Y Học TP. Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 2 * 2024
Nghiên cứu
45
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT
CỦA CAO CHIẾT BỘT CỦ NGHỆ (CURCUMA LONGA L.)
LÊN MEN BẰNG LACTOBACILLUS CASEI
Nguyễn Thanh Tố Nhi1, Phạm Song Phi Thuyền1, Đinh Thị Hoàng Nhi1,
Quang Trng Minh2, Nguyễn Minh Thái2
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Công nghệ lên men dược liệu bằng vi sinh vật (VSV) có thể cải thiện hoạt tính sinh học của
chúng. Curcuma longa là dược liệu được dùng phổ biến tại Việt Nam, các nghiên cứu lên men Nghệ bởi vi khuẩn
lactic còn hạn chế.
Mục tiêu: Khảo sát hoạt tính kháng VSV của cao chiết bột củ Nghệ (BCN) lên men bằng L. casei.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: BCN được ủ với pectinase trong 1, 3, 5 giờ trước khi lên men.
Điều kiện lên men BCN được khảo sát như sau: tỷ lệ cấy L. casei (0,1%, 0,5%, 1%, 2% (tt/kl)), thời gian lên men
(24, 48, 72 giờ). BCN được chiết cao bằng phương pháp ngâm lạnh trong cồn 96% kết hợp siêu âm và được đánh
giá hoạt tính kháng VSV bằng phương pháp giếng khuếch tán và vi pha loãng trong môi trường lỏng trên
Staphylococcus aureus nhạy cảm và kháng methicillin (MSSA, MRSA), Candida albicans.
Kết quả: So với cao chiết BCN ban đầu, BCN được xử lí pectinase trong 1 giờ, sau lên men 72 giờ với tỷ lệ
cấy L. casei 2% (tt/kl), cho nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thấp hơn, giảm 16 lần (MRSA), 32 lần (MSSA), hơn
16 lần (C. albicans).
Kết luận: BCN lên men bằng L. casei đã cải thiện hoạt tính kháng VSV, MIC thấp nhất (64 µg/mL)
trên MSSA.
Từ khóa: củ Nghệ, Lactobacillus casei, lên men, kháng vi sinh vật
ABSTRACT
INVESTIGATING THE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF
FERMENTED TURMERIC (CURCUMA LONGA L.,) POWDER BY LACTOBACILLUS CASEI
Nguyen Thanh To Nhi, Pham Song Phi Thuyen, Dinh Thi Hoang Nhi,
Quang Trong Minh, Nguyen Minh Thai
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine - Pharmacy * Vol. 27 - No. 2 - 2024: 45-50
Background: Fermentation technology of medicinal herbs by micro-organism can improve biological
activity. Curcuma longa is a medicinal herb commonly used in Vietnam, but studies on turmeric fermentation by
lactic acid bacteria are still limited.
Objective: To investigate the antimicrobial activity of fermented turmeric powder extract (TPE) using
Lactobacillus casei.
Methods: TPE was treated with pectinase (1, 3, 5 hours) before fermentation. Fermentation conditions were
examined, including L. casei inoculation ratios (0.1%, 0.5%, 1%, 2% v/w) and fermentation durations (24, 48,
72 hours). TPE was extracted by maceration in 96% alcohol combined with ultrasound and antimicrobial activity
was assessed via well diffusion and broth microdilution methods against methicillin-sensitive and resistant
1Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành
2Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Thanh Tố Nhi ĐT: 0905154489 Email: nttnhi@ntt.edu.vn
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học, 27(2):45-50. DOI: 10.32895/hcjm.p.2024.02.06
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 3 * 2024
46
Staphylococcus aureus (MSSA, MRSA) and Candida albicans.
Results: Compared to the initial TPE, the optimally fermented TPE (1-hour pectinase treatment, 2% v/w L.
casei inoculation, 72-hour fermentation) exhibited significantly lower minimum inhibitory concentrations
(MICs). MICs decreased 16-fold (MRSA), 32-fold (MSSA), and over 16-fold for C. albicans.
Conclusion: L. casei fermentation of TPE improved antimicrobial activity, with the lowest MIC (64 µg/mL)
observed against MSSA.
Keywords: turmeric, Lactobacillus casei, fermentation, antimicrobial activity
ĐẶT VẤN ĐỀ
Curcuma longa Linn., họ Gừng
(Zingiberaceae), là loài cây thân thảo lâu năm
có nguồn gốc từ Ấn Độ và được trồng rộng rãi
ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của Nam
và Đông Nam Á, bao gồm Việt Nam. Các
nghiên cứu ha thc vật trước đây đã xác định
nhiều hợp chất thứ cấp trong củ nghệ, bao
gồm các terpenoid (mono-, sesqui-, di-, tri-),
curcuminoid, phức hợp curcuminoid-
terpen, phenolic, flavonoid, saccharid,
steroid, acid béo và alkaloid. Những hợp
chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học
quan trọng như kháng ung thư, kháng oxy
hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, trị tiểu
đường, hạ lipid máu, bảo vệ gan và thần
kinh(1). Trong những năm gần đây, bên cạnh
những phương pháp vật lý, hóa học, công
nghệ lên men VSV cũng được sử dụng rộng rãi
để nâng cao hàm lượng, sinh khả dụng các hợp
chất hóa thc vật trong Nghệ cũng như các loại
dược liệu khác, đồng thời hạn chế sản phẩm phụ
và quy trình sử dụng thân thiện với môi
trường(2).Vi khuẩn lactic (LAB) đang được sử
dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men thc
phẩm và y sinh(2). Năm 2022, nghiên cứu của
Budiari và cộng s đã cho thấy hoạt tính kháng
S. aureus của dịch chiết Nghệ lên men tăng
lên đáng kể so với dịch chiết Nghệ không
lên men(3). Tại Việt Nam, mặc dù Nghệ được
trồng phổ biến, tuy nhiên các nghiên cứu về
lên men củ Nghệ bởi LAB vẫn chưa được
chú trọng. Do đ, nghiên cứu khảo sát một
số điều kiện lên men củ Nghệ C. longa bằng
L. casei nhằm cải thiện hiệu quả kháng VSV
gây bệnh.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Dược liệu sử dụng trong nghiên cứu là củ
Nghệ (Curcuma longa L.) trưởng thành (8-10
tháng sau khi trồng, màu vàng đến cam sậm,
chiều dài khoảng 30 – 50 mm, chiều rộng khoảng
9 - 10 mm, độ dày khoảng 5 – 6 mm), được thu
hoạch vào tháng 11-12 tại xã Tân Khánh Trung,
huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp. Mẫu được định
danh bằng hình thái, vi phẫu và so sánh với
chuyên luận dược liệu theo DĐVNV(4). Củ Nghệ
được rửa sạch bằng nước máy nhằm loại bỏ bụi,
tạp cơ học, để ráo, cắt lát, sấy khô ở 70 °C, trong
4 ngày, sau đ được xay mịn và sàng qua rây
35 mm, bảo quản trong lọ thủy tinh tránh
ánh sáng.
Nguyên vật liệu
Pectinase 30.000 U/g (Braumarkt), môi
trường Muller Hinton Broth/Agar (MHB/MHA),
Tryptic soya broth/agar (TSB/TSA), de Man,
Rogosa and Shape broth/agar (MRS/MRSA),
Sabouraud 2% glucose broth/agar (SDB/SDA)
(Merck), Dimethyl sufoxide (DMSO) (Merck),
D-glucose (Himedia), đĩa giấy Ketoconazol
10 µg, Amikacin 10 µg (Himedia) (công ty Nam
Khoa Biotek), Ketoconazol (Sigma), Amikacin
sulfat salt (Sigma), resazurin (Sigma), L. casei
ATCC 393, S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 33591,
C. albicans ATCC 10231 (Bộ môn Vi sinh ký sinh
trùng, Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành).
Phương pháp nghiên cứu
Xử lý BCN trước lên men bằng enzym
pectinase
Cân 75 g BCN vào 150 mL đệm acetat pH 5
đã c sẵn pectinase 30.000 U/kg, ủ ở 50 °C trong
Y Học TP. Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 2 * 2024
Nghiên cứu
47
1 giờ, 3 giờ, 5 giờ(5). Loại bỏ enzym bằng cách ly
tâm 5.600 rpm trong 5 phút(5), thu cắn và rửa cắn
nhiều lần bằng nước cất cho tới khi nước rửa đạt
pH 6,5. Cắn sau khi rửa là BCN đã được xử lý
với pectinase ở các thời gian khác nhau và được
sử dụng trc tiếp cho các thử nghiệm tiếp theo.
Khảo sát điều kiện lên men BCN
BCN sau khi xử lý với pectinase ở thời gian
thích hợp, được điều chỉnh độ ẩm bằng môi
trường MRS sao cho đạt 45 - 55% phù hợp cho
quá trình lên men bán rắn(6) (tỷ lệ môi trường
MRS:BCN ≈ 0,5:1 (tt/kl), tiệt trùng bằng cách hấp
ở 110°C, 15 phút. Huyền dịch L. casei có mật độ
106 CFU/mL được cấy vào BCN với các tỷ lệ
khảo sát là 0,1%, 0,5%, 1%, và 2% (tt/kl)(7), được ủ
ở 37 °C, trong bình kín, thu mẫu sau 24, 48 và 72
giờ. Mỗi thử nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau đ,
mẫu được ly tâm 10.000 rpm trong 5 phút, loại
dịch nổi, thu được BCN sau lên men dùng cho
thử nghiệm chiết xuất cao BCN.
Chiết xuất cao BCN
BCN ban đầu (không xử lý pectinase),
BCN có xử lý pectinase không lên men và có
lên men, được chiết cao theo phương pháp
ngâm lạnh trong ethanol 96%, tỷ lệ BCN:dung
môi là 1:10 (kl/tt), kết hợp siêu âm ở 50 °C, 30
phút. Mỗi mẫu được chiết 3 lần với ethanol
96% để đảm bảo chiết kiệt được các hoạt chất
trong BCN(5,8,9). Dịch chiết được lọc qua giấy
lọc và cô quay thu hồi dung môi ở 55 °C. Độ
ẩm của cao chiết được xác định bằng cân sấy
ẩm (không quá 20%), theo DĐVN V(4).
Khảo sát hoạt tính kháng VSV của cao chiết
Phương pháp giếng khuếch tán:
Thc hiện theo CLSI M02-A12 đối với
MRSA, MSSA(10), môi trường thử nghiệm là
MHA và CLSI M44-A2 đối với vi nấm, môi
trường thử nghiệm là MHA bổ sung glucose
2% (kl/tt)(11), Sau khi được hoạt hóa trên môi
trường thích hợp TSB (MSSA, MRSA), SDB
(C. albicans), huyền dịch VSV thử nghiệm
(1 - 2 × 108 CFU/mL (vi khuẩn), 1 - 5 × 106 CFU/mL
(vi nấm) được trải đều trên bề mặt môi trường
thử nghiệm. Sau đ, 60 µL cao chiết BCN
50 mg/mL trong DMSO được cho vào các
giếng 6 mm trên môi trường (nồng độ cuối của
DMSO là 0,03%). Đĩa thạch được ủ ở 37 °C, 24
giờ (MRSA, MSSA), 24 - 48 giờ (C. albicans).
Đường kính vùng ức chế được đo và ghi nhận.
Phương pháp vi pha loãng trên môi trường lỏng
Thc hiện theo CLSI M07 – A10 đối với
MRSA, MSSA(12), môi trường thử nghiệm là
MHB và CLSI M27-A3 có cải tiến đối với vi
nấm(13,14), môi trường thử nghiệm là MHB bổ
sung glucose 2% (kl/tt). Cao chiết BCN được
pha trong DMSO, sau đ pha loãng trong môi
trường thử nghiệm sao cho tạo thành dãy có
nồng độ sau bằng ½ nồng độ trước, khoảng
nồng độ của cao BCN trong giếng thử nghiệm
là 2.048 µg/mL - 16 µg/mL, nồng độ cuối
DMSO là 0,05%. Chứng dương là Amikacin
(MSSA, MRSA), Ketoconazol (C. albicans), với
dãy nồng độ 100 µg/mL - 0,78 µg/mL. Nồng
độ cuối của DMSO được sử dụng làm chứng
âm là 0,05%. Huyền dịch VSV được thêm
vào để đạt mật độ cuối là 5 × 105 CFU/mL
đối với vi khuẩn và 0,5 - 2,5 × 103 CFU/mL
đối với C. albicans. Đĩa được ủ ở 37°C, 24 giờ
(MRSA, MSSA), 24 - 48 giờ (C. albicans). Sau ủ,
30 µL resazurin 0,015% (kl/tt) được thêm vào
mỗi giếng và ủ tiếp 2 - 4 giờ(15,16). Giá trị MIC
được xác định là nồng độ thấp nhất của cao
chiết ức chế hoàn toàn s phát triển của VSV
(giữ nguyên màu xanh của resazurin). Thử
nghiệm được lặp lại 3 lần.
Phương pháp xử lý số liệu
S khác biệt giữa các mốc thời gian xử lý
BCN bởi pectinase và các điều kiện lên men
BCN được xác định bằng phân tích phương sai
một chiều (one-way ANOVA), với mức ý
nghĩa thống kê p < 0,05. Phân tích hậu kiểm
Tukey được sử dụng để so sánh cặp khi có s
khác biệt c ý nghĩa. Tất cả các phân tích thống
kê được thc hiện bằng phần mềm GraphPad
Prism phiên bản 9.
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 3 * 2024
48
KẾT QUẢ
Kt qu xử lý BCN trưc lên men bằng enzym
pectinase
Cao chiết thu được từ BCN có và không xử
lý pectinase 1 giờ, 3 giờ và 5 giờ đều có màu
vàng nâu và độ ẩm đạt tiêu chuẩn theo DĐVNV.
Kết quả đường kính vòng kháng VSV, giá trị
MIC của cao chiết BCN có và không xử lý
pectinase 1 giờ, 3 giờ và 5 giờ được trình bày
trong Hình 1 và Bảng 1.
Hình 1. Biểu đồ đường kính vòng kháng VSV của cao BCN không và có xử lý pectinase
(*: khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) **: khác biệt có ý nghĩa (p < 0,01)
Bảng 1. MIC (µg/mL) của cao chiết BCN không và
có xử lý pectinase ở các thời gian khác nhau
Cao/kháng sinhLoài VSV
MSSA
MRSA
BCN không xử lý
pectinase
2.048
2.048
BCN xử lý
pectinase 1 giờ
1.024
1.024
BCN xử lý
pectinase 3 giờ
2.048
2.048
BCN xử lý
pectinase 5 giờ
2.048
2.048
Amikacin
3,13
12,5
Ketoconazol
ND
ND
ND: không thực hiện
Qua kết quả thử nghiệm giếng khuếch tán
chúng tôi nhận thấy, khi xử lý mẫu BCN với
pectinase 30.000 U/kg trong dung dịch đệm
acetat pH 5 ở 50 oC, 1 giờ cho đường kính vòng
kháng VSV cao hơn mẫu BCN ban đầu (không
xử lý pectinase) và xử lý pectinase tại các thời
gian khác là 3 giờ và 5 giờ. Đồng thời, s khác
biệt về đường kính vòng kháng VSV của mẫu
cao BCN sau xử lý pectinase ở 1 giờ và mẫu
cao BCN ban đầu là c ý nghĩa với mức giá trị
p < 0,05 (ngoại trừ C. albicans). Ngoài ra, kết quả
thử nghiệm vi pha loãng trong môi trường lỏng
ở bảng 1 cho thấy sau khi xử lý BCN với
pectinase trong 1 giờ, giá trị MIC của cao BCN
trên VSV cũng thấp hơn so với không xử lý
pectinase và xử lý pectinase ở các thời gian 3 giờ
và 5 giờ.
Kt qu kho sát điều kiện lên men BCN
bằng L. casei
Kết quả đường kính vòng kháng VSV, giá trị
MIC của cao chiết BCN không và có lên men sau
24, 48 và 72 giờ được trình bày lần lượt trong
Bảng 2 và Bảng 3. Da vào Bảng 2, chúng tôi
nhận thấy đối với tất cả các VSV khảo sát, đường
kính vòng kháng VSV của cao chiết BCN lên
men bằng L. casei 2% sau 72 giờ cao hơn so với
không lên men c ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Đồng thời, đường kính vòng kháng VSV của cao
BCN lên men với các tỷ lệ L. casei khác nhau, ở
các thời gian thu mẫu khác nhau thì khác nhau
c ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Ngoài ra, theo
Bảng 3, đối với tất cả các VSV khảo sát, so với cao
chiết BCN không lên men, giá trị MIC của cao
chiết BCN lên men bằng L. casei 2%, sau 72 giờ
đều thấp hơn đáng kể, giảm 8 lần đối với MRSA
và C. albicans, giảm 16 lần đối với MSSA. Đồng
thời cao chiết BCN lên men bằng L. casei 2%, sau
72 giờ cho giá trị MIC thấp nhất là 64 µg/mL đối
với MSSA.
Y Học TP. Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 2 * 2024
Nghiên cứu
49
Bảng 2. Kết quả đường kính vòng kháng VSV của các mẫu BCN không và có lên men bằng L. casei
Tên cao BCN/ks Loài VSV
Ký hiệu mẫu Loài VSV
MRSA
MSSA
C. albicans
Xử lý pectinase 1 giờ (g), không lên men
1P
12,67f ± 0,58
13,67h ± 0,58
10,33f ± 0,58
Lên men L. Casei 0,1% sau 24g
C0124
13,33ef ± 0,58
14,33gh ± 0,58
10,67ef ± 1,15
Lên men L. Casei 0,1% sau 48g
C0148
13,67ef ± 0,58
14,33gh ± 0,58
10,67ef ± 0,58
Lên men L. Casei 0,1% sau 72g
C0172
14,00ef ± 0,00
15,00fh ± 1,00
11,33df ± 0,58
Lên men L. Casei 0,5% sau 24g
C0524
14,67e ± 0,58
16,00eh ± 1,00
11,33df ± 1,15
Lên men L. Casei 0,5% sau 48g
C0548
16,67d ± 0,58
16,67defg ± 0,58
13,00bcde ± 1,00
Lên men L. Casei 0,5% sau 72g
C0572
17,67cd ± 0,58
18,00ce ± 1,00
13,33bcd ± 1,15
Lên men L. Casei 1% sau 24g
C124
17,00cd ± 1,00
17,33cef ± 0,58
12,67cf ± 0,58
Lên men L. Casei 1% sau 48g
C148
17,67cd ± 0,58
18,67bcd± 0,58
14,33bc ± 1,15
Lên men L. Casei 1% sau 72g
C172
18,67bc ± 0,58
19,67ac ± 0,58
15,00ac ± 1,00
Lên men L. Casei 2% sau 24g
C224
17,67cd ± 0,58
18,00ce ± 1,00
14,00bc ± 1,00
Lên men L. Casei 2% sau 48g
C248
19,67ab ± 0,58
21,00ab ± 1,00
15,33ab ± 0,58
Lên men L. Casei 2% sau 72g
C272
20,67a ± 0,58
22,00a ± 1,00
17,33a ± 0,58
Amikacin
AK
15,67 ± 0,58
24,33 ± 1,15
ND
Ketoconazol
Ke
ND
ND
24,67 ± 1,53
Các giá trị trung bình trong cùng một cột có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
ND: không thực hiện
Bảng 3. MIC (µg/mL) của cao chiết BCN không và
có lên men bằng L. casei
Ký hiệu mẫu Loài VSV
MRSA
MSSA
C.
albicans
1P
1.024
1.024
2.048
C0124
1.024
1.024
2.048
C0148
1.024
1.024
2.048
C0172
1.024
1.024
2.048
C0524
1.024
512
2.048
C0548
512
512
2.048
C0572
256
256
2.048
C124
512
512
1.024
C148
512
256
1.024
C172
256
256
512
C224
512
256
512
C248
128
128
512
C272
128
64
256
BÀN LUẬN
Việc xử lý BCN bằng pectinase trước khi
lên men đã cải thiện đáng kể hoạt tính kháng
VSV. Điều này có thể được giải thích bởi
nhiều yếu tố. Pectin trong củ Nghệ chiếm
khoảng 6,3% (kl/kl)(17), có thể làm tăng độ
nhớt và cản trở s hòa tan của curcumin
trong quá trình tiền xử lý nhiệt(5). Pectinase
phân giải pectin, giúp giảm độ nhớt và tăng
hiệu quả chiết xuất các hợp chất polyphenol
và anthocyanidin từ các glycoside tương
ứng(18). Ngoài ra, pectin liên kết với cellulose
tạo ra s gắn kết và độ cứng của thành tế
bào(19). Việc phân giải pectin có thể làm giảm
độ cứng này, tạo điều kiện thuận lợi cho quá
trình chiết xuất. So sánh với nghiên cứu của
Le Tan và cộng s, chúng tôi nhận thấy hoạt
tính kháng VSV của cao chiết cũng cải thiện
đáng kể (p < 0,05) . Điều này cho thấy tầm
quan trọng của bước tiền xử lý enzym trong
việc nâng cao hiệu quả của quá trình lên men
và chiết xuất sau đ(4). Hoạt tính kháng VSV
của BCN được cải thiện đáng kể sau khi lên
men bằng L. casei 2% trong 72 giờ. Quá trình
lên men có thể làm thay đổi cấu trúc hoặc tạo
ra các phức hợp giúp tăng độ hòa tan của
curcumin. Curcumin có thể được gắn lên cấu
trúc peptidoglycan của thành tế bào L. casei,
dẫn đến tăng hoạt tính sinh học(20). Cao chiết
BCN sau lên men cho thấy hoạt tính kháng
VSV vượt trội so với mẫu BCN ban đầu. Cụ
thể, giá trị MIC giảm 16 lần (MRSA), 32 lần
(MSSA), và hơn 16 lần (C. albicans). Theo
nghiên cứu của Mohamed và cộng s, đối với
MSSA, cao methanol 80% và cao nước của củ
Nghệ lên men bằng Trichoderma reesei có MIC
62 µg/mL, tương t kết quả nghiên cứu của
chúng tôi (MIC trên MSSA 64 µg/mL)(21).