Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ THỊ NGỌC

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT HỮU CƠ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH

TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY SINH KHỐI IN VITRO LAN THẠCH HỘC TÍA

(Dendrobium officinale Kimura et Migo)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Lớp: K48 - CNSH

Khoa: CNSH - CNTP

Khóa học: 2016 - 2020

Giảng viên hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Xuân Vũ

2. TS. Nguyễn Văn Hồng

Thái Nguyên – năm 2020

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực tập và hoàn thành luận văn, em đã nhận được sự giúp đỡ

về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân.

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm

khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm và các thầy cô trong khoa đã

giúp đỡ, tạo mọi điều kiện và chia sẻ những kinh nghiệm của mình để giúp đỡ em

trong quá trình thực tập tốt nghiệp.

Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy TS. Nguyễn Xuân Vũ và

thầy TS. Nguyễn Văn Hồng đã luôn tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập

tốt nghiệp của mình của mình.

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình đã luôn tạo mọi điều

kiện tốt nhất cả về vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành kì thực tập của mình,

cảm ơn bạn bè đã luôn ở bên cạnh cho tôi nhưng lời khuyên và động viên chân thành

nhất.

Em xin chân thành cảm ơn.

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020

Sinh viên thực tập

Đỗ Thị Ngọc

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

BAP: 6-Benzylaminopurine

Cộng sự CS:

CT CT:

Coefficient of Variation (Hệ số biến động) VC:

ĐC ĐC:

HSNC: Hệ số nhân chồi

KC: Knudson C

HSN: Hệ số nhân

HCHC: Hợp chất hữa cơ

Least Singnificant Difference Test (Sai số trung bình nhỏ nhất có ý nghĩa) LSD:

Murashige and Skoog’s MS:

Naphlene axetic acid NAA:

Nước dừa ND:

Sắn dây SD:

THT: Than hoạt tính

TB: Trung bình

TQ: trùng quế

VW: Vacin & Went

iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối

in vitro lan Thạch Hộc Tía..................................................................... 24

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ..................................................... 26

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ..................................................... 27

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của casein đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in

vitro lan Thạch Hộc Tía ......................................................................... 30

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của Myo-inositol đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh

khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ............................................................ 32

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh

khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ............................................................ 33

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của tảo spirulina đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối

in vitro lan Thạch Hộc Tía..................................................................... 35

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ..................................................... ii

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iii

MỤC LỤC ................................................................................................................. iv

Phần 1. MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1

1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1

1.2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................... 3

1.2.1. Mục tiêu tổng quát ............................................................................................ 3

1.2.2. Mục tiêu cụ thể .................................................................................................. 3

1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .............................................................................. 3

1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài .............................................................................. 3

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ............................................................................... 3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 4

2.1. Tổng quan về lan Thạch Hộc Tía ......................................................................... 4

2.1.1. Tên khoa học ..................................................................................................... 4

2.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố .......................................................................... 4

2.1.3. Giá trị dược liệu của lan Thạch Hộc Tía ........................................................... 5

2.1.4. Giá trị kinh tế .................................................................................................... 7

2.2. Ảnh hưởng của các chất hữu cơ quá trình nuôi cấy sinh khối lan Thạch Hộc Tía ...... 8

2.5. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Thạch Hộc Tía ..................................... 13

Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 18

3.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu ........................................................ 18

3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu ...................................................... 18

3.3. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................................. 18

3.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ............................................................................. 18

3.5. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 19

3.6. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 20

3.6.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ........................................... 20

3.6.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ........................................... 21

3.7. Chỉ tiêu đánh giá ................................................................................................ 23

3.8. Phương pháp xử lí số liệu................................................................................... 23

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 24

4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến khả năng sinh trưởng

và tích lũy in vitro sinh khối của lan Thạch Hộc Tía ................................................ 24

4.2. Kết quả ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ........................................................................ 26

4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng

và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. ..................................................... 27

4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của casein đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ........................................................................ 30

4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Myo-inositol đến khả năng sinh trưởng và

tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. .......................................................... 31

4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng sinh trưởng và

tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. .......................................................... 33

4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tảo spirulina đến khả năng sinh trưởng và tích

lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. ................................................................. 35

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 37

5.1. Kết luận .............................................................................................................. 37

5.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 39

PHẦN PHỤ LỤC ..................................................................................................... 43

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Trong hàng thập kỉ qua con người đã hướng tới việc sử dụng thực vật để cung

cấp các hợp chất thiên nhiên như: polysacarit, carbohydrate, protein, chất béo…để

sản xuất thuốc, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Theo WHO thì có tới 80% dân số

có xu hướng sử dụng thực vật chứa dược chất để làm thuốc và chăm sóc cho sức

khỏe. Do nhu cầu sử dụng của con người ngày càng tăng nên quá trình khai thác và

thương mại hóa cũng vô cùng sôi nổi. Tuy nhiên vấn đề đặt ra ở đây việc khai thác

và quá trình thương mại hóa không có kế hoạch dẫn đến các loài chứa dược chất bị

giảm nhanh chóng về số lượng trong tự nhiên. Thêm vào đó việc biến đổi khí hậu tác

động mạnh mẽ đến môi trường sống trong tự nhiên của chúng khiến số lượng của

chúng giảm mạnh trong tự nhiên. Điều này buộc các nhà khoa học phải tính đến việc

nghiên cứu tạo ra môi trường nhân tạo và điều kiện thuận lợi để nuôi cấy chúng trong

phòng thí nghiệm có thể đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày càng tăng của con người.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được quan tâm và nghiên cứu từ những năm 1950.

Việc nuôi cấy mô tế bào thực vật mang lại nhiều ưu điểm vượt trội so với canh tác

ngoài tự nhiên như: thời gian nuôi cấy ngắn hơn, hạn chế được tác động của môi

trường tự nhiên, tránh được ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, và tránh được việc nhiễm

các hóa chất động hại như thuốc trừ sâu, thuốc bảo vệ thực vật… Bên cạnh đó nhiều

nghiên cứu cho rằng hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học tích lũy bên trong tế

bào thực vật được nuôi cấy in vitro tương đương hoặc cao hơn nhiều so với cơ quan

tích lũy của chúng bên ngoài tự nhiên.

Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale Kimura et Migo) thuộc chi Thạch Hộc,

họ Lan (Orchidaceae), phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng rừng có độ cao 1.000 -

3.400m so với mặt biển. Thạch Hộc Tía là loại dược liệu tốt và quý hiếm có tác dụng

chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và

kháng đông máu. Trong Thạch Hộc Tía có khoảng 190 hợp chất, đặc biệt

có nhóm polysaccharides, Alkaloids là những nhóm hoạt tính chống oxi hóa có

hiệu quả cao phòng và điều trị các bệnh về đường huyết, tim mạch và ung thư. Thạch

Hộc được chế biến thành phong đấu giá xuất khẩu vào những năm 80 thế kỷ trước

đạt mức 3.000 USD/kg. Một cây Thạch Hộc tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000

VNĐ. Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên thế giới về Thạch Hộc còn rất lớn

với giá cao, đem lại lợi nhuận cho những người trồng và chế biến Thạch Hộc. Dự báo

trong 10 năm tới thị trường nội địa cần tới 15.000 tấn/năm tương đương hàng chục tỉ

USD. Tuy nhiên việc sản xuất loại dược liệu này từ trước tới nay chưa được quan tâm

đầu tư thích đáng khiến Thạch Hộc Tía có nguy cơ bị tuyệt chủng và được đưa vào

danh mục đỏ của “Sách đỏ Việt Nam”.

Với giá trị to lớn của Thạch Hộc Tía, các nghiên cứu về bảo tồn, khai thác và

phát triển loài lan này đã và đang được thực hiện mạnh mẽ. Trong đó việc ứng dụng

công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống và sản xuất sinh khối, hợp chất tự

nhiên từ lan Thạch Hộc Tía đã có những thành công nhất định. Nhiều nhà nghiên cứu

đã công bố thành công trong việc sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng nhằm nâng

cao hệ số nhân giống lan Thạch Hộc Tía [31], [ 24]. Bên cạnh đó cũng có nhiều kết

quả nghiên cứu khác nhau trong việc sử dụng các chất hữu cơ (nước dừa, khoai tây,

carot,…) với mục đích nhân giống lan Thạch Hộc Tía.

Ngoài các công trình nghiên cứu về nhân giống lan Thạch Hộc Tía, các nghiên

cứu về nhân sinh khối trên đối tượng này còn hạn chế. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu

được công bố về ảnh hưởng của chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối lan

Thạch Hộc Tía in vitro. Xuất phát từ thực tế trên, việc thực hiện “Nghiên cứu ảnh

hưởng của chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thach

Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” là cần thiết và có tính khả thi

cao. Thành công của đề tài không những tăng cường khả năng sinh trưởng và tích lũy

sinh khối lan Thạch Hộc Tía in vitro mà còn giảm thiểu tác hại có thể có trong việc

sản xuất sinh khối an toàn Thạch Hộc Tía in vitro xuất phát từ việc sử dụng chất điều

tiết sinh trưởng tổng hợp, cung cấp nguồn sinh khối lan Thạch Hộc Tía sạch sử dụng

với mục đích chăm sóc sức khỏe và làm đẹp cho con người.

1.2. Mục tiêu của đề tài

1.2.1. Mục tiêu tổng quát

Xác định ảnh hưởng của chất hữu cơ đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh

khối của lan Thạch Hộc Tía trong môi trường in vitro.

1.2.2. Mục tiêu cụ thể

Xác định được nồng độ của một số chất hữu cơ tự nhiên đến sinh trưởng và tích

lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.

Xác định nồng độ tối ưu của một số chất hữu cơ tổng hợp đến sinh trưởng và

tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía.

1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài

Đề tài sẽ xác định được nồng độ ảnh hưởng của các loại chất hữu cơ đến sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía, bổ sung cơ sở khoa học cho

việc sử dụng các hợp chất hữu cơ trong nuôi cây mô lan Thạch Hộc Tía nói riêng và

nuôi cấy mô thực vật nói chung. Đồng thời kết quả của đề tài là nguồn tài liệu khoa

học có giá trị có thể tham khảo cho các nghiên cứu trên đối tượng này trong tương lai.

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Thực hiện đề tài nghiên cứu giúp cho sinh viên có cơ hội củng cố lại kiến thức

cũ , học hỏi được những kiến thức mới, và tích lũy được kinh nghiệm cho bản thân.

Kết quả của đề tài có thể dùng làm cơ sở khoa học cho quá trình nhân sinh khối

các loài thực vật chứa dược chất quy mô lớn.

Góp phần bảo tồn nguồn gene, cũng như thúc đẩy phát triển nuôi cấy cây dược

liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên

cứu khoa học.

Phần 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về lan Thạch Hộc Tía

Theo từ điển Bách khoa dược học của Việt Nam (1999) đã ghi “Thạch Hộc”

(Dendrobium nobile Lindt) có tên khác là Kim Thạch Hộc [28].

Thạch Hộc sống phụ sinh trên thân gỗ hoặc trên các vách đá ở vùng rừng có độ

ẩm cao. Hiện nay trên khắp thế giới có khoảng 1.400 loài Lan, ở Trung Quốc có

khoảng 81 loài. Trong chi Thạch Hộc cũng có rất nhiều loài được dùng để chữa bệnh.

Tại Trung Quốc, chi Thạch Hộc có khoảng 12 loài phụ và 14 loài chính, trong đó có

tới 11 loài được xem là dược liệu quý. Đặc biệt, Thạch Hộc Tía là loài được đánh giá

cao nhất và cũng có giá trị kinh tế lớn nhất.

Tại Việt Nam cũng có nhiều loài Lan. Chúng được phân bố rộng rãi, trải dài từ

Bắc vào Nam. Có nhiều loại sắp hoặc đã bị tuyệt chủng, một số khác thì đang được

liệt vào sách đỏ cần phải được bảo tồn. Trong số những loài này, chúng ta cần kể đến

loài lan Thạch Hộc Dendrobium nobile Lindl. Nó phân bố chủ yếu ở vùng trung du

và miền núi phía Bắc, được nghiên cứu nhân giống nhằm mục đích làm thuốc.

2.1.1. Tên khoa học

Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) là một loài thuộc chi

Dendrobium, họ lan (Orchidaceae).

2.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố

Đặc điểm hình thái

Là cây phụ sinh trên thân gỗ hay vách đá, cao 30-50 cm, thường mọc thành bụi.

Thân hơi dẹt, có rãnh dọc, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5-3 cm.

Lá hình thuôn dài, phía cuống tù, gần như không cuống, ở đầu hơi cuộn hình

nón, dài 12cm, rộng 2-3cm trên có 5 gân dọc. Lá mọc so le thành dãy đều ở hai bên thân.

Hoa to màu hồng, mọc thành chùm trên những cuống dài, ở họng hoa có những

điểm màu tím. Hoa rất đẹp, to, màu hồng hay điểm hồng. Cánh môi hình bầu dục

nhọn, dài 4-5cm, rộng 3cm cuộn thành hình phễu trong hoa, ở nơi họng hoa điểm

màu tía [5], [13].

Quả nang hình thoi, khi khô tự mở. Hạt nhiều, mùa hoa tháng 2-4, mùa quả:

tháng 4-6

Đặc điểm phân bố

Thạch Hộc được phân bố ở Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanma và nhiều

nước vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [13].

Ở Trung Quốc chi Thạch Hộc chủ yếu phân bố ở các tỉnh: Chiết Giang, Quảng

Tây, Hồ Nam, Vân Nam, Quý Châu.

Thạch Hộc khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã đã

được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt

chủng” được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên đã cạn kiệt, cấm thu

hái và buôn bán.

Trong tự nhiên Thạch Hộc thường sinh trưởng trong môi trường có độ ẩm

khoảng 70%, lượng mưa khoảng 900 – 1.500mm, nhiệt độ từ 12 – 18ºC. Do đó nó

thường tập trung ở các phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và các vách đá chua.

2.1.3. Giá trị dược liệu của lan Thạch Hộc Tía

Thành phần hóa học

Trong Thạch Hộc có chất nhầy và chất ankaloit gọi là dendrobin khoảng 0,3%

có CT thô C16H25O22. Theo báo cáo của Viện nghiên cứu y học, hệ dược học Bắc

Kinh năm 1958 thì trong Thạch Hộc Dendrobium nolile có 0,05% ankaloit, không có

saponin và không cho phản ứng tanin đới [13].

Tác dụng dược lý

Năm 1936, hai tác giả Kinh Lợi Bâu và Lý Đăng Bảng đã báo cáo dùng cao

Thạch Hộc chế bằng rượu 1ml = 4g dược liệu tiến hành thí nghiệm tác dụng giảm sốt

thì thấy với liều 2,5ml trên 1kg thể trọng, tiêm vào màng bụng thỏ đã được gây sốt

bằng dung dịch 0,03% trực trùng coli (2,3ml đối với 1kg thể trọng) không thấy có tác

dụng giảm sốt [13].

Trên tràng thỏ cô lập, với nồng độ thấp (0,0001-0,5%) thì thấy có tác dụng kích

thích, sự co bóp được tăng cường. Nhưng với nồng độ cao: 1-10% thì lại thấy tác

dụng ức chế [13].

Đối với tim cô lập của loài cóc Bugo sp. (dùng dung dịch Locke-Ringer) bất kể

nồng độ như thế nào đều thấy sử dụng ức chế co bóp. Hiện tượng ức chế này hình

như liên quan với thần kinh phó giao cảm vì thuốc chế từ thạch học đều có tác dụng

làm giảm ảnh hưởng của pilocacpin, atropin và adrenalin trên cơ ruột, trên tim. Tuy

nhiên tác dụng ức chế đối với adrenalin có kém hơn. Khi tiêm dung dịch Thạch Hộc

trên tim của loài cóc thấy dù nồng độ nào từ 0,01-10% đều không thấy ảnh hưởng

[13].

+ Tăng cường khả năng miễn dịch: Nghiên cứu về dược lý hiện đại cho biết,

Thạch Hộc có tác dụng tốt về chống mệt mỏi và chống chịu ngạt oxy [13].

+ Hệ gan lợi mật: Thạch Hộc có tác dụng lợi mật, tư dưỡng can âm, là dược

thảo tốt điều trị các bệnh gan, mật, chữa trị viêm gan, viêm túi mật, sỏi mật [13].

+ Kháng phong thấp: Thạch Hộc có khả năng tư dưỡng âm dịch, bôi trơn các

khớp, giúp cho gân cốt khỏe, khớp nối thanh thoát, có hiệu quả tăng cường kháng

phong thấp [13].

+ Giảm đường huyết, mỡ máu: Kết quả nghiên cứu lâm sàng cho biết Thạch

Hộc không những có hoạt tính tăng cường Insulin, đồng thời có khả năng giảm đường

huyết giúp cho máu hoạt động bình thường, xúc tiến tuần hoàn, giãn huyết quản, giảm

cholesterol và triglyceride [13].

+ Kháng u bướu: Thạch Hộc có khả năng tiêu diệt một số tế bào ác tính của

ung thư phổi, ung thư buồng trứng, bệnh máu trắng với hoạt tính kháng ung thư tương

đối mạnh. Trong lâm sàng sử dụng Thạch Hộc rỉ sắt làm thuốc điều trị bổ sung các

bệnh ung thư ác tính, cải thiện tình trạng của người bệnh, giảm nhẹ tác dụng phụ của

các liệu pháp xạ trị, hóa trị, tăng sức miễn dịch, nâng cao chất lượng cuộc sống, kéo

dài tuổi thọ [13].

+ Bảo vệ mắt: Thạch Hộc có công năng dưỡng âm, là thảo mộc quý bảo vệ mắt,

có hiệu quả tương đối tốt để chữa bệnh lòa của tuổi già, bảo vệ mắt cho trẻ em.

+ Tự dưỡng da: Khi vào tuổi trung niên, âm dịch sa sút, da lão hóa, nám da và

nhăn da. Thạch Hộc có chất nhờn, có tác dụng tư nhuận dinh dưỡng da [13].

+ Kháng suy não: Thạch Hộc là thần dược có tác dụng trẻ hóa cơ thể. Trong

Thạch Hộc có nhiều nguyên tố vi lượng quý có tác dụng chống lão hóa tốt hơn nhiều

so với các loại thuốc khác [13]

+ Thạch Hộc ngoài tác dụng trên thì nó còn được sủ dụng như một loại thực

phẩm bổ vào để bồi bổ sức khỏe. Chẳng hạn như nấu súp với hồng sâm, bách sa có

tác dụng lợi phổi, sinh tân. Bên cạch đó với những kĩ thuật hiện đại ngày nay Thạch

Hộc còn được sự dụng dưới dạng trà thảo mộc, cháo dinh dưỡng ăn liền bổ sung

Thạch Hộc. Ngoài ra ngành y học phát triển không ngừng thì hiện nay cũng có rất

nhiều dòng sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ Thạch Hộc. Chúng là

những sản phẩm bổ dưỡng và cũng an toàn cho sức khỏe, do đó bạn có thể tham khảo

và sử dụng.

2.1.4. Giá trị kinh tế

Trong các loại hoa phong lan được trồng tại Việt Nam thì lan công nghiệm cho

hiệu quả kinh tế tương đối cao. Giá của một chậu lan có thể cho thu nhập từ 100.000

1.000.000 đồng/cây [4].

Giá xuất khẩu vào những năm 80 đạt mức 3.000 USD/kg. Ở Đài Loan giá từ

1.000 -3.000USD/kg. Ở Trung Quốc khoảng 30 đến 60 triệu VNĐ/kg. Giá 1 cây

Thạch Hộc tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ, 1 ha trồng 1 triệu cây

Thạch Hộc, có thể thu được 25-30 tỷ trong 3 năm. Nhu cầu của Trung Quốc và các

nước trên thế giới về Thạch Hộc còn rất lớn với giá cao, đem lại siêu lợi nhuân cho

những người trồng và chế biến Thạch Hộc. Nhu cầu thị trường Trung Quốc hiện nay

cần khoảng 2.000 tấn/năm, nhưng mới sản xuất được 200 tấn/năm. Dự báo trong 10

năm tới thị trường nội địa cần tới 15.000 tấn/năm tương đương hàng chục tỉ USD [13].

Với loài hoa chủ lực là Dendrobium, Thái Lan xuất khẩu đạt doanh thu gần 600

triệu USD mỗi năm. Theo thống kê của Bộ Nông nghiệm Hoa Kỳ, năm 2000, tổng

sản lượng bán ra thị trường tương đương 100 nghìn USD. Bên cạnh đó, ở các nước

phát triển như: Anh, Mỹ, Đức, Ý đều nhập khẩu rất nhiều phong lan [26].

2.2. Ảnh hưởng của các chất hữu cơ quá trình nuôi cấy sinh khối lan Thạch Hộc

Tía

Trong nuôi cấy sinh khối thực vật nói chung và lan Thạch Hộc Tía nói riêng

chịu sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau: yếu tố vật lý (nhiệt độ, ẩm độ, ánh

sáng,…) và yếu tố hóa học (thành phần môi trường nuôi cấy). Trong thành phần môi

trường nuôi cấy có nhiều yếu tố khác nhau: khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, chất

điều tiết sinh trưởng và chất hữu cơ. Trong đó, chất hữu cơ là có vai trò rất quan trong

và được sử dụng nhiều trong nuôi cấy sinh khối, đặc biệt là nuôi cấy sinh khối các

dòng thực vật sử dụng làm thuốc, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm. Các chất hữu cơ

đã và đang được nghiên cứu phục vụ trong nuôi cấy mô tế bào gồm

* Nước dừa

Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cho biết trong nước dừa có nhiều protein,

carbohydrate, calcium, các hợp chất sắt, đường, và một số vitamin như thiamin,

riboflavin, niacin, acid ascorbic. Các chất này có thể đóng vai trò quan trọng trong

việc thúc đẩy hoạt động tăng trưởng và phân chia tế bào. Tác dụng tích cực của nước

dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận.

Ngoài ra nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và

chất kích thích sinh trưởng.. Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 - 20% thể tích

môi trường, kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi [9]. Nước dừa là thành phần dinh

dưỡng hữu cơ được bổ sung trong nhiều môi trường nuôi cấy mô đặc biệt đối với các

loài phong lan. Cụ thể như sau:

- Trong nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ liên quan đến quá

trình sinh trưởng và phát triển của cây lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) in vitro

nhằm nghiên cứu về ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển

của chồi lan hài hồng. Trong các nồng độ nước dừa được khảo sát, nồng độ 200 ml/l,

thích hợp nhất cho sự tạo chồi, tạo lá và tăng trưởng chiều cao của chồi. Khi tăng

nồng độ nước dừa lên trên 200 ml/l, quá trình tạo chồi bị hạn chế. Trong nghiên cứu

này, số lượng chồi đạt cao nhất (3,2 lầncấy) ở CT có bổ sung 200 ml/l nước dừa. Từ

kết quả trên có thể thấy, bổ sung nước dừa có khả năng kích thích quá trình sinh

trưởng và khả năng tạo chồi của lan hài hồng nuôi cấy in vitro. Điều này được giải

thích bởi trong các dịch chiết này có chứa các chất có lợi cho sự sinh trưởng phát

triển của cây như các amino acid, các loại vitamin, đường và các chất kích thích sinh

trưởng (nhóm cytokinin), cũng như các chất khoáng vô cơ như photpho, magiê, kali

và natri [2].

- Kết quả cho thấy, khi môi trường không bổ sung ND (CT1), các chỉ tiêu số lá

TB (trung bình)/chồi và chiều dài lá TB chỉ đạt lần lượt là 2,27 lá và 1,4cm. Khi bổ

sung ND với các nồng độ 5% (CT2), các chỉ tiêu số lá và chiều lá đã tăng rõ rệt với

kết quả là 3,1 lá; 1,6cm. Tốc độ lớn của chồi lan nhanh nhất khi môi trường có bổ

sung 10% ND, thể hiện ở chỉ số số lá TB/chồi là cao nhất (3,63 lá/chồi) và chiều dài

lá TB là 2,7cm. Khi tăng nước dừa lên đến nồng độ 15%, 20%, các chỉ tiêu về số lá

và chiều dài lá TB cao hơn CT1 (ĐC) nhưng vẫn thấp hơn CT3 ở mức có ý nghĩa,

đúng với nghiên cứu của Parisa (2014) [43] khi bổ sung nước dừa làm tăng khả năng

nhân nhanh giống lan Phalaenopsis lai. Vậy môi trường MS + 10% ND là thích hợp

nhất cho nuôi lớn chồi nghiên cứu [22].

* Dịch nghiền chuối

Dịch nghiền chuối có chứa nguồn chất sơ lành mạnh, giàu kali, Vitamin B6,

Vitamin C, chất chống oxy hóa và các phytonutrients. Theo nghiên cứu của Benrt

(1975) cho rằng dịch nghiền chuối có tác dụng kích thích chồi với khả năng tạo

protocorm và sinh trưởng chồi. Theo Hoàng Thị Giang và cs trong nghiên cứu nhân

giống in vitro và nuôi trồng lan hài quý đã nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền

chuối đến hệ số nhân của lan hài với các nồng độ: 50, 100, 120, 150g/l môi trường.

Kết quả khi bổ sung 100g/l chuối xanh hệ số nhân chồi cao làm chiều cao chồi thấp

chỉ đạt 2,67cm. Qua quan sát thấy CT 4, 5 chồi Thạch Hộc có hiện tượng ra rễ, chất

lượng chồi tốt; thân mập, lá xanh đậm, phát triển tốt [7].

* Dịch chiết của khoai tây

Dịch chiết của khoai tây có chứa cacbonhydrat dưới dạng saccaroza, glucose và

fructose, rất giàu amino axít acid amin như lysine, methionine, threonin, tryptophan,

vitamin c, vitamin B6, các muối khoáng (K, Fe, Mg…). Dịch chiết khoai tây thường

được bổ sung vào môi trường vi nhân giống hoa lan. Vì vậy dịch chiết khoai tây được

sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật khác nhau cụ

thể như:

- Nghiên cứu nhân giống lan Thạch Hộc từ hạt bằng phương pháp nuôi cấy mô

có sử dụng dịch nghiên khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm mục đích

tăng thêm hàm lượng các cacbonhydrat, acid amin, và vitamin. Từ kết quả của đề tài

cho thấy với nồng độ dịch chiết khoai tây 50g/l thích hợp cho hệ số nhân nhanh chồi

tăng lên đáng kể [9].

- Ngoài ra một số môi trường nuôi cấy các loại lan khác như: phi diệp, lan kim

tuyến,… cũng sử dụng dịch chiết khoai tây với nồng độ 100ml/l bổ sung trong môi

trường nền trong quá trình nghiên cứu và nhân giống [20], [14].

* Casein

Casein được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô và tế

bào thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung amino acid.

- Ảnh hưởng của casein hydrolysate lên khả năng tăng sinh khối và giảm sử

dụng nguồn nitrate vô cơ trong qui trình sản xuất sinh khối cây lan kim tuyến Casein

hydrolysate với các nồng độ khác nhau (0, 1, 3, 5, 7 g/L) được bổ sung vào môi trường

nuôi cấy đã cho thấy hiệu quả đối với sự gia tăng sinh khối lan kim tuyến. Sau 6 tuần

nuôi cấy, các chỉ tiêu tăng trưởng của cây được theo dõi, ghi nhận. Kết quả cho thấy

nồng độ casein hydrolysate thích hợp cho sự tăng trưởng của cây lan kim tuyến khi

bổ sung vào môi trường nuôi cấy là 5g/l [21].

* Myo-inosytol

Myo-inositol (inositol) là một carbohydrate giống như đường được tạo ra bởi

hầu hết các loại cây. Nó có vị đã được khảo nghiệm bằng một nửa vị ngọt của đường

(sucrose). Myo-inositol (inositol) là một thành phần quan trọng đối với sự tăng trưởng

và phát triển bình thường của cây. Inositol cũng là một phân tử thiết yếu để sản xuất

thành tế bào thực vật. Vách tế bào thực vật được làm chủ yếu bằng các chuỗi đường

được gọi là polysaccharides. Một dạng oxy hóa của inositol là đường phổ biến và quan

trọng nhất liên quan đến việc sản xuất polysaccharide cho thành tế bào. Ngoài việc tổng

hợp thành tế bào, các đường dẫn xuất inositol này cung cấp các thành phần quan trọng

khác liên quan đến lưu trữ, vận chuyển và phát triển.

- Với tầm quan trọng của Myo-inositol được sử dụng trong nhiều môi trường

phục vụ cho nhanh nhanh sinh khối một số loài thực vật khác nhau như:

+ Tăng hệ số nhân nhanh chồi chuối Laba (Musa SP.) nuôi cấy in vitro bằng

sử dụng ánh sáng, myo-inositol và adenin sulphate. Khảo sát ảnh hưởng của myo-

inositol đến khả năng nhân nhanh sinh khối chồi. Kết quả cho thấy việc sử dụng Myo-

inositol với nồng độ 0,1g/l thu được chồi có chiều cao vượt trội so với các nồng dộ

thử nghiệm khác. Ngoài ra, Myo-inositol còn có tác động tích cực đến quá trình hình

thành lá của chồi [6].

Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của

mô và tế bào. Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh

vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp.

- Ngoài ra dịch chiết nấm men cũng được sử dụng rộng rãi trong môi trường

nuôi cấy mô tế bào thực vật phổ biến như:

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự phát triển của cây lan

gấm (A. roxburghii) được thược hiện nhằm đánh giá vai trò của dịch chiết nấm men

trong môi trường nuôi cấy cây lan gấm không có chất điều hòa. Dịch chiết nấm men

được khảo sát với 3 nồng độ khác nhau 1, 3, 5 g/l đã cho thấy những tác động tích

cực lên sự phát triển sinh khối của cây lan gấm. Sau 8 tuần nuôi cấy, mẫu ban đầu có

khối lượng 0,3 – 0,4 g/cây được cấy trên môi trường Albert’s bổ sung hàm lượng dịch

chiết nấm men riêng lẻ thích hợp cho cây lan gấm phát triển là 1 g/l cho khối lượng

tươi và khối lượng khô đạt 0,56 g/cây và 0,074 g/cây [23]. Môi trường nuôi cấy bao

gồm các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin. Việc bổ sung cao nấm

men vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng hàm lượng nitơ trong môi trường có chứa

hàm lượng nitơ tương đối thấp hoặc không có nitơ để thúc đẩy sự tăng trưởng của

cây trồng. Sau 6 tuần nuôi cấy, mẫu cấy trên các môi trường có bổ sung cao nấm men

tăng trưởng tốt hơn so với môi trường không bổ sung cao nấm men. Kết quả ghi nhận

được cho thấy, cây lan kim tuyến tăng trưởng tốt nhất trên môi trường Albert’s chứa

muối nitrate theo các tỉ lệ (100%; 75%; 50% và 25%) kết hợp bổ sung 5 g/L cao nấm

men. Kết quả cho thấy lan kim tuyến tăng cao về lượng sinh khối [21].

* Tảo spirulina

Tảo spirulina: Hàm lượng protein trong Spirulina thuộc vào loại cao nhất trong

các thực phẩm hiện nay, 56%-77% trọng lượng khô, cao hơn 3 lần thịt bò, cao hơn 2

lần trong đậu tương...

- Hàm lượng vitamin rất cao. Cứ 1 kg tảo xoắn Spirulina chứa 55 mg vitamin

B1, 40 mg vitamin B2, 3 mg vitamin B6, 2 mg vitamin B12, 113 mg vitamin PP,

190 mg vitamin E, 4.000 mg caroten trong đó β-Caroten khoảng 1.700 mg (tăng

thêm 1.000% so với cà rốt), 0,5 mg axít folic,inosit khoảng 500-1.000 mg.

- Hàm lượng khoáng chất có thể thay đổi theo điều kiện nuôi trồng, thông

thường sắt là 580–646 mg/kg(tăng thêm 5.000% so với rau chân vịt), mangan 23–

25 mg/kg, Mg 2.915-3.811/kg, selen là 0,4 mg/kg, canxi, kali, phốtpho đều khoảng

là 1.000-3.000 mg/kg hoặc cao hơn (hàm lượng canxi tăng hơn sữa 500%).

- Phần lớn chất béo trong Spirulina là axít béo không no, trong đó axít

linoleic 13.784 mg/kg, γ-linoleic 11.980 mg/kg. Đây là điều hiếm thấy trong các thực

phẩm tự nhiên khác.

- Hàm lượng cacbon hydrat khoảng 16,5%, hiện nay đã có những thông tin

dùng glucoza chiết xuất từ tảo Spirulina để tiến hành những nghiên cứu

chống ung thư.

- Tảo Spirulina có chứa phong phú các axít amin cần thiết như lysin, threonin.

- Với hàm lượng dinh dưỡng cao trong tảo nên hiện nay tảo cũng được sử dụng

như một chất hữu cơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật cụ thể như:

+ Khảo sát ảnh hưởng của tảo spirulina lên quá trình sinh trưởng và phát triển

của chồi lan hài hồng nuôi cấy in vitro. Tảo spirulina được bổ sung ở các nồng độ 10

mg/l, 30 mg/l, 50 mg/l và 70 mg/l. Ảnh hưởng của tảo spirulina lên quá trình sinh

trưởng và phát triền của chồi lan hài hồng nuôi cấy in vitro. Kết quả cho thấy, bổ sung

của tảo spirulina có tác động tốt đến sự sinh trưởng và phát triển của chồi lan hài hồng

in vitro. Khi tăng nồng độ tảo spirulina, các chỉ tiêu theo dõi như số lá, số chồi, chiều

cao chồi và tỷ lệ sống của mẫu cấy cũng tăng theo tương ứng và đạt tốt nhất khi bổ

sung 50 mg/l bột tảo. Nếu tiếp tục gia tăng nồng độ tảo cao hơn 50 mg/l, các chỉ tiêu

tăng trưởng trên bắt đầu giảm. Bột tảo spirulina làm gia tăng tỷ lệ sống của mẫu cấy

và đạt 100%, đây là chỉ tiêu sinh trưởng rất quan trọng trong giai đoạn nhân chồi cây

lan hài hồng. Điều này có thể giải thích, trong thành phần của tảo có chứa nhiều amino

acid tự do, các loại vitamin như vitamin A, vitamin B và vitamin E làm gia tăng quá

trình trao đổi chất, chống hóa nâu của mẫu cấy, giúp mẫu cấy hấp thụ dưỡng chất tốt

hơn làm cho mẫu cấy sinh trưởng và phát triển mạnh làm gia tăng tỷ lệ sống [2].

2.5. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Thạch Hộc Tía

Năm 2014, Parisa Shekarriz nhân giống hạt lan Hồ Điệp trên môi trường

1/2MS bổ sung 100ml/l nước dừa, pepton giúp tăng tỷ lệ nảy mầm của lan Hồ

Điệp [29].

Năm 1999, Mai Thị Tâm và cs nghiên cứu trên giống lan Dendrobium E.R. Đối

tượng nghiên cứu là chồi và quả của giống Dendrobium E.R, tạo ra nguồn vật liệu

khởi đầu là protocorm. Môi trường cơ bản là VW có cải tiến với 1% sacarose, 15%

nước dừa và các hàm lượng khác nhau của BA. Kết quả cuối cùng tìm ra được các

môi trường thích hợp cho quá trình tạo nguồn vật liệu khởi đầu, quá trình nhân nhanh

tạo cây hoàn chỉnh [24].

Cũng trên giống này, với vật liệu là các protocorm đều, xanh mập, có mầm chồi,

nghiên cứu đã xác định được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng, phụ gia

như đường saccarose, nước dừa, NAA, axit Nicotinic đến sự phát sinh chồi từ

protocorm và sinh trưởng của cây. Trên môi trường VW, tìm ra hàm lượng các

chất bổ sung hợp lý giúp cây sinh trưởng tốt, tăng cường sức sống và tạo cây hoàn

chỉnh.

Năm 2003, Nguyễn Quang Thạch và cs nghiên cứu trên giống lan hồ điệp

(Phalaenopsis) với quả sau khi thụ phấn trên 100 ngày là đủ độ chín thuần thục và có

khả năng nảy mầm tốt nhất (95 - 100 %), thời gian khử trùng thích hợp cho tỷ lệ mẫu

nhiễm thấp, mẫu sạch sống cao là khử trùng kép 5 phút + 1 phút việc sử dụng nguồn

vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng (lá non, mắt ngủ trên phát hoa và đỉnh hoa)

và cơ quan sinh sản hữu tính (hạt), kết quả VW + 100 ml nước dừa + 10 g đường

saccarose + 6,5g agar +30 g khoai tây + 30 g cà rốt + 1g pepton thích hợp cho nhân

cụm chồi in vitro [22].

Năm 2007, Nguyễn Thị Tâm và cs nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi

trường và giá thể đến sinh trưởng của cây lan Dendrobium hybrid in vitro. Sử dụng

môi trường nền là VW (Vacin Went) + đường sacaroza 20 g/l + agar 9g/l + nước dừa

100 ml/l + than hoạt tính 2 g/l. Nồng độ BAP 2 mg/l và kinetine 3 mg/l thích hợp cho

sự sinh trưởng và phát triển của cây lan Dendrobium hybrid, cho hệ số tạo chồi và lá

mới cao nhất (sau 6 tuần nuôi cấy). Khi bổ sung kết hợp NAA 0,3 mg/l với BAP 2

g/l cho hệ số nhân chồi và tạo lá cao nhất (1,80 và 2,04). Bổ sung NAA 0,3 mg/l có

ảnh hưởng tốt đến khả năng ra rễ và phát triển của bộ rễ (số rễ đạt 15,83 cái/cây và

chiều dài rễ đạt 2,3 cm). Khi ra cây trên 3 nền giá thể: rêu ngoại, rêu ngoại: xơ dừa

(1:1), xơ dừa đều cho tỷ lệ sống khá cao (57,89 % - 67,67 %). Trong đó, giá thể rêu

ngoại đạt tỷ lệ sống cao nhất 67.67 % [25].

Năm 2009, Nguyễn Thanh Tùng và cs, nghiên cứu khả năng nhân nhanh in vitro

cây Mỹ Dung Dạ Lan Vanda denisoniana benson. Đã xác định được: Khử trùng quả

Mỹ Dung Dạ Lan bằng HgCl2 với nồng độ 0,5% trong 10 phút cho tỷ lệ sống và tỷ

lệ không nhiễm cao (81,82 %). Môi trường MS bổ sung kinetine 0,5 -1,5 mg/l cho tỷ

lệ nảy mầm cao (>75 %), cao nhất ở nồng độ 0,5 mg/l (đạt 92,31 %). Nồng độ NAA

tối ưu cho quá trình nảy mầm của hạt là từ 0,1-0,5 mg/l (tỷ lệ nảy mầm > 85%). MS

+BAP 0,5 mg/l cho hệ số nhân cao nhất (2,7 chồi/protocorm). Nồng độ kinetine tối

ưu cho nhân nhanh Mỹ Dung Dạ Lan là 0,5 mg/l [27].

Năm 2010, tác giả Ngô Xuân Bình và cs nghiên cứu kĩ thuật nhân giống phong

lan Đuôi Chồn (Rhynchostylis retusa blume [1]) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế

bào. Xác định được môi trường MS là tối ưu nhất cho sự nảy mầm của hạt lan. Đồng

thời, nhóm tác giả cho rằng cytokine có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả tái sinh hạt. Tuy

nhiên, khi sử dụng kết hợp giữa BA và Kinetine với tỷ lệ kinetine 0,1 mg/l + BA 0,3

mg/l cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất đạt 86.7 % [1].

Năm 2011, Hoàng Thị Nga và cs, xây dựng quy trình nhân nhanh giống địa lan

Hồng Hoàng (Cymbidium iridioides) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào đã cho kết quả

các chồi non có kích thước từ 4-6 cm hoặc hạt được sử dụng làm mẫu cấy, môi trường

để khởi động mẫu cấy là: MS + saccarose 20 g/l + agar 0,65 g + BA 1,5 ppm (hoặc 2

ppm Kinitine/l), để gieo hạt là: MS + sacarose 10 g/l + pepton 1 g + than hoạt tính 1

g/l + agar 6,5 g/l. Môi trường thích hợp để nuôi cấy lát mỏng đã xác định là: MS + 1

ppm K + sacarose 20 g/l + Kinitine 1 ppm (hoặc BA 0,5 ppm) + agar 6,5 g/l. Nghiên

cứu đã xác định được môi trường tối thích để tạo cây hoàn chỉnh là MS + than hoạt

tính 0,1 g/l+ sacarose 25 g/l [15].

Năm 2011, Nguyễn Văn Song, nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium

chysotoxum) – một loài lan có nguy cơ tuyệt chủng. Kết quả đã chỉ ra rằng nguyên

liệu sử dụng là quả lan 3 tháng. Môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh

protocom của hạt là môi trường MS cơ bản có sucarose 20 g/l + agar 8 g/l + ND 150

ml/l + BAP 2,0 mg/l. Môi trường nhân nhanh protocom tốt nhất là MS cơ bản có

sucarose 20 g/l + agar 8 g/l + ND 150 ml/l + BAP 2,0 mg/l. Môi trường MS cơ bản

có sacarose 30 g/l + agar 8 g/l + THT 1 g + ND 150 ml/l + BAP 2,0 mg/l + NAA 1,0

mg/l thích hợp cho tái sinh chồi từ protocom và sinh trưởng của chồi in vitro. Môi

trường cơ bản có sucarose 20 g/l + agar 8 g/l + ND 150 ml/l + NAA 1,0 mg/l là thích

hơp cho ra rễ của chồi in vitro [16].

Năm 2012, Nguyễn Thị Sơn và cs, nhân giống in vitro loài lan Dendrobium

fimbriatumhook (Hoàng thảo Long nhãn). Kế quả nghiên cứu đã chỉ rõ: Nguyên liệu

sử dụng là quả lan 3 tháng tuổi. Môi trường thích hợp cho nảy mầm là và phát sinh

protocom của hạt là môi trường MS + ND 100 ml/l + saccarose 10 g/l + agar 6,0 g/l

môi trường. Môi trường nhân nhanh protocom tốt nhất là môi trường KC + ND 100

ml/l + sacarose 10 g/l + khoai tây 80 g/l + agar 6,0 g/l môi trường. Môi trường MS +

ND 100 ml/l + sacarose 20 g/l + chuối chín 60 g/l + agar 6,0 g/l môi trường là thích

hợp cho nhân nhanh chồi in vitro. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + THT 1 g/l

+ agar 6,0 g/l môi trường [17].

Năm 2013, Vũ Ngọc Lan và cs, nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan bản địa

Dendrobium nobile Lindl (Thạch Hộc) nhằm bảo tồn và phát triển loài lan quý thuộc

chi Hoàng thảo, có giá trị thẩm mỹ dược liệu cao, đang có nguy cơ tuyệt chủng. Kết

quả cho thấy nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi, môi trường gieo

hạt là MS + ND 100 ml + saccarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường. Trong nhân in

vitro, môi trường nhân nhanh protocom tối ưu là KC + ND 100 ml + sacarose 10 g/l

+ agar 6,0 g/l môi trường; nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS + ND 100ml/l +

sacarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường. Môi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh là

RE + sacarose 10g/l + THT 0,6 g/l, cường độ chiếu sáng 2300 lux [12].

Năm 2014, Nguyễn Thị Sơn và cs, nhân giống in vitro lan Dendrobium

offcinale Kimura et Migo (Thạch Hộc Thiết bì). Một loài lan quý được sử dụng làm

thuốc và thực phẩm chức năng chữa bệnh tiểu đường và các bệnh nan y đang được

thương mại hóa rộng rãi trên thế giới. Kết quả nghiên cứu đã chỉ rõ: Nhân giống bằng

gieo hạt trên môi trường VW + saccarose 10 g/l + agar 6 g/l + ND 100 ml/l môi

trường. Nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + ND 100 ml/l + sacarose

20g/l + agar 6g/l + chuối chín 60 g/l môi trường. Nhân giống vô tính thông qua nuôi

cấy đoạn thân mang mắt ngủ sử dụng thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên

môi trường MS + sacarose 20 g/l + ND 100 ml/l + BA 0,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l +

agar 6 g/l môi trường. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10 g/l sacarose + agar

6 g/l + THT 0,3 g/l + NAA 0,5 mg/l môi trường [19].

Năm 2017, Hoàng Thị Hằng và cs, xây dựng quy trình nhân giống in vitro lan

Thạch Hộc Tía trên môi trường hưu cơ chứa phân trùn quế và kết hợp với bột sắn

dây. Nhằm mục đích hoàn thiện quy trình nhân giống Thạch Hộc Tía trong môi trường

hữu cơ. Kết quả cho thấy rằng: Hàm lượng phân trùn quế thích hợp cho môi trường

cơ bản trong nuôi cấy in vitro lan Thạch Hộc Tía là: 5% TQ + 20g/l glucose + 8g/l

agar. Môi trường bổ sung: 10g/l SD + 5% TQ + 20g/l glucose + 8g/l agar. Thử nghiệm

ra rễ là: 5g/l SD + 5% TQ + 20g/l glucose + 8g/l agar [11].

Năm 2017, Nguyễn Thị Diệu Hoa, nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều

tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và biện pháp kỹ thuật đến sinh trưởng của

giống lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) tại Thái Nguyên.

Kết quả cho thấy: môi trường nền được sử dụng là: MS + 6,3g/l Agar + 20g/l đường

+ 0,1g/l Myo + 30g/l khoai tây + 30g/l cà rốt + 100ml/l nước dừa sau đó được tiến

hành bổ sung hàm lượng các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau [10].

Năm 2018, Mai Thị Phương Hoa và cs, nuôi cấy protocorm lan Thạch Hộc thiết

bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) in vitro. Kết quả cho thấy nồng độ javel

75% trong thời gian 20 phút là thích hợp nhất để khử trùng mẫu lan Thạch Hộc thiết

bì. Môi trường C có bổ sung NAA 0,5mg/l, đường sucrose 30g/l là môi trường thích

hợp tạo protocorm. Nhân sinh khối protocorm tốt nhất trên môi trường C có bổ sung

NAA 0,5mg/l, BA 0,1mg/l, đường sucrose 30g/l và nước dừa 10% [8].

Phần 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Giống hoa lan Thạch Hộc Tía Cao Bằng

- Vật liệu nghiên cứu: Chồi lan Thạch Hộc

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ (nước dừa, chuồi,

khoai tây, casein, myo-inosytol, cao nấm men, tảo spirulina) nhằm xác định ảnh

hưởng của chúng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thach

Hộc Tía

3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu

- Địa điểm thực hiện nghiên cứu: Phòng thí nghiệm: Công nghệ Tế bào, Viện

khoa học Sự sống

- Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 2/2020 đến 7/2020

3.3. Điều kiện nuôi cấy

Thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm nuôi cấy vô trùng với các

điều kiện cụ thể sau:

- Môi trường nuôi cấy có pH = 5,6 – 5,8

- Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 20 0 C -25 0 C

- Cường độ ánh sáng 2000 - 3000lux, quang chu kì 16h sáng/8h tối

- Môi trường dinh dưỡng sử dụng để nuôi cấy mô lan Thạch Hộc Tía được khử

trùng ở 1210 C và 1atm 30 phút.

- Dụng cụ nuôi cấy được khử trùng ở 1210C , 1atm trong 20 phút.

3.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

- Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị sử dụng trong nuôi cấy in vitro lan Thạch Hộc Tía : cân phân tích,

máy lọc nước, máy đo pH, bếp gas, nồi hấp khử trùng, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh, tủ

sấy.

Dụng cụ dùng nuôi cấy: dao cấy, đĩa cấy, pank cấy, kéo, đèn cồn, bình nuôi cấy

250 ml, bình tam giác 250 ml. Dụng cụ khử trùng ở 1210 C

Hóa chất, vật tư nghiên cứu

Môi trường MS cơ bản

Cồn 70%

Đường saccharose

Agar Hạ Long

Nước dừa

Chuối

Khoai tây

Casein

Myo-inosytol

Cao nấm men

Tảo spirulina

3.5. Nội dung nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau:

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả

năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến khả năng sinh trưởng và

tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng và tích

lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng và

tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tổng hợp đến

khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ casein đến khả năng sinh trưởng và tích

lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của Myo-inositol đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tảo Spirulina (Earthrise, USA) đến khả năng sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

3.6. Phương pháp nghiên cứu

Bố trí thí nghiệm: Ở tất cả các thí nghiệm chúng tôi bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn

với 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại 3 bình, mỗi bình 6 mẫu

Bình nuôi cấy:

- Bình tam giác 250ml

- Bình trụ 200ml

Thể tích môi trường trong bình nuôi cấy 50ml/bình

Môi trường nền: MS + 30g/l Sucrose + 5g/l agar + 0.5g/l BAP, pH = 5,6 -5,8

3.6.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

Các chồi lan tái sinh lần thứ nhất từ hạt lan Thạch Hộc Tía gieo trên môi trường

MS được tách ra và cấy chuyển sang môi trường môi trường MS + 30 gram/l

saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP và bổ sung chất hữu cơ ở nồng độ khác

nhau tùy thuộc vào từng CT thí nghiệm. pH môi trường được chuẩn về 5,6-5,8 bằng

NaOH 1N hoặc HCl 1N.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến khả năng sinh

trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung nước Dừa vào môi trường nền

(trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với nông độ

dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các công thức (CT) thí nghiệm sau:

CT 1 (đ/c): MT nền + 0 mg/l nước Dừa.

CT 2: MT nền + 50 ml/l nước Dừa.

CT 3: MT nền + 100 ml/l nước Dừa.

CT 4: MT nền + 150 ml/l nước Dừa.

CT 5: MT nền + 200 ml/l nước Dừa.

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch nghiền chuối đến khả

năng sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung dịch nghiền chuối vào môi

trường nền (trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với

nông độ dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các CT thí nghiệm sau:

CT 1 (đ/c): MT nền + 0 g/l dịch nghiền chuối

CT 2: MT nền + 50 g/l dịch nghiền chuối

CT 3: MT nền + 100 g/l dịch nghiền chuối

CT 4: MT nền + 150 g/l dịch nghiền chuối

CT 5: MT nền + 200 g/l dịch nghiền chuối

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết khoai tây đến khả

năng sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung dịch chiết khoai tây vào môi

trường nền (trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với

nông độ dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các CT thí nghiệm sau:

CT 1 (đ/c): MT nền + 0 g/l dịch chiết khoai tây

CT 2: MT nền + 60 g/l dịch chiết khoai tây

CT 3: MT nền + 75 g/l dịch chiết khoai tây

CT 4: MT nền + 90 g/l dịch chiết khoai tây

CT 5: MT nền + 105 g/l dịch chiết khoai tây

3.6.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ casein đến khả năng sinh

trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung dịch chiết khoai tây vào môi

trường nền (trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với

nông độ dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các CT thí nghiệm sau:

CT 1 (đ/c): MT nền + 0 g/l casein

CT 2: MT nền + 0.05 g/l casein

CT 3: MT nền + 0.1 g/l casein

CT 4: MT nền + 0.15 g/l casein

CT 5: MT nền + 0.2 g/l casein

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Myo-inosytol đến khả năng

sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung myo-inosytol vào môi trường

nền (trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với nông

độ dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các CT thí nghiệm sau:

CT 1 (đ/c): MT nền + 0 g/l myo-inosytol

CT 2: MT nền + 0.05 g/l myo-inosytol

CT 3: MT nền + 0.1 g/l myo-inosytol

CT 4: MT nền + 0.15 g/l myo-inosytol

CT 5: MT nền + 0.2 g/l myo-inosytol

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng

sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung cao nấm men vào môi trường

nền (trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với nông

độ dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các CT thí nghiệm sau:

CT 1 (đ/c): MT nền + 0 g/l cao nấm men

CT 2: MT nền + 1.5 g/l cao nấm men

CT 3: MT nền + 3 g/l cao nấm men

CT 4: MT nền + 4.5 g/l cao nấm men

CT 5: MT nền + 5 g/l cao nấm men

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ tảo spirulina đến khả năng

sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung tảo spirulina vào môi trường nền

(trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với nông độ

dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các CT thí nghiệm sau:

CT 1 (đ/c): MT nền + 0 g/l tảo spirulina

CT 2: MT nền + 0.03 g/l tảo spirulina

CT 3: MT nền + 0.05 g/l tảo spirulina

CT 4: MT nền + 0.07 g/l tảo spirulina

CT 5: MT nền + 0.09 g/l tảo spirulina

3.7. Chỉ tiêu đánh giá

Các chỉ tiêu xác định khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối của chồi Thạch

Hộc Tía in vitro của các thí nghiệm được thu thập sau 40 ngày nuôi cấy. Bao gồm

Tổng số chồi thu được

các chỉ tiêu:

Tổng số chồi mẫu

Hệ số nhân chồi =

- Biến động chiều cao chồi = chiều cao chồi sau – chiều cao chồi trước

- Biến động số lá = số lá sau – số lá trước

- Chất lượng chồi: Đáng giá cảm quan chất lượng chồi theo các cấp sau:

Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm

Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt

Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt

Số lá của chồi

- Biến động khối lượng chồi= khối lượng sau – khối lượng trước

3.8. Phương pháp xử lí số liệu

Số liệu theo dõi các chỉ tiêu nghiên cứu được thu thập và xử lý để xác định sự

sai khác giữa các CT thí nghiệm. Xử lý số liệu được thực hiện bằng phần mềm SAS

9.1 và giá trị trung bình được so sánh theo phương pháp Duncan với P <0,01.

Phần 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến khả năng sinh

trưởng và tích lũy in vitro sinh khối của lan Thạch Hộc Tía

Trong các hợp chất hữu cơ tự nhiên có chứa các chất dinh dưỡng có ảnh hưởng

tốt đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây con nuôi cấy mô. Đặc biệt là đối

với phong lan. Để đánh giá được hiệu quả của hợp chất hữu cơ chúng tôi tiến hành

thí nghiệm cấy 6 chồi/bình, mỗi cụm cao 8 mm trên môi trường nền MS + 30g/l

Sucrose + 5g/l agar có bổ sung thành phần nước dừa. Kết quả theo dõi sau 5 tuần

được thể hiện ở bảng 4.1

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh

khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

CT Nồng độ (ml/l) Tổng số chồi vào mẫu/CT HSN Chất lượng chồi Biến động số lá

1(ĐC) Chỉ số theo dõi Biến động khối lượng (g) 0.43d 18 0.0 1.44d Biến động chiều cao (cm) 0.28e 3.11c Chồi kém

2 18 50 2.61c 0.63d 5.56b

3 0.61bc Chồi trung bình 0.89a 18 100 4.56a 1.64a Chồi tốt 7.56a

4 18 150 3.72b 1.41b 5.44b

5 18

2.50c 0.44 0.81 c 0.15 3.44c 0.41 200 LSD0.5 0.66b Chồi trung bình 0.47cd Chồi trung bình 0.15

CV% 5.46 5.56 8.99 3.01

a, b, c, … thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo phương

pháp Duncan

Chú thích:

- Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm

- Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt

- Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt.

Qua 40 ngày nuôi cấy, hệ số nhân chồi đạt được ở các CT thí nghiệm có sự sai

khác ở mức ý nghĩa 99%, biến động từ 1.44 lần đến 4.56 lần. Trong đó, nồng độ

100ml/l (CT 3) cho hệ số nhân chồi đạt cao nhất (4.56 lần), tiếp theo đến các CT 4

(3.72 lần), CT 5 (2.50 lần), CT đối chứng (1.44 lần) . Không có sự sai khác ý nghĩa

giữa CT 2 (50ml/l), 4 (150ml/l), 5(200ml/l).

Đối với biến động số lá ở các CT thí nghiệm có sự sai ở mức độ tin cậy 99%, biên

động từ 3.11 lá/chồi đến 7.56 lá/chồi. Trong đó ở CT 3 (100ml/l) cho biến động số lá cao

nhất đạt 7.56 lá/chồi, tiếp đến là các CT 2 ( 5.56 lá/chồi), CT 4 (5.44 lá/chồi), CT 5 (3.44

lá/chồi) và cho biến động số lá thấp nhất ở CT đối chứng (3.11 lá/chồi).

Ở chỉ tiêu biến động chiều cao các CT có sự sai khác với CT đối chứng ở mức

tin cậy 99%, biến động từ 0.28 cm/chồi đến 1.64cm/chồi. Trong đó ở CT bổ sung

100ml/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (1.64 cm/chồi), tiếp đến là CT 4

(1.41 cm/chồi), CT 5 (0.81 cm/chồi) và CT 2 (0.63 cm/chồi).

Biến động khối lượng ở các CT thí nghiệm có sự sai khác so với CT đối chứng

ở mức độ tin cậy 99%. Khối lượng biến động từ 0.43 g/chồi (CT đối chứng) đến

0.89g/chồi. Trong đó biếng động khối lượng đạt cao nhất ở CT 3 (0.98 g/chồi),CT

4(0.66 g/chồi), CT 2(0.61 g/chồi), và CT 5 (0.47 g/chồi).

Bằng mắt thường ta có thể nhận thấy chất lượng của chồi ở CT bổ sung 100ml/l

(CT 3) cho chất lượng chồi tốt nhất, lá rộng xanh thẫm, chồi mập. Ở các CT khác

chất lượng thấp hơn so với CT 3.

Kết quả nghiên cứu này đồng thuận với các nghiên cứu trước đó của Nguyễn

Thị Sơn (2014) [19] trên đối tượng lan Thạch Hộc Thiết Bì sử dụng nước dừa với

nồng độ 100ml/l nước dừa được đánh giá là tốt nhất cho hệ số nhân chồi. Ngược lại,

cũng có một số tác giả công bố môi trường bổ sung 200 ml/l nước dừa là môi trường

phù hợp với sự sinh trưởng trên đối tượng lan Hài Hồng [2]. Nguyên nhân có thể do

sự khác biệt về loài.

Kết luận: từ kết quả trên ta thấy bổ sung 100ml/l nước dừa vào môi trường nuôi

cấy cho tác động tích cực đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan

Thạch Hộc Tía.

4.2. Kết quả ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng và tích

lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng và tích

lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

Chỉ số theo dõi

Tổng số Biến động Biến Nồng Biến CT chồi vào khối Chất lượng động độ(g/l) HSN động mẫu/CT lượng chồi chiều số lá (g) cao (cm)

0.17d Chồi kém 18 1(ĐC) 0.0 0.46d 1.56c 3.11c

0.29d Chồi trung bình 18 2 50 0.77c 2.50b 5.11b

1.03a Chồi tốt 18 3 100 1.34a 3.55a 7.22a

0.79b Chồi tốt 18 4 150 2.83b 1.12ab 5.22b

0.54c Chồi trung bình 18 5 20 2.45b 0.91b 3.44c

0.13 0.70 0.28 LSD0.5 0.22

8.82 CV% 9.09 8.61 2.18

a, b, c, … thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo

phương pháp Duncan

Chú thích:

- Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm

- Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt

- Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt

a, b, c, … thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo phương

pháp Duncan

Qua 40 ngày nuôi cấy, hệ số nhân chồi đạt được ở các CT thí nghiệm có sự sai

khác ở mức ý nghĩa 99%, biến động từ 0.46 lần đến 1.34 lần. Trong đó, nồng độ 100

g/l (CT 3) cho hệ số nhân chồi đạt cao nhất (1.34 lần), tiếp theo đến các CT 4 (1.12

lần), CT 5 (0.91 lần), CT đối chứng (1.44 lần) . Không có sự sai khác ý nghĩa giữa

CT 2, 4, 5.

Đối với biến động số lá ở các CT thí nghiệm có sự sai ở mức độ tin cậy 99%,

biên động từ 3.11 lá/chồi đến 7.22 lá/chồi. Trong đó ở CT 3 (100g/l) cho biến động

số lá cao nhất đạt 7.22 lá/chồi, tiếp đến là các CT 4 ( 5.22 lá/chồi), CT 2 (5.11 lá/chồi),

CT 5 (3.44 lá/chồi) và cho biến động số lá thấp nhất ở CT đối chứng (3.11 lá/chồi).

Ở chỉ tiêu biến động khối lượng các CT có sự sai khác với CT đối chứng ở mức

tin cậy 99%, biến động từ 0.17g/chồi đến 1.03g/chồi. Trong đó ở CT bổ sung 100g/l

(CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (1.03 cm/chồi), tiếp đến là CT 4 (0.79

g/chồi), CT 5 (0.54 g/chồi) và CT 2 (0.29 g/chồi) và cuối cùng là CT đối chứng ( 0.17

g/chồi).

Biến động chiều cao ở các CT thí nghiệm có sự sai khác so với CT đối chứng ở

mức độ tin cậy 99%. Biến động chiều cao đạt được ở các CT thí nghiệm có sự sai

khác ở mức ý nghĩa 99%, biến động từ 0.46 cm/chồi đến 1.34 cm/chồi. Trong đó,

nồng độ 100 g/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (1.34 cm/chồi), tiếp theo

đến các CT 4 (1.12 cm/chồi), CT 5 (0.91 cm/chồi), CT đối chứng (1.44 cm/chồi) .

Không có sự sai khác ý nghĩa giữa CT 2, 4, 5.

Bằng mắt thường ta có thể nhận thấy chất lượng của chồi ở CT bổ sung 100ml/l

(CT 3) cho chất lượng chồi tốt nhất, lá rộng xanh thẫm, chồi mập. Ở các CT khác

chất lượng thấp hơn so với CT 3.

Hoàng Thị Giang(2010) [7] nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường có bổ sung

dịch nghiền chuối trên lan Hài Hằng, kết quả cho thấy việc bổ sung dịch nghiền chuối

vào môi trường nhân nhanh bổ sung 100g/l dịch nghiền chuối vào môi trường có ảnh

hưởng tích cực đến chồi. Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả đã được công bố

của tác giả.

Kết luận: bổ sung dịch nghiền chuối ở nồng độ 100g/l phù hợp cho việc phát

sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Thạch Hộc Tía.

4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía.

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng và

tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

Chỉ số theo dõi

Biến Biến Tổng số Nồng động Biến động Biến CT chồi vào Chất lượng độ(g/l) chiều động khối động mẫu/CT chồi cao số lá lượng HSN

(g) (cm)

1(ĐC) 0.0 18 0.28d 3.44d 0.40d Chồi kém 1.50d

18 60 2 0.73c 5.44b 0.58c Chồi trung bình 2.17c

18 75 3 1.30a 7.22a 1.10a Chồi tốt 3.72a

18 90 4 1.24a 4.44b 0.75b Chồi trung bình 2.72b

18 105 5 0.93b 3.78c 0.48cd Chồi trung bình 2.83b

0.14 0.47 0.16 0.36 LSD0.5

CV% 5.69 3.57 9.08 5.02

a, b, c, … thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo phương

pháp Duncan

Chú thích:

- Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm

- Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt

- Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt

Qua 40 ngày nuôi cấy, hệ số nhân chồi đạt được ở các CT thí nghiệm có sự sai

khác ở mức ý nghĩa 99%, biến động từ 1.50 lần đến 3.72 lần. Trong đó, nồng độ 75g/l

(CT 3) cho hệ số nhân chồi đạt cao nhất (3.27 lần), tiếp theo đến các CT 5 (2.83 lần),

CT 4 (2.72 lần), CT 2 (2.17 lần)CT đối chứng (1.44 lần) . Không có sự sai khác ý

nghĩa giữa CT 2, 4, 5.

Đối với biến động số lá ở các CT thí nghiệm có sự sai ở mức độ tin cậy 99%,

biên động từ 3.44 lá/chồi đến 7.22 lá/chồi. Trong đó ở CT 3 (75g/l) cho biến động số

lá cao nhất đạt 7.22 lá/chồi, tiếp đến là các CT 2 ( 5.44 lá/chồi), CT 4 (4.44 lá/chồi),

CT 5 (3.78 lá/chồi) và cho biến động số lá thấp nhất ở CT đối chứng (3.44 lá/chồi).

Ở chỉ tiêu biến động chiều cao các CT có sự sai khác với CT đối chứng ở mức

tin cậy 99%, biến động từ 0.28 cm/chồi đến 1.30cm/chồi. Trong đó ở CT bổ sung

75g/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (1,30 cm/chồi), tiếp đến là CT 4 (1.24

cm/chồi), CT 5 (0.93cm/chồi) và CT 2 (0.73cm/chồi).

Biến động khối lượng ở các CT thí nghiệm có sự sai khác so với CT đối chứng

ở mức độ tin cậy 99%. Khối lượng biến động từ 0.40 g/chồi (CT đối chứng) đến

1.10g/chồi. Trong đó biếng động khối lượng đạt cao nhất ở CT 3 (1.10 g/chồi),CT 4

(0.75 g/chồi), CT 2 (0.58 g/chồi), và CT 5 (0.48 g/chồi).

Về chất lượng chồi khi quan sát thấy rằng ở CT chồi thu được có chất lượng tốt

lá xanh thẫm, chồi mập. Các CT thí nghiệm còn lại cho chất lượng chồi trung bình.

Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả của Mai Thị Phương Hoa, Đỗ Tiến

Vinh (2018) [8] nghiên cứu trên đối tượng lan Thạch Hộc Thiết Bì (Dendrobium

officinale Kimura et Migo) kết quả thí nghiệm cho thấy việc bổ sung 75g/l khoai tây

đều cho kết quả tăng sinh tương đối cao. Kết quả của chúng tôi phù với kết quả đã

được công bố của tác giả

Kết luận việc bổ sung 75g/l khoai tây vào môi trường nuôi cấy có tác động

tích cực đến hệ số nhân chồi, chiều cao, số lá và khối lượng tươi của lan Thạch

Hộc Tía.

4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của casein đến khả năng sinh trưởng và tích

lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của casein đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh

khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

Chỉ số theo dõi

Tổng số Biến Biến động Nồng Biến CT chồi vào động khối Chất lượng độ(g/l) HSN động mẫu/CT chiều cao lượng chồi số lá (cm) (g)

0.25d 18 1(ĐC) 0.0 1.39c 3.33c 0.53d Chồi kém

0.65c 18 2 0.05 2.31b 3.33b 0.79c Chồi trung bình

1.37a 18 3 0.1 3.67a 7.11a 1.23a Chồi tốt

1.28a 18 4 0.15 3.33a 5.22b 0.93b Chồi trung bình

0.91b 18 5 0.2 2.17b 3.44c 0.72c Chồi trung bình

0.11 0.43 0.44 0.09 LSD0.5

4.25 CV% 6.12 3.32 4.007

a, b, c, … thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo

phương pháp Duncan

Chú thích:

- Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm

- Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt

- Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt

Sau 7 tuần theo dõi, chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD0.5 là 0.43 hệ số nhân

chồi của các CT tăng khi tăng nồng độ. Khi tăng nồng độ casein từ 0 -0.1g/l tương

ứng từ CT1 – CT3, hệ số nhân chồi biến động từ 2.31 – 3.67 lần, đặc biệt là ở CT3

nồng độ 3g/l cho biến động hệ số nhân chồi cao nhất đạt 3.67 lần. Tuy nhiên khi tăng

nồng độ lên hệ số nhân chồi giảm từ 3.33 lần ở CT4 xuống còn 2.17 lần ở CT5

Từ bảng 4.4 nhận thấy khi bổ sung casein với nồng độ từ 0 – 1g/l biến động

chiều cao chồi cao hơn CT ĐC. Trong đó ở CT3 biến đọng chiều cao là 1.37 cm. ở

CT4 và CT5 chiều cao lần lượt là 1.28 và 0.91 cm so với CT ĐC (0.28) sai khác này

không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 99%.

Về biến động số lá của chồi, theo kết quả ở bảng 4.4 cho thấy: biến động số lá

tăng từ 3.33 lá/chồi đến 7.11 lá/chồi trong đó CT 3 (0.1g/l) cho biến động số lá cao

nhất (7.11). Nhưng khi tăng nồng độ nên thì số lá giảm xuống 5.22 ở CT4 và 3.44 ở

CT5. Khi không sử dụng thì số lá tăng rất thấp chỉ đạt 3.33 lá/chồi

Ở CT3 khối lượng trung bình của chồi (1.23g) lớn hơn CT ĐC và các CT còn

lại. Giá trị khối lượng trung bình thu được ở CT2, CT4 không có sự thay đổi nhiều

(lần lượt đạt 0.79, 0.93g) 2 CT này sai khác không có ý nghĩa so vơi CT ĐC ở độ tin

cậy 99%. Ở CT5 cho khối lượng thấp nhất 0.72 so với CT ĐC (0.43g) sai khác không

có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 99%

Đáng giá về chất lượng chồi của CT2,3,4,5 đều cho chồi cho chất lượng tốt hơn

so với CT ĐC. Các CT 2,4,5 chồi thu được có chất lượng trung bình chồi nhỏ, lá có

màu xanh nhạt. Riêng ở CT 3 chồi thu được có chất lượng tốt nhất chồi mập, lá xanh

đậm

Kết luận: khi bổ sung casein ở nồng độ 0.1g/l vào môi trường nuôi cấy đã gia

tăng hệ số nhân chồi, chiều cao, số lá và cả trọng lượng chồi lan Thạch Hộc Tía.

4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Myo-inositol đến khả năng sinh trưởng

và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía.

Qua nghiên cứu tài liệu về nuôi cấy lan Thạch Hộc Tía chúng tôi thấy rằng trong

một vài nghiên cứu có sử dụng myo-inosytol với nồng độ tối thiểu là 0.1g/l trong môi

trường nền để tiến hành nghiên cứu với các nhân tố khác mà chưa khảo sát ảnh hưởng

của Myo-inosytol đến sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối của cây[10].

Chính vì thế chúng tôi thực hiên nghiên cứu ảnh hưởng của Myo-inosytol với

nồng đọ 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2g/l đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan

Thạch Hộc Tía

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của Myo-inositol đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

CT HSN Nồng độ (g/l) Tổng số chồi vào mẫu/CT Chất lượng chồi Biến động số lá

1(ĐC) 18 0.0 Biến động chiều cao (cm) 0.25d 1.39c Chỉ số theo dõi Biến động khối lượng (g) 0.37c 3.56c Chồi kém

2 18 0.05 2.31b 0.65c 5.22b Chồi trung bình 0.66b

3 18 0.1 Chồi tốt 1.03a 3.67a 1.37a 6.89a

4 18 0.15 Chồi trung bình 0.76b 3.33a 1.28a 4.90b

5 18 0.2 Chồi trung bình 0.47c 2.17b 0.91b 4.00c

0.12 4.25 0.68 LSD0.5 0.43

CV% 6.26 6.12 0.11 5.08

a, b, c, … thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo

phương pháp Duncan

Chú thích:

- Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm

- Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt

- Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt

Qua 40 ngày nuôi cấy, biến động hệ số nhân chồi đạt được ở các CT thí nghiệm

có sự sai khác ở mức ý nghĩa 99%, biến động từ 1.39 lần đến 3.67 lần. Trong đó,

nồng độ 0.1g/l (CT 3) cho hệ số nhân chồi đạt cao nhất (3.67 lần), tiếp theo đến các

CT 4 (3.33 lần), CT 2 (2.31 lần), CT 5 (2.17 lần)CT đối chứng (1.39 lần) . Không có

sự sai khác ý nghĩa giữa CT 2, 4, 5.

Đối với biến động số lá ở các CT thí nghiệm có sự sai ở mức độ tin cậy 99%,

biến động từ 3.56 lá/chồi đến 6.89 lá/chồi. Trong đó ở CT 3 (0.1g/l) cho biến động

số lá cao nhất đạt 6.89 lá/chồi, tiếp đến là các CT 2 ( 5.22 lá/chồi), CT 4 (4.90 lá/chồi),

CT 5 (4.00 lá/chồi) và cho biến động số lá thấp nhất ở CT đối chứng (3.56 lá/chồi).

Ở chỉ tiêu biến động chiều cao các CT có sự sai khác với CT đối chứng ở mức

tin cậy 99%, biến động từ 0.25 cm/chồi đến 1.37cm/chồi. Trong đó ở CT bổ sung

0.1g/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (1,37 cm/chồi), tiếp đến là CT 4 (1.28

cm/chồi), CT 5 (0.91 cm/chồi) và CT 2 (0.25 cm/chồi).

Biến động khối lượng ở các CT thí nghiệm có sự sai khác so với CT đối chứng

ở mức độ tin cậy 99%. Khối lượng biến động từ 0.37 g/chồi (CT đối chứng) đến

1.03g/chồi. Trong đó biếng động khối lượng đạt cao nhất ở CT 3 (1.03 g/chồi),CT

4(0.76 g/chồi), CT 2(0.66 g/chồi), và CT 5 (0.47 g/chồi).

Về chất lượng chồi khi quan sát thấy rằng ở CT chồi thu được có chất lượng tốt

lá xanh thẫm, chồi mập. Các CT thí nghiệm còn lại cho chất lượng chồi trung bình.

Kết luận bổ sung myo-inosytol với nồng độ 0.1g/l môi trường có tác động tích

cực đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía.

4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng sinh trưởng

và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía.

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

Chỉ số theo dõi

CT Nồng độ(g/l) HSN Tổng số chồi vào mẫu/CT Chất lượng chồi Biến động số lá

Chồi kém

18 18 1(ĐC) 2 0.0 1.5

18 3 3.0 Chồi tốt

18 4 4.5

18 5 6.0 Biến động chiều cao (cm) 0.28e 0.63d 1.64a 1.41b 1.41c 1.44d 2.61c 4.56a 3.72b 2.50c

0.15 0.44 3.11d 5.11b 6.78a 5.22b 5.22c 0.24 Biến động khối lượng (g) 0.43d 0.61bc Chồi trung bình 0.89a 0.65b Chồi trung bình 0.47cd Chồi trung bình 8.89 LSD0.5

CV% 5.55 5.46 1.88 0.15

a, b, c, … thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo

phương pháp Duncan.

Chú thích:

- Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm

- Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt

- Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt

Kết quả ở bảng 4.6 cho thấy khi bổ sung cao nấm men vào môi trường nuôi cấy

rõ ràng có ảnh hưởng tích cực đến các chỉ tiêu sinh trưởng như hệ số nhân chồi, số

lá, chiều dài và khối lượng chồi.

Ở tất cả các CT bổ sung cao nấm men đều cho hệ số nhân chồi cao hơn CT đối

chứng. Bổ sung cao nấm men ở nồng độ 1g/l cho hệ số nhân chồi cao nhất ( 4.56 lần).

Trong khi đó ở các nồng độ khác thì hệ số nhân chồi thấp hơn dao động từ 2.50 - 3.72

lần, đối chứng lá 1.44 lần.

Đối với biến động số lá ở các CT thí nghiệm có sự sai ở mức độ tin cậy 99%,

biến động từ 3.11 lá/chồi đến 6.78 lá/chồi. Trong đó ở CT 3 (0.1g/l) cho biến động

số lá cao nhất đạt 6.78 lá/chồi, tiếp đến là các CT 4 ( 5.22 lá/chồi), CT 2 (5.11 lá/chồi),

CT 5 (5.12 lá/chồi) và cho biến động số lá thấp nhất ở CT đối chứng (3.11 lá/chồi).

Ở chỉ tiêu biến động khối lượng các CT có sự sai khác với CT đối chứng ở mức

tin cậy 99%, biến động từ 0.43g/chồi đến 0.89 g/chồi. Trong đó ở CT bổ sung 0.1g/l

(CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (0.89 cm/chồi), tiếp đến là CT 4 (0.65

g/chồi), CT 2 (0.61 g/chồi) và CT 5 (0.47 g/chồi) và cuối cùng là CT đối chứng ( 0.43

g/chồi).

Biến động chiều cao ở các CT thí nghiệm có sự sai khác so với CT đối chứng ở

mức độ tin cậy 99%, biến động từ 0.28 cm/chồi đến 1.64 cm/chồi. Trong đó, nồng độ

0.1 g/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (1.64 cm/chồi), tiếp theo đến các CT

4 (1.41 cm/chồi), CT 5 (1.41 cm/chồi), CT 3 (0.63 cm/chồi) CT đối chứng (0.28

cm/chồ) . Không có sự sai khác ý nghĩa giữa CT 2, 4, 5.

Bằng mắt thường ta có thể nhận thấy chất lượng của chồi ở CT bổ sung 100ml/l

(CT 3) cho chất lượng chồi tốt nhất, lá rộng xanh thẫm, chồi mập. Ở các CT khác

chất lượng thấp hơn so với CT 3.

Kết luận: cao nấm men phù hợp với sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro

lan Thạch Hộc Tía với nồng độ 3g/l

4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tảo spirulina đến khả năng sinh trưởng

và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía.

Trong tảo spirulina có chứa các nhóm chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát

triển của cây như các vitamin, các amino acid, các chất khoáng đa lượng, vi lượng

trong tảo spirulina có chứa các nhóm chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển

của cây như các vitamin, các amino acid, các chất khoáng đa lượng, vi lượng. Để

đánh giá được ảnh hưởng của tảo chúng tôi tiến hành thí nghiệm và kết quả được thể

hiện ở bảng dưới đây.

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của tảo spirulina đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

Chỉ số theo dõi

CT HSN Nồng độ (g/l) Tổng số chồi vào mẫu/CT Chất lượng chồi Biến động số lá

18 1 (ĐC) 0.0 Chồi kém

18 2 0.03

18 3 0.05 Chồi tốt

18 4 0.07

18 5 0.09 Biến động chiều cao (cm) 0.40d 0.73c 1.21a 0.90b 0.73c 1.44d 2.83b 4.89a 3.00b 1.94c 3.67c 5.44b 7.78a 5.33b 3.89c Biến động khối lượng (g) 0.21d 0.40c Chồi trung bình 0.87a 0.60b Chồi trunh bình 0.47c Chồi trung bình

0.20 0.10 LSD0.5 0.20

0.20

CV% 2.53 2.5 4.12

2.53

a, b, c, … thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01

theo phương pháp Duncan

Chú thích:

- Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm

- Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt

- Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt

Sau 40 ngày nuôi cấy trên môi trường bổ sung tảo spirulina với dải nồng độ từ

0 đến 0.09g/l thu được kết quả ở bảng 4.7. Kết quả cho thấy các CT môi trường bổ

sung tảo spirulina có sự sai khác so với CT đối chứng.

Hệ số nhân có sự biến động ở các CT thí nghiệm có sự sai khác ở mức độ tin

cậy 99%, giá trị này biến động từ 1.44 lần đến 4.89 lần. Môi trường bổ sung 0.05g/l

tảo cho hệ số chồi cao nhất đạt 4.89 lần. Nếu tiếp tục tăng nồng độ tảo trên 0.05g/l

thì hệ số nhân giảm dần. Cụ thể ở nồng độ 0.07g/l hệ số nhân chồi giảm từ 4.89 xuống

3.00 lần, CT bổ sung 0.09g/l giảm xuống còn 1.94 lần.

Đối với biến động số lá ở các CT có sự sai khác với CT đối chứng. Số lá sau 40

ngày nuôi cấy biến động từ 3.67 đến 7.78 lá/chồi. Biến động số lá ở CT đối chứng

thấp nhất là 3.67 lá/chồi, tiếp theo là CT 5 là 3.89 lá/chồi, CT 4 là 5.33 lá/chồi, CT 2

là 5.44 lá/chồi CT 3 có biến động số lá cao nhất 7.78 lá/chồi.

Ở chỉ tiêu biến động chiều cao các CT có sự sai khác với CT đối chứng ở mức

tin cậy 99%, biến động từ 0.40 cm/chồi đến 1.21cm/chồi. Trong đó ở CT bổ sung

0.05g/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (0.90 cm/chồi), CT 2 và 5 có chung

giá trị biến động 0.73 cm/chồi

Biến động khối lượng ở các CT thí nghiệm có sự sai khác so với CT đối chứng

ở mức độ tin cậy 99%. Khối lượng biến động từ 0.21 g/chồi (CT đối chứng) đến

0.87g/chồi. Trong đó biếng động khối lượng đạt cao nhất ở CT 3 (0.87 g/chồi),CT

4(0.60 g/chồi), CT 5(0.47 g/chồi), và CT 2(0.40 g/chồi).

Đã có nghiên cứu bổ sung tảo spirulina vào môi trường nhân chồi trên đối tượng

lan hài hồng. Nguyễn Thị Cúc (2014) [2] đã xác định môi trường bổ sung 50mg/l tảo

spirulina cho số chồi đạt cao nhất là 4,0 lần cấy. Kết quả của chúng tôi phù hợp với

kết quả của tác giả.

Từ kết quả thí nghiệm trên kết luận rằng môi trường MS bổ sung 50mg/l tảo

spirulina thích hợp cho quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối lan Thạch Hộc Tía.

PHẦN 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

Kết quả nghiên cứu của đề tài khẳng định rằng chất hữu cơ có ảnh hưởng đến

khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. Cụ thể như sau:

Bổ sung nước dừa làm tăng khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro

lan Thạch Hộc Tía. Trong các nồng độ nghiên cứu (từ 0-200 ml/l), bổ sung 100ml/l

nước dừa cho hệ số nhân, số lá, chiều cao và cả khối lượng tươi đều cao nhất lần lượt

là 4,56 lần, 7.56 lá/chồi, 1,64 cm, 0,89g.

Bổ sung 100g/l chuối hệ nhân chồi trong thí nghiệm đạt 3.55 lần, ở các chỉ tiêu

khác như biến động chiều cao, số lá, khối lượng tươi của chồi cũng đạt giá trị cao nhất

lần lượt là 1.34cm, 7.22 lá/chồi, 1.03 g và cho chất lượng chồi mập, xanh đậm.

Bổ sung khoai tây và môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng và tích lũy

sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. Trong các nồng độ nghiên cứu (từ 0- 105ml/l),

bổ sung 75g/l khoai tây cho hệ số nhân chồi 3.72 lần chiều cao, số lá, khối lượng tươi

của chồi thu được đạt giá trị cao nhất lần lượt là 1.30 cm, 7.22 lá/chồi, 1.10 g.

Chiều cao, số lá, hệ số nhân và khối lượng đạt 1.37cm, 7.11 lá/chồi, 1.23 lần,

3.67g khi bổ sung 0,1g/l và chất lượng chồi sau 40 ngày nuôi cấy cũng có hình thái

xanh thẫm và mập khi bổ sung 0.1g/l casein.

Khi bổ sung 0.1g/l myo-inositol có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và tích

lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. Trong các nồng độ nghiên cứu (từ 0- 0.2g/l)

ở nồng độ 0.1g/l cho hệ số nhân chồi, số lá, khối lượng và chiều cao đạt giá trị cao

nhất trong thí nghiện này lần lượt là 3.67 chồi/mẫu, 6.89 lá/chồi, 1.03g và 1.37cm.

Cao nấm bổ sung ở nồng độ 3g/l cho hệ số nhân chồi 4,56 lần, khối lượng đạt

0.89, số lá đạt 2.11 lá/chồi, chiều cao chồi đạt 1.64 cm.

Tảo spirulina có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối chồi

lan Thạch Hộc Tía. Môi trường cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 4.89 lần, chiều cao

đạt 1.21cm, số lá 2.11 lá/chồi, trọng lượng 0.87g khi bổ sung 50mg/l, cho chất lượng

chồi tốt nhất trong thí nghiệm.

5.2. Kiến nghị

Nghiên cứu môi trường nuôi cấy loại bỏ hoàn toàn các chất điều tiết sinh trưởng

Nghiên cứu kết hợp các hợp chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối

lan Thạch Hộc Tía.

Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống lan Thạch Hộc Tía từ hạt

Tách chiết hợp chất trong cây lan Thạch Hộc bổ sung vào thực phẩm chức năng:

Cao Thạch Hộc, đồ uống, nước giải khát, ...

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tiếng việt

1. Ngô Xuân Bình, Võ Hà Giang(2010), “Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống phong lan

Đuôi Chồn Rhynchostylis retusa [L.] blume bằng phương pháp nuôi cấy mô

tế bào”, Tạp chí nông nghiệm & phát triển nông thôn, (146), trang 25-30.

2. Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Văn Kết, Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Kim Lý(2014).

“Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ liên quan đến quá trình

sinh trưởng và phát triển của cây lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) in

vitro”., Tạp chí sinh học, 36, 251-254.

3. Nguyễn Kim Dung, Nguyễn Văn Việt, Bùi Văn Thắng(2016). “Nhân giống lan

hoàng thảo ý thảo ba màu (Dendrobium gratiosissimum reichenb.f) bằng kỹ thuật

nuôi cấy in vitro”, Tạp chí khoa học và công nghệ lân nghiệm, 16, 157-158.

4. Đặng Văn Đông(2004), Công nghệ mới trồng hoa cho thu nhập cao, Nxb Lao Động

và Xã Hội, Hà Nội.

5. Lê Trần Đức(2008), Cây thuốc Việt Nam, NXB Nông nghiệm, trang 962 – 965.

Ngô Ánh Thư, Thái Xuân Du(2012). “Tăng hệ số nhanh nhanh chồi chuối Laba

6. Đỗ Đăng Giáp, Phạm Ngọc Vinh, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Thị Huyền Trang, Phạm

(Musa SP.) nuôi cấy in vitro bằng sử dụng ánh sáng, myo-inositol và adenin

sulphate”, Tạp chí sinh học, 34, 183-184.

7. Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà(2010),

“Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng lan hài quý P. hangianum

perner Gurss (Hài hằng) thu thập ở Việt Nam”, Tạp chí khoa học và phát triển,

8, 195-198.

8. Mai Thị Phương Hoa, Đỗ Tiến Vinh(2018).” Nuôi cấy protocorm lan Thạch Hộc

thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) in vitro”, Tạp chí khoa học

và công nghệ, 3, 52-57.

9. Đỗ Thị Hào(2015), Nghiên cứu nhân giống lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium

nobile Lindl) từ hạt bằng phương pháp nuôi cấy mô tại Trường đại Học Nông

Lâm Thái Nguyên, Trường đại Học Nông Lâm Thái nguyên.

10. Nguyễn Thị Diệu Hoa(2017), “ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết

sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và biện phát ký thuật đến sinh trưởng

của giống lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) tại Thái

Nguyên”, Luận văn Thạc sỹ cây trồng, Trường Đai học Nông Lâm Thái

Nguyên.

11. Hoàng Thị Hằng, Nguyễn Huỳnh Trâm Anh(2017),Xây dựng quy trình nuôi cấy

in vitro lan Thạch Hộc Tía(Dendrobium officinale Kimura et Migo) trên môi

trường hữu cơ chứa phân trùn quế( Perionyx Excavatus )kết hợp với bột sắn dây

(Pueraria Thomsoni). Hội nghị khoa học toàn quốc 2017 Sinh lý thực vật ứng dụng

trong công nghệ cao, Trường Đại học Lạc Hồng tháng 12 năm 2017

12. Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013), “Nhân giống in vitro loài lan bản địa

Dendrobium nobile Lindl”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 11, số 7, 917-

925.

13. Đỗ Tất Lợi(2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, trang 628

– 642

14. Phí Thị Cẩm Miêu(2012), “ Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan kim tuyến

(Anoectochilus Setaceus Blume)”, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường Đại học

Khoa Học Tự Nhiên.

15. Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch, Đỗ Đức Thịnh(2008), “Xây dựng quy

trình nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng (Cymbidium iridioides) bằng kĩ

thuật nuôi cấy mô”, Tạp chí Khoa học kĩ thuật Nông Nghiệm, 4: 387-394.

16. Nguyễn Văn Song (2011), “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dedrobium

chysotoxum)- một loài lan có nguy cơ tuyệt chủng”, Tạp chí Khoa học Đại

học Huế, 64: 127-136.

17. Nguyễn Thị Sơn, Trần Thế Mai, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Lý Anh (2013),

“Nghiên cứu ứng dụng hệ thống bioreator plantima trong nhân giống loài lan

Hoàng thảo Thạch Hộc (Dendrobium nobile Lindl)”, Tạp chí Nông nghiệm và

Phát triển nông thôn, 2: 28-34.

18. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2014), “Nhân dòng

vô tính cây lan hồ điệp Phalaenopsis sogo yukidian”. Tạp trí khoa học và phát

triển, 12, 1289-1291.

19. Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thủy, Đặng Thị Nhàn và cs (2014), “Nhân giống in

vitro lan Dendrobium Officinale Kimura Et Migo (Thạch Hộc Thiết Bì)”. Tạp

chí khoa học và phát triển, 12, 1277.

20. Nguyễn Quỳnh Trang, Vũ Thị Huệ, Khuất Thị Hải Ninh và cs (2013), “Nhân

giống in vitro lan phi điệp tím (Dendrobium anosmum)”. Tạp trí khoa học và

công nghệ lâm nghiệm, 3, 17.

21. Nguyễn Thị Huyền Trang, Đặng Thị Kim Thúy, Đỗ Đức Thăng và cs (2019).

“Ứng dụng các hợp chất hữu cơ thay thế nguồn Nitrate vô cơ trong môi trường

nuôi cấy sinh khối và thử hoạt tính sinh học của cây Lan kin tuyến

(Anoectochilus formosanus HAYATA) in vitro”. Tạp chí khoa học Trường

Đại học Cần Thơ, 55 136-139.

22. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Trường Sơn, Đỗ Năng Vịnh

(2003), “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồnphong lan

Phalaenopsis (lan Hồ Điệp)”, Báo cáo khoa học, hội nghị CNSH toàn quốc

2003, trang 850-85.

23. Đỗ Đức Thăng, Lê Đức Tuấn, Bùi Minh Trí, và cs, 2017. Ảnh hưởng của dịch

chiết nấm men và peptone lên sự sinh trưởng cua cây lan gấm (Anoectochilus

roxburghii) in vitro

(http://www.tapchikhoahocnongnghiep.vn/uploads/news/2017_12/15.pd).

24. Mai Thị Tâm, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Trường Sơn

(1999), “Nghiên cứu và nhân nhanh giống lan Dendrobium E.R ”, Kết quả

nghiên cứu khoa học nữ cán bộ giảng dạy Đại học Nông Nghiệm I.

25. Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thị Lan, Nguyễn Thành Luân (2007), “Ảnh hưởng của một

số yếu tố môi trường và giá thể đến sinh trưởng của cây lan Dendrrobium

hybrid in vitro”. Tạp chí khoa học và công nghệ, 3, 105-108.

26. Huỳnh Văn Thới (2005), Cẩm nang nuôi trồng và kinh doanh phong lan, Nxb

Trẻ.

27. Nguyễn Thanh Tùng và Trương Thị Bích Phượng (2009), “ Nhân nhanh invitro

cây Mỹ Dung Dạ Lan vanda denisoniana benson ”, Hội nghị CNSH toàn quốc

năm 2009, 452-454.

28. Từ điển Bách khoa dược học Việt Nam, (1999), Nxb Y học.

II. Tiếng Anh

29. Parisa Shekarriz, Mohsen Kafi, Shirin Dianati Deilamy, Masoud Mirmasoumi

(2014).

III. Trang web

http://www.tapchikhoahocnongnghiep.vn/uploads/news/2017_12/15.pd

PHẦN PHỤ LỤC

CT4

CT5

CT2

CT1

CT3 333 33# 33#

Phụ lục 1: một số hình ảnh thí nghiệm

Hình 1: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ nước dừa

CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar

CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 50ml/l nước dừa

CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 100ml/l nước dừa

CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 150ml/l nước dừa

CT5: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 200ml/l nước dừa

CT5

CT4

CT2

CT1

CT3

Hình 2: chồi lan Thạch Hộc Tía trên môi trường chuối

CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar

CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 100g/l chuối

CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 100g/l chuối

CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 150g/l chuối

CT5: MS + 30g/l Sucroza + 5g/l agar + 200g/l chuối

CT1

CT2

CT4

CT5

CT3

Hình 3: Chồi lan Thạch Hộc Tía trên môi trường khoai tây

CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar

CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 45g/l chuối

CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 60g/l chuối

CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 75g/l chuối

CT5: MS + 30g/l Sucroza + 5g/l agar + 90g/l chuối

CT1

CT2

CT4

CT5

CT3

Hình 4: Chồi lan Thạch Hộc Tía trên môi trường casein

CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar

CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.05g/l casein

CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.1g/l casein

CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.15g/l casein

CT5: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.2g/l casein

CT1

CT2

CT3

CT4

CT5

Hình 5: chồi lan Thạch Hộc Tía trên môi trường myo-inosytol

CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar

CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.05g/l myo-inosytol

CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.1g/l myo-inosytol

CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.15g/l myo-inosytol

CT5: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.2g/l myo-inosytol

CT1

CT2

CT3

CT4

CT5

Hình 6: Chồi lan Thạch Hộc Tía trên môi trường cao nấm men

CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar

CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 1.5g/l cao nấm men

CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 3g/l cao nấm men

CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 4.5 g/l cao nấm men

CT5: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 6 g/l cao nấm men

CT1

CT2

CT4

CT5

CT3

Hình 7: Chồi lan Thạch Hộc Tía trên môi trường tảo spirulin

CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar

CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.03g/l tảo spirulin

CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.05g/l tảo spirulin

CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.07 g/l tảo spirulin

CT5: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.09 g/l tảo spirulin

Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

0.20

2.53

Có thể bạn quan tâm

Đồ án môn học: Nghiên cứu phát triển sản phẩm kem trứng muối đóng hộp mix hạt điều

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống sấy khí thổi dùng để sấy tinh bột gạo nếp, năng suất 2000 kg/h theo sản phẩm

Báo cáo đồ án: Thiết kế hệ thống chưng cất mâm chóp hệ etanol – nước năng suất nhập liệu 2000 L/h

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống chùm để ngưng tụ hơi cồn nồng độ 96% khối lượng, lưu lượng 10000kg/ngày

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Bài giảng Quản lý chất lượng - ThS. Phan Thị Phương Thảo

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng chương trình quản lý chất lượng theo HACCP cho sản phẩm thịt ba rọi xông khói tại Cty TNHH MTV Việt Nam kỹ nghệ súc sản (VISSAN)

Khóa luận tốt nghiệp: Khảo sát điều kiện tách chiết và hoạt tính sinh học của cao chiết hoa đu đủ đực (Carica papaya L.) từ methanol và acetone

Báo cáo seminar chuyên ngành Công nghệ hóa học và thực phẩm

Luận án Tiến Sĩ: : Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết từ cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)

Báo cáo thực tập: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (QUATEST 2)

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần kim loại của cải thìa Brassica rapa subsp.chinensis trồng tại Hà Nội, định hướng ứng dụng xác thực nguồn gốc địa lý

Đồ án tốt nghiệp Kỹ thuật thực phẩm: Đánh giá khả năng thu nhận curd và đặc tính phomat tươi sử dụng chủng khởi động trong quá trình sản xuất phomat và biến đổi trong quá trình bảo quản

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần kim loại của cải thìa brassica rapa subsp.chinensis trồng tại khu vực Hà Nội, định hướng ứng dụng xác thực nguồn gốc địa lý

Báo cáo tiểu luận Kỹ thuật nuôi thủy sản: Vai trò của nuôi trồng thủy sản trong đời sống xã hội

Báo cáo tiểu luận Công nghệ sản xuất sản phẩm thủy sản truyền thống: Trình bày kỹ thuật sản xuất tôm viên, các yếu tố ảnh hưởng chất lượng sản phẩm và đề xuất biện pháp khắc phục

Câu hỏi ôn tập môn Công nghệ sinh học nấm ăn và nấm dược liệu

Câu hỏi ôn tập Đánh giá cảm quan thực phẩm

Đồ án tốt nghiệp Công nghệ thực phẩm: Thiết kế nhà máy sản xuất bia hơi với năng suất 17 triệu lít/ năm từ 100% nguyên liệu malt

Tài liêu mới

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống sấy khí thổi dùng để sấy tinh bột gạo nếp, năng suất 2000 kg/h theo sản phẩm

Đồ án môn học: Nghiên cứu phát triển sản phẩm kem trứng muối đóng hộp mix hạt điều

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống xử lý nước ngầm công suất 15000M3 /NG/Đ

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu về ứng dụng công nghệ số trong sản xuất in và tác động của nó đến chiến lược kinh doanh của công ty in

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống chùm để ngưng tụ hơi cồn nồng độ 96% khối lượng, lưu lượng 10000kg/ngày

Báo cáo đồ án: Thiết kế hệ thống chưng cất mâm chóp hệ etanol – nước năng suất nhập liệu 2000 L/h

Đồ án công nghệ: Thiết kế hệ thống chuyển hóa cacbon monoxit Water gas shift

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng hệ thống chia sẻ tài liệu theo kiến trúc hướng dịch vụ

Luận văn tốt nghiệp: Thiết kế nhà máy sản xuất màng ghép phức hợp ứng dụng cho bao bì thuốc trừ sâu năng suất 90 triệu m²/năm

Đồ án tốt nghiệp: Thành lập bản đồ lớp phủ thực vật tỉ lệ 1:50000 tại huyện Sóc Sơn, thành phố Hà Nội từ tư liệu ảnh viễn thám

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng chương trình quản lý chất lượng theo HACCP cho sản phẩm thịt ba rọi xông khói tại Cty TNHH MTV Việt Nam kỹ nghệ súc sản (VISSAN)

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng mô hình dự báo nguồn nhân lực thuyền viên xuất khẩu Việt Nam

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu giải pháp điều khiển bám quỹ đạo tàu thủy có ràng buộc tín hiệu và bất định hàm ở đầu vào

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Đánh giá sự hiện diện một số kim loại nặng trong nghêu trắng Meretrix lyrate và môi trường sống của chúng

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tính toán hệ dây neo công trình biển nổi đặt tại vùng biển Việt Nam

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok