119
Virus Real-time PCR
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Xác định DNA ho c ARN đ t trưng c a virus cần tìm.
2. Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ
ho c chứng nhận v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh
học/công nghệ sinh học).
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại
học ho c sau đại học v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh
học/công nghệ sinh học).
2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)
2.1. Trang thiết bị
- T an toàn sinh học cấp 2
- Máy nhiệt
- Máy ly tâm bàn dùng cho ống bệnh phẩm 5ml
- Máy ly tâm lạnh dùng cho tube 0,2 ml
- Máy vortex
- Máy chạy PCR
- Máy chạy Real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
- Các loại Micropipette đi u chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl
- T lạnh thường
- T âm sâu (-200C) ho c (-700C) (nếu có)
- Bộ lưu điện
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
STT
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao
Đơn vị
1
Bông
Kg
2
Dây garô
Cái
3
Cồn
ml
4
Bơm kim tiêm
Cái
120
STT
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao
Đơn vị
5
Panh
Cái
6
Khay đựng bệnh phẩm
Cái
7
Hộp vận chuyển bệnh phẩm
Test
8
Dụng cụ lấy bệnh phẩm (Ống chống đông 5ml có
chứa EDTA/ Tăm bông vô trùng/ Tube đựng bệnh
phẩm vô trùng)
Ống
9
Tube 1,5ml vô trùng
Tube
10
Găng không có bột (DNase-RNase free)
Đôi
11
Bộ kít chiết tách DNA/RNA tổng số
Hộp
12
Bộ kít tổng hợp cDNA (Nếu là virus RNA)
Hộp
13
Sinh phẩm chẩn đoán
Test
14
Khấu hao sinh phẩm cho mẫu chứng và kiểm tra
chất lượng, standard các loại
Test
15
Ependoff 1,7ml
Tube
16
Ependoff 0,2ml
Tube
17
Đầu côn 10 µl có lọc
Cái
18
Đầu côn 30 µl có lọc
Cái
19
Đầu côn 200 µl có lọc
Cái
20
Đầu côn 1 ml có lọc
Cái
21
Water-DEPC Treated
ml
22
Giấy thấm không bụi
Cuộn
23
Giấy xét nghiệm
Tờ
24
Sổ lưu kết quả xét nghiệm
Tờ
25
Bút viết kính
Cái
26
Bút bi
Cái
27
Mũ
Cái
28
Khẩu trang
Cái
29
Găng tay xử lý dụng cụ
Đôi
30
Quần áo bảo hộ
Bộ
31
Dung dịch xà phòng rửa tay
ml
32
Cồn sát trùng tay nhanh
ml
121
STT
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao
Đơn vị
33
Dung dịch khử trùng
ml
34
Khăn lau tay
Cái
35
Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*
* Ghi chú:
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình
ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với
số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm
Các loại bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm virus cần tìm
4. Phiếu xét nghiệm
Đi n đầy đ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định c a chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Thu nhận và xử lý mẫu:
- Tất cả loại bệnh phẩm khi chứa nhi u tạp nhiễm cần được thuần nhất trước
khi tách chiết.
2.2. Tách chiết DNA hoặc RNA từ bệnh phẩm bằng bộ kit tách DNA tổng số
hoặc RNA tổng số
2.3. Chạy phản ứng RT-PCR dùng mồi ngẫu nhiên với virus có bộ gen là
RNA (Bỏ qua bước này nếu kít sử dụng real-time PCR có chứa luôn phản
ứng RT-PCR)
- Bật máy PCR 15 phút trước khi chạy phản ứng RT-PCR
- Thực hiện bước này với các tube RT-PCR mix được giữ trong khay lạnh
ho c đá đang tan.
- Chỉ lấy đ số tube RT-PCR mix cần. Trước và sau khi đ t phản ứng RT-
PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.
- Cho dịch RNA tách chiết vào từng tube RT-PCR Mix. Xong, đ t các tube
vào máy PCR.
- Cài đ t chương trình “Protocol” cho máy PCR hoạt động theo hướng dẫn
c a bộ kit RT-PCR.
- Cho máy PCR chạy chương trình.
122
2.4 Chạy phản ứng Real-time PCR
- Bật máy real-time PCR 15 phút trước khi cho máy chạy. Bật máy tính và
kh i động chương trình real-time PCR.
- Thực hiện bước mix với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh ho c
đá đang tan.
- Chỉ lấy đ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đ t phản ứng PCR phải
ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.
- Cho chứng +, chứng -, các nồng độ standard, dịch DNA vừa tách (ho c
dịch cDNA vừa thu nhận được (ho c RNA vừa tách được nếu kít Real-time
PCR có chứa phản ứng RT-PCR)) vào từng tube Real-time PCR Mix. Xong,
đ t các tube vào máy real-time PCR.
- Cài đ t vị trí mẫu “Plate setup” trên phần m m đúng với vị trí mẫu đã đ t
trên máy real-time PCR.
- Chọn màu cho mẫu, chứng dương, chứng âm, standart theo hướng dẫn c a
bộ kít sử dụng
- Cài đ t chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động
- Lưu file dữ liệu vào máy tính
- Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Nhận định kết quả qua phân tích c a máy dựa trên cơ s hướng dẫn c a
bộ kít Real-time PCR được sử dụng.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường
- Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế ho c do máy Real-
time PCR bị hỏng.
- Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân th ch t chẽ quy trình kỹ thuật.