Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu tách chiết polyphenol từ bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép và hướng tới ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ MAI LIÊN

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT POLYPHENOL TỪ BÃ ỔI ĐÀO SAU KHI

SẢN XUẤT NƯỚC ÉP VÀ HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG KIỂM SOÁT QUÁ

TRÌNH OXY HÓA THỨC ĂN CHĂN NUÔI GIÀU CHẤT BÉO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo:

Chính quy

Chuyên nghành: Công nghệ Thực phẩm

Khoa:

CNSH - CNTP

Khóa học:

2016 - 2020

Thái Nguyên - 2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ MAI LIÊN

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT POLYPHENOL TỪ BÃ ỔI ĐÀO SAU KHI

SẢN XUẤT NƯỚC ÉP VÀ HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG KIỂM SOÁT QUÁ

TRÌNH OXY HÓA THỨC ĂN CHĂN NUÔI GIÀU CHẤT BÉO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo:

Chính quy

Chuyên nghành: Công nghệ Thực phẩm

Lớp:

K48 - CNTP

Khoa:

CNSH - CNTP

Khóa học:

2016 - 2020

Người hướng dẫn: TS. Lương Hùng Tiến

Thái Nguyên - 2020

i

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Nghiên cứu tách chiết polyphenol từ bã ổi đào sau khi sản xuất

nước ép và hướng tới ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa thức ăn chăn nuôi

giàu chất béo” là nội dung em lựa chọn để nghiên cứu và làm khóa luận tốt nghiệp

sau bốn năm theo học chuyên ngành Công nghệ thực phẩm tại trường Đại học Nông

Lâm Thái Nguyên.

Để hoàn thành quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này, trước tiên

em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên,

các phòng ban liên quan, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP đã giảng dạy, hướng

dẫn để em có những kiến thức như ngày hôm nay.

Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo hướng dẫn: TS. Lương

Hùng Tiến thuộc khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm trường Đại

học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời

gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp đại học.

Tiếp theo em xin cảm ơn Th.S Lưu Hồng Sơn và các cán bộ thuộc khoa

Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm đã hướng dẫn các kỹ năng trong

phòng thí nghiệm, động viên tinh thần và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể

hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Cuối cùng em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã

luôn động viên, khích lệ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu để hoàn

thành tốt đề tài.

Trong quá trình thực hiện nghiên cứu không thể tránh khỏi những thiếu sót

nên em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn để khóa luận được

hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Mai Liên

ii

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

Polyphenol tổng số (Total polyphenol Content) TPC

EtOH Ethanol

MeOH Methanol

DW Trọng lượng khô (Dry weight)

DPPH 2, 2-Diphenyl-1picrylhydrazyl

GAE Gallic acid equivalent (axit gallic tương đường)

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm........................................................... 18

Bảng 3.2. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm .............................................. 19

Bảng 3.3. Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu ............................................................. 27

Bảng 3.4. Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng polyphenol

của dịch chiết bã ổi đào ........................................................................... 27

Bảng 4.1. Bảng so sánh hàm lượng polyphenol thu được ở các loại dung môi

khác nhau ......................................................................................... 37

Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến

hàm lượng polyphenol ............................................................................. 38

Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng

polyphenol ............................................................................................... 38

Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng

polyphenol ............................................................................................... 39

Bảng 4.5. Kết quả ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố chiết Polyphenol

từ bã ổi đào .............................................................................................. 40

Bảng 4.6. Kết quả ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố chiết polyphenol từ

bã ổi đào ................................................................................................... 41

Bảng 4.7. Kết quả đáng giá chỉ tiêu vi sinh vật theo 10TCN 863:2006 ................... 44

Bảng 4.8. Chỉ số axit và chỉ số peroxyt ban đầu của thức ăn chăn nuôi ................... 44

Bảng 4.9. Sự biến đổi chỉ số axit và chỉ số peroxyt của thức ăn chăn nuôi có bổ sung

dịch chiết polyphenol trong 30 ngày bảo quản ........................................ 45

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1. Quả ổi .......................................................................................................... 3

Hình 2.2. Lá, Hoa, Quả và hạt, thân và vỏ cây ổi ....................................................... 4

Hình 2.3. a) Quả ổi ruột đỏ b) Quả ổi ruột trắng ........................................................ 4

Hình 2.4. Epicatechin .................................................................................................. 9

Hình 2.5. Epigalocatechin ........................................................................................... 9

Hình 2.6. Quercetin ..................................................................................................... 9

Hình 2.7. Kampherol ................................................................................................... 9

Hình 2.8. Antocyanidin ............................................................................................. 10

Hình 2.9. Polyphenol ................................................................................................. 10

Hình 4.1. Bề mặt đáp ứng hàm lượng polyphenol .................................................... 42

Hình 4.2. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu ở hàm lượng polyphenol ..................... 42

Hình 4.3. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết bã ổi đào .......................... 43

Hình 4.4. Sơ đồ hoàn thiện quy trình tách chiết polyphenol .................................... 46

v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT ................................................................. ii

DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... iv

MỤC LỤC ................................................................................................................... v

Phần 1. MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1

1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1

1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................ 2

1.3. Yêu cầu ................................................................................................................. 2

1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................ 2

1.4.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................................. 2

1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................... 2

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3

2.1. Giới thiệu về cây ổi .............................................................................................. 3

2.1.1. Đặc điểm thực vật ............................................................................................. 3

2.1.2. Đặc điểm phân bố và sinh thái .......................................................................... 4

2.1.3. Thành phần hóa học của quả ổi ......................................................................... 4

2.1.4. Hoạt tính sinh học và công dụng ....................................................................... 5

2.2. Giới thiệu chung về polyphenol và cơ chế chống oxy hóa của hợp chất

polyphenol ................................................................................................................... 7

2.2.1. Polyphenol ......................................................................................................... 7

2.2.2. Cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất polyphenol ...................................... 11

2.3. Gốc tự do, quá trình oxy hóa chất béo ............................................................... 13

2.3.1. Gốc tự do ......................................................................................................... 13

2.3.2. Quá trình oxy hóa ............................................................................................ 14

2.3.3. Biện pháp hạn chế quá trình oxy hóa .............................................................. 14

2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết polyphenol [5] ......................... 14

vi

2.4.1. Loại dung môi ................................................................................................. 14

2.4.2. Tỷ lệ dung môi trên nước ................................................................................ 15

2.4.3. Thời gian chiết ................................................................................................ 15

2.4.4. Nhiệt độ chiết .................................................................................................. 15

2.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới ............................................. 15

2.5.1. Trên thế giới .................................................................................................... 15

2.5.2. Trong nước ...................................................................................................... 17

Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 18

3.1. Đối tượng, địa điểm, vật liệu và thời gian nghiên cứu ...................................... 18

3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu ........................................................................ 18

3.1.2. Hoá chất sử dụng ............................................................................................. 18

3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ........................................................................... 19

3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................ 19

3.2.1. Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................... 19

3.2.2. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 20

3.2.3. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................... 20

3.3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 20

3.4. Phương pháp phân tích ....................................................................................... 20

3.4.1. Xác định trọng lượng khô của nguyên liệu ..................................................... 20

3.4.2. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số ........................................................ 22

3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 22

3.5.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu ...................................................................... 22

3.5.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................................ 23

3.5.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 4: Đánh giá khả năng chống oxy hóa của

dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn

nuôi giàu chất béo ..................................................................................................... 28

3.5.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 5: Hoàn thiện quy trình thu dịch chiết từ

bã quả ổi đào ............................................................................................................. 35

3.6. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 35

vii

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 36

4.1. Kết quả đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu ............................................ 36

4.1.1. Kết quả xác định trọng lượng khô của nguyên liệu ........................................ 36

4.1.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số ........................................... 36

4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã

ổi đào ......................................................................................................................... 37

4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và nồng độ của dung môi chiết đến

hàm lượng polyphenol .............................................................................................. 37

4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng

polyphenol ................................................................................................................. 37

4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol .............. 38

4.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol ............... 39

4.3. Thử nghiệm tách chiết trên điều kiện tối ưu ...................................................... 40

4.3.1. Kết quả thử nghiệm tối ưu hóa quá trình tách chiết polyphenol từ bã ổi đào . 40

4.4. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào thông qua

khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và ứng dụng bảo

quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo ....................................................................... 42

4.4.1. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào thông qua

khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) .............................. 42

4.4.2. Kết quả ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo ........................ 44

4.4.3. Khảo sát hàm lượng chất béo có trong thức ăn chăn nuôi giàu chất béo ........ 44

4.5. Hoàn thiện quy trình tách chiết polyphenol từ bã ổi đào ................................... 46

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 47

5.1. Kết luận .............................................................................................................. 47

5.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 48

PHỤ LỤC

1

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây việc tiêu thụ nhiều loại nước trái cây nhiệt đới có

giá trị dinh dưỡng đã tăng lên đáng kể. Quả ổi là một nguồn thực phẩm có nhiều

chất chống oxy hóa như polyphenol và β-carotenes [9, 10 và 11]. Trong ổi cũng có

một lượng lớn vitamin như axit ascorbic [11] và là một nguồn chứa rất nhiều các

khoáng chất quan trọng như photpho, canxi, và sắt [10, 12]. Hơn nữa, quả ổi có thể

được làm thành nhiều dạng sản phẩm thực phẩm nhờ có mùi hương rất đặc biệt.

Quả ổi còn được sử dụng để sản xuất sản phẩm nước ép công nghiệp hay phối trộn

với các loại nước ép khác. Sau khi sản xuất nước ép ổi đào, lượng bã còn lại cũng

có thể được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi. Các nghiên cứu đã được tiến hành trên

lượng bã còn sót lại từ quá trình sản xuất nước ổi ép cho thấy vẫn còn các hợp chất

polyphenol như axit polyphenol và flavonoid, là các hợp chất chống oxy hóa.Việc

tái sử dụng một cách hiệu quả lượng bã quả ổi thừa có thể là nguồn cung cấp

polyphenol quan trọng, thể hiện qua nghiên cứu gần đây của Jimenez-Escrig và

cộng sự [13]. Vì vậy tách chiết triệt để các hợp chất có giá trị từ bã quả ổi sau khi ép

giúp tránh lãng phí một cách có hiệu quả. Việt Nam là một quốc gia nhiệt đới sản

xuất nhiều loại nước trái cây như: ổi, măng cụt, sầu riêng,... Quả ổi là một trong

những loại trái cây hàng đầu được phân phối trên toàn quốc. Tuy nhiên việc bảo

quản còn nhiều hạn chế, do thực tế quả ổi rất dễ thâm sạm, hư hỏng và không thể

cất giữ trong một thời gian dài nếu như không có nguồn ra là các nhà máy sản xuất

hoặc siêu thị sẽ dẫn đến giá bán giảm và dẫn đến thua lỗ cho nông dân. Do đó,

nghiên cứu này nhằm mục đích tận dụng triệt để các hoạt chất còn sót lại trong bã ổi

đào sau khi sản xuất nước ép của các nhà máy để sử dụng làm sản phẩm phụ phẩm

có giá trị. Các polyphenol không chỉ là các hoạt chất đóng vai trò quan trọng đối với

sức khỏe của con người mà chúng còn đóng vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe

của vật nuôi. Bên cạnh đó thức ăn thành phẩm rất dễ bị oxy hóa đặc biệt đối với

thức ăn thành phẩm có hàm lượng chất béo cao hoặc thức ăn được bảo quản trong

thời gian dài ở điều kiện không thuận lợi gây ra mùi khó chịu và làm hao hụt dinh

dưỡng trong thức ăn của vật nuôi.

2

Từ lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tách chiết

polyphenol từ bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép và hướng tới ứng dụng kiểm

soát quá trình oxy hóa thức ăn chăn nuôi giàu chất béo”.

1.2. Mục đích nghiên cứu

- Tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào sau khi sản xuất nước ép ổi đào.

- Đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết và hướng tới ứng dụng bảo quản

thức ăn chăn nuôi giàu chất béo.

1.3. Yêu cầu

- Đánh giá được thành phần nguyên liệu ban đầu.

- Nghiên cứu lựa chọn được một số thông số tách chiết polyphenol thích hợp

- Tối ưu hóa được điều kiện chiết polyphenol trên dung môi đã chọn.

- Đánh giá được hoạt tính sinh học của dịch chiết polyphenol và thử nghiệm

kiểm soát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol trong việc bảo quản

thức ăn chăn nuôi giàu chất béo.

- Hoàn thiện được quy trình tách chiết dựa trên các thông số công nghệ đã

phân tích.

1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

1.4.1. Ý nghĩa khoa học

Tạo ra quy trình tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào và đánh giá được

hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết.

Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào

kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn.

Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế

cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này.

1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Góp phần gia tăng hiệu quả kinh tế cho người dân trồng ổi với khả năng

tận dụng phụ phẩm từ quả ổi.

Hướng tới ứng dụng thử nghiệm polyphenol từ bã quả ổi vào bảo quản thức

ăn chăn nuôi ngăn ngừa sự oxy hóa chất béo.

3

Phần 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về cây ổi

Ổi (danh pháp khoa học: Psidium guajava) là loài cây ăn quả thường xanh

lâu năm, thuộc họ Đào kim nương, có nguồn gốc từ Brasil được Carl Linnaeus mô

tả khoa học đầu tiên vào năm 1753.

Cây Ổi thuộc:

Giới Plante

Bộ Myrtalet

Họ Myrtaceae

Chi Psidium

Loài Psidium guajava

Hình 2.1. Quả ổi

2.1.1. Đặc điểm thực vật

Chi Psidium có 3 loài chính là:

- Psidium littorale Raddi (ổi xẻ): cây gỗ nhỏ, cao khoảng 6m, nhánh tròn. Lá

không có lông. Hoa đơn độc mọc ở nách lá, màu trắng [2].

- Psidium cujavillus Burm (ổi cảnh): cây gỗ nhỏ, cao 2 - 3m, nhánh non

vuông. Lá có phiến nhỏ, dài 3 - 5cm, rộng 1 - 1,8cm; gân phụ 11 - 15 cặp, cuống lá

dài 1 - 2mm. Hoa trắng, đơn độc mọc ở kẽ lá, cọng ngắn, lá đài dày, nhiều nhị. Quả

tròn, to khoảng 2 - 3,5cm, hột nhiều, nhỏ [2].

- Psidium guajava L. là cây gỗ cao 3 - 5m, cành non vuông, có lông mềm,

cành già hình trụ nhẵn. Thân có vỏ mỏng, trơn nhẵn, khi già bong ra từng mảng. Lá

đơn, mọc đối, hình bầu dục, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có gân nổi rõ. Hoa

trắng mọc đơn độc hoặc tập trung 2 - 3 cái ở kẽ lá, có 4 - 5 cánh hoa, rất nhiều nhị,

chỉ nhị rời, bao phấn có trung đới rộng, bầu dưới 5 ô dính vào ống đài. Quả hình

4

cầu, khi xanh có vị chua chát, khi chín màu vàng, ruột màu đỏ, trắng hoặc vàng, có

vị ngọt. Quả mọng, ở đầu quả có sẹo của đài tồn tại, có rất nhiều hạt hình thận [3].

Hình 2.2. Lá, hoa, quả và hạt, thân và vỏ cây ổi

2.1.2. Đặc điểm phân bố và sinh thái

Ở Việt Nam, ổi là cây ăn quả quan trọng được trồng hầu như ở khắp các địa

phương cả vùng đồng bằng và vùng miền núi, tuy nhiên chúng không có ở những

vùng cao trên 1500m. Ổi trồng có khoảng 7 - 10 giống khác nhau, là cây ưa sáng,

sinh trưởng phát triển tốt trong một giới hạn rộng của vùng khí hậu nhiệt đới và cận

nhiệt đới, ra hoa và quả hàng năm [4].

Hình 2.3 a) Quả ổi ruột đỏ b) Quả ổi ruột trắng

2.1.3. Thành phần hóa học của quả ổi

Thành phần hóa học của quả ổi bao gồm: Flavonoid, tanin, tinh dầu, vitamin

C, đường, carotene ,…

- Flavonoid: Trong cả quả xanh và chín đều có quercetin, leucocyanidin,

mecocyanidin, guajavarin [19].

- Tanin: Với hàm lượng cao khi quả còn xanh và thấp hơn khi quả chín, cũng

thuộc loại pyrogalol với cả arabio ester của acid ellagic, acid gallic,.. [4].

5

- Tinh dầu: β-carophylen (24,1%), nerolidol (17,3%), 3-phenyl acetat (5,3%),

carophyllen oxid (5,1%) [20].

- Các thành phần khác:

+ Quả ổi rất giàu giá trị dinh dưỡng. Phân tích thành phần hóa học của quả ổi ở

Ấn Độ cho thấy: nước (81,7%), protein (0,9%), chất béo (0,3%), sợi (5,2%), các hydrat

carbon chủ yếu ở dạng đường khử (11,2%), các hợp chất vô cơ (0,7%), Ca, Mg, acid

oxalic, P, Fe, Na, Cu, sulfua, thiamin, riboflavin, acid nicotinic, vitamin C [4].

+ Hàm lượng vitamin C trong quả ổi gấp 4 - 10 lần quả chanh, chúng thay

đổi khá nhiều, trung bình từ 100 - 1000mg/100g, nhiều nhất ở phần vỏ quả rồi đến

phần cùi [4].

+ Hạt ổi chiếm 6 - 12% trọng lượng quả và có khoảng 14% một chất dầu béo

có mùi thơm [4].

2.1.4. Hoạt tính sinh học và công dụng

Ổi không chỉ là một nguồn thực phẩm dinh dưỡng mà còn giống như một

loại thuốc dân gian được sử dụng rộng rãi ở các khu vực cận nhiệt đới trên toàn thế

giới [21]. Người ta biết rằng ổi thường được sử dụng ở nhiều nơi trên thế giới để

chữa nhiều bệnh như tiêu chảy, hạ sốt, kiết lỵ, viêm dạ dày ruột, tăng huyết áp, tiểu

đường, sâu răng, giảm đau...

Hoạt động kháng khuẩn

Quả ổi có hoạt tính kháng khuẩn cao, chúng chứa các hoạt chất chống ung

thư và chống oxy hóa. Có rất nhiều hợp chất như axit Gallic, galangin, kaempferol,

homogentisic acid và cyanidin 3-glucoside được tìm thấy trong vỏ, hạt và bã của

quả ổi theo nghiên cứu của Chen Y và cộng sự [22].

Hoạt động chống tiêu chảy

Tiêu chảy là một trong những vấn đề sức khỏe phổ biến và được công nhận

và là vấn đề toàn cầu. Nó rất phổ biến ngay cả ở các nước phát triển. Ước tính có

khoảng 2,2 triệu người chết hàng năm do tiêu chảy; hầu hết trong số họ, là trẻ em

hoặc trẻ sơ sinh [23].

6

Quả ổi được sử dụng để điều trị tiêu chảy do độc tố E. coli hoặc S. aureus

theo nghiên cứu của Vieira RHSF và cộng sự [24].

Chiết xuất từ quả ổi có hoạt tính chống tiêu chảy và nó được sử dụng để điều

trị và phòng ngừa tiêu chảy theo nghiên cứu của Ojewole J và cộng sự [25].

Hoạt động chống viêm

Chiết xuất từ quả ổi cho thấy Phenol là một hợp chất quan trọng có trong quả ổi

và rất quan trọng trong hoạt động chống dị ứng và chống viêm thể hiện trong nghiên

cứu của Denny C và cộng sự [26]. Một nghiên cứu khác của Roy CK cho thấy chiết

xuất từ quả ổi có hiệu quả trong điều trị viêm gan và sản xuất huyết thanh [27].

Hoạt động chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là các phân tử làm chậm quá trình oxy hóa. Các phản

ứng oxy hóa có thể tạo ra các gốc tự do gây tổn hại cho các tế bào bằng cách bắt

đầu các phản ứng khác nhau. Các gốc tự do gây tổn hại cho các tế bào gây ung thư

và nhiều bệnh khác. Chất chống oxy hóa bao gồm beta-carotene, lycopene, vitamin

C, E và A, polyphenol và một số chất khác. Phản ứng oxy hóa là một trong những

phản ứng phá hủy quan trọng nhất. Các gốc tự do gây ra rất nhiều rối loạn ở người

như rối loạn thần kinh, ung thư, nhiễm virus... Các gốc tự do này tác động gây ra

các phản ứng oxy hóa qua nghiên cứu của Masuda T và cộng sự [28].

Quả ổi rất giàu chất chống oxy hóa rất hữu ích trong việc làm giảm tỷ lệ mắc

các bệnh như rối loạn chức năng não, viêm, bệnh tim, ung thư, xơ cứng động mạch

và viêm khớp [29]. Trong trái cây, chất oxy hóa dồi dào nhất là polyphenol và axit

ascorbic. Các polyphenol chủ yếu là flavonoid và chủ yếu hiện diện ở dạng

glycoside và ester [30].

Quả ổi có hàm lượng cao axit protocatechuic, quercetin, axit ferulic, axit

ascorbic, quercetin, axit gallic và axit caffeic là những chất chống oxy hóa quan

trọng [31, 32].

7

2.2. Giới thiệu chung về polyphenol và cơ chế chống oxy hóa của hợp chất

polyphenol [5]

2.2.1. Polyphenol

Polyphenol là các hợp chất mà phân tử của chúng chứa nhiều vòng Benzen,

trong đó có một, hai hoặc nhiều hơn hai nhóm Hydroxyl (OH-). Dựa vào đặc trưng

của cấu tạo hóa học người ta chia ra các hợp chất polyphenol thành ba nhóm chính:

+ Nhóm hợp chất phenol C6-C1

Có đặc điểm trong cấu tạo phân tử gồm vòng benzen liên kết với nhóm COOH.

Đại diện thường gặp:

- Galic acid: có nhiều ở thực vật ở cả dạng tự do và liên kết:

- Vallinin: Có mùi thơm đặc biệt, ở dạng glycoside, có nhiều trong quả và

được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp xà phòng, công nghiệp thực phẩm với tư

cách là chất thơm.

- Protocatechin acid: Có nhiều trong hành, tỏi.

- Gentizic acid: Có nhiều trong cacao.

8

+ Nhóm hợp chất phenol C6-C3

Gồm các hợp chất có vòng benzene kết hợp với mạch bên có 3 nguyên tử

cacbon, đó là dẫn xuất phenyl propan. Chúng rất phổ biến trong nhiều loại thực vật,

có mùi thơm.

Đại diện thường gặp:

- Cynnamic acid

- Cafeic acid

- Ferulic acid

- Cumaric acid

+ Nhóm hợp chất phenol C6-C3-C6 (flavonoids)

Flavonoids là một nhóm sắc tố thực vật rất thường gặp có vai trò rất lớn

trong việc tạo ra màu sắc của nhiều loại hoa quả. Flavonoid cũng là một nhóm hoạt

chất quan trọng trong dược liệu, được phân lập và phân loại dựa vào cấu trúc hóa

học bao gồm:

9

- Flavanol: còn được biết đến như là flavan-3-ol hay catechin và galocatechin,

là cấu tử của hợp chất tanin có trong nhiều loại hoa quả, trà xanh, rượu đỏ và socola

(Yang et al., 2001), còn gallocatechin epigallocatechin và epigallocatechin gallate

được tìm thấy ở các loại hạt họ đậu và chè (Arts et al, 2000a, Arts et al., 2000b) [12].

Hình 2.4. Epicatechin Hình 2.5. epigalocatechin

- Flavon: Rất phổ biến trong thực vật, có nhiều trong tỏi, hành, chè, dâu

tây..., có màu vàng và ở dạng glycoside, thường gặp là flavonol. Flavonol thường ở

dạng glycoside có muôn hình muôn vẻ khác nhau, thường gặp là Kampherol và

Quercetin [6]. Sự tạo thành flavonols glycosides được quyết định bởi hoạt động của

ánh sáng, vì thế chúng chủ yếu được tìm thấy ở lá và vỏ quả (Hermann, 1976) [12].

Hình 2.6. Quercetin Hình 2.7. Kampherol

- Anthocyanin: Các hợp chất thuộc nhóm này đều là các sắc tố quan trọng

của hoa quả. Chúng là chất màu tan trong nước, cho màu đỏ, tím, xanh dương, vàng

của hoa quả và nhiều loại thực vật khác. Các anthocyan đều là các glycoside trong

đó phần aglucon là anthocyanidin. Các anthocyanin hòa tan trong nước còn

antocyanindin thì không hòa tan trong nước. Điều lưu ý là trong cấu tạo của

anthocyanidin, nguyên tử oxi trong vòng pyran có hoá trị tự do. Tuy nhiên đã không

xác định được một cách chắc chắn rằng nguyên tư nào hoặc oxi hoặc cacbon mang

10

điện tích dương tự do, vì thế thường biểu diễn cấu tạo của anthocyan bằng công

thức trung hoà.

Nhờ có điện tích dương tự do mà Anthocyanidin mang tính chất của cation

trong môi trường acid và mang tính chất anion trong môi trường kiềm, nghĩa là có

khả năng tạo muối với acid và base [13].

Tuỳ theo pH môi trường mà trạng thái tích điện của Antocyan thay đổi, theo

đó màu sắc cũng thay đổi. Các muối cation của Antocyan đều có màu đỏ với những

sắc thái màu khác nhau: vàng nhạt, tím, xanh nhạt. Các muối anion của Antocyan

có màu xanh. Nhiều hoa của thực vật màu hồng khi luộc chin chuyển thành màu

xanh, điều này chứng tỏ sự thay đổi pH dịch tế bào về phía kiềm [6].

Hình 2.8. Antocyanidin

Antocyanidin được chia thành 3 nhóm nhỏ, đó là: Pelargonidin, cyanidin,

delphinidin, ngoài ra còn gặp apigenidin.

Hình 2.9. Polyphenol

Tính chất: Các polyphenol có chứa gốc Pyrocatechic hoặc Pyrogalic nên

chúng có thể tham gia phản ứng oxy hóa- khử, phản ứng cộng và ngưng tụ.

- Phản ứng oxy hóa-khử: Dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxydase, các

polyphenol bị oxy hóa tạo thành Quinon.

- Phản ứng cộng: Khi có mặt các acid amin thì các Quinon này sẽ tiến hành

phản ứng cộng với acid amin để tạo thành các octoquinon tướng ứng.

11

- Phản ứng ngưng tụ: Các octoquinon này sẽ ngưng tụ với nhau để tạo thành

các sản phẩm có màu gọi chung là Flobafen.

2.2.2. Cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất polyphenol

Theo Jovanovic (2000); Nicole (2001); Marfak (2003); Van Camp, (2005)

trích dẫn bởi Chirinos Gallardo [12], cơ chế kháng oxi hoá của các chất phenol:

Cơ chế 1: Vô hoạt các gốc tự do

Polyphenol có cấu trúc dạng vòng, các điện tử chuyển động liên tục trong các

liên kết đôi cách bởi liên kết đơn có tác dụng như những chiếc bẫy đối với gốc tự

do. Gốc tự do là các nguyên tử hay phân tử có electron lớp ngoài không cặp đôi và

vì vậy có hoạt tính rất cao. Chúng rất dễ phản ứng với các phân tử các chất xung

quanh như DNA, lipid màng...v.v gây nên hiện tượng lão hóa hoặc ung thư. Nếu các

gốc tự do gặp polyphenol thì chúng sẽ nhường electron không cặp đôi cho

polyphenol và trở về trạng thái bền vững. Electron không cặp đôi trong polyphenol

bị "nhốt" lại. Electron này chạy hết vòng benzene này sang vòng benzene khác mà

không ảnh hưởng gì nhiều lắm đến cấu trúc của các vòng benzene [6].

Cơ chế 2: Tạo phức dạng chelat với các ion Fe2+ và Cu+

Polyphenol còn có khả năng ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do bằng

cách “bắt giữ” các ion kim loại. Các kim loại có chức năng sinh lí quan trọng trong

cơ thể con người như vận chuyển oxi (Fe trong hemoglobin), cofactor của nhiều

enzyme (Fe đối với catalase, Cu đối với superoxyde dismutase). Tuy nhiên, chúng

cũng là những tác nhân của việc hình thành các gốc tự do hoặc bằng cách cắt bỏ

hydrogen của lipid tạo gốc tự do peroxide hoặc tham gia phản ứng Fenton và

Haber-Weiss.

Thứ nhất, các ion kim loại có thể gây ra kích thích cắt bỏ hydrogen của lipid

chưa bão hòa thành gốc lipid:

RH + M+n→ R● + H+ + M+(n-1)+

Các ion kim loại cũng có thể phân tách hydro thành dạng alkoxyl và gốc

peroxyl, gây ra kích thích sự oxi hóa lipid:

Fe3+(Cu2+)+ ROOH → Fe2+(Cu+) + ROO●+ H+

Fe2+(Cu+) + ROOH → Fe3+(Cu2+) + RO●+ OH─

12

Các kim loại này có thể tham gia phản ứng Fenton và Haber-Weiss:

Fe3+ + O2-° → Fe2+ + O2

H2O2 + Fe2+(Cu+) →°OH + OH- + Fe3+ (Cu2+) (Phản ứng Fenton)

O2-°+ H2O2 →°OH + OH-+ O2 (Phản ứng Haber-Weiss)

Cấu trúc flavonoid cho phép chúng tạo phức bền dạng chelat với các ion kim

loại và do đó ngăn chặn sự tạo gốc tự do gây nên bởi kim loại như Fe và Cu [12].

Cơ chế 3: Kìm hãm enzyme xanthine oxydase

Hoạt động của xanthine oxidase cũng là một nguồn tạo các gốc tự do. Khi có

mặt của oxi, enzyme này xúc tác sự oxi hóa xanthine thành acid uric, phân tử oxi

nhận điện tử và trở thành ion superoxide.

Xanthine + 2O2 + H2O xanthine oxydase Acid uric + 2O2°-+ 2H+

Các flavonoid có cấu tạo vòng A giống như vòng purin của xanthine được

coi như chất kìm hãm cạnh tranh của xanthine oxidase do đó ngăn ngừa sự tạo ion

superoxide (Nicole, 2001) [12].

Nhiều hợp chất phenol đã thể hiện những tác dụng tốt của chúng đối với cơ

thể con người trên cơ sở khả năng chống oxi hóa. Các flavonoid có tác dụng bảo vệ

cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạnh, tai biến mạnh, lão hóa, thoái hóa gan, tổn

thương do bức xạ. Flavonoid làm bền thành mạch, được dùng trong các trường hợp

rối loạn chức năng tĩnh mạnh, trĩ, rối loạn tuần hoàn võng mạc,... Flavonoid còn có

tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan. Nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon,

flavanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt có trong lá diếp cá, cây râu mèo...

Nhiều flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp các catechin của trà có tác

dụng làm tăng biên độ co bóp tim.

Ngày nay, những dược liệu và hoa quả có hàm lượng flavonoid cao đã được

khai thác và chiết xuất, nghiên cứu, sản xuất thành sản phẩm: Thuốc viên, thuốc

nước, rất tiện ích khi sử dụng.

13

2.3. Gốc tự do, quá trình oxy hóa chất béo [5]

2.3.1. Gốc tự do

Gốc tự do là các nguyên tử không trọng vẹn, số điện tử vòng ngoài của nó là

số lẻ nên không bền vững, nó phải kết hợp với một nguyên tử khác để có số điện tử

chẵn để bền vững. Sự bền vững này chỉ trong chốc lát, chính nó lại tạo ra một

nguyên tử không trọng vẹn khác và tiếp tục kết hợp một nguyên tử khác rồi trở

thành nguyên tử không trọn vẹn và tiếp tục chu kì bất tận như thế. Phản ứng hóa

học của nó rất mãnh liệt và nó sẽ kéo theo một điện tử của phân tử khác về nó, cho

ra những phân tử khác bị hư hại hay bị oxy hóa. Một khi phân tử bị oxy hóa rồi thì

phân tử đó sẽ tự mất đi tất cả các chức năng vốn có của nó, tiếp đó chính nó lại là

tác nhân oxy hóa các phân tử xung quanh nó, làm hư hại các tế bào của các phân tử

xung quanh. Và quá trình này cứ tiếp tục như thế sẽ tạo thành các tế bào không bình

thường dẫn tới các loại bệnh như: Xơ vữa động mạch, ung thư...

Thông thường, các gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng

được kiểm soát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxy hóa nội tại bằng các hợp

chất như glutathione, vitamin E, vitamin C và các enzyme superoxide dismutase.

Ngoài ra cơ thể còn có các tế bào như neutrophill, monocyte, B- cell... Có khả năng

chống lại các yếu tố oxy hóa ngoại lai xâm nhập.

Tuy nhiên trong các tế bào có thể xuất hiện các hiện tượng các gốc tự do được

tạo ra quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngoài như

các chất độc, do nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ, tia UV, nhiễm phóng xạ, do

thuốc lá, môi trường ôi nhiễm... Các gốc tự do dư thừa trong khi cơ thể thiếu các yếu

tố bảo vệ để ngăn chặn, có khả năng tương tác, phá hủy màng lipit không bão hòa của

tế bào, làm giảm khả năng bảo vệ các tế bào dẫn đến sự xâm nhập các tác nhân gây

bệnh từ bên ngoài oxy hóa các nucleotid căn bản làm thay đổi cấu trúc ADN, dẫn đến

các quá trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư, làm hỏng cấu trúc protein hoặc

hoạt hóa enzyme trong các quá trình trao đổi chất gây bệnh.

14

2.3.2. Quá trình oxy hóa

Quá trình oxy hóa là quá trình phản ứng hóa học xảy ra, trong đó electron

được chuyển sang chất oxy hóa có khă năng tạo gốc tự do sinh ra phản ứng dây

chuyền phá hủy tế bào sinh vật.

2.3.3. Biện pháp hạn chế quá trình oxy hóa

Để hạn chế sự oxi hóa, một số biện pháp sau thường được sử dụng:

- Loại bỏ oxi trong thực phẩm bằng cách đóng gói chân không hoặc sử dụng

glucose-oxidase.

- Bảo quản trong nhiệt độ thấp và tránh ánh sáng. Trong trường hợp này, tốc

độ oxi hóa giảm rõ rệt. Tuy nhiên, phương pháp này không áp dụng được đối với

các loại trái cây, rau củ quả có chứa lipoxygenase. Sự ngăn ngừa hư hỏng thực

phẩm chỉ có thể đạt được sau khi xử lí nhiệt.

- Thêm các chất chống oxi hóa: Các chất chống oxi hóa ngoài khả năng loại bỏ

các gốc tự do còn hạn chế đáng kể sự phân hủy hydroperoxide thành các sản phẩm

thứ cấp khác. Các chất chống oxi hóa thường sử dụng trong bảo quản dầu mỡ là

vitamin E, BHA, BHT. Các chất chống oxi hóa tự nhiên như plyphenol, carotenoid

cũng được nghiên cứu bổ sung vào dầu mỡ để ngăn ngừa quá trình oxi hóa.

2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết polyphenol [5]

2.4.1. Loại dung môi

Dung môi có vai trò rất quan trọng trong quá trình tách chiết polyphenol từ

thực vật. Độ phân cực của dung môi sẽ ảnh hưởng đến độ hòa tan của các hợp chất

phenol vào dung môi do đó ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách của quá trình. Thêm

vào đó, việc lựa chọn dung môi sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến công đoạn tinh sạch dịch

chiết. Nhìn chung, việc lựa chọn dung môi tách chiết bao giờ cũng dựa trên hai tiêu

chí: Loại chất chủ đạo muốn tách và sự thuận tiện cho công đọan tinh sạch về sau.

Mỗi loại chất khác nhau trong nhóm phenolic lại thích hợp với những dung môi

chiết khác nhau. Phenolic có glicosid hóa thường tan nhiều trong nước nên dung

môi thường sử dụng là nước và hỗn hợp nước với methanol hoặc ethanol hoặc

aceton (Rice-Evans ea at, 1997). Ngược lại, phenolic ít phân cực như isoflavones,

flavanones...thường tan nhiều hơn trong dung môi kị nước. Ngoài ra, aceton và

15

methanol là dung môi thích hợp để chiết flavanol, methanol thì là tốt nhất cho chiết

catechin...

2.4.2. Tỷ lệ dung môi trên nước

Polyphenol là một nhóm các hợp chất vô cùng đa dạng, có thể tồn tại ở dạng

tự do hoặc ở dạng liên kết với các đường (Dạng glycosid). Để tách được polyphenol

ở dạng glycoside, nước thường được thêm vào dung môi tách. Trong các loại

nguyên liệu khác nhau, tỷ lệ hợp chất phenol glycoside hóa khác nhau do đó tùy

thuộc vào loại nguyên liệu mà tỷ lệ dung môi/ nước cần được xác định cho phù hợp

để tăng hiệu quả chiết cũng như quyết định chi phí thực hiện cả quá trình.

2.4.3. Thời gian chiết

Thời gian chiết là một nhân tố ảnh hưởng tới sự thu hồi polyphenol cũng như

chất lượng của dịch chiết. Thời gian chiết ngắn cho hiệu suất thu hồi thấp, tuy nhiên

thời gian chiết quá dài khiến polyphenol dễ bị oxi hoa và làm giảm hiệu suất sử

dụng thiết bị. Thời gian chiết thay đổi từ 1phút đến 24 giờ (Shahidi & Nack, 2004).

2.4.4. Nhiệt độ chiết

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng không những ảnh hưởng tới hiệu suất chiết mà

còn ảnh hưởng tới chi phí và chất lượng của dịch chiết polyphenol. Nhiệt độ làm

giảm độ nhớt của dung dịch, tăng tốc độ thẩm thấu của dung môi vào tế bào và tăng

hiệu suất trích li. Tuy nhiên, tiến hành chiết ở nhiệt độ quá cao thì vừa tốn cho phí

ổn nhiệt vừa tăng nguy cơ giảm chất lượng của dịch chiết do phản ứng nâu hóa.

2.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

2.5.1. Trên thế giới

- Theo nghiên cứu của Lilis Sukeksi và Maya Sarah, “Đặc tính và tách chiết

polyphenol từ bã ổi đào”, sử dụng những phương pháp:

+ Xác định trọng lượng khô: bằng cách thông qua sự bốc hơi của nước trong

bã ổi.

+ Phân tích quercetin: bằng máy đo quang phổ.

+ Xác định hàm lượng Axit Galic bằng: phương pháp đo màu Folin quy Ciocalteau.

+ Xác định lượng tanin bằng: phương pháp chuẩn độ.

+ Phân tích Apigenin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High

Performance Liquid Chromatography).

16

Kết quả thu được từ nghiên cứu trên:

+ Bã ổi đào sau khi chiết xuất polyphenol có trọng lượng khô là 28,42% và

hàm lượng chất chống oxy hóa dạng polyphenol như sau: 0,40 mg/100g, quercetin,

8,70 mg/100g axit gallic, 62,60 mg/100g tanin, và không có phát hiện của apigenin.

Nghiên cứu khám phá ứng dụng của bốn dung môi hữu cơ và nước để chiết xuất

hợp chất polyphenol từ bã ổi đào sau chế biến nước ép ổi. Nghiên cứu cho thấy

phần còn lại của hàm lượng polyphenol tổng của bã ổi 9.59 mg/100g. Hàm lượng

polyphenol tổng cao nhất thu được bằng cách sử dụng metanol làm dung môi và cao

thứ hai thu được bằng cách sử dụng nước làm dung môi.

Hàm lượng polyphenol cao nhất là kết quả của hỗn hợp metanol và nước ở

các nồng độ khác nhau, trong đó tỷ lệ tối ưu là 60% metanol/nước, sau đó là 50%

metanol/nước. Biến thể trong tổng hàm lượng polyphenol phụ thuộc vào điều kiện

dung môi và nồng độ giữa các dung môi. Hàm lượng polyphenol tổng là cao nhất

khi sử dụng tỷ lệ bã trên dung môi là 1g bã còn lại đến 25ml metanol/nước 60%.

180 phút được chọn là thời gian lý tưởng để tách chiết polyphenol.

- Seokwon Seo, Soojung Lee, Marcus L. Elam, Sarah A. Johnson, Jonghoon

Kang, Bahram H. Arjmaandi, đã cùng nhau: “Nghiên cứu tìm ra dung môi chiết tốt

nhất với lá ổi để cho hiệu quả chống oxy hóa cao”, sử dụng những phương pháp:

+ Xét nghiệm hàm lượng hợp chất Phenolic bằng phương pháp: Folin Ciocalteu.

+ Xét nghiệm hàm lượng Flavonoid bằng phương pháp của Moreno.

+ Thử nghiệm khử gốc 2, 2-Diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH).

+ Hoạt động của ABTS-Scavenging được đánh giá theo phương pháp được

mô tả bởi Re et al.

+ Hoạt tính khử gốc oxit nitric (NO) được đo bằng thuốc thử Greiss.

+ Hoạt động quét nitrite: hoạt tính quét nitrite được đánh giá dựa trên độ hấp

thụ ở bước sóng 520nm bằng máy quang phổ UV theo phương pháp được báo cáo

bởi kato et al.

+ Phân tích thống kê.

Từ việc nghiên cứu trên họ đã thu được kết quả:

+ Hàm lượng hợp chất phenolic của chiết xuất nước cao hơn chiết xuất

ethanol và metanol tinh khiết. Hơn nữa, hàm lượng hợp chất phenolic của chiết xuất

17

hydroethanolic cao hơn chiết xuất nước. Hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất

hydroethanolic cao hơn so với chiết xuất nước và cao đáng kể trong chiết xuất

hydroethanolic 50% có hàm lượng hợp chất phenolic cao nhất.

2.5.2. Trong nước

Nghiên cứu: “Tối ưu hóa chiết polyphenol từ lá ổi bằng phương pháp bề mặt

đáp ứng”, của Hồ Bá Vương, Nguyễn Xuân Duy, Nguyễn Anh Tuấn sử dụng những

phương pháp:

+ Thu mẫu: từ những lá ổi già từ một cây ổi.

+ Bố trí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết: Phương pháp bề mặt đáp ứng

(Response Surface Methodology) được lựa chọn để tối ưu hóa điều kiện chiết

polyphenol từ lá ổi.

+ Xác định hàm lượng polyphenol tổng theo phương pháp của Singleton et

al. (1999).

+ Xác định hoạt tính chống oxi hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH

(được xác định theo phương pháp của Fu và Shieh).

Và kết quả thu được:

+ Nghiên cứu đã xây dựng được mô hình toán học mô tả ảnh hưởng của bốn

nhân tố chiết (nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và nồng độ ethanol)

đến hàm lượng polyphenol từ lá ổi xẻ. Các giá trị tối ưu để chiết polyphenol từ lá ổi xẻ như sau: Dung môi chiết ethanol 44,3%, nhiệt độ chiết 90oC, thời gian chiết 76,5

phút và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 70/1(ml/g). Tại điều kiện chiết tối ưu, hàm lượng

polyphenol thu được là 233,76mg GAE/g chất khô. Dịch chiết polyphenol thu được

ở điều kiện tối ưu thể hiện hoạt tính chống oxi hóa cao đối với phép thử khả năng

thu gốc tự do DPPH, với giá trị IC50 là 2,1μg/ml. Những phát hiện trên chỉ ra tiềm

năng sử dụng lá ổi xẻ như một nguồn chiết xuất chất chống oxi hóa tự nhiên để

nâng cao khả năng ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm chức năng.

18

Phần 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng, địa điểm, vật liệu và thời gian nghiên cứu

3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Dịch chiết polyphenol từ bã ổi đào được tách chiết tại

trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

Vật liệu nghiên cứu:

- Quả ổi đào có độ chín 90% (Vỏ màu xanh nhạt, có mùi thơm, vị ngọt vừa

phải, vẫn còn độ cứng vừa phải chưa bị mềm) được thu mua tại chợ Minh phương

(Việt Trì - Phú Thọ). Quả được lựa chọn đồng đều về kích thước, màu sắc, độ chín,

không bị dập nát, sâu bệnh, thối hỏng. Rửa quả bằng nước sạch, để khô tự nhiên.

- Thức ăn chăn nuôi giàu chất béo: Cám lợn với hàm lượng chất béo 5,6%

3.1.2. Hoá chất sử dụng

Bảng 3.1. Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

STT Hóa Chất Nơi sản xuất

1 EtOH Việt Nam

2 MeOH Việt Nam

3 Thuốc thử Folin Ciocalteu Trung Quốc

4 Trung Quốc Na2CO3

5 Axit gallic Trung Quốc

6 DPPH Pháp

7 Cao thịt Trung Quốc

8 Agar Trung Quốc

9 Pepton Trung Quốc

10 Cao nấm men Trung Quốc

11 KOH Trung Quốc

12 Trung Quốc Na2S2O3

13 Trung Quốc CHCl3

14 Axit Acetic Việt Nam

15 KI Trung Quốc

19

3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Bảng 3.2. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Dụng cụ STT Nơi sản xuất

Bình tam giác 1 Trung Quốc

Khay inox 2 Việt Nam

Ống đong 3 Trung Quốc

Máy xay 4 Trung Quốc

Cốc đong có mỏ 5 Trung Quốc

Bình định mức 6 Trung Quốc

Hộp Petri 7 Trung Quốc

Pipet 8 Trung Quốc

Đầu côn 9 Trung Quốc

Giấy lọc 10 Trung Quốc

Que trang 11 Trung Quốc

Ống nghiệm 12 Trung Quốc

Thiết bị thí nghiệm Nơi sản xuất

Tủ sấy SRN 1 Pháp

2 Cân phân tích có độ chính xác 0,001g Trung Quốc

Máy quang phổ 3

4 Trung Quốc Máy lắc Shaking Incubator NB-205

Tủ lạnh Samsung 5 Việt Nam

Tủ ấm 6 Trung Quốc

7 Trung Quốc Tủ cấy vi sinh LV-VC 1200

Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của phòng thí

8 Nhật Bản Nồi hấp thanh trùng paster

nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm.

3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1. Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu một số thông số tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào.

Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình tách chiết polyphenol.

Phân tích, đánh giá tác dụng của dịch chiết polyphenol.

20

3.2.2. Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm: Phòng thí nghiệm hóa sinh và vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học

và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

3.2.3. Thời gian nghiên cứu

Thời gian thực hiện: từ 12/2019 - 5/2020.

3.3. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu

- Trọng lượng khô của nguyên liệu

- Hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu

Nội dung 2: Nghiên cứu lựa chọn một số thông số tách chiết polyphenol

thích hợp

- Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp

- Nghiên cứu thời gian chiết thích hợp

- Nghiên cứu nhiệt độ chiết thích hợp

Nội dung 3: Tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol trên dung môi đã chọn

Nội dung 4: Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm polyphenol và ứng

dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

- Đánh giá khả năng chống oxy hóa của polyphenol bằng thử nghiệm DPPH

- Ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa trong quá trình bảo quản thức ăn

chăn nuôi giàu chất béo

Nội dung 5: Hoàn thiện quy trình dựa trên các thông số công nghệ đã

phân tích

- Quy trình tách chiết polyphenol.

3.4. Phương pháp phân tích

Phương pháp phân tích nội dung 1: phương pháp Đánh giá thành phần

nguyên liệu ban đầu

3.4.1. Xác định trọng lượng khô của nguyên liệu

Sử dụng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 5631:1991

Nguyên tắc:

Dùng sức nóng để tách ẩm trong vật liệu, đồng thời giữ lại tất cả các chất có

trong vật liệu. Do đó nhiệt độ sấy không được quá cao hay quá thấp.

21

Nhiệt độ quá cao thì ẩm sẽ bốc hơi nhanh nhưng dễ gây hiện tượng làm thay

đổi tính chất hóa học của các chất, nhất là các chất có tính bay hơi thoát đi sẽ làm

ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

Nhiệt độ quá thấp thì hơi thoát ra chậm, làm kéo dài thời gian và các chất bị

biến đổi. Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi.

- Xác định độ ẩm TCVN 5613 – 1991

- Bản chất của phương pháp: Phương pháp dựa trên việc sấy mẫu bã quả ổi

đào đến khối lượng không đổi trong điều kiện xác định

- Thiết bị và vật liệu để tiến hành xác định độ ẩm, cần sử dụng:

+ Cân phân tích với sai lệch cho phép không vượt quá 0,001g

+ Tủ sấy đảm bảo điều chỉnh được nhiệt độ (105˚C) hoặc (120˚C)

+ Chén cân bằng thủy tinh, sứ hoặc nhôm đường kính 50mm và có nắp đậy kín

+ Bình hút ẩm

Cách tiến hành: - Lấy chén cân có thể đựng được 10g mẫu, rửa sạch sau đó đem sấy ở 1050C

cho đến khi trọng lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm 20-25 phút và sau

đó cân với trọng lượng chính xác

- Sau đó cho vào cốc khoảng 10 g mẫu. Cân tất cả ở cân phân tích một cách

chính xác.

- Cho tất cả vào tủ sấy ở 1050C, sấy trong vòng từ 6h cho đến khi trọng

lượng không đổi.

- Sấy xong, làm nguội trong bình hút ẩm (20 - 25 phút) và đem cân ở cân

phân tích một cách chính xác.

- Cho lại vào tủ sấy 1050C trong 1giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm

(20-25 phút) và đem cân ở cân phân tích một cách chính xác tới khi trọng lượng

không đổi.

Tính kết quả:

𝑚−𝑚₁

Độ ẩm (W) được tính theo phần trăm khối lượng xác định bằng công thức:

𝑚

W = × 100

Trong đó:

- W: Độ ẩm của thực phẩm (%).

22

- m: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g).

- m₁: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g).

3.4.2. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết bã quả ổi đào được xác định

bằng phương pháp của Singlton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ như

sau: dịch chiết từ bã quả ổi đào được pha loãng đến một tỷ lệ nhất định, sau đó 0,1

ml dịch chiết đã pha loãng được trộn với 0,9 ml nước cất trước khi thêm 1 ml thuốc

thử Folin-Ciocalteu (10%) và 2,5 ml Na2CO3 7,5%. Hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ

phòng trong 30 phút trước khi đo bước sóng ở 760 nm trên máy quang phổ kế.

Gallic acid được dùng làm chất chuẩn. Hàm lượng polyphenol tổng số được biểu

diễn theo mg đương lượng gallic acid (Gallic Acid Equivalent-GAE) trên 1g chất

khô (Dry Weight-DW) hay mg GAE/g DW.

Tính kết quả:

TPC = X * V * k / v * m * (1 - w)

Trong đó:

- TPC là hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g DW)

- X là nồng độ acid gallic xác định theo đường chuẩn (mg/ml)

- V là thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu bã quả ổi đào (ml)

- K là hệ số pha loãng

- V là thể tích dịch chiết được sử dụng (ml)

- m là khối lượng mẫu thí nghiệm (g)

- w là độ ẩm của mẫu (%)

3.5. Phương pháp nghiên cứu

3.5.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu

Quả ổi đào có độ chín 90% được thu hái về mang đi loại bỏ tạp chất, sâu

bệnh, thối hỏng. Rửa quả bằng nước sạch, để khô tự nhiên sau đó mang đi xay lấy

bã. Bã của quả ổi đào được tách chiết bằng phương pháp trích ly trong điều kiện: Dung môi chiết là nước, nhiệt độ và thời gian chiết lần lượt là 40oC và 30 phút, tỉ lệ

nguyên liệu so với dung môi chiết là 1/10 (w/v). Dịch chiết thu được sau khi tách

chiết được mang đi xác định hàm lượng polyphenol.

23

3.5.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm

3.5.2.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: phương pháp xác định một số thông

số tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào

Phương pháp nghiên cứu đơn yếu tố được sử dụng. Thí nghiệm sau kế thừa

kết quả nghiên cứu của thí nghiệm trước.

 Tách chiết polyphenlol từ bã ổi đào:

Ổi đào được thu hái, sau đó rửa sạch để ráo nước rồi tiến hành xay nhỏ để

lấy phần bã, tách chiết polyphenol bằng các loại dung môi: methanol, ethanol, nước.

Cân 4g bã ổi đào cho vào bình tam giác, bịt kín miệng bình và để vào thiết bị rung

lắc để tiến hành trích ly. Tiến hành tách chiết bằng phương pháp trích ly trong vòng

30 phút, cường độ 200 vòng/phút và nhiệt độ là 40oC. Sau khi kết thúc quá trình

chiết tiến hành ly tâm ở 4oC, 5000rpm/phút, tiếp tục lọc lại dịch chiết để thu dịch

chiết trong, dịch chiết có màu hồng phớt nhẹ.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết

Để nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết, sử dụng 3 loại dung môi

khác nhau bao gồm: Nước (H20), methanol (CH3OH) 60o và ethanol (C2H5OH) 60o.

Để đánh giá ảnh hưởng của loại dung môi chiết tới khả năng trích ly bố trí thí

nghiệm theo công thức thí nghiệm sau:

Cân 4g (Bã ổi đào)

Trích ly ở các loại dung môi

Dịch chiết

H20 CH3OH C2H5OH

Phân tích

Chiết ở cùng các điều kiện:

Thời gian chiết: 30 phút

24

Nhiệt độ tách chiết: 400C

Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 1/10 (w/v)

Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol.

Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn loại dung môi tốt nhất. Kết quả của thí

nghiệm 1 được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu nồng độ dung môi phù hợp:

Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol

Được bố trí gồm 4 công thức, lặp lại 3 lần

Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các nồng độ dung môi 20% 40% 60% 80%

Dịch chiết Phân tích Chiết ở cùng các điều kiện:

Dung môi sử dụng là dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1

Thời gian chiết: 30 phút

Nhiệt độ tách chiết: 400C

Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu :1/10 (w/v)

Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol.

Dựa vào kết quả phân tích chỉ tiêu, lựa chọn nồng độ dung môi chiết tốt nhất.

Kết quả của thí nghiệm 2 được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu phù hợp:

Để đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tới khả năng chiết, bố

trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm sau:

25

Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu

1/5 1/10 1/15 1/20

Dịch chiết Phân tích

Chiết ở cùng điều kiện:

Loại dung môi và nồng độ dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1,2

Nhiệt độ tách chiết 400C

Thời gian tách chiết 30 phút

Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm polyphenol.

Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tách

chiết tốt nhất. Kết quả của thí nghiệm 3 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết

Để đánh giá ảnh hưởng của thời gian tới khả năng chiết, bố trí thí nghiệm theo

công thức thí nghiệm sau:

Cân 4g (bã ổi đào)

Trích ly ở các khoảng thời gian

25phút 30phút 35 phút 40 phút

Phân tích

Dịch chiết

26

Chiết ở cùng điều kiện:

Loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tốt nhất được

tìm thấy ở thí nghiệm 1, 2, 3.

Nhiệt độ tách chiết 400C

Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng polyphenol.

Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được thời gian chiết tách tốt nhất. Kết quả

của thí nghiệm 4 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết

Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng chiết, bố trí thí nghiệm theo

công thức thí nghiệm sau:

Trích ly ở các nhiệt độ

Cân 4g (bã ổi đào)

Dịch chiết

350C 400C 450C 500C

Phân tích

Chiết ở cùng điều kiện:

Loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu, thời gian

tách chiết tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1, 2, 3, 4.

Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng polyphenol.

Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được nhiệt độ tốt nhất. Kết quả của thí

nghiệm 5 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.5.2.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3

Thí nghiệm 6: Tối ưu hóa điều kiện tách chiết bã ổi đào

Sau khi tiến hành khảo sát các đơn nhân tố, chúng tôi lựa chọn 03 yếu tố ký

hiệu là A, B, C là các yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng polyphenol trong

27

bã ổi đào để đánh giá khả năng ảnh hưởng của chúng, tôi sử dụng phương pháp bề

mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box-Benhken với ba yếu tố, ba cấp độ.

Bảng 3.3. Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu

Biến chữ Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1

Thời gian tách chiết phút 25 35 A

oC

Nhiệt độ tách chiết 35 45 B

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 1/g 5/1 15/1 C

Lập ma trận thực nghiệm Box - Behnken: Gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu

tố với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và mức 0 (mức trung bình),

trong đó 5 thí nghiệm lặp lại ở tâm (các yếu tố đều ở mức 0) (bảng 3.4).

Bảng 3.4. Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng

polyphenol của dịch chiết bã ổi đào

Biến mã hóa

Công thức A. Thời gian

C. Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 10 10 10 10 5 5 15 15 5 5 15 25 35 25 35 25 35 25 35 30 30 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

15 30 12

10 10 10 10 10 30 30 30 30 30 13 14 15 16 17 B. Nhiệt độ 35 35 45 45 40 40 40 40 35 45 35 45 40 40 40 40 40

28

Dựa vào kết quả thí nghiệm, lựa chọn được điều kiện tối ưu sao cho có kết quả

hàm lượng polyphenol là cao nhất.

3.5.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 4: Đánh giá khả năng chống oxy hóa

của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH và ứng dụng bảo quản thức

ăn chăn nuôi giàu chất béo

3.5.3.1. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử

nghiệm DPPH

Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu và CS

(2002) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Khoảng 30 µl đến 120 µl dịch chiết trộn với nước cất

để đạt thể tích tổng cộng 3 ml. Sau đó thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM, lắc đều và để

yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thụ quang học được đo ở bước sóng 517 nm trên máy

đo quang phổ. Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau:

DPPH (%) = 100 * (ACT – ASP) / ACT.

Trong đó:

- ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết

- ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết.

Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dịch chiết khử được 50%

gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc

tự do DPPH càng cao. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại ba lần, kết quả báo cáo

là giá trị trung bình.

3.5.3.2. Ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

Thức ăn chăn nuôi rất dễ bị hư hỏng trong quá trình bảo quản. Tiến hành

kiểm tra mức độ hư hỏng của thức ăn chăn nuôi bằng cách thông qua việc xác định

chỉ tiêu vi sinh vật tổng số, chỉ số axit và chỉ số peroxyt của thức ăn chăn nuôi giàu

chất béo.

 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật tổng số

Giới hạn vi khuẩn, nấm mốc (3113/1999/QĐ-BYT ngày 11/10/1999 của Bộ

trưởng Bộ Y tế)

 Vi sinh vật tổng số

29

Vi sinh vật là cơ thể sống có kích thước rất nhỏ quan sát được bằng kính hiển

vi, bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh và virus.

Vi sinh vật tổng số là tất cả vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển được trên

môi trường dinh dưỡng chung, ở 30  10C sau một thời gian nuôi cấy nhất định

trong 24-72 h.

Xác định tổng số vi sinh vật tổng số để đánh giá mức độ nhiễm tạp của

nguyên liệu và sản phẩm, từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh, điều kiện bảo quản và

dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm…

Phương pháp này cho phép phát hiện những tế bào vi sinh vật còn sống có

trong mẫu (ở cả dạng rắn và lỏng). Mặc dù đây không phải là một phương pháp

đếm vi sinh vật một cách nhanh chóng nhưng nó thường được dùng như là phương

pháp chuẩn để xác định số lượng vi sinh vật thực phẩm.

- Nguyên tắc:

Cấy chính xác một thể tích mẫu (hoặc dịnh pha loãng) vào trong hoặc lên

trên bề mặt môi trường thạch. Từ mỗi độ pha loãng cần cấy lặp lại ít nhất là 2 hộp.

Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp để làm sao trên mỗi hộp có từ 30-

300 khuẩn lạc/hộp. Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp cho các vi sinh vật phát

triển, sau đó đếm số lượng các khuẩn lạc mọc lên. Có thể coi mỗi khuẩn lạc là kết

quả của sự phát triển từ một tế bào [7].

- Thiết bị:

+ Hộp Petri

+ Que trang thủy tinh hoặc kim loại

+ Ống nghiệm dùng để pha loãng mẫu

- Hóa chất:

+ Thức ăn chăn nuôi

+ Nước cất vô trùng, đã qua lọc.

+ Môi trường thạch thích hợp.

Thực hiện cấy trên môi trường thạch TGA:

- Pepton: 5g

30

- Glucose: 5g

- Thạch: 15 g

- Cao nấm men: 2,5g

- Nước cất: 1000 ml

- Cách tiến hành [7]

Hoà tan các chất trong nước, đun nhỏ lửa, khuấy đều cho tan hoàn toàn.

Đóng vào các bình dung tích 250ml, mỗi bình 150ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp

121oC trong thời gian 15 - 20 phút. Môi trường nếu không dùng ngay, cần được bảo

quản nơi khô ráo, trong bóng tối, ở nhiệt độ từ 0 đến 5oC không quá 30 ngày.

Chuẩn bị dịch pha loãng.

Pha loãng mẫu đến nồng độ cần thiết.

- Cấy trong môi trường thạch

+ Đưa một cách vô trùng 1ml mẫu đã pha loãng đến nồng độ cần thiết vào

đĩa Petri vô trùng.

+ Rót khoảng 15–18 ml môi trường thạch đã hóa lỏng trên nồi cách thủy

(nhiệt độ khoảng 45˚C) vào mỗi đĩa đã có mẫu. Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha

loãng liên tiếp và từ mỗi độ pha loãng cần lặp lại ít nhất là 2 hộp.

+ Trộn theo kỹ thuật được chuẩn hóa. Đĩa được xếp trên mặt phẳng ngang

cho đến khi thạch nguội.

- Cấy trên môi trường thạch

+ Rót khoảng 15 – 18 ml môi trường thạch đã hóa lỏng trên nồi cách thủy

(nhiệt độ khoảng 45˚C) vào mỗi đĩa petri đã vô trùng.

+ Đĩa được xếp trên mặt phẳng ngang cho đến khi thạch nguội.

+ Đưa một cách vô trùng một thể tích 0,05 – 0,1 ml mẫu đã pha loãng đến

nồng độ cần thiết lên bề mặt thạch chứa trong đĩa Petri.

+ Dùng que trang vô trùng dàn đều thể tích này lên khắp bề mặt môi trường.

Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp sao cho trên mỗi hộp sẽ có từ 30 –

300 khuẩn lạc và từ mỗi độ pha loãng cần cấy lặp lại ít nhất là 2 hộp.

31

+ Lật hộp lại và đem nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian tùy theo sản phẩm cần

nghiên cứu và tùy theo lọai vi sinh vật mà người ta muốn đánh giá sự phát triển của

nó. Nhiệt độ thường 22˚C, 30˚C hay 37˚C và thời gian nuôi cấy là 24 giờ, 48 giờ.

- Tính kết quả :

Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu được tính như sau [34]:

N

A (CFU/g hay CFU/ml) = ———————————–

n1Vf1 +…+ n2Vf2

Trong đó :

A : số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu

N : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

Ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V : thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

Fi : độ pha loãng tương ứng

 Nấm men – Nấm mốc

Đếm nấm men và nấm mốc theo TCVN 4993-89

- Nguyên tắc:

+ Dùng môi trường nuôi chọn lọc quy định và 1 lượng mẫu thử quy định,

nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu, nếu sản

phẩm có dạng khác để đổ đĩa.

+ Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng điều kiện bằng cách sử dụng các dung

dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu.

+ Nuôi cấy hiếu khí các đĩa ở 25oC trong 3, 4 hoặc 5 ngày.

+ Tính số nấm men và nấm mốc trên gam hoặc trên mililít mẫu thử theo số

khuẩn lạc xác định được trên đĩa ở độ pha loãng đã chọn sao cho đạt được kết quả

có ý nghĩa.

Môi trường nuôi cấy:

- Chất chiết nấm men: 5g

- Dectroza ( C6H12O6): 20g

32

- Cloramphenicol ( C11H12Cl2O5): 0,1g

- Thạch: 12 – 15g

- Nước: 1000ml

- Cách tiến hành:

Sử dụng 2 đĩa petri vô trùng. Dùng pipet vô trùng lấy 1 ml mẫu thử (nếu sản

phẩm là chất lỏng) hoặc 1 ml huyền phù (nếu sản phẩm có dạng khác) lần lượt cho

vào từng đĩa.

Sử dụng tiếp 2 đĩa petri nữa. Dùng pipet vô trùng khác lấy 1 ml dung dịch

phaloãng 10-1 lần lượt cho vào từng đĩa (nếu sản phẩm là chất lỏng) hoặc 1 ml dung

dịch pha loãng 10-2 (nếu sản phẩm có dạng khác). Nếu cần, lặp lại thao tác trên với

các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo.

Từ bình lấy thêm khoảng 15 ml môi trường thạch - chất chiết nấm men -

dectroza - cloramphenicol làm lỏng và đã được giữ ở 45 ± 1oC trong bếp cách thủy

rồi lần lượt cho vào từng đĩa petri. Thời gian từ khi kết thúc chuẩn bị huyền phù ban

đầu (hoặc dung dịch pha loãng 10-1, nếu là sản phẩm lỏng) đến khi rót môi trường

vào đĩa không quá 15 phút.

Trộn cẩn thận chất nuôi cấy với môi trường và để đông đặc lại bằng cách đặt

đĩa petri trên 1 mặt phẳng mát nằm ngang. Chuẩn bị đĩa kiểm tra chứa 15 ml môi

trường để kiểm tra độ tiệt trùng.

- Đọc kết quả:

+ Úp các đĩa và đặt chúng vào tủ ấm ở 25 ± 1 oC. Đếm số khuẩn lạc trên các

đĩa sau khi nuôi 3, 4 và 5 ngày.

+ Sau 5 ngày, giữ lại các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc. Nếu nấm mốc phủ

kín trên các đĩa hoặc khó đếm được các khuẩn lạc tách biệt hẳn thì giữ lại số đếm

được sau khi nuôi 4 ngày hoặc thậm chí 3 ngày. Trong trường hợp này, cần ghi lại

thời gian nuôi là 3 hoặc 4 ngày vào biên bản.

+ Nếu cần có thể kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt các khuẩn lạc của

nấm men và nấm mốc với khuẩn lạc của vi khuẩn dựa vào các hình thái của chúng.

33

- Tính kết quả:

Số nấm men và nấm mốc, X, trên gam hoặc trên mililit được tính theo công thức:

X = ∑C (n1 +0,1n2).d

Trong đó:

ΣC - tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa;

n1 - số đĩa đếm được ở dung dịch pha loãng thứ nhất;

n2 - số đĩa đếm được ở dung dịch pha loãng thứ hai;

d - độ pha loãng cho số đếm thứ nhất

 Phương pháp đánh giá chất lượng của chất béo

Để kiểm tra mức độ ôi hóa của thức ăn chăn nuôi khi được bảo quản ở điều

kiện thường so với khi được bảo quản trong dịch chiết polyphenol, 4g bã ổi đào

được sử dụng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi sau đó xác định chỉ số axit và chỉ số

peroxyt của thức ăn chăn nuôi bằng việc kiểm tra định kỳ 5 ngày 1 lần trong khoảng

thời gian là 30 ngày khi được bảo quản ở nhiệt độ thường và khi được bảo quản

trong dịch chiết polyphenol như sau:

 Phương pháp xác định chỉ số axit (theo TCVN 6127:2010)

- Chỉ số axit là số mg KOH dùng để trung hòa các axit béo tự do có trong 1g

chất béo. Chỉ số axit càng cao, tức là lượng axit tự do càng nhiều chứng tỏ chất béo

đó đã thủy phân nhiều và chất lượng chất béo càng giảm.

- Nguyên lý:

Mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp và các axit béo có mặt được

chuẩn độ bằng dung dịch Kali hoặc Natri Hydroxyt trong ethanol hoặc methanol,

với chất chỉ thị phenolphtaelein.

- Cách tiến hành:

Cân chính xác 5g mẫu cho vào bình tam giác 250ml. Sau đó cho 15ml etanol

96% thể tích và 15ml dietyl ete, lắc nhẹ cho dần tan hết sau đó cho vài giọt

phenolphthalein rồi đem chuẩn độ bằng KOH 0,1N trong cồn 95o đến khi dung dịch

xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây thì kết thúc chuẩn độ.

34

- Tính kết quả:

Tính chỉ số axit (WAV), biểu thị bằng số mg KOH dùng để trung hòa các axit

béo tự do có trong 1g chất béo, sử dụng công thức sau:

WAV = 5,61*C*V

M

Trong đó:

C là nồng độ của dung dịch chuẩn KOH, tính bằng ,mol/lít (mol/l)

V là thể tích dung dịch chuẩn KOH 0,1N đã sử dụng, tính bằng mililit (ml)

M là khối lượng phần mẫu thử tính bằng gam (g)

 Phương pháp xác định định chỉ số peroxit

- Chỉ số peroxyt là số gram iod được giải phóng ra khi cho dung dịch Iodua

Kali (KI) tác dụng với 100g dầu mỡ nhờ tác dụng của cả peroxyt trong dầu mỡ (oxy

hoạt động). Chỉ số peroxyt đặc trưng cho sự ôi hóa của chất béo

- Thức hiện theo “TCVN 6121:2010 dầu mỡ động vật & thực vật - xác định chỉ

số peroxyt - phương pháp xác định điểm kết thúc chuẩn độ iod (quan sát bằng mắt)”.

- Nguyên tắc

Dựa vào tác dụng của peroxyt với dung dịch Iodua Kali (KI) tạo ra I2 tự do

(trong môi trường acid acetic và cloroform). Sau đó chuẩn độ I2 tự do bằng dung

dịch chuẩn Na2S2O3 với chỉ thị hồ tinh bột.

Điểm tương đương nhận được khi dung dịch chuyển từ màu tím đen sang

không màu.

- Cách tiến hành:

Cân vào erlen có nút nhám chính xác 5g mẫu thức ăn chăn nuôi. Hòa tan

mẫu thử bằng 10ml chloroform (CHCL3). Thêm 15ml axetic acid hoặc cho vào 15 -

30ml hỗn hợp chloroform-axetic acid bang (tỷ lệ 1:2). Thêm 1ml dung dịch KI bão

hòa. Đậy kín erlen ngay, lắc trong 1 phút và để yên 5 phút ở nơi tối và nhiệt độ từ 15 - 25oC.

Thêm 30ml nước cất, lắc mạnh, thêm 5 giọt hồ tinh bột 1% làm chất chỉ thị.

Chuẩn độ iod tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,002N cho mẫu có chỉ số peroxyt

nhỏ và Na2S2O3 0,01N cho mẫu có chỉ số peroxyt lớn.

35

Lưu ý:

- Cần chuẩn độ 2 - 3 mẫu trong cùng điều kiện.

- Chuẩn độ một mẫu trắng song song (thay 5ml dung dịch mẫu thử bằng 5ml

nước cất). Nếu kết quả của mẫu trắng vượt quá 0,1ml dung dịch Na2S2O3 0,01N thì

đổi hóa chất do không tinh khiết.

- Tính kết quả:

Tính chỉ số peroxit (PV), biểu thị bằng mili đương lượng (meq) ôxy hoạt

động trên kilogam, sử dụng Công thức sau:

PV= (V-V0)*Cthio*F*1000

m

Trong đó:

V là thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat dùng để xác định, tính bằng

mililit (ml)

V0 là thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat dùng trong phép thử trắng, tính

bằng mililit (ml)

cthio là nồng độ của dung dịch natri thiosulfat, tính bằng mol trên lít (mol/l)

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g)

F là nồng độ đường lượng gam của Na2S2O3

3.5.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 5: Hoàn thiện quy trình thu dịch chiết

từ bã quả ổi đào

- Tổng hợp và lựa chọn các chỉ tiêu sau khi phân tích

- Vẽ sơ đồ - thuyết minh quy trình tách chiết polyphenol từ bã qua ổi đào.

3.6. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20. So sánh sự sai khác giữa các

giá trị trung bình bằng so sánh Duncan.

Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp bề mặt

chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box- Behnken với ba biến ba cấp độ. Các số

liệu được xử lý trên phần mềm Design - Expert 7.0.

36

Phần 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu

4.1.1. Kết quả xác định trọng lượng khô của nguyên liệu

Hàm lượng chất khô của bã ổi đào là 32,637% cho thấy bã ổi đào có hàm

lượng nước khá cao chiếm 67,363% trọng lượng khô. Hàm lượng ẩm cao là một bất

lợi trong quá trình bảo quản mẫu. Vì vậy, để thuận tiện trong quá trình bảo quản và

chiết tách thì ta phải tiến hành làm khô sao cho hàm lượng nước trong bã ổi đào

xuống đến ẩm độ khoảng 10%. Hơn nữa làm khô giúp thuận tiện cho quá trình xay

nhỏ, giảm kích thước, tạo độ đồng đều cho mẫu giúp quá trình tách chiết đem lại

hiệu quả cao hơn.

4.1.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol tổng của bã quả ổi đào 38,465mg

GAE/g DW cao hơn so với hàm lượng polyphenol thu được từ vỏ thân quao nước

khi sử dụng dung môi là hexan, thời gian chiết tách là 3 giờ, nhiệt độ chiết tách là

30oC với tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 1/10 theo nghiên cứu của Phạm Ngọc

Khôi (2017) với hàm lượng polyphenol là 36,79 mgGAE/g DW. Một số tác giả đã

công bố hàm lượng polyphenol trong một số loại thực vật. Kết quả nghiên cứu của

Marja và cộng sự (1999) khi nghiên cứu hàm lượng polyphenol của 92 loại thực vật

ăn được và không ăn được đã báo cáo rằng hàm lượng polyphenol của chúng dao

động khá rộng trong khoảng từ 0,2 đến 155,3 mg GAE/g DW. Theo nhóm tác giả

này những loại thực vật có hàm lượng polyphenol lớn hơn 20 mg GAE/g DW thì có

hoạt tính chống oxi hóa mạnh mẽ. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hàm

lượng polyphenol của bã ổi đào còn lại là tương đối cao chúng có thể được dùng để

ứng dụng trong một số lĩnh vực, trong đó có thực phẩm. Tuy nhiên, để khẳng định

khả năng chống oxi hóa cần tiến hành các phân tích in vitro để khẳng định khả năng

chống oxi hóa của bã ổi đào.

37

4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tách chiết thu dịch chiết tổng

từ bã ổi đào

4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và nồng độ của dung môi chiết đến

hàm lượng polyphenol

Nhìn vào bảng 4.1 cho thấy hàm lượng polyphenol thu được thấp nhất là

36.87 mg GAE/g DW khi sử dụng dung môi là meOH, cao thứ 2 là nước với hàm

lượng polyphenol là 37,19 mg GAE/g DW và cao nhất là EtOH với hàm lượng

polyphenol là 37,23 mg GAE/g DW. Ta thấy ở dung môi là nước và EtOH cho hàm

lượng polyphenol không có sự sai khác về giá trị trung bình. Chính vì vậy chúng tôi

đã lựa chọn nước là dung môi để tránh ô nhiễm, giảm công đoạn thu hồi dung môi

và tiết kiệm được chi phí tách chiết.

Bởi vì lựa chọn dung môi nước cho nên không có nồng độ dung môi.

Bảng 4.1. Bảng so sánh hàm lượng polyphenol thu được

ở các loại dung môi khác nhau

Hàm lượng polyphenol Dung môi (mg GAE/ g DW)

MeOH 36,87b

Nước 37,19a

EtOH 37,23a

4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng

polyphenol

Tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol thu

được. Nếu lượng dung môi quá ít thì không đủ để hòa tan, chiết rút các cấu tử ra

bên ngoài môi trường, chỉ đủ làm ướt nguyên liệu. Nếu dùng lượng dung môi lớn

thì gây lãng phí, tốn kém dung môi, chi phí cao. Thí nghiệm tiến hành để khảo sát

ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol thu được và

tìm ra tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tốt nhất cho quá trình chiết, kết quả được trình

bảy ở bảng 4.2.

38

Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu

đến hàm lượng polyphenol

Công thức

Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α<0,05

CT1 CT2 CT3 CT4 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (ml/g) 5/1 10/1 15/1 20/1 Hàm lượng polyphenol (mg GAE/ g DW) 36,22b 37,06a 35,93b 35,49c

Qua bảng trên ta thấy được tỷ lệ dung môi/nguyên liệu có ảnh hưởng tới hàm

lượng polyphenol được chiết từ bã ổi đào. Ở tỷ lệ 10/1, hàm lượng polyphenol đạt

cao nhất là 37,06 mg GAE/g DW, hàm lượng polyphenol cao thứ 2 là 36,22 mg

GAE/g DW ở tỷ lệ 5/1 và giảm dần ở 2 tỷ lệ 15/1 và 20/1 với hàm lượng

polyphenol lần lượt là 35,93 mg GAE/g DW và 35.8 mg GAE/g DW. Đạt hàm

lượng polyphenol cao nhất 37,06 mg GAE/g DW ở tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là

10/1 (v/w). Vì vậy chúng tôi lựa chọn tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu thích hợp là

10/1 (v/w). Kết quả này được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.

4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol

Thời gian chiết là một trong những yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới hàm lượng

polyphenol. Nếu thời gian chiết kéo dài không những hàm lượng polyphenol giảm

mà còn có thể khiến polyphenol bị oxy hóa. Nhưng nếu thời gian chiết ngắn thì

không đủ cho dung môi xâm nhập vào trong tế bào để hòa tan polyphenol và chiết

rút ra ngoài ít khiến hàm lượng polyphenol thu được thấp. Do vậy cần phải xác định

thời gian chiết tối ưu. Kết quả được biểu diễn ở bảng 4.3:

Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết

đến hàm lượng polyphenol

Công thức

Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α<0,05

CT1 CT2 CT3 CT4 Thời gian chiết (phút) 25 30 35 40 Hàm lượng polyphenol (mg GAE/ g DW) 36,34b 37,07a 36.87a 36.93a

39

Từ bảng 4.3 cho thấy thời gian tách chiết có ảnh hưởng đến quá trình chiết

tách polyphenol từ bã ổi đào. Ta có thể nhận thấy hàm lượng polyphenol tăng khi

thời gian chiết từ 25 lên 30 phút là 36,34 mg GAE/g DW lên 37,07 mg GAE/g DW.

Nhưng khi tăng thời gian chiết lên 35 và 40 phút thì hàm lượng polyphenol giảm

xuống còn 36.78 và 36,93 mg/g DW. Khi chiết ở thời gian là 30 phút thì cho hàm

lượng polyphenol là cao nhất, vì vậy chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 30

phút. Kết quả này được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.

4.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn tới hàm lượng polyphenol thu được sau quá

trình chiết. Nhiệt độ làm giảm độ nhớt của dung dịch, tăng tốc độ thẩm thấu của

dung môi vào tế bào và tăng hiệu suất trích ly. Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ quá cao

sẽ làm giảm hiệu quả của quá trình chiết vì đã làm bay hơi một phần dung môi và

gây ảnh hưởng tới trạng thái, cấu trúc của polyphenol. Ngược lại, nhiệt độ thấp thời

gian chiết kéo dài, không chiết kiệt được các chất trong bã. Vì vậy cần tìm ra một

giá trị nhiệt độ chiết phù hợp, kết quả thu được như sau:

Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết

đến hàm lượng polyphenol

Hàm lượng polyphenol Công thức

CT1 Nhiệt độ chiết (0C ) 35

CT2 40

CT3 45

Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α<0,05

CT4 50 (mg GAE/ g DW) 36,74b 37,13a 36,95ab 36,96ab

Qua bảng 4.4 ta thấy rằng, hàm lượng polyphenol trong dịch chiết tăng

nhanh ở 35oC từ 36,74 mg GAE/g DW lên đến 37,17 mg GAE/g DW ở 40oC. Tuy

nhiên khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên 45 và 500C thì hàm lượng polyphenol có xu

hướng giảm, giảm tương đối. Hàm lượng polyphenol thu được cao nhất cao nhất ở

nhiệt độ 400C . Vì vậy nhiệt độ chiết thích hợp cho quá trình chiết là 400C, kết quả

này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

40

4.3. Thử nghiệm tách chiết trên điều kiện tối ưu

4.3.1. Kết quả thử nghiệm tối ưu hóa quá trình tách chiết polyphenol từ bã ổi đào

Sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box-

Behnken với ba biến ba cấp độ. Các số liệu thu được từ dịch chiết polyphenol được

xử lý trên phần mềm Design-Expert 7.0 (Stat-Ease Inc, Minneapolis, USA)

ANOVA được dùng để đánh giá cao thu được. Tiến hành giải bài toán tối ưu theo

phương pháp “hàm mong đợi”. Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.0 để tiến hành

tối ưu hóa nhằm xác định được giá trị của ba yếu tố mà tại đó hàm lương

polyphenol là cao nhất. Áp dụng phương pháp phân tích hồi quy các số liệu thực

nghiệm, thu được mô hình đa thức bậc hai thể hiện hàm lượng polyphenol :

Y = + 6.20 + 0.029 * A + 8.803 E - 0.003 * B + 0.026 * C + 0.018 * A * B + 0.012 * A * C - 0.11 * A2 - 0.055 * B2 - 0.060 * C2

Trong đó Y là hàm lượng polyphenol trong dịch chiết dự báo thu được.

Bảng 4.5. Kết quả ma trận thực nghiệm Box- Behnken

ba yếu tố chiết Polyphenol từ bã ổi đào

Biến thực

TN Hàm lượng polyphenol (mg GAE /g DW) A (thời gian chiết)

C (dung môi/ nguyên liệu) 10 10 10 10 5 5 15 15 5 5 15 15 10 10 10 10 10 25 35 25 35 25 35 25 35 30 30 30 30 30 30 30 30 30 36,13 36,44 35,98 37,18 35,87 36,24 36,23 37,17 36,79 36,54 37,04 37,56 38,33 38,51 38,36 38,59 38,21 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 B (nhiệt độ chiết) 35 35 45 45 40 40 40 40 35 45 35 45 40 40 40 40 40

41

Để đánh giá mô hình chúng tôi sử dụng phân tích ANOVA. Kết quả phân

tích ANOVA được thể hiện qua bảng sau:

Bảng 4.6. Kết quả ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố

chiết polyphenol từ bã ổi đào

DF MS Chuẩn F Giá trị p Nguồn SS

9 Model 0.099 0.011 107.39 < 0.0001

1 A 6.806E-003 6.806E-003 66.70 < 0.0001

1 B 6.199E-004 6.199E-004 6.08 0.0432

1 C 5.570E-003 5.570E-003 54.59 0.0002

1 AB 1.350E-003 1.350E-003 13.23 0.0083

1 AC 5.470E-004 5.470E-004 5.36 0.0538

1 BC 9.990E-004 9.990E-004 9.79 0.0166

1 A2 0.047 0.047 459.10 < 0.0001

1 B2 0.013 0.013 127.00 < 0.0001

1 C2 0.015 0.015 148.78 < 0.0001

7 Residual 7.142E-004 1.020E-004

3 Lack of Fit 1.231E-004 4.105E-005 0.28 0.8395

4 Sai số (pure error) 5.911E-004 1.478E-004

SS tổng Số 0.099 16

SS: Tổng phương sai; DF:Bậc tự do; MS: Trung bình phương sai; chuẩn F: Chuẩn

Fisher; Residual: Phần dư; “Lack of Fit”: Chuẩn đánh giá độ không tương thích

của mô hình với thực nghiệm.

Từ kết quả phân tích ANOVA ta thấy giá trị xác suất của mô hình P-value =

0,0214 < 0,05 do đó mô hình được lựa chọn để giải thích cho kết quả của thí

nghiệm, Lack of fit test = (not significant) có ý nghĩa đối với mô hình.

42

Hình 4.1. Bề mặt đáp ứng hàm lượng polyphenol

a. Mô hình tương tác giữa nhiệt độ chiết tách và thời gian chiết tách

b. Mô hình tương tác giữa tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu và thời gian chiết tách

c. Mô hình tương tác giữa tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu và nhiệt độ chiết tách

Phương án tốt nhất được dự đoán nhiệt độ chiết tách là 30,73oC, thời gian

chiết tách là 40,52 phút khi đó hàm lượng, tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 10/1

(v/w), polyphenol đạt 38,4322 mg/g DW. Kết quả kiểm tra bằng thực nghiệm cho

kết quả tương ứng.

Hình 4.2. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu ở hàm lượng polyphenol

4.4. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào thông

qua khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và ứng

dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

4.4.1. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào thông

qua khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)

Khả năng quét gốc tự do DPPH là một trong những phép phân tích để đánh

giá hoạt tính chống oxi hóa trong in vitro thường sử dụng nhất trong nghiên cứu, có

43

đến 90% các nghiên cứu về chất chống oxi hóa sử dụng phép phân tích này (Joon-

Kwan và Takayuki, 2009). Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết bã ổi đào thể

hiện khả năng chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH. Trong phạm

vi nghiên cứu này, sự tăng khả năng khử gốc tự do DPPH có mối tương quan tuyến

tính khá chặt với thể tích dịch chiết sử dụng (R2 = 0,9981). Mối tương quan giữa

thể tích dịch chiết và khả năng khử gốc tự do có dạng: y = 0,4637x + 7.435, trong

đó y là khả năng khử gốc tự do DPPH, x là thể tích dịch chiết. Giá trị IC50 của dịch

chiết có khả năng khử được 50% gốc tự do DPPH trong điều kiện thí nghiệm được

xác định từ mối quan hệ tuyến tính giữa thể tích dịch chiết và khả năng khử gốc tự

do DPPH, Giá trị IC50 càng thấp khả năng chống oxy hóa càng cao [10, 11]. Kết

quả cho thấy giá trị IC50 của dịch chiết là 91,8 µl thấp hơn 0,91µl so với kết quả

trong nghiên cứu của Hồ Minh Hiệp (2013) với giá trị IC50 là 92,71µl. Điều này

cho thấy dịch chiết polyphenol trong nghiên cứu này có khả năng chống oxi hoá cao

hơn, thể hiện thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH có thể được lý giải là do

trong dịch chiết bã quả ổi đào có chứa các chất chống oxi hóa, mà điển hình là các

hợp chất polyphenol. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tiềm năng có thể

sử dụng bã ổi đào làm nguồn chiết xuất các chất chống oxi hóa và khả năng áp dụng

dịch chiết này trong một số lĩnh vực, trong đó có thực phẩm.

Hình 4.3. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết bã ổi đào

44

4.4.2. Kết quả ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

4.4.2.1. Kết quả xác định về chỉ tiêu vi sinh vật tổng số

Kết quả khảo sát giới hạn vi sinh vật & nấm men, nấm mốc trong thức ăn

chăn nuôi. Tiến hành thí nghiệm xác định chỉ tiêu vi sinh vật tổng số, kết quả thu

được trình bày ở bảng 4.7:

Bảng 4.7. Kết quả đáng giá chỉ tiêu vi sinh vật theo 10TCN 863:2006

Tên chỉ tiêu Kết quả Mức tối đa

8,9.104 1.106 Tổng số vsv hiếu khí

6,7.103 1.105 Nấm men, nấm mốc

Qua bảng 4.7 cho thấy chỉ tiêu vi sinh vật tổng số đạt yêu cầu theo quy định

ban hành.

4.4.3. Khảo sát hàm lượng chất béo có trong thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

Thức ăn chăn nuôi trong quá trình bảo quản có thể bị hư hỏng do bị chua do

chất béo bị thủy phân sinh ra các axit béo tự do và glyxerin và bị ôi khét do bị oxy

hóa chất béo bởi oxy của không khí, chúng kết hợp với các mạch cacbon không bão

hòa của dầu mỡ và cho các peroxyt không bền vững. Các peroxyt này bị phân hủy

thành các aldehyt và xeton làm cho thức ăn chăn nuôi bị ôi khét,…

Để đánh giá mức độ thủy phân và oxy hóa của thức ăn chăn nuôi cần xác

định chỉ số axit và chỉ số peroxyt… Từ đó đánh giá được chất lượng của thức ăn

chăn nuôi trong quá trình bảo quản.

Bảng 4.8. Chỉ số axit và chỉ số peroxyt ban đầu của thức ăn chăn nuôi

Giá trị đo Chỉ số axit (mg KOH/g) Chỉ số peroxyt (meq/g)

Chất béo trong cám lợn 3,08 7,13

45

Bảng 4.9. Sự biến đổi chỉ số axit và chỉ số peroxyt của thức ăn chăn nuôi có bổ

sung dịch chiết polyphenol trong 30 ngày bảo quản

Bảo quản trong dịch chiết Bảo quản điều kiện thường polyphenol Ngày bảo

Chỉ số axit Chỉ số peroxyt Chỉ số axit Chỉ số peroxyt quản

(mg KOH/g) (meq/kg) (mg KOH/g) (meq/kg)

7,13 3,08 3,08 7,13 0

7,41 4,12 4,06 7,28 5

8,03 5,34 5,12 7,35 10

8,59 6,89 6,11 7,48 15

9,12 7,16 6,29 7,78 20

9,87 7,97 6,48 8,32 25

10,05 8,21 6,51 8,85 30

Theo QCVN 01 - 78: 2011/BNNPTNT (Phụ lục 7) với thức ăn chăn nuôi có

nguồn gốc từ một số nguyên liệu khác nhau có chỉ số peroxyt tối đa cho phép không

lớn hơn 40 meq/kg và chỉ số axit tối đa cho phép không vượt quá 60 mg KOH/100g

bột. Qua việc khảo sát chúng ta thấy được hàm lượng polyphenol trong bã ổi đào

thu được tương đối cao vì vậy khi bảo quản thức ăn chăn nuôi trong dịch chiết đã

giúp làm chậm quá trình oxy hóa chất béo. Bên cạnh đó chúng ta có thể tận dụng

được triệt để bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép.

46

4.5. Hoàn thiện quy trình tách chiết polyphenol từ bã ổi đào

Quả ổi đào

Xử lý ( rửa, xay..)

Bã ổi đào

Chiết chất chống oxy hóa

Dung môi chiết :nước Nhiêt độ chiết: 40,52o C Thời gian chiết: 30,73 phút Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 10/1 (w/v).

Dịch chiết

Xác định hàm lượng Polyphenol

Hình 4.4. Sơ đồ hoàn thiện quy trình tách chiết polyphenol

Thuyết minh quy trình:

Quả ổi đào có độ chín 90% được thu hái về mang đi loại bỏ tạp chất, sâu

bệnh, thối hỏng. Rửa quả bằng nước sạch, để khô tự nhiên sau đó mang đi xay lấy

bã. Bã của quả ổi đào được tách chiết bằng phương pháp trích ly trong điều kiện:

Dung môi chiết là nước, nhiệt độ và thời gian chiết lần lượt là 40,52o C và 30,73

phút, tỉ lệ nguyên liệu so với dung môi chiết là 1/10 (w/v). Dịch chiết thu được

được mang đi xác định hàm lượng polyphenol.

47

Phần 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

Qua những kết quả nghiên cứu đạt được, có thể đưa ra một số kết luận như sau:

Xác định được trọng lượng khô trong nguyên liệu là 32,637%

Xác định được hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu là 38,465 mg

GAE/g DW.

Sử dụng phương pháp phân tích đơn yếu tố, thí nghiệm sau kế thừa kết quả

nghiên cứu của thí nghiệm trước. Lựa chọn dung môi chiết là nước, thời gian chiết

30 phút, nhiệt độ chiết 40oC tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 10/1 (ml/g).

Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box- Behnken đã tìm đươc điều

kiện tối ưu quá trình tách chiết dịch chiết của bã ổi đào: Dung môi chiết là nước, tỷ

lệ dung môi trên nguyên liệu là 10/1 (v/w), thời gian chiết là 30,73 phút và nhiệt độ

chiết là 40,52oC cho hàm lượng Polyphenol là 38,4322 mg/g DW.

Khả năng quét gốc tự do DPPH: cứ 91,8 µg dịch chiết bã quả ổi đào ở điều

kiện chiết tối ưu thì khử được 50% gốc tự do.

Ứng dụng hợp chất polyphenol chiết được từ bã quả ổi đào trong bảo quản

thức ăn chăn nuôi cho thấy Polyphenol trong bã quả ổi đào có khả năng chống oxi

hóa trong bảo quản thức ăn chăn nuôi.

5.2. Kiến nghị

Do điều kiện nghiên cứu còn giới hạn nên còn nhiều khía cạnh vẫn chưa thể

khai thác được triệt để, chúng tôi xin đề nghị một số vấn đề cần nghiên cứu tiếp

theo như: Khảo sát thêm một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết

polyphenol từ bã quả ổi đào, đồng thời tiến hành thử nghiệm khả năng chống oxy

hóa của dịch chiết bã ổi đào đối với thức ăn chăn nuôi giàu chất béo và nhiều đối

tượng khác để đưa ra được kết quả chính xác hơn nữa về khả năng chống oxy hóa

của chúng.

48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. TIẾNG VIỆT

[1] Hồ Bá Vương, Nguyễn Xuân Duy, Nguyễn Anh Tuấn, “Tối ưu hóa chiết

polyphenol từ lá ổi bằng phương pháp bề mặt đáp ứng”, Tạp chí Khoa học

và Nông nghiệp Việt Nam - Vol. 7, No.13.

[2] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, quyển II, tr.59.

[3] Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học,

tr.5p431.

[4] Viện dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa

học và kỹ thuật, tr.499-504.

[5] Ngô Thanh Hùng (2013), “Tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol từ lá vối

(cleistocalyx operculatus) và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch

chiết”, Đại học Nha Trang.

[6] Ngô Xuân Mạnh (2006). GT Hóa sinh thực vật. NXB Nông Nghiệp

[7] Nguyễn Thị Đoàn (2010), Phân tích thực phẩm, Giáo trình nội bộ - Trường Đại

học Nông lâm Thái Nguyên.

[8] Phạm Ngọc Khôi, Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2017), “Khảo sát điều kiện tách chiết và hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn của hợp chất polyphenol từ vỏ thân cây quao nước”, tạp chí Đại học sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, tập 14, số 12, tr.181-193.

[9] Hồ Minh Hiệp (2013), “Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết lá Ổi

và ứng dụng hạn chế sự oxi hóa chất béo thịt cá Dầu bảo quản lạnh ”, khóa

luận tốt nghiệp - trường Đại học Nha Trang.

[10] Nguyễn Minh Cẩm Tiên, Phạm Ngọc Khôi, “Nghiên cứu hoạt tính kháng

khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa của hợp chất polyphenol chiết xuất từ rễ

cây mướp gai (Lasia spinosaL.)”,Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, tập 20, Phụ

bản số 20, tr.436 -446, 2016.

49

[11] Phạm Ngọc Khôi, Lê Trọng Nghĩa, “Khảo sát các điều kiện thu hồi dịch chiết

và hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa của dịch chiết bắp cải tím (Brassica

oleracea),”Tạp chí Khoa học Yersin, số 1 (11/2016), tr.23 -29, 2016

II. TIẾNG ANH

[12]. Chirinos Gallardo(2008), “Polyphenols from the Andean mashua (Tropaeolum

tuberosum) tuber: Evaluation of genotypes, extraction,chemical

characterization and antioxidant properties”, These doctorale de University

catholique de Louvain.

[13]. Unno, T., Kondo, K., Itakura, H. and Takeo, T.(1996), “Analysis of

Epigallocatechin Gallate in Human Serum Obtained after Ingesting Green

Tea in Biosci, Biotech. Biochem, 60, 2066-2148

[14] Luximon - Ramma A., Bahorun T., and Crozier A. (2003), “Antioxidant

actions and phenolics and vitamin C contents of common Mauritian exotic

fruits”, Journal of the Science of Food and Agriculture, 83(5), 496-502.

[15] Mercadante, A., Z., Teck, Z., and Pfander, H. 1999, “Carotenoids from guava

(Psidium Guajava L.): isolation and structure elucidatio”, Journal

Agriculture Food Chemistry”, 47(1), 145-151.

[16] Dassgupta, A., and Klein, K. (2014), “Antioxidants in Food, Vitamin and

Supplements, Prevention and Treatment of Disease”, Elsevier, pp. 209-235.

[17] Lim, T., K., and Khoo, K., C. (1990), “Guava in Malaysia: Production, pests

and diseases”, Tropical Press Malaysia. Kuala Lumpur.

[18] Jimenez-Escrig, A., Rincon, M., Pulido, R., and Saura-Calixto, F. (2001),

“Guava fruit (Psidium guajava L.) as a new source of antioxidant dietary

fiber”, Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49(11), 5489-5493.

[19] Arima, H, Danno, G (2002), “ Isolation of antimicrobial compounds from

guava”, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. Vol.66, issue 8,

p.1727-1730.

[20] Paniandy, J.C. Chane – ing, J.. Pieribattesti (2000), “ Chemical composition of

the essential oil and headspeace solid phase microextraction of the guava

50

fruit ( Psidium guajava L.)”. Journal of Esential oil Research, Vol.12, Issue

2, p.153-158.

[21] Deguchi Y, Miyazaki K (2010), Anti-hyperglycemic and anti-hyperlipidemic

effects of guava leaf extract, Nutr Metab (Lond), 7:9.

[22] Chen Y, Zhou T, Zhang Y, Zou Z, Wang F, Xu D (2015), Evaluation of

antioxidant and anticancer activities of guava, Int J Food Nutr Saf, 6(1):1–9.

[23] Venkatesan N, Thiyagarajan V, Narayanan S, Arul A, Raja S, Kumar SGV,

Rajarajan T, Perianayagam JB (2005), Antidiarrheal potential of Asparagus

racemous wild root extracts in laboratoire animals, J Pharm Pharmaceut Sci,

8:39–45.

[24] Vieira RHSF, Rodrigues DP, Gonçalves FA, Menezes FGR, Aragoo JS, Sousa

OV(2001), Microbicidal effect of medicinal plant extracts (Psidium guajava

linn. And Carica papaya linn.) upon bacteria isolated from fish muscle and

known to induce dirrhea in children, Rev Inst Med trop S Paulo, 43:145–8.

[25] Ojewole J, Awe EO, Chiwororo WDH (2008), Antidiarrhoeal activity of

Psidium guajava Linn. (Myrtaceae) leaf aqueous extract in rodents. J

Smooth Muscle Res, 44(6):195–207.

[26] Denny C, Melo PS, Franchin M, Massarioli AP, Bergamaschi KB, Alencar SM

De, et al (2013), Guava pomace: a new source of anti-inflammatory and

analgesic bioactives.

[27] Roy CK, Kamath JV, Asad M (2006), Hepatoprotective activity of Psidium

guajava Linn. leaf extract. Indian J Exp Biol, 2006;44(4):305–11.

[28] Masuda T, Inaba Y, Maekawa T, Takeda Y, Yamaguchi H, Nakamoto K,

Kuninaga H, Nishizato S, Nonaka A(2003), Simple detection method of

powerful antiradical compounds in the raw extract of plants and its

application for the identification of antiradical plant constituents, J Agric

Food Chem, 51:1831–8.

[29] Feskanich D, Ziegler RG, Michaud DS, Giovannucci EL, Speizer FE, Willett

WC, Colditz GA (2000), Prospective study of fruit and vegetable

51

consumption and risk of lung cancer among men and women, J Natl Cancer

Inst, 92:1812–23.

[30] Fleuriet A, Macheix JJ (2003), “Phenolic acids in fruits and vegetables. In C.A.

Rice-Evans & L. packer, flavonoids in health and disease”, New York:

Marcel Dekker Inc.

[31] Jiminez-Escrig A, Rincon M, Pulido R, Saura-Calixto F (2001), “Guava fruit

(Psidium guajava L.) as a new source of antioxidant dietary fiber”, J Agric

Food Chem. 49(11):5489–93.

[32] He Q, Venant N, Antioxidant power of phytochemicals from Psidium guajava

leaf, J Zhejiang Univ Sci A 2004; 5(6):676-83.

[33] C.A Rice-Evans, N. J. Miller, G. Paganga (1997), “Antioxidant properties of

phenolic compounds, Trends Plant Sci, 2(4).

TRANG WEB

[34] https://visitech.vn/cfu-la-gi-cach-tinh-cfu-nhu-the-nao/

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Một số hình ảnh trong quá trình nghiên cứu

Dãy nồng độ pha loãng axit gallic Quá trình rung lắc dịch chiết

bã ổi đào

Dịch chiết Polyphenol Bã ổi đào

Phụ lục 2: Xử lý số liệu

1. Xử lý kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chiết

polyphenol từ bã ổi đào

1.1. Xử lý kết quả khảo sát loại dung môi chiết

ANOVA

TPC

Sum of df Mean Square F Sig.

Squares

Between Groups .116 187.125 .000 .233 2

Within Groups .001 .004 6

Total .237 8

TPC

Duncan

Dungmoi N Subset for alpha = 0.05

1 2

CT1 36.8700 3

CT2 3 37.1933

CT3 3 37.2267

Sig. .153 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

1.2. Xử lý kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu

ANOVA

TPC

Sum of df Mean Square F Sig.

Squares

Between Groups 3.925 1.308 24.435 .000 3

Within Groups .428 .054 8

Total 4.353 11

TPC

Duncan

dungmoi.nguyenlieu N Subset for alpha = 0.05

1 2 3

35.4900 3 CT4

35.9300 3 CT3

36.2167 3 CT1

37.0567 3 CT2

1.000 .168 1.000 Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

1.3. xử lý kết quả khảo sát thời gian chiết

ANOVA

TPC

Sum of df Mean Square F Sig.

Squares

Between Groups .927 3 .309 8.924 .006

Within Groups .277 8 .035

Total 1.204 11

TPC

Duncan

N Subset for alpha = 0.05 thoigian

1 2

36.3400 3 CT1

3 36.8700 CT3

3 36.9333 CT4

3 37.0733 CT2

.235 1.000 Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

1.4. xử lý kết quả khảo sát tỷ lệ nhiệt độ chiết

ANOVA

TPC

Sum of df Mean Square F Sig.

Squares

Between Groups .233 3 .078 5.982 .019

Within Groups .104 8 .013

Total .337 11

TPC

Duncan

N Subset for alpha = 0.05 nhietdo

1 2

3 36.7400 CT1

3 36.9467 36.9467 CT2

3 36.9600 36.9600 CT4

3 37.1333 CT3

.053 .091 Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

1.5. Tối ưu hóa quá tình tách chiết Polyphenol từ bã ổi đào

Nguồn SS DF MS Chuẩn F Giá trị p

Model 0.099 0.011 107.39 < 0.0001 9

A 6.806E-003 6.806E-003 66.70 < 0.0001 1

B 6.199E-004 6.199E-004 6.08 0.0432 1

C 5.570E-003 5.570E-003 54.59 0.0002 1

AB 1.350E-003 1.350E-003 13.23 0.0083 1

AC 5.470E-004 5.470E-004 5.36 0.0538 1

BC 9.990E-004 9.990E-004 9.79 0.0166 1

A2 0.047 0.047 459.10 < 0.0001 1

B2 0.013 0.013 127.00 < 0.0001 1

C2 0.015 0.015 148.78 < 0.0001 1

Residual 7.142E-004 1.020E-004 7

Lack of Fit 1.231E-004 4.105E-005 0.28 0.8395 3

Sai số (pure error) 5.911E-004 1.478E-004 4

SS tổng Số 0.099 16

2. Xác định trọng lượng khô

Chỉ tiêu phân tích Lặp lại Hàm lượng Đơn vị

1 32,635

Trọng lượng khô % 2 32,554

3 32,723

3. Xác định hàm lượng polyphenol của dịch chiết bã ổi đào

Tên chỉ tiêu lặp lại Hàm lượng Đơn vị

1 38,421

Polyphenol mg GAE/ g DW 2 38,513

3 38,461

4. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết bã ổi đào

Khả năng khử gốc tự do DPPH (%) Thể tích dịch Trung Bình chiết (µg) Lần 1 Lần 2 Lần 3

30 17,47 23,36 21,26 20,7

60 31,34 37,38 38,83 35,85

90 45,85 49,41 54,49 49,92

120 57,16 66,26 63,71 62,38

5. Kết quả xác định chỉ tiêu vi sinh vật tổng số trong quá trình bảo quản thức ăn

chăn nuôi

Tên chỉ tiêu Kết quả Mức tối đa

8,9.104 1.106 Tổng số vsv hiếu khí

6,7.103 1.105 Nấm men, nấm mốc

6. Kết quả sự biến đổi chỉ số axit và chỉ số peroxyt của mẫu cám lợn có bổ sung

dịch chiết polyphenol trong 30 ngày bảo quản

Bảo quản trong dịch chiết Bảo quản điều kiện thường polyphenol Ngày bảo

Chỉ số axit Chỉ số peroxyt Chỉ số axit Chỉ số peroxyt quản

(mg KOH/g) (meq/kg) (mg KOH/g) (meq/kg)

3,08 7,13 3,08 7,13 0

4,12 7,41 4,06 7,28 5

5,34 8,03 5,12 7,35 10

6,89 8,59 6,11 7,48 15

7,16 9,12 6,29 7,78 20

7,97 9,87 6,48 8,32 25

8,21 10,05 6,51 8,85 30

7. Chỉ tiêu chất lượng thức ăn chăn nuôi

Tên Tên chỉ Hàm lượng tối đa STT nguyên Phương pháp tiêu cho phép liệu

TCVN Tính theo meq/kg Chỉ số 6121:2010 dầu, không lớn peroxyt (ISO hơn 40 3960:2007) 1 Cám gạo Tính theo các loại mgKOH để ISO

Chỉ số axit trung hòa 7305:1998

100g bột,

không quá 60.

TCVN Cám mì Tính theo meq/kg Chỉ số 6127:2010 2 (dạng dầu, không lớn peroxyt (ISO viên, bột) hơn 40. 660:2009)

Tính theo Bột mì mgKOH để loại dùng ISO trung hòa Chỉ số axit 3 trong 7305:1998 100g bột, chăn nuôi không quá 60.

Dầu mỡ TCVN Tính theo meq/kg động vật Chỉ số 6121:2007 dầu, không lớn 4 và thực peroxyt (ISO hơn 40. vật 03960:2001)