TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH
TẠP CHÍ KHOA HỌC
HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF EDUCATION
JOURNAL OF SCIENCE
ISSN:
1859-3100
KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ
Tập 15, Số 6 (2018): 118-129
NATURAL SCIENCES AND TECHNOLOGY
Vol. 15, No. 6 (2018): 118-129
Email: tapchikhoahoc@hcmue.edu.vn; Website: http://tckh.hcmue.edu.vn
118
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA LOÀI GAI MA VƯƠNG
(Tribulus terrestris L.) Ở VÙNG ĐẤT CÁT TỈNH BÌNH THUẬN
Nguyễn Thị Thanh Tâm*, Trần Huỳnh Bảo Nam, Phạm Văn Ngọt
Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh
Ngày nhận bài: 18-4-2018; ngày nhận bài sửa: 05-6-2018; ngày duyệt đăng: 19-6-2018
TÓM TẮT
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao ethanol toàn cây Gai ma vương tại tất cả các nồng độ
khảo sát từ 200 đến 1000 mg/ml đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên cả ba chủng: Bacillus
subtilis, Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa. Hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol thể
hiện mạnh nhất trên chủng B. subtilis. Trong khi đó, nước sắc toàn cây của loài chỉ thể hiện hoạt
tính kháng khuẩn đối với chủng B. subtilis và chỉ với nồng độ cao hơn 40%.
Từ khóa: đặc tính kháng khuẩn, Gai ma vương, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli.
ABSTRACT
Antibacterial activity of Tribulus terrestris L. living on sands of Binh Thuan province
The results of this study showed that ethanol extract of Tribulus terrestris L. at any
concentration from 200 to 1.000 mg/ml possessed an anti-bacterial activity against all three
bacteria including Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, and Escherichia coli. The ethanol
extract was more effective on B. subtilis than the other two strains. However, aqueous extract of
Tribulus terrestris L. showed anti-bacterial activity against B. subtilis only and just at the
concentration of over 40%.
Từ khóa: Antibacterial activity, Tribulus terrestris L., Bacillus subtilis, Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli.
1. Mở đầu
Trong nền y học cổ truyền của nhiều nước châu Á, loài cây Gai ma vương (Tribulus
terrestris L.) được biết đến như một phương thuốc hiệu quả dùng để chữa các bệnh về phổi,
tim mạch; giúp hạ huyết áp, điều hòa miễn dịch, tăng cường hấp thu, kháng viêm, kháng ung
thư. Đặc biệt, loài thực vật này có tác dụng lớn trong việc cải thiện chức năng sinh lí sinh sản
ở nam giới cũng như chữa một số chứng bệnh liên quan đến hệ sinh sản nữ [1].
Do những đặc tính dược liệu quý giá, ngày càng nhiều công trình đã chọn loài Gai
ma vương làm đối tượng nghiên cứu. Tuy nhiên, tại Việt Nam, những nghiên cứu về loài
cây này còn rất ít, thường tập trung vào việc chọn lọc giống để ứng dụng trồng đại trà
nhằm thu hợp chất saponin steroid mà thiếu đi đánh giá về dược tính của loài. Kết quả
* Email: tamntth@hcmup.edu.vn
TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM
Nguyễn Thị Thanh Tâm và tgk
119
nghiên cứu của bài báo “Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của loài Gai ma vương
(Tribulus terrestris L.) ở vùng đất cát tỉnh Bình Thuận” nhằm mục đích đánh giá hoạt tính
kháng vi sinh vật của loài Gai ma vương trên ba chủng vi sinh vật phổ biến, có tỉ lệ kháng
thuốc cao, gây bệnh ngoài da, hô hấp, gây viêm nhiễm mô mềm, gây các bệnh và các
chứng ngộ độc qua đường thực phẩm như: Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, từ đó làm cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn về dược tính của
loài dược liệu quý này [2],[3].
2. Địa điểm, đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Địa điểm thu mẫu
Xã Tiến Thành, thành phố Phan Thiết, tỉnh Bình Thuận.
2.2. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: loài Gai ma vương (Tribulus terrestris L.).
Mẫu dùng để thử hoạt tính kháng khuẩn bao gồm cao ethanol và nước sắc toàn cây.
Những chủng vi sinh vật được dùng để khảo sát tính kháng khuẩn bao gồm:
+ Vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli từ Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí
Minh, lưu trữ ở Phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư
phạm TP Hồ Chí Minh được cấy truyền và thử nghiệm trên môi trường MPA.
+ Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh
học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TPHCM được cấy truyền và thử
nghiệm trên môi trường NA.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu hái, sơ chế, bảo quản mẫu
Mẫu cây được thu đầy đủ các bộ phận và được phơi dưới nắng 1 ngày trước khi cho
vào bao chứa và đem về phòng thí nghiệm.
Tại phòng thí nghiệm, mẫu cây được tách riêng quả và phần còn lại (bao gồm thân,
lá, rễ – gọi chung là phần toàn cây). Phần toàn cây được cắt nhỏ thành các đoạn dài từ 2 –
5 cm, được rửa sạch đất cát và phơi nắng trong 2 – 3 ngày.
Mẫu sau khi phơi nắng được gói bằng giấy báo và được sấy ở nhiệt độ từ 50 đến
60oC cho đến khi khối lượng không đổi. Lúc này, mẫu đạt trạng thái khô hoàn toàn.
Mẫu khi đã khô hoàn toàn được bảo quản trong điều kiện khô thoáng ở phòng thí
nghiệm cho những thử nghiệm tiếp theo.
2.3.2. Phương pháp điều chế cao ethanol
Quy trình tạo cao ethanol được tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Kim Phi
Phụng [4].
Mẫu cây sau khi phơi khô sẽ được đem xay thành bột mịn.
Ngâm 100 g bột cây trong 1000 ml dung dịch ethanol 96o.
Sau 48 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc để loại cặn.
TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM
Tập 15, Số 6 (2018): 118-129
120
Dịch chiết được thu hồi dung môi bằng hệ thống cô quay ở nhiệt độ 50oC và áp suất
175mbar.
Sau khi dịch chiết đã đuổi gần hết dung môi, rót dịch chiết ra một cốc thủy tinh và để
bay hơi tự nhiên.
Khi dung môi đã bay hơi hoàn toàn, ta thu được cao chiết ethanol thô. Cao được bảo
quản trong tối và nhiệt độ thấp (4oC).
Phần bột cây còn lại tiếp tục được ngâm trong dung dịch ethanol 96o với cùng tỉ lệ
như trên. Quá trình chiết lặp lại 3 lần để đảm bảo quá trình diễn ra triệt để [4].
2.3.3. Phương pháp thu nhận nước sắc
Quy trình thu nhận nước sắc được tiến hành theo Hồ Huỳnh Thùy Dương [5].
Ngâm 10 g mẫu khô trong nước cất 10 – 15 phút để rửa mẫu, sau đó bỏ nước ngâm.
Thêm 300 ml nước cất và đun sôi mẫu.
Khi mẫu đã sôi, tiếp tục đun mẫu ở nhiệt độ từ 70 đến 80oC trong 90 phút. Sau đó,
thu lấy nước sắc.
Thêm 200 ml nước cất và đun sôi mẫu lần thứ hai.
Khi mẫu đã sôi, mẫu tiếp tục được đun ở nhiệt độ từ 70 đến 80oC trong 90 phút. Sau
đó thu lấy nước sắc lần thứ hai.
Trộn nước sắc của 2 lần đun lại rồi đem ủ ở nhiệt độ từ 50 đến 60oC để nước bay hơi
sao cho dung dịch nước sắc thu được còn đúng 10 ml.
Dung dịch nước sắc được li tâm ở tốc độ 5000 rpm trong 10 phút để loại cặn.
Nước sắc được thu nhận tương ứng với tỉ lệ 1 g/ml.
Nước sắc sử dụng trong các thử nghiệm được pha loãng đến nồng độ nhất định, sau
đó lọc qua màng lọc vô trùng 0,22 µm và được sử dụng trong ngày [5].
2.3.4. Phương pháp lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào
Để so sánh hoạt tính kháng khuẩn của mẫu thử trên những chủng vi sinh vật khác
nhau, mỗi chủng vi sinh vật cần được sử dụng ở cùng một mật độ tế bào tương đương
5.106 CFU/ml. Do đó, trước khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, mỗi loại vi khuẩn cần
được xác định giá trị OD tại bước sóng 610 nm tương ứng với nồng độ vi khuẩn 5.106
CFU/ml. Để xác định được giá trị OD này, ta cần xây dựng đường hồi quy tuyến tính giữa
độ đục và mật độ tế bào theo quy trình sau:
Pha loãng một huyền phù chứa chủng vi sinh vật cần kiểm nghiệm có mật độ bất kì
thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD 610nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2;
0,3; 0,4; 0,5. Đo OD 610nm của các huyền phù vừa pha, ghi nhận số đo thực tế.
Dùng phương pháp đếm khuẩn lạc, xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này.
Tính giá trị log(N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi độ đục. Xác
định phương trình hồi quy tuyến tính giữa log(N/ml) và OD 610nm [6].
Dựa trên phương trình hồi quy tuyến tính giữa mật độ tế bào và giá trị OD 610nm, ta
xác định được giá trị OD 610nm tương ứng với mật độ tế bào đạt 5.106 CFU/ml.
TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM
Nguyễn Thị Thanh Tâm và tgk
121
2.3.5. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn
Cao ethanol được hòa tan trong dung dịch ethanol 70o với nồng độ 1000 mg/ml. Tiếp
tục dùng dung dịch trên pha loãng ra các nồng độ 800 mg/ml, 600 mg/ml, 400 mg/ml, 200
mg/ml. Chứng âm dùng cho thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn của cao chiết
ethanol là dung dịch ethanol 35o tương ứng với nồng độ 0 mg/ml. Chứng dương là đĩa giấy
kháng sinh đồ tẩm Streptomycin 10 µg (đối với vi khuẩn Gram dương: B. subtilis) hoặc
Tetracyclin 30 µg (đối với vi khuẩn Gram âm: E.coli và P. aeruginosa). Mỗi nghiệm thức
được lặp lại 3 lần.
Nước sắc toàn cây Gai ma vương được cô đặc về nồng độ 1 g/ml tương ứng với nồng
độ 100% sau đó được pha loãng thành các nồng độ 80%, 60%, 40%, 20%. Chứng âm dùng
cho thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn của nước sắc toàn cây là nước cất vô trùng
tương ứng với nồng độ 0%. Chứng dương là đĩa giấy kháng sinh đồ tẩm Streptomycin
10µg (đối với vi khuẩn Gram dương: B. subtilis) hoặc Tetracyclin 30 µg (đối với vi khuẩn
Gram âm: E.coli và P. aeruginosa). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Vi khuẩn được lấy ra từ ống nghiệm giống sau đó hòa tan vào trong nước cất vô
trùng tạo thành dịch huyền phù. Dịch huyền phù được pha loãng tới giá trị OD 610nm
tương ứng với mật độ tế bào 5.106 CFU/ml.
Rút 0,02 ml dịch huyền phù vi khuẩn cho vào mỗi đĩa Petri đã có môi trường nuôi
cấy thích hợp (tương ứng 100.000 tế bào vi khuẩn trong 1 đĩa Petri). Dịch huyền phù được
trang đều trên bề mặt thạch đến khi bề mặt trở nên không còn dính ướt. Sau đó, một giếng
có đường kính d = 6 mm được khoan trên lớp thạch. Mỗi giếng được nhỏ 0,1 ml dung dịch
thuốc thử ở các nồng độ khác nhau.
Đĩa Petri sau khi đã được nhỏ thuốc thử được gói giấy báo và giữ lạnh ở 4oC từ 4 – 8
giờ để thuốc thử được khuếch tán vào lớp thạch. Sau đó, đĩa Petri được đặt ở nhiệt độ
phòng từ 8 – 12 giờ [7].
Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng việc có hay không có vòng vô khuẩn quanh các
giếng. Nếu có vòng vô khuẩn, đường kính vòng vô khuẩn được tính bằng cách lấy đường
kính vòng vô khuẩn (D) có thể đo được trên đĩa Petri trừ đi đường kính của giếng (d).
Hoạt tính kháng khuẩn của mẫu thử tại các nồng độ được đánh giá bằng đường kính
vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn trong Bảng 1 cũng như so sánh với đường kính vòng vô
khuẩn ở đối chứng dương.
Bảng 1. Bảng đánh giá hoạt tính kháng khuẩn dựa trên giá trị đường kính vòng vô khuẩn
Đường kính vòng vô khuẩn
≥ 15 mm
10 – 14 mm
≤ 9 mm
Không cho vòng vô khuẩn
TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM
Tập 15, Số 6 (2018): 118-129
122
2.3.6. Phương pháp xử lí số liệu
Phần mềm Microsoft Excel 2013 được sử dụng để xây dựng phương trình hồi quy
tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào vi khuẩn. Phương trình hồi quy được chấp nhận
khi P value < 0,05 và hệ số tương quan R2 > 90%.
Phần mềm Statistical Package for the Social Sciences 20 được sử dụng để tính giá trị
trung bình và độ lệch chuẩn đường kính vòng vô khuẩn ở các nghiệm thức cũng như so
sánh giá trị trung bình đường kính vòng vô khuẩn giữa các nồng độ mẫu thử và giữa các
chủng vi khuẩn bằng hàm ANOVA một yếu tố ở độ tin cậy 95%.
3. Kết quả nghiên cứu
3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol toàn cây Gai ma vương
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol toàn cây Gai ma vương ở
các nồng độ từ 0 đến 1.000 mg/ml được thể hiện qua Bảng 2 và Hình 1.
Bảng 2. Giá trị đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết ethanol toàn cây Gai ma vương
ở các nồng độ trên 3 chủng vi sinh vật thử nghiệm
Nồng độ cao ethanol
(mg/ml)
Giá trị đường kính vòng vô khuẩn (mm)
B. subtilis
E. coli
P. aeruginosa
1.000
22,556 0,509e3
19,667 0,882e2
11,889 0,509c1
800
19,667 0,334d2
18,889 0,839e2
10,111 0,192b1
600
17,778 1,018c2
16,222 0,839d2
10,111 1,071b1
400
14,222 1,072b2
12,333 1,202c2
6,111 0,509a1
200
11,000 0,882a3
7,667 0,882b2
5,556 0,193a1
0
-
-
-
Streptomycin 10 µg
9,867 0,897a
Tetracyclin 30 µg
2,567 0,636a1
11,444 0,096c2
(-): không xuất hiện vòng vô khuẩn
a, b, c, d, e: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo hàng dọc
1, 2, 3: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo hàng ngang
Cao ethanol toàn cây Gai ma vương có hoạt tính kháng cả 3 chủng vi sinh vật thử
nghiệm ở tất cả các nồng độ từ 200 đến 1000 mg/ml. Đối với chủng B. subtilis, có sự khác
nhau có ý nghĩa thống kê về đường kính vòng vô khuẩn giữa các nồng độ mẫu thử. Trong
khi đó, đối với E. coli, đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết ở nồng độ 1000 và
800mg/ml không có sự khác biệt. Đối với P. aeruginosa, đường kính vòng vô khuẩn của
các cặp nồng độ cao ethanol 800 và 600 mg/ml, 400 và 200 mg/ml cũng không có sự khác
biệt có ý nghĩa thống kê.