Tiểu luận: Nghiên cứu Enzyme amylase

Chia sẻ: Huynh Canh | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:36

Thêm vào BST

Báo xấu

1.068
lượt xem 296
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang,...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tiểu luận: Nghiên cứu Enzyme amylase

Tiểu luận Nghiên cứu Enzyme amylase
Enzyme amylase Nhom: TRAN DUY TIEN MAI HOANG VU NGUYEN QUOC CUONG Mục lục Phần I: Tổng quan về enzym amylase I.Amylase là gì? II.Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym α-amylase II.1.Đặc tính của enzym α-amylase II.2. Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase III. Lịch sử phát hiện eznym Phần II: Phân lập, bảo quản giống VSV – Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae I.Vai trò của giống trong công nghệ enzym II.Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzym III.Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae IV.Qúa trình phân lập giống VSV IV.1. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên IV.2. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất IV.3. Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng V.Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae VI. Phương pháp bảo quản giống VSV VI.1. Cấy truyền và bảo quản lạnh VI.2. Bảo quản giống trong đất hay trong cát VI.3. Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc Phần III: Công nghệ lên men tạo enzym α-amylase I.Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt I.1. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt I.1.1. Môi trường lỏng I.1.2. Môi trường đặc I.2. Qui trình sản xuất nấm mốc giống I.2.1. Nguyên liệu I.2.2.Chuẩn bị mốc giống I.2.2.1.Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng I.2.2.2.Nuôi cấy giống trong bình tam giác I.2.2.3.Nuôi cấy mốc trên khay I.2.3. Qui trình sản xuất II. Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase II.1. Nguyên liệu
II.2. Qui trình công nghệ II.3. Thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae II.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm II.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng enzym II.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Phần IV : Ứng dụng và kết luận I.Ứng dụng I.1.Ứng dụng amylase trong sản xuất bia I.2. Ứng dụng amylase trong sản xuất cồn I.3.Ứng dụng amylase trong chế biến thực phẩm gia súc I.4.Ứng dụng enzym amylase trong công nghiệp dệt II.Kết luận Phần V: Phụ lục và tài liệu tham khảo Lời giới thiệu: Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid,…. Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá và giai đoạn đường hoá. Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên, trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ phân tinh bột bằng acid và bằng enzym. Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl và H2SO4. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzym để thuỷ phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển. Enzym amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Enzym amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật và VSV. Amylase càng ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở qui mô công nghiệp. Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được tách chiết từ VSV, cụ thể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng. Ngoài ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh
bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường. Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắp, khoai mì,… đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nước ta. Do đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển. Ví dụ: sản xuất bánh kẹo, bia, cồn, sirô và làm mềm vải,… Phần I: Tổng quan về enzym amylase I.Amylase là gì? Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: RH +R.R’ + H-OH R’OH Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( enzyme nội bào ) và exoamylase ( enzyme ngoại bào ). Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase ( hay α- dextrin 6 – glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6- glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen: • Tinh bột: là nhóm Carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì… , trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n.Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin ( Meyer, 1940 ). Các loại tinh bột đều có 20-30% amylase và 70-80% amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng. -Amylase có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da, được cấu tạo từ 200- 1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh. -Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da, được
cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4- glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch tinh bột bị đun nóng ( 60-850C ) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh bột . Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: Dịch hóa và đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose. -Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng cho cơ thể con người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose. Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là đường và tinh bột. • Glycogen: là một loại Cabohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ trong cơ thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, VSV, glucogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glycoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glycoside. Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2 triệu-3 triệu Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều Carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan. II.Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym α-amylase II.1.Đặc tính của enzym α-amylase α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme: - α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine. - Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956;Fisher,Stein, 1960 ). - Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. - Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. -Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 ). -α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme ( Modolova, 1965 ). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn
tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại như :Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase. Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau ( g/100 g protein ): alamine=6,8 ; glycine= 6,6; valine= 6,9, leucine= 8,3; Isoleucine= 5,2; prolin= 4,2, phenylalanine= 4,2; tyrosine=9,5; trytophan= 4,0; xetin= 6,5; trionin= 10,7, cystein + cystine= 1,6; glutamic acid= 6,9; amide= 1,5 ( Akabori et amiloza, 1954 ). Không giống các α-amylase khác, amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide. Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên 1 mol enzyme ( Akabori et amiloza, 1965 ). Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme. α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và maltose. Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) . Fenikxova và Eromsina (1991) cho biết rằng các maltopentose và maltohexose bị thủy phân theo sơ đồ sau:  G4+G1; G6G5 G2 + G4 hay 2G3 ( chính ) hoặc G5 + G1 ( ít ) α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzym α-amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh. Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Khi dùng nồng độ α-amylase VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84-87%. Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0-4,8 (
có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5-5,8 ). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae trong vùng 5,6-6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-amylase của Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH= 3,6 và 0oC, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ). Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH= 5,0-5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5- 2,8.Ở 0oC và pH= 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. . Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 70OC( Kozmina, 1991 ). Trong dung dịch đệm pH= 4,7, α-amylase của Asp.oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22-29%, hoạt lực đường hóa còn 27-85%. Ở 500C trong 2 giờ, α- amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và cộng sự ). II.2. Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase α-amylase ( 1,4-α-glucan-glucanhydrolase ). α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc đột rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn. + Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ):Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ). + Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose( vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc
glucopiranose 1 ). + Sau đó, các poliglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α- 1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase: + Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp + Giai đoạn đường hóa: Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide Amylase oligosacharide poliglucose Maltose maltotriose maltotetrose III.Lịch sử phát hiện eznym Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá trình lên men. Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của mầm đại mạch có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ thường. Đây là công trình đầu tiên thu được chế phẩm ở dạng dung dịch và lịch sử enzyme học thực sự được xem như bắt đầu từ đây. Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Pessoz đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột. Thí nghiệm được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa. Kết tủa được hình thành này có khả năng chuyển hóa tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tác dụng chuyển hóa. Danh từ diastase (từ chữ Latinh diastasis - phân cắt) là do Payen và Persoz dùng để gọi enzyme lúc bấy giờ.
Phần II: Phân lập, bảo quản giống VSV – Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường. Quá trình này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp. Bản chất của 2 quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức và phương diện thì khác nhau hoàn toàn. Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn của VSV. Tự tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên. Các VSV và vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp, không đồng đều về chủng loại và về số lượng. Mặt khác, quá trình lên men này không được kiểm soát, bao gồm nhiều pha và không định hướng. Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn định; do dó, chất lượng sản phẩm kém không đồng nhất. Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập giống VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quá trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn ( Sản phẩm tạo ra mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV cho đến cuối quá trình thu nhận sản phẩm ) . Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện . I.Vai trò của giống trong công nghệ enzyme Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định: - Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy - Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hay là hoạt tính enzyme) - Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất - Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm Như vậy, giống VSV có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ VSV II.Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là: - Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng
nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV cần tổng hợp nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác. Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng. - Giống phải cho năng suất sinh học cao. - Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp. - Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động. - Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh. - Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn; dễ dàng tách sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống. - Giống phải ổn định trong bảo quản và dể dàng bảo quản. Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên men công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết. III. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Condium of Aspergillus oryzae Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau… Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào ( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có
khi thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. IV.Qúa trình phân lập giống VSV VSV phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường đến nơi có địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt VSV.Ở những nơi giàu chất hữu cơ, những nơi nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ thế người, động vật, nơi có nhiệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhiệt độ cao. VSV có khả năng thích nghi trong mọi hoàn cảnh môi trường. Chính nhờ khả năng tuyệt vời này mà VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong hoàn cảnh khắc nghiệt nhất. Thông thường để phân lập một giống chủng VSV để thu nhận enzyme thì có 3 cách phân lập: + Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên + Phân lập giống trong điều kiện sản xuất + Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập cho phù hợp nhất. Mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng biệt. Sau đây là 1 số ưu điểm: IV.1.Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên -Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh được thì cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển hóa nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào. Điều này thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme ( ở quy mô sản xuất công nghiệp ) với một loại enzyme thật sự mạnh. -Do phát triển trong điều kiện tự nhiên, VSV phải cùng lúc đối phó với hàng loạt các yếu tố ngoại cảnh và phải phân giải rất nhiều loại cơ chất khác nên VSV bắt buộc phải tổng hợp nhiều loại enzyme với một nỗ lực rất lớn. -Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt đáng kể các giống VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự nhiên, được gọi chung là các chủng VSV hoang dại. Chúng đã quá quen thuộc với sự thay đổi thất thường của điều kiện tự nhiên. Khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với nhiều điều kiện môi trường cố định, đòi hỏi các loài VSV giống phải có một thời gian thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp. Huấn luyện chúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều rất cần thiết. -Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập
trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa và đặc điểm này để chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV sinh tổng hợp enzyme mà ta cần. Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp protease cao, ta phải tìm nơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp amylase ta cần phải tìm nơi có chứ nhiều tinh bột trong tự nhiên. -Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài VSV, VSV trong điều kiện tự nhiên luôn xảy ra những thường biến và đột biến. Những đột biến thường cho ra hai hiệu ứng: Thứ nhất gây cho cá thể c hết; thứ hai là nhiều đột biến tạo ra loài mới có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất cao. Việc tìm ra những đột biến kiểu này thì hết sức có ý nghĩa và rất cần tiến hành. Và một lợi điểm nữa là, những đột biến có lợi kiểu này thường rất bền vững. Rất thích hợp để đưa vào sản xuất ở qui mô công nghiệp. IV.2. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất -Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm. -Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại. -Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men, dịch nước thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả năng thu nhận được những chủng có bản năng sinh tổng hợp cao thường rất cao. IV.3. Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có thể rất nhiều tế bào VSV giống bị thoái hoá, nhưng cũng còn nhiều tế bào không bị thoái hoá. Việc phân lập lại từ nguồn giống này nhiều khi lại đạt được những kết quả tốt. V.Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết
quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm. Quá trình lấy mẫu: Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rủ sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao nyclon và mang về phòng thí nghiệm. Tiến hành thí nghiệm phân lập: Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đó đảo trộn mẫu. Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ông nghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo. Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar). Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày. Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc. Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy. Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột. Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong máy làm đông. -Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ). Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm. Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù. Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi trường sinh trưởng của nấm. KH2PO4 1,4 MgSO4.7H2O 0,1 NH4NO3 10 FeSO4.7H2O 0,01 PH = 6,5 KCl 0,5 hồ tinh bột 20 Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi Autoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ, để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp.
VI. Phương pháp bảo quản giống vsv Mục đích của bảo quản giống VSV dùng trong sản xuất enzym là đảm bảo tính ổn định trong quá trình tổng hợp enzym và tính ổn định của hoạt tính enzym. Có các phương pháp để thực hiện quá trình này như sau: VI.1. Cấy truyền và bảo quản lạnh Phương pháp dựa trên nguyên tắt là VSV sẽ hạn chế quá trình trao đổi chất trong điều kiện lạnh ở một khoảng thời gian nhất định. Trong thời gian này VSV có khả năng bảo tồn được khả năng sinh tổng hợp enzym. Cách thực hiện: Ống giống VSV được cấy truyền vào 3-5 ống nghiệm có môi trường tối thiểu. Trong đó một ống dùng để kiểm tra, một ống dùng cho sản xuất hoặc nghiên cứu và một ống dùng để bảo quản.Có thể làm thêm hai ống để tránh sai sót do thao tác đối với những người mới bắt đầu làm công tác bảo quản giống. Sau khi cấy truyền, ống giống cần được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ lạnh từ 4-70C. Sau thời gian định kỳ, sẽ phải cấy truyền trở lại, thao tác này được thực hiện liên tục. VI.2.Bảo quản giống trong đất hoặc trong cát Phương pháp dựa trên nguyên tắt: Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm thấp, vsv có bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzym trong thời gian dài. Phương pháp này rất phù hợp và có hiệu quả đối với nấm mốc Asp. oryzae. Trước khi sử dụng , đất, cát phải được làm sạch và sấy đến độ ẩm < 5%. Asp. oryzae được nuôi cho đến khi tạo bào tử. Người ta trộn bào tử với đất hoặc cát đã được làm sạch và sấy khô. Sau đó hỗn hợp này cho vào bao, hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường. VI.3.Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc Phương pháp dựa trên nguyên tắt bào tử nấm mốc được giữ trong hạt ngũ cốc đã xử lý nhiệt có độ ẩm < 8% và giữ được khả năng sinh tổng hợp enzym trong một thời gian dài. Người ta thực hiện bảo quản giống trong hạt ngũ cốc như sau: Giống ống nấm mốc được nuôi trong môi trường hạt ngũ cốc cho đến khi tạo nhiều bào tử. Bào tử cùng thành phần môi trường được sấy khô ở nhiệt độ < 50oC cho đến khi độ ẩm < 8%, đưa vào bao, hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường.
Phần III: Công nghệ lên men tạo enzym α-amylase I. Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt Thiết kế công nghệ: Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường được thực hiện theo phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh và một số quá trình lên men truyền thống. I.1.Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát triển trên bề mặt môi trường. Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là: - Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không phức tạp. - Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại. - Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. - Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém. - Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn. Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những ưu điểm cần quan tâm để khắc phục và hoàn thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường ( môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích. I.1.1.Môi trường lỏng Ở môi trườn lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) và pha khí ( không khí ). Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV.
Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay: Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác. Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao. Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong kháy nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý. I.1.2.Môi trường đặc Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc . Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối VSV. VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại , không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý. Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường. Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn(môi trường đặc ) này rất thích hợp cho len men ở nấm mốc Asp.oryzae.
I.2.Qui trình sản xuất nấm mốc giống I.2.1Nguyên liệu cho sản xuất mốc giống Gạo nếp:Nước 14% ,Glucid 79,4%, Lipid 1,5% và protein 8,2% trong đó Protein của gạo nếp chủ yếu là glutein(oryzaine)và glubuline ngoài ra còn một ít lẫn Cozine và Prolamin. Glucid của gạo nếp chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose và hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin.Ngoài ra còn chứa một số vitamin như B1,B2,B6,PP và E. Gạo tẻ:Nước 13,84%; Glucid 77,55%; Protein 7,35%; Lipid 0,52%; cellulose 0,18% và muối khoáng :0,54%. Bột Mì:Nước 11,6%; Glucid 72%; Lipid 4,8%,Protein 9%; cellulose 1,5% và muối khoáng 1,2%. Bắp mảnh:Nước 11,4%; Glucid 78,9%; Lipid0,8%; Protein8,5%,cellulose 0,4% và muối khoáng 0,4%. I.2.2.Chuẩn bị mốc giống Nuôi cấy giồng bao gồm: -Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm -Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ) -Trên sàng, khay (nhân giống lớn) I.2.2.1.Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển những mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác.Yêu cầu ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một loài VSV nào khác.Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng. I.2.2.2.Nuôi cấy giống trong bình tam giác Cách làm môi trường trong bình tam giác: Môi trường gạo:gạo tẻ loại tốt, nấu cơm như nấu bình thường, hạt cơm chín đều không qúa nhão và không qúa khô. Độ ẩm khoảng 45% để nguội bớp rời thành từng hạt cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm. Đậy nút bình tam giác bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng ở P = 1atm trong vòng 30-45 phút. Môi trường ngô mảnh: Ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5 mm cho nước vào theo tỷ lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn đều trong khay để 1-2 giờ cho
ngấm nước đều. Bóp tơi cho vào bình tam giác khác thành lớp dày 1cm. Đậy nút bình bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng đồng thời làm chín ở P = 1atm, 1200C, trong thời gian 60 phút, lấy ra để nguội lắc cho khỏi vón cục. Môi trường cám: Chọn cám tốt, mới nhưng loại thô không cần mịn hạt, sau đó làm tương tự như đối với ngô mảnh. Thường sử dụng các bình tam giác dung tích 0,3-0,5 lít hay 1 lít có cổ rộng. Sau khi chuẩn bị môi ttrường trong bình thuỷ tinh ta tiến hành nuôi cấy nấm mốc. Trước tiên cần phải chuẩn bị lấy 5ml nước vô trùng cho vào các ống nghiệm. Sau đó, đổ nước vô trùng cho bào tử hoà vào trong nước đồng thời cấy chuyển chúng sang bình tam giác. Trung bình cứ một ống nghiệm có thể cấy chuyển sang 2-3 bình tam giác có dung tích 1 lít, lắc cho giống phân bố đều trong môi trường và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện thích ứng. Thường nuôi khoảng 5-6 ngày là được. Yêu cầu cơ bản trong giai đoạn này là làm sao tạo được nhiều bào tử mạnh khoẻ. Trường hợp nào thấy bình bị nhiễm thì phải loại bỏ ngay. I.2.2.3.Nuôi cấy mốc trên khay Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay: Nguyên liệu thường dùng là ngô mảnh có kích thước 0,2-0,5mm. Trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng lượng so với ngô nếu hấp dưới áp lực cao. Trộn xong để khoảng 3-4 giờ cho ngô ngấm nước đều rồi hấp chín. Thời gian hấp khoảng 3-4 giờ, dài hơn so với thời gian hấp cám hay gạo. Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, không được quá bết hoặc quá khô. Độ ẩm còn lại 45-50% là vừa. Cách gieo cấy và nuôi mốc trên khay: Nguyên liệu dỡ ra, làm nguội nhanh. Nếu ít có thể bóp bằng tay cho tơi ra, nếu nhiều cho qua máy đánh tơi và dùng quạt thổi. Sau khi làm nguội đến 26-280C thì trộn nước giống từ bình tam giác vào với tỷ lệ 0,5-1% hoặc với tỷ lệ cao hơn. Sau khi trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao (0,3m). Đặt ở nhiệt độ 30-320C, độ ẩm 85-100%. Thời gian ủ 6-8 giờ, nhiệt độ khối môi trường lên tới 34-360C và bào tử đã nảy mầm gần hết nhưng chưa thành sợi dài. Lúc này cần rải môi trường thành lớp mỏng 2-3cm cần giữ cho nhiệt độ môi trường không vượt quá 360C. Lượng nhiệt tỏa ra nhiều nhất ở khoảng 10-14 giờ sau khi trộn giống. Sau khi nuôi 34-36 giờ, nhiệt độ khối môi trường bắt đầu giảm, cần phải điều chỉnh nhiệt độ lên 34-350C, để duy trì sự hình thành bào tử của nấm mốc. Thời gian nuôi mốc giống trên khay thường vào khoảng 60 giờ. Nếu thấy hình thành bào tử chậm thì có thể kéo dài đến 70-72 giờ. Mốc giống khi lấy ra thường có độ ẩm 32-35 % có thể dùng ngay làm giống cho công đoạn sản xuất. Nếu không dùng ngay thì phải đem sấy khô đến độ ẩm 8%, giữ dùng dần hoặc là cung cấp giống cho các nơi sản xuất. Nhiệt độ phòng sấy không
được quá 400C. Các bao mốc giống cần được bảo quản nơi thoáng, mát ( có thể bảo quản lạnh 4-50C ) tránh ánh nắng. Thời gian bảo quản tùy điều kiện có thể, từ 1-2 tháng hoặc lâu hơn. I.2.3.Qui trình sản xuất II. Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase
II.1. Nguyên liệu Nguồn tinh bột: Ở nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa dạng và phong phú.Ví dụ tinh bột từ gạo ( gạo tẻ, gạo nếp), ngô (bắp), sắn, …Nhưng để phù hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô công nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm. Do vậy, nguồn nguyên liệu cần được quan tâm và chú trọng về mức độ rẻ tiền và dể kiếm. Đây là một lợi thế rất quan trọng cho nhà sản xuất và cho cả người tiêu dùng để có giá thành thấp và được sản xuất đại trà.Sau đây, giới thiệu một số nguồn nguyên liệu dễ tìm: +Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo: Thành phần dinh dưỡng Đơn vị tính Hàm lượng/100g Protein g 6 Tinh bột g 82 Lipid (tổng số) g 0,8 Cellulse g 0,6 Nước g 10,2 Năng lượng kcal 361 (Viện Nghiên cứu dinh dưỡng thuộc Đại học Mahidol, Thái Lan,1999) - Protein của gạo chiếm khoảng 8-9%, chủ yếu là glutelin và glubuline. Ngoài ra còn cólẫn ít : cozine và prolamin. Lượng protein thoái hoá và biến tính dần trong quá trình bảo quản. - Glucid thì chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin, có chứa một ít chất khoáng như: P,K,Mg,…Ngoài ra còn có một số Vitamin:B1, B2, B6, PP, H, C, E và carotenoid. +Thành phần dinh dưỡng của ngô: Thành phần dinh dưỡng /100g Bắp nếp Bắp ngọt Protein 9,1 12,9 Tinh bột 72,8 69,3 Lipid(tổng số) 2,2 3,9 Cellulose 1,8 2,9 Nước 11,2 9,5 Khoáng 2,9 1,5 (Cortez và Wild-Altamirano,1972)