265
Vi sinh vật nhiễm khuẩn hô hấp
Real-time PCR đa tác nhân
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN
1. Mục đích
Xác định DNA/RNA đ c trưng c a các vi sinh vật gây bệnh trong bệnh
phẩm đường hô hấp c a người.
2. Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ
ho c chứng nhận v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh
học/công nghệ sinh học).
- Người nhận định pduyt kết qu: Người thc hin trình độ đại
hc ho c sau đại hc v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh hc phân t/ sinh
hc/công ngh sinh hc).
2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)
2.1. Trang thiết bị
- Máy real-time PCR đa màu và h thng máy vi tính.
- B lưu điện
- Máy nhit
- Máy ly tâm > 12000 gpm/phút
- Máy ly tâm lnh
- T lnh 20C -80C
- T âm sâu (-200 C) ho c (-700C) (nếu có)
- Máy vortex
- T an toàn sinh hc
- Micropipettes các th tích t 5 l - 1000 l.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
STT
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao
Đơn vị
1
Tăm bông vô trùng ho c lọ đựng bệnh phẩm
Cái
2
Găng không có bột tal ( DNase-RNase free)
Đôi
3
Khay đựng bệnh phẩm
Cái
4
Hộp vận chuyển bệnh phẩm
Cái
266
5
Sinh phẩm chẩn đoán
Test
6
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng
Test
7
Hóa chất và vật tư tiêu hao cho tách acid nucleic
Test
8
Tube eppendorff 1,5 ml
Cái
9
Strip 8 tubes 0,1 ml
Cái
10
Nắp đậy strip 8 tubes
Cái
11
Đầu côn có phin lọc 1 ml
Cái
12
Đầu côn có phin lọc 200 l
Cái
13
Đầu côn có phin lọc 30 l
Cái
14
Đầu côn có phin lọc 10 l
Cái
15
Giấy thấm không bụi
Cuộn
16
Giấy xét nghiệm
Tờ
17
Sổ lưu kết quả xét nghiệm
Tờ
18
Bút viết kính
Cái
19
Bút bi
Cái
20
Cái
21
Khẩu trang
Cái
22
Găng tay xử lý dụng cụ
Đôi
23
Quần áo bảo h
Bộ
24
Dung dịch xà phòng rửa tay
ml
25
Cồn sát trùng tay nhanh
ml
26
Dung dịch khử trùng
ml
27
Khăn lau tay
Cái
28
Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*
* Ghi chú:
- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình
ngoại kiểm (EQAS) 1/50 tổng chi pdụng cụ, hóa chất, vật tiêu hao (với
số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm
Dịch mũi hầu, dịch ngoáy họng, dịch tỵ hầu, dịch hút phế quản, dịch rửa phế
quản.
4. Phiếu xét nghiệm
267
Đi n đầy đ thông tin theo mẫu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.
1. Ly bnh phm
Theo đúng quy định c a chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).
2. Tiến hành k thut
2.1. Thu nhận và xử lí mẫu
Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA/RNA (nếu cần)
2.2. Tách chiết DNA/ RNA
2.3. Thực hiện phản ứng real-time PCR
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Điều kiện của phản ứng
- Chứng dương đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang tuyến tính vượt
quá tín hiệu n n (đường biểu diễn dương tính) đường biểu diễn tín hiệu
huỳnh quang cho chứng nội dương tính ho c thẳng không vượt qua tín hiệu
n n (đường biểu diễn âm tính).
- Chứng âm đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang âm tính đường
biểu diễn tín hiệu huỳnh quang chứng nội dương tính
2. Phân tích mẫu
- Mẫu dương tính: Mẫu đường biu diễn dương tính ràng tương ng
vi màu c a tng tác nhân và bắt đầu t chu k 42 tr v trước. Mt mu có th
dương tính với 1 ho c nhi u tác nhân.
- Mu nghi ng: Mẫu có đường biu diễn dương tính và lớn hơn chu k 42
thc hin li xét nghim. Nếu kết qu vn l p li thì tr li kết qu dương
tính. Nếu kết qu khác vi lần đầu thì yêu cu ly li mu bnh phẩm khác để
kim tra li.
- Mu âm tính: Mẫu đường biu din âm tính, chng ni phải dương
tính.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
1. S c: mu chng nội cũng đ u âm tính. Chứng bình thường, mu
dương, mu âm tht s.
2. Nguyên nhân: Có th mu âm thc s, có th phn ng PCR b c chế.
3. Khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ
bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu.
Nếu vẫn g p sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.