Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương (Soy whey protein isolate) và bột protein thủy phân (Soy whey protein hydrolysate) từ đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ----------o0o---------

NGUYỄN THỊ PHƯỢNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT SẢN PHẨM

BỘT PROTEIN ĐẬU TƯƠNG (SOY WHEY PROTEIN ISOLATE)

VÀ BỘT PROTEIN THỦY PHÂN (SOY WHEY PROTEIN

HYDROLYSATE) TỪ ĐẬU TƯƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Ngành : Công nghệ Sinh học

Khoa : CNSH - CNTP

Khóa học : 2015 – 2019

THÁI NGUYÊN, NĂM 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ----------o0o---------

NGUYỄN THỊ PHƯỢNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT SẢN PHẨM

BỘT PROTEIN ĐẬU TƯƠNG (SOY WHEY PROTEIN ISOLATE)

VÀ BỘT PROTEIN THỦY PHÂN (SOY WHEY PROTEIN

HYDROLYSATE) TỪ ĐẬU TƯƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Ngành : Công nghệ Sinh học

Lớp : K47 – CNSH

Khoa : CNSH – CNTP

Khóa học : 2015 – 2019

Người hướng dẫn : 1. TS. Phạm Bằng Phương

2. ThS. Vi Đại Lâm

THÁI NGUYÊN, NĂM 2019

i

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp,

em đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình, chỉ bảo và động viên của thầy cô,

bạn bè và gia đình. Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Phạm Bằng

Phương, cùng các thầy cô công tác tại Khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực

phẩm – Đại học Nông lâm Thái Nguyên cùng toàn thể cán bộ công tác tại Bộ môn

Sinh học Phân tử - Viện Khoa học Sự sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái

Nguyên, những người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian

thực hiện đề tài và hoàn thiện khoá luận tốt nghiệp. Xin được bày tỏ sự cảm ơn chân

thành tới ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự Sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái

Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành tốt đề tài

nghiên cứu.

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh,

ủng hộ và động viên em, giúp đỡ em vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình

học tập và nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 02 tháng 6 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Thị Phượng

ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần axit amin trong hạt đậu tương ...................................... 4

Bảng 3.1. Danh mục thiết bị được sử dụng ..................................................... 17

Bảng 3.2. Danh mục các loại hóa chất được sử dụng ..................................... 18

Bảng 3.3. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein theo Lowry ................ 23

Bảng 3.4. Kết quả đo sự ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hàm lượng

protein ............................................................................................. 24

Bảng 3.5: Thành phần dung dịch pha gel SDS - PAGE ................................. 25

Bảng 4.1. Hàm lượng protein đậu tương hòa tan ở bước thu dịch sữa đậu .... 30

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Quá trình biến tính protein của SDS ............................................... 12

Hình 4.1. Đậu tương xanh ............................................................................... 27

Hình 4.2. Sơ đồ quy trình nghiên cứu sản xuất bột đậu tương protein Isolate 28

Hình 4.3. Đường chuẩn xác định hàm lượng protein...................................... 29

Hình 4.4. Một số hình ảnh sản xuất thử nghiệm bột protein đậu tương cô đặc

......................................................................................................... 31

Hình 4.5. Sơ đồ quy trình thủy phân protein đậu tương ................................. 32

Hình 4.6. Một số hình ảnh sản xuất thử nghiệm bột protein đậu tương thủy

phân ................................................................................................. 33

Hình 4.7: Thử nghiệm sản xuất bột protein thủy phân từ dịch chiết thô

enzyme thực vật .............................................................................. 34

Hình 4.8. Kết quả điện di mẫu protein thủy phân ........................................... 35

iv

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chú thích

SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis

BSA Albumin huyết thanh bò

HCl Axit clohydric

µl Microlit

µg Microgram

Ml Mililit

SPH Soy Protein Hydrolazed

SPI Soy Protein Isolate

RPM Revolutions Per Minute

kDa Kilodalton

v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i

DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... ii

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... iii

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ........................................... iv

MỤC LỤC ......................................................................................................... v

PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1

1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1

1.2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2

1.2.1. Mục tiêu tổng quát .................................................................................. 2

1.2.2. Mục tiêu cụ thể ........................................................................................ 2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

2.1. Tổng quan về đậu tương ............................................................................. 3

2.1.1. Giới thiệu chung ..................................................................................... 3

2.1.2. Cấu tạo và thành phần hóa học chung của hạt đậu tương ....................... 3

2.2. Sản xuất protein đậu tương ........................................................................ 5

2.3.Thủy phân protein bằng enzyme ................................................................. 8

2.4. Các phương pháp định lượng protein ...................................................... 10

2.4.1. Định lượng protein bằng phương pháp Kjendahl ................................. 10

2.4.2. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry ......................... 11

2.4.3. Phương pháp điện di protein bằng gel acrylamide .............................. 11

2.5. Phương pháp sấy thăng hoa ..................................................................... 12

2.5.1. Định nghĩa ............................................................................................. 12

2.5.2. Nguyên lí hoạt động của hệ thống sấy thăng hoa ................................. 13

2.5.3. Ưu nhược điểm của phương pháp sấy thăng hoa .................................. 14

vi

2.6. Tổng quan tình hình nghiên cứu sản xuất bột protein đậu tương trong

nước và trên thế giới........................................................................................ 14

2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................... 14

2.6.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 15

PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU ................................................................................................................ 17

3.1. Đối tượng, thiết bị và dụng cụ.................................................................. 17

3.1.1. Đối tượng .............................................................................................. 17

3.1.2. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................... 17

3.1.3. Hóa chất................................................................................................. 18

3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 18

3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 18

3.2.2. Thời gian tiến hành nghiên cứu ............................................................ 18

3.2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 18

3.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 19

3.3.1. Lựa chọn nguyên liệu ............................................................................ 19

3.3.2. Quy trình nghiên cứu sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương cô đặc .... 19

3.3.3.Quy trình sản xuất bột protein đậu tương thủy phân ............................. 20

3.3.4.Định lượng protein tổngsố bằng phương pháp Kjeldahl ....................... 21

3.3.5. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry ......................... 23

3.3.6.Phương pháp điện di SDS – PAGE để đánh giá mức độ thủy phân của

protein .............................................................................................................. 24

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 27

4.1. Lựa chọn nguyên liệu và đánh giá hàm lượng protein khô trong đậu

tương bằng phương pháp Kjeldahl .................................................................. 27

4.1.1. Lựa chọn nguyên liệu ............................................................................ 27

4.1.2. Đánh giá hàm lượng protein khô theo phương pháp Kjeldahl ............. 27

vii

4.2. Kết quả nghiên cứu sản xuất thử nghiệm bột đậu tương cô đặc .............. 28

4.3. Kết quả nghiên cứu sản xuất thử nghiệm bột protein đậu tương thủy

phân ................................................................................................................. 32

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................... 36

5.1. Kết luận .................................................................................................... 36

5.2. Đề nghị ..................................................................................................... 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 37

1

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L) Merrill) là một nguồn thực phẩm giàu

dinh dưỡng, chúng chứa khoảng 40% protein, 20% dầu cũng như các vitamin,

muối khoáng và các hợp chất khác. Các thực phẩm giàu protein thường có

khả năng giúp cơ thể tăng nhanh cơ bắp, cung cấp đầy đủ năng lượng và giúp

cơ thể khỏe mạnh, giúp hỗ trợ quá trình chữa bệnh. Nguồn dinh dưỡng giàu

protein có nguồn gốc từ đậu tương có thể cung cấp cho người cần bổ sung

dinh dưỡng như người bệnh, người tập thể hình, người ăn kiêng, ăn chay…

Hiện nay các sản phẩm giàu protein trên thị trường chủ yếu là “whey

protein” được làm từ sữa. Những sản phẩm dạng này thường có giá thành cao.

Một số sản phẩm vẫn còn lượng chất béo nhất định có nguồn gốc từ động vật

có nguy cơ liên quan tới các vấn đề về hệ tuần hoàn như bệnh tim hay xơ vữa

thành động mạnh. Vì vậy việc tạo ra một sản phẩm bột protein từ đậu tương

(Soy whey protein) với hàm lượng protein cao (≥80%) làm thực phẩm giàu

dinh dưỡng cho mọi đối tượng có nguồn gốc từ thực vật với giá thành phù

hợp sẽ mang lại nhiều tiềm năng về mặt kinh tế, xã hội đáp ứng nhu cầu của

thị trường Việt Nam.

Nhằm góp phần chủ động nguồn nguyên liệu protein từ đậu tương có

chất lượng tốt phục vụ cho sản xuất các sản phẩm dinh dưỡng, thay thế một số

sản phẩm với giá thành cao chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng

quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương cô đặc (soy whey

protein isolate) và bột protein đậu tương thủy phân (soy whey protein

hydrolysate) từ đậu tương”.

2

1.2. Mục tiêu của đề tài

1.2.1. Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất bột protein đậu tương cô đặc

và bột đậu tương thủy phân với hàm lượng protein trên 85% để cung cấp cho

người cần bổ sung dinh dưỡng như người bệnh, người tập thể hình, người ăn

kiêng, ăn chay…

1.2.2. Mục tiêu cụ thể

Tiến hành các thử nghiệm nghiên cứu làm cơ sở để sản xuất và đưa ra

thị trường bột protein đậu tương cô đặc và bột protein đậu tương thủy phân

với hàm lượng protein cao, tự chủ sản xuất trong nước, để cung cấp cho người

cần bổ sung dinh dưỡng với chất lượng cao và giá thành hợp lý.

3

PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về đậu tương

2.1.1. Giới thiệu chung

Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) hay còn gọi là đậu nành, là

một trong số cây trồng có lịch sử lâu đời nhất của loài người. Những bằng

chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu tương có

nguồn gốc từ Trung Quốc. Hiện nay đậu tương đã lan truyền khắp thế giới.

Các sản phẩm làm từ đậu tương đã được tiêu thụ ở các nước châu Á trong

hàng trăm năm. Ở phương Tây, đậu tương chỉ được sử dụng chủ yếu để làm

thức ăn chăn nuôi và khai thác dầu cho đến những năm 1950. [5]

Hiện nay, đậu tương là một nguồn protein tuyệt vời, cung cấp các axit

amin thiết yếu cho dinh dưỡng của con người như lysine và methionine. Việc

tiêu thụ protein đậu tương được quan tâm đáng kể từ khi Cục Quản lý Thực

phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ chấp thuận tuyên bố về khả năng có thể làm

giảm nguy cơ mắc bệnh tim của chế độ ăn ít chất béo và cholesterol chứa

25% protein đậu nành trong một ngày. Tuyên bố này được thành lập bằng

cách xem xét nhiều nghiên cứu dài hạn về tác dụng của protein đậu tương đối

với các bệnh tim mạch. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tiêu thụ protein đậu

tương có một số tác động tích cực khác đối với sức khỏe, bao gồm hạ huyết

áp, giảm mức cholesterol và mỡ cơ thể, phòng chống loãng xương và giảm tỷ

lệ mắc ung thư dạ dày, ung thư đại trực tràng và ung thư vú.[14]

2.1.2. Cấu tạo và thành phần hóa học chung của hạt đậu tương

2.1.2.1. Cấu tạo của hạt đậu tương

Hạt đậu tương có nhiều hình dạng khác nhau như: Hình tròn, hình

dẹt…Màu sắc của hạt có nhiều loại khác nhau trong đó đậu tương màu vàng

4

xanh được đánh giá là tốt, được trồng và sử dụng nhiều, có giá trị thương

phẩm cao.

Hạt đậu tương gồm 3 phần chính:

- Vỏ hạt (seed coats) chiếm 8% trong toàn hạt

- Phôi (embryo) chiếm 2% trong toàn hạt

-Tử diệp (cotyledon) chiếm 90% trong toàn hạt, chứa hàm lượng

protein và dầu cao nhất trong toàn hạt.[2]

2.1.2.2. Thành phần hóa học của hạt đậu tương

Trong thành phần hóa học của đậu tương, thành phần protein chiếm một

tỷ lệ lớn (từ 35 – 40 %). Thành phần axit amin trong protein của đậu tương

ngoài methionine và tryptophan còn có các axit amin khác với số lượng khác

cao tương đương lượng axit amin có trong thịt (Bảng 2.1).

Bảng 2.1: Thành phần axit amin trong hạt đậu tương

STT Axit amin Hàm lượng (%)

Izoleusine 1 1,1

Leucine 2 7,7

Lyzine 3 5,9

4 Methionine 1,6

Cysteine 5 1,3

Phenylalanine 6 5

Treonine 7 4,3

Tritophan 8 1,3

9 Valine 5,4

10 Histidine 2,6

5

Lipid trong hạt cũng chiếm tỉ lệ khá lớn, khoảng 18 – 24 % tùy theo

giống và điều kiện khí hậu. Trong nhóm lipid của đậu tương có 2 thành

phần được xem là quan trọng chiếm khoảng 20% trọng lượng chất khô

trong hạt là glyceride và lecithin. Ngoài ra hạt đậu tương còn chứa các

thành phần khác như hydratcacbon, chiếm khoảng 30%, các vitamin, đặc

biệt là hàm lượng vitamin B1 và B2 cùng các vitamin, A, E, K, C,… các

khoáng đa lượng, vi lượng.

Hàm lượng vitamin D trong đậu tương được đánh giá cao và được

khuyến khích sử dụng cho phụ nữ mang thai. Khi tiến hành nghiên cứu,

những phụ nữ mang thai sử dụng protein từ đậu tương cũng có được những

lợi ích về sức khỏe giống như những phụ nữ sử dụng các protein từ sữa. Tuy

nhiên các sản phẩm từ sữa thường không chứa hoặc chứa ít vitamin D so với

đậu tương.[12]

2.2. Sản xuất protein đậu tương

Việc sản xuất protein đậu tương bao gồm nhiều quá trình tách chiết

phức tạp dựa theo mức độ tinh khiết của protein mong muốn đạt được. Protein

đậu tương được chiết xuất từ các loại đậu sau khi tách chất béo thường chia

thành 4 dạng chính: “Concentrate”- đậm đặc, “Isolate”- cô đặc với độ tinh

khiết cao, “Hydrolysate” - thủy phân và “Soy Flour”- bột.[11]

Dạng bột (Soy Flour) của đậu tương chứa tối thiểu 50% protein, lượng

protein ít nhất so với ba dạng protein đậu tương còn lại. Hình thức thường ở

dạng mảnh thô, các mảnh được loại bớt chất béo. Loại sản phẩm này chủ yếu

được sử dụng trong sản xuất các sản phẩm dạng nướng, nước sốt và nước thịt.

Protein đậu tương cô đặc sở hữu khoảng 70 ~ 80% protein theo trọng

lượng khô. Sản xuất protein đậu tương cô đặc bắt đầu bằng cách khử các hạt

xay thô và sau đó chiết xuất protein hòa tan bằng cách xử lý nhiệt hoặc trộn

6

với dung môi hữu cơ. Protein đậu tương cô đặc có các hạt mịn hơn, ứng dụng

chủ yếu trong thực phẩm như thịt, sản phẩm thay thế thịt, đồ nướng và các

thanh dinh dưỡng (thanh, miếng đồ ăn).[11]

Dạng Protein đậu tương cô đặc tinh khiết nhất thường được sử dụng

trong ngành công nghiệp thực phẩm là protein đậu tương dạng “isolate” (SPI).

Hàm lượng protein của dạng isolate cao (> 90%), các đặc điểm chức năng và

thuộc tính cảm quan tuyệt vời, chủ yếu là hương vị nhẹ và màu sáng, SPI

được sử dụng trong một loạt các ứng dụng thực phẩm như: Đồ uống dinh

dưỡng, sữa bột trẻ em, thịt chế biến, thanh dinh dưỡng và sản phẩm thay thế

sữa. SPI được sản xuất từ mảnh đậu tương đã khử chất béo, sau đó là chiết

xuất bằng kiềm. Protein hòa tan được kết tủa ở pH 4,5 và ly tâm để tách

protein khỏi các polysacarit hòa tan. Kết tủa được phân tán trong nước, sau đó

được trung hòa với dung dịch thích hợp và đông khô.[11]

Một dạng sản phẩm khác từ protein đậu nành là các sản phẩm thủy

phân (SPH). Hiện nay có thể thủy phân protein bằng enzyme từ nhiều nguồn

như động vật, thực vật, vi sinh vật. Các enzyme rất đa dạng như: Trypsin,

chymotrypsin, substilisin, pepsin, thermolysin, papain, bromelain, ficin, và

alcalase. Protein ban đầu được thủy phân để tăng khả năng tiêu hóa protein

cho những người bị rối loạn tiêu hóa. Protein sau thủy phân sẽ dễ dàng được

hấp thụ ở ruột non do chuỗi a xít amin đã được rút ngắn. Do khả năng tiêu

hóa được cải thiện, SPH phù hợp để kết hợp sản xuất sữa bột trẻ em cũng như

sử dụng cho những người bị dị ứng với các sản phẩm từ sữa. Cũng như các

dạng protein đậu tương khác, SPH được sử dụng trong các sản phẩm thực

phẩm khác nhau như thanh dinh dưỡng và đồ uống.[11]

Protein đậu tương chiếm 40 đến 45% toàn bộ đậu tương.Hai loại

protein lưu trữ chính là glycinin và-conglycinin, đóng góp khoảng 65 đến

7

80% tổng lượng protein trong một hạt đậu tương điển hình. Protein đậu tương

cũng cấu thành nhiều loại enzyme khác nhau như lipoxygenase,

chalconesynthase, catalase và urease, tuy nhiên, chúng chiếm ít hơn 1% tổng

số protein. Dựa trên hệ số lắng của chúng, glycinin và-conglycinin được phân

loại lần lượt là 11S và 7S.[16,17] Glycinin và-conglycinin có các tính chất

hóa lý khác nhau đáng kể, bao gồm thành phần hóa học và cấu hình phân tử.

Glycinin là một hexamer bao gồm sáu monome có trọng lượng phân tử

trung bình từ 320 đến 375 kDa. Ba monome được liên kết với nhau để tạo

thành một trimer thông qua các tương tác kỵ nước và hai trimer được xếp

chồng lên nhau để tạo thành hexamer bằng các tương tác tĩnh điện và liên kết

hydro. Năm loại tiểu đơn vị chính có thể tồn tại trong glycinin, G1, G2, G3,

G4 và G5. Ba tiểu đơn vị G1, G2 và G3 sở hữu khoảng 90% tương đồng trình

tự với hàm lượng phân tử và axit amin lưu huỳnh cao hơn so với G4 và G5,

cũng có khoảng 90% tương đồng trình tự.[21]

β-conglycinin là một tông đơn vị có trọng lượng phân tử khoảng 180

kDa, bao gồm ba tiểu đơn vị được tổ chức bởi các tương tác kỵ nước. Bốn

loại tiểu đơn vị đã được tìm thấy trong β-conglycinin, bao gồm ba tiểu đơn vị

chính là α, α, và và một tiểu đơn vị nhỏ.

Protein bao gồm:

Protein dự trữ (Globulin) có thể bị thủy phân trong thời gian hạt nảy

mầm để làm chất dinh dưỡng cho phôi sinh trưởng

Protein cấu trúc (protein chức năng) như enzyme và chất kìm hãm

enzyme thì được định vị trong phầ còn lại của tế bào

Trong hạt còn có một lượng nhỏ các hợp chất như oestrogen, goitrogen,

saponin,… Các hợp chất này và một số oligosaccharide không có lợi.

8

Bằng phương pháp ly tâm, người ta đã tách được bốn đoạn 2,7,11,15.

Các globulin 7S và 11S chiếm trên 70% tổng lượng protein của hạt. Phương

pháp này được phát triển những năm 1970.

Globulin 2S (gồm chất kìm hãm trypsin và cytochrome) chiếm 35%

trọng lượng protein của hạt.

Globulin 11S (Glycinin) được cấu tạo từ 12 tiểu phần tương đối ưa béo:

6 tiểu phần có tính axit và 6 tiểu phần có tính kiềm. Trong phân tử có từ 42 –

46 nguyên tử lưu huỳnh dưới dạng các cầu disulfua nối các đơn vị hay trong

nội bộ một tiểu phần.

Globulin 7S là β- conglycinin thường chiếm 35% trọng lượng protein

của hạt, là một glucoprotein. Phân tử cấu tạo nên từ 3 tiểu phần có tính chất

acid: α, α’ và β. Các tiểu phần α, α’ có thành phần acid amin rất giống nhau,

thiếu cysteine và cystine. Dưới đon vị β không chưa cysteine và methionine.

Trong đoạn 7S còn có các hemaglutine (lectin) mà phân tử của chúng có thể

tạo thành phức bền với các hợp chất glucid.[7]

Globulin chiếm 85 – 95% hàm lượng protein, khả năng tan của protein

đậu tương phụ thuộc chủ yếu vào khả năng tan của globulin.

Protein đậu tương chủ yếu thuộc loại tan trong nước. Nếu không bị biến

tính trong quá trình chế biến, 85% protein đậu tương sẽ tan trong nước ở pH =

7 và pH = 2, 95% tan ở pH = 11.[7]

2.3.Thủy phân protein bằng enzyme

Protein phân hủy và giải phóng các peptide nhỏ hơn ở điều kiện thủy

phân tối ưu. Đặc tính của các peptide được giải phóng phụ thuộc vào loại

enzyme và điều kiện thủy phân. Đặc tính của các peptide được thoát ra có thể

bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, chẳng hạn như nguồn gốc của enzyme, hoạt

tính enzyme và khả năng chọn lọc, mức độ enzyme trên cơ chất, và điều kiện

9

thủy phân bao gồm pH, nhiệt độ và thời gian. Các peptide được giải phóng

dẫn đến các tính chất chức năng nâng cao tùy thuộc vào tính chất hóa lý của

chúng. Ngoài ra, thủy phân có thể tạo ra những thay đổi trong sự cân bằng của

các phần tích điện (chuỗi bên axit amin) dẫn đến tăng độ hòa tan của phân tử.

Tuy nhiên, những nghiên cứu này được thực hiện ở nồng độ protein tương đối

thấp 0,2 - 1% mà không cần xử lí nhiệt. Độ hòa tan protein bị ảnh hưởng bởi

nhiệt và nồng độ, vì vậy tạo ra một loại protein có hàm lượng cao là một

trong những thách thức lớn nhất trong ngành thực phẩm. Do đó, cần nhiều

nghiên cứu hơn nữa để làm rõ các vấn đề ảnh hưởng của nhiệt độ cũng như

nồng độ cao tới tính ổn định của các protein bị thủy phân và hàm lượng

protein.

Ngoài các hoạt tính chức năng, các peptide hoạt tính sinh học có thể

được giải phóng từ thực phẩm có nguồn gốc protein trong quá trình thủy phân

enzyme bị hạn chế. Các peptide hoạt tính sinh học có đặc tính là các chuỗi

axit amin có nguồn gốc từ protein có thể có tác dụng điều hòa sinh lý đối với

cơ thể con người.

Các a xít amin có thể lien quan tới vị đắng khi sử dụng enzyme để thủy

phân. Đây cũng là nguyên nhân có thể làm hạn chế việc sử dụng enzyme thủy

phân làm nguyên liệu thực phẩm. Thủy phân protein đậu tương một phần có

vị đắng do sự hình thành các peptide trọng lượng phân tử thấp bao gồm các a

xít amin kỵ nước. Độ kỵ nước của một peptide và vị trí của các a xít amin kỵ

nước nói chung có thể lieen quan nhiều đến vị đắng của sản phẩm. Để giảm

những bất lợi đến chất lượng cảm quan trong khi vẫn giữ được chức năng và

hoạt tính sinh học mong muốn, mức độ thủy phân có kiểm soát và hạn chế ở

mức 2 - 8%. Nghiên cứu về whey protein đã chỉ ra rằng hàm lượng mức độ

thủy phân thấp (2 - 8%) là đủ để đạt được các đặc tính chức năng cao và tối

đa giải phóng các peptide hoạt tính sinh học với các peptide trọng lượng phân

10

tử thấp. Do đó, điều quan trọng là duy trì lượng mức độ thủy phân để đạt

được các đặc tính chức năng và hoạt động sinh học mong muốn với việc giảm

tác dụng phụ đối với chất lượng cảm quan.

Thông thường, nhiều peptide hoạt tính sinh học là chuỗi dài tương đối

ngắn, bao gồm từ 2 đến 9 axit amin. Tuy nhiên, một số peptide chứa hơn 20 a

xít amin vẫn có thể có hoạt tính sinh học. Các peptide hoạt tính sinh học

không hoạt động một cách tự nhiên trong một chuỗi protein lớn và có thể

được giải phóng thông qua quá trình phân giải enzyme, cả trong đường tiêu

hóa của con người và trong quá trình chế biến thực phẩm. Trong khi phân giải

enzyme in vivo là ngẫu nhiên và do đó có thể hoặc không dẫn đến việc giải

phóng các peptide hoạt tính sinh học, thủy phân enzyme in vitro có thể được

kiểm soát để giải phóng các peptide với hoạt tính sinh học quan tâm. Sau khi

được giải phóng, các peptide này có đặc tính sinh học tùy thuộc vào trình tự a

xít amin được giải phóng, bao gồm cả hạ huyết áp, chống ung thư, chống oxi

hóa, kháng khuẩn, điều hòa miễn dịch và khả năng lien kết khoáng chất.[11]

2.4. Các phương pháp định lượng protein

2.4.1. Định lượng protein bằng phương pháp Kjendahl

Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc: Hàm lượng nitơ

trong protein chiếm tỉ lệ 15-18% khối lượng phân tử, do đó vô cơ hóa mẫu

bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác, sau đó dùng kiềm mạnh (NaOH hay

KOH) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do. Định lượng

NH3 bằng H2SO4 0,1N.[5]

11

2.4.2. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry

Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp

photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo

phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660nm. Cường

độ mầu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm

vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể

xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.[5]

2.4.3. Phương pháp điện di protein bằng gel acrylamide

a) Nguyên lí hoạt động của SDS- PAGE:

SDS-PAGE (điện di gel natri dodecyl sulphate-polyacrylamide) thường

được sử dụng trong phòng thí nghiệm để tách protein dựa trên trọng lượng

phân tử của chúng. Tốc độ di chuyển chênh lệch của protein qua gel dưới tác

động của điện trường.

SDS được dùng để phá vỡ cấu trúc bậc 3 của protein. SDS được thêm

vào đệm điện di cùng với những chất khử như DDT (dithiotheitol) hoặc B-

ME (beta-mercaptoethanol) để phá vỡ liên kết disulfide trong protein, biến

protein từ dạng không gian (cấu trúc bậc 3) về dạng thẳng (cấu trúc bậc 1).

Đồng thời SDS tích điện âm cho protein, làm cho điện tích của phân tử

protein lớn hơn hẳn điện tích có sẵn của nó (tồn tại ở gốc R trong amino acid).

SDS bám lên protein theo một tỷ lệ ổn định (xấp xỉ 1.4g SDS/ 1g protein), và

điều này làm cho điện tích mới của phân tử protein tỷ lệ với khối lượng phân

tử của nó.[4]

SDS được thêm vào trong thành phần gel để duy trì trạng thái biến tính

của protein (duỗi thẳng, tích điện âm) trong suốt quá trình điện di.

12

Hình 2.1. Quá trình biến tính protein của SDS

Yếu tố duy nhất ảnh hưởng tới sự di chuyển của các phân tử protein

được biến tính bởi SDS chính là kích thước phân tử của chúng. Phân tử

protein được biến tính và tích điện âm sẽ tồn tại ở dạng thẳng, có chiều rộng

khoảng 18 Å, chiều dài tỷ lệ với khối lượng phân tử (do tồn tại ở dạng thẳng).

Kích thước phân tử protein (cùng với đó là tốc độ di chuyển trong gel) được

quyết định bởi khối lượng phân tử của protein. Điện tích của protein không

ảnh hưởng tới quá trình điện di, do các phân tử protein đã được tích điện âm

bởi SDS, và điện tích của mỗi protein lại tỷ lệ với khối lượng phân tử của

chính nó.[4]

2.5. Phương pháp sấy thăng hoa

2.5.1. Định nghĩa

Sấy: là quá trình tách ẩm ra khỏi vật liệu nhằm tránh hư hỏng trong quá

trình bảo quản, tang độ bền cho sản phẩm, giảm trọng lượng, giảm chi phí

chuyên trở và đồng thời nó cũng làm tang giá trị cảm quan cho sản phẩm.

Sấy thăng hoa: là quá trình tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng sự thăng hoa của

nước. Quá trình thăng hoa là quá trình chuyển trực tiếp từ thể rắn qua thể hơi,

ở điều kiện bình thường ẩm trong thực phẩm ở dạng lỏng, nên để thăng hoa

chúng cần chuyển qua thể rắn bằng phương pháp lạnh đông, chính vì vậy còn

gọi là phương pháp sấy lạnh (Freeze Drying hay Liophillisation).

13

Phương pháp sấy thăng hoa do kĩ sư G.I.Lappa Stajenhexki phát minh

năm 1921, được ứng dụng lần đầu tiên ở Nga. [1]

2.5.2. Nguyên lí hoạt động của hệ thống sấy thăng hoa

Quá trình sấy được tiến hành ở áp suất khí quyển, tác nhân sấy là không

khí được đưa vào thiết bị bay hơi của một hệ thống lạnh (bơm nhiệt) để hạ

thấp nhiệt độ của chúng xuống dưới điểm động sương, hơi nước trong không

khí bị ngưng tụ tách ra làm cho không khí có độ chứa hơi giảm về không, áp

suất riêng phần hơi nước trong không khí giảm về không (nhưng không thể

bằng không), không khí này được dẫn qua thiết bị ngưng tụ của hệ thống lạnh

(bơm nhiệt) để đốt nóng, nhiệt độ không khí tăng lên và lớn nhất bằng nhiệt

độ ngưng tụ môi chất lạnh ở thiết bị ngưng tụ. Sau đó, chúng được dẫn vào

buồng sấy chứa sản phẩm, dưới sự chênh lệch áp suất riêng của hơi nước trên

bề mặt sản phẩm với áp suất riêng của hơi nước trong không khí (tác nhân

sấy), hơi nước ở sản phẩm tự bay bốc hơi và làm khô. [1]

Nguyên lý hoạt động của phương pháp sấy thăng hoa:

Giai đoạn 1 – Giai đoạn tiền đông (prefreezing): Trong giai đoạn

này,vật liệu sấy được chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái khí, vật liệu

đông khô trước tiên phải được làm lạnh đến nhiệt độ thích hợp nhiệt độ cấp

đông trong khoảng từ -50°C đến -80°C (-58°F đến -112°F). Giai đoạn này là

quan trọng nhất trong toàn bộ quá trình vì sản phẩm có thể hư hỏng nếu

không thực hiện đúng cách. Phương pháp đông lạnh và nhiệt độ cuối của sản

phẩm lạnh đông có thể ảnh hưởng đến khả năng đông khô thành công của vật

liệu sấy.

Giai đoạn 2 – Giai đoạn sấy chủ yếu (giai đoạn sấy thăng hoa): Một

số yếu tố có thể gây ảnh hưởng tới khả năng đông khô một hỗn hợp huyền

phù đóng băng.

14

Giai đoạn 3 – Giai đoạn sấy thứ cấp (Giai đoạn bốc hơi ẩm còn

lại): Sau khi kết thúc giai đoạn 2, tất cả băng đã thăng hoa. Tuy nhiên vẫn còn

hơi ẩm tồn tại bên trong vật sấy. Sản phẩm nhìn về ngoài giống như có trạng

thái đã khô, nhưng thực tế độ ẩm còn lại tương đối cao khoảng 7-8%. Giai

đoạn sấy thứ cấp này tại nhiệt độ cao hơn là quá trình cần thiết để bốc hơi ẩm

còn lại, giúp quá trình sấy đạt hiệu suất tối đa nhất. Quá trình này được gọi là

sự giải hấp đẳng nhiệt vì độ ẩm liên kết sẽ được bay hơi khỏi sản phẩm.[1]

2.5.3. Ưu nhược điểm của phương pháp sấy thăng hoa

Ưu điểm: Sấy thăng hoa có ưu điểm rất lớn đó là sản phẩm có chất lượng

rất cao (giữ nguyên hương vị, màu sắc, cấu trúc và tính thủy hóa) giữ được

các hoạt tính sinh học không làm mất các vitamin. Tiêu hao năng lượng để

bay hơi hàm lượng ẩm thấp.

Nhược điểm: Giá thành thiết bị cao, vận hành cần có trình độ kỹ thuật

cao, tiêu thụ điện năng lớn. [1]

2.6. Tổng quan tình hình nghiên cứu sản xuất bột protein đậu tương

trong nước và trên thế giới

2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước

Trên thị trường Việt Nam đã có các sản phẩm làm từ đậu tương như là:

Bột đậu nành, bột ngũ cốc, bột mầm đậu nành, đậu phụ, nước tương, bánh đậu

lên men…đó là những sản phẩm được người tiêu dùng biết đến nhiều nhất

hiện nay trên thị trường. Tuy nhiên, protein trong những sản phẩm đó chủ yếu

ở dạng thô, khó có thể phù hợp cho những trường hợp đặc biệt, ví dụ như các

bệnh nhân gặp vấn đề về rối loạn tiêu hóa.

Sản phẩm dạng cô đặc (concentrate) cũng đã được giới thiệu trên thị

trường trong nước ở một số công ty có liên doanh với công ty, tổ chức với

15

nước ngoài. Tuy nhiên hàm lượng protein chỉ khoảng 65% và chủ yếu sử

dụng làm thức ăn chăn nuôi.

Các nghiên cứu về sản xuất protein từ đậu tương với mức tinh sạch như

dạng “isolate” và dạng thủy phân chưa thấy công bố trên các tạp chí khoa học

có uy tín của Việt Nam. Các công bố chủ yếu tập trung về bột protein từ sữa

vốn có nhiều nguồn ý kiến phản đối, ủng hộ đa chiều (Việc tách bê con lấy

sữa và thu nhận thịt bê con bị nhiều tổ chức và cá nhân phê phán về mặt đạo

đức). Do đó, nghiên cứu nguồn protein tinh sạch mới từ thực vật là một

hướng đi mới, có giá trị về mặt thực phẩm và kinh tế đồng thời vượt qua các

rào cản từ các ý kiến đa chiều.

2.6.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Đậu tương là nguồn dinh dưỡng quan trọng ở nước châu Á và ngày càng

được ưa chuộng ở châu Mỹ, châu Âu. Nhờ việc ứng dụng các công nghệ tiến

bộ, người ta đã trích ly riêng protein vốn rất nhiều trong đậu tương. Các chế

phẩm protein đậu tương được sử dụng để chế biến các thực phẩm chức năng

như thực phẩm cho trẻ sơ sinh, thực phẩm trong điều trị bệnh. Nhiều nghiên

cứu đã và đang được tiến hành để làm rõ và khai thác các lợi ích thiết thực

của nguồn protein từ thực vật này.

Năm 2003, Kristen S. Montgomery - tại trường đại học USC

(University of South Carolina) đã công bố trên tạp chí TJPE (The Journal of

Perinatal Education) về các protein và khẳng định những protein này rất tốt

cho sức khỏe của trẻ em và phụ nữ.[12]

Năm 2004, Miroljub B. Barać và cộng sự cũng công bố những quan điểm,

lập luận đồng tình về những lợi ích của protein từ đậu tương. Một số yếu tố

làm giảm dinh dưỡng của sản phẩm từ đậu tương như: Hemagglutinins, phytic

acid, saponins và isoflavones cũng được đề cập tới. Đây là những chất ức chế

16

các enzyme proteases. Tuy nhiên khi ở nồng độ thấp, chúng lại có những tác

dụng có lợi cho sức khỏe. Vì vậy, trong các khuyến cáo về việc phát triển

công nghệ, các vấn đề liên quan tới biến đổi protein như nhiệt độ, chất hóa

học, enzyme được chú ý và đào sâu.[17]

Gần đây nhất, tháng 02 năm 2019, một công bố mới của Eric Banan-

Mwine Daliri và cộng sự về việc thành công trong việc sử dụng protein từ đậu

tương sản xuất sản phẩm sử dụng cho bệnh nhân cao huyết áp với sự kết hợp

của các enzyme từ vi sinh vật cho thấy xu hướng sử dụng và khai thác nguồn

protein thực vật, đồng thời việc kết hợp nhiều thành tựu của các lĩnh vực khoa

học như vi sinh, hóa sinh,...là một xu thế tất yếu.[11]

17

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng, thiết bị và dụng cụ

3.1.1. Đối tượng

Đậu tương hạt (đậu tương thương phẩm): Đậu tương xanh, được mua tại

các đại lý bán buôn, bán lẻ tại khu vực chợ Đồng Quang – Thái Nguyên.

3.1.2. Thiết bị nghiên cứu

Bảng 3.1. Danh mục thiết bị được sử dụng

STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ

1 Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany

2 Bộ điện di Scie – plas Ltd – Uk

3 Bể ủ nhiệt Techne – OSI

4 Máy nước cất Canada Bio Water system – Pall Co.Uk

5 Máy chụp gel Gel Logic 1500 – Kodak – USD

6 Máy đo pH F – 51 BW – Horiba - Japan

7 Máy xay Panasonic

8 Máy ly tâm Eppendorf – CHLB Đức

9 Tủ lạnh Super freezer Eco 130 – Ficchetti – Italy

10 Máy sấy lạnh Metech Việt Nam

11 Máy nghiền bột IKA – WERKE

12 Máy đo quang phổ Thermofisher

13 Cốc đong, ống đong Dinlab – Đức

18

3.1.3. Hóa chất

Bảng 3.2. Danh mục các loại hóa chất được sử dụng

STT Tên hóa chất Hãng sản xuất

Merck Ethanol 1

Merck Isopropanol 2

Merck Tris Base 3

4 Comassia Brilliant Blue R-250 Bio Basic

5 Bromophenol blue Bio Basic

6 Protein ladder Thermo scientific

HCl 7 Trung Quốc

NaOH 8 Trung Quốc

Acetic acid 9 Trung Quốc

Glycerol 10 Biogenix inc private limited

11 Coomassie Brilliant Blue G-250 Bio Basic

12 Temed Bio – Rad

13 Albumin (BSA) Bomei

3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1. Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn sinh học phân tử và Công nghệ gen – Viện Khoa học Sự Sống

– Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên – Tổ 10 – Xã Quyết Thắng – Tp

Thái Nguyên.

3.2.2. Thời gian tiến hành nghiên cứu

Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 01/01/2019 – 30/05/2019.

3.2.3. Nội dung nghiên cứu

- Lựa chọn nguyên liệu và đánh giá hàm lượng protein khô theo

phương pháp Kjeldahl

19

- Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất bột protein isolate

- Định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry

- Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất bột protein thủy phân

- Đánh giá mức độ thủy phân của protein bằng phương pháp điện di

trên gel SDS – PAGE.

3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Lựa chọn nguyên liệu

Tạp chất trong nội dung này được hiểu là các yếu tố không mong muốn

như: Cát, sỏi, các hạt teo lép. Cân 100g đậu sau đó loại bỏ tạp chất, rồi đem

cân lại khối lượng. Nguyên liệu ít tạp chất nhất được lựa chọn cho các nghiên

cứu tiếp theo.

3.3.2. Quy trình nghiên cứu sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương cô đặc

Dựa vào các trang thiết bị có sẵn tại Viện Khoa học Sự sống – Trường

Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu

tương cô đặc và protein thủy phân được nghiên cứu xây dựng như sau:

Bước 1: Tiến hành ngâm đậu tương ở các mức thời gian khác nhau: 4h,

7h, 10h, 12h. Lượng nước ngâm là 250ml/100g đậu, nhiệt độ phòng.

Bước 2: Đậu tương đã ngấm nước, tiến hành loại bỏ vỏ hạt bằng cách

chà xát thủ công sau đó nhúng vào nước. Lớp vỏ đậu tương sau khi tách sẽ

nổi trên mặt nước, dùng tay hoặc rổ hớt bỏ hoàn toàn phần vỏ ra khỏi hạt

đậu tương.

Bước 3: Tiếp theo sau khi tách vỏ, hạt đậu tương được cho vào máy và

cho thêm nước để xay nhỏ mục đích để phá vỡ hạt và giải phóng protein. Giai

đoạn này có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tách protein, đồng thời dùng

nước hòa tan các chất để thu được dung dịch “sữa đậu”, thời gian xay khoảng

3 – 5 phút.

20

Bước 4: Sau khi xay, thu được hỗn hợp đậu tương gồm có dịch sữa đậu

tương và những chất rắn không tan trong nước. Lọc ít nhất 2 lần để có thể thu

được phần dịch sữa đậu nhiều nhất và loại hoàn toàn phần bã ra khỏi dung

dịch sữa đậu tương.

Bước 5: Sau khi thu được dịch lỏng, tiến hành ly tâm lạnh 14000 vòng

trong 30 phút. Ly tâm bỏ dịch nổi thu cặn và sử dụng phương pháp sấy thăng

hoa để sấy khô.

Bước 6: Dùng phương pháp sấy thăng hoa để tạo ra được sản phẩm

dạng bột mịn, thời gian bảo quản lâu.

3.3.3.Quy trình sản xuất bột protein đậu tương thủy phân

Nguyên liệu: Chuẩn bị nguyên liệu sạch tạp chất. Quá trình sản xuất bột

protein thủy phân gồm các công đoạn sau:

Công đoạn 1: Tiến hành ngâm đậu tương ở các mức thời gian khác

nhau: 4h, 7h, 10h, 12h. Lượng nước ngâm là 250ml/100g đậu, nhiệt độ nước

ngâm là 15 – 20˚C (nhiệt độ phòng).

Công đoạn 2: Đậu tương sau khi ngâm được loại bỏ vỏ hạt bằng cách chà

xát thủ công và nhúng vào nước. Lớp vỏ đậu tương sau khi tách sẽ nổi trên mặt

nước, dùng tay hoặc rổ hớt bỏ hoàn toàn phần vỏ ra khỏi hạt đậu tương.

Công đoạn 3: Tiếp theo sau khi tách vỏ, hạt đậu tương được cho vào

máy và cho thêm nước để xay nhỏ nhằm giải phóng protein, đồng thời dùng

nước hòa tan các chất để thu được dung dịch sữa đậu, xay trong thời gian

khoảng 3 – 5 phút.

Công đoạn 4: Hỗn hợp đậu tương sau khi xây gồm có hai thành phần:

Dịch sữa đậu tương và những chất rắn không tan trong nước. Lọc ít nhất 2 lần

21

để có thể thu được phần dịch sữa đậu nhiều nhất và loại hoàn toàn phần bã ra

khỏi dung dịch sữa đậu tương.

Công đoạn 5: Để thu nhận protein trong dịch sữa đậu, dùng axit HCl để

tủa protein hòa tan trong dung dịch. Với sự có mặt của HCl, pH của dung dịch

được đưa về 4,5 là pH đẳng điện của protein globulin. Nhiệt độ kết tủa ở 45˚C

với các mức thời gian khác nhau 1h, 2h, 3h. Sau khi tủa rửa lại bằng nước để

loại bỏ một phần axit ra khỏi dịch thủy phân protein.

Công đoạn 6: Dùng NaOH để trung hòa đưa pH về 7 – 9

Công đoạn 7: Sử dụng máy ly tâm lạnh để ly tâm thu protein bỏ phần

dịch trên, ly tâm 14000 vòng trong thời gian 30 phút.

Công đoạn 8: Sử dụng máy sấy lạnh để sấy với nhiệt độ - 60˚C, áp suất

120mmTorr trong 10h đến 16h.

3.3.4.Định lượng protein tổngsố bằng phương pháp Kjeldahl

Trong phương pháp Kjeldahl, mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 98%,

kết hợp với chất xúc tác để chuyển Nitơ hữu cơ ra dạng vô cơ (NH4)2SO4, rồi

dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối amoni. Các phân tử NH3 sau khi được

giải phóng ra sẽ được cuốn đi bằng dòng hơi nóng. Sau khi được làm nguội sẽ

hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có

mầu xanh trong.

Để xác định lượng ammoniac (NH3) giải phóng ra trong quá trình

chưng cất, tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi nào dung

dịch chuyển sang màu tím nhạt. Dư lượng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá

trình chuẩn độ cho phép tính được lượng protein có trong mẫu.

Thuốc thử và vật liệu:

+ Axit sunfuaric, (H2SO4) = 1,84g/mol

22

+ Chất xúc tác, (Viên xúc tác Kjeltao ST và Kjeltab CM của hang

Gerhardt)

+ Hydroxit natri, (NaOH) 33%

+ Chất chỉ thị màu Tashiro

+ Axit Boric (H3BO3) 4%

+ Axit sunfuric (H2SO4) 0,1N

+ Nước cất

+ Chất chuẩn

Dụng cụ và thiết bị

Hệ thống phân tích Nitơ bao gồm: Bộ công phá mẫu Turbortherm –

Gerhardt và hệ thống chưng cất mẫu Vapodest 40 – Gerhardt, tủ hút có hệ

thống thông gió, máy khuấy từ, Buvet điện tử, cân phân tích điện tử với độ

chính xác 0,0001, ống công phá mẫu Kjeldahl 250ml.

Kết quả

Để có thể biết được hàm lượng protein tổng số ta tính toán theo công thức

V – V1 × f × 0,0014 x 6,25 × 100

X=

m Trong đó:

X: là lượng protein có trong mẫu

V: là lượng H2SO4 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ cho mẫu phân tích (ml)

V1: là lượng H2SO4 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ cho mẫu trắng (ml)

f: là hệ số chuẩn độ a xít (hệ số sử dụng dung dịch)

0,0014: là lượng Nitơ tương ứng với 1ml dung dịch a xít sulphuaric

0,1N

m: là khối lượng mẫu (g)

Chúng ta biết rằng trong chất đạm có chứa khoảng 16% N, vì vậy việc

tính toàn lượng đạm hàm lượng N thường được dùng hệ số 100/16 = 6,25.

23

3.3.5. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry

Nguyên tắc:

Dựa vào cường độ màu xanh của phức đòng chất, protein khử hỗn hợp

Phosphomolipdate – phosphovonphramate (thuốc thử Foling – Ciocalteau).

Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein.[5]

Lập đồ thị chuẩn định lượng protein:

Nguyên liệu và hóa chất:

Albumin tiêu chuẩn 100%.

Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N

Dung dịch B : CuSO4 0,5% trong Natri, kali tactrate 1N

Dung dịch C : 49 ml dung dịch A: 1 ml dung dịch B

Thuốc thử Folling.

Pha dung dịch albumin 0,02% từ albumin gốc tinh khiết 100%. Lấy 6

ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6, cho các chất tham gia phản ứng trong bảng

3.1. Sau đó đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 660nm.

Bảng 3.3. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein theo Lowry

Các ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Hóa chất

Protein 0,02% 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Nước cất (ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

0,1 Lượng protein (ml) 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08

Dung dịch C (ml) 4 4 4 4 4 4

Thuốc thử Follin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Kết quả đo OD ở 660 nm 0,00 0,091 0,182 0,252 0,332 0,377

24

- Cách tiến hành:

+ Mẫu thí nghiệm: Lấy 0,5 ml dung dịch đậu tương, thêm vào 0,5ml

H2O và 4 ml dung dịch C, lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Sau đó

thêm chính xác 0,5 ml thuốc thử Follin nồng độ 1N, lắc đều, để 30 phút sau

đó đem so màu trên máy với bước sóng 660nm.

+ Từ số đọc của mẫu thí nghiệm, đối chiếu với đồ thị để tính ra hàm

lượng protein có trong mẫu.

+ Mẫu đối chứng: Song song với mẫu thí nghiệm, làm ống đối chứng trong

đó thay dung dịch protein bằng nước cất và tiếp tục làm như mẫu thí nghiệm.

Bảng 3.4. Kết quả đo sự ảnh hưởng của thời gian ngâm đến

hàm lượng protein

Thí nghiệm

Đ/c 4h 7h 10h 12h

(T/g) Hóa chất Dd protein mẫu(ml) 0 0,5 0,5 0,5 0,5

Nước cất (ml) 1 0,5 0,5 0,5 0,5

Dd C (ml) 4 4 4 4 4

Dd folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Kết quả OD ở 660nm 0,00 0,0157 0,016 0,0159 0,058

3.3.6.Phương pháp điện di SDS – PAGE để đánh giá mức độ thủy phân của

protein

SDS-PAGE phân tách protein theo trọng lượng phân tử của chúng,

dựa trên tốc độ di chuyển chênh lệch của chúng (gel) dưới tác động của điện

trường. Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau:

25

Bảng 3.5: Thành phần dung dịch pha gel SDS - PAGE

Stacking Seperating Gel Gel

4% 7.5% 10% 12.5% 15% 17.5% 20%

Monomer  2ml 2.67ml 3.34ml 4ml 4.67ml 5.34ml 0.67ml

4☓resolving gel buffer 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 1.25ml 

Water  3.86ml 3.19ml 2.53ml 1.86ml 1.19ml 5.25ml 3ml

10% SDS  80μl 80μl 80μl 80μl 80μl 80μl 50μl

10% APS 60μl 60μl 60μl 60μl 60μl 60μl 25μl

TEMED  4μl 4μl 4μl 4μl 4μl 4μl 5μl

Chuẩn bị gel Seperating 12.5% và Stacking 4%:

- Các bước tiến hành:

+ Chuẩn bị dung dịch

+ Lau sạch 2 tấm kính làm khuôn gel và miếng đệm

+ Rót dung dịch gel vào giữa 2 tấm kính rồi gắn lược vào

+ Để trong nhiệt độ phòng trong 30 phút

+ Rút lược, tháo băng, gắn khuôn gel vào buồng điện di

+ Đổ dung dịch đệm Running buffer 1x vào bể điện di đủ để ngập hết

bản gel.

- Tra mẫu điện di:

+ Sử dụng Loading Buffer => tỉ lệ mẫu được pha trộn là 20µl mẫu +

5µl loading buffer rồi để 100˚C trong 5 phút.

+ Cài đặt chương trình điện di ở hiệu điện thế:

26

Step1: 50V, 100mA, 15W trong 30 phút

Step2: 100V, 200mA, 30W trong 1 giờ 30 phút

- Nhuộm gel với dung dịch Coomassie Blue Stain:

+ Bản gel được lấy ra khỏi bể điện di sau khi điện di xong và được

nhuộm qua đêm.

+ Rửa gel bằng dung dịch Isopropanol Fixing Solution

+ Kiểm tra kết quả điện di và chụp ảnh bản gel.

27

PHẦN 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Lựa chọn nguyên liệu và đánh giá hàm lượng protein khô trong đậu

tương bằng phương pháp Kjeldahl

4.1.1. Lựa chọn nguyên liệu

Để lựa chọn nguyên liệu đậu tương thích hợp cho chế biến sản phẩm

bột protein đậu tương. Loại “đậu tương xanh” có kích cỡ hạt tương đối đồng

đều, màu vàng xanh và ít hạt bị hỏng được lựa chọn làm nguyên liệu ban đầu.

Những tạp chất không mong muốn bị loại bỏ, thu được những hạt chắc và tốt

để đảm bảo cho quá trình sản xuất sản phẩm không bị ảnh hưởng bởi những

yếu tố khác (Hình 4.1).

Hình 4.1. Đậu tương xanh

Đậu tương sau chọn lọc được bảo quản ở nhiệt độ thường, trong túi zip

để tránh côn trùng, hơi ẩm hoặc các tác nhân bên ngoài không mong muốn.

4.1.2. Đánh giá hàm lượng protein khô theo phương pháp Kjeldahl

Kết quả được kiểm tra bằng phương pháp Kjeldahl tại phòng Phân tích

Hóa sinh – Viện Khoa học Sự sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái

Nguyên. Kết quả cho biết trong đậu tương hàm lượng protein thô chiếm

28

37,2%. Nồng độ này phù hợp với hàm lượng protein trong đậu tương nói

chung. Vì vậy, đậu tương xanh là nguyên liệu phù hợp cho nghiên cứu tạo ra

sản phẩm bột protein ở Việt Nam cùng với ưu điểm giá thành thấp, dễ kiếm,

được đông đảo người dân sử dụng.

4.2. Kết quả nghiên cứu sản xuất thử nghiệm bột đậu tương cô đặc

Bột đậu tương cô đặc thường có màu trắng sữa, mịn và có hàm lượng

protein cao. Quy trình sản xuất gồm nhiều công đoạn phức tạp (hình 4.2).

Hình 4.2. Sơ đồ quy trình nghiên cứu sản xuất bột đậu tương protein Isolate

Đầu tiên, những hạt đậu tương có màu sáng, không bị mốc hỏng được

ngâm trong thời gian từ 7h đến 10h ở nhiệt độ phòng. Trong giai đoạn này hạt

hút nước và trương nở đều, nước ngâm không tạo bọt, hạt đậu không bị nhũn,

bề mặt không có màu thâm đen hay màu sắc bất thường.

29

Sau khi ngâm, đậu tương được tách và loại bỏ hết phần vỏ thu được

phần hạt chứa nhiều chất dinh dưỡng. Tiếp đến, đậu tương được xay ướt để

thu được dung dịch có màu trắng sữa chứa protein. Sử dụng một chiếc khăn

sạch để lọc phần dịch sữa đậu và bỏ phần bã. Cần tiến hành lọc tối thiểu hai

lần. Dịch sữa đậu sau lọc có màu trắng sữa và không còn dính phần bã.

Tiến hành đo hàm lượng protein hòa tan của dịch đậu tương sau lọc

theo phương pháp Lowry. Đường chuẩn được cung cấp bởi phòng thí nghiệm

Hóa sinh, viện Khoa học Sự sống, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên (Hình

4.3).

Hình 4.3. Đường chuẩn xác định hàm lượng protein

Từ kết quả đo OD và công thức đường chuẩn, xác định được hàm

lượng protein của các mẫu đậu tương với thời gian ngâm khác nhau. Theo đó

giá trị OD là x, hàm lượng protein trong dung dịch cần xác định là y. Kết quả

hàm lượng protein tính được cho thấy thời gian ngâm đậu cũng ảnh hưởng

đến kết quả thu protein trong quá trình nghiên cứu (bảng 4.1). Thời gian ngâm

quá ngắn sẽ làm đậu trương nở không hoàn toàn, ảnh hưởng tới quá trình xay

kế tiếp, các mảnh hạt còn nhiều. Thời gian ngâm trong nước lâu, bề mặt nước

30

thường tạo váng, có mùi chua. Nguyên nhân có thể do thay đổi pH trong quá

trình trao đổi chất của hạt hoặc sự phát triển của vi sinh vật. Điều này sẽ ảnh

hưởng đến chất lượng sản phẩm.

Bảng 4.1. Hàm lượng protein đậu tương hòa tan ở bước thu dịch sữa đậu

Thời gian Mật độ quang (A) Hàm lượng protein (%) STT ngâm mẫu

0,0157 1 4h 40

0,016 2 7h 45

0,0159 3 10h 43

0,0158 4 12h 42

Dung dịch sữa đậu sau lọc được ly tâm và loại bỏ dịch nổi. Cuối cùng,

sử dụng phương pháp sấy thăng hoa ở nhiệt độ -60˚C. Kết quả cho thấy sản

phẩm thu được có dạng bột mịn và có màu trắng sữa (hình 4.3E). Hình thức

bột đẹp mắt tạo cảm quan tích cực, có mùi rất nhẹ đặc trưng của đậu tương.

Bột đậu tương cô đặc sau khi sản xuất thử nghiệm được kiểm tra hàm lượng

protein tại phòng Phân tích Hóa sinh – Viện Khoa học Sự sống – Trường Đại

học Nông Lâm Thái Nguyên bằng phương pháp Kjeldahl thu được kết quả

protein là 44,22%.

Từ kết quả trên cho thấy hàm lượng protein sau thu nhận chưa thực sự

cao. Nguyên nhân có thể do quá trình thu nhận protein bằng ly tâm không thu

nhận được toàn bộ protein hòa tan, hoặc quá trình lọc gây thất thoát protein.

Các nghiên cứu nhằm tối ưu hóa quá trình thu nhận protein vẫn đang được

tiếp tục nghiên cứu và thử nghiệm.

31

A-Đậu tương nguyên hạt B- Sau khi tách vỏ

C- Sau khi xay ướt D- Sau khi lọc

Chú thích:

- Hình A và B: Nguyên liệu ban đầu

- Hình C: Hỗn hợp đậu tương trước

lọc

- Hình D: Hỗn hợp đậu tương sau lọc

- Hình E: Bột đậu tương cô đặc thử

nghiệm

E- Sau khi sấy khô

Hình 4.4. Một số hình ảnh sản xuất thử nghiệm bột protein đậu tương cô đặc

32

4.3. Kết quả nghiên cứu sản xuất thử nghiệm bột protein đậu tương

thủy phân

Bột đậu tương có thể được thủy phân bằng enzyme hoặc axit HCl. So

với bột protein cô đặc, trong protein thủy phân có nhiều thành phần peptide,

có ý nghĩa trong việc sản xuất các sản phẩm cho người có chế độ ăn đặc

biệt. Quy trình sản xuất tổng quát gồm nhiều bước với những điều kiện

riêng (hình 4.4).

Hình 4.5. Sơ đồ quy trình thủy phân protein đậu tương

Sự khác biệt trong quá trình sản xuất protein đậu tương cô đặc và

protein thủy phân là quá trình thủy phân bằng axit HCl loãng và trung hòa

bằng NaOH loãng để đưa pH về mức trung tính hoặc kiềm nhẹ. Nếu thay thế

33

HCl bằng enzyme sẽ rút ngắn được bước trung hòa bằng kiềm trong quá trình

sản xuất. Phần protein sau ly tâm được sấy bằng phương pháp sấy thăng hoa ở

nhiệt độ - 60, áp suất 120mmTorr trong 10 đến 16h (hình 4.5).

A- Sau khi thủy phân bằng HCl B- Trung hòa

C- Sau khi ly tâm D- Bột khi sấy khô

E-Bột sau nghiền

Hình 4.6. Một số hình ảnh sản xuất thử nghiệm bột protein đậu tương

thủy phân

34

Kết quả cho thấy, sau khi thủy phân bằng axit HCl, hỗn hợp sữa đậu

tương chia thành hai phần rõ rệt (Hình 4.5 A). Dịch trong phía trên là nước

và các tạp chất, phần dịch trắng phía dưới chứa các protein đậu tương đang

được quan tâm. Sau khi trung hòa, ly tâm và sấy khô, thu nhận được bột đậu

tương có màu vàng nhạt, mềm, mịn. Sử dụng phương pháp đo Kjeldahl, xác

định được hàm lượng protein trong mẫu thủy phân là 60,74%.

Thay thế HCl bằng hỗn hợp enzyme bromelain từ dứa cũng thu được

kết quả đáng chú ý. Sau khi bổ sung dịch chiết dứa vào dịch đậu tương sau hai

lần lọc, dung dịch cũng chia thành hai pha (Hình 4.6). Tuy nhiên sản phẩm

cuối dạng bột có độ mịn kém. Mặt khác dịch chiết dứa có chứa enzyme

protease nhưng ở dạng thô, còn nhiều tạp chất, có thể làm ảnh hưởng hoạt

động của enzyme vì vậy cần nghiên cứu thêm.

A B

Hình 4.7: Thử nghiệm sản xuất bột protein thủy phân từ dịch chiết thô enzyme

thực vật

A: Dung dịch sữa đậu tương sau thủy phân; B: Bột protein.

35

4.3.1 Kết quả phân tích đánh giá mức độ thủy phân của protein bằng

phương pháp điện di

Để biết được mức độ thủy phân protein đậu tương, phương pháp chạy

điện di protein SDS – PAGE được sử dụng. Sử dụng dung dịch protein sau

thủy phân bằng HCl và thử nghiệm thủy phân trong 1h, 2h, 3h (hình 4.7).

Hình 4.8. Kết quả điện di mẫu protein thủy phân

Kết quả cho thấy giếng số 1(đối chứng) có nhiều băng đậm do hàm

lượng protein còn nhiều, chưa bị thủy phân. Giếng số 2, số 3, số 4 có mẫu

tương ứng với lượng protein thủy phân sau 1,2,3 giờ. Các băng protein thu

được theo thứ tự có kích thước nhỏ dần do lượng protein bị thủy phân ngày

càng nhiều. Điều này cho thấy thời gian thủy phân có tác động rõ rệt tới

sản phẩm thủy phân.

36

PHẦN 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận

- Đã xác định được đậu tương xanh là nguyên liệu phù hợp để sản

xuất bột protein đậu tương.

- Đã đánh giá được thời gian ngâm xử lí đậu tương xanh trong quá trình

nghiên cứu sản xuất.

- Đã bước đầu sản xuất thành công bột protein cô đặc và bột protein

thủy phân từ đậu tương.

- Đã xác định được hàm lượng protein trước và sau khi sản xuất.

- Đã đánh giá được mức độ thủy phân của protein trong nhiều giờ

khác nhau.

- Đã xác định được hiệu quả lọc chưa cao là nguyên nhân gây thất thoát

protein trong quá trình nghiên cứu sản xuất.

5.2. Đề nghị

Do thời gian nghiên cứu ngắn nên nhiều vấn đề phát sinh trong quá

trình nghiên cứu vẫn chưa được giải quyết triệt để, vì vậy nhóm nghiên cứu

xin đưa ra một số đề nghị như sau:

- Tiếp tục tiến hành nghiên cứu để có thể đưa ra được sản phẩm bột

protein đậu tương có hàm lượng cao ≥ 90%.

- Tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện khả năng ứng dụng các enzyme

thực vật, vi sinh vật vào quá trình thủy phân để tăng năng suất thu hồi, tăng

khả năng thủy phân và đánh giá mức độ an toàn thực phẩm.

37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

1. Trần Đức Ba – Phạm Văn Bôn – Chuomk L.G – Larianovski C.I –

Parkkaladze E.G – “Công nghệ lạnh thực phẩm nhiệt đới”, NXB ĐHBK

TpHCM 1993.

2. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp Hà Nội.

3. Đàm Sao Mai (2010), “Hóa sinh thực phẩm” –, NXB ĐHQG TP Hồ Chí

Minh

4. Võ Công Thành (2004), “Giáo trình kỹ thuật điện di”, Khoa Nông Nghiệp

trường ĐH Cần Thơ.

5. Nguyễn Quang Vinh, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa, “Thực tập

hóa sinh”, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, (2004).

Tài liệu nước ngoài

6. Cynthia Chatterjee, Stephen Gleddie, and Chao-Wu Xiao (2018),

“Soybean Bioactive Peptides and Their Functional Properties”.

7. Chun Liu, Hongling Wang, Zhuimei Cui, Xiaoling Hia, Xiaseng Wang

(2006). “Otimizaion of extration and isolation for 11S and 7S globulis of

soybean seed strage protein”.

8. De Angelis E., Pilolli R., Bavaro S.L., Monaci L (2017). “Insight into the

gastro-duodenal digestion resistance of soybean proteins and potential

implications for residual immunogenicity”, Food Funct.

9. Erdman và Fordyce, (1989).Soy products and the human diet.

10. Eric Banan-Mwine Daliri, Fred Kwame Ofosu, Ramachandran Chelliah,

Mi Houn Park, Jong-Hak Kim 2 and Deog-Hwan Oh (2019)

“Development of a Soy Protein Hydrolysate with an Antihypertensive

Effect”, International Journal of Molecular Sciences, 20, 1496.

38

11. Jookyeong Lee (2011), “Soy protein hydrolysate; solubility, thermal

stability, bioactivity, and sensory acceptability in a tea beverage”,

University of Minnesota.

12. Kristen S. Montgomery (2003), “Soy Protein, The Journal of Perinatal

Education”, The Journal of Perinatal Education, Vol. 12, No. 3

13. Ma, C – Y (2015), “Soy bean/ Soy Concentrates and Isolates”, Reference

Module in food science.

14. Messina MJ, Loprizi CL (2001), “Soy for breast cancer survivors”.

15. Miroljub B. Barać, Slađana P. Stanojević, Snežana T. Jovanović and

Mirjana B. Pešić (2004), “Soy protein modification - A review”,

University of Belgrade, Faculty of Agriculture.

16. Nutritional Aspects, and Utilization – Joseph G. Enders, Ph.D, “Soy

protein products Characteristics”, The Endres Group, Inc.Fort Wayne,

Indiana.

17. Park J.H., Jeong H.J., Lumen B.O.(2007), “In vitro digestibility of the

cancer-preventive soy peptides lunasin”, Food Chem.

18. Song W.O., Chun O.K., Hwang I., Shin H.S., Kim B.G., Kim K.S., Lee

S.Y., Shin D., Lee S.G,(2007), “Soy isoflavones as safe functional

ingredients”, J. Med. Food.

19. W. J. Stadelman, A. Watrins, (1997),“Analysis of Food Constiunents”,

Wiley – VCH.

20. Wang Q., Ge X., Tian X., Zhang Y., Zhang J., Zhang P.(2013), “Soy

isoflavone: The multipurpose phytochemical (Review) Biomed”,Rep.

21. Wang W., De Mejia E.G.(2005), “A new frontier in soy bioactive peptides

that may prevent age-related chronic diseases”,Comp. Rev. Food Sci.

Food Saf.

39

22. Yamada Y., Muraki A., Oie M., Kanegawa N., Oda A., Sawashi Y.,

Kaneko K., Yoshikawa M., Goto T., Takahashi N., et al.(2012),

“Soymorphin, a soy-derived mu-opioid peptide, decreases glucose and

triglyceride levels through activating adiponectin and PPARalpha systems

in diabetic KKAy mice”. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.