M Đ UỞ Ầ
M c đ gia tăng dân s nhanh chóng đã đ y toàn nhân lo i ph i đ i m tứ ộ ố ẩ ạ ả ố ặ
v i thách th c l n lao, đó là kh c ph c s đói nghèo. V n đ làm sao đ tăng s nớ ứ ớ ắ ụ ự ấ ề ể ả
l ng nông nghi p, cung c p l ng th c n đ nh cho con ng i luôn là m i quanượ ệ ấ ươ ự ổ ị ườ ố
tâm đ c bi t c a nhi u qu c gia trên th gi i. Tình hình l ng th c b p bênh cònặ ệ ủ ề ố ế ớ ươ ự ấ
khá ph bi n nhi u n i. Bên c nh nh ng nguyên nhân chính nh nông nghi pổ ế ở ề ơ ạ ữ ư ệ
ch a đ c coi tr ng đúng m c, đ t đai ch a đ c s d ng h p lý, thì sâu b nh,ư ượ ọ ứ ấ ư ượ ử ụ ợ ệ
đ c bi t là côn trùng, là m t trong nh ng tác nhân gây thi t h i ch y u cho mùaặ ệ ộ ữ ệ ạ ủ ế
màng. Theo th ng kê c a Dean & Adang [ố ủ ], Oerke & đtg [], nh ng t n th t mùaữ ổ ấ
màng nghiêm tr ng trên toàn c u do sâu b nh gây ra c tính chi m t 35 đ nọ ầ ệ ướ ế ừ ế
42% t ng s n l ng nông nghi p hàng năm, trong đó thi t h i do côn trùng chi mổ ả ượ ệ ệ ạ ế
t 13-16%. M c đ thi t h i có khi lên t i 70% n u nh cây tr ng không đ c ápừ ứ ộ ệ ạ ớ ế ư ồ ượ
d ng các bi n pháp b o v . ụ ệ ả ệ
Hi n nay, r t nhi u lo i thu c tr sâu hoá h c đang đ c s d ng đệ ấ ề ạ ố ừ ọ ượ ử ụ ể
phòng tr sâu b nh v i chi phí t n kém, gây ô nhi m môi tr ng và gây đ c h iừ ệ ớ ố ễ ườ ộ ạ
cho s c kho con ng i, v t nuôi. Đ c i thi n tình hình này, chúng ta c n ngứ ẻ ườ ậ ể ả ệ ầ ứ
d ng nh ng k thu t tiên ti n trong b o v cây tr ng nh m xây d ng m t n nụ ữ ỹ ậ ế ả ệ ồ ằ ự ộ ề
nông nghi p s ch, b n v ng. Vi c t o ra các gi ng cây tr ng bi n đ i di truy nệ ạ ề ữ ệ ạ ố ồ ế ổ ề
(Genetically Modified Crops, GMOs) có kh năng kháng sâu b nh và côn trùng nóiả ệ
riêng nh k thu t t o dòng phân t , k thu t chuy n gen th c v t đ c quan tâmờ ỹ ậ ạ ử ỹ ậ ể ự ậ ượ
nghiên c u và ng d ng th c ti n nh m nâng cao năng su t cây tr ng và đem l iứ ứ ụ ự ễ ằ ấ ồ ạ
l i ích t i đa cho n n nông nghi p. H n n a, các ti n b đ t đ c còn kh c ph cợ ố ề ệ ơ ữ ế ộ ạ ượ ắ ụ
đ c nh ng h n ch khi s d ng các bi n pháp tr sâu hoá h c cũng nh các bi nượ ữ ạ ế ử ụ ệ ừ ọ ư ệ
pháp sinh h c truy n th ng, nâng m c đ an toàn cho con ng i, v t nuôi và c iọ ề ố ứ ộ ườ ậ ả
thi n môi tr ng sinh thái. B ng các k thu t di truy n m i này, tri n v ng t o raệ ườ ằ ỹ ậ ề ớ ể ọ ạ
các gi ng cây tr ng mang nh ng đ c tính mong mu n trong th i gian t ng đ iố ồ ữ ặ ố ờ ươ ố
ng n đã tr thành hi n th c. Đ n nay hàng lo t gen mã hoá protein có ho t tínhắ ở ệ ự ế ạ ạ
1
di t côn trùng gây h i (gen kháng côn trùng) nh gen ệ ạ ư cry c a vi khu n ủ ẩ Bacillus
thuringiensis, gen mã hoá các ch t c ch proteaza và -amylaza… đ c chuy nấ ứ ế ỏ ượ ể
vào th c v t nh các ph ng pháp thích h p v i s n ph m là nh ng cây tr ng cóự ậ ờ ươ ợ ớ ả ẩ ữ ồ
kh năng t kháng sâu b nh.ả ự ệ
Trên th gi i, khá nhi u ph ng pháp chuy n gen th c v t đã đ c nghiênế ớ ề ươ ể ự ậ ượ
c u và áp d ng thành công, nh ph ng pháp vi tiêm, s d ng súng b n gen, xungứ ụ ư ươ ử ụ ắ
đi n. Trong đó, ph ng pháp có giá tr th c ti n cao và đ c s d ng r ng rãiệ ươ ị ự ễ ượ ử ụ ộ
nh t là ph ng pháp bi n n p gen thông qua vi khu n đ t ấ ươ ế ạ ẩ ấ Agrobacterium
tumefaciens. V i u đi m nh ít t n kém, d áp d ng trên các đ i t ng cây tr ngớ ư ể ư ố ễ ụ ố ượ ồ
nên ph ng pháp này r t phù h p v i đi u ki n c a các n c đang phát tri n nhươ ấ ợ ớ ề ệ ủ ướ ể ư
Vi t Nam ệ[]. Nhi u n i trên th gi i, k thu t chuy n và bi u hi n gen kháng cônề ơ ế ớ ỹ ậ ể ể ệ
trùng nói riêng và gen có l i nói chung vào cây tr ng thông qua ph ng pháp này đãợ ồ ươ
và đang là công c h tr chính trong ch n gi ng th c v t. n c ta, nghiên c uụ ỗ ợ ọ ố ự ậ Ở ướ ứ
chuy n gen th c v t m i ch b t đ u, ch y u t i các phòng thí nghi m c a Vi nể ự ậ ớ ỉ ắ ầ ủ ế ạ ệ ủ ệ
Công ngh Sinh h c và Vi n Sinh h c Nhi t đ i (thu c Trung tâm Khoa h c Tệ ọ ệ ọ ệ ớ ộ ọ ự
nhiên và Công ngh Qu c gia), Vi n Di truy n Nông nghi p và Vi n Nghiên c uệ ố ệ ề ệ ệ ứ
Lúa đ ng b ng sông C u Long (thu c B Nông nghi p và Phát tri n Nông thôn).ồ ằ ử ộ ộ ệ ể
H u h t các nghiên c u s d ng gen ch th và m t s gen khác trên các vectầ ế ứ ử ụ ỉ ị ộ ố ơ
plasmit đ c thi t k s n. Tuy nhiên, ph n l n các vect tái t h p và các k t c uượ ế ế ẵ ầ ớ ơ ổ ợ ế ấ
gen đ c các nhà sáng ch và công ty/ c quan đăng ký s h u trí tu d i d ngượ ế ơ ở ữ ệ ướ ạ
các sáng ch ho c các gi i pháp h u ích. V khía c nh s h u trí tu , đ đ cế ặ ả ữ ề ạ ở ữ ệ ể ượ
quy n s d ng m i thành ph n trong vect tái t h p, thông th ng ng i nh nề ử ụ ỗ ầ ơ ổ ợ ườ ườ ậ
ph i liên l c v i các nhà sáng ch , c quan ho c công ty s h u đ ký các h pả ạ ớ ế ơ ặ ở ữ ể ợ
đ ng chuy n giao nguyên li u (Material Transfer Agreement, MTA). Qua các h pồ ể ệ ợ
đ ng này, chúng ta th ng ch đ c s d ng nguyên li u cho m c đích nghiên c uồ ườ ỉ ượ ử ụ ệ ụ ứ
v i r t nhi u ràng bu c v khía c nh xu t b n, s n ph m nghiên c u, s h u,ớ ấ ề ộ ề ạ ấ ả ả ẩ ứ ở ữ
chuy n giao... Rõ ràng, đ có đ c nh ng vect mang gen tái t h p có giá tr doể ể ượ ữ ơ ổ ợ ị
n c ngoài thi t k , bên c nh nh ng chi phí l n, còn có nhi u khó khăn ph c t pướ ế ế ạ ữ ớ ề ứ ạ
trong chuy n giao nguyên li u và công ngh . Do v y, m t yêu c u c p bách đ t raể ệ ệ ậ ộ ầ ấ ặ
2
là chúng ta ph i t thi t k đ c các vect chuy n gen th c v t nói chung vàả ự ế ế ượ ơ ể ự ậ
vect mang đo n kh i đ ng đ c hi u đ đi u khi n bi u hi n gen kháng cônơ ạ ở ộ ặ ệ ể ề ể ể ệ
trùng nh m m c đích chuy n và bi u hi n các gen này trong các đ i t ng câyằ ụ ể ể ệ ố ượ
tr ng n c ta. ồ ở ướ
Trên c s ý nghĩa lý lu n và th c ti n c a h ng nghiên c u này, chúngơ ở ậ ự ễ ủ ướ ứ
tôi đã ti n hành đ tài: “ế ề T o ch ng vi khu n ạ ủ ẩ Agrobacterium tumefaciens mang
gen kháng côn trùng đ chuy n vào cây tr ngể ể ồ ”, v i các m c đích và n i dungớ ụ ộ
nghiên c u chính sau đây: ứ
Môc ®Ých nghiªn cøu
Sö dông c¸c kü thuËt sinh häc ph©n tö vµ c«ng nghÖ gen ®Ó nghiªn cøu
c¸c ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt vµ gen cã ho¹t tÝnh kh¸ng c«n trïng.
Trªn c¬ së ®ã, thiÕt kÕ c¸c vect¬ Ti-plasmit vµ t¹o chñng A. tumefaciens phôc
vô c«ng nghÖ chuyÓn gen nh»m môc ®Ých n©ng cao tÝnh kh¸ng s©u bÖnh
cña c©y trång.
Néi dung nghiªn cøu
•Su tËp vµ ph©n lËp c¸c ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt vµ gen cã ho¹t
tÝnh kh¸ng c«n trïng.
•ThiÕt kÕ c¸c vect¬ Ti-plasmit mang gen kh¸ng c«n trïng díi sù ®iÒu khiÓn
cña ®o¹n khëi ®éng c¬ ®Þnh hoÆc ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt
trong tÕ bµo E. coli.
•T¹o c¸c chñng A. tumefaciens mang c¸c vect¬ Ti-plasmit chøa gen kh¸ng
c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång.
•ThiÕt kÕ vect¬ vµ biÓu hiÖn gen kh¸ng c«n trïng trong tÕ bµo E. coli.
•T¹o kh¸ng thÓ kh¸ng protein cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng phôc vô cho nghiªn
cøu vµ gi¸m ®Þnh c©y chuyÓn gen.
Nh÷ng ®ãng gãp míi cña luËn ¸n
3
B¶n luËn ¸n nµy cã nh÷ng ®ãng gãp míi vÒ khoa häc vµ thùc tiÔn nh
sau:
1. §· nh©n, t¹o dßng vµ ®äc tr×nh tù ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza
synthaza (sucrose synthase) ë gièng lóa C71 cã kh¶ n¨ng ®iÒu khiÓn sù
biÓu hiÖn gen ®Æc hiÖu ë bã m¹ch. §©y lµ ®o¹n khëi ®éng gen ®Çu tiªn
®îc ph©n lËp vµ ®äc tr×nh tù tõ mét gièng lóa ViÖt Nam. Tr×nh tù cña
®o¹n khëi ®éng nµy ®· ®îc ®¨ng ký trong c¸c Ng©n hµng tr×nh tù gen
quèc tÕ.
2. §· t¹o ®îc mét kÕt cÊu gen míi ®ã lµ gen cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña
®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu bã m¹ch C71S-P nh»m môc ®Ých chuyÓn vµo
c¸c gièng lóa ViÖt Nam t¹o kh¶ n¨ng kh¸ng s©u ®ôc th©n lóa.
3. §· thiÕt kÕ thµnh c«ng 4 vect¬ Ti-plasmit míi, cung cÊp nguyªn liÖu cho
c¸c nghiªn cøu chuyÓn gen vµo c©y trång vµ nghiªn cøu ®o¹n khëi ®éng.
Trong ®ã, gen cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng Ubiquitin
hoÆc ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71
®· ®îc ®a vµo vect¬ Ti-plasmit c¶i tiÕn vµ vect¬ chuyÓn gen thÕ hÖ míi
nhÊt sö dông hÖ thèng chän läc tÝch cùc (Positive Selection System).
4. §· hoµn thiÖn vµ sö dông ph¬ng ph¸p xung ®iÖn vµ ph¬ng ph¸p phèi ba
bè mÑ ®Ó t¹o 4 chñng A. tumefaciens míi, trªn c¬ së c¸c chñng LBA4404
vµ EHA105, mang c¸c vect¬ Ti-plasmit chøa gen kh¸ng c«n trïng ®Ó
chuyÓn vµo c©y trång.
5. LÇn ®Çu tiªn trong ®iÒu kiÖn ViÖt Nam ®· thµnh c«ng trong viÖc biÓu
hiÖn gen cryIA(c) tæng hîp ho¸ häc b»ng vi khuÈn E. coli. Protein CryIA(c)
t¸i tæ hîp sau khi tinh chÕ ®· ®îc dïng ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ kh¸ng
CryIA(c) nh»m môc ®Ých sö dông lµm c«ng cô kiÓm tra sù cã mÆt cña
s¶n phÈm gen cryIA(c) ë c¸c c©y trång ®îc chuyÓn gen.
4
6. C¸c vect¬ Ti-plasmit míi ®· vµ ®ang ®îc ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc
chuyÓn vµo lóa vµ c¸c lo¹i c©y trång quan träng kh¸c. Ngoµi ra, 2 chñng
A. tumefaciens míi còng ®· ®îc chuyÓn giao cho ViÖn Nghiªn cøu Ng«
(thuéc Bé N«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn N«ng th«n) nh»m triÓn khai c¸c
nghiªn cøu hîp t¸c chuyÓn gen cry vµo c©y ng« ViÖt Nam.
5