Mẫu phân

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

MAÃU PHAÂN

Muïc tieâu

• Höôùng daãn ñöôïc laâm saøng hay thöïc hieän hay laáy ñuùng maãu phaân laøm xeùt nghieäm vi sinh

laâm saøng phaùt hieän caùc taùc nhaân vi khuaån gaây beänh nhôø bieát ñöôïc caùc caùch laáy vaø chuyeân

•

chôû maãu phaân.

thöïc hieän ñöôïc caùc qui trình vi sinh laâm saøng maãu phaân moät caùch chính xaùc vaø thích hôïp

• Löïa choïn ñöôïc phöông tieän thích hôïp nhaát cho caáy phaân trong caùc beänh vieän hieän nay nhôø

nhờ bieát ñöôïc qui trình thöïc hieän.

bieát ñöôïc phöông tieän thích hôïp nhaát ñeå thöïc hieän ñöôïc xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng maãu

phaân.

Chæ ñònh caáy phaân

ƒ Chæ ñònh caáy phaân khi beänh nhaân bò tieâu chaûy hay bò caùc roái loaïn tieâu hoaù nghi do bò nhieãm

ƒ Ñöùng tröôùc caùc beänh nhaân coù moät trong caùc trieäu chöùng sau ñaây, neân cho chæ ñònh caáy

truøng tieâu hoùa.

phaân: tieâu chaûy, lî vôùi phaân coù muû, nhaày hay maùu, bò côn ñau buïng.

Thôøi ñieåm laáy phaân

ƒ Neân laáy vaøo giai ñoaïn sôùm, caøng sôùm caøng toát cuûa beänh.

ƒ Laáy phaân khaûo saùt tröôùc khi beänh nhaân duøng khaùng sinh.

Caùch laáy maãu phaân

ƒ Coù theå laáy phaân töôi, toát nhaát laø vuøng nhaày maùu, cho vaøo loï saïch; roäng mieäng; naép vaën chaët

coù gaén maùi cheøo (duøng loï laáy maãu phaân khoâng F 2M), göûi ñeán phoøng thí nghieäm. Phaân töôi

ƒ Coù theå duøng taêm boâng nhuùng vaøo phaân, vuøng nhaày maùu, cho vaøo moâi tröôøng chuyeân chôû

phaûi ñöôïc caáy trong voøng khoâng quaù 2 giôø sau khi laáy maãu.

Cary-Blair (duøng caëp tube ñuõa taêm boâng voâ truøng/tube ñuõa Cary-Blair ) roài göûi ñeán phoøng

thí nghieäm. Moâi tröôøng chuyeân chôû Cary-Blair coù theå giöõ maãu phaân trong hôn 48 giôø. Tuy

33

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

nhieân, phaûi tieán haønh caáy caøng sôùm caøng toát. Trong tröôøng hôïp nghi beänh nhaân bò thoå taû

(do vi khuaån taû), coù theå cho taêm boâng laáy phaân vaøo oáng moâi tröôøng peptone kieàm ñeå vöøa

ƒ Coù theå laáy maãu phaân baèng taêm boâng queät haäu moân roài cho vaøo moâi tröôøng chuyeân chôû

taêng sinh, vöøa chuyeân chôû ñeán phoøng thí nghieäm.

(duøng caëp tube ñuõa taêm boâng voâ truøng/tube ñuõa Cary-Blair ) ñeå göûi ngay ñeán phoøng thí

ƒ Coù theå khoâng duøng moâi tröôøng chuyeân chôû neáu taêm boâng laáy phaân (duøng taêm boâng voâ truøng

nghieäm.

laáy maãu) ñöôïc nuoâi caáy trong voøng 30 phuùt sau khi laáy maãu.

Khaûo saùt ñaïi theå

ƒ Loûng hay ñaëc? Coù nhaày, coù maùu khoâng?

ƒ Maøu: traéng, vaøng, naâu ñen? Coù giun saùn khoâng?

Quan saùt maãu phaân vaø ghi nhaän:

Khaûo saùt vi theå

ƒ Laøm pheát soi töôi trong tröôøng hôïp nghi taû.

ƒ Laøm pheát nhuoäm Gram trong tröôøng hôïp nghi taû vaø nghi Campylobacter jejuni.

Chæ khaûo saùt vi theå caùc tröôøng hôïp sau:

Nuoâi caáy

ƒ Coù theå caáy phong phuù vaøo caùc moâi tröôøng

- GN broth deå phong phuù caû Salmonella laãn Shigella.

- Peptone kieàm ñeå phong phuù Vibrio.

- Campy-thio ñeå phong phuù C. jejuni.

ƒ Caáy ngay phaân, hay caáy töø moâi tröôøng phong phuù ñaõ caáy phaân vaøo caùc hoäp thaïch phaân laäp:

- Toái thieåu laø MC (hay EMB) vaø SS (hay XLD hay HE).

- Neáu coù yeâu caàu tìm Vibrio, caáy theâm leân MEA hay TCBS.

- Neáu coù yeâu caàu tìm C. jejuni thì caáy theâm Campy-CAP.

- Neáu nghi naám, caáy theâm thaïch Sabouraud.

34

ƒ Caùc hoäp thaïch phaân laäp phaûi ñöôïc uû 35-37 oC trong tuû aám. Rieâng hoäp Campy-CAP thì uû vi

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

ƒ Quan saùt hoäp thaïch sau khi uû qua ñeâm, choïn khuùm vi khuaån nghi ngôø ñeå tieán haønh ñònh

hieáu khí trong nhieät ñoä 42oC.

ƒ Ñoái vôùi caùc khuùm vi khuaån nghi ngôø Salmonella hay Shigella thì coù theå laøm phaûn öùng tuï vôùi

danh vaø laøm khaùng sinh ñoà.

khaùng huyeát thanh ñaëc hieäu ñeå ñònh nhoùm hay ñònh type.

Caùc vi khuaån laø taùc nhaân gaây beänh tìm thaáy trong maãu phaân

ƒ Caùc vi khuaån chaéc chaén gaây beänh

: Salmonella, Shigella , caùc E. coli gaây beänh (ETEC,

EPEC, EIEC, VETEC), S. aureus (coù enterotoxin), V. cholerae vaø caùc Vibrio khaùc ,

Campylobacter jejuni vaø caùc Campylobacter khaùc, Yersinia enterocolitica vaø caùc Yersinia

ƒ Caùc vi khuaån coù theå gaây beänh: Plesiomonas, Aeromonas.

khaùc, Clostridium difficile (coù toxin).

Caùc vi khuaån khaùc coù theå gaây beänh neáu chieám ña soá do bò loaïn khuaån.

Caâu hoûi oân taäp

1. Cho bieát caùc chæ ñònh ñeå caáy phaân.

2. Haõy cho bieát caùch laáy maã u phaân nhö theá naøo?

3. Haõy cho bieát phöông tieän ñeå laáy vaø chuyeân chôû maãu phaân thích hôïp nhaát cho caùc beänh

vieän hieän nay, vaø phaân tích caùc öu khuyeát ñieåm cuûa caùc phöông tieän naøy.

4. Haõy cho bieát qui trình xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng thöïc hieän taïi phoøng thí nghieäm ñoái

vôùi beänh phaåm phaân.

5. Haõy cho bieát caùc vi khuaån gaây beänh coù theå gaëp ñöôïc trong caáy phaân.

35

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

CAÁY PHAÂN – Caùc caâu hoûi thöôøng gaëp

ƒ Neáu laáy maãu phaân töôi thì toát nhaát laø duøng loï saïch coù maùi cheøo gaén treân naép ñeå laáy maãu.

Phöông tieän naøo thích hôïp ñeå laáy vaø chuyeân chôû maãu phaân?

Cuõng coù theå duøng taêm boâng voâ truøng ñeå queät laáy maãu phaân. Maãu phaân töôi phaûi ñöôïc göûi

ñeán phoøng thí nghieäm ñeå laøm xeùt nghieäm ngay vì neáu chaäm treã thì seõ laøm giaûm cô hoäi phaùt

ƒ Trong ñieàu kieän hieän nay, toát nhaát laø duøng caëp tube ñuõa taêm boâng voâ truøng/tube ñuõa Cary-

hieän caùc vi khuaån gaây beänh.

Blair ñeå laáy maãu phaân. Lyù do laø vôùi phöông tieän naøy, phoøng thí nghieäm coù theå ñeå doàn maãu

laïi ñeå caáy vaøo cuoái ngaøy hay vaøo thôøi ñieåm thích hôïp nhaát trong ngaøy maø khoâng caàn phaûi

ƒ Traùnh duøng caùc loï penicillin röûa saïch, tube naép goøn vôùi taêm boâng töï quaán hay caùc loï nhöïa,

caáy ngay moãi khi nhaän ñöôïc maãu.

huû thuyû tinh ñeå laáy maãu phaân vì nhö vaäy seõ khoâng an toaøn trong khaâu göûi maãu hay trong

thao taùc xeùt nghieäm.

ƒ Coù theå beänh bò tieâu chaûy khoâng phaûi do vi khuaån maø do caùc nguyeân nhaân khaùc nhö do

Taïi sao ña soá caùc tröôøng hôïp tieâu chaûy xeùt nghieäm phaân thöôøng aâm tính?

virus, do thaåm thaáu, do ñau bao töû, hay do caùc roái loaïn tieâu hoaù khaùc. Moät taùc nhaân virus

thöôøng gaây tieâu chaûy laø Rota virus, vaø phoøng thí nghieäm vi sinh laâm saøng coù theå phaùt hieän

taùc nhaân naøy neáu coù phöông tieän sinh hoïc phaân töû (PCR, hay chæ caàn ly trích RNA toaøn

phaàn roài ñieän di ñeå phaùt hieän 11 vaïch RNA ñaëc hieäu cuûa virus) hay mieãn dòch (tuï latex hay

ƒ Coù theå beänh nhaân bò tieâu chaûy do caùc taùc nhaân vi khuaån ngoaøi khaû naêng phaùt hieän cuûa

ñieän di mieãn dòch ñoái löu ñeå phaùt hieän khaùng nguyeân ñaëc hieäu cuûa virus trong phaân).

phoøng thí nghieäm do thieáu phöông tieän, hay do phoøng thí nghieäm khoâng coù kinh nghieäm ñeå

phaùt hieän nhö E. coli (EPEC, ETEC, EIEC, EHEC, VETEC), S. aureus tieát enterotoxin, maø

muoán phaùt hieän chính xaùc phaûi coù theâm phöông tieän mieãn dòch hay sinh hoïc phaân töû; hay

Campylobacter jejuni, Clostridium difficille, Y. enterocolitica, maø muoán phaùt hieän phaûi coù

phöông tieän nuoâi caáy thích hôïp; Vibrio cholerae, Aeromonas, Plesiomonas maø muoán phaùt

ƒ Cuõng coù theå do khoâng duøng ñuùng phöông tieän ñeå laáy vaø chuyeân chôû beänh phaåm, keùo theo

hieän thì phaûi coù kinh nghieäm hay phaûi coù quan taâm tröôùc.

haäu quaû laø vi khuaån gaây beänh khoâng coøn nhieàu trong beänh phaåm, hay do phoøng thí nghieäm

36

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

chaäm treã laøm xeùt nghieäm caùc maãu phaân töôi khoâng ñöôïc laáy vaøo moâi tröôøng chuyeân chôû.

Ngoaøi ra moät nguyeân do nöõa coù theå laø do phoøng thí nghieäm khoâng coù phöông tieän vi sinh

toái thieåu ñeå phaân laäp vi khuaån gaây beänh trong maãu phaân cuõng nhö ñònh danh ñöôïc vi khuaån

ƒ Cuoái cuøng, coù theå do beänh nhaân ñaõ duøng khaùng sinh tröôùc khi laáy maãu neân khoâng theå caáy

gaây beänh coù trong maãu phaân.

ñöôïc vi khuaån gaây beänh coù trong phaân,

Vôùi qui trình xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng maãu phaân nhö ñaõ trình baøy, coù phaûi chuùng ta

ƒ Qui trình ñaõ trình baøy cho pheùp chuùng ta coù theå phaùt hieän haàu heát caùc vi khuaån gaây beänh keå

chæ phaùt hieän ñöôïc moät soá chöù khoâng phaûi taát caû caùc vi khuaån gaây beänh?

caû C. jejuni vaø Vibrio spp . Chæ coù C. difficille, S. aureus sinh Enterotoxin vaø Y.

enterocolitica laø khoâng theå phaùt hieän ñöôïc vì caàn phaûi coù theâm phöông tieän nuoâi caáy thích

ƒ Vôùi C. jejuni, vì ñaây laø vi khuaån cuõng khaù thöôøng gaëp, do vaäy caùc beänh vieän cuõng neân quan

hôïp, tuy nhieân ñaây laø 2 taùc nhaân khoâng thöôøng gaëp.

taâm ñeå trang bò cho phoøng thí nghieäm phöông tieän nuoâi caáy phaùt hieän ñöôïc taùc nhaân naøy

ƒ Vôùi caùc vi khuaån E. coli gaây beänh, ñeå phaùt hieän ñöôïc EPEC, phoøng thí nghieäm phaûi trang

(xem phaàn kyõ thuaät phaân laäp C. jejuni).

bò theâm boä khaùng huyeát thanh phaùt hieän (coù theå mua töø Biorad). Vôùi caùc E. coli khaùc nhö

ETEC, EIEC, EHEC, VETEC thì neáu muoán phaùt hieän chính xaùc caàn phaûi coù theâm caùc

ƒ Vôùi S. aureus sinh enterotoxin, ñeå phaùt hieän chính xaùc thì caàn phaûi coù theâm boä thuoác thöû

phöông tieän mieãn dòch hay sinh hoïc phaân töû (PCR).

ELISA phaùt hieän ñoäc toá hay phöông tieän sinh hoïc phaân töû phaùt hieän enterotoxin gene baèng

ƒ Vôùi caùc phoøng thí nghieäm khoâng theå trang bò theâm caùc phöông tieän phaùt hieän chính xaùc E.

kyõ thuaät PCR.

coli, neáu khoâng phaùt hieän ñöôïc caùc taùc nhaân vi khuaån gaây beänh khaùc maø treân hoäp thaïch

phaân laäp vi khuaån E. coli laïi chieám ña soá thì neân laøm khaùng sinh ñoà vi khuaån naøy ñeå traû lôøi

ƒ Caùc vi khuaån khoâng gaây beänh ñöôøng ruoät nhö Proteus, Klebsiella, Pseudomonas... coù theå laø

keát quaû cho laâm saøng.

taùc nhaân gaây tieâu chaûy trong caùc tröôøng hôïp loaïn khuaån do vaäy vaãn neân laøm khaùng sinh ñoà

vaø traû lôøi keát quaû cho laâm saøng neáu chieám ña soá treân hoäp thaïch phaân laäp vaø khoâng coù caùc vi

khuaån gaây beänh khaùc.

37

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Hình 6: Loï laáy phaân töôi coù trang bò Hình 7: Loï laáy phaân khaûo saùt kyù sinh truøng

maùi cheøo gaén treân naép raát thuaän tieän cho beänh nhaân laáy phaân vaø naép vaën chaët traùnh nguy cô ræ phaân ra mieäng loï coù tuùi F2M saün saøng ñeå duøng baûo quaûn phaân khaûo saùt kyù sinh truøng. Vôùi loï naøy chuùng ta coù theå löu maãu hôn 1 tuaàn.

Hình 8: Caëp tube ñuõa taêm boâng voâ truøng/moâi tröôøng chyeân chôû Cary -Blair coù theå giuùp

löu maãu phaân trong 48 giôø

38

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Phaân töôi

Caáy ngay

Coù theå chôø ñeán chieàu

Cary-Blair

Moâi tröôøng phaân laäp 1. MC/EMB 2. SS/HE/XLD 3. (neáu coù yeâu caàu:

Sô ñoà 3: QUI TRÌNH VI SINH LAÂM SAØNG KHAÛO SAÙT MAÃU PHAÂN

D0

UÛ 37oC/6-8h

TCBS, MEA cho Vibrio; Campy-BAP cho C. jejuni)

MT taêng sinh GN broth (peptone kieàm cho Vibrio, hay Campy-thio cho C. jejuni; neáu coù yeâu caàu)

UÛ 37oC/qua ñeâm. (Ñoái vôùi Campy-BAP thì uû vi hieáu khí 42oC vaø tieáp tuïc qui trình cho C. jejuni )

D1

Choïn khuùm VK nghi ngôø • khoâng leân men lactose • khuùm E. coli • khuùm öu theá

Caáy taêng sinh leân BA/NA

UÛ 37oC/töø saùng ñeán chieàu

Khaùng sinh ñoà

Ñònh type, group

Ñònh danh

KQ sô boä: type vaø group VK gaây beänh

D2

KQ chung cuoäc KSÑ

Ñònh danh

39

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Kyõ thuaät phaân laäp Campylobacter jejuni

Laáy maãu

Maãu coù theå laáy töôi göûi ñeán phoøng thí nghieäm ñeå laøm xeùt nghieäm ngay. Neáu ñeå chaäm treã hôn

2 giôø thì maãu phaûi laáy vaøo moâi tröôøng chuyeân chôû/taêng sinh Campy-thio.

Phaân laäp Campylobacter jejuni

oC

Coù theå caáy phaân laäp ngay, hay coù theå giöõ taêng sinh maãu trong Campy - thio ôû tuû aám 42

ƒ Phaân laäp tröïc tieáp: Caáy beänh phaåm baèng phöông phaùp 3 chieàu treân moâi tröôøng Campy –

trong 4 – 6 giôø roài môùi caáy phaân laäp. Coù hai caùch:

BAP, roài uû hoäp thaïch trong moät bình uû kî khí (Genbox-anaer cuûa bio-Meùrieux) duøng bao

sinh vi hieáu khí (Microanaer cuûa bio-Meùrieux). Giöõ bình trong tuû aám 42 oC trong 24 ñeán 48

ƒ Phaân laäp qua loïc: Duøng moät loïc cellulose acetate 0.65 mm voâ truøng ñaët treân maët hoäp thaïch

giôø.

Campy – BAP nhöng khoâng coù khaùng sinh. Duøng pipette Pasteur voâ truøng huùt beänh phaåm

hay dung dòch taêng sinh beänh phaåm, nhoû 5 – 15 gioït leân taâm cuûa giaáy loïc. UÛ ngöõa hoäp

thaïch trong tuû aám 37 oC hay 42 oC trong 1 giôø. Sau ñoù laáy tôø giaáy loïc ra khoûi maët thaïch,

traùnh khoâng cho beänh phaåm nhoû tröïc tieáp leân maët thaïch. UÛ hoäp thaïch naày trong ñieàu kieän

vi hieáu khí nhö treân.

Ñònh danh Campylobacter jejuni

ƒ Sau khi uû, quan saùt maët thaïch. C. jejuni cho khuaån laïc khaù tieâu bieåu: maøu xaùm nhaït hay

xaùm vaøng nhaït, hôi nhaày, ñoâi khi coù ñuoâi theo ñöôøng caáy (hình 10). Kích thöôùc khaù lôùn: 1.5

ƒ Nhuoäm Gram, vi khuaån aên maøu Gram [-], hôi nhoû, hình cong, coù theå thaáy daïng daëc tröng

– 2 mm.

ƒ Soi töôi qua kính hieån vi ñaûo phase hay neàn ñen, thaáy vi khuaån di ñoäng nhö teân baén.

ƒ Thöû nghieäm oxidase [+], catalase [+]

hình caùnh chim haûi aâu. Ñoâi khi coù hình daáu ngaõ (hình 9).

Hoäi ñuû ñöôïc caùc yeáu toá treân laø coù theå ñònh danh Campylobacter jejuni.

40

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Moâi tröôøng caàn thieát ñeå phaân laäp C. jejuni

Dung dòch khaùng sinh 100X

ƒ Coâng thöùc

Vancomycin 100mg

Trimethoprim 50mg

Polymyxin B 25000UI

Amphotericin B 20mg

Cephalothin 150mg

ƒ Voâ truøng qua loïc milipore. Phaân phoái vaøo caùc chai, moãi chai 2ml ñeå cheá 200 ml moâi

Nöôùc caát cho ñeán 100ml

tröôøng. Giöõ caùc chai trong tuû ñoâng –70oC

Moâi tröôøng chuyeân chôû/taêng sinh Campy-thio

ƒ Coâng thöùc

Thioglycolate media 30gr

Bacto agar 1.6gr

ƒ Ñun tan moâi tröôøng vaø agar, ñeå nguoäi, chænh pH ñeán 7.2.

ƒ Phaân vaøo caùc chai Duran loaïi 250ml naép vaën chaët, moãi chai cho vaøo chính xaùc 200ml moâi

Nöôùc caát 1000ml

tröôøng. Haáp khöû truøng 121 oC/15 phuùt. Ñeå nguoäi, theâm vaøo moãi chai 2ml dung dòch khaùng

oC, hay phaân phoái voâ truøng 5ml

sinh 100X ôû treân. Coù theå ñeå nguyeân chai trong tuû laïnh 4

oC

Campy-thio vaøo caùc tube 15 x 125mm voâ truøng naép vaën chaët roài giöõ trong tuû laïnh 4

(khoâng quaù 2 thaùng).

Moâi tröôøng phaân laäp Campy-BAP

ƒ Coâng thöùc

Brucella agar base 43gr

ƒ Ñun tan moâi tröôøng vaø agar, ñeå nguoäi, chænh pH ñeán 7.2.

ƒ Phaân vaøo caùc chai Duran 250ml naép vaën chaët, moãi chai 200ml moâi tröôøng. Khöû truøng baèng

Nöôùc caát 1000ml

haáp öôùt 121oC/15 phuùt. Ñeå nguoäi ñeán 45oC, theâm vaøo moãi chai 10ml maùu cöøu ñaõ maát fibrin

41

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

vaø 2ml dung dòch khaùng sinh 100X ôû treân. Laéc nheï ñeå troän ñeàu, traùnh boït. Ñoå vaø o hoäp

petrie voâ truøng loaïi 90 mm, moãi hoäp ñoå 18 – 20 ml moâi tröôøng. Chôø ñaëc laïi hoaøn toaøn.

Giöõ caùc hoäp thaïch trong tuû laïnh (khoâng quaù 2 thaùng).

Hình 9: Hình aûnh Gram vi khuaån Campylobacter jejuni

Hình 10: Hình aûnh khuùm vi khuaån Campylobacter jejuni treân thaïch Campy-BAP

42