Nghiên cứu tính đa hình đoạn gen mã hóa carboxylesterase EstV của một số chủng Helicobacter pylori phân lập tại Việt Nam

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 117­122<br /> Nghiên cứu tính đa hình đoạn gen mã hóa carboxylesterase EstV<br />  DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH ĐOẠN GEN MàHÓA CARBOXYLESTERASE <br /> EstV CỦA MỘT SỐ CHỦNG Helicobacter pylori PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM<br /> <br /> Nguyễn Mai Khánh1, Phạm Thị Vinh Hoa2, Võ Thị Phương1, Phạm Bảo Yên1*<br /> 1<br /> Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, *cinaus@gmail.com<br /> 2<br /> Trường Đại học Y tế công cộng<br /> <br /> TÓM TẮT:  Các nghiên cứu gần đây cho thấy lipase đóng vai trò quan trọng trong việc thủy  <br /> phân lipid màng nhầy dạ dày, giúp vi khuẩn Helicobacter pylori dễ dàng bám dính và xâm nhập <br /> dạ dày, gây ra các bệnh dạ dày như viêm loét, ung thư. Lipase gồm phân họ lipase (EC 3.1.1.3),  <br /> đối tượng của nhiều nghiên cứu, và carboxylesterase (EC 3.1.1.1), đặc biệt là phân lớp V, có rất  <br /> ít thông tin. Nhằm nghiên cứu tính đa hình  ở  cấp độ  phân tử  đông th<br /> ̀ ơi phát hi<br /> ̀ ện các điểm sai  <br /> khác có khả  năng làm phát sinh tính kháng thuốc diệt khuẩn trong trình tự  gen mã hóa enzyme <br /> này, cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại đoạn gen kích thước xấp xỉ 750 bp với chu  <br /> trình nhiệt đã tối ưu trên 26 mẫu ADN được tách chiết từ các chủng H. pylori phân lập tại Việt <br /> Nam. Kết quả  điện di cho thấy sản phẩm PCR có kích thước dự  kiến, không xuất hiện băng  <br /> phụ, tiếp tục được gửi đọc trình tự và so sánh với chủng tham chiếu  H. pylori 26695. Phân tích <br /> tính đa hình chỉ  ra duy nhất một chủng có tính tương đồng cao (hơn 98% trình tự  amino acid  <br /> chuyển đổi giống trình tự  công bố); các trình tự  còn lại có sự  khác biệt đáng kể  với trình tự <br /> tham chiếu này. Cụ thể, 14/26 chủng có trình tự khác biệt trên 3% (dựa trên ngưỡng tương đồng  <br /> về chuỗi polypeptide là 97%). Đặc biệt, một số chủng thể hiện tính đa hình trong vùng trình tự <br /> bảo thủ, có thể  dẫn tới thay đổi lớn trong hoạt tính enzym cũng như  khả  năng sống của vi  <br /> khuẩn. Sắp tới, các thí nghiệm sẽ được tiến hành nhằm nhân dòng gen mã hóa EstV, biểu hiện  <br /> enzym tái tổ hợp, và xác định ý nghĩa của các điểm đa hình này. <br /> Từ khóa: Helicobacter pylori, lipase, đa hình, EstV, nhân dòng.<br /> <br /> MỞ ĐẦU tham gia vào quá trình sinh trưởng và xâm nhâp ̣  <br /> ́ ̀ ̣<br /> tê bao vât chu c ̉ ủa H. pylori. Những protein này <br /> Vi khuẩn  Helicobacter pylori  là một trong <br /> có thể được sử dụng như là đích tác động của <br /> các nguyên nhân chinh gây b<br /> ́ ệnh viêm loét dạ <br /> các   loại   thuốc   điều   trị   tiềm   năng.  Lần   đầu <br /> ́ ̉ ̉<br /> dày co kha năng phat triên thanh ung th<br /> ́ ̀ ư. Năm  <br /> tiên, Slomiany et al. (1989) [15, 16] đã nghiên <br /> 1983,   Marshall   và   Warren   lần  đầu  tiên   phân <br /> cứu  đặc  tính  phân hủy  lipid  và   phospholipid <br /> lập được Helicobacter pylori, trươc đây đ́ ược <br /> màng nhầy dạ  dày của lipase, đồng thời cũng <br /> gọi là Campylobacter pyloridis . Vi khuẩn này <br /> nghiên cứu sự   ức chế  hoạt động của enzyme <br /> thường  tồn tại suôt đ ́ ời trong  dịch niêm mạc <br /> này  bởi   hợp  chất   chống  viêm   loét   subcitrate <br /> dạ dày của bệnh nhân nêú  không được điều trị <br /> bismuth và sofalcone. Nhiều nghiên cứu về tác <br /> bằng  kháng sinh thích hợp  .  Theo nhưng báo ̃  <br /> động ức chế hoạt động enzyme của sucralfate,  <br /> cáo gần đây, khoảng một nửa dân số thế giới <br /> ranitidine   bismuth   citrate,   và   các   tác   nhân <br /> bị  nhiễm  H. pylori  và  ở  các nước đang phát <br /> chống loét khác  [8, 11, 12, 17, 18] cho thấy  <br /> triển  trong đó có  Việt Nam,  tỷ  lệ  này  lên tới <br /> lipase giữ  vai trò quan trọng trong phát triển <br /> 70% [9, 10].<br /> viêm loét. Gần đây, nhóm nghiên cứu dẫn đầu <br /> Trình tự  genome hoàn thiện của ba chủng  bởi Ruiz (2007) [13] đã công bô môt bai bao vê<br /> ́ ̣ ̀ ́ ̀ <br /> H. pylori cho thấy tính đa dạng di truyền cao,  đặc tính của một lipase gọi là EstV có thể góp <br /> ̣ ́ ̀ ́ ̉ ̣ ́ ới cơ <br /> đăc tinh nay co thê liên quan mât thiêt t phần vào sự hinh thanh va phát tri<br /> ̀ ̀ ̀ ển của viêm <br /> chế  gây bênh c<br /> ̣ ủa vi khuẩn . Duckworth et al.   loét, băng ch<br /> ̀ ưng la<br /> ́ ̀ enzyme nay có th<br /> ̀ ể  bị   ức <br /> (2009)  [3]  đã tổng kết được gần 400 protein <br /> <br /> <br /> 117<br />  Nguyen Mai Khanh et al.<br /> <br /> chế bởi hai chất kháng viêm chiết xuất từ thaỏ   Nồng độ và độ tinh sạch của ADN trong mẫu  <br /> dược.  lưu giữ  được kiểm tra lại bằng phương pháp <br /> Ở Việt Nam, cac sô liêu cho thây<br /> ́ ́ ̣ ́  liệu pháp  đo   quang   phổ   (Nanodrop   Technologies, <br /> chuẩn  bộ   ba  gồm  bismuth   subsalicylate,  Rockland, DE).<br /> metronidazole,  và   clarithromycin,  thường  cho  Tối  ưu hóa quy trình khuếch  đại gen mã <br /> tỷ lệ chữa khỏi cao (80­90%) đã được khuyến  hóa lipase và xác định trình tự <br /> cáo là không nên dùng bởi các chủng đang lưu <br /> Cặp   mồi   với   trình   tự   đã   được   công   bố <br /> ̀  có khả năng kháng kháng sinh manh <br /> hanh ̣ [20]. <br /> trong nghiên cứu của Ruiz et al. (2010) [] được <br /> Các tác giả đã chỉ ra rằng hơn 80% các chung  ̉<br /> sử   dụng   để   khuếch   đại   gen   mã   hóa   lipase: <br /> H. pylori  được phân lập  ở  Việt Nam  có khả <br /> Lipase_FW_1407:  5’­ACTAAGCTTGAATAA <br /> năng kháng  kháng sinh [4, 6]. Khi tính kháng <br /> GTAAATGGCC­3’   và  Lipase_RV_1407:  5’­T <br /> kháng sinh của  H. pylori  ngày càng gia tăng, <br /> GAGAATTCAGCCAACTAAGAC­3’<br /> việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất  ức  <br /> Phản ứng chuỗi polymerase theo nguyên lý <br /> chế  hoạt động của các enzyme tham gia vào <br /> của Mullis (1987)  được tiến hành với thể tích <br /> quá trình sinh trưởng và xâm nhập tế  bào vật <br /> là 12,5  l gồm các thành phần phản ứng: 10 ng <br /> chủ  có ý nghĩa quan trọng trong việc điều trị <br /> ADN tổng số; 0,2 pM mỗi mồi;  5 unit Dream <br /> các bệnh dạ dày gây ra bởi vi khuẩn H. pylori. <br /> Taq ADN polymerase; 0,2 mM dNTPs và đệm  <br /> Năm 2012, bai bao nghiên c<br /> ̀ ́ ưu vê s<br /> ́ ̀ ự  đa hinh<br /> ̀  <br /> cho Dream Taq (10X) tương  ứng với chu trình <br /> ̉<br /> cua gen   hp1125  mã hóa cho môṭ   protein  màng <br /> nhiệt trên máy luân nhiệt iCycler Bio­Rad đã <br /> ngoài của vi khuẩn nhằm phát triển vắc­xin là <br /> được tối ưu hóa như sau: 94oC ­ 4 phút, 35 chu <br /> một trong những nghiên cứu đầu tiên ở cấp độ <br /> kỳ (94oC ­ 30 giây, 52,5oC ­ 45 giây, 72oC ­ 30 <br /> phân tử trên đôi t<br /> ́ ượng nay <br /> ̀ [7]. Tuy nhiên, chưa <br /> giây); 72oC ­ 10 phút; sau đó giữ ở 4oC. <br /> có một nghiên cứu ở cấp độ phân tử về lipase  <br /> trên các chủng H. pylori tại Việt Nam để hiểu  Kết quả  PCR được kiểm tra bằng điện di <br /> rõ sự  liên hệ  giữa tính đa hình, khả  năng gây   trên  gel   agarose   0.8%   (g/100  ml).  Sản  phẩm  <br /> viêm  loét  cũng  như  tính kháng các  hợp chất  PCR đặc hiệu có kích thước xấp xỉ 750 bp từ <br /> chống   viêm   loét   của   vi   khuẩn  H.   pylori.  26 chủng H. pylori được tinh sạch sử dụng bộ <br /> Nghiên cứu trình bày trong bài báo này về tính  kit của Promega (Berg, Cohen và Boyer, 1973) <br /> đa hình của gen,  đặc biệt là các sai khác có  và gửi đọc  trình tự  trực tiếp theo nguyên lý <br /> khả  năng  ảnh hưởng đến hoạt tính lipase, là  của   Sanger  et   al.  (1975)  [14]  tại   hãng <br /> cần thiết để  từ  đó định hướng sàng lọc các  Macrogen, Korea. <br /> hợp chất  ức chế  enzyme nhằm phát triển các  Phân tích trình tự nucleotide và amino <br /> hợp chất kháng khuẩn, chống viêm loét mới.  acid của 26 mẫu<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Kết quả  đọc trình tự  nucleotide và amino <br /> acid sẽ được so sánh với trình tự tham chiếu – <br /> Thu thập chủng và tách chiết ADN  trình   tự   gen   HP0739   của   chủng   H.   pylori  <br /> Các   chủng  H.   pylori  được   phân   lập   từ  26695.   Chúng   tôi   tiến   hành   phân   tích   sự   đa <br /> bệnh   nhân   Việt   Nam   và   được   lưu   giữ   bởi  hình các trình tự  gen thu nhận được sử  dụng  <br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa  phần   mềm   Bioedit   (http://www.bioedit.com). <br /> học và Công nghệ Việt Nam. ADN tổng số đã  Để phân tích cây phát sinh chủng loại, phương  <br /> được tách chiết và bảo quản  ở  ­20oC, được  pháp maximum likelihood theo mô hình Jones­<br /> chuyển   về   Phòng   Thí   nghiệm   trọng   điểm  Taylor­Thornton   được   lựa   chọn   với   việc   sử <br /> Công nghệ  Enzyme và Protein, Đại học Khoa  dụng phần mềm MEGA phiên bản 6.06 [19]. <br /> học Tự  nhiên. Chúng tôi  đã tiếp nhận ADN  <br /> của 26 chủng để  tiến hành nghiên cứu tính đa  KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> hình   đoạn   gen   mã   hóa   lipase   mong   muốn.  Thu thập chủng và tách chiết ADN <br /> <br /> 118<br />  Nghiên cứu tính đa hình đoạn gen mã hóa carboxylesterase EstV<br /> <br /> Nồng độ  và độ  tinh sạch của ADN trong   Sử  dụng cặp mồi và chu trình nhiệt được <br /> mẫu lưu giữ  được kiểm tra lại bằng phương   công bố, sản phẩm nhân gen thu nhận được <br /> pháp   đo   quang   phổ   (Nanodrop   Technologies,   kiểm   tra   trên   bản   điện   di   agarose   0,8%   cho  <br /> Rockland, DE) (bảng 1, và 2), và  điện di trên  thấy, một đoạn ADN có độ  dài dự  kiến, tuy  <br /> bản gel agarose 0.8 (hình 1). Kết quả cho thấy  nhiên hình ảnh băng mờ. Quy trình khuếch đại <br /> các  mẫu  có  nồng  độ   ADN   đủ   tinh  sạch  để  đoạn gen  được tối  ưu với việc tăng chu kỳ <br /> tiến hành các thí  nghiệm  tiếp  theo.   Để   tiến  phản   ứng   luân   nhiệt   lên   35   chu   kỳ,   và   đã <br /> hành nhân đoạn gene mã hóa lipase, dung dịch   khuếch đại thành công đoạn gen mã hóa lipase <br /> ADN   mẫu   được   pha   loãng   tới   nồng   độ   10  từ  26 mẫu nghiên cứu. Kết quả  điện di cho <br /> ng/ul.  thấy sản phẩm PCR có kích thước dự  kiến, <br /> Tối  ưu hóa quy trình khuyếch đại gen mã  khoảng   750   bp,   không   xuất   hiện   băng   phụ, <br /> được tinh sạch để  đọc trình tự trực tiếp (hình <br /> hóa lipase và xác định trình tự <br /> 1). <br /> <br /> Bảng 1. Nồng độ ADN 26 chủng H. pylori được sử dụng trong nghiên cứu:<br /> Mẫu Nồng độ (ng/ul) Mẫu Nồng độ (ng/ul) Mẫu Nồng độ (ng/ul)<br /> 83 25 91 41 101 19<br /> 84 52,5 93 32 102 21<br /> 85 52 94 25 103 24,5<br /> 86 20,5 95 34 104 15,5<br /> 87 34 96 28,5 105 12,5<br /> 88 21 97 13 7ab 20<br /> 89 42 97 22,5 21ab 20<br /> 90 33 99 21,5 24ab 18<br /> 91 77,5 100 18<br /> <br /> Bảng 2. Độ tinh sạch nồng độ ADN chủng H. pylori được sử dụng trong nghiên cứu:<br /> Mẫu OD (260/280) Mẫu OD (260/280) Mẫu OD (260/280)<br /> 83 2,1 91 1,7 101 2,1<br /> 84 2,1 93 1,8 102 1,8<br /> 85 1,7 94 1,3 103 1,7<br /> 86 2,5 95 1,5 104 1,6<br /> 87 1,8 96 1,6 105 2,2<br /> 88 1,9 97 0,9 7ab 1,9<br /> 89 1,4 97 1,3 21ab 2,0<br /> 90 1,6 99 1,6 24ab 1,1<br /> 91 1,3 100 1,7<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 119<br />  Nguyen Mai Khanh et al.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Kết quả điện di sản <br /> phẩm PCR đại diện cho một số <br /> mẫu Hình 2. Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối tương quan <br /> M: thang ADN 1kb; 90, 91, 100, 7ab,  giữa gen mã hóa lipase của các chủng thu nhập được và <br /> 21ab: sản phẩm PCR từ các chủng  chủng H. pylori 26695 (NC 000915.1).<br /> 90, 91, 100, 7ab và 21ab; (­, +): sản <br /> phẩm PCR mẫu đối chứng âm, <br /> dương<br /> Phân tích trình tự  nucleotide và amino acid <br /> của 26 mẫu thay thế  cặp nucleotide  ở  khung đọc mở. <br /> Kết quả phân tích trình tự chủng 91 có sự khác <br /> Trình tự gen được phân tích và so sánh với  biệt nhất so với chủng tham chiếu với mức độ <br /> chủng   tham   chiếu  H.   pylori  26695.   Độ   dài  tương đồng  ở  trình tự  nucleotide là 96%, và ở <br /> trình tự  được phân tích bao gồm cả  các cách  trình tự  amino acid chuyển đổi là 98%. Theo <br /> đoạn là 630 nucleotide và 176 amino acid. Phân  đó,   2   trong   số   4   điểm   amino   acid  khác   biệt  <br /> tích tính đa hình trình tự  nucleotide và amino  nằm trong vùng bảo thủ 3 và 4 đã được nghiên <br /> acid thu được cho thấy duy nhất chủng 21ab  cứu trước đây [13]: A thay thế  cho V  ở  vị  trí <br /> có   tính   tương   đồng   cao   (hơn   98%   trình   tự  95, và I thay thế  cho M  ở  vị  trí 113 (hình 3). <br /> amino   acid   chuyển   đổi   giống   trình   tự   công  Tính đa hình trong vùng trình tự  bảo thủ  này <br /> bố); các trình tự  còn lại có sự  khác biệt đáng  có   thể   dẫn   tới   thay   đổi   lớn   trong   hoạt   tính <br /> kể  với trình tự  tham chiếu này (hình 2). Cụ  enzyme cũng như khả năng sống của vi khuẩn. <br /> thể, 14/26 chủng có trình tự khác biệt trên 3%  Một điểm phát hiện đáng chú ý là sự thay thế <br /> (dựa   trên   ngưỡng   tương   đồng   về   chuỗi  amino acid D cho G ở vị trí 89 được tìm thấy ở <br /> polypeptide là 97%), hầu hết là  tất cả  các chủng  H. pylori  phân lập tại Việt <br /> Nam. <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 120<br />  Nghiên cứu tính đa hình đoạn gen mã hóa carboxylesterase EstV<br /> <br /> Hình 3. Một số điểm đa hình tiêu biểu trên trình tự gen mã hóa lipase của các chủng H. pylori <br /> phân lập tại Việt Nam với chủng tham chiếu H. pylori 26695 (NC 000915.1).<br /> <br /> ̉ ́ ̀ ́ ̣ ưa tinh đa hinh di<br /> Gia thiêt vê môi liên hê gi ̃ ́ ̀   số  lượng lớn hơn là cần thiết. Sắp tới, nhóm  <br /> ̀ ̀ ̉<br /> truyên va kha năng khang ́ hợp chất ức chế viêm  nghiên cứu sẽ tiến hành nhân dòng gen mã hóa <br /> ̃ ̀ ưa được hiêu ro, vi vây,<br /> loét  vân con ch ̉ ̃ ̀ ̣  nghiên  EstV   được   lựa   chọn   từ   các   chủng   dựa   trên <br /> cứu  nhân dòng gen mã hóa  EstV sẽ  được tiến  phân tích tính đa hình để, biểu hiện enzyme tái  <br /> hành để  biểu hiện hoạt tính enzyme tái tổ hợp  tổ  hợp nhằm xác định vai trò và ý nghĩa của  <br /> nhằm xác định ý nghĩa của các điểm đa hình  các điểm đa hình này tới hoạt tính lipase trong <br /> này. mối liên quan với tính kháng hợp chất  ức chế <br /> viêm loét.<br /> KẾT LUẬN <br /> Lời cảm  ơn:  Chương trình nghiên cứu nằm <br /> Chúng tôi đã khuếch đại đoạn gen mã hóa  trong khuôn khổ  đề  tài “Nghiên cưu lipase va ́ ̀ <br /> lipase thành công với cặp mồi đặc hiệu và chu  peptide   deformylase   cuả   cać   chung ̉   vi   khuân ̉  <br /> trình nhiệt được tối ưu hóa. Trình tự đoạn gen  Helicobacter pylori phân lâp  ̣ ở  Viêt Nam: tinh<br /> ̣ ́  <br /> của 26 chủng H. pylori đã được phân tích tính  ̣ ̀ ̉<br /> đa hinh di truyên, tinh sach va biêu biên enzym<br /> ̀ ̀ ̣  <br /> đa hình và   tính tương   đồng  với   chủng   tham  ́ ̉ ợp va kiêm tra kha năng <br /> tai tô h ̀ ̉ ̉ ưc chê b<br /> ́ ́ ởi cać  <br /> chiếu  H. pylori  26695. Phân tích tính đa hình  ̣   chiêt́   thaỏ   dược   nhăm<br /> dich ̣   hương<br /> ̀   đinh ́   phat́ <br /> chỉ ra duy nhất một chủng có tính tương đồng  ̉ ́ ược Quỹ phát triển Khoa học và <br /> triên thuôc” đ<br /> cao; các trình tự  còn lại có sự  khác biệt đáng  Công nghệ  Quốc gia ­ Bộ  Khoa học và Công <br /> kể với trình tự tham chiếu. Việc phân lập các  nghệ tài trợ (Số 106­NN.02­2013.55).<br /> chủng  H. pylori  để  phân tích tính đa hình với <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> <br />  GENETIC POLYMORPHISM STUDIES OF A GENE ENCODING LIPASE <br /> FROM Helicobacter pylori STRAINS ISOLATED IN VIETNAM <br /> <br /> Nguyen Mai Khanh1, Pham Thi Vinh Hoa2, Vo Thi Phuong1, Pham Bao Yen1<br /> 1<br /> Ha Noi University of Science, VNU, Hanoi<br /> 2<br /> Hanoi School of Public Health<br /> <br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Recent  studies  show that  lipase  plays  an important role  in  lipid  hydrolysis  of  gastric mucosa, helping <br /> Helicobacter  pylori  bacteria   attach  and  penetrate  the   stomach,   causing  gastric   ulcer   diseases   that   could <br /> develop   into   cancer.   Lipase   can   be   divided   into   two   main   groups   including   lipase   (EC   3.1.1.3)   and <br /> carboxylesterase (EC 3.1.1.1). Interestingly, there has been not much information about the subgroup lipase <br /> V, which belongs to the latter. To study the polymorphism at the molecular level and to clone the gene coding <br /> for EstV, twenty­six H. pylori strains in Vietnam were isolated for DNA extraction and amplification using <br /> specifically designed primers and optimized thermal cycle. The expected PCR product had approximately 750 <br /> bp. The electrophoresis results showed a single band as expected without smear and unspecific bands. The <br /> PCR   product   was   then   sequenced   and   analyzed   by   comparison   with   the  H.   pylori  26695   strain.   The <br /> polymorphism   analysis   showed   that   only   one   strain   with   high   similarity   with   the   reference   strain   (98% <br /> similarity in translated amino acid sequence). Specially, 14/26 strains had sequences with more than 3% <br /> differences (based on 97% cut off of polypeptide sequence). Interestingly, some strains show polymorphism <br /> <br /> <br /> 121<br />  Nguyen Mai Khanh et al.<br /> <br /> in the highly conserved amino acid blocks, which could significantly affect the activity of enzyme as well as <br /> the survival of the microorganism. To identify the significance of nucleotide changes, the EstV coding gene <br /> will   be   inserted   into   a   cloning   vector   and   the   activity   of   the   expressed   recombinant   enzyme   will   be  <br /> characterized.<br /> Keywords: Helicobacter pylori, cloning lipase, EstV, polymorphism.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 22­10­2014<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 122<br />