên cứu viện nghiên cứu sở nông nghiệp, Đại học quốc gia Đài Loan,

Trung Quốc, vào tháng 9 năm 2009 và 2010 bệnh đốm trắng đã xuất hiện ở một số cây

Thanh long tại Đài Loan. Triệu chứng của bệnh là các vết nhỏ, tròn, vết bệnh lõm, màu

cam. Bệnh được xác định do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra.

Năm 2008, nấm Neoscytalidium dimidiatum đã phát hiện trên các quả Thanh long

trồng ở Malaysia. Neoscytalidium dimidiatum đã gây ra triệu chứng như chấm tròn nhỏ,

thối và sau đó mục nát. Mẫu bệnh đã được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường PDA

và ủ ở 250C trong 7 ngày. Nấm thu được nuôi cấy trên môi trường PDA, nấm có quả

cành màu đen, đường kính 90mm, hình elip, hình trứng, hình que hoặc hình tròn trong

pha lê có 2 vách ngăn. DNA chiết từ sợi nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA thực

hiện phản ứng khuếch đại sử dụng mồi ITS4 và ITS5. Cuối cùng thực hiện lây bệnh

nhân tạo để so sánh đánh giá bệnh.

1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Sự xuất hiện một loại dịch hại mới phát sinh gần đây gây thiệt hại nghiêm trọng

và có xu hướng càng ngày lan rông, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng quả là mối

lo ngại cho người nông dân trồng thanh long. Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên

cứu cây ăn quả Miền nam (2011), bệnh đốm trắng do nấm Neoscytalidium dimidiatum

gây ra, nấm này còn có tên khác là Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola,

Hendersonula toruloidea,…(Crous et al. 2006) bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh

và mùa mưa, nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển từ 20 – 30˚C. Ẩm độ càng cao càng

tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan mạnh. Bệnh lây theo gió và nguồn

nước nhiễm bệnh. Qua theo dõi thấy bệnh hại nặng ở những vùng có mực nước ngầm

cao, những vườn vệ sinh kém, rậm rạp và bị che mát nhiều, vườn sử dụng nhiều phân

đạm hay phân bón phân chuồng chưa ủ hoai, vườn sử dụng nhiều chất kích thích tăng

trưởng hay vườn bón thiếu trung, vi lượng đều có tỉ lệ bệnh cao hơn bình thường và khi

có bệnh thì khó phòng trừ hơn. Vết bệnh ban đầu là những đốm tròn nhỏ màu trắng, hơi

lõm, về sau chuyển sang màu vàng cam và khi bệnh phát triển nặng đốm bệnh trở thành

vết loét có màu nâu, hơi nổi lên và gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây, năng suất

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

và giá trị thương phẩm của quả. Bệnh thường gây hại trên bẹ non, nụ bông, quả non và

giai đoạn chuẩn bị thu hoạch.

Theo Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2014) khi so sánh trình tự vùng gen ITS-

RADN của mười một mẫu phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum tại Viện Nghiên

Cứu CNSH và Môi Trường - trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh cho thấy các

mẫu phân lập tương đồng rất cao với trình tự của loài Neoscytalidium dimidiatum đã

được định danh về hình thái.

Hà Thị Thúy và các cộng sự (2016) tại Viện Môi trường Nông nghiệp đã nghiên

cứu ứng dụng vi sinh vật để kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long do nấm

Neodiumdimidiatum gây ra. Nghiên cứu đã xác định được 2 chủng vi sinh vật có khả

năng ức chế Neoscytalidium dimidiatum cao là chủng Bacillus polyfermenticus và

Streptomyces fradiea và đảm bảo an toàn sinh học khi đưa ra môi trường.

1.3. Giới thiệu nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long.

1.3.1. Phân loại

Ngành: Ascomycota

Sordariomycetes Lớp:

Glomerellales Bộ:

Glomerellaceae Họ:

Colletotrichum Chi:

Loài: Colletotrichum sp

Hình 1.2 Hình thái vi thể của Colletotrichum gloeosporioides (nguồn intrernet) Nấm Colletotrichum có hệ khuẩn ty

thật, gồm có sự phát triển sợi nấm mảnh, phân nhánh, không màu và vách ngăn sợi nấm.

Hệ sợi nấm có gian bào và nội bào, mỗi tế bào chứa nhiều nhân. Nhiều hạt dầu được sản

xuất trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm. Khi chín, sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn

lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng (Nguyễn Văn Bá và cs, 2005).

Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều

gọi là bào tử hậu (= bào tử áo = chlamydospores), nó có thể ở tận cùng hoặc chen giữa

sợi nấm và tồn tại trong thời gian dài và khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành

sợi nấm mới (Nguyễn Văn Bá và cs, 2005).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Theo Agrios (2005) thì ở giai đoạn vô tính chúng cho ra các bào tử đính đơn bào,

có dạng hình thoi, hình liềm hoặc hình trụ không màu và đôi khi có giọt dịch trong bên

trong bào tử. Bào tử vô tính được sinh ra trong đĩa đài (acervulus) chứa nhiều đính bào

đài (conidiophore) và gai cứng (setae) ở mép bìa đĩa đài hoặc giữa các cành bào đài. Đĩa

đài dạng tròn hoặc dạng gối, có sáp, màu đen, có thể được quan sát trên bề mặt môi

trường thạch agar bằng kính hiển vi. Trên mô bệnh, đĩa đài được tìm thấy bên dưới lớp

biểu bì. Cành bào đài đơn giản, thon dài, bào tử trong suốt, một tế bào, dạng trứng hoặc

dạng thon đến dạng liềm (Barnett và Hunter, 1998). Colletotrichum thường sản xuất

khối bào tử nhày dính bên trong đĩa đài. Khối bào tử màu hồng hay màu da cam và đĩa

đài đôi khi nhầm lẫn với ổ bào tử của nấm Fusarium.

Những loài trong chi nấm Colletotrichum có thể hoặc không thể sinh ra gai . Theo

Barnett và ctv(1998), trong nuôi cấy, gai cũng có thể không xuất hiện. Các gai dài cứng,

thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ. Riêng ở loài Colletotrichum

gloeosporioides, Padman và Janardhna còn ghi nhận thêm là mỗi loài nấm đều có bào

tử và gai đặc trưng, sự sinh ra gai của nấm Colletotrichum chịu ảnh hưởng của ẩm độ

không khí, gai được sinh ra nhiều ở điều kiện ẩm độ không khí tương đối thấp (Nguyễn

Văn Bá và ctv., 2005).

Phần lớn các chủng nấm Colletotrichum phân lập được ở Việt Nam thuộc loài C.

gloeosporioides, chúng có khả năng gây bệnh trên cây thanh long cao hơn so với các

loài khác. Các chủng của loài C. gloeosporioides chủ yếu được phân nhóm về mặt di

truyền theo nguồn gốc địa lý.

Thán thư (Anthracnose) mang nghĩa là “thui đen”, là bệnh hại trên tán lá cây,

thân cành hoặc trái với đặc điểm là sự xuất hiện của những đốm màu đen hoặc những

vết thương lõm xuống với mép rìa mảnh nhô lên (Agrios, 2005). Nó cũng là nguyên

nhân của một số hiện tượng chết ngược của cành non, nhánh. Trong sự xâm nhiễm ở

trái, triệu chứng thán thư thường có giai đoạn tiềm ẩn kéo dài. Triệu chứng ở một số cây

ăn trái là những đốm nhô cao và có hóa bần trên bề mặt (Agrios, 2005).

1.3.2. Hình thức xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp

Để nấm Colletotrichum xâm nhập vào mô kí chủ, chúng có 2 hình thức:

Bằng cách bào tử đính nảy mầm và hình thành đĩa áp để xâm nhập trực tiếp

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trong chi Colletotrichum có cấu trúc xâm nhiễm đặc biệt giúp nấm xâm nhập vào

mô kí chủ được gọi là đĩa áp. Đĩa áp được xem là bộ phận rất quan trọng và cần thiết

cho sự xâm nhiễm thành công của nấm (Perfec et al, 1990).

Trong điều kiện môi trường thích hợp, ống mầm sẽ được tạo ra từ bào tử. Điều này

được gọi là nảy mầm hay mọc mầm của bào tử. Với sự tăng trưởng liên tục của ống

mầm, đĩa áp sẽ được phân biệt ở hai đầu của nó và dần dần tối màu lại (O'Connell et al,

2000). Trong đó, tín hiệu đầu tiên của bào tử nảy mầm là tiết ra chất extracellular matrix

(ECM), chất ECM được coi là dấu hiệu trong suốt quá trình nảy mầm và hình thành đĩa

áp, tổng thời gian để bào tử nảy mầm và tạo thành đĩa áp là 6 ˗ 9 giờ. Quá trình hình

thành và phát triển của đĩa áp trải qua 7 giai đoạn:

(1) Tiết ECM

(2) Phân chia nhân

(3) Tạo thành vách ngăn đầu tiên

(4) Mầm nhú ra

(5) Đỉnh phồng lên

(6) Tạo thành vách thứ cấp

(7) Sự hình thành melanin của đĩa áp

Bằng cách xâm nhập thụ động vào mô kí chủ

Bên cạnh xâm nhiễm trực tiếp bằng cách hình thành đĩa áp, nấm còn có thể xâm

nhiễm bằng các con đường khác một cách thụ động. Nấm có thể xâm nhập qua các lỗ

hở tự nhiên hoặc qua các vết thương trên cây (Đường Hồng Dật, 1984).

Vết thương trên cây có thể do côn trùng, sâu bọ, tuyến trùng chích hút, cắn phá

hoặc do các động vật lớn gây ra (trâu, bò, chim, chuột, gà, vịt, …) ở các bộ phận trên

mặt đất và trong đất. Vết thương còn do dụng cụ trong quá trình chăm sóc cây gây ra

hoặc do bứng cây đem trồng,… Vết thương cũng có thể là vết nứt trong lúc chồi non,

mầm hoa đâm ra từ thân, cành của cây. Ngoài ra, vết thương còn do yếu tố tác động của

giông bão, lũ lụt. Sự tích tụ các muối độc trong điều kiện đất ẩm cũng có thể làm cho rễ

và cổ rễ bị tổn thương do tế bào ở nơi tiếp xúc với các chất độc đó bị chết đi. Cũng theo

ông, các vết thương nhỏ li ti sẽ nhanh chóng được hàn gắn lại nên ít bị kí sinh xâm nhập

vào, còn các vết thương to là nơi thuận lợi nhất cho tất cả các mầm bệnh xâm nhập vào.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Các cửa ngõ tự nhiên trên cây bao gồm các khí khẩu (Stoma) ở lá, bì khẩu (Lenticles)

ở thân, cành và các thủy khẩu (Hydathodes) ở trên lá của một số loài cây. Các cửa ngõ

này do không có các bộ phận bao che tốt như lớp cutin hoặc lớp sáp, chúng được cấu

tạo hở nên rất dễ bị các loại mầm bệnh lợi dụng và xâm nhập vào một cách dễ dàng.

1.4. Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm nâu và thán thư trên cây thanh long.

Để đảm bảo cây thanh long sinh trưởng và phát triển tốt hạn chế bệnh hại cây cần

kiểm soát và quản lý từ giống, môi trường, biện pháp canh tác trong phòng trừ và trị

bệnh cho cây trồng.

Trồng các giống sạch bệnh, cần lựa chọn kỹ các cây con trước khi trồng, các cây

có dấu hiệu nhiễm bệnh cần loại bỏ.

a. Biện pháp canh tác

Trước khi trồng cần làm sạch vườn để loại bỏ các nguồn có nguy cơ gây bệnh cho

cây từ đất, nước, xác bã thực vật, dọn dẹp cỏ và các loại dây leo hoang dại xung quanh

vườn thanh long.

Tỉa cành tạo độ thông thoáng, thu gom và tiêu hủy các bộ phận của cây bệnh bằng

cách chôn sâu hoặc đốt, ngoài ra, có thể xử lý bằng các chế phẩm sinh học làm phân

bón, không vứt cành, quả bệnh xuống mương nước sẽ làm mầm bệnh dễ lây lan.

Bón phân hữu cơ đã ủ hoại mục, cung cấp thêm vôi trước và sau mùa mưa. Bổ

sung thêm vi lượng ( Bo, Canxi, Magie, Silic, Bo…) tăng sức kháng chịu cho cây.

Cuối mùa khô, những cành còn phấn non nên tiến hành cắt 2 – 3 cm ở đầu mút

cành để thoát nước đọng trên cành, giúp thúc nhanh quá trình già hóa cành nhằm hạn

chế bệnh gây hại.

Không để chồi non trong mùa mưa, nếu chồi non ra phải cắt tỉa hết và khử trùng

ngay vết cắt bằng thuốc có chứa gốc đồng, tăng cường chăm sóc cây trong mùa mưa.

b. Biện pháp sinh học

Các tác nhân sinh học có khả năng phòng bệnh tốt không kém hơn thuốc hóa học

nhưng lại an toàn và tiết kiệm chi phí hơn. Có thể bổ sung chế phẩm sinh học

Trichoderma trộn với phân hữu cơ bón cho đất nhằm cung cấp nguồn dinh dưỡng cần

thiết đồng thời tăng khả năng kiểm soát nguồn bệnh.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

c. Biện pháp hóa học

Khi cây ra đọt non có thể phun ngừa luân phiên các loại thuốc bảo vệ thực vật có

chứa hoạt chất Propiconazole, Trifloxystrobin, Iprodione, Mancozeb 7 – 10 ngày/lần

(tuỳ vào điều kiện mưa bão). Thường xuyên kiểm tra vườn để kịp thời phát hiện bệnh

khi mới xuất xuất hiện để phun thuốc kịp thời.

Ngoài ra, nên rút râu bông thanh long sớm ở thời điểm 2 – 3 ngày sau trổ và tương

tự phun ngừa các loại thuốc nêu trên cho giai đoạn trái non và trái chuẩn bị thu hoạch.

Lưu ý khi phun xịt thuốc ở giai đoạn chuẩn bị thu hoạch trái phải tuyệt đối tuân thủ và

đảm bảo thời gian cách ly thuốc an toàn.

1.5. Giới thiệu về nấm Trichoderma spp đối kháng với nấm bệnh.

1.5.1. Phân loại

Năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc phân loại:

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Sordariomycetes

Bộ: Hypocreales

Họ Hypocreaceae

Chi: Trichoderma

Trichoderma thuộc nhóm nấm bất toàn

(Deuteromycetes) không có giai đoạn sinh sản

hữu tính, sinh sản vô tính bằng bào tử. Nhóm nấm Hình 1.3 Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum. (nguồn internet) bất toàn là những nấm sinh sản vô tính bằng bào

tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau (đính bào tử) ở đầu ngọn có

cuống bào tử.

1.5.2. Các chủng nấm Trichoderma spp.

Kubicek và Harman (1998) đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma, ông cho rằng

tùy từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma

Tên loài Đặc điểm Hình ảnh

Đại thể: Khuẩn lạc phát triển nhanh,

đạt 8 – 9cm sau 14 ngày nuôi cấy ở

20˚C, sợi nấm trong suốt, vách dày,

trơn láng rộng 2 – 14µm. Bào tử màu

Trichoderma xanh, có hình cầu méo hoặc bầu dục

atroviride đường kính từ 4 – 12µm, khi nấm già

thường mất màu hay màu vàng nhạt

hoặc xám, bào tử già phát ra mùi

hương dừa (Kubicek và Harman,

1998).

Đại thể: Môi trường có nhiệt độ từ

15 – 35˚C, pH: 3,7 – 4,7 rất thích

hợp cho sự phát triển của nấm

Kubicek và Harman (1998). Khuẩn

lạc phát triển nhanh, đường kính

khoảng 9cm sau 5 ngày nuôi cấy ở

nhiệt độ 20˚C. Bào tử đính có hình Trichoderma cầu méo đến bầu dục ngắn, màu hazianum xanh lục, vách trơn láng, kích thước

(2,7 – 3,2) x (2,5 – 2,8)µm

Sinh hóa: Là loài nấm rất phổ biến

trong đất (Cook và Baker, 1983), nảy

mầm tốt nhất trong môi trường mùn

cưa có độ ẩm khoảng 30% (Domsch

và Gams,1980).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đại thể: Khuẩn lạc có đường kính

3 – 5cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt

độ 20˚C, bào tử có hình trụ ngắn,

vách trơn láng, kích thước (3,0 –

4,8) x (1,9 – 2,8)µm. Trichoderma Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp đất koningii mặt, nhưng ở độ sâu 120cm vẫn có

sự hiện diện của loài nấm này. Nấm

phát triển tốt ở nhiệt độ từ 26˚C trở

lên tùy theo nguồn gốc của loài, pH:

3,7 – 6,0 (Cook và Baker, 1983).

Đại thể: Đường kính khuẩn lạc đạt 7

cm khi nuôi cấy 5 ngày ở 20˚C Bào

tử màu xanh lục, trơn, dạng elip, có

kích thước khác nhau tùy theo chủng

(Domsch và Gams,1980). Trichoderma

Sinh hóa: Nhiệt độ 24˚C và pH: 3,7 hamatum

– 4,7 là những điều kiện rất thuận lợi

cho sự phát triển của Trichoderma

hamatum và chúng phát triển chậm

lại ở 00C (Domsch và Gams,1980).

Đại thể: Bào tử màu xanh lục, vách

xù xì, dạng hình cầu, kích thước

(4 – 5) x (2,5 – 3)µm (Cook và

Trichoderma Baker, 1983).

viride Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hai

nguồn nitrogen đơn giản và phức

tạp. Khi Trichoderma tăng trưởng

trên nguồn carbonhydrate như là

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

nguồn carbon cho dinh dưỡng thì

ammonium được sử dụng tốt hơn là

nitrate (Danielson và Davey, 1973).

1.5.3. Đặc điểm hình thái

Sinh thái học của Trichoderma cho chúng ta biết sự phân bố của chúng trong đất.

Nấm Trichoderma có khu vực phân bố rất rộng, chúng hiện diện khắp nơi trong đất, trên

vỏ cây mục nát. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây,

một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Khi quan sát hạch nấm hay chồi mầm

của nhiều loại nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma (Klein và

Eveleigh,1998). Sự phân bố và điều kiện môi trường sống của các loài Trichoderma có

liên hệ mật thiết với nhau. Nhìn chung các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất trung

tính hoặc kiềm.

Cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân

nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn. Bào tử thường có màu xanh, đơn bào hình

trứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy từng loài. Bào tử đính ở đỉnh của cành. Bào tử của

hầu hết các loài có hình elip, 3 – 5 x 2 – 4 µm (L/W=1,3), bào tử hình cầu (L/W < 1,3)

rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài. Đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5

µm.

Khuẩn lạc Trichoderma tăng trưởng rất mạnh đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 9

cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 25˚C (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998). Chúng phát

triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác), chúng cũng tồn tại

khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%). Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khả năng

này mất dần đi. Điều này có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học của

Trichoderma. Bào tử sinh sôi nảy nở và thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ

duy trì cân bằng trong đất từ 9 – 36 tuần sau khi cấy nấm vào đất).

Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà Trichoderma

harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng.

Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của

Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên

Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học (Nguyễn Hoàng

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Anh, 2013).

1.5.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa.

Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp

nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là

là nguồn đạm mà nấm monosaccharide, disaccharide, polysaccharide….NH3

Trichoderma dễ sử dụng, nên trong môi trường nuôi cấy Trichoderma người ta thường

bổ sung NH3, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường có nhiều

dinh dưỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng

của Trichoderma (Gary, 2005).

Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 30˚C, có một vài loài Trichoderma tăng

trưởng được ở 35˚C. Một số ít phát triển tốt ở 40˚C. Trichoderma phát triển tốt ở đất có

độ pH từ 3,5 – 7,0 nhưng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5 và phát triển tốt

ở pH trung tính (Vũ Triệu Mân, 2007).

Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2,5 đến 9,5.

Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ tối ưu của Trichoderma trong khoảng 25 – 30˚C.

Một vài dòng phát triển tốt ở 35˚C, một số ít phát triển được ở 40˚C. (Gary J.Samuels,

2004). Theo Prasun K.M. và Kanthadai R. (1997) hình thái khuẩn lạc và bào tử của

Trichoderma khác nhau ở những nhiệt độ khác nhau.

Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau.

Ví dụ: Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong môi

trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum thích hợp ở

nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí hậu ấm áp.

Ánh sáng có tác động sâu sắc trên nhiều loại nấm bằng cách ảnh hưởng đến quá

trình sống đa dạng của chúng, chẳng hạn như: tác động đến tốc độ tăng trưởng, quá trình

chuyển hóa, sắc tố, và sự chuyển hóa. Tác động của ánh sáng trên nấm đã là chủ đề được

nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và bàn luận (Kubicek và Harman, 1998). Quá trình hình

thành bào tử được cảm ứng theo hai con đường khác nhau: thiếu dinh dưỡng hoặc ánh

sáng. Khi khuẩn lạc của Trichoderma viride phát triển trong cảm ứng tối do thiếu dinh

dưỡng, hình thành bào tử màu xanh đậm và bắt đầu khuếch tán từ trung tâm của khuẩn

lạc, tại đó chất dinh dưỡng đã bị sử dụng hết. Mặt khác, việc hình thành bào tử được

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

cảm ứng bởi các xung ánh sáng tạo điều kiện cho các khuẩn lạc phát triển trong tối,

trước khi để chiếu (Gary,2004).

1.5.5. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của Trichoderma spp.

Theo Lynch và Harper (1985) thì Trichoderma có khả năng phân hủy xác bã thực

vật còn sót lại sau mùa vụ và chuyển chúng thành đường, đồng thời chúng còn có khả

năng ký sinh và diệt một số nấm bênh gây hại cho cây trồng.

Những chất do nấm Trichoderma tiết ra bao gồm: endochitinase, chitobiosidase,

N-acetyl-β-D-glucusaminidase (NADase), trypsin chymotrypsin, glucan 1,3-β-

glucosida, cellulase, proterase, lypase (Marco, 2002; Kredics và ctv, 2003).

Enzyme cellulase thuộc lớp Hydrolase (phản ứng thủy phân), tố Gycosidases

(thủy phân liên kết glucoside), nhóm hydrolyzing O-glycosyl compounds (Phạm Thị

Trân Châu và cộng sự, 2006).

Cellulase là enzyme thủy phân cellulose, là hệ thống enzyme phức hợp bao gồm

cellulase C1, cellulase Cx và glucosidase. Trong đó, cellulase C1 và Cx thủy phân

cellulose thành cellobiose, còn glucosidase tiếp tục thủy phân cellsobiose thành glucose

(Trần Minh Tâm, 2000).

Trichoderma là nấm hoại sinh trong đất có khả năng tiết enzyme cellulase nên

trong hệ sinh thái vi sinh vật có vai trò quan trọng trong xử lý xác bã thực vật. Khả năng

phân hủy cellulose của nấm Trichoderma bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như:

ẩm độ, độ thoáng khí, pH, hàm lượng nitrogen. Bên cạnh đó hiệu quả của sự phân hủy

này còn phụ thuộc vào cơ chất sử dụng và sự sinh trưởng của nấm.

1.5.6. Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma spp phòng trừ nấm gây bệnh.

Nấm Trichoderma còn được sử dụng như một tác nhân sinh học bảo vệ cây trồng

chống lại các loại nấm gây hại như: Pythium spp., Phytophthora spp., sclerotinia spp.,

Botrytis spp. và Fusarium spp...gây bệnh khô vằng ở lúa, bệnh thối gốc chảy mủ ở cam

quýt, sầu siêng,bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lú, hồ tiêu, bắp đậu, cà rốt, cà

chua (Bùi Xuân Đồng,1982).

Theo Harman (1996), nấm Trichoderma spp. có các cơ chế đối kháng như: cơ

chế ký sinh, tiết kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng và cạnh tranh không gian sống.

1.5.6.1. Ký sinh

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ tính hướng hóa chất, nó ký sinh

phân nhánh hướng về những nấm đã được định trước (do những nấm này tiết ra các hóa

chất). Ngoài ra, vật ký sinh và vật đối kháng được Trichiderma nhận dạng bằng phân

tử, sự nhận dạng này có thể tự nhiên hay hóa học (qua trung gian lectin trên bề mặt tế

bào của mầm bệnh và vật đối kháng). Đồng thời, Trichoderma ký sinh và cuộn quanh

sợ nấm vật chủ thông qua hình thành các dạng móc hay dạng giác bám, tiết enzyme

chitinase, β-glucanase, protease, những enzyme này có khả năng bào mòn thành tế bào

hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ, đây là khả năng tấn công

trực tiếp của Trichoderma.

1.5.6.2. Tiết kháng sinh

Sản xuất kháng sinh giúp ngăn cả sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong

sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào, ngăn

chặn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. (Nguyễn

Hoàng Anh, 2013).

Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do Trichoderma sinh ra có

liên quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine, anthraquinones, butenolides,

isonitrin D và F, trichorzianines, furanone do T. harzianum sinh ra; các kháng sinh

gliovirin, viridian, viridiol và valinotricin do T. virens sinh ra.

1.5.6.3. Cạnh tranh

Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng

bằng cách hút hết chất dinh dưỡng một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử

chóng chịu (chlamydospores).

Ngoài ra, Trichoderma còn cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Brotrysis spp.

và Slerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng

chúng làm nền tảng, từ đó xâm nhập vào những mô khỏe). Nấm Trichoderma sử dụng

những mô già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đó nấm

Trichoderma cạnh tranh triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và nấm

Sclerotina spp.

Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium

spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

tử Pythium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự

nảy mầm của nấm Pythium spp. bằng cách sử dụng dịch tiết của cây vì thế mà các bào

tử Pythium spp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh

bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó

ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh (Trần Thị Thanh Thuần, 2009).

Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn carbon, nitơ và yếu tố cần thiết cho sự tăng

trưởng khác với nấm bệnh. T. harzianum có thể kiểm soát nấm Botrysis cinerea (gây

bệnh trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tại

những vùng bị nhiễm, đã chứng minh rằng sự cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế

chính được T. harzianum sử dụng để kiểm soát nấm bệnh F. oxysporum .

1.5.7. Một số nghiên cứu của nấm Trichoderma spp trên thế giới và ở Việt Nam.

1.5.7.1. Nghiên cứu trên thế giới

Eman R. Hamed, 2015 đã phân lập và sử dụng Trichoderma Asperellum nhưng

một tác nhân sinh học kích thích sinh trưởng và có khả năng đối kháng với nấm bệnh

trên đậu đũa.

Theo Buimistru (1997) dùng chế phẩm Trichoderma spp. có tác dụng phòng trừ

bệnh hại cây trồng, làm giảm tỷ lệ cây bị bệnh rõ rệt, chế phẩm nấm đối kháng nấm

Trichoderma có thể giúp cây khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, tác

dụng kích thích sinh trưởng đối với cây.

Năm 2010, Vinit Kumar Mishra đã chọn được 10 chủng Trichoderma để đối kháng

với Pythium aphanidermatum bằng phương pháp đồng nuôi cấy.

1.5.7.2. Nghiên cứu ở Việt Nam

Tricoderema đã được biết đến gần đây, có ảnh hưởng lớn đến nền nông nghiệp

Việt Nam. Các chế phẩm Trichoderma đã được sử dụng trong quá trình canh tác cây

trồng, góp phần làm giảm đáng kể nấm gây bệnh. Có tác dụng lâu dài không ảnh hưởng

đến sức khỏe do việc sử dụng thuốc hóa học. Một số nghiên cứu về nấm Trichoderma:

Năm 2006, Huỳnh Văn Phục với đề tài nghiên cứu “ Khảo sát tính đối kháng của

nấm Trichoderma spp. đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên

cây lúa và bắp”. Kết quả thu được là phân lập được 17 dòng nấm Trichoderma spp. có

khả năng đối kháng tốt với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum .

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trần Thị Thanh Thuần và cộng sự (2009) đã nghiên cứu enzyme cellulase và

pectinase chủng Trichoderma Viride và Aspergillus Niger nhằm xử lý nhanh vỏ cà phê

cho thấy điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase của T.vỉide là 4 ngày, độ

ẩm 58%, hàm lượng giống là 8%. Điều kiện tối ưu cho sự phân giải trên vỏ cà phê là 14

ngày, độ ẩm 60% hàm lượng giống 8%.

Hồng Châu, (2009) cho rằng nấm Trichoderma giúp thúc đẩy tiến trình phân giải

chất hữu cơ nhanh hơn được dùng để ủ phân chuồng, phân xanh sẽ rút ngắn thời gian

hoại mục.

Năm 2017 Nguyễn Đức Huy và cộng sự đã phân lập và đánh giá khả năng đối

kháng của Trichoderma asperellum đối với tác nhân gây bệnh cây có nguồn gốc trong

đất. Kết quả thu được nấm T.asperllum có khả năng ức chế tốt sự phát triển của nấm R.

solani gây bệnh lở cổ rễ và nấm S. clerotiorum gây bệnh thối hạch bắp cải trong điều

kiện invitro.

Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2017) đã tiến hành đề tài đánh giá khả năng đối

kháng của một số dòng Trichoderma đối với Phytopythium helicoides trong điều kiện

phòng thí nghiệm.

Các chế phẩm sinh học của Viện Sinh học nhiêt đới như BIO-F, chế phẩm sinh

học chứa các VSV do nhóm phân lập và tuyển chọn: xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm

mốc Trichoderma sp. và vi khuẩn Bacillus sp.. Những VSV trên trong chế phẩm sinh

học có tác dụng phân hủy nhanh các hợp chất hữu cơ trong phân lợn, gà và bò (protein

và xenlulo), gây mất mùi hôi. Trước đó, chế phẩm sinh học BIO-F đã được sử dụng để

sản xuất thành công phân bón hữu cơ vi sinh từ bùn đáy ao, vỏ cà phê và xử lý rác thải

sinh hoạt.

1.5.8. Ứng dụng Trichoderma trong nông nghiệp

Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ, Viện Lúa Đồng bằng Sông

Cửu Long, Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu

quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng Sông Cửu

Long và Đông Nam Bộ.

1.5.8.1. Khả năng kiểm soát bệnh cây

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nhiều chủng nấm Trichoderma có khả năng kiểm soát các loài nấm gây bệnh cho

cây trồng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma có khả năng đối kháng

với các loại nấm gây bệnh thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium

(Dương Xô Hoa, 2005).

Các loài nấm Trichoderma nói chung phát triển trong môi trường tự nhiên trên bề

mặt của rễ cây, do đó có tác dụng kiểm soát sinh học với một số bệnh trên rễ gây ra bởi

tuyến trùng và nấm, nó còn giúp tái tạo, phục hồi các rễ bị tổn thương do tuyến trùng

hoặc rệp sáp gây ra. Nấm Trichoderma còn tạo ra các chất có hoạt tính tương tự như

“thuốc kháng sinh”, có tác dụng kìm hãm sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh đồng

thời Trichoderma còn ký sinh các loài nấm gây bệnh, tiết ra các enzyme phân hủy chúng.

Ngoài ra nấm Trichoderma phòng trừ được các bệnh trên lá do loài nấm này kích

thích bộ rễ tổng hợp chất đề kháng để chống lại các tác nhân vi sinh vật xâm nhập, các

chất đề kháng này từ rễ di chuyển đến các bộ phận phía trên của cây (Dương Xô Hoa,

2005).

Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số chủng nấm Trichoderma có

khả năng hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những chủng nấm này cũng có

khả năng kiểm soát những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm.

1.5.8.2. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng

Nấm Trichoderma kích thích sự tăng trưởng và phát triển của bộ rễ. Trichoderma

bám vào những vùng rễ cây như những sinh vật cộng sinh khác. Nó tiết ra đất những

chất kích thích để rễ cây ăn sâu xuống lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn và tăng khả

năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ, tạo thành một lớp thành bảo vệ vùng rễ

tránh sự xâm nhập của nấm bệnh, làm giảm khả năng nhiễm bệnh nhờ Trichoderma bám

vào các đầu rễ cây, tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiều cao

của cây, tăng năng suất cây trồng.

Hiện nay, một chủng nấm Trichoderma đã được phát hiện có khả năng tăng số

lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các loài cây như

bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán.

1.5.8.3. Khả năng phân hủy cellulose , phân giải lân chậm tan

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Lợi dụng khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân của nấm Trichoderma mà

trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân

hủy hữu cơ được nhanh chóng. Sử dụng chế phẩm Trichoderma ủ phân hữu cơ để bón

cho cây trồng sẽ giúp tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất. Phân giải nhanh các

chất hữu cơ thành dạng dễ tan, cung cấp dinh dưỡng cho cây, phòng một số nấm bệnh

gây hại cho cây trồng, chất lượng phân cao hơn.

Chế phẩm nấm Trichoderma được sử dụng để xử lý giúp phân hủy rơm rạ, sau đó

được dùng phối hợp với phân lân sinh học như dạng phân hữu cơ. Phân hữu cơ được

bón riêng rẽ hoặc phối hợp với phân vô cơ (NPK) trên nền sét nặng. Kết quả nghiên cứu

hai năm trên giống lúa IR64 cho thấy: nếu bón liên tục 100% phân hữu cơ cho năng suất

tăng hơn so với đối chứng là 13,58% và nếu bón kết hợp 50% phân hữu cơ với 50%

phân vô cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 22,46%. Khi bón 100% phân hữu

cơ thì côn trùng và bệnh khô vằn xuất hiện trễ hơn và ít gây hại cho cây lúa và quần thể

vi sinh vật đất ổn định hơn, có chiều hướng gia tăng hơn so với bón 100% phân vô cơ .

Với những hiệu quả mà chế phẩm Trichoderma mang lại, bà con nông dân nên sử dụng

chế phẩm sinh học thay cho việc dùng các loại phân bón hóa học để cải thiện năng suất

và chất lượng cây trồng, góp phần bền vững môi trường đất canh tác nông nghiệp.

1.6. Khái niệm về ủ compost và sử dụng xác bã hữu cơ để ủ compost

1.6.1. Định nghĩa compost

Ủ phân (composting): Là quá trình phân hủy chất hữu cơ tự nhiên chủ yếu là

cenlulose bởi quần thể vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh,…)

dưới tác động của nhiệt độ, độ ẩm, không khí tạo nên sản phẩm cuối cùng là chất mùn

và chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể hấp thụ được (Haug,1993).

1.6.2. Cấu trúc và cơ chế phân giải cellulose

Cellulose là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa) từ gốc β–D–

glucose bằng cầu nối β–1,4–glycosid nhờ vào khả năng tự dưỡng dưới ánh sáng của thực

vật. Vì vậy, cellulose là hợp chất phổ biến nhất trong tự nhiên. Cellulose có cấu trúc

mạch thẳng dạng sợ rất bền, khó bị phân hủy.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử cellulose (nguồn internet)

Theo cơ chế thủy phân của King (1969) và Reese (1952) ngoài 3 enzyme chính

của quá trình thủy phân :

Exo–β–1,4D glucanaza (hay 1,4–β–D glucan4–glucanohydrolaza). Enzyme này

thủy phân Cellulose vô định hình hoặc Cellulose đã biến tính như

Cacboxymethylcelluloza (CMC).

Exo–β–1–4 glucanaza (hay exocellobbiohydrolaza) tấn công lên các liên kết

Cellilose kết tinh vô định hình như các xenlo-saccarit từ các đầu không thử của chuỗi

Cellulose. Exo–glucanaza tác động rất yếu lên các Cellulose biến tính như CMC.HEC

(hydroxyl etyl celluloza).

β–1–4glucanaza (hay xenlobioaza) thủy phân các xenlobiaza và xenlo-sacarit

mạch ngắn. Glucoza là sản phẩm thủy phân duy nhất của enzyme này.

Còn có C1 là tiền nhân tố thủy phân có tác dụng làm trương nở Cellulose tự nhiên

làm cho phân tử trở nên hoạt động. Chuỗi cellulose hoạt động sẽ bị phân cắt bởi endo

và exo-glucanaza thành các xenlo-oligosacarit tạo cơ chất cho xenlobiaza thủy phân tiếp

thành đường glucoza.

Cenlulose bị VSV phân hủy thành các thành phần có phân tử lượng nhở hơn. Chính

những thành phần nhỏ này kết hợp với những thành phần khác trong đất tạo thành mùn.

Cơ chế phân giải: Cenlulose → disaccarit → monosaccarit (glucose)

Khi mùn được hình thành, vi sinh vật lại tiếp tục phân hủy mùn bằng quá trình

amon hóa, sự chuyển hóa này giúp đất tích lũy NH3. Sự tạo thành NH3 trong đất xảy ra

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

chậm chạp và điều này rất có lợi cho cây trồng vì quá trình cây hấp thụ NH3 cũng chậm,

không làm dư đạm dễ phát sinh dịch bệnh.

Chất mùn + O2 + Vi sinh vật ==>CO2 + H2O + NH3

Trong tự nhiên, nhiều loài vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc phân giải cellulose rất

mạnh nhờ tiết ra cenlulase ngoại bào. Nấm Trichoderma có thể phân giải 48% cellulose

trong 10 ngày lên men nguyên liệu lingo-cellulose. Nấm Phnerochaete chrysosporium

phân giải 69% cellulose tự nhiên trong 28 ngày.

Trong điều kiện thoáng khí, cellulose được phân giải bởi các vi sinh vật hiếu khí.

Ngoài ra, còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia tích cực vào quá trình

phân giải cellulose. Các sinh vật như: Cytophaga, Cellulomonas, Bacillus, Clostridium,

Aspergillus, Penicillium,…

• Các nhóm vi sinh vật có mặt trong quá trình ủ phân

Vi khuẩn: trong đất người ta phân lập được các dòng vi khuẩn Gram (+) hiếu khí

như Brevibacllus, PaeniBacillus, Bacillus và Geobacillus. Đối với các dòng ưa ấm, pH

và nhiệt độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase của chúng hoạt động là 5,5 và

550C còn đối với các dòng ưa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt độ 750C (Rastogi, G., et al. 2009)

Xạ khuẩn: có vai trò trong việc phân hủy các chất hữu cơ phức tạp như cellulose,

lignin, chitin và protein trong quá trình ủ. Enzyme của chúng cho phép xạ khuẩn phân

hủy hóa học các mảnh vụn như thân cây, vỏ cây. Một vài loài xuất hiện trong giai đoạn

chịu nhiệt trung bình, những loài khác đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn làm mát

và ổn định.

Nấm: có vai trò quan trọng trong việc phân hủy các mảnh vụn, tạo cho các vi khuẩn

tiếp tục quá trình phân hủy hết các cellulose còn lại. Các loài nấm có số lượng lớn trong

cả 2 giai đoạn: nhiệt độ trung bình và nhiệt độ cao. Hầu hết nấm sống ở lớp bên ngoài

của đống ủ khi nhiệt độ cao.

Động vật nguyên sinh: tìm thấy ở trong nước rỉ rác của đống ủ, chúng ăn các hợp

chất hữu cơ, vi khuẩn và nấm.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.6.3. Các thông số quan trọng trong quá trình ủ compost.

Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí

Thông số Giá trị

Quá trình ủ đạt hiệu quả tối ưu khi kích thước cơ chất khoảng 25 – 1. Kích thước 75mm

Tỉ lệ C/N tối ưu dao động trong khoảng 25 – 40

2. Tỉ lệ C/N Ở tỉ lệ thấp hơn, dư NH3, hoạt tính sinh học giảm

Ở tỉ lệ cao hơn, chất dinh dưỡng bị hạn chế.

Thời gian ủ ngắn hơn 3. Pha trộn

Nên kiểm soát trong phạm vi 50 – 60% trong suốt quá trình ủ. Tối 4. Độ ẩm ưu là 55%

Nhằm ngăn ngừa hiện tượng khô, đóng bánh và sự tạo thành các

5. Đảo trộn rảnh khí, trong quá trình làm phân hữu cơ, cơ chất phải được xáo

trộn định kỳ. Tần suất đảo trộn phụ thuộc vào quá trình thực hiện

Nhiệt độ phải được duy trì trong khoảng 50 – 550C đối với một vài

6. Nhiệt độ ngày đầu và 55 – 600C trong những ngày sau đó. Trên 660C, hoạt

tính vi sinh vật giảm đáng kể.

7. Kiểm soát Nhiệt độ 60 – 700C, các mầm bệnh đều bị tiêu diệt mầm bệnh

Lượng oxy cần thiết được tính toán dựa trên cân bằng tỷ lượng. 8. Nhu cầu về Không khí chứa oxy cần thiết phải được tiếp xúc đều với tất cả các không khí phần của cơ chất

Tối ưu: 7 – 7,5. Để hạn chế sự bay hơi Nitơ dưới dạng NH3, pH 9. pH không được vượt quá 8,5

10. Mức độ Đánh giá qua sự giảm nhiệt độ vào thời gian cuối phân hủy

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

Thời gian: Tháng 3/2018 đến tháng 8/2018.

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Viện khoa học ứng dụng của trường Đại học Công

nghệ TP.Hồ Chí Minh

2.2. Vật liệu

2.2.1. Nguồn nấm đối kháng, nấm gây bệnh

2.2.1.1 Nấm đối kháng

Các chủng nấm Trichiderma của phòng thí nghiệm Viện khoa học Ứng dụng

HUTECH cung cấp.

2.2.1.2. Nấm gây bệnh

Nấm Neoscytilidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu và nấm Colletotrichum sp gây

bệnh thán thư trên cây thanh long do phòng thí nghiệm Viện khoa học Ứng dụng

HUTECH cung cấp.

2.2.2. Dụng cụ và thiết bị

2.2.2.1. Dụng cụ

Ống nghiệm Cốc thủy tinh

Đĩa petri Ống đong

Que cấy Đèn cồn

Đũa thủy tinh Khay nhựa

Khoan thạch hình trụ Bình xịt nước

Thùng xốp

2.2.2.2. Thiết bị

Tủ cấy Kính hiển vi

Máy hấp Autoclave Cân phân tích

Tủ lạnh Bếp từ

Lò nung Hệ thống chưng cất mẫu kjeldahl

Tủ hút khí độc

2.2.3. Hóa chất

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NaOH D-Glucose

CMC ZnSO4

KCl Bột chitin

FeSO4 NaNO3

Agar K2HPO4

Nước cất MgSO4

Cồn 700, 960 MgSO4.7H2O

NH4NO3

2.2.4. Các loại môi trường

2.2.4.1 Môi trường nuôi cấy nấm mốc PDA.

Thành phần:

Khoai tây 200g

D-glucose 20g

Agar 20g

Nước cất 1000ml

Cách pha môi trường:

Khoai tây gọt vỏ rửa sạch cắt thành hạt lựu, cân 200g rồi cho nước cất vào đun sôi

khoảng 20 phút từ lúc bắt đầu sôi. Sau đó lọc bỏ bã, lấy dịch chiết, tiếp tục đun sôi bổ

sung thêm đường và agar, khuấy đều để tránh agar vón cục. Đem môi trường hấp khử

trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút.

2.2.4.2. Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase

Thành phần môi trường:

0,4g NaNO3

0,2g K2HPO4

0,1g MgSO4

KCl 0,1g

CMC 1%

Agar 2%

Nước cất 1000ml

Cách pha môi trường:

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đun tan CMC trong nước cất rồi cho các thành phần môi trường còn lại vào chai

thủy tinh và khấy đều sau đó đậy nắp rồi đem hấp khử trùng ở 1210C, 15 phút, 1atm.

Sau khi hấp khử trùng xong lấy ra chờ nguội trong tủ cấy vô trùng.Trên ngọn lửa

đèn cồn, lần lượt đổ môi trường vào đĩa đã hấp vô trùng, chờ cho môi trường nguội và

đặc lại.

2.2.4.3. Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase

Thành phần môi trường:

3,5g NaNO3

1,5g K2HPO4

0,5g MgSO4.7H2O

KCl 0,5g

0,01g FeSO4.7H2O

Cloramphenicol 0,005 g

Dịch chitin huyền phù 1%: bổ sung đến 1 lít

pH: 7

Cách pha huyền phù chitin 1%

Cân 1g bột chitin cho dần vào 20ml HCl đậm đặc, ủ ở 40C và để qua đêm

Thêm vào hỗn hợp 200ml ethanol lạnh(-200C) khấy đều thật nhanh và ủ qua đêm.

Ly tâm hỗn hợp ở 4000 vòng/phút, trong 10 phút thu lấy kết tủa và rửa bằng nước cất

cho đến khi pH trung tính. Thêm vào tủa nước cất cho đến thể tích 100ml.

2.2.4.4. Môi trường Czapeck dox để nhân giống cấp 2 Trichoderma

Thành phần môi trường:

Sacchorose 30g

3g NaNO3

1g K2HPO4

MgSO4.7H2O 0,5g

KCl 0,5g

FeSO4.7H2O 0,01g

Nước cất 1000ml

pH 6

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Cách pha môi trường:

Cân và cho lần lượt từng chất vào erlen khuấy đều để tránh các chất phản ứng vào

nhau tạo tủa, thêm nước cất, điều chỉnh pH 6. Đem hấp khử trùng ở 1210C trong 15

phút, áp suất 1atm.

2.3. Phương pháp nhiên cứu.

Các chủng nấm Trichoderma đã được hoạt hóa từ ống giống Các chủng nấm bệnh đã được hoạt hóa từ ống giống

Khảo sát khả năng sinh trưởng

Test sinh hóa

Thử nghiệm đối kháng ở điều kiện phòng thí nghiệm

Sàng lọc

Lên men tạo chế phẩm

Xử lí cành và phế phẩm thanh long

Sơ đồ tổng quát nội dung thí nghiệm

Thuyết minh sơ đồ

Các chủng nấm Trichoderma được giữ giống trong ống thạch nghiêng. Các chủng

này sẽ lần lượt cấy lên đĩa petri môi trường PDA để hoạt hóa sự phát triển sau thời gian

giữ giống. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 1 tuần để nấm phát triển và hình thành bào tử.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Sử dụng các chủng nấm này để tiến hành quan sát sự sinh trưởng, hình thái vi thể, kiểm

tra khả năng sinh enzyme và khả năng đối kháng với nấm bệnh ở điều kiện invitro.

Sàng lọc lựa chọn các chủng nấm đạt yêu cầu theo mục tiêu đã đề và tiến hành

lên men tạo chế phẩm.

Sử dụng môi trường nhân giống cấp 2 Czapeck dox được trình bày ở mục 2.2.4.4

để nhân sinh khối nấm. Sau khi cẩn đúng khối lượng từng chất, hòa tan từng chất với

nước cất theo đúng thứ tự tránh kết tủa khi pha, kết thúc pha dịch trong không màu. Đổ

200ml môi trường vào các erlen đã chuẩn bị sẵn, đem hấp khử trùng nhiệt độ 1210C

trong 15 phút, áp suất 1atm.

Sau hấp xong để môi trường nguội từ từ đến nhiệt độ phòng rồi tiến hành cấy

giống Trichoderma đã nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA, với mỗi erlen chứa 200ml

môi trường cấy 1/4 đĩa nấm đã cấy và ủ 7 ngày trước đó.

Lắc đều trên máy lắc với tốc độ 60 vòng/phút, trong 48 giờ, ở nhiệt độ phòng.

Giống sau khi được nhân giống cấp 2 trên môi trường lỏng Czapeck dox sẽ được

cấy vào 200g môi trường rắn với cơ chất lúa bổ sung D-glucose 3% và (NH4)2SO4 1%

ủ ở nhiệt độ phòng.

Quá trình lấy mẫu được thực hiện khi tơ nấm đã ăn lan và bảo tử bắt đầu phủ kín

cơ chất trên môi trường nhân sinh khối, tiến hành lấy 10g mẫu sau đó đem đi pha loãng

với nồng độ thích hợp và đếm số bào tử bằng phương pháp đếm gián tiếp từ đó xác định

được (số bào tử)/g chế phẩm theo công thức sau:

Trong đó:

A: số khuẩn lạc trong 1g mẫu

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

n là số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ i

V là thể tích mẫu (ml) cấy vào mô trường

F là hệ số pha loãng tương ứng

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Chế phẩm Trichoderma sau quá trình lên men thể rắn được sử dụng cho thử nghiệm

ủ compost từ cành thanh long.

2.3.1.Quan sát khả năng sinh trưởng của Trichoderma.

Dùng que cấy thẳng đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, gạt nhẹ lấy một ít bào tử

nấm Trichoderma trong ống giống cấy chuyền vào tâm đĩa petri chứa môi trường PDA,

ủ ở nhiệt độ phòng. Dùng khoan thạch hình trụ đường kính 5mm đục một miếng thạch

(từ đĩa nấm thí nghiệm đã ủ 7 ngày) đặt lên tâm đĩa petri môi trường PDA rồi đem ủ ở

nhiệt độ phòng. Quan sát hình thái tản nấm (hình dạng, màu sắc) ở mặt trên và mặt dưới

theo từng ngày cho tới khi tản nấm mọc đầy đĩa.

2.3.2.Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma

spp.

2.3.2.1.Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên

thạch.

Nguyên tắc

Cellulase tác động lên cơ chất CMC trong môi trường thạch. CMC bị phân hủy

thành các đường khử là độ đục của môi trường bị giảm và trở nên trong suốt khi nhuộm

bằng Lugol. Đường kính của vòng phân giải phản ánh hoạt tính của enzyme.

Tiến hành

Các chủng nấm thí nghiệm đã được cấy chuyền trên môi trường PDA, ủ 7 ngày ở

nhiệt độ phòng.

Dùng khoan thạch hình trụ đường kính 5mm đục một miếng thạch (từ đĩa nấm thí

nghiệm đã ủ 7 ngày) đặt lên tâm đĩa môi trường CMC và ủ trong thời gian 2 ngày ở 28-

320C.

Sau 2 ngày, nhuộm màu môi trường bằng cách đổ dung dịch lugol vào đĩa thí

nghiệm, để yên 5 phút rồi đổ lugol thừa ra, cho nước cất vào tráng đĩa, đổ nước cất ra

và tiến hành đo đường kính vòng phân giải.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa.

Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng phân giải (dựa theo Trần Thị Thuần, 1996).

D – d ≥ 2,5 cm: hoạt tính enzyme rất mạnh.

D – d ≥ 2 cm: hoạt tính enzyme mạnh.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

D – d ≥ 1,5 cm: hoạt tính enzyme trung bình.

D – d ≥ 1 cm: hoạt tính enzyme yếu.

Trong đó:

D: đường kính vòng phân giải (cm).

d: đường kính khoanh thạch chứa nấm thí nghiệm (cm).

2.3.2.2. Khảo sát khả năng tổng hợp chitinase của Trichoderma trên môi trường thạch.

Nguyên tắc

Enzyme chitinase có khả năng phân giải chitin thành N-acetyl glucosamine và cấu

trúc mạch ngắn hơn không bất màu với thuốc thử lugol. Khi tác dụng với thuốc thử

lugol, đường kính phần môi trường trong suốt do chitinase phân hủy chitin phản ánh khả

năng sinh enzyme của Trichoderma. Phương pháp này chỉ dùng để định tính, đánh giá

sơ bộ khả năng sinh tổng hợp enzyme chứ không xác định chính xác hoạt độ của enzyme.

Tiến hành

Chuẩn bị các chủng nấm thí nghiệm đã được nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA,

ở nhiệt độ phòng. Dùng khoan thạch hình trụ đã khử trùng có đường kính 5mm đục 1

miếng thạch chứa chủng nấm thí nghiệm. Sau đó đặt miếng thạch vừa được đục sang

môi trường có chứa chitin, đặt ngay tại tâm đĩa và ủ ở 28-320C.

Sau 2 ngày tiến hành nhuộm lugol quan sát vòng phát triển, đổ lugol ngập bề mặt

đĩa, để 5 phút rồi đổ lugol thừa ra, cho nước cất vào tráng đĩa, đổ nước cất ra và tiến

hành quan sát.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần mỗi lần 1 đĩa petri.

Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng phân giải (dựa theoTrần Thị Thuần, 1996).

D – d ≥ 2,5 cm: hoạt tính enzyme rất mạnh.

D – d ≥ 2 cm: hoạt tính enzyme mạnh.

D – d ≥ 1,5 cm: hoạt tính enzyme trung bình.

D – d ≥ 1 cm: hoạt tính enzyme yếu.

Trong đó:

D: đường kính vòng phân giải chitin (cm).

d: đường kính khoanh thạch chứa nấm thí nghiệm (cm).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây

bệnh.

2.3.3.1. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây

bệnh đốm trắng trên cây thanh long.

Phương pháp đồng nuôi cấy: Hoạt động đối kháng invitro của chủng nấm

Trichoderma với nấm Neoscytalidium Dimidiatum đã được đồng nuôi cấy bằng cách

làm theo phương pháp mô tả bởi Upadhyay and Rai (1987).

Cách tiến hành:

Chuẩn bị nguồn nấm

Các chủng nấm Trichoderma đã được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở nhiệt

độ phòng trong 7 ngày làm nguồn đối kháng nấm bệnh.

Nấm Neoscytalidium dimidiatum từ ống giống được cấy chuyền sang đĩa môi

trường PDA và ủ trong 7 ngày để làm vật liệu thí nghiệm.

Thí nghiệm đối kháng trực tiếp.

Đĩa đối kháng: dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5mm đục 1 miếng thạch có

chứa nấm đối kháng Trichoderma từ đĩa nấm đã chuẩn bị và đặt vào đĩa chứa môi trường

PDA (đặt cách mép đĩa 1cm). Sau đó, làm tương tự đặt miếng thạch có chứa nấm

Neoscytalidium dimidiatum đối xứng với miếng thạch có chứa nấm đối kháng

Trichoderma qua tâm đĩa và cách mép đĩa 1 cm.

Đĩa đối chứng: cấy khoanh thạch nấm bệnh, đường kính 5mm lên môi trường PDA

đặt cách mép đĩa petri 1cm và không cấy nấm Trichoderma.

Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 1 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng.

Quan sát ghi nhận kết quả sau 3, 5, 7 ngày sau cấy.

Chỉ tiêu theo dõi:

Bán kính khuẩn lạc nấm bệnh (cm)

Khả năng ức chế của nấm Trichoderma với nấm Neoscytalidium dimidiatum

𝑅1−𝑅2

được tính theo công thức của Fokkema

PMIG =

× 100(%)

𝑅2

Trong đó:

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

R1: Bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh ở công thức đối chứng (không cấy nấm

đối kháng) (cm).

R2: Bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh ở công thức đối kháng (cm).

PIMG (Percent Inhibition of Mycelial Grow): Chỉ số đối kháng của Trichoderma.

PIMG ≤ 50: Đối kháng thấp.

51 ≤ PIMG ≤ 60: Đối kháng trung bình.

61 ≤ PIMG ≤ 75: Đối kháng cao.

PIMG > 75: Đối kháng rất cao.

2.3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm

Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long.

Phương pháp đồng nuôi cấy: Hoạt động đối kháng invitro của chủng nấm

Trichoderma với nấm Colletotrichum sp đã được đồng nuôi cấy bằng cách làm theo

phương pháp mô tả bởi Upadhyay and Rai (1987).

Cách tiến hành:

Chuẩn bị nguồn nấm

Các chủng nấm Trichoderma đã được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở nhiệt

độ phòng trong 7 ngày làm nguồn đối kháng nấm bệnh.

Nấm Colletotrichum sp sau khi phân lập được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ

trong 7 ngày để làm vật liệu thí nghiệm.

Thí nghiệm đối kháng trực tiếp

Đĩa đối kháng: dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5mm đục 1 miếng thạch có

chứa nấm Colletotrichum sp đặt vào đĩa chứa môi trường PDA (đặt cách mép đĩa 1cm)

đem ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 ngày, cấy nấm đối kháng Trichoderma và đặt vào đĩa

môi trường PDA đã cấy Colletotrichum sp 2 ngày trước đó, đối xứng với nhau qua tâm

đĩa và cách mép đĩa 1 cm.

Đĩa đối chứng: cấy khoanh thạch nấm bệnh Colletotrichum sp, đường kính 5mm

lên môi trường PDA đặt cách mép đĩa petri 1cm và không cấy nấm Trichoderma. Đĩa

đối chứng và đối kháng cấy nấm Colletotrichum sp cùng thời gian với nhau.

Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 1 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Quan sát ghi nhận kết quả sau 3, 5, 7 ngày sau cấy.

Chỉ tiêu theo dõi:

Bán kính khuẩn lạc nấm bệnh (cm)

Khả năng ức chế của nấm Trichoderma với nấm Colletotrichum sp được tính theo

𝑅1−𝑅2

công thức của Fokkema.

PMIG =

× 100(%)

𝑅2

Trong đó:

R1: Bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh ở công thức đối chứng (không cấy nấm

đối kháng) (cm).

R2: Bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh ở công thức đối kháng (cm).

PIMG (Percent Inhibition of Mycelial Grow): Chỉ số đối kháng của Trichoderma.

PIMG ≤ 50: Đối kháng thấp.

51 ≤ PIMG ≤ 60: Đối kháng trung bình.

61 ≤ PIMG ≤ 75: Đối kháng cao.

PIMG > 75: Đối kháng rất cao.

2.3.4. Thử nghiệm ủ compost cành thanh long của nấm Trichoderma spp.

Các phế phẩm thanh long được băm thành những đoạn 5 ˗ 10cm và được phơi nắng

để giảm độ ẩm. Sau đó, các phế phẩm này được cho vào thùng xốp để ủ có kích thước

30x50x25cm. Trong quá trình ủ có đảo trộn thường xuyên. Theo dõi và ghi nhận kết quả

sau 30 ngày ủ.

2.3.4.1. Xác định độ tro

a. Nguyên tắc:

Xác định lượng tro tổng hoặc tro không tan trong acid bằng cách nung mẫu ở nhiệt

độ 5500C đến khối lượng không đổi.

b. Tiến hành

Nung cốc sứ 1 giờ ở 5500C, để nguội trong bình hút ẩm 30 phút. Cân khối lượng

cốc với độ chính xác 0,1mg (m1).

Cân chính xác 5g mẫu (m) đã được nghiền và đồng nhất vào cốc.

Đặt cốc lên bếp điện và đốt cho đến khi hết khói.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đưa cốc vào tủ nung ở 5500C trong 4 giờ.

Sau khi nung nếu mẫu chưa hóa tro hoàn toàn thì làm nguội tro và thêm vài giọt

H2O2. Đặt cốc nung lên bếp và đun cho đến khi hết sủi bọt, tiếp tục đốt cho đến khô.

Đưa cốc đun trở lại lò nung, tiếp tục nung cho đến khi tro hóa hoàn toàn. Làm

nguội trong bình hút ẩm. Lặp lại quá trình này cho đến khi đạt khối lượng không đổi

(m2).

c.Tính toán kết quả

Hàm Lượng tro được tính bằng số gam tro còn lại sau khi đốt trên 100g mẫu.

Hàm lượng tro (%) = x 100

m: khối lượng mẫu đã sấy khô (g)

m1: khối lượng cốc (g)

m2: khối lượng cốc có chứa tro sau khi nung (g).

2.3.4.2. Xác định hàm lượng carbon

Hàm lượng carbon được xác định theo công thức sau:

2.3.4.3. Xác định độ ẩm

a. Nguyên tắc

Dùng sức nóng làm bay hết hơi nước trong mẫu. Độ ẩm được xác định bởi sự

chênh lệch về khối lượng mẫu tươi trước khi sấy và sau khi sấy ở 105±20C đến khi khối

lượng không đổi.

b. Tiến hành

Mở nắp cốc sấy và để chúng trong tủ sấy, sấy ở 105±20C trong 1 giờ, lấy ra để

nguội ở bình hút ẩm 30 phút, cân khối lượng cốc (m1).

Cân chính xác 5 gam mẫu (m) đã nghiền nhỏ vào cốc sấy.

Mở nắp cốc sấy có chứa mẫu và để chúng trong tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105±20C

trong thời gian 4 giờ kể từ lúc nhiệt độ đạt 1050C.

Đậy nắp (không kín) lại và để nguội trong bình hút ẩm 30p.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đậy nắp thật kín lấy ra khỏi bình hút ẩm và cân xác định khối lượng. Lặp lại quá

trình từ bước 3 đến bước 5 cho tới khi xác định được khối lượng không đổi (m2). (Chênh

lệch giữa hai lần cân liên tiếp không quá 0.1%).

c.Tính toán kết quả

Ẩm độ (%) = (

Trong đó:

m: là khối lượng mẫu tươi đem sấy (gam)

m1 : là khối lượng cốc khô (gam)

m2 : là khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (gam)

2.3.4.4. Xác định hàm lượng Nitơ

a. Vô cơ hóa mẫu

Cân 100g chất hữu cơ.

Lưu ý: giai đoạn này phải thực hiện trong tủ hút Hottle, đặt bình hơi nghiêng trên bếp,

khi đã sôi giữ nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất bắn ra ngoài, không bị thất

thoát ammoniac.

Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy

dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo phần chất hữu cơ bám trên

thành bình còn chưa bị oxy hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch

trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100ml,

dùng nước cất vô đạm tráng lại bình kjeldahl và định mức đến vạch.

b. Cất đạm:

Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml

nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu hồng tím. Tiếp tục cho

vào bình cất 15ml NAOH40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá

mạ (thêm 5ml NAOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá

mạ).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Tiến hành lắp hệ thống cất đam, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0,1N và 3 giọt

thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống

sinh hàn. Bật công tắc cất đạm.

Sau khi cất đạm 10 ˗ 12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy

quỳ thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi màu xanh là được, ngưng cất đạm,

đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.

c.Chuẩn độ:

Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0,1N cho đến khi mất màu tím

hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0,1N đã sử dụng.

Công thức tính hàm lượng % nitơ tổng số:

1,42 ∗ (V1 − V2) ∗ 100 𝑁% = 𝑎

Trong đó:

V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng.

V2: số ml NaOH 0,1N đã chuẩn độ.

a: số miligam nguyên liệu.

1,42: hệ số; cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42

mg Nitơ.

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2010 và SAS (Stattistical Anlysis

System) 9.1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đặc điểm sinh trưởng nấm Trichoderma spp

Bảng 3.1 Đường kính tản nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy.

Đường kính tản nấm

Các chủng Trichoderma spp. Hình ảnh đại thể của các (cm) sau 2 ngày nuôi Trichoderma chủng Trichoderma cấy

5,40bcde±0,40 T1

5,67ab±0,06 T3

5,57abcd±0,71 T7

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

5,03de±0,06 T9

5,47abcde±0,21 T11

5,33bcde±0,31 T12

5,37bcde±0,15 T13

5,33bcde±0,12 T15

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

5,43abcde ±0,25 T21

5,97a±0,12 T22

5,57abcd±0,06 T23

5,10bcde±0,26 T25

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

5,70ab±0,10 T26

5,43abcde±0,15 TC1

5,33bcde±0,25 TC2

4,97e±0,15 TC3

5,53abcd±0,21 TC5

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

5,53abcd±0,15 TC6

5,33bcde±0,12 TC7

4,30f±0,20 TC8

5,40bcde±0,36 TC9

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

5,03e±0,21 TC10

5,53abcd±0,12 TC11

5,27bcde±0,25 TC13

5,47abcde±0,32 TC15

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

5,23bcde±0,15 TCC1

5,60abc±0,10 TCC6

Ghi chú: NSC: ngày sau cấy. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng

một cột có có có cùng chữ cái theo sau giống nhau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê

với độ tin cậy 99%, không khác biệt thống kê ở α = 0,01.

CV (%) 4,56

Sự sinh trưởng của Trichoderma là một chỉ tiêu quan trọng để ứng dụng tạo chế

phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh và ủ compost. Kết quả bảng 3.1 cho thấy hầu hết

các chủng Trichoderma đều phát triển tốt trên môi trường PDA. Sau 2 ngày nuôi cấy,

tản nấm phát triển từ 4,30 – 5,97 (cm). Đặc biệt tốc độ tăng trưởng T22 và T26 là cao

nhất. So với kết quả của Nguyễn Thị Bích Tuyền (2016), sự sinh trưởng của nấm trong

luận văn này có chiều hướng yếu hơn, có lẽ do thời gian chuyển phòng thí nghiệm từ

Bình Thạnh sang quận 9, một số tủ lạnh bị hư, các mẫu không giữ lạnh được nên sự sinh

trưởng của các chủng bị suy yếu. Vì vậy, cần phải có biện pháp tăng sinh phục hồi lại

các chủng này.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.1 Chủng nấm Trichoderma T22, T26 và T3 sau 2 ngày nuôi cấy trên môi

trường PDA.

3.2. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm

Trichoderma spp.

3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng nấm Trichoderma

spp.

Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng nấm Trichoderma spp.

Các chủng Đường kính vòng phân giải cellulose của

Trichoderma các chủng Trichoderma 2NSC

3,00klm±0,17 T1

4,27a±0,12 T3

4,00abcd±0,10 T7

3,27hijklm±0,25 T9

3,83bcdef±0,06 T11

3,07jklm±0,06 T12

3,30hijklm±0,26 T13

3,40ghijk±0,17 T15

3,33hijkl±0,21 T21

4,20ab±0,20 T22

3,57efghi±0,32 T23

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3,90abcde±0,10 T25

4,13abc±0,12 T26

2,93lm±0,15 TC1

3,33hijkl±0,42 TC2

2,90m±0,10 TC3

3,83bcdef±0,15 TC5

4,10abc±0,10 TC6

4,03abcd±0,06 TC7

3,87abcdef±0,06 TC8

4,07abc±0,12 TC9

3,47fghij±0,06 TC10

3,77cdefg±0,35 TC11

3,17ijklm±0,35 TC13

4,10abc±0,10 TC15

3,63defgh±0,15 TCC1

4,00abcd±0,10 TCC6

Ghi chú: NSC: ngày sau cấy. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng

một cột có cùng chữ cái theo sau giống nhau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với

độ tin cậy 99%, không khác biệt thống kê ở α = 0,01

5,24 CV(%)

Khả năng sinh enzyme ngoại bào của Trichoderma là một trong những chỉ tiêu

lựa chọn để ủ compost. Kết quả trên cho thấy tất cả các chủng Trichoderma khảo sát

đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase. Khả năng sinh enzyme cellulase đều

từ mạnh đến rất mạnh, đường kính vòng phân giải từ 2,90 – 4,27 cm. Trong đó khả năng

phân giải cơ chất mạnh nhất là Trichoderma T3 (4,27 cm), T22 (4,20 cm), T26 (4,13 cm),

TC15 (4,10 cm), TC6 (4,10 cm). Kết quả này cũng trùng với kết quả của Nguyễn Thị Bích

Tuyền (2016). Vì vậy có thể sử dụng các chủng này để tăng cường sự phân hủy cành

thanh long.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.2. Vòng phân giải enzyme cellulase của chủng Trichoderma

T3,T22,T26,TC15,TC6.

3.2.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng Trichoderma spp.

Bảng 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma sau 2NSC.

Đường kính vòng phân giải chitin Các chủng của các chủng Trichoderma Trichoderma 2NSC

3,17defghi±0,15 T1

4,10a±0,10 T3

3,93ab±0,15 T7

3,10efghi±0,20 T9

3,53bcde±0,25 T11

2,77hij±0,25 T12

2,73ij±0,15 T13

2,23k±0,25 T15

3,30cdefg±0,20 T21

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3,93ab±0,06 T22

2,90ghij±0,10 T23

3,20defgh±0,10 T25

3,83ab±0,15 T26

3,10efghi±0,17 TC1

2,63jk±0,23 TC2

3,23defg±0,25 TC3

2,97fghij±0,06 TC5

3,37cdef±0,21 TC6

2,93fghij±0,40 TC7

3,70abc±0,10 TC8

3,20defgh±0,26 TC9

3,53bcde±0,32 TC10

2,73ij±0,25 TC11

3,13defghi±0,23 TC13

3,53bcde±0,15 TC15

3,57bcd±0,06 TCC1

3,53bcde±0,21 TCC6

Ghi chú: NSC: ngày sau cấy. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ±SD trong cùng

một cột có cùng chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99%., không

khác biệt thống kê ở α= 0,01.

6,26 CV(%)

Thành tế bào nấm được cấu tạo từ chitin và glucan. Trichoderma spp có khả năng

tổng hợp enzyme chitinase có tác dụng phân hủy chitin ở thành tế bào nấm bệnh. Kết

quả khảo sát vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma cho thấy đều có khả năng

sinh enzyme mạnh và rất mạnh với đường kính vòng phân giải 2,2 – 4,1cm. Trong đó

mạnh nhất với chủng Trichoderma T3 có đường kính vòng phân giải là 4,10cm, chủng

T22 và chủng T7 là 3,93cm. Nguyễn Thị Bích Tuyền (2016) cho rằng chủng T3 là chủng

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

có khả năng sinh chitinase mạnh nhất. Ngoài chủng T3 thì nghiên cứu này còn cho thấy

các chủng T7, T22, T26 là các chủng có hoạt tính chitinase mạnh.

Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma T3,T22,T7.

3.3. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma spp với nấm

bệnh.

3.3.1. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm

Neoscytalidium dimidiatum.

Bảng 3.4 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium

dimidiatum.

Tỉ lệ đối kháng (%) sau các ngày theo dõi Các chủng

Trichoderma 3NSC 5NSC 7NSC

39,20abcde±4,03 62,08bcdefgh±0,72 75,00bcdef±5,00 T1

45,04abc±5,18 72,92a±3,61 87,50a±6,25 T3

45,13ab±3,32 65,42abcdefg±3,15 85,42ab±3,61 T7

32,36cde±1,19 57,50efgh±2,17 79,17abcde±7,22 T11

41,15abcde±3,79 63,75abcdefgh±2,17 81,25abcde±6,25 T12

39,13abcde±9,78 63,33bcdefgh±1,44 70,42efg±2,89 T13

42,16abcde±9,90 63,75abcdefgh±3,31 72,92cdefg±3,61 T15

42,26abcde±2,94 61,67cdefgh±6,41 82,08abcd±1,44 T21

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

50,69a±6,77 71,25ab±3,75 86,67a±5,05 T22

44,88abc±7,43 68,33abcd±5,64 75,42bcdef±1,91 T23

43,89abcd±7,03 66,25abcdef±3,31 77,92abcde±3,15 T25

46,96ab±7,45 68,75abcd±3,75 87,08a±6,88 T26

44,46abc±9,36 62,50cdefgh±6,25 72,08defg±3,15 TC1

42,66abcd±5,99 64,58abcdefg±3,61 82,50abcd±4,51 TC2

42,01abcde±7,12 62,50bcdefgh±2,50 83,33abc±7,22 TC3

39,19abcde±5,03 60,00defgh±5,00 77,92abcde±3,15 TC5

42,26abcde±2,94 65,42abcdefg±3,15 70,42efg±7,32 TC6

45,04abc±5,18 70,83abc±3,61 85,42ab±3,61 TC7

30,03de±3,81 56,25gh±6,25 64,58fg±3,61 TC8

38,63abcde±3,67 63,33bcdefgh±1,44 77,92abcde±3,15 TC9

42,91abcd±6,99 62,50bcdefgh±2,50 82,50abcd±4,51 TC10

31,76cde±1,36 57,08fgh±5,05 63,75g±4,50 TC11

28,25e±16,14 54,58h±4,02 65,42fg±8,51 TC13

34,17bcde±2,36 65,00abcdefg±5,45 66,67fg±3,61 TC15

33,88bcde±8,40 62,50defgh±6,25 85,42ab±3,60 TCC1

42,01abcde±7,12 66,67abcde±7,22 80,00abcde±6,62 TCC6

Ghi chú: NSC: ngày sau cấy. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ±SD trong cùng

một cột có cùng chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99%, không

khác biệt thống kê ở α=0,01.

CV (%) 16.31 6.69 6,40

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Khả năng đối kháng của Trichoderma đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum

gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long là chỉ tiêu quan trọng quyết định hiệu quả phòng

trừ trên cây trồng. Khả năng đối kháng các chủng Trichoderma ở bảng 3.4 cho thấy sau

7 ngày nuôi cấy hầu hết các chủng đều có khả năng ức chế nấm Neoscytalidium

dimidiatum. Các chủng có khả năng ức chế mạnh sau 7 ngày là chủng T3, T26, T22.

Hình 3.4. Đĩa nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum ở 3,5,7 NSC (theo

thứ tự từ trái qua).

Hình 3.5 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm

Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua).

Hình 3.6 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T26 với nấm

Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.7 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T22 với nấm

Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua).

3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm

Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên thanh long.

Bảng 3.5 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma với nấm Colletotrichum sp.

Tỷ lệ đối kháng % sau các ngày theo dõi Các chủng

Trichoderma 5NSC 7NSC

32,47ab±4,70 71,96a±3,15 T3

34,19a±1,04 69,75a±4,53 T7

34,68a±3,59 71,01a±4,57 T22

30,94abc±4,34 71,01a±11,41 T26

25,67c±2,92 47,04b±7,34 TC1

30,83abc±6,78 69,76a±4,53 TC3

30,38abc±3,15 68,87a±3,90 TC7

TCC1 27,16bc±4,27 52,84b±6,02

Ghi chú: NSC: ngày sau cấy. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ±SD trong cùng

một cột có cùng chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99%., không

khác biệt thống kê ở α=0,01.

CV(%) 13,47 9,49

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Tỷ lệ đối kháng các chủng Trichoderma khảo sát được trình bày ở bảng 3.5 cho

thấy sau 7 ngày nuôi cấy các chủng Trichoderma hầu hết các chủng đều có khả năng ức

chế nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên thanh long trong điều kiện phòng thí

nghiệm. Trong đó, các chủng có khả năng đối kháng mạnh nấm bệnh là chủng T3,T22,

T26.. Như vậy, các chủng T3, T22, T26 vừa có khả năng đối kháng với nấm Neoscytalidium

dimidiatum vừa đối kháng với nấm Colletotrichum sp. Thể hiện triển vọng tốt để sử

dụng phòng trừ nấm bệnh trên thanh long. Đặc biệt là chủng T3, đã được định danh là

loài Trichoderma asperellum (Nguyễn Thị Bích Tuyền, 2016) vừa sinh enzyme

cellulase mạnh nhất vừa đối kháng với nấm bệnh, đây là chủng có triển vọng để sử dụng

trong ủ compost cành thanh long.

Hình 3.8 Đĩa nấm đối chứng Colletotrichum sp ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua).

Hình 3.9 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm

Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.10 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T22 với nấm

Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua).

Hình 3.11 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T26 với nấm

Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua).

3.4. Thử nghiệm ủ compost từ cành thanh long của chủng nấm Trichoderma T3

Trong quá trình trồng thanh long, người nông dân thường tỉa cành tạo độ thông

thoáng và trong đấy có những cành, hoa, trái non bị nhiễm bệnh cũng bị loại bỏ vứt ngay

tại vườn nên đây là nguồn gây ô nhiễm môi trường, cũng là nguồn phát tán mầm bệnh.

Chính vì vậy nguồn phế phẩm này cần được thu gom xử lý bằng biện pháp ủ compost.

Sau khi khảo sát các đặc điểm của các chủng Trichoderma khả năng sinh enzyme

cellulase, chitinase và khả năng đối kháng với 2 loại nấm bệnh phổ biến trên cây thanh

long thì chủng T3 là phù hợp nhất để tiến hành ủ compost cành thanh long.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 3.6 Kết quả phân tích hàm lượng carbon, hàm lượng nitơ tổng của nguyên liệu

ban đầu và 30 ngày sau ủ.

Thành phẩm 30 ngày sau ủ Nguyên liệu Chỉ tiêu phân tích ban đầu Đối chứng Thí nghiệm

Hàm lượng carbon (%) 55,52±0,03 45,64±1,24 37,15±0,96

Hàm lượng nitơ tổng (%) 2,11±0,04 2,42±0,18 2,85±0,14

Tỷ lệ C/N 26,42±0,69 18,97±1,88 13,07±0,98

Ẩm độ 63,90%±2,55

Nguyên liệu ban đầu khi mới cắt cành có độ ẩm 86,51%, không thuận lợi cho quá

trình ủ phân, sau 2 ngày phơi nắng nguyên liệu giảm độ ẩm còn 63,90%±2,55 thích hợp

cho quá trình ủ phân.

Kết quả phân tích tỷ lệ C/N 30 ngày sau ủ của đối chứng và công thức thí nghiệm

có sự khác biệt. Ở công thức đối chứng tỉ lệ C/N là 18,97 còn ở công thức thí nghiệm

13,07. Như vậy chủng nấm T3 có khả năng phân hủy cành thanh long ủ compost, ngoài

ra còn có khả năng đối kháng với nấm bệnh.

a b

Hình 3.12 Thanh long trước khi ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

a b

Hình 3.13 Thanh long ở công thức đối chứng 30 ngày sau ủ: (a) đối chứng ; (b) công

thức thí nghiệm.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1.Kết luận

Các chủng Trichoderma đều có khả năng sinh trưởng mạnh. Trong đó chủng T22,

T26, T3 có sinh trưởng mạnh nhất.

Hầu hết các chủng đều có khả năng sinh enzyme cellulase và chitinase. Các chủng

có khả năng tổng hợp enzyme cellulase mạnh là T3,T22,T26. Tổng hợp enzyme chitinase

mạnh là các chủng T3, T7, T22 và T26.

Tất cả các chủng đều có khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây

bệnh đốm trắng và nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trong điều kiện phòng thí

nghiệm. Các chủng T3, T22, T26 là những chủng có khả năng đối kháng mạnh với cả 2

loại bệnh trên.

Dùng chủng T3 Trichoderma asperellum ủ compost xử lý phế thải từ cành thanh

long cho kết quả tốt. Sau 30 ngày ủ tỷ lệ C/N chỉ còn 13,07 ở công thức bổ sung

Trichoderma so với 18,97 ở công thức không bổ sung nấm.

4.2.Kiến nghị

Thử nghiệm chế phẩm nấm Trichoderma ở quy mô ngoài đồng đánh giá ảnh hưởng

của các yếu tố ngoại cảnh từ môi trường ảnh hưởng đến chế phẩm.

Thử nghiệm sự kết hợp của các chủng Trichoderma spp với nhóm vi khuẩn

Bacillus spp trong đất để tăng hiệu suất ủ compost.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TRONG NƯỚC

Nguyễn Hoàng Anh (2013). Tối ưu hóa điều kiện thu nhận bào tử nấm Trichoderma sp.

nhằm định hướng tạo chế phẩm sinh học trừ nấm bệnh trên cây trồng, Luận văn

tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách Khoa Tp. Hồ

Chí Minh.

Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành (2005). Giáo trình môn Nấm học.

Trường Đại học Cần Thơ

Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2006. Công nghệ sinh học tập 3 Enzyme và ứng

dụng. Nhà xuất bản Giáo dục.

Hồng Châu (2009). Ứng dụng chế phẩm Trichoderma, Trạm khuyến nông Tân Trụ,tr 1.

Đường Hồng Dật (1984). Cơ sở khoa học bảo vệ cây, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

Bùi Xuân Đồng (1982). Vi nấm, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

Nguyễn Đức Huy, Phạm Quang Nguyên, Nguyễn Thị Thanh Hồng, Hà Giang, Nguyễn

Văn Viên, Nguyễn Tất Cảnh (2017). Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng

của Trichoderma asperellum đối với tác nhân gây bệnh cây có nguồn gốc trong

đất. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2017, p.1593-1603.

Vũ Triệu Mân (2007). Giáo trình Bệnh cây chuyên khoa, Chuyên ngành Bảo vệ thực

vật, Trường Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội.

Võ Thị Thu Oanh, Lưu Từ Đoan Trang (2017). Đánh giá khả năng đối kháng của một

số dòng Trichoderma đối với Phytopythium helicoides trong điều kiện phòng thí

nghiệm. Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 5/2017. P1-8. Trường Đại học Nông

Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

Võ Thị Thu Oanh, Cách Tuyến Nguyễn, Phan Thành Lê, Đình Đôn Phan, Thị Thu

Hiền (2014). Xác định tác nhân gây bệnh đốm nâu (Neoscytalidium dimidiatum)

trên cây thanh long dựa vào trình tự vùng ITS-RADN , Tạp chí Nông nghiệp và

Phát triển Nông thôn 2014, số 21 tr.17-23.

Huỳnh Văn Phục (2006). Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với

Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúc và bắp. Luận văn

tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm Tp.HCM.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trần Minh Tâm (2000). Công nghệ vi sinh ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp.

Hồ Chí Minh.

Trần Thị Thuần (1996). Kết quả nghiên cứu bước đầu về nấm đối kháng Trichoderma

Tuyển tập công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật 1990-1995, Nxb. Hà Nội

Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng, 2009. Nghiên cứu enzyme cellulase và

pectinase từ chủng Trichoderma Viride và Aspergillus Niger nhằm xử lý nhanh vỏ

cà phê. Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, Tập 12, Số 13 – 2009 p50-56.

Hà Thị Thúy,Lương Thành Hữu, Vũ Thúy Nga, Hứa Thị Sơn, Tống Hải Vân (2016).

Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum

gây bệnh đốm nâu thanh long, Hội thảo quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ

hai. p.1167-1172.

Nguyễn Thị Bích Tuyền (2016). Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh đốm nâu do nấm

Neoscytalidium đimidiatum trên thanh long của các chủng Trichoderma spp. Luận

văn tốt nghiệp trường Đại học công nghệ TP. Hồ Chí Minh.

Dương Hoa Xô, (2005). Vai trò nấm đối kháng Trichoderma trong kiểm soát vi sinh, Sở

Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thành phố Hồ Chí Minh.

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

Agrios G.N, (2005). Plant pathology, 5th edition, Elsevier Academic Press: San Diego,

California.

Barnett H. L., Barry B. Hunter. (1998). Illustrated genera of imperfect fungi. APS Pess,

The American Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota, 1-218

Crous & Slippes, 2006. Neoscytalidium dimidiatum ( Penz), Studies in Mycology

55 :244

Chuang M.F., Ni H.F., Yang H.R., Shu S.L., and Lai S.Y. 2012. First Report of Stem

Canker Disease of Pitaya (Hylocereus undatus and H. polyrhizus) Caused

by Neoscytalidium dimidiatum in Taiwan. The American Phytopathological

Society.

Cook R.J., and Baker K. F. 1983. The Nature and Practice of Biological Coltrol of plant

Pathogens. American Phythopathological Society, St. Paul, MN. 539 pp

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Danielson, R.M. and Davey, C.B., 1973a. Carbon and nitrogen nutrition of

Trichoderma. Soil Biol. Biochem. 5: 505 – 515

Domsch, K.H., Gams, W., 1980. Compendium of soil fungi. Academic Press

Gary E. Harman, C. P. Kubicek (2005). Trichoderma And Gliocladium: Enzymes,

Biological Control and commercial applications, Volume 2, This edition

published in the Taylor & Francis e-Library.

Gary J. Samuels, 2004. Trichoderma aguide to identification and biology, United States

Department of Agriculture Research Service Systematic Botany and Mycology

Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA.

Harman, G.E., 1996. Trichoderma for biocontrol of plant pathogens: from basic

research to comercialized production. Deparments of Horticultural Science and of

Plant Pathology, Cornell University NYSASE. Cornell community cofenrence on

biological control.

Kubicek, C.P. and Harman, G.E. (1998). Trichoderma and Gliocladium. Vol. 1, Basic

Biology, Taxonomy and Genetics. Taylor & Francis, London.

Kredics, L., Antal, Z., Manczinger, L., Szekres, A., Kevei, F., Nagy, E., 2003. Influence

of environmental parameter on Trichoderma strains with biocontrol potential.

Food Technol. Biotechnol. 41(1): 37 - 41.

Lynch, J.M and Harper, S.H.T., 1985. The Microbiol Upgrading of Straw for

Agriculture Use. Philosophycal Transactions of the Royal Society of London 310:

1144, 221 - 226.

Masratul Hawa M., Salleh B. and Latiffah Z. (2013). Identification and Molecular

Characterizations of Neoscytalidium dimidiatum Causing Stem Canker of

Red-fleshed Dragon Fruit (Hylocereus polyrhizus) in Malaysia. Journal of

phytopathology

Marco, J.L.D., Valadares-Inglis, M.C., Felix, C.R., 2002. Production of hydrolytic

enzyme by Trichoderma isolates with antagonistic activity against Crinipellis

perniciosa, the causal agent of Witches’ broom of cocoa. Brazillian journal of

Microbiology. 34: 33 - 38.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

O'connell, R.; Perfect, S.; Hughes, B.; Carzaniga, R.; Bailey, J.; Green, J. Dissecting the

cell biology of Colletotrichum infection processes. In: Prusky, D.; Freeman, S.;

Dickman, M.B. (Ed.) 2000. Colletotrichum: host specificity, pathology and host-

pathogen interation. Minnessota: APS Press. cap. 5, p. 57-77.

Perfect SE, Hughes HB, O’Connell RJ, Green JR, 1999. Colletotrichum: a model genus

for studies on pathology and fungal–plant interactions. Fungal Genetics and

Biology 27:186–198

Polizzi, G., Aiello, D., Vitale, A., Guiffrida, F., Groenewald, J.Z., Crous, P.W. 2009.

First Report of Shoot Blight, Canker, and Gummosis Caused by Neoscytalidium

dimidiatum on Citrus in Italy. Plant disease 2009 v.93 no.11 pp. 1215-1215

Prasun K. Mukherjee, B.A. Horwitz, U.S. Singh (2013). Trichoderma: Biology and

Applications.

Prasun K. Mukherjee and Kanthadai Raghu, 1997. Effect of temperature on antagonistic

and biocontrol pontential of Trichoderma sp. on Sclerotium rolfsii.

Mycopathologia. 139: 151-155.

Rastogi, G., et al. ,2009. Isolation and characterization of cellulose-degrading bacteria

from the deep subsurface of the Homestake gold mine, Lead, South Dakota, USA.

Journal of industrial microbiology & biotechnology 36, 585-598

Vinit Kumar Mishra, 2010. In vitro antagonism of Trichjoderma species against

Pythium aphanidermatum Phytology, 9: p. 28-35.

TÀI LIỆU INTERNET

https://www.2lua.vn/article/bien-phe-pham-cua-cay-thanh-long-thanh-phan-huu-co- sinh-hoc-15798.html

http://vietnamtradeoffice.net/tinh-hinh-san-xuat-va-tieu-thu-thanh-long-viet-nam/

https://en.wikipedia.org/wiki/Trichoderma

https://en.wikipedia.org/wiki/Neoscytalidium_dimidiatum

http://dost-bentre.gov.vn/TinTuc/NoiDung.aspx?tintuc=6796

https://baomoi.com/benh-dom-trang-thanh-long-giai-phap-quan-ly-tam- thoi/c/11650958.epi

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

http://www.phanbondientrang.vn/cong-nghe/benh-dom-trang-va-bien-phap-phong- ngua-sinh-hoc-cho-vuon-thanh-long-394.html

PHỤ LỤC

Phụ lục A: Bảng số liệu thô

A.1. Tốc độ sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày.

Vòng phát triển (cm)

Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3

5,8 5,7 6,2 5,1 5,3 5,6 5,5 5,4 5,7 5,9 5,5 5,0 5,8 5,3 5,3 5,1 5,7 5,7 5,4 4,5 5,0 5,1 5,6 5,3 5,1 5,2 5,6 5,4 5,6 4,8 5,0 5,7 5,0 5,2 5,4 5,2 6,1 5,6 5,4 5,7 5,4 5,6 4,8 5,3 5,5 5,2 4,1 5,7 5,2 5,6 5,5 5,6 5,4 5,5 5,0 5,7 5,7 5,0 5,4 5,4 5,4 5,2 5,4 5,9 5,6 4,9 5,6 5,6 5,1 5,0 5,6 5,4 5,4 4,3 5,5 4,8 5,4 5,0 5,7 5,1 5,7 T1 T3 T7 T9 T11 T12 T13 T15 T21 T22 T23 T25 T26 TC1 TC2 TC3 TC5 TC6 TC7 TC8 TC9 TC10 TC11 TC13 TC15 TCC1 TCC6

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

A.2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma

spp sau 2 ngày.

Vòng phân giải cellulose (cm)

Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3

2,9 4,2 4,1 3,0 3,8 3,1 3,6 3,5 3,5 4,2 3,2 3,9 4,2 2,8 3,0 2,9 4,0 4,1 4,0 3,9 4,2 3,5 3,4 2,8 4,2 3,5 4,0 3,2 4,2 3,9 3,5 3,9 3,1 3,2 3,5 3,1 4,0 3,7 3,8 4,0 2,9 3,2 3,0 3,8 4,2 4,1 3,9 4,0 3,4 4,1 3,5 4,0 3,6 3,9 2,9 4,4 4,0 3,3 3,8 3,0 3,1 3,2 3,4 4,4 3,8 4,0 4,2 3,1 3,8 2,8 3,7 4,0 4,0 3,8 4,0 3,5 3,8 3,2 4,1 3,8 4,1 T1 T3 T7 T9 T11 T12 T13 T15 T21 T22 T23 T25 T26 TC1 TC2 TC3 TC5 TC6 TC7 TC8 TC9 TC10 TC11 TC13 TC15 TCC1 TCC6

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

A.3. Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma spp

sau 2 ngày.

Vòng phân giải Chitin (cm)

Đĩa 2 3,0 4,0 3,8 2,9 3,8 2,5 2,6 2,2 3,3 4,0 2,8 3,3 3,7 3,0 2,5 3,2 2,9 3,3 3,3 3,6 3,5 3,9 2,7 3,4 3,5 3,6 3,6 Đĩa 3 3,2 4,2 4,1 3,3 3,3 3,0 2,9 2,5 3,5 3,9 2,9 3,2 3,8 3,0 2,9 3,5 3,0 3,6 3,0 3,7 3,1 3,4 3,0 3,0 3,4 3,5 3,7 Đĩa 1 3,3 4,1 3,9 3,1 3,5 2,8 2,7 2,0 3,1 3,9 3,0 3,1 4,0 3,3 2,5 3,0 3,0 3,2 2,5 3,8 3,0 3,3 2,5 3,0 3,7 3,6 3,3 T1 T3 T7 T9 T11 T12 T13 T15 T21 T22 T23 T25 T26 TC1 TC2 TC3 TC5 TC6 TC7 TC8 TC9 TC10 TC11 TC13 TC15 TCC1 TCC6

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

A.4. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm

Neoscytalidium dimidiatum sau 3 ngày nuôi cấy.

CHỦNG

Đối kháng (cm) Lần 2 Lần 3 Lần 1 Đối kháng (phần trăm) Lần 2 Lần 3

5,8 3,4 3,5 3,0 4,0 3,5 4,0 4,0 3,5 3,0 3,0 3,7 3,5 3,6 3,0 3,5 3,7 3,5 3,5 4,3 3,5 3,0 4,0 5,2 3,8 4,0 3,5 5,5 3,6 3,0 3,0 3,7 3,0 3,5 3,0 3,0 3,0 3,5 3,0 2,5 3,0 3,5 3,5 3,5 3,0 3,0 3,8 3,6 3,0 3,8 3,7 3,5 4,0 3,5 Lần 1 41,38 39,66 48,28 31,03 39,66 31,03 31,03 39,66 48,28 48,28 36,21 39,66 37,93 48,28 39,66 36,21 39,66 39,66 25,86 39,66 48,28 31,03 10,34 34,48 31,03 39,66 6,0 3,5 3,0 3,5 4,0 3,7 3,0 3,0 3,5 2,5 3,0 3,0 3,2 3,0 3,4 3,0 3,3 3,5 3,0 4,0 3,5 3,9 4,0 3,5 4,1 3,4 3,0 34,55 45,45 45,45 32,73 45,45 36,36 45,45 45,45 45,45 36,36 45,45 54,55 45,45 36,36 36,36 36,36 45,45 45,45 30,91 34,55 45,45 30,91 32,73 36,36 27,27 36,36 41,67 50,00 41,67 3333 38,33 50,00 50,00 41,67 58,33 5000 50,00 46,67 50,00 43,33 50,00 45,00 41,67 50,00 33,33 41,67 35,00 33,33 41,67 31,67 43,33 50,00 ĐC T1 T3 T7 T11 T12 T13 T15 T21 T22 T23 T25 T26 TC1 TC2 TC3 TC5 TC6 TC7 TC8 TC9 TC10 TC11 TC13 TC15 TCC1 TCC6

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

A.5. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm

Neoscytalidium dimidiatum sau 5 ngày nuôi cấy.

Đối kháng (phần trăm)

Đối kháng (cm) Lần 2 Lần 1 Lần 3 Lần 1 Lần 3

9,0 3,0 2,0 2,5 3,5 3,0 3,0 3,2 3,5 2,3 2,1 2,5 2,8 3,5 3,0 3,2 3,6 3,0 2,5 4,0 3,0 2,8 3,0 4,0 3,3 3,0 3,0 9,0 3,1 2,5 2,8 3,5 2,7 2,8 2,8 2,5 2,6 3,0 2,6 2,5 3,0 3,0 2,8 3,2 2,5 2,0 3,0 3,0 3,0 3,8 3,5 2,5 3,5 3,0 9,0 3,0 2,0 3,0 3,2 3,0 3,0 2,7 3,2 2,0 2,5 3,0 2,2 2,5 2,5 3,0 2,8 2,8 2,5 3,5 2,8 3,2 3,5 3,4 2,6 2,5 2,5 CHỦNG ĐC T1 T3 T7 T11 T12 T13 T15 T21 T22 T23 T25 T26 TC1 TC2 TC3 TC5 TC6 TC7 TC8 TC9 TC10 TC11 TC13 TC15 TCC1 TCC6 62,50 75,00 68,75 56,25 62,50 62,50 60,00 56,25 71,25 73,75 68,75 65,00 56,25 62,50 60,00 55,00 62,50 68,75 50,00 62,50 65,00 62,50 50,00 58,75 62,50 62,50 Lần 2 61,25 68,75 65,00 56,25 66,25 65,00 65,00 68,75 67,50 62,50 67,50 68,75 62,50 62,50 65,00 60,00 68,75 75,00 62,50 62,50 62,50 52,50 56,25 68,75 56,25 62,50 62,50 75,00 62,50 60,00 62,50 62,50 66,25 60,00 75,00 68,75 62,50 72,50 68,75 68,75 62,50 65,00 65,00 68,75 56,25 65,00 60,00 56,25 57,50 67,50 68,75 75,00

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

A.6. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm

Neoscytalidium dimidiatum sau 7 ngày nuôi cấy.

Đối kháng (phần trăm)

Đối kháng (cm) Lần 2 Lần 1 Lần 3 Lần 1 Lần 3

Lần 2

8,0 1,6 1,5 1,0 2,0 2,0 2,1 2,0 1,5 1,5 2,1 1,8 1,6 2,0 1,5 1,0 1,5 2,8 1,0 3,0 1,8 1,5 3,2 3,3 2,5 1,5 2,0 8,0 2,4 1,0 1,0 2,0 1,5 2,5 2,5 1,5 0,7 2,0 2,0 1,0 2,2 1,7 1,0 2,0 2,6 1,0 2,5 2,0 1,7 3,0 2,0 2,5 1,0 1,0 8,0 2,0 0,5 1,5 1,0 1,0 2,5 2,0 1,3 1,0 1,8 1,5 0,5 2,5 1,0 2,0 1,8 1,7 1,5 3,0 1,5 1,0 2,5 3,0 3,0 1,0 1,8 CHỦNG ĐC T1 T3 T7 T11 T12 T13 T15 T21 T22 T23 T25 T26 TC1 TC2 TC3 TC5 TC6 TC7 TC8 TC9 TC10 TC11 TC13 TC15 TCC1 TCC6 80,00 81,25 87,50 75,00 75,00 73,75 75,00 81,25 81,25 73,75 77,50 80,00 75,00 81,25 87,50 81,25 65,00 87,50 62,50 77,50 81,25 60,00 58,75 68,75 81,25 75,00 70,00 87,50 87,50 75,00 81,25 68,75 68,75 81,25 91,25 75,00 75,00 87,50 72,50 78,75 87,50 75,00 67,50 87,50 68,75 75,00 78,75 62,50 75,00 68,75 87,50 87,50 75,00 93,75 81,25 87,50 87,50 68,75 75,00 83,75 87,50 77,50 81,25 93,75 68,75 87,50 75,00 77,50 78,75 81,25 62,50 81,25 87,50 68,75 62,50 62,50 87,50 77,50

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

A.7. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm

Colletotrichum sp sau 5 ngày.

Đối kháng 5NSC (cm) Đối kháng 5NSC (phân trăm)

4,8 4,5 4,5 4,9 ĐC

3,2 3,2 3,2 3,0 33,33 28,89 28,89 38,78 T3

3,1 3,0 3,0 3,2 35,42 33,33 33,33 34,69 T7

2,9 3,0 3,1 3,2 39,58 33,33 31,11 34,69 T22

3,2 3,4 3,0 3,3 33,33 24,44 33,33 32,65 T26

3,5 3,5 3,2 3,7 27,08 22,22 28,89 24,49 TC1

2,9 3,4 3,3 3,3 39,58 24,44 26,67 32,65 TC3

3,2 3,3 3,2 3,3 33,33 26,67 28,89 32,65 TC7

3,5 3,3 3,5 3,3 27,08 26,67 22,22 32,65 TCC1

A.8. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm

Colletotrichum sp sau 7 ngày.

Đối kháng 7NSC (cm) Đối kháng 7NSC (phân trăm)

5,8 5,6 5,5 5,6 ĐC

1,5 1,5 1,8 1,5 74,14 73,21 67,27 73,21 T3

1,5 2,0 1,5 1,8 74,14 64,29 72,73 67,86 T7

1,5 1,5 1,5 2,0 74,14 73,21 72,73 64,29 T22

1,0 2,5 1,5 1,5 82,76 55,36 72,73 73,21 T26

2,6 3,5 2,8 3,0 55,17 37,50 49,09 46,43 TC1

1,5 1,8 1,5 2,0 74,14 67,86 72,73 64,29 TC3

1,7 2,0 1,8 1,5 70,69 64,29 67,27 73,21 TC7

2,5 3,0 2,8 2,3 56,90 46,43 49,09 58,93 TCC1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

A.9. Hàm lượng C, N trong cành thanh long.

C/N

NL ÐC TN1 NL ÐC TN1 NL ÐC TN1 Lần 1 55,08 44,42 37,04 2,15 2,60 2,88 25,62 17,08 12,86 Lần 2 55.94 46,89 38,16 2,08 2,25 2,70 26,89 20,84 14,13 Lần 3 56,43 45,61 36,25 2,11 2,40 2,97 26,74 19 12,21

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Phụ lục B: Số liệu xử lý

B.1. Tốc độ sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày.

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for sinhtruong

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 54

Error Mean Square 0.06

Critical Value of t 2.66998

Least Significant Difference 0.534

Means with the same letter are

not significantly different.

t Grouping Mean N chung

A 5.9667 3 T22

5.7000 3 T26

B A B A 5.6667 3 T3

B A C 5.6000 3 TCC6

B D A C 5.5667 3 T23

B D A C 5.5667 3 T7

B D A C 5.5333 3 TC6

B D A C 5.5333 3 TC11

B D A C 5.5333 3 TC5

E B D A C 5.4667 3 T11

E B D A C 5.4667 3 TC15

E B D A C 5.4333 3 TC1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

E B D A C 5.4333 3 T21

E B D 5.4000 3 T1 C

C E B D 5.4000 3 TC9

C E B D 5.3667 3 T13

C E B D 5.3333 3 TC7

C E B D 5.3333 3 T15

C E B D 5.3333 3 T12

C E B D 5.3333 3 TC2

C E B D 5.2667 3 TC13

C E B D 5.2333 3 TCC1

E B D 5.1000 3 T25

C E D 5.0333 3 T9

5.0333 3 TC10

E E 4.9667 3 TC3

F 4.3000 3 TC8

B.2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma spp

sau 2 ngày.

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for CMC

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 54

Error Mean Square 0.036543

Critical Value of t 2.66998

Least Significant Difference 0.4167

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Means with the same letter are

not significantly different.

t Grouping Mean N chung

A 4.2667 3 T3

B A 4.2000 3 T22

B A C 4.1333 3 T26

B 4.1000 3 TC15

A C B A C 4.1000 3 TC6

B A C 4.0667 3 TC9

B D A C 4.0333 3 TC7

B D A C 4.0000 3 T7

B D A C 4.0000 3 TCC6

E B D A C 3.9000 3 T25

E B D A C F 3.8667 3 TC8

E B D C F 3.8333 3 T11

C F 3.8333 3 TC5

E B D E D

C F 3.7667 3 TC11 E H D G F 3.6333 3 TCC1

E H G I F 3.5667 3 T23

H J G I F 3.4667 3 TC10

K H J G I 3.4000 3 T15

K H J L I 3.3333 3 TC2

K H J L I 3.3333 3 T21

K H J L I M 3.3000 3 T13

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

K H J L I M 3.2667 3 T9

K J L I M 3.1667 3 TC13

K M 3.0667 3 T12

J L L M 3.0000 3 T1

K M 2.9333 3 TC1

L M 2.9000 3 TC3

B.3. Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma spp

sau 2 ngày.

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for chitin

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 54

Error Mean Square 0.041605

Critical Value of t 2.66998

Least Significant Difference 0.4447

Means with the same letter are

not significantly different.

t Grouping Mean N chung

A 4.1000 3 T3

B A 3.9333 3 T22

B A 3.9333 3 T7

3.8333 3 T26 B

A B A C 3.7000 3 TC8

B D C 3.5667 3 TCC1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

B E D C 3.5333 3 TCC6

B E D C 3.5333 3 TC10

B E D C 3.5333 3 T11

B E D C 3.5333 3 TC15

F E D C 3.3667 3 TC6

G F E D C 3.3000 3 T21

G F E D 3.2333 3 TC3

G F E D H 3.2000 3 T25

G F E D H 3.2000 3 TC9

G F E D H I 3.1667 3 T1

G F E D H I 3.1333 3 TC13

G F E H I 3.1000 3 T9

G F E H I 3.1000 3 TC1

G F J H I 2.9667 3 TC5

G F J H I 2.9333 3 TC7

G J H I 2.9000 3 T23

J H I 2.7667 3 T12

J I 2.7333 3 T13

J I 2.7333 3 TC11

K 2.6333 3 TC2

J K 2.2333 3 T15

B.4. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm

Neoscytalidium dimidiatum sau 3 ngày nuôi cấy.

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DK

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 52

Error Mean Square 43.41037

Critical Value of t 2.67373

Least Significant Difference 14.384

Means with the same letter are

not significantly different.

t Grouping Mean N chung

A 50.687 3 T22

B A 46.960 3 T26

45.133 3 T7

B A C B A C 45.037 3 T3

B A C 45.037 3 TC7

B A C 44.880 3 T23

B A C 44.460 3 TC1

B D A C 43.887 3 T25

B D A C 42.910 3 TC10

B D A C 42.657 3 TC2

E B D A C 42.260 3 TC6

E B D A C 42.260 3 T21

E B D A C 42.160 3 T15

E B D A C 42.007 3 TC3

E B D A C 42.007 3 TCC6

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

E B D A C 41.147 3 T12

E B D A C 39.200 3 T1

E B D A C 39.190 3 TC5

E B D A C 39.130 3 T13

E B D A C 38.627 3 TC9

E B D C 34.170 3 TC15

C 33.877 3 TCC1

E B D E D C 32.363 3 T11

E D C 31.757 3 TC11

30.033 3 TC8

E D E 28.247 3 TC13

B.5. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm

Neoscytalidium dimidiatum sau 5 ngày nuôi cấy.

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DK

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 52

Error Mean Square 18.22917

Critical Value of t 2.67373

Least Significant Difference 9.3209

Means with the same letter are

not significantly different.

t Grouping Mean N chung

A 72.917 3 T3

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

B A 71.250 3 T22

B A C 70.833 3 TC7

B D A C 68.750 3 T26

B D A C 68.333 3 T23

E B D A C 66.667 3 TCC6

E B D A C F 66.250 3 T25

E B D A G C F 65.417 3 TC6

E B D A G C F 65.417 3 T7

E B D A G C F 65.000 3 TC15

E B D A G C F 64.583 3 TC2

E B D A H G C F 63.750 3 T12

E B D A H G C F 63.750 3 T15

E B D H G C F 63.333 3 T13

E B D H G C F 63.333 3 TC9

E B D H G C F 62.500 3 TC3

E B D H G C F 62.500 3 TCC1

E B D H G C F 62.500 3 TC10

E B D H G C F 62.500 3 TC1

E B D H G C F 62.083 3 T1

E D H G C F 61.667 3 T21

E F 60.000 3 TC5

D H G E H G F 57.500 3 T11

H G F 57.083 3 TC11

H G 56.250 3 TC8

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

H 54.583 3 TC13

B.6. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm

Neoscytalidium dimidiatum sau 7 ngày nuôi cấy.

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DK

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 52

Error Mean Square 24.71955

Critical Value of t 2.67373

Least Significant Difference 10.854

Means with the same letter are

not significantly different.

t Grouping Mean N chung

A 87.500 3 T3

A 87.083 3 T26

A 86.667 3 T22

B A 85.417 3 T7

B A 85.417 3 TCC1

B A 85.417 3 TC7

B A C 83.333 3 TC3

B D A C 82.500 3 TC2

B D A C 82.500 3 TC10

B D A C 82.083 3 T21

E B D A C 81.250 3 T12

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

E B D A C 80.000 3 TCC6

E B D A C 79.167 3 T11

E B D A C 77.917 3 T25

E B D A C 77.917 3 TC9

E B D A C 77.917 3 TC5

E B D C F 75.417 3 T23

E B D C F 75.000 3 T1

E D G C F 72.917 3 T15

E D F 72.083 3 TC1 G

G F 70.417 3 TC6 E

G F 70.417 3 T13 E

G F 66.667 3 TC15

G F 65.417 3 TC13 G F 64.583 3 TC8

G 63.750 3 TC11

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

B.7. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm

Colletotrichum sp sau 5 ngày nuôi cấy.

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DK

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 24

Error Mean Square 17.204

Critical Value of t 2.79694

Least Significant Difference 8.2032

Mean N chung

t Grouping A 34.678 4 T22

34.193 4 T7

A A 32.473 4 T3

B B A 30.938 4 T26

B A 30.835 4 TC3

B A 30.385 4 TC7

B A 27.155 4 TCC1

B 25.670 4 TC1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

B.8. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm

Colletotrichum sp sau 7 ngày nuôi cấy.

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DK

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 24

Error Mean Square 38.43937

Critical Value of t 2.79694

Least Significant Difference 12.262

Mean N chung

t Grouping A 71.958 4 T3

71.093 4 T22

A A 71.015 4 T26

A 69.755 4 T7

A 69.755 4 TC3

A 68.865 4 TC7

52.838 4 TCC1

B B 47.048 4 TC1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Phụ lục C: Hình ảnh

C.1. Hình thái đại thể của các chủng nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy

trên môi trường PDA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

C.2.Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) và chitinase (cm) sau 2 ngày nuôi

cấy của các chủng Trichoderma spp.

Chủng nấm Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) Đường kính vòng phân giải chitin (cm)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

T11

T12

T13

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

T15

T21

T22

T23

T25

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

T26

TC1

TC2

TC3

TC5

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TC6

TC7

TC8

TC9

TC10

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TC11

TC13

TC15

TCC1

TCC6

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

C.3. Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm

Neoscytalidium dimidiatum.

Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp

với nấm N. dimidiatum Chủng

3NSC 5NSC 7NSC

T11

T13

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

T15

T21

T22

T23

T25

T26

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TC1

TC2

TC3

TC5

TC6

TC7

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TC8

TC9

TC11

TC13

TC15

TC10

TCC1

TCC6

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

C.4. Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm

Colletotrichum sp

Kết quả đối kháng của các chủng nấm

Trichoderma spp với nấm N. dimidiatum Chủng

5NSC 7NSC

ĐC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

T22

T26

TC1

TC7

TCC1

Đồ án tốt nghiệp: Tuyển chọn các chủng Trichoderma đối kháng nấm bệnh trên cây thanh long và tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG TRICHODERMA ĐỐI KHÁNG NẤM BỆNH TRÊN CÂY THANH LONG VÀ TĂNG CƯỜNG QUÁ TRÌNH Ủ COMPOST TỪ CÀNH THANH LONG

Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HAI

Sinh viên thực hiện

: THÁI QUỐC ĐÔNG

MSSV: 1615101003 Lớp: 16HSH02

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LUC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

× 100(%)

× 100(%)

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có thể bạn quan tâm

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận án Tiến Sĩ: : Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết từ cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)

Báo cáo thực tập: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (QUATEST 2)

Câu hỏi ôn tập môn Công nghệ sinh học nấm ăn và nấm dược liệu

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Công nghệ nông nghiệp năm 2025 - Sở GD&ĐT Cà Mau

Câu hỏi ôn tập kiểm tra học kì 2 môn Công nghệ chăn nuôi lớp 11 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Đề cương ôn tập học kì 2 môn Công nghệ nông nghiệp lớp 12 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Virus Real-time PCR

Bài giảng Công nghệ sản xuất enzym - Lê Ngọc Khánh

Đề khảo sát giữa học kì 2 môn Khoa học tự nhiên lớp 9 năm 2024-2025 có đáp án - Trường THCS Xuân Tiến (Đề số 02)

Định danh chủng vi khuẩn Bacillus subtilis R1 phân lập từ rơm có hoạt tính phân huỷ huyết khối

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Công nghệ sinh học nano năm 2021-2022

Bài giảng Công nghệ sinh học phân tử vi sinh vật - Trần Linh Thước

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Xuân Lộc, Đồng Nai

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ môi trường: Nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học theo mẻ (SBR) để xử lý nước thải sinh hoạt trong nhà cao tầng và khu dân cư quy mô tới 10000 người

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đột biến và đa hình của một số gen ở trẻ em mắc bệnh teo đường mật bẩm sinh

Đề thi kết thúc học phần học kì 2 môn Công nghệ sinh học dinh dưỡng năm 2023-2024 có đáp án

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Quản lý chất lượng sản phẩm năm 2023-2024

Tài liêu mới

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống sấy khí thổi dùng để sấy tinh bột gạo nếp, năng suất 2000 kg/h theo sản phẩm

Đồ án môn học: Nghiên cứu phát triển sản phẩm kem trứng muối đóng hộp mix hạt điều

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống xử lý nước ngầm công suất 15000M3 /NG/Đ

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu về ứng dụng công nghệ số trong sản xuất in và tác động của nó đến chiến lược kinh doanh của công ty in

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống chùm để ngưng tụ hơi cồn nồng độ 96% khối lượng, lưu lượng 10000kg/ngày

Báo cáo đồ án: Thiết kế hệ thống chưng cất mâm chóp hệ etanol – nước năng suất nhập liệu 2000 L/h

Đồ án công nghệ: Thiết kế hệ thống chuyển hóa cacbon monoxit Water gas shift

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng hệ thống chia sẻ tài liệu theo kiến trúc hướng dịch vụ

Luận văn tốt nghiệp: Thiết kế nhà máy sản xuất màng ghép phức hợp ứng dụng cho bao bì thuốc trừ sâu năng suất 90 triệu m²/năm

Đồ án tốt nghiệp: Thành lập bản đồ lớp phủ thực vật tỉ lệ 1:50000 tại huyện Sóc Sơn, thành phố Hà Nội từ tư liệu ảnh viễn thám

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng chương trình quản lý chất lượng theo HACCP cho sản phẩm thịt ba rọi xông khói tại Cty TNHH MTV Việt Nam kỹ nghệ súc sản (VISSAN)

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng mô hình dự báo nguồn nhân lực thuyền viên xuất khẩu Việt Nam

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu giải pháp điều khiển bám quỹ đạo tàu thủy có ràng buộc tín hiệu và bất định hàm ở đầu vào

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Đánh giá sự hiện diện một số kim loại nặng trong nghêu trắng Meretrix lyrate và môi trường sống của chúng

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tính toán hệ dây neo công trình biển nổi đặt tại vùng biển Việt Nam

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok