ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR BÁN ĐỊNH LƯỢNG
VÀ ĐỊNH LƯỢNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ SAO CHÉP
CỦA HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN Ở MÔ
UNG THƯ
Phương pháp PCR bán định lượng và định lượng là những phương
pháp đơn giản, chính xác và cho độ tin cậy tương đối cao được sử dụng rất
rộng rãi để xác định mức độ biểu hiện của mỗi gen được khuyếch đại sau
mỗi phản ứng PCR.
Mục tiêu: Sử dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng
để đánh giá mức độ sao chép của Heparansulphat Interacting Protein (HIP) ở
mô ung thư so với mô lành tính; so sánh kết quả của 2 phương pháp trên.
Phương pháp: Tách triết mRNA tổng số từ mô ung thư và lành tính;
tổng hợp cDNA; xác định mức độ sao chép của HIP sử dụng phương pháp
PCR bán định lượng và định lượng.
Kết quả: Cả phương pháp này đều cho kết quả tương tự như nhau;
HIP được tăng cường sao chép rất rõ ở những mô ung thư trong khi đó phát
hiện được rất thấp trên mẫu lành tính.
Kết luận: Mức độ biểu hiện của HIP ở mô ung thư và mô lành tính
khác biệt nhau một cách rõ rệt. Chúng ta có thể dùng một trong hai phương
pháp PCR bán định lượng và định lượng trên để đánh giá mức độ sao chép
của HIP trong chẩn đoán bệnh ung thư.
ABSTRACT
Semiquantitative PCR and quantitative PCR are accurate and simple
methods. They are commonly used to determine amplified gene levels in
PCR reaction.
Objective: Using semiquantitative PCR and quantitative PCR
methods to determine HIP transcript levels in cancer and normal tissue; to
evaluate sensibility of tow methods.
Methods: mRNA was extracted from cancer and normal tissues,
cDNA synthesis by reverse transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR);
HIP transcript determination using semiquantitative PCR and quantitative
PCR methods.
Results: Both methods showed the same results: HIP transcript was
up regulated in cancer tissues.
Conclusion: Levels of HIP transcript was different between cancer
tissue and the normal control. Semiquantitative PCR and quantitative PCR
are useful methods to determine HIP transcript for cancer diagnosis.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Heparin và heparansulfate (HP/HS) là đại phân tử mang điện âm với
độ sulphate hóa rất cao, chính vì vậy chúng có khả năng tương tác với nhiều
loại protein trong các quá trình sinh học khác nhau và đóng vai trò rất quan
trọng trong việc hình thành và duy trì cấu trúc chức năng của tế bào(6).
Daniel D. Carson và cộng sự đã phát hiện ra một protein bề mặt tế bào biểu
mô thận người và một số dòng tế bào khác, protein này được đặt tên là
Heparansulphat Interacting Protein (HIP)(2). Đây là một protein có chiều dài
155 aa với trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa(3). Khi nghiên cứu sâu hơn về
chức năng sinh học của HIP các tác giả đã phát hiện ra rằng HIP cũng có
chức năng tương tự như những protein gắn ái lực với HP/HS và chúng được
tổng hợp nhiều ở các dòng tế bào nội mạc và tế bào biểu mô trưởng thành.
Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng HIP được tăng cường tổng
hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư ở cả mức độ RNA thông tin và protein
như: ung thư tuyến giáp trạng và ung thư vú, ung thư đại tràng... Đặc biệt
mức độ biểu hiện của HIP liên quan chặt chẽ với quá trình phát triển và xâm
lấn của ung thư và phụ thuộc vào mức độ ác tính của các dòng ung thư(1,7).
Việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế ung thư ở mức độ phân tử, từ đó tìm ra
phương pháp chẩn đoán hữu hiệu và điều trị sớm là một lĩnh vực đang được
rất nhiều nhà khoa học quan tâm. Trong một vài nghiên cứu gần đây, bằng
phương pháp RT-PCR chúng tôi đã phát hiện thấy mRNA của HIP được sao
chép với một lượng đáng kể trong mô ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt
trong khi đó không phát hiện được hoặc phát hiện rất thấp ở mô u xơ(4,5).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp RT-PCR bán định
lượng và định lượng để xác định mức độ sao chép của HIP ở mô ung thư, từ
đó so sánh kết quả, đánh giá độ tin cậy của 2 phương pháp trên để ứng dụng
chúng xác định mức độ sao chép của HIP và các gen khác trong chẩn đoán
bệnh ung thư.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng
30 bệnh nhân ung thư được chẩn đoán xác định dựa trên lâm sàng, cận
lâm sàng (siêu âm, hoá sinh, mô bệnh học) tại Bệnh viện K Hà nội. Chúng
tôi sử dụng 15 mẫu mô lành tính để làm đối chứng.
Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết mRNA và tổng hợp cDNA
RNA tổng số được tách chiết từ mô ung thư theo quy trình chuẩn đã
được mô tả trước đây(5). 5µg RNA tổng số được sử dụng để tổng hợp chuỗi
cDNA bổ xung bằng phản ứng reverse transcript-polymerase chain reaction
RT- PCR.
Phương pháp PCR bán định lượng
Cặp mồi đặc hiệu với HIP có trình tự như sau: HIP-F: 5’-GCT TAT
GGT GCA GAC ATG G -3’; HIP-R: 5’-CAG AGA TAT CTA CTC TGA
AGC-3’. PCR được tiến hành với tổng thể tích 20µl gồm: 4 µl cDNA, 2 µl
10x Ex Taq Buffer, 2 µl 2.5mM dNTPs, 10 pmol mồi xuôi và ngược, 1 unit
Ex Taq Polymerase (Takara Bio Inc.Kyoto, Japan). Chu trình nhiệt của phản
ứng PCR như sau: Biến tính 940C - 5 phút, 35 chu kỳ ฀940C - 50 giây, 580C
- 50 giây, 720C - 50 giây฀, 720C - 5 phút. Sử dụng gen nội chuẩn GAPDH
để đánh giá chất lượng RNA và so sánh lượng mẫu sử dụng trong phản ứng