1
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh Liên, Phòng Công Nghệ
Tế Bào Thực Vật, Viên Công Nghệ Sinh Học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo,
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, ThS. Phạm Thị Vân
cùng tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật,
Viện Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ và truyền đạt
nhiều kinh nghiệm làm việc quý báu trong suôt quá trình hoàn thành khóa
luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện
Đại Học Mở Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho em
học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè nhứng
người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập
và thực hiện khóa luận.
Hà Nội, tháng 05 năm 2011
Sinh viên
Nguyễn Thị Thu Hiền
2
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN Deoxyribonucleic Acid
ARN Ribonucleic Acid
Bp Base pair
dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate
LB Luria and Bertani
PCR Polymerase Chain Reaction
Taq Thermus aquaticus
IAA Indolaxetic Acid
NAA α- naphthalenneacetic Acid
PVY Ptato virus
TMV Tobacco Mosaic virus
CMV Cucumber Mosaic virus
MS Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog
BAP 6- benzenladenine
Gus Gen mã hóa enzyme β-glucuronidase
RM Môi trƣờng ra rễ
RNAi RNA interfence
X-gluc 5-bromo-4- chloro-3- indolyl glucuronide
EDTA Ethylene Diamine tetra- acetate Acid
3
MỞ ĐẦU
Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế vừa là cây mô
hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng. Vì vậy,
thuốc lá là một trong những đối tƣợng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đặc biệt là làm đối tƣợng chuyển gen.
Khảm lá bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá, bệnh khảm lá gây thiệt hại
nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng thuốc lá, nhất lá đối với thuốc lá
sợi vàng. Bệnh khảm thuốc lá do hai loại virus TMV (Tobacco mosaic virus)
và CMV (Cucumber mosaic virus) gây ra. Trong đó, TMV loại virus có phổ
ký chủ rất rộng có tới 230 loài thuộc 32 họ và là một trong virus gây hại trên
thực vật đƣợc mô tả sớm nhất ở nƣớc ta.
Những phƣơng pháp thông dụng để khắc phục bệnh khảm lá nhƣ sử dụng
giống kháng bệnh, giống sạch bệnh và các biện pháp canh tác( trồng luận
canh cây thuốc lá với cây lúa, vệ sinh đồng ruộng...). Tuy nhiên, những biện
pháp này không những chỉ có tác dụng làm giảm bớt sự lây lan và phát triển
của bệnh, chủ yếu chỉ manh tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh
này mà còn đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và ảnh hƣởng xấu tới môi
trƣờng.
Hiện nay, nhờ những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền mà ngƣời ta đã tạo
ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách
đƣa gen mã hóa protein vỏ (coat protein gene) của virus vào genome của thực
vật.
Xuất phát từ cơ sở thực tiễn trên, giống thuốc lá C9-1 đã đƣợc lựa chọn cho
nghiên cứu “ Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm
tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá” với các nội dung và mục
đích nghiên cứu: (1) Chuẩn hóa phƣơng pháp chuyển gen vào giống thuốc lá
C9-1 thông qua cấu trúc mang chỉ thị gus; (2) Tạo cây thuốc lá chuyển gen
mang cấu trúc TMV-RNAi; (3) Bƣớc đầu phân tích cây chuyển gen bằng
phƣơng pháp PCR
4
Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ
1.1.1. Phân loại
Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotinana.sp thuộc ngành hạt kín
Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotylndones, phân lớp Asteridae, bộ hoa mõm sói
Scrophulariales, họ cà Solanaceae, chi Nicotiana. Trong chi Nicotiana có 50-
70 loài, đa số là dạng cỏ, một số dạng thân đứng, hầu hết là các dạng dại phụ.
Căn cƣ va o hi nh tha i, màu sắc của hoa ngƣời ta phân chia thành 4 loại chính:
- Loài Nicotiana tabacum L.: có hoa màu hồng hay đỏ tƣơi . Đây la loa i
phô biê n nhâ t chiê m 90% diê n ti ch thuô c la trên thê giơ i.
- Loài Nicotiana rustica L.: có hoa màu vàng, chiê m 10% diê n ti ch thuô c
lá trên thế giới.
- Loài Nicotiana petunioide L.: có hoa màu trắng , phơ t hô ng hay ti m .
Thƣơ ng chi co trong vƣơ n thƣ c vâ t phu c vu nguô n dƣ trƣ gen cho lai
tạo, ít đƣợc dng trong sản xuất.
- Loài Nicotiana polidiede L. : có hoa màu trắng. Loài này cng ít đƣợc
dng trong sản xuất, chủ yếu chỉ có trong vƣờn thực vật học của một số
quô c gia.
5
Hình 1.1: Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.)
Trên thế giới cây thuốc lá đƣợc trồng chủ yếu ở Châu Á với diện tích
canh tác khoảng 2.500.000ha, Châu Mĩ là 1.600.000ha và Châu Phi
khoảng 326.000ha với nhiều loại thuốc lá khác nhau trong đó giống thuốc
lá sợi vàng phổ biến nhất.Vùng trồng thuốc lá cho chất lƣợng cao tập trung
chủ yếu ở một số bang của nƣớc Mĩ, Cu Ba, Ấn Độ.Tại Việt Namcây
thuốc lá đƣợc canh tác từ Bắc chí Nam, chủ yếu ở các tỉnh sau: Cao Bằng
và Lạng Sơn (khu vực phía Bắc), Đà Nẵng, Gia Lai và Dak Lak (khu vực
miền Trung), Ninh Thuận (khu vực Tây nguyên) và Tây Ninh (khu vực
phía Nam).
1.1.2. Giá trị của cây thuốc lá
Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là loại cây công nghiệp ngắn ngày có
tầm quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trƣờng thế giới không chỉ đối với
trên 33 triệu nông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công
nghiệp - từ các nhà máy chế biến, cuốn điếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu đến cả
hệ thống phân phối tiêu thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tƣ