T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
1
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Chitinase - glucanase
KHÁNG NẤM VÀO CÂY CÀ CHUA THÔNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens
Bùi Thị Lan Hương
1
, Nguyễn Thị Trường
4
, Vũ Duy Thanh
2
,
Nguyễn Thị Kim Lý
2
, Nguyễn Đức Doanh
2
, Phan Tố Phượng
2
,
Nguyễn Hồng Minh
3
, Lê Thị Ánh Hồng
2
SUMMARY
Study of antifungal genetransformation on tomato
Tomato is a major vegetable crop that has tremendous popularity over the last century. It is grown
in almost every country of the world. Development of protocols for in vitro selection can provide
new advances for the production of stress tolerant cultivars.
Research objective is to develop transgenic plants from selected Vietnamese tomato cultivars
carrying and expressing a chitinase gene under a constitutive promoter.
The hypothesis is that the transgenic tomato plants expressing this gene will have enhanced
resistance to economically important fungal diseases, which are a problem for warm and humid
climatic conditions.
Research results presented concerning study on the regeneration capacity of tomato varieties
P375 after Agrobacterium mediated transformation. The experimental data show low generation
capacity after transformation in P375 variety in both cotyledon (4,32) and hypocotyls (2,63).
In this result we obtained two tomato lines confirmed the presence of Chitin’s gene with 788 bp.
The primers were used in this investigation are:
CHIF. 5’ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3’;
CHIR.5’GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’
Further testing including tests of the field growth. Plant is necessary to identify individual
transformed lines with resistance.
Keywords: Callus, Cotyledon, Hypocotyls, genotype, ELISA, , Cytokine, Auxin.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Chuyển gen là phương pháp gây biến dị di
truyền có định hướng ở cây trồng (Rosen và
cs., 2003; Veluthambi và cs., 2003; Sung Hun
Park và cs., 2003) đã và đang được áp dụng
rộng rãi trong những năm gần đây. Trong
nghiên cứu tạo ra cây chuyển gen kháng bệnh,
các nhà khoa học đã phát hiện được gen
Chitinase trong cây trồng có khả năng hạn chế
sự phát triển các loại nấm gây bệnh cây như
Fusarium, Botrytis cinerea, Rhizoctonia, hạn
chế sự phát triển của nấm Verticillium dahliae
chủng 1 và 2 (Z.K. Punja, 2001; Schlumbaum,
A. và cs., 1986) và một số bệnh nấm khác. Sự
kết hợp giữa các gen Chitinase và Glucanase
còn tạo ra cây chuyển gen có khả năng kháng
bệnh cao hơn với phổ rộng hơn so với những
cây trồng được chuyển từng gen đơn lẻ
(Jongedyk e và cs., 1995; Zu và cs., 1994;
Lawrence và cs., 2000).
Nội dung trình bày dưới đây là một số
kết quả nghiên cứu bước đầu về chuyển gen
vào giống cà chua P375 thông qua chủng vi
khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA 105
có chứa plasmid pCAMBIA 1300 mang gen
kháng nấm Chitinase (nguồn tách từ đậu
Pysium), được tiến hành tại Phòng Bệnh phân
tử thực vật; Viện Di truyền N ông nghiệp.
Ghi chú:
1
Viện Môi trường %ông nghiệp, Hà %ội,
2
Viện Di truyền %ông nghiệp,
3
Trường Đại học %ông nghiệp Hà %ội,
4
Trường Trung cấp %ông nghiệp, Hà %ội
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
2
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu
- Các giống cà chua P375 được lựa
chọn là giống có khả năng cho tái sinh cao,
đã được kiểm tra bệnh bằng kỹ thuật
ELISA. Các mẫu được sử dụng trong thí
nghiệm này là các bộ phận trụ lá mầm
(hypocotyl) và lá mầm (cotyledone) của các
cây cà chua được nuôi cấy trong in vitro.
- Vector mang gen kháng nấm
Chitinase được cung cấp từ IN RA- Pháp.
Cấu trúc vector:
Hình 1. Cấu trúc vector mang gen kháng nấm Chitinase
- Chủng vi khuNn Agrobacterium
tumefaciens EHA105 có chứa plasmid
pCAMBIA 1300 CHI-GLUC, mang 2 gen
kháng nấm: Chitinase, Glucanase và gen
kháng Hygomicine (hpt). Gen hpt có
promoter 35S, còn gen Chitinase - Glucanase
có promoter A9, cả 2 promoter này đều hoạt
động rất mạnh ở genome thực vật,
- Gen kháng nấm Chitinase được tách
từ Phaseolus vulgaris cv Saxa (nguồn
N CBI-Genbank).
2. Phương pháp nghiên cứu
- N uôi cấy mẫu phục vụ cho biến nạp: Lá
mầm và trụ lá mầm được cắt nhỏ, đặt vào đĩa
petri đã được khử trùng có chứa môi trường
dinh dưỡng MS, thành phần gồm các nguyên
tố đa lượng và vi lượng của MS, vitamins
MS, 20 g/l đường sucrose, 0,6% agar, pH: 5,8
có bổ sung 2 mg/l BA + 0,2 mg/l IAA, đặt
trong phòng tối trong 36, 48 và 60 giờ. Sau
đó mẫu lấy ra dùng vào biến nạp gen.
- Chuyển gen gián tiếp qua
Agrobacterium tumefaciens: Theo quy trình
của Swapan K. Datta và cs., 1997.
- Đánh giá hiệu xuất chuyển gen: Xác
định số mẫu sống sót, số cây tái sinh thu
được, số cây tái sinh được chuyển gen.
- Số liệu thí nghiệm xử lý bằng phương
pháp Duncan's.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. !ghiên cứu khả năng tái sinh của
giống cà chua
Những kết quả nghiên cứu của của
các nhà khoa học (Shahin và cs.,1986;
Chyi và Phillips, 1987; Mc. Cormick,
1991; Van Roekel và cs., 1993; Shen và
cs., 1998; Krasnyanski và cs., 2001) cho
thấy, khả năng tái sinh của cây cà chua
liên quan đến kiểu gen của giống, bộ
phận sử dụng để nuôi cấy, tuổi của cây,
các tổ hợp và nồng độ các chất kích thích
sinh trưởng, điều kiện nuôi cấy v.v...
Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, sự
“đóng, mở” và hoạt hoá gen với một cơ
chế còn chưa rõ hoặc thích hợp, hoặc
không thích hợp sẽ dẫn đến sự tái sinh
cây với tỷ lệ cao hoặc thấp ở các giống
cà chua khác nhau.
Trong thí nghiệm, chúng tôi sử dụng
giống cà chua (P375) có các đặc tính nông
học tốt để đánh giá khả năng tái sinh của
trụ lá mầm và lá mầm, nhằm tìm được bộ
phận có khả năng tái sinh cao làm vật liệu
nuôi cấy chuyển nạp gen kháng nấm gây
bệnh cây (bảng 1).
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
3
Bảng 1. Khả năng tái sinh các mẫu trụ lá mầm và lá mầm của giống P375
(L. esculentum Mill)
Giống cà
chua
Khả năng tạo callus (%) Khả năng tái sinh chồi (%) Khả năng tái sinh/mẫu
Trụ lá mầm Lá mầm Trụ lá mầm Lá mầm Trụ lá mầm Lá mầm
P375 83,3ac 93,3ab 37,7b 78.1 a 4,5c 4,2b
Ghi chú: a, b, c chỉ sự khác nhau không đáng kể. Các giá trị trung bình, độ lệch chuNn được thực hiện theo
chương trình của Ducan với độ tin cậy p ≤ 0,05.
Kết quả cho thấy, trong cùng một môi
trường tái sinh chồi, với mô tế bào từ lá
mầm, giống cà chua P375 cho tỷ lệ tái sinh
chồi đạt 78,1%, trụ lá mầm chỉ đạt 37,7%.
Những kết quả này tương tự với nghiên cứu
của các tác giả McComick et al., 1986;
Zhang et al., 1999; Peres et al., 2001;
Moghaieb et al., 2004; Pravda et al., 2005;
Gorinova et al., 2005. Theo các tác giả trên
thì khả năng này có thể còn phụ thuộc vào
phản ứng của genotype đối với sự nuôi cấy
mô - là kết quả của quá trình đóng mở và
hoạt hoá gen thông qua tác nhân trung gian
là các chất kích thích sinh trưởng như BAP,
NAA và một số yếu tố ngoại cảnh khác.
2. !ghiên cứu chuyển gen kháng bệnh
nấm Chitinase vào cà chua P375
a. Kết quả biến nạp gen Chitinase
Tiến hành biến nạp gen Chitinase có
khả năng kháng nấm gây bệnh cây vào
giống cà chua P375 bằng phương pháp gián
tiếp thông qua vi khuNn Agrobacterium
tumefaciens (theo quy trình của Swapan K.
Datta và cs., 1997). Cắt nhỏ các mẫu cấy để
tạo vết thương, nhiễm vi khuNn vào mẫu.
Quá trình chuyển nạp gen Chitinase vào tế
bào cà chua được thực hiện thông qua vi
khuÈn Agrobacterium tumefaciens được
nhiễm vào các tế bào bị thương đang phân
chia mạnh trong môi trường giàu auxin. Khi
vi khuNn Agrobacterium tumefaciens tiếp
xúc với tế bào bị thương chúng tiết ra chất
transzeatin để giúp quá trình biến nạp trong
tế bào thực vật và quá trình biến nạp gen
được thực hiện. Sau khi biến nạp, mẫu được
chuyển sang môi trường cứng MS1 có bổ
sung đồng thời 2 loại kháng sinh Cefotaxim
và Hygromicin. Cefotaxim nhằm hạn chế sự
phát triển trở lại của vi khuNn, trong đó
kháng sinh Hygromicin là kháng sinh chỉ
thị để chọn lọc các tế bào và các mô đã
được biến nạp.
b. %ghiên cứu khả năng tái sinh của
cây cà chua biến đổi gen
Căn cứ vào tính chất tác động lên các
callus của 2 loại kháng sinh đã được bổ
sung vào môi trường nuôi cấy (250 mg/l
Cefotaxime) và (50 mg/l Hygromicin).
Tiến hành theo dõi khả năng tái sinh cây
của mô tế bào trên môi trường tạo callus
(MS1), sau thời gian nuôi cấy 15 - 20 ngày,
tính kháng với kháng sinh Hygromicin
được bắt đầu biểu hiện. Trên những callus
được biến nạp xuất hiện mầu xanh và phát
triển trên môi trường, ngược lại những
callus không được biến nạp, khả năng phát
triển hầu như bị đình trệ, các tế bào tại bề
mặt tiếp xúc với môi trường đã có xu
hướng đổi mầu, có những mẫu đã đổi sang
mầu thẫm. Hiện tượng này biểu hiện ở các
mô tế bào chưa mang gen ngoại lai hpt,
trên môi trường nuôi cấy chứa
Hygromycin, các mô tế bào bị kháng sinh
này ức chế quá trình sinh tổng hợp protein
làm mất khả năng xanh hóa của mẫu. Ở
các mẫu không thực hiện được sự chuyển
nạp gen, mô phát triển kém, mất khả năng
duy trì màu xanh ban đầu, úa dần đen lại
và bị chết.