Đ c tính m t s môi tr ng phân l p và ch n đoán vi khu n gây b nh ặ ộ ố ườ ậ ẩ ẩ ệ
Trong phòng thí nghiệm y tế, để phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh cần phải sử
dụng đến nhiều loại môi trường nuôi cấy và hoá chất thích hợp cho một số thử nghiệm, đặc biệt
là thử nghiệm sinh hoá. Bên cạnh đó, việc đánh giá chất lượng pha chế môi trường đúng quy
cách cũng là một trong những khâu quan trọng trong công tác xét nghiệm vi khuẩn.
Cho đến nay, có nhiều loại môi trường khác nhau được dùng cho phân lập và định danh vi
khuẩn, và thường được xếp thành 3 loại chủ yếu là: môi trường nuôi cấy cơ bản, môi trường tăng
sinh vi khuẩn (có giầu chất dinh dưỡng) và môi trường nuôi cấy chọn lọc. Mỗi loại môi trường sẽ
được sử dụng với những mục đích khác nhau trong nuôi cấy, phân lập và định danh vi sinh vật có
trong mẫu xét nghiệm của bệnh nhân.
1. MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÔNG THƯỜNG
1.1. Môi trường Chocolate agar
Môi trường thạch chocolate là môi trường giầu dinh dưỡng và thường được dùng cho vi
khuẩn Haemophilus, S.pneumoniae và các loài vi khuẩn khó phát triển khác. Đây là môi trường
thạch máu cừu, khi thêm máu cừu vào môi trường cơ bản trong điều kiện nhiệt độ đủ để giải
phóng tế bào hồng cầu và nicotinamid - adenin dinucleotid (NAD). Môi trường đổ đĩa được bảo
quản ở 40C. Đĩa môi trường đã cấy bệnh phẩm được ủ ấm ở nhiệt độ 350C trong khí trường có 5%
CO2, thời gian 18 – 24 giờ, quan sát sự phát triển của vi khuẩn.
1.2. Môi trường Simmons citrate
Môi trường thạch Cimmons citrate được sử dụng cho các trực khuẩn đường ruột gram
âm khác nhau. Giống như nguyên lý sử dụng môi trường acetat của vi khuẩn, để phân biệt các
loại vi khuẩn người ta dựa vào sự khác biệt do khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy
nhất của chủng phân lập. Môi trường có pH khoảng 6,9. Ống môi trường sau khi cấy huyền dịch vi
khuẩn lên mặt nghiêng, để tủ ấm 35oC, quan sát sự thay đổi trong 4 ngày.
1.3. Môi trường Deoxychocolate citrate
Thạch Deoxychocolate citrate là môi trường chọn lọc, môi trường khác nhau dùng cho phân
lập trực tiếp các căn nguyên gây bệnh đường ruột từ phân và bệnh phẩm nước tiểu hoặc gián tiếp
từ canh thang giầu dinh dưỡng như selenite-F. Các thành phần chọn lọc có trong môi trường như
citrate natri và deoxycholate natri đã phối hợp với nhau để ức chế các trực khuẩn đường ruột khác
mà không phải là căn nguyên gây bệnh nguy hiểm.
Thành phần khác nhau ở đây là lactose, căn nguyên gây bệnh đường ruột không lên men
đường sẽ xuất hiện các khuẩn lạc không màu. Nếu lên men đường lactose, xuất hiện những
khuẩn lạc chuyển từ màu hồng sang màu đỏ, đó là kết quả của sự thay đổi pH trong quá trình lên
men đường lactose.
Cấy khuẩn lạc lên môi trường đổ đĩa, ủ ấm 350C/48 giờ. Chất nuôi cấy mà nhiều như mẫu
phân, nước tiểu, hoặc các chất khác của cơ thể thì có thể cấy trực tiếp vào môi trường, ngược lại
nếu chất nuôi cấy ít thì nên làm thêm một bước là cấy vào môi trường tăng sinh trước rồi mới cấy
vào môi trường chọn lọc.
1.4. Môi trường Kligler Iron Agar (KIA)
Môi trường thạch Kligler Iron Agar được sử dụng để nuôi cấy trực tiếp cho trực khuẩn gram
âm lên men đường glucose, đây là đặc điểm cơ bản trong phân loại bước đầu của các trực khuẩn
gram âm. Môi trường này cũng đồng thời thử tính lên men đường lactose, sinh hơi trong quá trình
lên men carbohydrat và sinh H2S. Tất cả những đặc điểm đó đã được sử dụng cho các trực
khuẩn gram âm thuộc họ vi khuẩn đường ruột.
Môi trường KIA gồm glucose và lactose (có thể lên men carbohydrat), đỏ phenol (chỉ thị
pH), pepton (nguồn carbon/nitrogen) và muối sắt cộng với thiosulfate natri. Có 3 hình thái lên
men carbohydrat có thể xảy ra là:
- Acid (màu vàng) phần gốc và kiềm (màu đỏ) phần nghiêng của môi trường, khi đó cho thấy vi
sinh vật lên men đường glucose nhưng không lên men đường lactose.
- Acid (màu vàng) phần gốc và acid (màu vàng) phần nghiêng của môi trường, khi đó
cho thấy vi sinh vật lên men cả đường glucose và đường lactose.
- Kiềm (màu đỏ) phần gốc và kiềm (màu đỏ) phần nghiêng môi trường, khi đó cho thấy vi
sinh vật không thể lên men đường glucose và đường lactose. Các sản phẩm sinh ra không phải là
sản phẩm acid.
Nếu sinh hơi, có hơi ở phần gốc của ống môi trường, môi trường bị chia cắt hoặc đẩy môi
trường lên khỏi đáy ống. Nếu thấy màu đen ở phần gốc ống, vi sinh vật đã sinh ra hydrogen sulfid
gas từ thiosulfid. Phản ứng được đọc sau khi nuôi cấy từ 18 – 24 giờ, nếu môi trường được đọc
quá sớm, vi sinh vật chỉ có thể lên men đường glucose. Nếu đọc qua muộn, các chất gây men
lactose có thể dùng hết lactose và bắt đầu dị hoá pepton, phần nghiêng của môi trường trở lại
màu đỏ.
1.5. Môi trường MacConkey Agar
Thạch MacConkey là môi trường chọn lọc cho các vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột và
các trực khuẩn gram âm khác có trong một quần thể hỗn tạp và phân biệt chúng có lên men lactose
hay không lên men lactose. Muối mật và tinh thể màu tím ức chế hầu hết các vi sinh vật gram dương
nhưng cho phép các trực khuẩn gram âm mọc được. Đường lactose như một nguồn cung cấp
carbohydrat duy nhất. Trực khuẩn gram âm, nếu lên men lactose sẽ sinh ra khuẩn lạc màu hồng
hoặc đỏ. Ngược lại, nếu không lên men lactose thì khuẩn lạc không có màu hoặc khuẩn lạc có màu
trong.
Sau khi đã cấy vi khuẩn lên đĩa môi phân lập, đặt vào tủ ấm 350C, thời gian từ 18 – 24 giờ.
Vi khuẩn có thể lên men lactose mạnh hoặc yếu, sau 24 giờ nuôi cấy sinh ra những khuẩn lạc có
màu hoặc xuất hiện màu hồng nhẹ sau 24 – 48 giờ. Không nuôi cấy kéo dài quá 48 giờ, như thế
có thể làm đảo lộn kết quả.
Thạch MacConkey Sorbitol, có chứa các thành phần giống như thạch MacConkey thông
thường khác nhưng có thêm D-sorbitol. Môi trường này được dùng cho phân lập E.coli O157:H7.
1.6. Môi trường Mueller-Hinton Agar
Môi trường thạch Mueller-Hinton Agar là môi trường trong, dùng cho thử nghiệm tính nhạy
cảm của vi sinh vật với kháng sinh. Môi trường cũng thường được dùng để thử nghiệm sự thuỷ
phân tinh bột. Thạch Mueller-Hinton có chứa hỗn dịch động vật, casamino acid và tinh bột giúp
cho hầu hết các vi sinh vật phát triển. Hơn nữa, có thể cho thêm máu cừu vào công thức cơ bản
để thực hiện thử nghiệm tính nhạy cảm của chủng Streptococci. Khi đun nóng máu cừu tạo thành
chocolate với thạch Mueller-Hinton thì có thể thử nghiệm với các vi sinh vật khó mọc, như
Heamophilus và Neisseria.
1.7. Môi trường dinh dưỡng (Nutrient Agar)
Môi trường thạch dinh dưỡng được sử dụng để phân biệt giữa một số ít loài Neisseria dễ
mọc với các loài Neisseria khác, như N.gonorrhoeae và N.meningitidis. Số ít loài Neisseriae dễ
mọc thì phát triển được trên môi trường thạch dinh dưỡng, ngược lại có nhiều loài không phát triển
được. Thạch dinh dưỡng cũng thường được dùng làm môi trường lưu giữ chủng. Thạch dinh dưỡng
có chứa các chất dinh dưỡng động vật và đặc biệt là hàm lượng protein thấp. Chủng phân lập nào
phát triển được trên môi trường này thì cũng có nghĩa là chủng đó rất dễ mọc và không đòi hỏi bất
cứ thành phần đặc biệt nào.
1.8. Môi trường Oxydative-Fermentative (OF)
Môi trường thạch Oxydative-Fermentative hoặc OF là môi trường luôn được dùng để xác
định cách sử dụng carbonhydrat của vi sinh vật là kiểu oxy hoá, lên men hoặc trơ. Đây là môi
trường rất quan trọng để định danh các trực khuẩn gram âm không lên men đường glucose như:
Pseudomonas, Acinetobacter spp .
Môi trường có chứa một lượng nhỏ pepton để ngăn cản sự tạo thành sản phẩm kiềm, vì các
sản phẩm này có thể trung hoà một lượng nhỏ sản phẩm acid qua quá trình oxy hoá. Lượng lớn
carbonhydrat trong môi trường đã làm tăng số lượng acid mà nó có thể tạo thành. Môi trường cũng
có lượng nhỏ thạch để tạo cho môi trường không rắn cũng không lỏng, tạo điều kiện cho phép acid
tạo thành trên bề mặt và khuếch tán qua môi trường. Màu xanh bromthymol như chỉ thị màu pH để
phát hiện acid.
1.9. Môi trường thử nghiệm tính di động
Mục đích của môi trường thử tính di động là để xác định một vi khuẩn có thể di động được
hay không. Đây là thử nghiệm đặc biệt dùng cho định danh các thành viên của họ vi khuẩn đường
ruột, thường cho 2 loại Shigella và Klebsiella luôn không di động, và các loài Yersinia chắc chắn
di động ở nhiệt độ phòng nhưng không di động ở 350C.
Các vi khuẩn không di động là do không có lông roi, chỉ phát triển ở trong đường cấy và
xung quanh môi trường trong. Các vi sinh vật di động, đã sử dụng lông roi để di chuyển ra ngoài
của đường cấy và xuất hiện mờ khói trong môi trường. Lượng thạch trong môi trường thấp làm cho
môi trường không lỏng, không cứng để cho phép phát hiện di động tốt nhất.
Dùng đầu que cấy chọc thẳng vào môi trường, thận trong di chuyển đầu que cấy trên 1
đường, không chọc que cấy xuông tận đáy tupe. Ủ môi trường nuôi cấy ở 350C. Bản chất lông roi
là protein, do vậy không tạo thành tốt ở nhiệt độ cao, một số nhà sinh vật học thích ủ ở nhiệt độ từ
18 – 200C.
1. 10. Môi trường thạch Salmonella- Shigella (SS Agar)
Thạch Salmonella- Shigella thường dùng để chọn lọc Salmonella và một vài chủng
Shigella từ mẫu xét nghiệm phân. Những vi sinh vật này được phân biệt trên môi trường thạch SS
bằng đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường. Thành phần môi trường SS có chứa muối mật, natri
citrate và xanh brillian, để ức chế các trực khuẩn gram dương và rất nhiều trực khuẩn lên men
đường lactose thông thường khác tìm thấy trong phân. Nếu một vi sinh vật phát triển trên môi
trường và lên men lactose, thì nó sẽ sinh ra acid và thay đổi thành màu đỏ - hồng. Nếu thiosulfate
natri tham gia vào như một nguồn sulfur cho quá trình sinh ra hydrogen sulfid. Nếu hydrogen
sulfid hiện diện trong môi trường thì sẽ tạo thành chất kết tủa màu đen ở giữa khuẩn lạc.
Khuẩn lạc Shigella xuất hiện không màu trên môi trường SS, vì những vi sinh vật này
không lên men đường lactose hoặc sinh hydrogen sulfid. Khuẩn lạc Salmonella không màu và có
điểm đen ở giữa khuẩn lạc, vì vi khuẩn này to lên hydrogen sulfid nhưng không lên men đường
lactose. Khuẩn lạc chuyển từ màu hồng đến màu đỏ cho thấy sinh vật lên men đường lactose,
nếu có màu đen ở giữa thì đó cũng sinh ra hydrogen sulfid. Nếu Proteus phát triển trên môi
trường này thì khả năng tạo thành những đám sẽ bị hạn chế.
1. 11. Môi trường Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS)
Môi trường thạch Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose là môi trường chọn lọc dùng để
phân lập các loài Vibrio từ mẫu xét nghiệm phân có lẫn với vi khuẩn chí khác. Các loài Vibrio
được phân biệt bằng đặc điểm do khuẩn lạc sinh ra trên môi trường. Các kiểu khuẩn lạc khác
nhau được sinh ra từ các loài Vibrio khác nhau, thể hiện qua sự lên men của sucrose. Ví dụ:
V.cholerae và V. alginolyticus sinh ra các khuẩn lạc màu vàng, vì chúng lên men đường sucrose,
ngược lại V. parahaemolyticus và V.vulniticus luôn sinh ra khuẩn lạc màu xanh do thiếu lên men
sucrose. Vi sinh vật Vibrio không sinh ra hydrogen sulfid.
Khi dùng thạch TCBS, chúng ta nên dùng chất nuôi cấy đặc, những loài Vibrio dễ chết đột
ngột và môi trường này có để ngăn chặn được điều đó. Mẫu xét nghiệm tươi là tốt nhất, vì vi sinh
vật này nhạy cảm với điều kiện khô, ánh sáng và pH acid. Nếu xử lý chậm thì nên sử dụng môi
trường Cary-Blair để vận chuyển bệnh phẩm tốt hơn là môi trường vận chuyển có đệm glycerol.
Đĩa môi trường nuôi cấy nên ủ ở nhiệt độ 350C, thời gian từ 18 – 24 giờ, dài nhất là 48 giờ. Không
lấy khuẩn lạc ở môi trường TCBS để làm thử nghiệm oxydase.
1.12. Môi trường Esculin Agar
Môi trường thạch esculin là môi trường phân biệt khả năng thủy phân esculin của vi khuẩn.
Những sản phẩm thuỷ phân từ phản ứng esculin với muối sắt có trong môi trường gây ra kết tủa
các thành phần iron, và sản phẩm của sự kết tủa đó làm đổi màu của môi trường từ màu xám tới
màu đen. Cấy vi khuẩn lên phần nghiêng của môi trường, ủ ở 350C trong điều kiện hiếu khí và
quan sát sự phát triển, môi trường có màu đen cho thấy có sự thủy phân esculin.
1.13. Môi trường Methyl Red-Voges-Proskauer (MR-VP)
Môi trường canh thang MRVP dùng cho các thử nghiệm đỏ methyl và Voges-Proskauer.
Quy trình này dùng để phân biệt các thành viên thuộc họ Enterobacteriaceae (họ vi khuẩn đường
ruột), ví dụ: E.coli, đỏ methyl dương và Voges-Proskauer âm; Enterobacter aerogene và
Klebsiella pneumoniae cho các phản ứng ngược lại. Các thành viên thuộc họ vi khuẩn đường ruột
được chia thành 2 nhóm dựa trên cách chuyển hoá đường glucose. Một nhóm sản sinh ra một
lượng lớn hỗn hợp acid (lactic, formic, succinic, acetic). Khi cho thuốc thử đỏ methyl vào một trong
các vi khuẩn thuộc nhóm này, màu đỏ xuất hiện do pH có tính acid. Nhóm thứ 2 sản sinh chủ yếu
các sản phẩm trung tính, acetoin hoặc acetyl-methylcarbinol.
Thử nghiệm đỏ methyl, canh khuẩn phải được ủ ấm 48 giờ. Lấy vào mỗi ống nghiệm 0,5
đến 1 ml canh khuẩn, ủ 350C, thời gian 18 – 24 giờ là có thể thực hiện được thử nghiệm. Trong
quá trình thử nghiệm, lắc ống nghiệm để canh khuẩn hấp thụ oxy và tăng thêm phản ứng.
1.14. Môi trường Blood Agar
Môi trường thạch máu (Blood Agar) là môi trường thường xuyên dùng để nuôi cấy các vi
khuẩn không khó mọc lắm. Môi trường được pha chế hoặc thạch triptic soy cơ bản được làm giầu
thêm bằng cách thêm 5 – 10% máu cừu, máu thỏ hoặc máu người đã phá vỡ sợi fibrin. Sự kết
hợp của máu không chỉ cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển mà còn cho phép phát
hiện đặc tính tan máu của vi khuẩn.