Điều tra, nghiên cứu một số thực vật Việt Nam có
tác dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường trong máu
để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đường type 2
Hà Thị Bích Ngọc
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Khoa Sinh học
Luận án Tiến sĩ ngành: Hóa sinh học; Mã số: 62 42 30 15
Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Văn Mùi, TS. Phạm Thị Hồng Minh
Năm bảo vệ: 2012
Abstract. Thu thập 24 mẫu thực vật ở Việt Nam được tham khảo là có khả năng trong hỗ
trợ điều trị bệnh đái tháo đường (ĐTĐ). Tách chiết thu cao nước nóng và cao cồn, thử
nghiệm khả năng hạ đường huyết trên chuột nhắt ĐTĐ type 2. Chiết phân đoạn cao nước
nóng lá vối và lá chè đắng bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần và nghiên cứu khả
năng hạ đường huyết của các phân đoạn đó trên chuột nhắt ĐTĐ type 2. Xác định thành
phần hóa học của cao chiết phân đoạn có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất. Thử nghiệm
khả năng ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết phân đoạn và các chất tinh sạch được.
Nghiên cứu bào chế chế phẩm, khả năng hạ đường huyết, xác định độ an toàn về chỉ tiêu vi
sinh vật, độc tính cấp cũng như hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của chế phẩm sinh
học.
Keywords. Hóa sinh học; Thuốc chữa bệnh; Đái tháo đường; Bệnh nhân; Thực vật
Content
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Đã từ lâu con người biết rằng đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh rối loạn chuyển hóa, nhưng
những biến chứng mà nó gây ra thì gần đây mới được làm sáng tỏ. Từ những năm 90 của thế kỷ 20,
các chuyên gia y tế đã dự báo “Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh rối loạn chuyển hoá”. Bệnh ĐTĐ
có thể gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm và là nguyên nhân hàng đầu gây nhồi máu cơ tim, đột
quỵ, suy thận giai đoạn cuối và mù lòa… làm tăng tỷ lệ tử vong lên gấp 2-4 lần so với người không
bị ĐTĐ.
Việc sử dụng các thực phẩm bổ sung có nguồn gốc từ thực vật cho các bệnh nhân ĐTĐ sẽ có tác
dụng phối hợp với việc điều trị bằng thuốc. Việt Nam ta sở hữu nguồn tài nguyên thực vật nói chung, tài
nguyên thực vật chứa các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học nói riêng rất đa dạng. Đây là nguồn
dược liệu quí, tiềm năng, có giá trị kinh tế và xã hội rất lớn lao. Ngày nay, với sự phát triển của các
ngành sinh học, hóa học các hợp chất tự nhiên và dược học, hàng chục ngàn hoạt chất có trong cây cỏ
đã được phát hiện, nghiên cứu, chế biến và làm thuốc chữa bệnh. Do đó việc điều tra, nghiên cứu để
phát hiện, khai thác, sử dụng có hiệu quả cũng như bảo tồn, phát triển bền vững nguồn tài nguyên
thực vật chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học là nhiệm vụ lớn đã và đang đặt ra trước chúng ta.
Xuất phát từ những yêu cầu và thực tế trên đây, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Điều
tra, nghiên cứu một số thực vật Việt Nam có tác dụng hỗ trợ điều hoà lượng đường trong máu để
ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đường type 2”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Điều tra, sàng lọc một số thực vật Việt Nam có tác dụng hạ đường huyết trên chuột nhắt đái tháo
đường type 2.
- Xác định các cao chiết phân đoạn của một số thực vật có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất.
- Xác định thành phần hóa học của các phân đoạn có tác dụng hạ đường huyết, tinh sạch các chất và
làm sáng tỏ cơ chế hạ đường huyết của chúng.
- Bào chế chế phẩm có nguồn gốc từ các thực vật đã được sàng lọc, nghiên cứu khả năng và cơ chế hạ
đường huyết, xác định độc tính cấp của chế phẩm.
3. Nội dung nghiên cứu
- Thu thập 24 mẫu thực vật ở Việt Nam được tham khảo là có khả năng trong hỗ trợ điều trị bệnh
ĐTĐ. Tách chiết thu cao nước nóng và cao cồn, thử nghiệm khả năng hạ đường huyết trên chuột nhắt
ĐTĐ type 2.
- Chiết phân đoạn cao nước nóng lá vối và lá chè đắng bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần và
nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của các phân đoạn đó trên chuột nhắt ĐTĐ type 2.
- Xác định thành phần hóa học của cao chiết phân đoạn có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất.
- Thử nghiệm khả năng ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết phân đoạn và các chất tinh sạch
được. Nghiên cứu bào chế chế phẩm, khả năng hạ đường huyết, xác định độ an toàn về chỉ tiêu vi sinh
vật, độc tính cấp cũng như hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của chế phẩm sinh học.
4. Những đóng góp mới của luận án
Đã có đóng góp mới trong nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của lá cây vối Cleistocalyx
operculatus (Roxb.) Merr.& Perry, trước đây các nghiên cứu chỉ quan tâm đến nụ vối. Là kết quả
đầu tiên tại Việt Nam xác định được khả năng hạ đường huyết của cây chó đẻ răng cưa Phyllanthus
urinaria L., tầm gửi trên cây mít Macrosolen cochinchinensis (Lour.) Blume, củ chuối hột Musa
balbisiana Colla, vỏ thân ổi Psidium guajava L., lá chè đắng Ilex kaushue S.Y.Hu trên chuột nhắt
ĐTĐ type 2.
Đã xác định được khả năng ức chế enzym α-glucosidase của 4/7 hợp chất tinh sạch được từ lá vối
gồm: 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcon (H6), 3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic
acid (C3), triterpenoid khung olean 3-hydroxy-olean-12(13)-en-28-oic acid (LVE2), 2,3β,23-
trihydroxy-urs-12en-28-oic acid (LVE4) và 01 hợp chất tinh sạch từ lá chè đắng là 24 methyl (3-
hydroxy-lup-20(29)-en-24-oic acid) ester (H4). Khả năng ức chế enzym α-glucosidase được xác
định là một trong những cơ chế gây hạ đường huyết nhằm ứng dụng bào chế thuốc điều trị ĐTĐ.
Đã bào chế chế phẩm Thivoda với thành phần từ lá vối, lá chè đắng, nụ vối, chó đẻ răng cưa, dây
thìa canh. Chế phẩm được xác định có khả năng hạ đường huyết trên chuột nhắt ĐTĐ type 2, đảm
bảo chỉ tiêu vi sinh vật, không xác định được liều gây độc, có hoạt tính ức chế α-glucosidase. Là cơ
sở tiến tới nghiên cứu sử dụng các nguyên liệu thực vật cũng như chế phẩm Thivoda hỗ trợ cho
bệnh nhân ĐTĐ type 2.
5. Bố cục luận án
Luận án bao gồm 125 trang, trong đó có 26 bảng và 36 hình. Mở đầu: 3 trang. Chương 1-Tổng
quan tài liệu: 31 trang. Chương 2- Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: 22 trang. Chương 3-
Kết quả và thảo luận: 54 trang. Kết luận và kiến nghị: 3 trang. Các công trình khoa học của tác giả
liên quan đến luận án (5 công trình): 1 trang. Tài liệu tham khảo: 11 trang, 36 tài liệu tiếng Việt, 90
tài liệu tiếng Anh. Phụ lục: 110 trang gồm 13 phụ lục chi tiết.
Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG
Khái niệm bệnh ĐTĐ. .. Phân loại bệnh ĐTĐ: gồm ĐTĐ type 1, ĐTĐ type 2, ĐTĐ thai kỳ
và các tình trạng tăng đường huyết đặc biệt khác.
Bệnh ĐTĐ type 2 và tính kháng insulin: nêu được cơ chế tác dụng của insulin và tính kháng
insulin.
Biến chứng bệnh đái tháo đường: nêu được hai loại biến chứng: biến chứng cấp tính hôn mê
tăng đường máu và biến chứng mạn tính.
Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và tại Việt Nam.
1.2. SỬ DỤNG THUỐC VÀ THẢO DƢỢC TRONG ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƢỜNG
Tổng quan về sử dụng thuốc trong điều trị ĐTĐ.
Nghiên cứu điều trị ĐTĐ bằng thảo dược trên thế giới
Nghiên cứu điều trị ĐTĐ từ nguồn thực vật tại Việt Nam.
1.3. HOẠT CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THỰC VẬT CÓ KHẢ NĂNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT DO
ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE
Giới thiệu về cơ chế tác dụng của chất gây ức chế enzym α-glucosidase và tổng quan các dịch
chiết thực vật, hoạt chất sinh học có khả năng ức chế α-glucosidase.
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu
- Nguyên liệu: sử dụng 24 đối tượng thực vật được thu hái theo mùa, tương ứng với từng bộ
phận thu hái mà thời điểm thu hái khác nhau, lúc ra hoa, kết trái, phát triển sinh dưỡng như lá,
thân… , một số mẫu được mua tại các địa phương.
- Đối tượng động vật: chuột nhắt trắng đực dòng Swiss, trọng lượng từ 18–22g, được cung cấp
bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
- Hóa chất: Tất cả các hóa chất đều đảm bảo độ tin cậy cho thí nghiệm, của các hãng Merck,
Sigma, Wako, Crystal Chem Inc…
- Thiết bị: máy cất quay chân không, bình chiết phân đoạn, hệ thống phân tích ELISA, máy đo
quang phổ, cân phân tích, máy li tâm lạnh, máy đo điểm chảy, cột sắc ký, máy đo phổ cộng hưởng
từ hạt nhân, máy đo pH, máy đo đường huyết, tủ lạnh sâu, tủ sấy…
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp chiết xuất
2.2.1.1. Xử lý mẫu
2.2.1.2. Chiết mẫu bằng nước nóng
2.2.1.3. Chiết mẫu bằng cồn 600
2.2.1.4. Chiết thu phân đoạn trong các dung môi có độ phân cực tăng dần
Từ cao nước tổng số (CNN) chiết bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane,
ethylacetate, n-buthanol, dịch chiết tương ứng được cô quay thu hồi dung môi và cao chiết phân đoạn:
cao chiết n-hexane-CHe, ethylacetate-CEtA, n-buthanol-CBuOH, nước cuối còn lại: CNC.
2.2.2. Phƣơng pháp gây chuột nhắt ĐTĐ type 2
2.2.2.1. Nuôi chuột nhắt béo bằng chế độ ăn giàu chất béo
2.2.2.2. Gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 thực nghiệm
2.2.2.3. Định lượng đường huyết
2.2.2.4. Nghiệm pháp dung nạp glucose
2.2.2.5. Định lượng insulin máu chuột nhắt bằng kỹ thuật ELISA
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột nhắt ĐTĐ type 2 của: cao thô 24 mẫu
thực vật, cao chiết phân đoạn lá vối, lá chè đắng và chế phẩm Thivoda.
2.2.4. Xác định chỉ số hóa sinh: GOT, GPT, cholesterol, triglyceride
2.2.5. Xác định khả năng ức chế enzym α-glucosidase
2.2.6. Xác định thành phần hóa học một số mẫu thực vật
2.2.6.1. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học trong một số cao thô thực vật
2.2.6.2. Phương pháp phân lập các chất
2.2.6.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
2.2.7. Bào chế chế phẩm Thivoda
2.2.8. Xác định độc tính cấp của chế phẩm Thivoda
2.2.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CHIẾT XUẤT BẰNG NƢỚC NÓNG VÀ CỒN 600 CÁC MẪU THỰC VẬT
Qua tham khảo các tài liệu, kinh nghiệm dân gian và thực tế của các bệnh nhân ĐTĐ type 2,
chúng tôi đã lựa chọn và thu thập 24 mẫu thực vật được dự đoán có khả năng hạ đường huyết. Điều
tra các thực vật với tính kế thừa và phát huy, chúng tôi mong muốn làm phong phú thêm về khả
năng hạ đường huyết của các thực vật và xác định cơ chế tác dụng của các hoạt chất, từ đó sàng lọc
các thực vật có tác dụng hạ đường huyết nhằm hỗ trợ cho bệnh nhân ĐTĐ.
Sau khi xử lý mẫu, hiệu suất thu mẫu khô dao động từ 9% đến 16,25%. Sau đó chiết xuất mẫu
khô bằng nước nóng và cồn 600, phần trăm tách chiết thu cao thô bằng nước nóng cao hơn so với
cồn. Một số cao nước có hiệu suất tách chiết trên 30% như: lá chè đắng (31,4%), củ chuối hột
(36,2%), thân và lá cỏ nhọ nồi (32,9%), lá dây thìa canh (40%), thân và lá lược vàng (32,4%), thân
và lá mã đề (37,6%), quả nhàu (34%), lá tía tô (32,9%), lá tầm gửi trên cây mít (30,8%). Các cao
cồn có phần trăm tách chiết khá cao, bao gồm: củ chuối hột (18,9%), hoa actisô (16%), lá dây thìa
canh (30%), lá tầm gửi trên cây mít (14,6%)…
3.2. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐIỀU HÒA ĐƢỜNG HUYẾT CỦA DỊCH CHIẾT THỰC
VẬT TRÊN CHUỘT NHẮT ĐTĐ TYPE 2
3.2.1.Gây chuột nhắt ĐTĐ type 2
3.2.1.1. Kết quả nuôi chuột nhắt béo
Chuột nhóm I cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (ND) và nhóm II cho ăn thức ăn giàu chất béo (HFD).
Nhận thấy, chuột nhóm HFD ở tuần thứ 8 có trọng lượng trung bình là 60,28±4,06g đã tăng lên gấp
gần 4 lần so với thời điểm trước khi cho ăn béo (15,45±0,57g) và tăng gần gấp đôi so với nhóm ND
cùng thời điểm (35,01±3,03g). Trong khi ở nhóm ND, ở tuần thứ 8 trọng lượng trung bình chuột là
0
5
10
15
20
25
Nồng độ đường huyết
(mmol/l)
0h 48h 72h 7 ngày 10 ngày 14 ngày
Thời gian
HFD+STZ
HFD+ đệm
ND+STZ
ND+đệm
1.42
0.62
0.78
0.57
1.80
0.20
0.60
0.52
1.00
0.57
0.60
0.15
1.22
1.38
1.10
0.20
1.00
0.58
1.00
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
con chuột
nồng độ insulin (ng/ml)
35,01±3,03g, tăng gần 2 lần so với thời điểm ban đầu. Hình 3.2 là ảnh hai con chuột nuôi béo
(HFD) và nuôi bình thường (ND).
Xác định các chỉ số mỡ máu: cholesterol toàn phần, triglyceride, HDLc, LDLc. Chỉ số
triglyceride ở 5 cá thể nhóm HFD tăng đáng kể (tăng 139,31%) và có ý nghĩa so với 5 cá thể nhóm
ND (p<0,001). Tương tự như vậy, chỉ số cholesterol ở 5 cá thể thuộc nhóm HFD cao hơn so với
nhóm ND (hơn 30,3%) và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, p<0,05. Hai chỉ số HDLc và LDLc tuy
có sự khác biệt nhưng là hoàn toàn ngẫu nhiên, không có ý nghĩa thống kê.
3.2.1.2. Định lượng đường huyết và insulin của chuột nhắt béo sau tiêm màng bụng STZ
Chúng tôi đã ứng dụng mô hình của Sawant và tập thể, nhóm chuột HFD tiêm màng bụng (tmb)
STZ liều 120mg/kg (HFD+STZ) được so sánh với ba nhóm HFD tmb đệm (HFD+đệm), ND tmb
STZ (ND+STZ), ND tmb đệm (ND+đệm). Kết quả định lượng đường huyết của các nhóm chuột thể
hiện trên Hình 3.3. Nồng độ đường huyết nhóm ND+STZ tăng dần đến 18,89±0,04 mmol/l tại 72
giờ, sau đó lại giảm dần sau 7 ngày, 10 ngày, 14 ngày lần lượt là:13,59±0,59, 8,65±0,57, 8,84±0,4
mmol/l. Với nhóm HFD+STZ nồng độ đường huyết tại các thời điểm này rất cao, tương ứng là:
22,53±1,12, 23,24±2,29, 22,96±2,47, 23,2±1,86 mmol/l, sự tăng đường huyết ở nhóm này được duy
trì khá ổn định, (p<0,001).
Các con chuột HFD+STZ có nông đô
đương huyêt cao (trên 18 mmol/l) được định lượng
insulin (Hình 3.5). Với những con có nông đô
insulin năm trong khoang 0,5 - 2 ng/ml là chuột ĐTĐ
type 2. Kết quả chúng tôi đã gây được 17/20 con chuô
t ĐTĐ type 2, hiê
u suất đa
t 85%.
Hình 3.2. Chuột nuôi HFD (bên trái) và chuột nuôi ND (bên phải)
Hình 3.3. Nồng độ đƣờng huyết của các lô
chuột thí nghiệm
tại các thời điểm
Hình 3.5. Định lƣợng nồng độ insulin máu
chuột
HFD + STZ