B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Ộ Ụ Ạ
TR ƯỜ NG Đ I H C K THU T CÔNG NGH TP.HCM Ậ Ạ Ọ Ỹ Ệ
KHOA MÔI TR NG VÀ CÔNG NGH SINH H C ƯỜ Ọ Ệ
BAI BAO CAO
̀ ́ ́
̣
CÔNG NGHÊ ENZYME VA ̀ PROTEIN
GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN
̃ ̣ ́
SVTH: TH I TH BÍCH NGA
Ờ
Ị
TP.HCM, thang 04 năm 2011 ́
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
M C L C Ụ Ụ
Trang 2
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
NG PROTEIN THEO PH NG PHÁP BRADFORD BÀI1: XÁC Đ NH HÀM L Ị ƯỢ ƯƠ
1. Thu nh n ch ph m enzyme cellulose thô. ẩ ế ậ
a. Th c hành. ự
- Cân 5 g CPE cho vào c c và tách b ng n ằ ố c v i t l ướ ớ ỉ ệ là 1:5, t c 5 g + 25 ứ
ml n c c t. ướ ấ
- Khu y đ u trong th i gian 30 phút. ề ấ ờ
- L c l y d ch chi t và đ c th tích là 21 ml. ọ ấ ị ế ượ ể
- T a b ng c n l nh v i t l 1:3, t c 21 ml d ch chi t + 63 ml c n l nh. ủ ằ ồ ạ ớ ỷ ệ ứ ị ế ồ ạ
- Cho h n h p dung d ch trên vào bình erlen và gi l nh 30 phút. ỗ ợ ị ữ ạ
ph n d i bình v i th tích là 25 ml và cho vào - Tách l y ph n t a ấ ầ ủ ở ầ ướ ể ớ
ng ly tâm 50 ml. ố
- Đem cân phân tích đ c 33.4 g. ượ
- Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút.
- Tách l y protein t a, gi l nh đ xác đ nh hàm l ữ ạ ể ị ượ ạ ng protein và ho t
ấ tính enzyme tr ủ c s c ký. ướ ắ
b. K t qu . ả ế
Hình 1: D ch chi t trong bình erlen ị ế
Trang 3
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Hình 2: D ch t a protein trong ng ly tâm 50 ml ủ ố ị
ng protein chu n. 2. D ng đ ự ườ ẩ
a. Th c hành. ự
- Dung d ch m u protein, c th trong bài này là m u enzyme cellulose c n xác
ụ ể
ẫ
ầ
ẫ
ị
đ nh. ị
0C. Khi dùng pha loãng 100 l n, đ
- Dung d ch albumin 0.1mg/ml: Cân chính xác 10mg albumine pha trong 100ml ượ c 20
ị ướ ấ
ầ
ắ ề
n dung dich albumine có n ng đ 0,01mg/ml.
c c t. L c đ u cho tan. Gi ữ ở ộ
ồ
- Dung d ch thu c th Bradford : ố
ử
ị
Coomassie Brilliant blue : 0,001g
Ethanl tuy t đ i 4,7g
ệ ố
Acid photphoric 85%: 8,5g.
• Hóa ch t ấ
Trang 4
-
ẩ
ượ
ự c làm tan trong ethanol trong chai đ ng
Ph m màu Coomassie Brilliant Blue đ có n p, b sung acid photphoric 85% và ch nh t
i 100ml b ng n
c c t.
ắ
ổ
ỉ
ớ
ằ
ướ ấ
• Thi
ế ị
t b : máy quang ph . ổ
b. L p đ th chu n. ẩ ồ ị
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Đ dung dich albumine chu n có các n ng đ t
ộ ừ
ể
ẩ
ồ
10-50 µg/ml ta th c hi n nh sau: ự
ư
ệ
ng chu n protein( Albumine):
- D ng đ ự
ườ
ẩ
2
3
4
5
1
S ng ố ố
ộ
ồ
20 1 0 2
30 1 0 2
40 1 0 2
50 1 0 2
Đ iố ch ngứ 0 0 1 2
10 1 0 2
N ng đ albumin (µg) V(ml) albumin H2O (ml) Thu c th Coomassie ử
ố
ậ
• Quan sát b ng m t th
ng, theo th t
ắ
ằ
t ứ ự ừ ả
ườ ạ
ứ
ố
ố ph i sang trái ta th y: ng đ i ế ố
ấ ố ố
ố ng s 1 đ n ng s 5
ừ ố
ệ
ch ng có màu xanh nh t nh t, và các ng thí nghi m t ấ có màu xanh đ m d n nh hình 3. ư
ầ
ậ
Hình 3: K t qu so màu.
ế
ả
• K t qu đo đ h p th (OD)
c sóng 595 nm:
ộ ấ
ụ
ế
ả
b ở ướ
c. K t qu . ả ế
Trang 5
ố
ứ
S ng ố ố OD
Đ i ch ng 0
1 0.088
2 0.131
3 0.161
4 0.188
5 0.209
ng protein chu n.
• D ng đ ự
ườ
ẩ
c sóng 595 nm, ta d ng đ
ụ
ế
b ở ướ
ự
ượ c
ả ng protein chu n nh sau:
D a vào k t qu đo đ h p th (OD) ự đ ẩ ườ
ộ ấ ư
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
• D aự
ế d. Nh n xét k t ậ qu :ả
vào k tế qu soả màu ta
• D a vào k t qu đo đ h p th (OD) ta th y, n ng đ
th y, n ng đ ồ ấ ộ albumin càng cao thì màu xanh càng đ m.ậ
ỉ ố
ộ ấ ự ụ ả ấ ồ ộ albumin càng cao ế thì ch s OD càng cao.
ng chu n c a đ ng glucose .
3. D ng đ ự
ườ ẩ ủ ườ
a. Th c hành. ự
0C
- C n 96 ồ
-
Sodium acetate
- Acid acetic 1M
- C ch t ơ ấ
- Dung dich c ch t CMC pH5
ơ ấ
- Dung d ch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS)
ị
• Hóa ch tấ
Trang 6
- Dung d ch lactose ị
- Dung d ch DNS-lactose
ị
- Dung d ch enzyme ị
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
- Máy ly tâm.
t, máy đo quang ph , máy Vortex, pH k , cân phân tích.
- B n nhi ộ ổ
ệ
ế
ổ
- B p đi n. ế
ệ
- Ch u n
c l nh.
ậ ướ ạ
- Que khu y th y tinh. ấ
ủ
• D ng c và thi ụ ụ t b ế ị
• Hòa tan 100 ml glucose monohydrate v i 80 ml n
c c t và chuy n vào bình
ể
ướ ấ c c t đ n v ch và l c đ u.
đ nh m c 100 ml, thêm n ị
ứ
ắ ề
ớ ạ
ướ ấ ế
• Th c hi n m t lo t 6 ng nghi m.
ự
ệ
ệ
ạ
ộ
ố
ố
ộ
ng sỐ N ng đ glucose (mg/ml) ộ ml dd glucose (1mg/ml)
ml n
c c t ướ ấ
ml dd CMC pH5 ml dd DNS-lactose
ĐC 0 0 1 1 2
1 0.1 0.1 0.9 1 2
2 0.2 0.2 0.8 1 2
3 0.3 0.3 0.7 1 2
4 0.4 0.4 0.6 1 2
5 0.5 0.5 0.5 1 2
• L c đ u các ng nghi m này, đem đun sôi cách th y trong 15 phút. Làm l nh ạ
ố
ệ ằ
ụ ủ ố
c sóng 540 nm b ng 0. Đo đ h p th c a các ng còn l
c l nh. Đ t đ h p th c a ng đ i ố i
ủ ặ ộ ấ ụ ủ
ộ ấ
ố
ạ ở ướ c b
ắ ề t đ phòng b ng ch u n đ n nhi ế ệ ộ b ch ng ứ ở ướ sóng 540 nm và ghi l
ậ ướ ạ ằ i k t qu . ả
ạ ế
c. K t quế
b. L p đ th chu n ẩ ồ ị ậ
ả:
Trang 7
• Quan sát b ng m t th
t
ằ
ắ
ứ ự ừ
ườ
ả
ố trái sang ph i ta th y: ng đ i ng thí ậ
ấ ố ầ ừ ố
ứ
ng, theo th t ch ng có màu vàng, các ng thí nghi m có màu đ và đ m d n t ỏ ệ ố nghi m s 1 đ n ng thí nghi m s 5 nh hình 4.
ế ố
ư
ệ
ệ
ố
ố
Hình 4: K t qu so màu.
ế
ả
• K t qu đo đ h p th (OD)
c sóng 540 nm
ộ ấ
ụ
ế
ả
b ở ướ
ố
ng sỐ OD
4 0.504
5 0.675
3 0.392 ng glucose
ĐC 0 • D ng đ ự
1 0.149 ườ
2 0.253 ng chu n đ ẩ ườ
c sóng 540 nm, ta d ng đ
ộ ấ
ụ
ả
b ở ướ
ự
ượ c
ng glucose nh sau:
ng chu n đ
D a vào k t qu đo đ h p th (OD) đo ự đ ườ
ế ẩ ườ
ư
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Trang 8
d. Nh n xét k t qu : ả
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
• D a vào k t qu so màu ta th y, n ng đ đ
ế ậ
c c t càng gi m thì màu
càng cao, đ ngồ
ườ
ể
ả
ậ
ồ ộ ườ ấ ả ng glucose càng cao và th tích n ng glucose ướ ấ ự ế th i th tích đ ể ờ đ càng đ m. ỏ
c c t càng
• D a vào k t qu đo đ h p th (OD) ta th y, n ng đ ộ đ ể
ườ
ể
ng glucose ướ ấ
ả
ự ấ ồ ụ ườ ng glucose càng cao và th tích n ả ờ ộ ấ càng cao, đ ng th i th tích đ gi m thì ch s OD càng cao. ế ồ ỉ ố
Trang 9
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Bài 2: CÁC Y U T NH H
NG HO T TÍNH C A ENZYME
Ế Ố Ả
ƯỞ
Ủ
Ạ
1.
nh h
t đ đ n ho t tính c a enzyme (30
0C – 700C)
Ả
ưở
ng b i nhi ở
ệ ộ ế
ủ
ạ
a. Nguyên t cắ
- D a vào s th y phân c ch t CMC c a enzyme,
ự
ự ủ
ơ ấ
ệ ộ
ủ
nh ng nhi ở ữ ả
t đ khác ỉ ố
ế
nhau là 300C, 400C, 500C, 600C, và 700C. Cho k t qu so màu và ch s OD, khác nhau
c sóng 540 nm.
b ở ướ
b. Th c hành ự
ớ - Chu n b 7 ng nghi m: 1 ng đ i ch ng, 1 ng không ph n ng v i ố
ả ứ
ố
ẩ
ố
ệ ứ enzyme, 5 ng có ph n ng v i enzyme. ả ứ
ị ố ố
ớ
•
ng đ i ch ng :
Ố
ứ
ố
- Hút 1 ml H2O cho vào ng nghi m.
ệ
ố
-
Thêm 2ml dung dich DNS-Lastose và l c đ u.
ắ ề
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
ị ắ 5 vào ng nghi m ch a enzyme và l c ứ ệ ố
đ u.ề
t đ phòng ủ ế ệ ộ
- Đem đun sôi cách th y trong 15 phút. Làm l nh đ n nhi c l nh. Đo đ h p th trong ch u n c sóng 540 nm. ạ b ụ ở ướ ậ ướ ạ ộ ấ
• ng nghi m không có ph n ng enzyme Ố ả ứ ệ
- Hút 1 ml dung d ch enzyme cho vào ng nghi m đun sôi 10 phút đ ệ ố ể
ị b t ho t enzyme. ấ ạ
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
- Thêm 2 ml dung d ch DNS-lactose và l c đ u. ắ ề ị
ị ắ 5 vào ng nghi m ch a enzyme và l c ứ ệ ố
đ u.ề
- Đem đun sôi cách th y trong 15 phút. Làm l nh đ n nhi t đ phòng ệ ộ
ủ c l nh. Đo đ h p th ế ạ b c sóng 540 nm. ụ ở ướ ộ ấ trong m t ch u n ộ ậ ướ ạ
- Hút 1 ml dung d ch enzyme cho vào ng nghi m 1 và
• 5 ng nghi m có ph n ng enzyme, đ c đánh s t ả ứ ệ ố ượ ố ừ 1 đ n 5. ế
ủ ở ệ ị
nhi ứ ể
5 thích h p
ố ờ t đ phòng. ệ ộ t đ phòng (300C) trong 10 phút. Đ ng th i, ta cũng đ chai ch a dung ồ nhi d ch CMC pH ệ ộ ị ợ ở
Trang 10
- Hút 1 ml dung d ch enzyme cho vào ng nghi m 2 và
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
ủ ở ệ ố ị
nhi ị ứ ể
- Hút 1 ml dung d ch enzyme cho vào ng nghi m 3 và
ờ 0C. nhi ệ ộ t đ 400C trong 10 phút. Đ ng th i, ta cũng đ chai ch a dung d ch CMC pH5 thích h p ồ t đ 40 ệ ộ ợ ở
ủ ở ệ ố ị
nhi ị ứ ể
- Hút 1 ml dung d ch enzyme cho vào ng nghi m 4 và
ờ 0C. nhi ệ ộ t đ 500C trong 10 phút. Đ ng th i, ta cũng đ chai ch a dung d ch CMC pH5 thích h p ồ t đ 50 ệ ộ ợ ở
ủ ở ệ ố ị
nhi ị ứ ể
- Hút 1 ml dung d ch enzyme cho vào ng nghi m 5 và
ờ 0C. nhi ệ ộ t đ 600C trong 10 phút. Đ ng th i, ta cũng đ chai ch a dung d ch CMC pH5 thích h p ồ t đ 60 ệ ộ ợ ở
ủ ở ệ ố ị
nhi ị ứ ể
-
ờ 0C. nhi ệ ộ t đ 700C trong 10 phút. Đ ng th i, ta cũng đ chai ch a dung d ch CMC pH5 thích h p ồ t đ 70 ệ ộ ợ ở
ị ứ 5 vào 5 ng nghi m ch a ệ ố
Sau đó thêm 1 ml dung d ch CMC pH enzyme trên và l c đ u. ắ ề
- Đ ph n ng nhi t đ thích h p chính xác 10 phút. ả ứ ở ể ệ ộ ợ
ả ứ - Thêm 2 ml dung d ch DNS-lastose và l c đ u đ ng ng ph n ng ể ừ ắ ề ị
t đ phòng trong
ủ
ế
ệ ộ
- Đem đun sôi cách th y trong 15 phút. Làm l nh đ n nhi c l nh. Đo đ h p th
m t ch u n
ạ c sóng 540 nm. b ụ ở ướ
ướ ạ
ộ ấ
ậ
ộ
c. K t quế
ả
- Quan sát b ng m t th
ng, t
ph i sang trái theo th t
ắ
ằ
ườ
ừ ả
ứ
ế ố
ỏ ậ
ệ
ố
ố t là: ng l n l ứ ự ầ ượ ố ở ng thí nghi m s 1 ệ ừ ố ố ở 600C màu đ đ m d n, và ng nghi m s ố ầ
đ i ch ng và ng không ph n ng có màu vàng, t ố ố 300C đ n ng nghi m s 4 5
ả ứ ư
ỏ
ệ ở 700C màu đ nh t d n nh hình 5. ạ ầ
Hình 5: K t qu so màu.
ế
ả
enzyme.
Trang 11
- K t qu đo đ h p th (OD)
c sóng 540 nm là:
ộ ấ
ụ
ế
ả
b ở ướ
S ng ố ố OD
ĐC 0
KPƯ 0.232
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
d. Tính toán k t quế
ả
300C 1.15 400C 1.431 500C 1.55 600C 1.568 700C 1.515
các nhi ự ệ ộ
0C,400C, 500C, 600C, c ch s OD ỉ ố
t đ khác nhau 30 ả ứ ở ủ ố ỉ ố ỉ ố ượ
t là: D a vào ch s OD 700C và ch s OD c a ng không ph n ng, ta tính đ l n l ầ ượ
OD30 = 0.918
OD40 = 1.199
OD50 = 1.138
OD60 =1.336
OD70 = 1.285
Th vào ph ng trình: y = 1.303x + 0.003 ta đ c: ế ươ ượ
X30
T ng t cách tính trên ta đ c: ươ ự ượ
X40 = 0.92
X50 = 0.87
X60= 1.023
X70= 0.98
M t khác ta có ph ng trình : ặ ươ
U= ( At – A0)*F *
Th x vào ph ng trình U ta đ c: ế ươ ượ
U30 = 0.702*0.75*
Trang 12
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
U40 = 153.4
U50 =199.9
U60 = 222.7
U70 = 213.8
e. V đ th . ẽ ồ ị
f. Bi n lu n s đ : ậ ơ ồ
t đ ta v đ D a vào ch s U và nhi ỉ ố ự ệ ộ c đ th : ẽ ượ ồ ị
ệ
• D a vào đ th ta th y: ồ ị ự ấ
0C. Vì
- Ho t tính eyme đ t c c đ i tính enzyme th y phân t
t đ 60 nhi ạ ạ ự ạ ở ệ ộ ở ệ ộ ạ t đ này ho t
-
nhi t nh t. ấ ủ ố
t đ 30 t đ cho enzyme ệ ộ
0C, 400C, 500C, 700C không đ nhi ủ ậ
-
Ở ệ ộ ủ th y phân. Vì v y hi u su t th y phân gi m. nhi ủ ệ ả ấ
0C thì enzyme d n d n b bi n tính nên hi u su t th y ủ ị ế
nhi ệ ầ ấ ầ
t đ 70 Ở ệ ộ phân gi m d n. ầ ả
g. Đánh giá k t qu : ả ế
D a vào k t qu so màu ta th y: ả ự ế ấ
- M u đ i ch ng có màu vàng là màu c a thu c th DNS pha loãng ử ủ ố ố
ẫ v i 1ml n ớ ứ c c t. ướ ấ
Trang 13
-
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
ng không ph n ng có màu vàng đ m, ch ng t ứ ậ
ỏ ở ủ ị ấ
-
đây ho t tính Ố ạ enzyme b b t ho t nên không x y ra quá trình th y phân gi a ữ ả 5. enzyme và dung d ch CMC pH ả ứ ạ ị
0C. Ch ng t
nhi ả ứ
ừ ệ ộ t đ 30, 40 và 50 ứ ệ t
0c có màu đỏ ệ ộ nhi t đ 30, 40 đ n 50 ỏ ế 0C thì ho t tính enzyme tăng d n. ầ ạ
-
ớ t ứ ự ừ 30, 40 đ n 50 ng có ph n ng v i enzyme t Ố đ m d n theo th t ầ ậ đ tăng d n t ộ nhi ế ầ ừ
nhi t đ 60 nhi ệ ộ ứ
0C màu đ đ m nh t, ch ng t ạ ộ
t đ này ho t ạ ỏ ậ ạ ỏ ở ủ ị
-
ấ Ở ệ ộ tính enzyme ho t đ ng m nh nh t. Enzyme th y phân dung d ch ấ CMC càng m nh làm cho màu c a dung d ch có màu đ đ m. ủ ỏ ậ ạ ị
t đ 70 ỏ ả ho t tính enzyme gi m
0C màu đ nh t d n, ch ng t ỏ ứ ị ế
2.
ạ ạ ầ t đ càng cao thì enzyme b bi n tính. nhi Ở ệ ộ d n. Vì nhi ầ ệ ộ
nh h
ng c a pH đ n ho t tính c a enzyme ( pH
3 – pH8 )
Ả
ưở
ủ
ủ
ế
ạ
a. Nguyên t cắ
ự
ự ủ
ơ ấ
ủ
ế
ả
ệ c sóng 540 nm.
D a vào s th y phân c ch t CMC c a enzyme cellulose, trong dung d ch ị các đ m Na-acetate có pH 3, 4, 5, 6, 7, 8. Cho k t qu so màu khác nhau ở b ướ
b. Th c hành ự
ẩ
ả ứ
ứ
ố
ố
ố
ị
- Chu n b 13 ng nghi m: 1 ng đ i ch ng, 6 ng không ph n ng v i ớ ớ
ệ enzyme và 6 ng có ph n ng v i enzyme. ả ứ
ố ố
•
ng đ i ch ng :
Ố
ứ
ố
- Hút 1 ml H2O cho vào ng nghi m.
ệ
ố
Thêm 2ml dung dich DNS-Lastose và l c đ u.
-
ắ ề
Thêm 1ml CMC pH5 vào ng nghi m và l c đ u.
-
ắ ề
ệ
ố
- Đo đ h p th
c sóng 540 nm.
ộ ấ
b ụ ở ướ
•
6 ng không ph n ng đ
c đánh s th t
t
ả ứ
ố
ượ
ố ứ ự ừ
1 đ n 6. ế
-
ệ
ố
ể
Hút 1ml dung d ch enzyme cho vào 6 ng nghi m và đun sôi 10 phút đ ị b t ho t enzyme. ấ
ạ
Thêm 2ml dung d ch DNS-lactose vào 6 ng nghi m và l c đ u.
-
ắ ề
ệ
ố
ị
Thêm 1ml dung d ch CMC pH
-
3 vào ng nghi m s 1 và l c đ u.
ị
ắ ề
ệ
ố
ố
Trang 14
-
Thêm 1ml dung d ch CMC pH
4 vào ng nghi m s 2 và l c đ u.
ị
ắ ề
ệ
ố
ố
-
Thêm 1ml dung d ch CMC pH
5 vào ng nghi m s 3 và l c đ u.
ị
ắ ề
ệ
ố
ố
-
Thêm 1ml dung d ch CMC pH
6 vào ng nghi m s 4 và l c đ u.
ị
ắ ề
ệ
ố
ố
-
Thêm 1ml dung d ch CMC pH
7 vào ng nghi m s 5 và l c đ u.
ị
ắ ề
ệ
ố
ố
-
Thêm 1ml dung d ch CMC pH
8 vào ng nghi m s 6 và l c đ u.
ị
ắ ề
ệ
ố
ố
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
ệ
ủ ấ ả ố t đ phòng trong ch u n ạ t c 6 ng nghi m trong 15 phút. Làm l nh ụ ở ướ b c c l nh. Đo đ h p th ậ ướ ạ ộ ấ
•
6 ng ph n ng đ
c đánh s th t
t
ả ứ
ố
ượ
ố ứ ự ừ
1 đ n 6. ế
- Đem đun sôi cách th y t đ n nhi ệ ộ ế sóng 540 nm.
- Hút 1 ml dung dich enzyme cho vào ng nghi m và ứ
nhi ủ ở ệ ố
0C trong 10 phút.
ệ ộ t đ ị ể ồ ờ
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
3 vào ng nghi m 1 ch a enzyme và
40 400C trong 10 phút. Đ ng th i, ta cũng đ chai ch a dung d ch: CMC pH3, CMC pH4, CMC pH5, CMC pH6, CMC pH7, CMC pH8, thích h pợ ở
ị ứ ệ ố
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
4 vào ng nghi m 2 ch a enzyme và
l c đ u. ắ ề
ị ứ ệ ố
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
5 vào ng nghi m 3 ch a enzyme và
l c đ u. ắ ề
ị ứ ệ ố
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
6 vào ng nghi m 4 ch a enzyme và
l c đ u. ắ ề
ị ứ ệ ố
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
7 vào ng nghi m 5 ch a enzyme và
l c đ u. ắ ề
ị ứ ệ ố
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
8 vào ng nghi m 6 ch a enzyme và
l c đ u. ắ ề
ị ứ ệ ố
- Đ ph n ng
l c đ u. ắ ề
0C chính xác 10 phút.
40 ả ứ ở ể
- Thêm 2 ml dung d ch DNS-lastose vào 6 ng nghi m và l c đ u đ ắ ề ệ ố ị ể
ng ng ph n ng enzyme. ả ứ ừ
ủ ấ ả ố ạ t c 6 ng nghi m trong 15 phút. Làm l nh
t đ phòng trong m t ch u n ệ c l nh. Đo đ h p th - Đem đun sôi cách th y t ệ ộ ậ ướ ạ ộ ộ ấ ụ ở
c sóng 540 nm. đ n nhi ế b ướ
Trang 15
c. K t qu : ả ế
• Quan sát b ng m t th
t
ằ
ắ
ườ
ứ ự ừ
ấ ố
ả
ng, theo th t ố
ừ ố
trái sang ph i ta th y: ng đ i ố ớ ế ố
ả ứ ố
ậ
ố
ố
ố ng s 1 ch ng có màu vàng và 6 ng nghi m không ph n ng v i enzyme, t ệ ứ đ n ng s 2 có màu vàng đ m d n. T ng s 3 đ n ng s 6 màu vàng nh t ạ ừ ố ầ ế ố d n nh hình 6. ư ầ
Hình 6: K t qu so màu c a ng ĐC và 6 ng nghi m không ph n ng.
ả ứ
ủ ố
ế
ệ
ả
ố
• Quan sát b ng m t th
t
ằ
ắ
ườ
ấ ố
ả
ớ
ng s 3
ệ pH
pH
ố ở
ế ố
ừ ố
ầ
ứ ng s 1 ng s 6
pH pH
trái sang ph i ta th y: ng đ i ố ứ ự ừ ừ ch ng có màu vàng và 6 ng nghi m có ph n ng v i enzyme có màu đ . T ỏ ả ứ 5 đ nế 4 màu đ đ m d n, t ố ỏ ậ ố
ng, theo th t ố 3 đ n ng s 2 ố ở 8 màu đ nh t d n nh hình 7. ạ ầ ổ
ố ở ố ở
ư
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Trang 16
Hình 7: K t qu so màu c a ng đ i ch ng và 6 ng nghi m có ph n ng.
ả ứ
ủ ố
ứ
ế
ệ
ả
ố
ố
• K t qu đo đ h p th (OD)
c sóng 540nm:
ộ ấ
ụ
ế
ả
b ở ướ
ố ố
pH3 0.453 0.939
pH4 0.394 0.958
pH5 0.315 0.837
pH6 0.398 0.641
pH7 0.372 0.382
pH8 0.391 0.517
S ng nghi m ệ Không ph n ng ả ứ Ph n ng ả ứ
d. Tính toán k t qu . ả
ế
D a vào k t qu ch s OD và ph
ng trình y = 1.303x + 0.003.
ả ỉ ố
ự
ế
ươ
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Ta có: - T i pH=3: D OD= 0.939 – 0.453 = 0.486 ạ X1 = 0.486 - T i pH=4: D OD= 0.958 – 0.394 =0.564 ạ X2= 0.564 - T i pH=5: D OD= 0.837- 0.398 =0.439 ạ
X3=0.492 - T i pH = 6: D OD = 0.641-0.398=0.243 ạ X4=0.3012 - T i pH = 7: D OD = 0.382-0.372=0.01 ạ X5=0.21 -T i pH = 8: D OD = 0.517-0.391= 0.126 ạ
X6=0.126 c: ượ ừ
T đó ta tính đ U1=81 U2=94 U3=82 U4=50.2
Trang 17
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
U5=35 U6=21
100
90
80
70
60
Series1
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
c s đ sau: e. V s đ : ẽ ơ ồ d a vào ch s u và pH ta v đ ỉ ố ự ẽ ượ ơ ồ
ệ i u là ở pH=4 thì enzyme có ho t tính cao nh t, mà pH t ạ ấ ố ư
ng protein tr
c s c ký.
3. Xác đ nh hàm l ị
ượ
ướ ắ
a. Nguyên t c:ắ
ả ứ
ẽ
ợ
ấ l
ng đ màu t ộ
ỷ ệ ớ v i
ấ
ườ ộ
t ki m th i gian.
Các protein khi ph n ng v i xanh Coomassie s hình thành h p ch t màu có ớ kh năng h p th c ánh sáng b ở ướ ả ụ n ng đ protein trong dung d ch. Ph ị ồ ộ i vài µg protein/ml,d th c hi n và ti hi n t ễ ự ệ ớ
ng pháp có đ nh y cao cho phép phát ạ ờ
c sóng 595nm, c ươ ệ
ệ
ế
i u thì ho t tính c a enzyme s gi m. Vì v y trong môi ấ ạ ẽ ả ố ư ậ ượ ng càng ki m hay càng acid thì ho t tính c a enzyme s gi m. f. Bi n lu n s đ : ậ ơ ồ - Theo đ th trên, ồ ị pH có ho t tính enzyme cao nh t. ạ - V t quá pH t tr ề ườ ẽ ả ủ ạ ủ
b. Th c hành: ự
- L y t a protein thu đ
c s c ký. ấ ủ l n, sau đó ti n hành xác đ nh hàm l ầ bài 1, hòa trong đ m và pha loãng 100 c ệ ượ ở ng protein tr ị ướ ắ ượ ế
ự - Chu n b 2 ng nghi m g m: 1 ng đ i ch ng và 1 ng th c ị ố ứ ệ ố ố ồ ố
ẩ nghi mệ
• ng nghi m đ i ch ng: ch nh quang ph k v đ h p th b ng 0. Ố ổ ế ề ộ ấ ụ ằ ứ ệ ố ỉ
- Hút 1 ml n c c t cho vào ng nghi m. ướ ấ ệ ố
- Thêm 2 ml thu c th Coomassie. ố ử
- Đo đ h p th c sóng 595 nm. ộ ấ b ụ ở ướ
Trang 18
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
• ng th c nghi m: ph n ng enzyme. Ố ả ứ ự ệ
- Hút 1ml dung d ch enzyme cho vào ng nghi m. ệ ố ị
- Thêm 2 ml thu c th Coomassie. ố ử
- Đo đ h p th c sóng 595 nm. ộ ấ b ụ ở ướ
c. K t qu : ả ế
- Quan sát b ng m t th t ằ ấ ố ắ
trái sang ta th y, ng đ i ố ệ ứ ự ừ ự ườ ạ ư ở ố
ng, theo th t ch ng có màu xanh nh t và ng th c nghi m có màu xanh nh ứ hình 8.
Hình 8: K t qu so màu ế ả
- K t qu đo đ h p th c sóng 595 nm có OD = 0.25 ộ ấ b ụ ở ướ ế ả
d. c: Tính toán k t qu thu đ ế ả ượ
Đ ng chu n protein có d ng y = Ax + B ườ ẩ ạ
Ta có đ ng chu n protein là: y = 0.003x + 0.0657 ườ ẩ
Ta l i có: OD = 0.25 ạ
Suy ra: x =
= 61.4 ( µg/ml )
Vì đ c pha loãng 100 l n nên: ượ ầ
Trang 19
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
x = 61.4 (µg/ml)* 100 * 10 (ml) = 61400 ( µg ) = 61.4 (mg)
V y t ng hàm l ng protein là: = 61.4 (mg) ậ ổ ượ
c s c ký.
4. Xác đ nh ho t tính enzyme tr ạ
ị
ướ ắ
i. Nguyên t c:ắ
ự
ươ
ự ủ
ng đ
ơ ấ 5 và 400C. L
ườ
ượ
ở
ượ
ng pháp so màu trên quang ph k
c xác đ nh b ng ph
ớ ị
ươ
ằ
Ph ng pháp này d a vào s th y phân c ch t carboxymethyl cellulose b i enzyme carboxymethyl cellulose ng kh sinh pH ở ử c cho ph n ng v i acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobeenzoic, màu sinh ra ra đ ả ứ sau ph n ng đ ổ ế ả ứ ượ c sóng 540nm. b ở ướ
ii. Th c hành: ự
- L y t a protein thu đ
c s c ký. bài 1, hòa trong đ m và pha loãng 100 c ệ ượ ở ấ ủ l n, sau đó ti n hành xác đ nh ho t tính enzyme tr ị ầ ướ ắ ế ạ
- Chu n b 3 ng nghi m: 1 ng đ i ch ng, 1 ng không ph n ng, 1 ả ứ ị ố ứ ệ ẩ ố ố ố
ng ph n ng. ố ả ứ
• ng nghi m đ i ch ng: ch nh quang ph k v đ h p th b ng 0. Ố ổ ế ề ộ ấ ụ ằ ứ ệ ố ỉ
- Hút 1 ml n ướ c cho vào ng nghi m. ố ệ
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
- Thêm 2 ml dung d ch DNS-lastose và l c đ u. ắ ề ị
ị ắ 5 vào ng nghi m ch a enzyme và l c ứ ệ ố
đ u.ề
t đ phòng ủ ệ ộ
- Đem đun sôi cách th y trong 15 phút. Làm l nh đ n nhi c mát. Đo đ h p th ế ạ c song 540 nm. trong c c n b ụ ở ướ ố ướ ộ ấ
• ng nghi m không có ph n ng enzyme Ố ả ứ ệ
- Hút 1 ml dung d ch enzyme cho vào ng nghi m đun sôi 10 phút đ ệ ố ể
ị b t ho t enzyme. ấ ạ
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
- Thêm 2 ml dung d ch DNS-lactose và l c đ u. ắ ề ị
ị ắ 5 vào ng nghi m ch a enzyme và l c ứ ệ ố
đ u.ề
Trang 20
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
- Đem đun sôi cách th y trong 15 phút. Làm l nh đ n nhi t đ phòng ệ ộ
ế c song 540 nm. trong m t c c n ủ c l nh. Đo đ h p th ộ ố ướ ạ ạ b ụ ở ướ ộ ấ
• ng nghi m có ph n ng enzyme. Ố ả ứ ệ
- Hút 1 ml dung dich enzyme cho vào ng nghi m và ứ
nhi ủ ở ệ ố
ệ ộ t đ ị ể
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
ờ ồ 0C trong 10 phút. 40 400C trong 10 phút. Đ ng th i, ta cũng đ chai ch a dung d ch CMC pH5 thích h p ợ ở
ị ắ 5 vào ng nghi m ch a enzyme và l c ứ ệ ố
- Đ ph n ng
đ u.ề
0C chính xác 10 phút.
40 ả ứ ở ể
ả ứ - Thêm 2 ml dung d ch DNS-lastose và l c đ u đ ng ng ph n ng ể ừ ắ ề ị
enzyme.
- Đem đun sôi cách th y trong 15 phút. Làm l nh đ n nhi t đ phòng ệ ộ
iii. K t qu : ả ế
- Quan sát b ng m t th
ế c sóng 540 nm. trong m t c c n ủ c l nh. Đo đ h p th ộ ố ướ ạ ạ b ụ ở ướ ộ ấ
ố ắ ằ ứ ườ ấ ố
ủ ng ta th y: ng đ i ch ng có màu vàng là ướ ấ Ố c c t. ng ớ
ủ ả ạ
ị ấ ị Ố
đây có x y ra quá trình th y phân gi a enzyme và ị ả ứ ủ đây enzyme b b t ho t nên không x y ra quá trình th y 5. ng có ph n ng có màu ả ứ ủ ỏ ở ữ
màu c a dung d ch DNS-lastose pha loãng v i 1 ml n không có ph n ng có màu vàng là màu vàng c a DNS-lastose, ch ng t ứ phân gi a enzyme và dung d ch CMC pH đ , ch ng t ỏ dung d ch CMC pH ả 5, nh hình 9. ư ỏ ở ữ ứ ị
Hình 9: K t qu so màu ế ả
Trang 21
- K t qu đo đ h p th
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
c sóng 540 nm: ộ ấ b ụ ở ướ ế ả
+ ng không ph n ng có OD = 0.036 ả ứ Ố
iv. Tính toán k t qu thu đ
c:
ế
ả
ượ
+ ng ph n ng có OD = 1.541 ả ứ Ố
D a vào ph ng trình: y = 1.303x + 0.003 ự ươ
Ta có: ODkpư = 0.036
ODpư = 1.541
Suy ra OD = 1.505
u = At – A0 * F *
*
* *
Ta có ph ng trình: ươ
Tính F:
F =
= 0.75
Trang 22
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Thay vào ph ng trình ta có: ươ
x = = 1.15
Th vào ph ng trình u ta đ c: ế ươ ượ
*
* * 100 * 10 = 645.8
U = 1.15 * 0.75 *
V y t ng ho t tính c a enzyme là: = 645.8 ậ ổ ủ ạ
Ta có ho t tính riêng là: ạ
=
= 10.52
Ho t tính riêng = ạ
Trang 23
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Bài 3: S C KÝ L C GEL SEPHADAX_G50 Ọ Ắ
1. B c đ u tinh s ch enzyme cellulose b ng s c ký l c gel. ướ ầ ọ ắ ạ ằ
a. Nguyên t cắ
có kích ể ử
ỷ ướ
ử ử
ữ ằ c đ nh đ l ướ ủ ỏ ể ọ ộ
ượ ữ ẽ ị ử ớ ể
i h p ra kh i c t s m h n các phân t c gi khác nhau b ng cách cho chúng đi có kích th t vào bên gel s b trì hoãn và di chuy n chaamjqua c t, trong khi ể l n h n di chuy n bên ngoài các h t gel nên s di ẽ ử ỏ ộ ớ ơ ượ ạ ơ ả ấ
K thu t s c ký l c gel dùng đ tách nh ng phân t ậ ắ ọ c, tr ng l th ng phân t ọ qua c t gel. Nh ng phân t ộ trong l ỗ nh ng phân t ữ chuy n nhanh và đ ể nh .ỏ
b. Th c hành ự
• D ng c và thi ụ ụ t b ế ị
- Ph u đ gel ễ ổ
- Bình hút chân không
- C t s c ký Bio-Rad, kích th c 30*1.5 cm, th tích: 53 ml. ộ ắ ướ ể
- Bình đ ng dung d ch đ m ự ệ ị
- ng nghi m 20 cái vòi hút chân không đ kh b t khí cho các dung ể ử ọ ệ
Ố d ch. ị
- Gel “Sephadex G-100”.
- Đ m Acetate 50 mM pH
• Hóa ch tấ
5, đu i b t khí đ tách enzyme t ể
t h n. ệ ổ ọ ố ơ
- Cân 5g gel “Sephadex G-100” khô, cho b t gel t
• Chu n b gel ẩ ị
t ừ ừ
ị
ộ ố ể ề ấ ớ ớ
-
vào dung d ch ị ệ đ m acetate 50Mm, pH 5.0 đ ng trong c c. Dùng dung d ch đ m ệ acetate pH 5.0 nhi u g p 2 l n so v i th tích l p n n gel c n cho ầ trong c t. C th dùng ít nh t 53*2=106 ml dung d ch đ m. ự ầ ấ ụ ể ề ị ệ ộ
ạ ớ ề ổ
ể ặ ị
Sau khi quá trình hydrat hóa xãy ra hoàn toàn, g n l p n i trên b m t. Chuy n dung d ch vào m t bình nút hút chân không có g n v i ớ ộ ắ 5 phút- vòi hút chân không. Kh khí c a dung d ch trong kho ng t ủ ừ ử ả ị
Trang 24
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
ẹ ả ắ ấ
10 phút, th nh tho ng l c nh bình. Không dùng đũa khu y vì nó có th làm h gel. ỉ ư ể
ệ ể ấ ầ ớ
ắ ử ị ị ẹ ể
ạ ớ ả i công vi c trên 4 l n đ lo i h n 90% h t m n làm c n ể ạ ơ ể ố ạ ổ ể ạ ạ ổ ổ ệ ầ ị
ề - Thêm dung d ch đ m kh khí v i th tích g p 2 l n th tích l p n n ớ và l c nh . Đ gel n đ nh cho đ n khi 90% - 95% s h t n đ nh. ị ế G n ho c lo i l p n i trên b m t b ng cách hút đ lo i các h t ạ ặ ề ặ ằ m n. L p l ặ ạ tr quá trình l c gel. ạ ị ở ọ
- G n phi u đ gel vào c t, đóng l ắ đ m làm đ y 20% th tích c t. ệ
thoát c a c t và cho dung d ch ể ổ ộ ỗ ủ ộ ị
- Rót đ u dung d ch gel vào c t thành m t dòng di chuy n nh . Tránh
ể ầ ộ
ộ
- Khi l p n n đã hình thành trong c t t
ẹ làm b n gel, đ m b o vi c nh i c t đ u và tránh b b t khí. ộ ồ ộ ề ể ị ọ ị ả ề ẩ ệ ả
ủ 2-5cm, m khóa đ u ra c a ầ ở ớ
- Khi c t đã n p đ y gel, khóa đ u ra c a c t và g n flow adaptor. ầ
ề c t cho đ n khi c t đ ế ộ ộ ừ c n p đ y gel. ầ ộ ượ ạ
ạ ộ
ể ầ ấ ủ ộ ị
M khóa đ u ra c a c t và cho dung d ch đ n v i th tích g p 2 l n ầ th tích l p n n ch y qua c t lúc đi u khi n t c đ ch y. ộ ở ể ề ề ớ ắ ệ ớ ể ố ộ ả ầ ủ ộ ả
ầ ủ ộ ề
ế ớ ặ ố ơ ề ẫ ạ ằ
ề ế ẫ ớ
• Chu n b m u ị ẫ ẩ
ề - Đóng đ u ra c a c t và đi u ch nh flow adaptor xu ng đ n l p n n ỉ gel. N p m u vào trên b m t l p n n b ng cách b m ho c tiêm ề ặ ớ ố ộ m u vào trên l p n n gel qua flow adaptor. N u tiêm m u thì t c đ dòng tiêm không nên v ố ộ ẫ t quá t c đ dòng tách đ ngh . ị ượ ề
ọ - Hòa tan hoàn toàn protein trong dung d ch đ m, sau đó ti n hành l c. ệ ế ị
Vì m u ch y s c ký ph i s ch. ạ ắ ả ạ ẫ
ủ - L c m u qua milipore s làm gia tăng đ b n /th i gian s d ng c a ử ụ ộ ề ẽ ẫ ờ
ọ c t. ộ
c. K t quế ả
Trang 25
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Hình 10: l c gel. ọ
• K t qu đo đ h p th (OD) c sóng 280 nm. ộ ấ ụ ế ả b ở ướ
1 2 3 4 5 6 7 8
Số ngố
OD 0.013 0.03 0.05 0.021 0.019 0.016
0.01 7 0.01 8
c. V đ th : ẽ ồ ị
0.06
0.05
0.04
0.03
Series1
0.02
0.01
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
c đ th sau: D a vào ch s OD ta v đ ỉ ố ẽ ượ ồ ị ự
ố ố
ấ ừ ố ượ ộ ng s 2 đ n ng s 8, tr n ế ố ng protein sau s c ký và h at tính ắ ọ
Trong 8 ng nghi m trên ta l y t ệ ố chung l i đ xác đ nh hàm l ị ạ ể enzeme sau s c ký. ắ
Trang 26
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
ng protein sau s c ký. 2. Xác đ nh hàm l ị ượ ắ
a. Th c hành ự
- Chu n b 2 ng nghi m: 1 ng đ i ch ng và 1 ng th c nghi m. ị ố ứ ự ệ ệ ẩ ố ố ố
• ng nghi m đ i ch ng: ch quang ph k v đ h p th b ng 0. Ố ổ ế ề ộ ấ ụ ằ ứ ệ ố ỉ
- Hút 1 ml n ướ c cho vào ng nghi m. ố ệ
- Thêm 2 ml dung d ch thu c th Coomassie. ử ố ị
- Đo đ h p th c sóng 595 nm. ộ ấ b ụ ở ướ
• ng nghi m th c nghi m. Ố ự ệ ệ
- Hút 1 ml dung d ch enzyme cho vào ng nghi m. ệ ố ị
- Thêm 2 ml dung d ch thu c th Coomassie. ử ố ị
- Đo đ h p th c sóng 595 nm. ộ ấ b ụ ở ướ
b. K t qu . ả ế
- Quan sát b ng m t th ằ ườ ứ ệ ố
ng ta th y: ng nghi m đ i ch ng có ệ ắ ạ ố ệ ậ
ấ ố ơ màu xanh nh c, ng nghi m th c nghi m có màu xanh đ m h n ự nh hình 11. ư
Hình 11: k t qu so màu. ế ả
- K t qu đo đ h p th c sóng 595 nm là OD = 0.265 ộ ấ b ụ ở ướ ế ả
c. Tính toán k t qu thu đ c. ế ả ượ
Trang 27
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
D a vào ph ng trình y = 0.003x + 0.0657 ự ươ
Và ta có OD = 0.265
= 88.3 ( µg/ml ) * 20 ( ml )
Suy ra x =
= 1766 ( µg )
= 1.766 ( mg )
3. Xác đ nh ho t tính enzyme sau s c ký.
V y t ng hàm l ng protein sau s c ký là: = 1.766 ( mg ) ậ ổ ượ ắ
ắ ạ ị
a. Th c hành ự
ị ố ứ ệ ệ ố ố ố
•
Chu n b 2 ng nghi m: 1 ng nghi m đ i ch ng và 1 ng nghi m th c ự ệ ẩ nghi m.ệ
ng nghi m đ i ch ng: ch nh quang ph k v đ h p th b ng 0. Ố ổ ế ề ộ ấ ụ ằ ứ ệ ố ỉ
- Hút 1 ml n ướ c cho vào ng nghi m. ố ệ
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
- Thêm 2 ml dung d ch DNS-lastose và l c đ u. ắ ề ị
ị ắ 5 vào ng nghi m ch a enzyme và l c ứ ệ ố
đ u.ề
- Đem đun sôi cách th y trong 15 phút. Làm l nh đ n nhi c l nh. Đo đ h p th
t đ phòng ủ ế
trong ch u n c sóng 540 nm. ệ ộ ạ b ụ ở ướ ậ ướ ạ ộ ấ
• ng nghi m th c nghi m Ố ự ệ ệ
- Hút 1 ml dung dich enzyme cho vào ng nghi m và ứ
nhi ủ ở ệ ố
ệ ộ t đ ị ể
- Thêm 1 ml dung d ch CMC pH
ờ ồ 0C trong 10 phút. 40 400C trong 10 phút. Đ ng th i, ta cũng đ chai ch a dung d ch CMC pH5 thích h p ợ ở
ị ắ 5 vào ng nghi m ch a enzyme và l c ứ ệ ố
- Đ ph n ng
đ u.ề
0C chính xác 10 phút.
40 ả ứ ở ể
Trang 28
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
ả ứ - Thêm 2 ml dung d ch DNS-lastose, l c đ u đ ng ng ph n ng ể ừ ắ ề ị
- Đem đun sôi cách th y trong 15 phút. Làm l nh đ n nhi
enzyme.
t đ phòng ệ ộ
ủ c l nh. Đo đ h p th ế ạ b c sóng 540 nm ụ ở ướ ộ ấ trong m t ch u n ộ ậ ướ ạ
- Quan sát b ng m t th
b. K t qu : ả ế
ắ ằ ườ ố
ớ
5, nh hình 12.
ủ ỏ ậ ị ứ ỏ ở ủ
ng ta th y: ng đ i ch ng có màu vàng là ấ ố ứ màu c a dung d ch DNS-lastose. ng có ph n ng v i enzyme có ả ứ Ố màu đ đ m, ch ng t ữ đây có x y ra quá trình th y phân gi a ả enzyme và dung d ch CMC pH ư ị
- K t qu đo đ h p th
Hình 12: K t qu so màu. ế ả
c. Tính toán k t qu thu đ
c sóng 540 nm có OD = 1.53 ộ ấ b ụ ở ướ ế ả
c: ế ả ượ
D a vào ph ng trình: y = 1.303x + 0.003 ự ươ
Ta có k t qu đo đ b c sóng 540 nm là OD = 1.53 ộ ướ ế ả
Trang 29
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
u = (At-A0) * F *
Ta có ph ng trình: ươ
*
* * 20 * 2
Tính F:
V đ th : ẽ ồ ị
F =
= 0.75
Thay vào ph ng trình ta có: ươ
x = = 1.17
Th vào ph ng trình u ta đ c: ế ươ ượ
*
* 20 * 2 = 19.5
U = 1.17 * 0.75 *
Trang 30
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
V y t ng ho t tính c a enzyme là: = 19.5 ậ ổ ủ ạ
Ta có ho t tính riêng là: ạ
=
= 11.04
Ho t tính riêng = ạ
K t qu chung sau khi xác đ nh hàm l ng protein và ho t tính ị ượ ạ ế
ả enzyme tr c và sau s c ký. ướ ắ
- Ta có b ng k t qu tính toán chung: ế ả ả
HSR (u/mg) Hi u su t (%) Nghi m th c ứ ệ ệ ấ Đ tinh ộ s chạ (u)
Tr c s c ký 645.8 19.5 (mg) 61.4 1.766 10.52 11.04 1 1.05 100 3.02 ướ ắ Sau s c kýắ
- Các công th c liên quan: ứ
Đ tinh s ch sau s c ký = ạ ắ ộ
Hi u su t sau s c ký = ệ ắ ấ
Trang 31
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Bài 4: ĐI N DI Ệ
1. Nguyên t c ắ
ậ ệ ộ ỹ ự ệ
ộ ử
ớ ậ ấ ẩ
ế ổ
ự ể ệ
ừ ấ t c các protein đ u đ ử ữ ộ
ướ ể ơ
có kích th ủ ữ ấ ị
ườ ử ệ
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamid Gel Eloctrophoresis)là m t k thu t đi n di trên gel polyacrylamid khi có s hi n di n c a SDS, ệ ủ protein. Trong đây là m t tác nhân làm bi n tính và âm tính hóa các phân t ế ố c x lý v i ch t t y SDS và tác nhân kh c u n i k thu t này protein đ ử ầ ượ ử ỹ disulfite là mercaptoethanol ho c dithiotheitol ( DDT). V i các tác nhân này ớ ặ c u trúc b c 2, 3, 4 đ c bi n đ i thành chu i polypeptide ( b c protein t ậ ỗ ượ ậ c tách đi n âm. Nh đó, s di chuy n trong 1) và t ề ượ ấ ả có gel c a các phân t ử ướ ủ kích th ỏ ướ ớ ẽ ử khi đi qua m t l ộ ỗ ng các phân t tr tích đi n d ệ ươ ờ protein ch ph thu c vào kích th c, nh ng phân t ỉ ụ c nh c l n s di chuy n ch m h n nh ng phân t ậ ệ c nh t đ nh. D i tác d ng c a đi n ụ ướ ướ ng và các phân t ề ự ươ ẽ ng. ng s di chuy n v c c âm c a đi n tr ệ ề ự tích đi n âm s di chuy n v c c d ườ gel có kích th ử ẽ ể ủ ể
2. D ng c và thi ụ ụ t b . ế ị
- B đi n di đ ng ộ ệ ứ
- B ngu n ch y đi n di ệ ạ ộ ồ
- Pipetteteman 1000µl
- Pipetteteman 200µl
- Pipetteteman 10µl
- Típ xanh: 1 h p ộ
- Típ vàng: 1 h pộ
- Típ tr ng: 1 h p ộ ắ
- Gi y l c ấ ọ
- Gi y th m ấ ấ
- Giăng tay: 1 đôi
- Phao đ eppendorf. ể
- Eppendorf
- pH kế
Trang 32
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
3. Hóa ch t.ấ
- N, N, N’,N’-tetramethylenediamide.
- Dung d ch Acryamide/Bisacryamide 40% ( 29:1) (3.3%C) ị
- β –Mercapptoethanol.
ẩ - Thang protein chu n SDS-PAGE ( Bio- Rad), g m các protein chu n ẩ ồ
có kích th ướ c xác đ nh sau: ị
+ Phosphorylase b 97.400 Daltons
+ Bovine serum albumin 66.200 Daltons
+ Ovalbumin 45.000 Daltons
+ Carbonic anhydrase 31.000 Daltons
+ Soybean trypsin inhibitor 21.500 Daltons
+ Lysozome 14.400 Daltons
- Sodium Dodecyl Sulfate.
- Ammonium persulfate.
0
- C n tuy t đ i 99,5
- Coomassie Brilliant Blue G 250 d ng viên ( Bio- Rad) ạ
ệ ố ồ
- Methanol.
- Tris ( hydroxymethyl ) amonimethane
- Axit acetic
- Bromophenol blue
- Glycerol
- Glycine
- Axit clohydric
- cướ
i khi tan h t. Sodium docecyl sulfate ( SDS) 10%: cân 10g SDS cho 100ml n c t vào khu y cho t ế ấ ấ ớ
Trang 33
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
ệ
ầ i khi pH k ch 8.8. Hút 8ml dung d ch SDS 10%
36,3g Tris pha trong 100ml n dung dich trên cho t cho vào. Thêm n - Dung dich đ m gel phân tách Tris-Cl 1.5M, Ph8.8-0.4%SDS: cân ấ c c t thêm d n HCl 6N và khu y ướ ấ ế ỉ ủ ớ c c t cho đ 200ml, l c đ u gi ướ ấ ị 4 đ . ộ ắ ề ữ ở
ị ệ
ướ ấ ấ
- Dung d ch đ m gel gom Tris – Cl 0.5M, pH 6.8-0,4 % SDS: cân 6.05g c c t thêm d n HCl 6N và khu y dung d ch
Tris pha trong 100ml n trên cho t ớ Thêm vào n c cho đ 100ml, l c đ u gi ị ầ i khi ph k ch 6.8. Hút 4ml dung d ch SDS 10% cho vào. ướ ị 4 đ . ộ ế ỉ ủ ắ ề ữ ở
ỉ
c khi dùng): cân 0.1g cho nhi c c t, l c đ u, đ ộ ướ ướ ấ ắ ề ể ở ệ t
- Ammoniumpersulfate 10% ( ch pha tr vào m t eppendorf 1000µl thêm 1 ml n đ phòng. ộ
ệ ệ ị ị
ch a 30g Tris, 144g Glycine, 10g SDS hòa trong 1000ml n - Dung d ch đ m đi n di Tris-glycine ph 8.3: pha dung d ch m 10X ẹ c c t ướ ấ ứ
ị ạ ư ẫ ầ ị
- Dung d ch n p m u 2X: có thành ph n nh sau: 2.5ml dung d ch đ m Tris-Cl 0.5M , ph 6.8,4ml 10%SDS; 2ml Glycerol; 2mg ệ Bromophenol Blue; 0.2ml mercaptoethanol; thêm n c đ 10ml ướ ủ
ị ộ ẩ ị
ộ ệ ố
c c t và 25ml acid acetic, l c đ u, gi trong chai màu t ứ - Dung d ch nhu m gel: chu n b 250ml dung d ch nhu m gel ch a ị 0,625g Coomassie Blue G 250, 112.5ml ethanol tuy t đ i, 112.5ml n ắ ề ướ ấ i ố ữ
- Dung d ch gi i nhu m: 30ml methanol: 10ml acid acetic: 60ml n ị ả ộ ướ c
c tấ
4. Ph ng pháp ươ
• Đ gelổ
ậ ượ c
Chú ý: Polyacrylamide là ch t đ c cho th n kinh. Vì v y không đ ầ hít và u ng. khi dính vào nên r a tay ngay ấ ộ ữ ố
c 100*100*0.75mm có n ng đ ẩ ị ổ ộ ướ ồ ộ
Chu n b đ m t gel có kích th acrylamide là 10%.
a. Gel tách.
• Cho các thành ph n sau theo th t vào becher 50ml s ch : ứ ự ầ ạ
- Acrylamide 2 ml
- Đ m Tris-HCl1,5M pH 8,8 1.25 ml ệ
Trang 34
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
- SDS 50 µl
1.7 ml - N c c t ướ ấ
-
- TEMED 5µl
50 µl ắ ẹ ố
ọ ạ ặ
ứ ổ ị
ị ẹ ọ
ặ c ph ng. ch gel c c t lên trên l p gel đ m t gel đ ượ ẳ ớ ờ
b. Gel gom
Fersulfatamonium Sau khi cho Amonium persulfate 10% vào, l c nh ng Falcon vài l n (tránh t o b t khí), dùng pipette Pasteur ho c pipetteman b m ơ ầ dung d ch gel vào khuôn, đ gel sao cho m c dung d ch gel cao h n ơ ộ 7cm( tránh t o b t khí trong khuôn gel). Sau đó, nh nhàng đ t m t ạ l p n ớ ướ ấ ể ặ đông( kho ng 20-30 phút) ả
vào m t Becher50ml khác: Cho các thành ph n sau theo th t ầ ứ ự ộ
Acrylamide 0,68 ml
Tris-HCl1,5M ph6,8-0,4%SDS 1.25 ml
SDS 50 µl
3.05 ml N c c t ướ ấ
TEMED 5 µl
Fersulfatamonium. 50µl
ạ ạ ị c. Sau đó gi 2. chu n b m u và ch y đi n di. ẩ ồ ạ ộ ị ẫ ẫ ớ ệ ẩ ệ ị ệ Dùng pipetman 10µl n p m u vào các gi ng r i ch y đi n di n đ nh dòng: 100 ế ả i i nhu m cho đ n khi gel tr nên trong ế ằ ả ộ ộ ở ị ổ V.Sau khi đi n di, nhu n gel v i dung d ch nhu m đã chu n b tr ị ướ ộ nhu m b ng cách ngâm gel trong dung d ch gi su t không màu. ố
protein a. Xác đ nh tr ng l ị 4. K t qu : ả ế ng phân t ượ - ọ ả ử ể ủ i v ch màu cu i cùng: 6.2 ố
gel phân tách t Gi ng 3 ế 2.2 2.5 3.1
Đo kho ng cách di chuy n c a các band protein Kho ng cách di chuy n t ớ ạ ể ừ ả Gi ng 2 Gi ng 1 ế ế 1.5 0.5 1.9 1.1 2.3 1.5 2.5 2.2 3.1 2.5
Trang 35
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
3.1 b. Tính giá tr Rf ị
- Gi ng 1: ế
- Gi ng 2 : ế
Trang 36
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
- Gi ng 3: ế
ng phân t protein (dalton) logWM
5 Bi u đ log ể ồ Tr ng l ọ
10 ượ
ử
6
0.08
0.17
5
Thang chu nẩ 204.000 124.000 80.000 49.100 31.900 20.800 log (204.000) = 5.3 log (124.000) = 5.09 log (80.000) = 4.9 log (49.100) = 4.69 log (31.900) = 4.49 log (20.800) = 4.3
0.24
0.35
0.4
0.5
y = -2.3609x + 5.4847 R2 = 0.9952
4
)
3
(
2
1
0
0
0.1
0.2
0.4
0.5
0.6
0.3
W M g o L
Rf
Hinh 4.1: Đ th bi u di n ễ
ồ ị ể
̀
ử ủ 6 Tr ng l ọ Ph ng phân t ng trình đ c a các v ch protein ạ ng chu n : ượ ươ ẩ Y = -2.360X + 5.484 ườ
Trang 37
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
- t MW nh trên ẩ ế ư -
Gi ng 1: là thang chu n nên bi Gi ng 2: chi u dài gel là 6.2 ề V i Rf = x đã đ c tính trên ế ế ớ ượ ở
• Tính MW: Ta có : Y= log MW MW = 10y Y = -2.360X + 5.484
- MW1 = 10-2.360(0.24 ) + 5.484 = 82718 dal MW2 = 10-2.360(0.31 ) + 5.484 = 56545.7 dal MW3 = 10-2.360(0.37 ) + 5.484 = 40813.13 dal MW4 = 10-2.360( 0.4) + 5.484 = 34673.7 dal MW5 = 10-2.360(0.5 ) + 5.484 = 20137.2 dal ng t nh trên ự ư ế ươ Gi ng 3: t • Tính MW: Y = -2.360X + 5.484
MW1 = 10-2.360(0.35) + 5.484 = 45498.8 dal MW1 = 10-2.360(0.4 ) + 5.484 = 34673.7 dal MW1 = 10-2.360(0.5) + 5.484 = 20137.2 dal
Sau khi điên di băng ph ng phap SDS-PAGE ta tiên hanh th c hiên b i cung, ươ ự c c ướ ướ ̣ ̀ ́ ́ ̀ ̣ ̀ đo la xac đinh hoat tinh cua enzyme băng cach cô đinh enzyme ́ ̀ ́ ̣ ̣ ́ ̉ ̀ ́ ́ ̣
•
Trang 38
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
1. C đ nh enzyme cellulose lên ch t mang Natrilginate.
BÀI 5: C Đ NH ENZYME Ố Ị
ố ị ấ
• Cân 0.5 g enzyme cellulose hòa tan trong 16.5 ml dung dich đ mệ
a. Th c hành ự
acetat pH5.
• B sung 0.5 ml enzyme. ổ
• Dùng ng xilanh có đ u kim tiêm, hút dung d ch enzyme hòa tan đ cao 20 cm vào trong 50 ml dung d ch 0.2M CaCl
2
ầ ị
ố ỏ ừ ộ ị
này nh t đ t o gel. ể ạ
• Quá trình t o gel x y ra trong 30 phút, nhi t đ phòng. ạ ả ở ệ ộ
• L c và thu đ c d nh enzyme còn l i. ọ ượ ị ạ
• S l n tái s d ng: ử ụ ố ầ
- Thêm vào 50 ml n ướ ấ ể ọ c c t đ yên trong 10 phút, sau đó ti n hành l c ế
và thu đ c d ch enzyme l n1. ượ ị ầ
- Thêm vào 50 ml n ướ ấ ể ọ c c t đ yên trong 10 phút, sau đó ti n hành l c ế
và thu đ c d ch enzyme l n2. ượ ị ầ
- ướ ấ ể ọ c c t đ yên trong 10 phút, sau đó ti n hành l c ế
Thêm vào 50 ml n và thu đ c d ch enzyme l n 3. ượ ị ầ
b. K t quế ả
ị ượ ầ ượ
c đánh s th t ố c cho l n l ượ
c vào 2 bình erlen và nh hình ố ứ ự ư ị ả ạ ệ ể
ng protein sau c đ nh và xác đ nh hàm l ng enzyme sau c ả ượ ố ị ượ ị ố
trên đ D ch enzyme thu đ c ượ ở 2 c c th y tinh bu c ch c mi ng, và đ ệ ặ ộ ủ 13. B o qu n l nh các bình này đ dùng cho thí nghi m xác đ nh hàm l đ nh. ị
Trang 39
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Hình 13: Enzyme còn l i và enzyme tái s d ng. ạ ử ụ
ng protein sau c đ nh .
2. Xác đ nh hàm l ị
ượ ố ị
a. Th c hành. ự
ị ố ứ ệ ố ố
Chu n b 5 ng nghi m: 1 ng đ i ch ng và 4 ng thí ố ẩ nghi m.ệ
• ng nghi m đ i ch ng: ch quang ph k v đ h p th b ng 0. Ố ổ ế ề ộ ấ ụ ằ ứ ệ ố ỉ
- Hút 1 ml n ướ c cho vào ng nghi m. ố ệ
- Thêm 2 ml dung d ch thu c th Coomassie. ử ố ị
- Đo đ h p th c sóng 595 nm. ộ ấ b ụ ở ướ
• ng nghi m th c nghi m. Ố ự ệ ệ
- Hút 1 ml dung d ch enzyme cho vào ng nghi m. ệ ố ị
- Thêm 2 ml dung d ch thu c th Coomassie. ử ố ị
- Đo đ h p th c sóng 595 nm. ộ ấ b ụ ở ướ
b. K t qu . ả ế
K t qu đo đ h p th c sóng 595 nm. ộ ấ b ụ ở ướ ế ả
Trang 40
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Còn l S ng ố ố iạ L n 1ầ L n 2ầ L n 3ầ
OD 0.23 0.18 0.17 0.019
c. Tính toán k t qu . ả ế
D a vào ch s OD và đ ng th ng y=0.003x + 0.0675. ỉ ố ự ườ ẳ
Ta có:
Xcd=2.738 mg
Suy ra:
tcd-HLclai=61.4-2.738=58.7 mg
Hàm l ng protein c đ nh=HL ượ ố ị
Hi u su t ấ cd=(Ecd/Etcd)*100=95.6%. ệ
S l n tái s d ng: ử ụ ố ầ
L n 1: x=1.905 mg ầ
Hi u su t là 100% ấ ệ
L n 2: x=1.738 mg ầ
Hi u su t=(1.738*100)/1.905=91.2% ệ ấ
L n 3: x= 0.055 mg ầ
Hi u su t = (0.055*100)/1.905=11.6% ệ ấ
V đ th : ẽ ồ ị
Trang 41
120
100
80
60
Series1
40
20
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
d. Nh n xét k t qu ế ậ ả
ấ ệ ồ ị ầ ả
ầ ệ ấ
ầ ượ
3. Xác đ nh ho t tính enzyme sau c đ nh
D a vào đ th ta th y hi u su t gi m d n qua ba l n tái s ử ấ ự d ng . l n tái s d ng l n th hai có hi u su t là 91.2% thì s ứ ụ d ng đ ứ ụ thì không s d ng đ ử ử ụ c. hi u su t l n th ba gi m quá nhanh 11.6% (<50%) ả ệ ử ụ ầ ấ ầ c ượ
. ố ị ạ ị
a. Th c hành. ự
•
Chu n b 5 ng nghi m : 1 ng đ i ch ng và 4 ng thí nghi m. ị ố ứ ệ ệ ẩ ố ố ố
ng đ i ch ng : Ố ứ ố
- Hút 1ml n ướ c cho vào ng nghi m ố ệ
- Thêm 1ml dung d ch CMC pH
5
- Thêm 2ml thu c th DNS ử ố
ị
• 4 ng ph n ng : ả ứ ố
- ng 1: Hút 1ml enzyme tái s d ng l n 1 cho vào ng nghi m Ố ử ụ ệ ầ ố
- ng 2: Hút 1ml enzyme tái s d ng l n 2 cho vào ng nghi m Ố ử ụ ệ ầ ố
Trang 42
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
- ng 3: Hút 1ml enzyme tái s d ng l n 3 cho vào ng nghi m Ố ử ụ ệ ầ ố
- Đem 4 ng nghi m trên
- ng 4: Hút 1ml enzyme còn l Ố ạ i cho vào ng nghi m ố ệ
0C t
nhi t đ 40 5-10 phút ệ ố ủ ở ệ ộ ừ
5
- Thêm vào 4 ng trên, m i ng 1ml dung d ch CMC pH ỗ ố
tr c ị ủ ướ ở
- Đem 4 ng nghi m trên
nhi t đ 40 ố 0C ệ ộ
0C
-
chính xác 10 phút nhi t đ 40 ệ ố ủ ở ệ ộ
ấ ể ừ ỗ ố ử ố
ả Sau đó l y ra cho vào m i ng 2ml thu c th DNS đ ng ng ph n ng.ứ
- Đem đun sôi 15 phút. Đ ngu i. Đo c sóng 540nm. ể ộ b ở ướ
b. K t qu ả ế
t ườ ắ ằ ẫ ồ trái sang ph i, ta th y m u c n ả ấ
• Quan sát b ng m t th ấ ầ
i có m u đ m nh t ch ng t ho t tính enzyme còn cao. ng theo th t ỏ ứ ứ ự ừ ạ l ạ ậ
• K t qu đo OD: ả ế
i )ạ S ng ố ố OD 1 0.164 2 0.139 3 0.079 4(còn l 0.37
D a vào đ ng chu n albumin ta có ph ng trình: ự ườ ẩ ươ
Y= 0.003x + 0.0657
Trang 43
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Suy ra :
c c đ nh
ố ị = HLenzyme tr
ướ ố ị
i ạ
= 61.4 – 5.071 = 56.329(mg)
HLenzyme c đ nh – HLenzyme còn l
Hi u su t = ệ ấ
=
1 =
S l n tái s d ng: ử ụ ố ầ
2 =
L n 1: x ầ
3 =
L n 2: x ầ
L n 3: x ầ
Hi u su t c a 3 l n tái s d ng: ấ ủ ử ụ ệ ầ
1 =
L n 1: x ầ
2 =
L n 2: x ầ
3 =
L n 3: x ầ
D a vào hi u su t sau 3 l n tái s d ng ta d ng đ c đ th sau: ử ụ ự ự ệ ầ ấ ượ ồ ị
Trang 44
Công nghê enzyme va protein GVHD: CN. ĐÔ THI TUYÊN ̣ ̀ ̃ ̣ ́
Nh n xét k t qu : ả ế ậ
ử ụ ấ
ạ Sau 3 l n tái s d ng ta th y tái s d ng l n th 3 t o quá nhanh nên hi u su t ho t ầ tính gi m nhi u. Do đó khuy n cáo không nên s d ng enzyme tái s d ng l n th 3. ứ ạ ứ ử ụ ử ụ ề ệ ử ụ ấ ầ ầ ả ế
Trang 45
