intTypePromotion=1

Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng

Chia sẻ: Nguyen Lan | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:37

0
587
lượt xem
69
download

Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

PCR và phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1. Phát hiện điểm cuối (End-Point Detection) 2. Độ đặc hiệu kém 3. Độ nhạy thấp 4. Độ phân giải kém 4. Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR 5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm 6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư)

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng

  1. Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy
  2. PCR
  3. PCR VÀ GIỚI HẠN CỦA PCR PCR và phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1. Phát hiện điểm cuối (End-Point Detection) 2. Độ đặc hiệu kém 3. Độ nhạy thấp 4. Độ phân giải kém 4. Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR 5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm 6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung th ư)
  4. REALTIME PCR → Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt. Kiểm soát tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR tạo thành trong từng chu kỳ nhiệt - Real time). Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang.
  5. REALTIME PCR
  6. HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY REALTIME PCR Kính lọc phát sáng Kính lọc kích thích Nguồn: laser, LED, đèn tungsten-halogen Detector: CCD (charge coupled device), PMT (photomultiplier tube)
  7. 1 10 102 103 104 105 106 1 10 102 103 104 105 106 Cycle 11 Cycle 13 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41
  8. 1 10 102 103 104 105 106 Cycle 11 Cycle 13 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 C.41 Cycle 31 C.39 Mẫu chưa biết [C] Cycle 33 C.36 Cycle 34 Standard curve C.34 Cycle 36 C.33 Cycle 39 C.31 Cycle 41 C.29 1 10 102 103 104 105 106
  9. PHƯƠNG TRÌNH TÍNH SỐ COPY/MẪU
  10. THỜI ĐIỂM PHÁT HIỆN TÍN HIỆU Threshold: điểm bắt đầu quan sát được tín hiệu huỳnh quang phát ra, tại thời điểm này tín hiệu do sản ph ẩm PCR > tín hiệu nền. - Ct (Threshold cycle): là số chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của sản phẩm khuếch đại vượt qua ngưỡng. -Động học RealtimePCR Phân tích tiến trình phản ứng trong mỗi chu kỳ nhiệt nhờ computer
  11. REALTIME PCR
  12. REALTIME PCR Log view Rael time PCR định lượng số copies trong giai đoạn tăng lũy thừa
  13. TÍN HIỆU HUỲNH QUANG TRONG REAL TIME PCR Primers 1. Chất nhuộm khi chèn vào sợi Taq polymerase đôi DNA sẽ phát huỳnh quang: dNTP PCR buffer ♦ Ethidium bromide MgCl2 ♦ SYBR green 1 Chất phát huỳnh quang 2. Probe đặc hiệu có gắn chất Target DNA (Template) phát huỳnh quang ♦ Taqman probe. ♦ Molecular Beacon Real-time PCR MIX ♦ Hybridization probe… Real-time PCR mix
  14. SYBR GREEN I Huỳnh quang không Không phát huỳnh quang SYBR SYBR GREEN I GREEN I
  15. SYBR GREEN I DNA caàn tìm DNA khoâng caàn tìm Khoâng phaân bieät ñöôïc saûn phaåm ñaëc hieäu hay
  16. SYBR GREEN I  Tính đặc hiệu không cao.   Tầm soát sản phẩm trước khi sử dụng probe    đặc hiệu  Thực hiện khi PCR đã được tối ưu hóa, không có      primer dimer, không có amplicon không đặc hiệu
  17. PHÂN BIỆT SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU (Melting Curve) Mục đích: phân tích tính đặc hiệu của sản phẩm sau khu ếch đại Melting temperature (Tm) của dsDNA: –To tại đó ½ pt DNA ở dạng sợi đôi, ½ sợi đơn –Phụ thuộc chiều dài và thành phần nucleotide Thực hiện: tăng To, DNA tách nhau ra, Đưa To về 55oC. Tăng dần nhiệt độ, chụp hình tín hiệu huỳnh quang mỗi 0,5oC.
  18. Melting Curve
  19. PHÂN BIỆT SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU (Melting Curve)
  20. REAL TIME PCR SỬ DỤNG TAQMAN PROBE 1. ƯU ĐIỂM Probe đặc hiệu Multiplex PCR 2. NHƯỢC ĐIỂM Giá thành cao
ADSENSE
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2