Luận án nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của vi bao cao chiết Trâm vỏ đỏ nhằm xác định thành phần, hoạt tính sinh học, dự đoán thời hạn bảo quản.
Đắk Lắk - 2024
Đắk Lắk - 2024
i
Nghiên cứu của Luận án này được thực hiện dưới sự tài trợ của Quỹ Phát triển Khoa
học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số 106.99-2020.17.
Nguyễn Minh Trung được tài trợ bởi Chương trình học bổng đào tạo thạc sĩ, tiến sĩ
trong nước của Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF), mã số
VINIF.2021.TS.157, VINIF.2022.TS.139 và VINIF.2023.TS.138.
ii
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường,
Trường Đại học Tây Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho quá trình học tập
và nghiên cứu để tôi hoàn thành Luận án. Tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.
Nguyễn Quang Vinh, người Thầy tận tâm, đã luôn quan tâm, chỉ bảo, dìu dắt, đồng hành
và tận tình hướng dẫn tôi từng bước vào con đường nghiên cứu khoa học, thực hiện
nghiên cứu và hoàn thành Luận án Tiến sĩ.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Trường Đại học Tây Nguyên,
Khoa Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Bộ môn Sinh học đã tạo điều kiện công tác,
cho phép tôi theo học chương trình Tiến sĩ; Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và
Môi trường - Trường Đại học Tây Nguyên, Viện NTT Hi-tech - Trường Đại học Nguyễn
Tất Thành, Trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC) Đắk Lắk đã tạo điều kiện về cơ sở vật
chất, trang thiết bị giúp tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia
(NAFOSTED), mã số 106.99-2020.17 đã tài trợ cho nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng
biết ơn đến Quỹ đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF) đã tài trợ cho tôi thông qua Chương
trình học bổng đào tạo thạc sĩ, tiến sĩ trong nước, mã số VINIF.2021.TS.157,
VINIF.2022.TS.139 và VINIF.2023.TS.138. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
PGS.TS. Bạch Long Giang, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tin tưởng giới thiệu
tôi là ứng viên nhận học bổng của Quỹ đổi mới sáng tạo Vingroup.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba mẹ đã sinh thành, dưỡng dục, luôn ủng
hộ mọi quyết định của tôi. Tôi vô cùng biết ơn vợ con đã luôn đồng hành, ủng hộ, chia
sẻ, động viên; anh chị em trong gia đình đã ủng hộ tôi theo đuổi con đường học thuật và
hoàn thành Luận án.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả Quý Thầy cô, đồng nghiệp, sinh viên,
anh chị em, bạn bè. Những cuộc gặp gỡ, những câu chuyện chia sẻ, gợi mở đã giúp ích
rất nhiều cho tôi trong quá trình hoàn thiện Luận án này. Trân trọng./.
Đắk Lắk, ngày tháng năm 2024 Tác giả luận án
Nguyễn Minh Trung
iii
Đề tài được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Tây Nguyên từ tháng 6/2021 đến tháng 12/2023 trên đối tượng vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ, thu thập tại Khu bảo tồn thiên nhiên Easo, Ea Kar, Đắk Lắk với mục tiêu: Xác định được thành phần các hợp chất chính trong cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ và khả năng hạ đường huyết thông qua tác động đa mục tiêu của sản phẩm vi bao cao chiết trên mô hình in vitro và in vivo làm cơ sở nghiên cứu phát triển các sản phẩm bảo vệ sức khoẻ trong kiểm soát đường huyết. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án gồm:
− Đánh giá ảnh hưởng của trích ly phân đoạn đến khả năng kiểm soát đường huyết đa mục tiêu của cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ, gồm: (1) Trích ly phân đoạn cao chiết thô, xác định hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số của cao chiết thô và các loại cao chiết phân đoạn; (2) Đánh giá khả năng chống oxy hóa, kháng viêm, ức chế α-glucosidase và α-amylase, kháng khuẩn và kích thích sinh trưởng lợi khuẩn của các loại cao chiết; (3) Đánh giá độc tính của các chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ trên mô hình cá ngựa vằn; (4) Đánh giá khả năng kiểm soát đường huyết của cao chiết phân đoạn trên mô hình cá ngựa vằn; (5) Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết tiềm năng đến hệ vi sinh đường ruột trên mô hình in vivo; (6) Đánh giá tác động của cao chiết tiềm năng đến điều hòa biểu hiện gene liên quan đến kiểm soát đường huyết trên mô hình cá ngựa vằn;
− Phân lập các hợp chất, định lượng và đánh giá tương quan với hoạt tính sinh học của cao chiết vỏ thân Trâm vỏ đỏ, gồm: (1) Phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết tiềm năng; (2) Định lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong các loại cao chiết; (3) Đánh giá tương quan giữa thành phần hoạt chất và hoạt tính sinh học của các loại cao chiết;
− Vi bao cao chiết và đánh giá khả năng kiểm soát đường huyết đa mục tiêu của sản phẩm vi bao, gồm: (1) Xác định điều kiện vi bao phù hợp bằng phương pháp sấy phun; (2) Đánh giá hoạt tính hạ đường huyết của sản phẩm vi bao trong điều kiện in vitro; (3) Đánh giá tính an toàn của sản phẩm vi bao trên mô hình cá ngựa vằn; (4) Đánh giá khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao trên mô hình cá ngựa vằn; (5) Đánh giá khả năng điều hòa biểu hiện một số gene liên quan đến kiểm soát đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết; (6) Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro và in vivo của sản phẩm vi bao cao chiết;
− Nghiên cứu xây dựng mô hình dự đoán thời hạn bảo quản của sản phẩm vi bao, gồm: (1) Đánh giá tác động của điều kiện kích thích đến sự thay đổi độ ẩm và hàm lượng polyphenol của sản phẩm vi bao theo thời gian bảo quản; (2) Đánh giá tác động của điều kiện kích thích đến sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa và ức chế enzyme của sản phẩm vi bao theo thời gian bảo quản; (3) Xây dựng mô hình dự đoán thời hạn bảo quản của sản phẩm bột vi bao;
iv
− Cung cấp những dữ liệu quan trọng về hiệu quả hạ đường huyết của cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ và sản phẩm vi bao thông qua tác động đa mục tiêu gồm: Ổn định đường huyết lúc đói, chống tăng đường huyết sau ăn, chống oxy hóa, kháng viêm, ổn định hệ vi sinh vật đường ruột và điều hoà biểu hiện của các gene liên quan đến quá trình tăng đường huyết ở mô hình cá ngựa vằn gây bệnh đái tháo đường. Cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ và sản phẩm vi bao có khả năng điều hoà biểu hiện một số gene liên quan đến kiểm soát quá trình sinh tổng hợp chất béo như gene SREBF1, ACC1, và FASN; cải thiện kháng insulin thông qua gene insulin (INS), và thụ thể insulin (INSRA1 và INSRB1); ức chế hấp thu glucose qua thành ruột thông qua gene SGLT1 và cải thiện chuyển hóa glucose thông qua gene GLP-1. − Phân lập và xác định được cấu trúc của các hợp chất chính trong vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ thể hiện hoạt tính tiềm năng trong kiểm soát đường huyết. Trong đó, gallic acid, catechin, epicatechin, ellagic acid, quercetin, caffeine và apigenin là các thành phần chống oxy hóa quan trọng. Ethyl gallate và rutin là thành phần chính ức chế α- glucosidase. − Sử dụng maltodextrin kháng tiêu hóa làm chất mang vi bao gói cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ bằng phương pháp sấy phun đã nâng cao được tính sinh khả dụng của sản phẩm, nhờ vào sự tương tác phân tử giữa vật liệu bao gói và các hợp chất trong cao chiết. − Xây dựng được mô hình dự đoán thời hạn bảo quản của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (Mô hình tuân theo quy luật hàm bật nhất: 𝐶𝑡 = 𝐶0. 𝑒−𝑘𝑡. Sản phẩm vi bao gói ổn định ở điều kiện nhiệt độ (40 °C) và độ ẩm môi trường bảo quản (75%), với thời gian bán rã và suy thoái 90% hoạt tính lần lượt là 346,57 ngày và 1.151,29 ngày, so với cao chiết không vi bao lần lượt là 231,05 ngày và 767,53 ngày.
Luận án làm sáng tỏ những minh chứng khoa học về khả năng hạ đường huyết thông qua tác động đa mục tiêu của các loại cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ. Đồng thời, cung cấp các dẫn liệu ban đầu về tiềm năng ứng dụng để phát triển các thực phẩm an toàn từ cây Trâm vỏ đỏ trong phòng chống đái tháo đường, góp phần làm gia tăng chuỗi giá trị trong hoạt động khai thác tài nguyên thiên nhiên một cách bền vững.
Những vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu gồm (1) Tối ưu hóa điều kiện sơ chế, trích ly và vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ để nâng cao khai thác các hợp chất cũng như nâng cao hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ; (2) Đánh giá tác động của cao chiết và sản phẩm vi bao trên các mô hình nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng để có thể phát triển thành các dạng thực phẩm thuốc cũng như thực phẩm chức năng trong phòng chống bệnh đái tháo đường; (3) Thử nghiệm sản xuất một số sản phẩm thực phẩm có khả năng ổn định đường huyết hỗ trợ phòng ngừa và điều trị đái tháo đường.
v
This study was conducted at the Institute of Biotechnology and Environment, Tay Nguyen University, from June 2021 to December 2023. The investigation focused on the trunk-bark of Syzygium zeylanicum (L.) DC., which was collected from the Easo Nature Reserve, Ea Kar, Dak Lak. The primary objective of this investigation is to elucidate the composition of the principal bioactive compounds in the trunk-bark extract of Syzygium zeylanicum (L.) DC. and assess its hypoglycemic potential through the multi-target effects of its microencapsulated products in in vitro and in vivo models. This pivotal investigation provides a cornerstone for the advancement of health- protective interventions that target glucose homeostasis. This investigation comprises four primary contents, as follows:
− Investigate the impact of fractionation on glycemic control through the multi-target effects of Syzygium zeylanicum (L.) DC. extract, encompassing (1) fractionation of crude extract and determination of total polyphenol and flavonoid contents in the crude extract and its fractions; (2) assessment of antioxidant, anti-inflammatory, α- glucosidase, and α-amylase inhibitory activities, as well as antimicrobial and prebiotic properties of the extracts; (3) evaluation of the toxicity of the extracts in a zebrafish model; (4) assessment of the glycemic control efficacy of the extracts in a zebrafish model; (5) examination of the modulation of the intestinal microflora of the potential extracts; and (6) investigation of the impact of potential extracts on gene expression related to glycemic control in a zebrafish model.
− Isolation and quantification of bioactive compounds, as well as evaluation of their correlation with the bioactivity of Syzygium zeylanicum (L.) DC., encompassing (1) isolation and structural elucidation of bioactive compounds from the potential extracts, (2) quantitative analysis of bioactive compounds in extracts, and (3) evaluation of the correlation between active constituents and bioactivity of extracts.
− Microencapsulate the Syzygium zeylanicum (L.) DC. extract and evaluate its multi- target effects on glycemic control, including (1) determination of suitable conditions for microencapsulation via the spray-drying method, (2) assessment of the hypoglycemic potential of the microencapsulated products in an in vitro model, (3) examination of the toxicity of the microencapsulated products, (4) evaluation of the hypoglycemic efficacy in a zebrafish model, (5) investigation of the ability to modulate gene expression related to glycemic regulation of microencapsulated products, and (6) assessment of the anti- inflammatory activity of the microencapsulated products in in vitro and in vivo models. − Research to develop a model for predicting the storage life of microencapsulated products, encompasses (1) assessment of the impact of accelerated conditions on the alteration in moisture and polyphenol content of microencapsulated products over the storage period, (2) evaluation of the effect of stimulating conditions on the change in antioxidant and enzyme inhibitory activities of microencapsulated products over the
vi
− Syzygium zeylanicum (L.) DC extract and microencapsulated products have been demonstrated to exhibit hypoglycemic efficacy through multi-target effects, including stabilization of fasting and postprandial blood glucose levels, mitigation of oxidative stress and inflammatory responses, modulation of intestinal microbiota, and regulation of hyperglycemia-associated genes in diabetes-induced zebrafish. Furthermore, these extracts and microencapsulated products can regulate fat biosynthesis by modulating SREBF1, ACC1, and FASN genes, ameliorating insulin resistance by modulating insulin (INS) and insulin receptor (INSRA1 and INSRB1) genes, attenuating glucose absorption through the intestinal wall via the SGLT1 gene, and enhancing glucose metabolism through the GLP1 gene.
− The isolation and identification of primary compounds in the trunk-bark of Syzygium zeylanicum (L.) DC has demonstrated potential for glycemic control. Essential antioxidant components include gallic acid, catechin, epicatechin, ellagic acid, quercetin, caffeine, and apigenin. Ethyl gallate and rutin are the principal compounds that inhibit the α-glucosidase activity.
− The utilization of digestion-resistant maltodextrin as a carrier
for microencapsulation of the Syzygium zeylanicum (L.) DC extract through the spray- drying method enhances the bioavailability of the product, which is attributable to the molecular interaction between the encapsulating material and the principal compound in the core extract.
to optimize
required
is
This dissertation elucidates the scientific evidence supporting hypoglycemic effects via multi-target effects of the trunk-bark extract from Syzygium zeylanicum (L.) DC. Furthermore, this study provides preliminary data on the potential application of this plant in the development of safe food products for diabetes prevention, which may contribute to sustainable resource utilization and enhance the value chain. Additional research the pre-processing, extraction, and microencapsulation conditions of Syzygium zeylanicum (L.) DC to improve the utilization of these compounds and enhance their bioactivity. It is imperative to conduct research and evaluate the effects of extracts and microencapsulated products in preclinical and clinical research models to develop medicinal and functional foods for diabetes prevention. Investigating the production of food products that stabilize blood glucose levels is essential for the prevention and treatment of diabetes.
vii
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ iii
THÔNG TIN VỀ NHỮNG KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN TIẾN SĨ ................... iv
DECLARATION OF THE NOVELTY OF THE DOCTORAL DISSERTATION ....... vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................x
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... xiii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ........................................................................xv
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề/tính cấp thiết của đề tài .............................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................................2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...............................................................................3
4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...............................................................................3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .....................................................................................3
5.1. Ý nghĩa khoa học ..................................................................................................3
5.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................4
6. Những đóng góp mới của luận án ...............................................................................4
Chương 1. TỔNG QUAN ................................................................................................5
1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường ......................................................................5
1.2. Các phương pháp tiếp cận hiện đại nhằm kiểm soát đường huyết trong điều trị
bệnh đái tháo đường ....................................................................................................9
1.3. Tiềm năng phòng chống bệnh đái tháo đường thông qua khả năng kiểm soát
đường huyết của các polyphenol từ thực vật .............................................................13
1.4. Chi Trâm (Syzygium sp.) và tiềm năng phòng chống bệnh đái tháo đường .......23
1.5. Công nghệ vi bao gói các hợp chất tự nhiên ứng dụng trong phòng chống bệnh
đái tháo đường ...........................................................................................................30
1.6. Mô hình cá ngựa vằn trong nghiên cứu đái tháo đường .....................................36
1.7. Thực trạng và hướng tiếp cận nghiên cứu ..........................................................39
viii
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................42
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................42
2.2. Nội dung nghiên cứu .........................................................................................44
2.3. Phương pháp nghiên cứu và chỉ tiêu đánh giá ....................................................46
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................................70
3.1. Ảnh hưởng của trích ly phân đoạn đến thành phần hoạt chất và khả năng hạ đường
huyết đa mục tiêu của các loại cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ ........................70
3.2. Phân lập các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
...................................................................................................................................97
3.3. Vi bao gói cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ ................................................... 116
3.4. Xây dựng mô hình dự đoán thời hạn bảo quản của sản phẩm vi bao .............. 141
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 149
Kết luận ................................................................................................................... 149
Kiến nghị ................................................................................................................ 150
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ........................................................... 151
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 153
PHỤ LỤC .................................................................................................................... P-1
ix
Chú thích
Chữ viết tắt 3T3-L1 ABTS AGES
AGES
Akt1 ALA AMPK
AQP2 AQP3 AVV α-CD BCAAs
β-CD CAT CFU
COSY
CRP DHA DPPH DPP4 ĐTĐ EGCG EPA GA GAE
GEN GIP GLP-1 GLP-1Ras
GLUT
GLUT4
GR GSH GS-MS 3T3-L1 preadipocyte cells 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) Advanced glycation end products (Sản phẩm cuối quá trình glycated hóa) Advanced Glycated End-products (Sản phẩm cuối quá trình glycate hóa) Protein Kinase B α-linolenic acid AMP-activated protein kinase pathway (Con đường protein kinase được kích hoạt bởi AMP) Aquaporin-2 Aquaporin-3 Adeno-Asociated Virus Vector α-cyclodextrin Branched-chain amino acids (Acid béo mạch phân nhánh) β-cyclodextrin Catalase Colony-forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) ¹H-¹H Correlation Spectroscopy (Phổ tương quan ¹H-¹H) C-reactive protein Docosahexaenoic acid 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl Dipeptidyl peptidase-4 Đái tháo đường Epigallocatechin-3-gallate Eicosapentaenoic acid Gum Arabic Gallic Acid Equivalents (Đương lượng gallic acid) Genistein Gastric Inhibitory Peptide Glucagon-like peptide 1 Glucagon-like peptide 1 receptor agonists (Chất chủ vận thụ thể peptide giống glucagon 1) Glucose transporter (Chất vận chuyển glucose) Glucose transporter type 4 (Chất vận chuyển glucose loại 4) Glutathione reductase Glutathione Gas chromatography–Mass spectrometry (Sắc ký khí – Khối phổ)
x
GST -CD HbA1c HFD HT IC50
IDF
IL-6 ipGTT
iPSCs
IRS
IRS1 JNK LA LC-MS
LC-PUFA
MA MHA
MHB
MSCs
NF- B NMR
NOESY
Nrf2/Glo1 OA OGTT
PI3K PPAR PPARγ PPARG2 PPCs
Glutathione S-Transferases -cyclodextrin The hemoglobin A1c High-fat diet Hydroxytyrosol Half-maximal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế 50 %) The International Diabetes Federation (Liên đoàn Đái tháo đường quốc tế) Interleukin-6 Intraperitoneal glucose tolerance tests (Thử nghiệm chống chịu glucose đường tiêm) Induced Pluripotent Stem Cells (Tế bào gốc cảm ứng đa năng) Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại) insulin receptor substrate protein 1 c-Jun N-terminal kinase Linoleic acid Liquid chromatography–Mass spectrometry (Sắc ký lỏng – Khối phổ) Long-chain polyunsaturated fatty acid (Acid béo không bão hòa đa chuỗi dài) Maslinic acid Muler Hinton Agar (Môi trường Muler Hinton rắn) Muler Hinton Broth (Môi trường Muler Hinton lỏng) Mesenchymal Stem Cells (Tế bào gốc trung mô) Nuclear Factor-kappa B Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (Phổ hiệu ứng overhauser hạt nhân) Nuclear factor erythroid 2-related factor 2/glyoxalase 1 Oleanolic acid Oral Glucose Tolerance Test (Thử nghiệm chống chịu glucose đường uống) Phosphoinositide 3-kinases/ phosphatidylinositol 3-kinases Peroxisome proliferator-activated receptor Peroxisome proliferator-activated receptor gamma Peroxisome proliferator-activated receptor γ 2 gene Pancreatic polypeptide cells (Tế bào polypeptide tuyến tụy) Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 6 PTPN6
Quercetin Equivalents QE
xi
qRT-PCR
RMD
RNS
ROS
SCFAs
SGLT
SGLT1 SGLT2 Slc2a4 SOD SZL TGFβ2 TLC
TNF-α TZDs (Đương lượng quercetin) Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (PCR phiên mã ngược định lượng theo thời gian thực) Digestion-Resistant maltodextrin (Matodextrin kháng tiêu hóa) Reactive Nitrogen Species (Gốc nitơ nguyên tử hoạt động) Reactive Oxygen Species (Gốc oxy nguyên tử hoạt động) Short-chain fatty acids (Acid béo chuỗi ngắn) Sodium-glucose cotransporter (Chất đồng chuyển Natri-glucose) Sodium-glucose co-transporter-1 Sodium-glucose co-transporter-2 Glucose transporter gene Superoxide dismutases Syzygium zeylanicum L. (DC) Transforming Growth Factor Beta 2 Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) Tumor Necrosis Factor-α Thiazolidinediones
UPLC/UHPLC Ultra Performance Liquid Chromatography/Ultra High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng siêu hiệu năng) Vasopressin receptor 2 V2R
WHO
WPRO
YY World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới) WHO Regional Office (Văn phòng đại diện tổ chức y tế thế giới) Peptide YY
xii
Bảng 1.1. Khả năng kiểm soát đường huyết và phòng chống bệnh đái tháo đường của
một số loài cây thuốc thuộc Chi Trâm ...........................................................................23
Bảng 1.2. Các nghiên cứu về thành phần hoạt chất và hoạt tính sinh học của Trâm vỏ đỏ
.......................................................................................................................................27
Bảng 1.3. Các hợp chất polyphenol và dẫn xuất được vi bao gói bằng kỹ thuật sấy phun
.......................................................................................................................................32
Bảng 2.1. Trình tự mồi cho phản ứng chuỗi polymerase định lượng gene thời gian thực
(a real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR) ...................................55
Bảng 2.2. Thiết kế thực nghiệm phân tích mức độ biểu hiện gene ...............................56
Bảng 2.3. Các công thức sấy phun ................................................................................60
Bảng 2.4. Thiết kế thực nghiệm đánh giá khả năng kháng viêm của sản phẩm vi bao cao
chiết vỏ thân Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC) trên mô hình ấu trùng cá ngựa vằn67
Bảng 2.5. Điều kiện bảo quản sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ ......68
Bảng 3.1. Hàm lượng polyphenol, flavonoid tổng số của các loại cao chiết từ vỏ thân
cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC.) ......................................................................71
Bảng 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các loại cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (S.
zeylanicum (L.) DC.) .....................................................................................................72
Bảng 3.3. Khả năng ức chế biến tính protein của các loại cao chiết từ vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC.) ......................................................................................74
Bảng 3.4. Khả năng ức chế enzyme thủy phân tinh bột của các loại cao chiết từ vỏ thân
cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum L. (DC.)) ......................................................................76
Bảng 3.5. Khả năng ức chế Echesteria coli ATCC25923 và Staphylococcus aureus
ATCC25923 của các loại cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC.) ....79
Bảng 3.6. Giá trị nồng độ tối thiểu ức chế sinh trưởng vi khuẩn (MIC) của các loại cao chiết
từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC.) .........................................................80
Bảng 3.7. Khả năng kích thích sinh trưởng lợi khuẩn Lactobacillus casei của các loại
cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC.) trong điều kiện tăng đường
huyết in vitro ..................................................................................................................82
Bảng 3.8. Thành phần và hàm lượng các hợp chất polyphenol trong cao chiết từ vỏ thân
cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum L. (DC.)) .................................................................... 110
Bảng 3.9. Ma trận tương quan Pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số
(TPC và TFC), các hoạt tính trung hòa DPPH• và ABTS•+ (DPPH &; ABTS), hoạt tính
xiii
ức chế α-glucosidase và α-amylase (aAI & aGI), các hợp chất polyphenol của các loại
cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum L. (DC.)) ................................... 111
Bảng 3.10. Các thuộc tính lý hóa của sản phẩm vi bao gói cao chiết vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ ............................................................................................................................ 118
Bảng 3.11. Hiệu suất sấy, hiệu quả vi bao gói và hàm lượng polyphenol được bao gói
.................................................................................................................................... 120
Bảng 3.12. Các thông số mô hình động học giải phóng hoạt chất từ sản phẩm vi bao gói
.................................................................................................................................... 122
Bảng 3.13. Khả năng chống oxy hóa của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ ........................................................................................................................... 123
Bảng 3.14. Khả năng ức chế enzyme của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ
đỏ ................................................................................................................................ 124
Bảng 3.15. Tổng hợp sự thay đổi hoạt tính sinh học và khả năng kiểm soát đường huyết
của sản phẩm vi bao (MEP) so với cao chiết thô (CE) và cao phân đoạn ethyl acetate
(EAF) từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC.) ...................................... 138
Bảng 3.16. Hằng số tốc độ (k), hệ số xác định (R2), chu kỳ bán rã (t1/2) và hệ số nhiệt độ
Van’t Hoff (Q10) liên quan đến sự suy giảm hàm lượng polyphenol của bột vi bao cao
chiết và cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC.) ..................... 147
xiv
Hình 1.1. Các loại hormone tuyến tụy và mối liên hệ điều hòa các mô cơ quan trong quá
trình chuyển hóa glucose .................................................................................................6
Hình 1.2. Cơ chế điều hòa đường huyết của các hormone tuyến tụy ..............................7
Hình 1.3. Các mục tiêu tác động kiểm soát đường huyết của thuốc điều trị đái tháo đường
....................................................................................................................................... 11
Hình 1.4. Phân nhóm các hợp chất tự nhiên từ thực vật có khả năng kiểm soát đường
huyết và chống đái tháo đường ......................................................................................13
Hình 1.5. Các vị trí tác động kiểm soát đường huyết của polyphenol trong phòng trị đái
tháo đường .....................................................................................................................17
Hình 1.6. Tác dụng kiểm soát đường huyết và chống đái tháo đường của hợp chất tự
nhiên thông qua hệ vi sinh đường ruột (theo Xia et al. (2021) và các công bố khác) ...22
Hình 1.7. Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.) ................................................27
Hình 1.8. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật sấy phun ......................................................31
Hình 1.9. Các quá trình bao gói hợp chất tự nhiên sử dụng kỹ thuật sấy phun ............32
Hình 1.10. Mục tiêu bao gói các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học: bảo vệ cấu trúc
và tăng sinh khả dụng ....................................................................................................34
Hình 1.11. Các phương pháp gây tăng đường huyết, đái tháo đường và mô hình nghiên
cứu các biến chứng do đái tháo đường sử dụng cá ngựa vằn ........................................38
Hình 2.1. Mẫu vỏ thân và bột vỏ thân Trâm vỏ đỏ ........................................................42
Hình 2.2. Sơ đồ tổng quan tiến trình nghiên cứu ..........................................................44
Hình 2.3. Sơ đồ tiến trình thí nghiệm nội dung nghiên cứu số 1 ..................................46
Hình 2.4. Sơ đồ tiến trình tách phân đoạn cao chiết ......................................................47
Hình 2.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ vỏ thân Trâm
vỏ đỏ ..............................................................................................................................57
Hình 3.1. Tác dụng của các loại cao chiết từ vỏ thân Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.)
DC.) và acarbose đối với đường huyết sau ăn ở cá ngựa vằn khỏe mạnh .....................85
Hình 3.2. Tác dụng của các loại cao chiết từ vỏ thân Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.)
DC.) và metformin đối với đường huyết ở cá ngựa vằn đái tháo đường. .....................87
Hình 3.3. Ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn ethyl acetate từ vỏ thân Trâm vỏ đỏ (S.
zeylanicum (L.) DC.) đến biểu hiện một số gene liên quan chuyển hóa chất béo ........91
Hình 3.4. Ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn ethyl acetate từ vỏ thân Trâm vỏ đỏ (S.
zeylanicum (L.) DC.) đến biểu hiện gene insulin và thụ thể sau 20 ngày tác động. .....93
xv
Hình 3.5. Ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn ethyl acetate từ vỏ thân Trâm vỏ đỏ (S.
zeylanicum (L.) DC.) đến biểu hiện gene liên quan hấp thu và chuyển hóa glucose sau
20 ngày tác động. ...........................................................................................................95
Hình 3.6. Cấu trúc hợp chất SBE1 (Ellagic acid) ..........................................................97
Hình 3.7. Cấu trúc hợp chất SBE2 ((-)-epicatechin) .....................................................98
Hình 3.8. Cấu trúc hợp chất SBE3 (Ethyl gallate) ..................................................... 100
Hình 3.9. Cấu trúc hợp chất SBE4 (Quercetin) .......................................................... 100
Hình 3.10. Cấu trúc hợp chất SBE5 (Quercitrin) ....................................................... 101
Hình 3.11. Cấu trúc hợp chất SBE6 (Rutin) ............................................................... 103
Hình 3.12. Cấu trúc hợp chất SBE7 (Vitexin) ............................................................ 105
Hình 3.13. Cấu trúc hợp chất SBE8 (Gallic acid) ...................................................... 106
Hình 3.14. Cấu trúc hợp chất SBE9 (Chlorogenic acid) ............................................ 107
Hình 3.15. Cấu trúc hợp chất SBE10 (Catechin) ....................................................... 108
Hình 3.16. Phân tích thành phần chính (PCA) Biplot cho tổng hàm lượng polyphenol và
flavonoid, khả năng chống oxy hóa, hoạt tính ức chế enzyme, các hợp chất polyphenol
của cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum L. (DC.)) ............................. 114
Hình 3.17. Đặc điểm hình thái sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân Trâm vỏ đỏ ghi nhận
bằng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopes - SEM) ................... 119
Hình 3.18. Ảnh hưởng của chất mang đến mức độ giải phóng polyphenol của sản phẩm
vi bao cao chiết vỏ thân Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC.) sau 5 phút phân tán trong
nước cất ...................................................................................................................... 121
Hình 3.19. Khả năng làm chậm quá trình gia tăng đường huyết sau ăn của sản phẩm vi
bao cao chiết vỏ thân Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC) trên mô hình cá ngựa vằn.
.................................................................................................................................... 126
Hình 3.20. Tác động của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum
(L.) DC) lên đường huyết lúc đói của cá ngựa vằn đái tháo đường sau 20 ngày điều trị.
.................................................................................................................................... 127
Hình 3.21. Ảnh hưởng bột vi bao cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum
(L.) DC.) đến biểu hiện một số gene liên quan chuyển hóa chất béo sau 20 ngày tác
động. ........................................................................................................................... 129
Hình 3.22. Ảnh hưởng bột vi bao cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum
(L.) DC.) đến biểu hiện gene insulin và thụ thể sau 20 ngày tác động. ..................... 130
xvi
Hình 3.23. Ảnh hưởng bột vi bao cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum
(L.) DC.) đến biểu hiện gene liên quan hấp thu và chuyển hóa glucose sau 20 ngày tác
động. ........................................................................................................................... 131
Hình 3.24. Khả năng chống biến tính protein của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây
Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC) so với cao chiết không được vi bao và thuốc kháng
viêm ibuprofen. ........................................................................................................... 133
Hình 3.25. Khả năng kháng viêm của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân Trâm vỏ đỏ (S.
zeylanicum (L.) DC) trên mô hình ấu trùng cá ngựa vằn. .......................................... 134
Hình 3.26. Cấu hình quang phổ FTIR của maltodextrin kháng tiêu hóa (RMD), cao
chiết thô Trâm vỏ đỏ (CE) và bột vi bao cao chiết (MEP). ........................................ 136
Hình 3.27. Sơ đồ mô tả con đường tác động kiểm soát đường huyết của sản phẩm vi bao
cao chiết vỏ thân Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC.) trên mô hình cá ngựa vằn ... 140
Hình 3.28. Ảnh hưởng của nhiệt độ (40 và 60oC) và độ ẩm tương đối (75 và 90%) đến
hàm lượng polyphenol của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ ........ 142
Hình 3.29. Ảnh hưởng của nhiệt độ (40 và 60 oC) và độ ẩm tương đối (75 và 90%) đến khả
năng chống oxy hóa của sản phẩm cao chiết vỏ thân Trâm vỏ đỏ ................................. 144
Hình 3.30. Ảnh hưởng của nhiệt độ (40 và 60 oC) và độ ẩm tương đối (75 và 90%) đến khả
năng ức chế α-amylase và α-glucosidase của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ theo thời gian bảo quản .................................................................................... 145
xvii
Tăng đường huyết mạn tính là đặc trưng cơ bản bệnh đái tháo đường (ĐTĐ), là bệnh
rối loạn chuyển hóa phổ biến do thiếu hoặc suy giảm hoạt tính insulin. ĐTĐ có nhiều
biến chứng liên quan tới hầu hết các cơ quan trong cơ thể như suy thận, thoái hóa võng
mạc, thần kinh, tim mạch hay hoại tử chi [369]. ĐTĐ là gánh nặng kinh tế - xã hội toàn
cầu, nằm trong nhóm 10 nguyên nhân gây tử vong hàng đầu thế giới với chi phí điều trị
liên tục gia tăng [209, 332]. Theo Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (International
Diabetes Federation, IDF, 2022), tỷ lệ người mắc ĐTĐ toàn cầu năm 2021 ước tính
10,5% dân số (tương đương 546,6 triệu người), dự đoán đến năm 2045 sẽ lên đến 12,2%
dân số (tương đương 783,2 triệu người) [366]. Theo báo cáo của Bộ Y tế, năm 1990 tỉ
lệ mắc bệnh ĐTĐ tại Việt Nam ở độ tuổi từ 20 - 79 là 1,2%, đến năm 2019, tỉ lệ này đã
tăng lên 5,7%. Hiện nay, Việt Nam có khoảng 7 triệu người mắc đái tháo đường với tỷ
lệ biến chứng hơn 55%. Sự gia tăng nhanh chóng khiến Việt Nam trở thành một trong
những quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ĐTĐ tăng nhanh nhất thế giới. Trong số bệnh
nhân ĐTĐ, có khoảng 90% là bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2. Tuy nhiên, chỉ có
khoảng 6% số bệnh nhân đạt được mục tiêu điều trị [366]. Theo các tài liệu y khoa, tăng
đường huyết kéo dài trong đái tháo đường là nguyên nhân cơ bản dẫn đến các biến chứng
nguy hiểm của đái tháo đường [249]. Do đó, kiểm soát gia tăng đường huyết là mục tiêu
tiên quyết trong phòng trị đái tháo đường.
Hiện nay, nhiều loại thuốc giúp kiểm soát đường huyết được sử dụng rộng rãi trong
điều trị đái tháo đường và cho thấy những hiệu quả nhất định. Tuy nhiên, những loại
thuốc này lâu dài gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn như nhiễm độc gan
(troglitazone), suy tim (rosiglitazone) [81] và chi phí điều trị cao [366]. Hợp chất tự
nhiên có hoạt tính sinh học đã khẳng định vai trò quan trọng trong nền y học cổ truyền
ở các nước phương Đông. Các loài cây thuốc được sử dụng để hạ đường huyết trong
nhiều bài thuốc cổ truyền ở nhiều nền văn hóa khác nhau. Nhiều dẫn liệu khoa học cho
thấy, hợp chất tự nhiên có nhiều lợi thế để phát triển các loại dược phẩm dựa trên nền
tảng cấu trúc của chúng như đa dạng sinh học các loài cây thuốc, sự đa dạng trong thành
phần hóa học và cấu trúc, tác dụng tương đương thuốc với độ an toàn tốt hơn, tính tương
hợp sinh học cao, tác động đa mục tiêu điều trị và đặc biệt là khả năng sản xuất với quy
mô lớn bằng cách tiếp cận công nghệ sinh học phù hợp [364]. Những hiểu biết về hợp
1
chất tự nhiên, cấu trúc, công dụng cung cấp các dẫn liệu khoa học quan trọng, làm cơ
sở cho việc phát triển các dược phẩm mới hoặc giải pháp mới cho điều trị/hỗ trợ điều trị
các bệnh lý rối loạn chuyển hóa, bao gồm kiểm soát đường huyết trong đái tháo đường
ngày càng được quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học [423]. Thực vật đóng góp
tới 25% vào nguyên liệu sản xuất thuốc chữa bệnh đái tháo đường với hơn 1.000 loài
thực vật, trong đó có đến 800 loài thực vật được ghi nhận từ tri thức bản địa của người
dân sinh sống tại vùng đệm [378]. Hiện nay, một số loại thuốc điều trị đái tháo đường
được tổng hợp dựa trên các khung cấu trúc các hoạt chất từ thực vật cho thấy hiệu lực
kiểm soát đường huyết cao như acarbose, androgrpholide, galegine, metformin [364].
Việt Nam đứng 16 trong nhóm 25 quốc gia có độ đa dạng sinh học lớn nhất thế giới
[144]. Trong đó, Tây Nguyên là khu vực có tài nguyên phong phú, quý hiếm với nhiều
vườn Quốc gia, khu bảo tồn thiên nhiên. Nguồn tài nguyên tri thức bản địa từ cộng đồng
dân tộc thiểu số sinh sống tại các vùng đệm, với nhiều bài thuốc chữa bệnh hay từ các
cây thuốc quý cần được bảo tồn và khai thác phù hợp. Theo cáo cáo của Mai et al. (2007),
Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.) là một trong những loài cây ăn được có
tiềm năng chống đái tháo đáo đường với khả năng ức chế α-glucosidase, chống oxy hóa
tốt và hàm lượng cao các hợp chất polyphenol [219]. Đáng chú ý, cao chiết vỏ thân cây
Trâm vỏ đỏ thu thập tại Tây Nguyên cho thấy tiềm năng ứng dụng hạ đường huyết thông
qua khả năng ức chế tốt các enzyme tiêu hóa tinh bột, làm chậm quá trình gia tăng đường
huyết sau ăn trên mô hình động vật thí nghiệm và an toàn ở nồng độ có hoạt tính [268].
Tuy nhiên, các thông tin về thành phần, cấu trúc các hợp chất hóa học, hoạt chất quyết
định đến khả năng hạ đường huyết của các loại cao chiết, và đặc biệt là khả năng bền
hóa hoạt tính của các hoạt chất bằng các vật liệu bao gói phù hợp nhằm nâng cao khả
năng ứng dụng thực tiễn còn chưa được công bố. Một nghiên cứu toàn diện về khả năng
vi bao cao chiết và đánh giá hiệu quả tác động trên cơ sở nghiên cứu thành phần hoạt
chất, cơ chế tác động phù hợp còn chưa được tiến hành. Trên cơ sở đó, tiến hành thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết từ cây
Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)”
2.1. Mục tiêu tổng quát
Xác định được thành phần các hợp chất chính trong cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ
đỏ và khả năng hạ đường huyết thông qua tác động đa mục tiêu của sản phẩm vi bao cao
2
chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ trên mô hình in vitro và in vivo, làm cơ sở nghiên cứu phát
triển các sản phẩm bảo vệ sức khoẻ trong kiểm soát đường huyết.
2.2. Mục tiêu cụ thể
− Xác định được ảnh hưởng của quá trình trích ly phân đoạn đến khả năng kiểm soát đường huyết đa mục tiêu của cao chiết phân đoạn vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ; từ đó xác định được cao chiết phân đoạn tiềm năng để phân lập và xác định cấu trúc của các hợp
chất chính có hoạt tính sinh học.
− Nâng cao tính sinh khả dụng và thời hạn bảo quản của cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ bằng kĩ thuật vi bao gói thông qua lựa chọn chất mang và điều kiện sấy phun phù hợp.
− Đối tượng nghiên cứu: Vỏ thân Cây Trâm vỏ đỏ, thu thập tại Khu bảo tồn thiên
nhiên Easo, Ea Kar, Đắk Lắk.
− Phạm vi nghiên cứu:
+ Đề tài tiến hành nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học trên cao chiết và sản phẩm vi bao cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.)
DC.) thu thập tại Khu bảo tồn thiên nhiên Easo, Eakar, Đắk Lắk.
+ Kết quả của nghiên cứu có thể sử dụng trong việc theo dõi kiểm soát chất lượng đầu vào nguyên liệu, phát triển các hướng ứng dụng của cao chiết trong hỗ trợ
phòng chống đái tháo đường.
− Địa điểm nghiên cứu: Phòng công nghệ sinh học các hợp chất tự nhiên có hoạt tính
sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Tây Nguyên.
− Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2021 đến tháng 12/2023.
5.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu cung cấp những dẫn liệu khoa học mới về khả năng hạ đường
huyết thông qua tác động đa mục tiêu của cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ; xác định
rõ các hoạt chất chính và tác động của cao chiết cũng như sản phẩm vi bao đến các gene
mục tiêu liên quan đến bệnh đái tháo đường, đồng thời bảo vệ hoạt tính của chúng bằng
phương pháp vi bao gói; góp phần quan trọng trong việc bảo tồn nguồn gene cây dược liệu
quý thông qua việc công bố các hoạt tính có giá trị.
3
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu nhằm khai thác vỏ thân Trâm
vỏ đỏ làm nguyên liệu phát triển thực phẩm chức năng hoặc thực phẩm thuốc ứng dụng
trong phòng chống đái tháo đường, góp phần làm gia tăng chuỗi giá trị trong hoạt động
khai thác tài nguyên thiên nhiên một cách an toàn và bền vững.
− Cung cấp những dữ liệu quan trọng về hiệu quả hạ đường huyết của cao chiết vỏ
thân cây Trâm vỏ đỏ và sản phẩm vi bao thông qua tác động đa mục tiêu gồm: Ổn định
đường huyết lúc đói, chống tăng đường huyết sau ăn, chống oxy hóa, kháng viêm, ổn
định hệ vi sinh vật đường ruột và điều hòa biểu hiện của các gene liên quan đến quá
trình tăng đường huyết ở mô hình cá ngựa vằn gây bệnh đái tháo đường. Cao chiết vỏ
thân cây Trâm vỏ đỏ và sản phẩm vi bao có khả năng điều hoà biểu hiện một số gene
liên quan đến kiểm soát quá trình sinh tổng hợp chất béo như SREBF1, ACC1, và FASN;
cải thiện kháng insulin thông qua gene insulin (INS), và thụ thể insulin (INSRA1 và
INSRB1); ức chế hấp thu glucose qua thành ruột thông qua gene SGLT1 và cải thiện
chuyển hóa glucose thông qua gene GLP1.
− Phân lập và xác định được cấu trúc của các hợp chất chính trong vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ thể hiện hoạt tính tiềm năng trong kiểm soát đường huyết. Trong đó, gallic acid,
catechin, epicatechin, ellagic acid, quercetin, caffeine và apigenin là các thành phần
chống oxy hóa quan trọng. Ethyl gallate và rutin là thành phần chính ức chế α-
glucosidase.
− Sử dụng maltodextrin kháng tiêu hóa làm chất mang vi bao gói cao chiết vỏ thân
cây Trâm vỏ đỏ bằng phương pháp sấy phun đã nâng cao được tính sinh khả dụng của
sản phẩm, nhờ vào sự tương tác phân tử giữa vật liệu bao gói và các hợp chất trong cao
chiết.
− Xây dựng được mô hình dự đoán thời hạn bảo quản của sản phẩm vi bao cao chiết
vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (Mô hình tuân theo quy luật hàm bậc nhất: Ct = C0. e−kt). Sản phẩm vi bao gói ổn định ở điều kiện nhiệt độ (40 °C) và độ ẩm môi trường bảo quản
(75%), với thời gian bán rã và suy thoái 90% hoạt tính lần lượt là 346,57 ngày và
1.151,29 ngày, so với cao chiết không vi bao lần lượt là 231,05 ngày và 767,53 ngày.
4
1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường
1.1.1. Sự gia tăng đường huyết và bệnh đái tháo đường
Sự gia tăng đường huyết (hyperglycemia), dấu hiệu rối loạn chuyển hóa [351], là
yếu tố dự báo tử vong độc lập trong nhiều trường hợp cấp tính, bao gồm nhồi máu cơ
tim, chấn thương, chấn thương sọ não và đột quỵ, và là dấu hiệu đặc trưng của bệnh đái
tháo đường [52]. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh lý rối loạn chuyển hóa rất phổ
biến ở loài người. Theo Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (International Diabetes
Federation, IDF, 2022), tỷ lệ người mắc bệnh ĐTĐ toàn cầu năm 2021 ước tính 10,5%
dân số (tương đương 546,6 triệu người), dự đoán đến năm 2045 sẽ lên đến 12,2% dân
số (tương đương 783,2 triệu người) [366]. Theo các tài liệu y khoa, tăng đường huyết
kéo dài trong bệnh đái tháo đường là nguyên nhân cơ bản gây tổn thương mạch máu,
tim, thận, mắt và thần kinh, dẫn đến các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng, còn được gọi là
các biến chứng do mắc bệnh đái tháo đường [249]. Do đó, kiểm soát gia tăng đường
huyết là mục tiêu tiên quyết trong phòng trị đái tháo đường.
ĐTĐ bao gồm rất nhiều loại (tuýp), tuy nhiên hai loại phổ biến nhất là ĐTĐ tuýp 1
và ĐTĐ tuýp 2. ĐTĐ tuýp 1, một bệnh lý tự miễn hiếm gặp, có nguyên nhân từ việc mất
khả năng sản sinh insulin do tế bào β bị tấn công bởi tế bào lympho T. Trong khi đó,
ĐTĐ tuýp 2 có đặc điểm là kháng hoặc suy giảm khả năng sản xuất insulin của tuyến
tụy. Người mắc ĐTĐ tuýp 1 thường có tuổi thọ rất thấp do có nguy cơ gặp phải các bệnh
lý tim mạch và rối loạn chuyển hóa nghiêm trọng, trong khi ĐTĐ tuýp 2 đe dọa sức
khỏe của hơn 95% số người mắc ĐTĐ toàn cầu [190]. Dù ở dạng nào thì điều đặc biệt
lưu ý là người mắc ĐTĐ cần được chẩn đoán và điều trị ở giai đoạn sớm nhằm hạn chế
và làm chậm lại các biến chứng nặng nề ở các mô và cơ quan [369].
1.1.2. Cơ chế tăng đường huyết trong bệnh đái tháo đường
1.1.2.1. Rối loạn chuyển hóa và chức năng hormone tuyến tụy
Tuyến tụy giữ vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình tiêu hóa, giúp duy trì cân
bằng chuyển hóa và năng lượng thông qua xuất tiết các enzyme tiêu hóa và hormone
tuyến tụy [323]. Trong đó, các hormone được sản xuất bởi các tế bào nội tiết hợp thành
khối mô được gọi là đảo tụy Langerhans. Tế bào α và tế bào β là hai nhóm tế bào chính
của đảo tụy phụ trách sản xuất các hormone quan trọng tham gia vào quá trình ổn định
5
đường huyết, lần lượt là glucagon và insulin. Đặc điểm cấu trúc đảo tụy và thành phần
các hormone cũng như mối liên hệ tác động đến một số mô cơ quan quan trọng trong
chuyển hóa glucose được mô tả ở Hình 1.1 (theo Ruud et al., 2017) [331].
Ghi chú: : kích thích; ⊥: ức chế
Cơ chế điều hòa đường huyết của hormone tuyến tụy mô tả trong Hình 1.2 (theo
Singh et al., 2022) [353]. Một cách tổng quát, insulin giúp tăng cường hấp thu glucose
ở các tế bào/mô ngoại vi (tế bào cơ, tế bào mỡ, …), ức chế quá trình tân tạo đường
(gluconeogenesis) ở gan, quá trình chuyển các cơ chất như amino acid, glycerol, lactate,
pyruvate thành glucose [229], và phân giải mỡ ở mô mỡ, giúp ổn định đường huyết sau
ăn. Ở chiều ngược lại, glucagon kích thích quá trình phân giải mỡ và tân tạo đường cũng
như quá trình giải phóng glucose từ glycogen ở gan, làm tăng đường huyết, cung cấp
năng lượng cho cơ thể [90]. Sự cân bằng trong hoạt động giữa insulin và glucagon giúp
ổn định đường huyết ở người bình thường và sự rối loạn xuất tiết các hormone này, như
gia tăng glucagon và suy giảm insulin, có thể dẫn đến gia tăng đường huyết [176, 331].
6
Các bằng chứng khoa học cho thấy, sự tổn thương tế bào β dẫn đến mất khả năng sản
xuất insulin là cơ chế bệnh sinh cơ bản của đái tháo đường tuýp 1 [325]. Trong khi đó,
sự rối loạn trong xuất tiết insulin và glucagon dẫn đến mất khả năng kiểm soát đường
huyết là cơ chế bệnh sinh cơ bản của đái tháo đường tuýp 2 [176, 193].
1.1.2.2. Kháng insulin và các yếu tố liên quan trong kiểm soát đường huyết
Kháng insulin là đặc trưng cơ bản của đái tháo đường tuýp 2. Trạng thái này được
mô tả khi các tế bào trong cơ thể suy giảm hoặc mất khả năng nhận diện/đáp ứng với
insulin trong khi hàm lượng insulin lưu hành trong máu vẫn ở mức cao. Tế bào β liên
tục sản sinh insulin trong thời gian dài dẫn đến suy kiệt và mất khả năng kiểm soát hàm
lượng hormone này dẫn đến các rối loạn chuyển hóa nghiêm trọng trong kiểm soát
đường huyết, gây bệnh đái tháo đường tuýp 2 [193]. Các bằng chứng khoa học cho thấy,
tình trạng kháng insulin gây ảnh hưởng và tác động đến hầu hết các mô cơ quan trong
cơ thể, gây nên các rối loạn như suy giảm hiệu suất hấp thu glucose ở mô cơ, tăng sản
sinh glucose và triglyceride ở gan, tăng quá trình phân giải mỡ và tích lũy đại thực bào
ở mô mỡ. Các rối loạn chuyển hóa này càng làm nghiêm trọng thêm sự kháng insulin, gây
tăng đường huyết và bệnh đái tháo đường tuýp 2 [274].
7
Có nhiều nguyên nhân gây nên tình trạng kháng insulin, trong đó các gốc tự do bao
gồm gốc oxy nguyên tử hoạt động (Reactive Oxygen Species - ROS) và gốc nitơ nguyên
tử hoạt động (Reactive Nitrogen Species - RNS) đóng vai trò quan trọng. Các gốc tự do
hình thành ở mức cao khi cơ thể sống ở trạng thái căng thẳng do các tác nhân môi trường
hoặc nội sinh, trong khi hệ thống chống oxy hóa tự nhiên của cơ thể suy giảm là nguyên
nhân cơ bản dẫn tới kháng insulin, mất chức năng tế bào β, giảm khả năng chuyển hóa
glucose và gây bệnh đái tháo đường tuýp 2. Bên cạnh đó, các gốc tự do thúc đẩy quá
trình glycosyl hóa các protein hoặc lipid trong điều kiện tăng đường huyết, hình thành
nên các sản phẩm glycate hoá bền vững (advanced glycated end-products, AGES) làm
nghiêm trọng thêm tình trạng bệnh [122].
Ngoài ra, tình trạng viêm mạn tính cấp độ thấp ở những người béo phì được xem là
yếu tố nguy cơ gây kháng insulin, thúc đẩy tình trạng tăng đường huyết trong đái tháo
đường [121]. Sự tích tụ mỡ thừa trong các mô mỡ ở người bệnh béo phì dẫn đến giải
phóng các phân tử gây viêm (cytokine) như các yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α) và
interleukin-6 (IL-6), thúc đẩy quá trình viêm, cản trở quá trình truyền tín hiệu insulin,
cuối cùng dẫn đến kháng insulin [54]. Bên cạnh đó, tình trạng viêm toàn thân đặc trưng
bởi sự gia tăng hàm lượng các protein C phản ứng (C-reactive protein, CRP) và các
cytokine tiền viêm làm suy yếu chức năng sản xuất insulin của tuyến tụy, gây rối loạn
chức năng tế bào β, gây tăng đường huyết [101]. Các con đường truyền tín hiệu để đáp
ứng các yếu tố gây viêm như dư thừa dưỡng chất, acid béo tự do, các cytokine gây viêm
như yếu tố nhân-kappa B (Nuclear Factor-kappa B, NF- B) và c-Jun N-terminal kinase
(JNK), có thể cản trở quá trình truyền tín hiệu insulin và thúc đẩy tình trạng kháng insulin
[24, 426].
1.1.3. Hệ vi sinh đường ruột và nguy cơ tăng đường huyết
Nhiều bằng chứng khoa học cho thấy mối liên hệ mật thiết giữa hệ vi sinh đường
ruột và đái tháo đường [204]. Hệ vi sinh đường ruột tác động đến sự cân bằng glucose
nội môi qua nhiều cơ chế khác nhau. Cụ thể, trong quá trình chuyển hóa thức ăn, các vi
sinh vật đường ruột tạo ra các tín hiệu trao đổi chất (metabolites) như các acid béo chuỗi
ngắn (short-chain fatty acids, SCFAs), amino acid chuỗi nhánh (branched-chain amino
acids, BCAAs) và các chất khác. Các tín hiệu này tác động đến quá trình chuyển hóa
glucose và lipid, quá trình tân tạo đường ở gan hay điều hòa các hormone incretin, gây
ảnh hưởng đến quá trình xuất tiết insulin ở tụy [75]. Bên cạnh đó, sự mất cân bằng hệ vi
8
sinh đường ruột liên hệ mật thiết đến tình trạng viêm mạn tính cấp độ thấp và kháng
insulin. Tình trạng này gây gián đoạn chức năng hàng rào ruột, chuyển vị các sản phẩm
bất lợi vào máu, thay đổi tính thấm thành ruột và gây viêm, làm giảm tín hiệu insulin
[336]. Khả năng điều hòa phản ứng viêm của một hệ vi sinh đường ruột cân bằng tác
động đến khả năng dung nạp glucose của tế bào [75]. Ngoài ra, hệ vi sinh đường ruột
giúp điều hòa nội tiết tố như glucagon-like peptide-1 (GLP-1) và peptide YY (YY) ở
ruột. Các nội tiết tố này có thể tác động lên não bộ giúp kiểm soát cảm giác no/đói, điều
chỉnh mức giải phóng insulin ở tụy và quá trình chuyển hóa glucose tổng thể [387]
Có thể thấy rằng, tăng đường huyết trong bệnh đái tháo đường là các rối loạn chuyển
hóa phức tạp liên quan đến nhiều cơ quan và chức phận trong cơ thể sống, gây ra nhiều
biến chứng nguy hiểm, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người bệnh. Do đó,
cần một phương thức tiếp cận toàn diện và có hệ thống nhằm tìm hiểu thấu đáo về cơ
chế kiểm soát đường huyết, từ đó đưa ra các phương thức tiếp cận phù hợp trong phòng
trị bệnh đái tháo đường.
1.2. Các phương pháp tiếp cận hiện đại nhằm kiểm soát đường huyết trong điều
trị bệnh đái tháo đường
1.2.1. Liệu pháp gene
Liệu pháp gene điều trị đái tháo đường dựa trên nguyên tắc tăng cường biểu hiện
gene insulin và glucokinase. Các kỹ thuật dùng vector chuyển gene sống như lentivirus,
adenovirus và vector tương đồng (adeno-asociated virus vector, AVV) [123] cũng như
các vector chuyển gene không sống khác như liposome và DNA trần, nhằm đưa gene
insulin đến các tế bào như tụy, gan, mỡ và cơ đã được nghiên cứu cho thấy những hiệu
quả nhất định trong việc kiểm soát đường huyết [369].
1.2.2. Tái tạo tế bào β tuyến tụy
Sự suy giảm số lượng và/hoặc chức năng của các tế bào β sản xuất insulin là một
trong những nguyên nhân gây tăng đường huyết. Do đó, bổ sung tế bào β chức năng
được xem là một chiến lược hiệu quả để chữa bệnh [419]. Phương pháp chuyển đổi tế
bào là liệu pháp tái tạo tế bào β thông qua việc kích thích biệt hóa từ các dòng tế bào
khác. Kỹ thuật này được mô tả là quá trình chuyển đổi từ tế bào này thành tế bào khác
thông qua việc lập trình lại quá trình biệt hóa tế bào [369]. Tuy nhiên, phương pháp này
có nhiều hạn chế liên quan đến tìm nguồn tế bào thay thế hoặc can thiệp vào giai đoạn
sớm của phôi, bị giới hạn bởi quy định đạo đức y sinh.
9
Phương pháp tế bào gốc được xem là cách tiếp cận thay thế hiệu quả cho phương
pháp lập trình biệt hóa tế bào. Nghiên cứu cho thấy tế bào gốc cảm ứng đa năng (induced
pluripotent stem cells, iPSCs), có khả năng tái lập trình nhân, tạo ra các phân tử nhỏ và
ribonucleic acid, vượt qua các phản ứng của hệ miễn dịch nhờ tính tương đồng di truyền,
có thể được sử dụng trong điều trị đái tháo đường [89]. Tế bào gốc trung mô
(Mesenchymal stem cells, MSCs), với khả năng điều hòa miễn dịch, sửa chữa và tái tạo
các mô bị hư hỏng, cũng cho thấy những hiệu quả nhất định trong điều trị [238].
Ngoài ra, phương pháp tác động vào quá trình tự tái tạo tế bào β nội sinh bằng cách
can thiệp vào các tín hiệu phân tử nhất định cũng được nghiên cứu như một chiến lược
bổ sung tế bào β. Tuy nhiên, liệu pháp này có những hạn chế nhất định về khả năng
kiểm soát chặt chẽ các quá trình phức tạp trong cơ thể và cần nghiên cứu sâu hơn để áp
dụng trên lâm sàng [438].
1.2.3. Liệu pháp insulin ngoại sinh
Thiếu hụt insulin được xem là nguyên nhân cơ bản dẫn đến sự gia tăng đường huyết
trong đái tháo đường. Do đó, bổ sung insulin ngoại sinh là giải pháp điều trị chính cho
bệnh nhân ĐTĐ tuýp 1 và là giải pháp ưu tiên sử dụng hoặc kết hợp với thuốc điều trị
khác đối với bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2, khi loại thuốc khác không còn phát huy tác dụng
kiểm soát đường huyết và HbA1c. Các minh chứng trên lâm sàng cho thấy, liệu pháp
insulin cho hiệu quả kiểm soát tốt đường huyết và làm giảm đáng kể các biến chứng liên
quan tới mạch máu. Tuy nhiên, liệu pháp này cần được hướng dẫn chi tiết và kiểm soát
chặt chẽ việc sử dụng vì các nguy cơ liên quan đến việc tiêm truyền hoặc khả năng gây
hạ đường huyết do quá liều [350, 377]
1.2.4. Thuốc điều trị bệnh đái tháo đường
Các bằng chứng khoa học cho thấy, đái tháo đường là bệnh lý có nguyên nhân đa
yếu tố, do đó các loại thuốc điều trị cũng có nhiều cơ chế và mục tiêu tác động nhằm
đạt được hiệu quả điều trị [117]. Hình 1.3 mô tả tổng quan các vị trí tác động và cơ chế
kiểm soát đường huyết trong điều trị đái tháo đường của các thuốc hiện đại.
Tuyến tụy là cơ quan phụ trách sản sinh các hormone nội sinh đảm bảo cân bằng
glucose nội môi. Cơ quan này có hai loại tế bào sản xuất hai loại hormon có chức năng
ngược nhau. Tế bào α sản sinh glucagon với chức năng kích thích giải phóng đường vào
máu, trong khi tế bào β sản sinh insulin làm tăng khả năng dung nạp đường của tế bào
10
và giảm lượng đường trong máu. Hoạt động phối hợp của hai hormon này giúp ổn định
đường huyết. Do đó, tuyến tụy là cơ quan mục tiêu hàng đầu trong tác động điều trị đái
tháo đường . Các thuốc tác động lên tuyến tụy theo hai cơ chế khác nhau. Các loại thuốc
như sulfonylureas, meglitinide có tác dụng tăng khả năng sản sinh insulin của tuyến tụy
[389]. Trong khi đó, incretin và amylin làm giảm khả năng xuất tiết glucagon [12, 59].
Đường ruột giữ vai trò quan trọng trong kiểm soát lượng đường đi vào máu, từ đó
tác động lớn đến diễn tiến của đái tháo đường [142]. Các nhóm thuốc tác động lên quá
trình hấp thu đường ở ruột giúp ổn định đường huyết có hiệu quả. Incretin có tác dụng
làm giảm nhu động ruột và làm chậm quá trình tiêu hóa ở dạ dày [59] và amylin tác
động làm giảm giải phóng enzyme tiêu hóa và acid mật vào dạ dày [12]. Các thuốc ức
chế trực tiếp hoạt động của α-glucosidase như acarbose, viglibose, và miglitol có hiệu
quả đáng kể trong kiểm soát lượng đường vào trong máu từ ruột [389].
Gan giữ vai trò quan trọng để đảm bảo cân bằng glucose nội môi. Quá trình chuyển
hóa đường ở gan trong một số trường hợp có thể làm gia tăng đường huyết [143].
Metformin có thể ức chế quá trình tân tạo đường ở gan từ đó làm giảm lượng đường đi
vào máu. Trong khi đó, Thiazolidinediones (TZDs) hoạt hoá thụ thể γ kích hoạt
peroxisome (Peroxisome proliferators–activated receptor γ, PPARγ), giúp tăng độ nhạy
của insulin trong tế bào mỡ, cơ tim và gan [389].
Quá trình kháng insulin có thể làm ngăn chặn sự hấp thu và chuyển hóa glucose ở
cơ bắp, mô mỡ. Tác dụng cải thiện độ nhạy của tế bào với insulin của metformin và 11
TZDs có hiệu quả chống đái tháo đường thông qua tăng cường chuyển hóa glucose ở tế
bào. Ngoài ra, hai loại thuốc này có tác dụng lên quá trình chuyển hóa lipid, làm giảm
đáng kể tác dụng gây độc của các chất béo dư thừa, từ đó cải thiện hiệu quả điều trị tổng
thể [389].
Thận giữ vai trò ổn định đường huyết thông qua hoạt động tái hấp thu đường nhờ
hoạt động kênh đồng vận chuyển natri-glucose 2 (Sodium-glucose co-transporter-2,
SGLT2). Gliflozins ức chế SGLT2 giúp tăng cường loại thải glucose qua thận và giảm
nồng độ glucose trong máu. Ngoài ra, nhóm thuốc này có thể tăng cường chức năng của
tế bào β, tăng độ nhạy insulin và giảm độc tính glucose nhờ kiểm soát được glucose niệu
[120, 389].
Não bộ có vai trò cơ bản trong kiểm soát đường huyết, hiểu biết về mối liên hệ này
cung cấp góc nhìn toàn diện hơn về các cơ chế gây tăng đường huyết ở đái tháo đường
tuýp 2 [21]. Incretin có thể tác động đến não bộ làm giảm cảm giác thèm ăn [59], hoạt
tính tương tự được báo cáo với amylin [12]. Thuốc chủ vận thụ thể dopamine,
bromocriptine, hiện được dùng trong kiểm soát và điều trị đái tháo đường tuýp 2 liên
quan đến việc tăng hàm lượng dopamine trong não bộ vào buổi sáng, giúp cải thiện độ
nhạy insulin, giảm sản xuất glucose ở gan, tăng khả năng chuyển hóa glucose [282].
Quá trình này chứng minh khả năng kiểm soát đường huyết thông qua phương pháp tiếp
cận đa mục tiêu của các thuốc điều trị đái tháo đường hiện nay.
Phương pháp tiếp cận đa mục tiêu có thể thực hiện qua phương thức kết hợp phù
hợp các loại thuốc khác nhau trong kiểm soát đường huyết và điều trị đái tháo đường.
Liệu pháp này được chứng minh có hiệu quả nhanh và giảm liều cho bệnh nhân [164].
Insulin kết hợp với metformin hoặc TZDs làm tăng hiệu quả kiểm soát đường huyết
[405, 417]. Insulin kết hợp với chất chủ vận thụ thể của peptide giống glucagon
(Glucagon-like peptide 1 receptor agonists, GLP-1Ras) có hiệu quả cao và an toàn với
bệnh nhân đái tháo đường thừa cân [239]. Chất ức chế SGLT2 có thể kết hợp với
metformin hoặc chất ức chế DPP4 để tăng cường hiệu quả kiểm soát đường huyết và
giảm cân, không gây tụt đường huyết [105, 232]. Sự phối hợp metformin liều thấp và
các loại thuốc thuộc nhóm TZDs có tác dụng ngăn chặn sự diễn tiến từ tiền đái tháo
đường thành đái tháo đường [369]
Các phương pháp điều trị dùng thuốc cho thấy hiệu quả ổn định nhanh chỉ số đường
huyết. Tuy vậy, hầu hết bệnh nhân cần một liệu pháp kết hợp để mang lại hiệu quả điều
12
trị lâu dài. Mặt khác, việc sử dụng các tác nhân hóa dược cần được xem xét nhiều khía
cạnh bao gồm giá, tác dụng phụ tiềm ẩn, các tác dụng tiềm năng, hiệu quả giảm đường
huyết và liều sử dụng, đặc biệt với người có nhiều bệnh lý nền phức tạp hoặc gặp các
biến chứng do đái tháo đường [369, 389].
1.3. Tiềm năng phòng chống bệnh đái tháo đường thông qua khả năng kiểm soát
đường huyết của các polyphenol từ thực vật
1.3.1. Hợp chất tự nhiên từ thực vật trong hỗ trợ phòng chống bệnh đái tháo đường
Theo Colegate et al. (2007), hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học là các hợp chất
hóa học được sản sinh bởi các sinh vật có tác dụng sinh học đến các sinh vật khác. Các
tác động bao gồm khả năng gây độc đối với người và động vật, khả năng gây độc chọn
lọc để chống lại các tác nhân gây hại lên sinh vật. Trong một số trường hợp, các tác động
này bao gồm khả năng điều trị một số bệnh lý ở người và động vật. Ngoài ra, các hợp
chất có hoạt tính sinh học là các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, giúp sinh vật chống lại
các tác động bất lợi từ môi trường, hoặc là các chất thiết yếu cho hoạt động sống của
sinh vật và ngẫu nhiên thể hiện hoạt tính ở các hệ thống sinh học khác [69]. Các hợp
chất tự nhiên từ lâu đã đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc khám phá các loại
thuốc ứng dụng trong điều trị nhiều bệnh lý khác nhau ở con người [390]. Trên thực tế,
rất nhiều loại thuốc đã được phát triển dựa trên nền tảng cấu trúc hóa học và hoạt tính
sinh học của các hợp chất tự nhiên, điển hình như morphine, cocaine, quinine, penicillin,
artemisinin [202].
13
Các hợp chất tự nhiên có thể được tạo ra bởi thực vật, vi khuẩn, nấm và vi nấm,
động vật và các hệ thống sinh học khác. Trong đó, các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc
từ thực vật, chủ yếu là cây thuốc, được quan tâm nhờ khả năng cung cấp đa dạng và
phong phú các hợp chất với nhiều giá trị dược học, hoạt tính sinh học chống lại nhiều
bệnh lý khác nhau, bao gồm bệnh đái tháo đường [14]. Nguồn tài nguyên thiên nhiên
này ngày càng được quan tâm nghiên cứu nhằm tìm ra các loại thuốc giúp kiểm soát
đường huyết hiệu quả hơn nhờ tính đa dạng trong thành phần hóa học và thuộc tính cấu
trúc [18]. Các nghiên cứu cho thấy, nhiều hợp chất tự nhiên từ thực vật có khả năng
kiểm soát đường huyết theo nhiều cơ chế đã được nghiên cứu và đánh giá ở các mô hình
nghiên cứu khác nhau. Hình 1.4 mô tả tổng hợp các nhóm hợp chất từ thực vật có khả
năng kiểm soát đường huyết và tiềm năng ứng dụng chống bệnh đái tháo đường
1.3.2. Khả năng kiểm soát đường huyết của các hợp chất polyphenol
Polyphenol là nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp có nguồn gốc thực vật được tổng
hợp từ l-phenylalanine hoặc l-tyrosine thông qua con đường phenylpropanoid. Cấu trúc
phân tử polyphenol gồm ít nhất một gốc phenolic là khung phân tử chính và tạo nên sự
đa dạng bậc nhất trong cấu trúc của các hợp chất tự nhiên, từ các phenolic acid đơn giản
đến các tannin polymer hóa rất phức tạp. Ngoài ra, sự có mặt của các gốc đường đơn
phân hoặc oligomer giúp mở rộng thêm sự đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học của
nhóm hợp chất này [385].
Polyphenol có thể được phân loại thành hai nhóm cơ bản: (1) các flavonoid bao gồm
anthocyanin, flavanol, flavanone, flavonol, flavonone, và isoflavone và (2) nhóm non‐
flavonoid gồm các phenolic acid, xanthone, stilbene, lignan và tannin, đều được gọi
chung là các polyphenol. Polyphenol phổ biến trong các loại thực vật ăn được và có tác
dụng hữu ích đối với sức khỏe con người ở các khía cạnh khác nhau như cải thiện bệnh
lý tim mạch, cao huyết áp, rối loạn chuyển hóa, béo phì, ung thư và đặc biệt là bệnh đái
tháo đường [107].
Các hợp chất polyphenol trong chế độ ăn có khả năng kiểm soát đường huyết thông
qua nhiều phương thức khác nhau như bảo vệ tế bào β, giảm stress oxy hóa, kích hoạt
tín hiệu insulin, kích thích tuyến tụy tiết insulin, ức chế hấp thu glucose, ức chế enzyme
tiêu hóa tinh bột, điều hòa hệ vi sinh vật đường ruột, điều chỉnh phản ứng viêm và ức
chế hình thành các sản phẩm glycat hóa bền vững (Advanced glycation end products,
AGEs). Hơn nữa, các polyphenol giúp cải thiện các biến chứng do sự gia tăng đường
14
huyết kéo dài như rối loạn chức năng mạch máu, các bệnh thoái hóa võng mạc, thần
kinh, cơ tim, bệnh mạch vành, suy thận [364].
Phenolic acid: Phenolic acid là nhóm có cấu trúc đơn giản nhất trong các hợp chất
polyphenol, được tìm thấy tương đối phổ biến trong rau củ quả, ngũ cốc, các loại đậu
và rượu không chưng cất. Các hợp chất như salicylic acid, protocatechuic acid, gallic
acid, syringic acid, ellagic acid, cinamic acid, p-coumaric acid, caffeic acid, ferulic acid,
synapinic aid, eugenol, chlorogenic acid, và rosmarinic acid có hiệu quả kiểm soát
đường huyết thông qua các cơ chế tác động khác nhau như tăng hấp thu glucose của các
mô ngoại vi, tăng cường sinh tổng hợp glycogen, cải thiện thành phần mỡ máu [383]
Coumarin và các dẫn xuất: Courmarin là các sản phẩm trao đổi chất bậc hai được
tìm thấy phổ biến trong thực vật, thường được dùng trong chống đông máu và chống
huyết khối. Coumarin và các dẫn xuất có hiệu quả kiểm soát đường huyết nhờ khả năng
bảo vệ tế bào β, cải thiện tín hiệu insulin, chống oxy hóa, kháng viêm, ức chế α-
glucosidase, và khả năng cải thiện các biến chứng của đái tháo đường [315]
Stilbene: Các nghiên cứu cho thấy, stilbene có khả năng hạ đường huyết và chống
đái tháo đường nhờ khả năng kiểm soát lượng thức ăn tiêu thụ và hấp thụ dưỡng chất,
ức chế α-glucosidase, kháng viêm, duy trì cân bằng glucose nội môi, bảo vệ tế bào β
đảo tụy [292]. Trong đó, resveratrol là một stilbene được quan tâm nghiên cứu với khả
năng làm giảm các rối loạn chuyển hóa, giảm triệu chứng và các biến chứng liên quan
đái tháo đường tuýp 2 [245, 292].
Lignan: Lignan là nhóm hợp chất polyphenol liên kết chất xơ phổ biến trong nhiều
loài cây và thực phẩm phổ biến như ngũ cốc, quả hạch, rau, hạt và các thức uống như
trà, coffee, và rượu không chưng cất. Quá trình chuyển hóa lignan chịu tác động lớn của
hệ vi sinh đường ruột [425]. Lignan tự nhiên được tìm thấy nhiều nhất là
secoisolariciresinol diglucoside có trong hạt lanh, có khả năng cải thiện độ nhạy insulin
thông qua tăng biểu hiện gene mã hoá chất vận chuyển glucose 4 (Glucose transporter
type 4, GLUT4) [396]. Furofuran lignans có hiệu quả kiểm soát đường huyết thông qua
khả năng ức chế α-glucosidase, và chống stress oxy hóa [404]
Flavonoid: Flavonoid là nhóm các polyphenol hòa tan có cấu trúc đặc trưng với hai
vòng benzene được gắn bởi một chuỗi ba carbon ngắn (C6-C3-C6). Flavonoid trong tự
nhiên được phân loại thành bảy nhóm: (1) anthocyanidin (cyanidin, delphinidin,
malvidin, peonidin, petunidin); (2) flavan-3-ol (catechin, epicatechin, gallocatechin); 15
(3) flavonol (isorhamnetin, kaempferol, myricetin, quercetin); (4) flavone (apigenin,
luteolin, baicalein, chrysin); (5) flavanone (eriodictyol, hesperetin, naringenin), (6)
isoflavone (daidzein, genistein, glycitein, biochanin A); và (7) chalcone (flavokawin,
butein, xanthoangelol, 4-hydroxyderricin, cardamonin, 2′,4′-dihydroxychalcone,
isoliquiritigenin, isosalipurposide, và naringenin chalcone) [343]. Flavonoid có nhiều
hoạt tính sinh học quan trọng như kháng virus, kháng viêm, chống oxy hóa, chống ung
thư, bảo vệ hệ tim mạch, và chống đái tháo đường [394]. Các đặc tính chống đái tháo
đường của flavonoid một phần do khả năng chống oxy hóa và khả năng điều chỉnh một
số tín hiệu tế bào [1]. Các flavonoid có tác dụng kiểm soát đường huyết đa mục tiêu
thông qua khả năng chống oxy hóa, kháng viêm, ức chế enzyme tiêu hóa, kích thích quá
trình dự trữ glycogen, hoạt hóa tín hiệu insulin, ức chế hình thành các AGEs [409]. Tác
dụng đa mục tiêu trong kiểm soát đường huyết của quercetin, một flavonol, được báo
cáo gần đây với khả năng kích thích tế bào dung nạp glucose, ổn định đường huyết,
giảm stress oxy hóa, cải thiện tình trạng kháng insulin, điều hòa các tín hiệu trao đổi
chất cơ bản của quá trình chuyển hóa glucose [97].
Tannin: Tannin là nhóm hợp chất polyphenol phân tử lượng lớn có trong các sản
phẩm tự nhiên như quả mọng, quả hạch, các loại đậu, sô-cô-la, gia vị và thảo mộc.
Tannin có khả năng tạo phức với protein và các hợp chất khác gây nên hiện tượng kết
tủa. Nhóm hợp chất này có thể phân thành hai nhóm cơ bản: (1) tannin thủy phân
(hydrolysable tannin) như gallic acid, ellagic acid và (2) tannin ngưng tụ (condensed
tannin) như gallocatechin, epigallocatechin, proanthocyanidin, procynidin. Tác dụng
chống đái tháo đường và các biến chứng liên quan đến thận, hệ thần kinh, tim mạch và
mắt của các tannin đã được ghi nhận [195]. Tannic acid có khả năng kích thích vận
chuyển glucose, ức chế sự biệt hóa tế bào mỡ 3T3-L1 bằng cách phosphoryl hóa thụ thể
insulin và chuyển vị chất vận chuyển glucose 4 (GLUT4). Ngoài ra, tannic acid còn có
thể ức chế hoạt động của các gene quan trọng cho quá trình tạo mỡ [1]. Theo Kunyanga
et al. (2011), tannin ngưng tụ chiết xuất từ hạt α-amaranth, hạt kê ngón, hạt đậu, hạt
hướng dương, lá dùi trống và rau dền có tác dụng kiểm soát đường huyết chủ yếu bằng
cách ức chế hoạt động của α-amylase và α-glucosidase [182].
1.3.3. Các cơ chế kiểm soát đường huyết của các hợp chất polyphenol
Hợp chất tự nhiên có nhiều lợi thế để phát triển các liệu pháp chống đái tháo đường
mới nhờ tính đa dạng trong cấu trúc phân tử, hoạt tính sinh học, khả năng đáp ứng tốt
16
và tác dụng phụ thấp [18, 313]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng, các hợp chất polyphenol có
thể kiểm soát đường huyết bằng các cơ chế và cơ quan tác động mục tiêu tương tự như
các thuốc điều trị thương mại hiện nay. Hình 1.5 mô tả một số con đường và cơ chế tác
động kiểm soát đường huyết của polyphenol trong phòng chống đái tháo đường (dựa
trên báo cáo của Arulselvan et al. (2014) [30] và Xu et al. (2018) [414] và cập nhật từ
các tài liệu liên quan khác). Cụ thể, các polyphenol có thể: (1) điều hòa quá trình xuất
tiết các hormon và phục hồi chức năng tuyến tụy; (2) ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột
và giảm lượng đường hấp thu qua ruột; (3) cải thiện độ nhạy insulin ở các mô, cơ quan;
(4) giảm sản xuất glucose và sinh tổng hợp cholesterol ở gan; (5) tăng quá trình hấp thu
và chuyển hóa glucose ở cơ; (6) điều hòa quá trình sinh tổng hợp chất béo; (7) điều hòa
hoạt động não bộ và giảm cảm giác thèm ăn [414]. Ngoài ra, các hợp chất tự nhiên còn
thể hiện qua khả năng chống oxy hóa và kháng viêm, giúp bảo vệ mô/cơ quan trước các
quá trình lão hóa gây suy thoái chức năng và cân bằng chuyển hóa glucose [1, 104]. Đặc
biệt, một số hợp chất polyphenol còn có tác dụng kiểm soát đường huyết thông qua tác
động lên hệ vi sinh đường ruột [93, 365]
17
1.3.3.1. Phương thức tiếp cận phụ thuộc insulin
Phương thức tiếp cận phụ thuộc insulin liên quan tới các quá trình thúc đẩy sản xuất
và tăng cường độ nhạy insulin [364]. Tuyến tụy là cơ quan nội tiết giúp sản xuất các
hormone quan trọng trong chuyển hóa đường glucose. Các vấn đề liên quan đến tuyến
tụy thường dẫn đến sự mất cân bằng glucose và là cơ chế bệnh sinh quan trọng của đái
tháo đường [193]. Do đó, tụy là cơ quan đích của nhiều liệu pháp điều trị bệnh đái tháo
đường.
Nhiều nhóm hợp chất tự nhiên có khả năng bảo vệ tế bào β tuyến tụy trước các tác
nhân phá hủy tế bào, từ đó giảm quá trình chết, thúc đẩy tăng sinh tế bào β, đảm bảo
lượng insulin được xuất tiết [338]. Các polyphenol có thể bảo vệ tế bào β bằng khả năng
chống stress oxy hóa, phục hồi chức năng ty thể, kháng viêm hay thay đổi tín hiệu của
con đường autophagy/mitophagy [126]. Hoạt động ổn định của tuyến tụy tác động tích
cực đến các quá trình sinh tổng hợp và thủy phân glycogen, quá trình tân tạo đường
(glyconeogenesis) ở gan, tăng cường hấp thu và chuyển hóa đường ở các tế bào ngoại
vi, từ đó ổn định được đường huyết [364].
1.3.3.2. Phương thức tiếp cận không phụ thuộc insulin
Các phương thức tiếp cận độc lập với insulin trong kiểm soát đường huyết rất đa
dạng, bao gồm ức chế hấp thu glucose vào máu, ức chế hệ enzyme tiêu hóa tinh bột,
điều chỉnh các phản ứng viêm, tăng cường các phản ứng chống oxy hóa nội sinh, ức chế
sự hình thành các AGEs, điều hòa hệ vi sinh đường ruột [364].
a. Ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột
Tinh bột từ thức ăn được thủy phân dưới tác dụng của các enzyme tiêu hóa tạo thành
glucose trước khi xâm nhập vào máu và làm gia tăng đường huyết sau ăn. Giảm lượng
đường xâm nhập vào máu và làm chậm quá trình giải phóng đường vào máu là giải pháp
cơ bản giúp kiểm soát sự gia tăng đường huyết sau ăn và có hiệu quả cao trong phòng
trị đái tháo đường [50].
α-amylase và α-glucosidase là hai enzyme tác động đến quá trình thủy phân tinh bột
trong đường tiêu hóa. α-amylase giúp cắt nhỏ các chuỗi polysacharide đường bột thành
những đoạn ngắn và đường đôi trước khi những phân tử này tiếp tục bị thủy phân bởi
α-glucosidase thành glucose đi vào máu. Ức chế α-amylase và α-glucosidase được xem
là giải pháp hiệu quả trong điều trị đái tháo đường [136] với một số loại thuốc được
thương mại hóa như acarbose, miglitol và voglibose [364]
18
Những hạn chế của thuốc điều trị thúc đẩy các nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế α-
amylase và α-glucosidase hiệu quả và an toàn hơn từ hợp chất tự nhiên. Các hợp chất tự
nhiên có hoạt tính ức chế α-amylase và α-glucosidase rất đa dạng bao gồm các polyphenol,
saponin, terpenoid, alkaloid, trong đó nhóm terpenonid và flavonoid có các hợp chất phong
phú nhất [102]. Các báo cáo khoa học cho thấy nhóm polysaccharide tự nhiên từ thực vật
cũng có tiềm năng ứng dụng như các chất ức chế enzyme tiêu hóa đường bột và làm chậm
quá trình gia tăng đường huyết sau ăn [83].
b. Ức chế/chuyển vận chất vận chuyển glucose liên hợp natri
Các chất vận chuyển glucose (Glucose transporter, GLUT) và chất đồng vận chuyển
glucose-natri (Sodium-glucose cotransporter, SGLT) đóng vai trò quan trọng nhằm duy
trì sự ổn định đường huyết thông qua kiểm soát hàm lượng glucose xâm nhập vào máu
qua thành ruột hay ở thận [255]. Ở ruột, các SGLT1 giúp hấp thụ glucose vào tế bào
biểu mô ruột trước khi chúng được chuyển vào máu bởi GLUT2. Ở thận, SGLT2 và
SGLT1 giúp tái hấp thu glucose được lọc từ nước tiểu vào tế bào biểu mô thận trước khi
GLUT2 và GLUT1 vận chuyển chúng từ các tế bào biểu mô trở lại máu [49]. Thuốc ức
chế SGLT có thể làm chậm tốc độ hấp thu glucose ở ruột và tăng đào thải glucose qua
thận vào nước tiểu ở bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2, được xem là liệu pháp điều trị
đái tháo đường hiệu quả [368]. Các nghiên cứu nhằm sàng lọc từ tự nhiên hoặc tổng hợp
hóa học các chất ức chế SGLT1/SGLT2 được quan tâm trong thời gian gần đây [280].
Phlorizin, một flavonoid được tìm thấy trong vỏ rễ, lá, chồi và quả cây táo, có thể gia
tăng đào thải glucose qua đường tiết niệu ở người khỏe mạnh thông qua khả năng ức
chế hoạt động của SGLT2 [321]. Do hạn chế về khả năng hòa tan của phlorizin, các hợp
chất tổng hợp hóa học được phát triển dựa trên gốc phlorizin với hoạt tính ức chế SGLT2
đã được chấp thuận trong điều trị đái tháo đường tuýp 2 bao gồm canagliflozin,
dapagliflozin, empagliflozin, ipragliflozin, ertugliflozin, bên cạnh rất nhiều hợp chất
khác đang được thử nghiệm trên lâm sàng [237]. Trong số đó, dapagliflozin là thuốc ức
chế SGLT2 đầu tiên được sử dụng trong điều trị đái tháo đường [20, 99]. Đáng chú ý,
sotagliflozin, hợp chất có khả năng ức chế đồng thời SGLT1 và SGLT2 được chấp thuận
trong điều trị bệnh tim mạch [66], có khả năng làm giảm đáng kể khả năng tử vong do
tim ở bệnh nhân đái tháo đường với tình trạng suy tim nặng [45]. Ngoài ra, các hợp chất
tự nhiên khác như chlorogenic acid, quercetin, kaempferol, kurarinone, và
sophoraflavanone cũng đang được nghiên cứu như các chất ức chế SGLT tiềm năng [237].
19
c. Chống oxy hóa và kháng viêm
Viêm và stress oxy hóa là các cơ chế bệnh sinh phổ biến ở nhiều bệnh lý rối loạn
chuyển hóa. Tình trạng viêm và stress oxy hóa mạn tính giữ vai trò quan trọng trong sự
khởi phát và diễn tiến, đặc biệt là các biến chứng nghiêm trọng của đái tháo đường [46].
Các phản ứng viêm mạn tính ở mức độ thấp sinh ra các gốc tự do hoạt động mạnh, các
gốc này tác động bất lợi đến các mô/tổ chức và gây tổn thương, phá hủy các cơ chế
chống oxy hóa tự nhiên của cơ thể, từ đó gây nên các rối loạn chuyển hóa, tình trạng
kháng insulin và bệnh đái tháo đường [273]. Do đó, chống oxy hóa và kháng viêm là một
trong những yêu cầu quan trọng trong kiểm soát đường huyết, giúp phòng chống đái
tháo đường hiệu quả.
Khả năng chống oxy hóa là đặc tính nổi bật của hầu hết các hợp chất tự nhiên ở thực
vật và giúp con người giảm nguy cơ mắc các bệnh lý chuyển hóa mạn tính thông qua
tiêu thụ các rau, củ, quả tươi giàu hợp chất chống oxy hóa [162]. Khả năng chống đái
tháo đường của các hợp chất flavonoid có liên hệ mật thiết với khả năng chống oxy hóa
của chúng [1]. Quercetin thể hiện khả năng giảm stress oxy hóa và cải thiện độ nhạy
insulin, là hợp chất có tiềm năng chống lại các biến chứng do đái tháo đường [97]. Hiệu
quả chống biến chứng đái tháo đường của resveratrol có đóng góp đáng kể của khả năng
kích hoạt các cơ chế chống oxy hóa nội sinh [157]. Berberine, hợp chất thuộc nhóm
alkaloid, chống stress oxy hóa và kháng viêm thông qua một số con đường phức tạp bao
gồm một số kinase và con đường truyền tín hiệu liên quan đến NF-κB (Nuclear factor-
κB) và AMPK (AMP-activated protein kinase), từ đó cải thiện đáng kể các triệu chứng
của bệnh đái tháo đường [217].
d. Ức chế sự hình thành các sản phẩm glycat hóa bền vững (AGEs)
Trong điều kiện đường huyết cao, rối loạn mỡ máu và stress oxy hóa kéo dài dẫn
đến sản sinh và tích luỹ các các AGEs. AGEs là sản phẩm cuối cùng của phản ứng tạo
liên kết ngang giữa đường và protein hoặc lipid hoặc peptides. Các phân tử này đóng
góp vào quá trình hình thành và diễn tiến đến các biến chứng do mắc bệnh đái tháo
đường [376]. Các lựa chọn liên quan tới lối sống như chế độ ăn uống, ít vận động, hút
thuốc lá, … có thể thúc đẩy hình thành các AGEs, gây nên trạng thái stress oxy hóa,
viêm và tiến triển các bệnh lý chuyển hóa, bao gồm đái tháo đường [304, 330]. Do đó,
ức chế sự hình thành các AGEs được xem là mục tiêu quan trọng trong các can thiệp
làm giảm các biến chứng do đái tháo đường [216].
20
Các nghiên cứu cho thấy một số hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế sự hình thành
AGEs như polyphenol, polysaccharide, terpenoid, vitamin và alkaloid, trong đó nhiều
hợp chất có khả năng ứng dụng chống đái tháo đường như resveratrol, curcumin, ursolic
acid, berberine, ….. Các cơ chế ức chế bao gồm trung hòa gốc tự do, tạo phức kim loại
nặng, thu nhận các hợp chất carbonyl hoạt động, bảo vệ các vị trí có khả năng bị đường
hóa của protein, và giảm lượng đường trong máu [357]. Hoạt tính ức chế hình thành
AGEs cho thấy khả năng ứng dụng các hợp chất tự nhiên như một cách tiếp cận đa mục
tiêu, hiệu lực và hiệu quả trong phòng trị đái tháo đường.
1.3.3.3. Phương thức tiếp cận trung gian qua hệ vi sinh vật đường ruột
Sự thay đổi hệ vi sinh đường ruột giữ vai trò quan trọng trong sự khởi phát, tiến
triển của béo phì và bệnh đái tháo đường tuýp 2. Sự suy giảm đa dạng hệ vi sinh vật
đường ruột liên quan đến kháng insulin và rối loạn chuyển hóa năng lượng. Sự thay đổi
các hợp chất trao đổi đi kèm với rối loạn vi khuẩn đường ruột, kéo theo rò rỉ độc tố và
thay đổi tính thấm thành ruột, gây ảnh hưởng rõ rệt đến sự khởi phát và tiến triển của
bệnh đái tháo đường tuýp 2 [38, 406]. Do đó, hệ vi sinh đường ruột trở thành mục tiêu
tác động mới trong phòng trị đái tháo đường [145]. Cơ chế tác dụng kiểm soát đường
huyết thông qua hệ vi sinh đường ruột của các hợp chất tự nhiên được mô tả ở Hình 1.6
(theo Xia et al. (2021) [406] và các công bố khác có liên quan).
Hợp chất tự nhiên kiểm soát đường huyết thông qua hệ vi sinh đường ruột với nhiều
cơ chế tác động khác nhau bao gồm: (1) điều chỉnh thành phần và sự phong phú của hệ
vi sinh đường ruột; (2) giảm tính thấm thành ruột, ngăn chặn sự xâm nhập của các thành
phần bất lợi, giảm viêm; (3) tăng quá trình tổng hợp các acid béo chuỗi ngắn (short-
chain fatty acids, SCFAs); (4) tăng sinh tổng hợp và chuyển hóa các acid béo chuỗi
nhánh (branched-chain fatty acids); (5) giảm hàm lượng các lipopolysaccharide; (6) ức
chế quá trình viêm mạn tính mức độ thấp (Low-grade inflammation) [406]
Các flavonoid bao gồm epigallocatechin-3-gallate (EGCG), curcumin, allicin,
quercetin, genistein (GEN), capsaicin, rhein, betacyanin, pectin, vaccarin, hesperetin-7-
O-glucoside, prunin, và isoquercitrin đã được nghiên cứu về khả năng kiểm soát đường
huyết thông qua tác động đến hệ vi sinh vật đường ruột và cho thấy hiệu quả tích cực
[145, 288]. Nghiên cứu cho thấy, rutin giúp cải thiện tình trạng đái tháo đường thông
qua giảm nồng độ glucose máu, cải thiện các chỉ số mỡ máu, các tín hiệu viêm như yếu
tố hoại tử khối u-α (tumor necrosis factor-α, TNF- α), interleukin-6 (IL-6), hàm lượng
21
insulin. Đặc biệt, rutin giúp giảm bớt các tổn thương ở ruột kết và điều chỉnh hệ vi sinh
đường ruột ở chuột mắc đái tháo đường [57].
Hiểu biết về mối liên hệ giữa đái tháo đường với hệ vi sinh đường ruột cung cấp
góc nhìn mở rộng hơn về tính hệ thống và tính đa dạng trong các cơ chế bệnh sinh của
đái tháo đường. Cách tiếp cận phòng trị thông qua điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột
và các quá trình chuyển hóa liên quan bằng các hợp chất tự nhiên mang đến một giải
pháp toàn diện nhằm kiểm soát bệnh đái tháo đường có hiệu quả [290].
Có thể thấy sự đa dạng và phong phú của các hợp chất polyphenol từ thực vật cùng
với các hoạt tính sinh học quý của chúng là một nguồn tài nguyên lớn. Các báo cáo hiện
tại cho thấy, polyphenol là tác nhân phòng trị đái tháo đường độc lập hoặc cộng hợp thể
hiện qua khả năng kiểm soát đường huyết, đều ghi nhận những hiệu quả nhất định. Bên
cạnh đó, các tính chất liên quan đến độc tính, tác dụng phụ cần được tính đến. Do đó,
mặc dù có rất nhiều tiến bộ trong thời gian gần đây, nhưng vẫn cần rất nhiều các nghiên
cứu sâu hơn nhằm làm sáng tỏ cơ chế tác dụng, mối liên hệ giữa cấu trúc và chức năng
của các hợp chất polyphenol tiềm năng, từ đó khai thác có hiệu quả nguồn tài nguyên
phong phú này.
22
1.4. Chi Trâm (Syzygium sp.) và tiềm năng phòng chống bệnh đái tháo đường
1.4.1. Khả năng kiểm soát đường huyết của một số cây thuốc thuộc Chi Trâm
Trâm (Syzygium sp.) là chi có độ đa dạng cao với khoảng 1.200 đến 1.800 loài, hầu
hết là cây bụi và thường xanh. Những đặc điểm sinh học được ghi nhận như phần thân
thô ráp, bong tróc với lớp vỏ màu xám đen, càng lên cao càng mịn và nhạt màu. Gỗ có
khả năng chống nước. Lá thường xanh, hình elip có thể cùn hoặc thuôn với đỉnh nhọn,
có màu xanh đậm, bóng và có mùi như nhựa thông. Quả màu xanh lục hoặc nâu hình
thuôn dài, chứa một hạt đơn, hương vị thay đổi từ chua đến ngọt vừa. Hiện nay, các
nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các cây thuốc chi Trâm được công bố khá nhiều,
đặc biệt là khả năng chống oxy hóa và hạ đường huyết trên các mô hình gây bệnh đái
tháo đường. Các loài thuộc chi Trâm có tiềm năng ứng dụng phòng chống đái tháo đường
bao gồm S. alternifolium, S. aqueum, S. aromaticum, S. calophyllifolium, S. cumini, S.
malaccense, S. polyanthum, và S. samarangense [442]. Bảng 1.1 tổng hợp các nghiên
cứu về khả năng kiểm soát đường huyết và phòng chống bệnh đái tháo đường của một
số loài cây thuốc thuộc chi Trâm.
[168]
Syzygium alternifoliu m
Giảm đáng kể đường huyết và chỉ số HbA1c; Chống lại sự gia tăng mỡ máu; Bảo vệ gan và thận
[223]
Syzygium aqueum
[103]
Syzygium aromaticum
tế bào
Chiết xuất vỏ thân/Mô hình tế bào SV40 MES13 và chuột mắc bệnh đái tháo đường do Streptozotocin
Đường huyết, HbA1c; Chỉ số lipid máu; Chỉ số men gan; Chỉ số chức năng thận: urea và creatinine chế năng ức Khả enzyme α-amylase, α- aldose glucosidase, trình reductase; Quá hình thành các sản phẩm glycate hóa bền vững Sự hình thành sản phẩm glycate hóa bền vững (AGEs); Khả năng gây độc tế bào; Chống oxy hóa; Đường huyết; khối thận; albumin lượng nước tiểu; Biểu hiện Nrf2/Glo1;
Ức chế hiệu quả α-amylase, α-glucosidase hơn so với acarbose; Ức chế aldose reductase và chống lại sự hình thành các sản phẩm glycate hóa bền vững; Cải thiện stress oxy hóa và trước bảo vệ methylglyoxal (MG); Giảm các chỉ thị (đường huyết, kích thước thận, albumin nước tiểu) ở chuột mắc bệnh đái tháo đường; ức chế sự hình thành AGEs do ngộ độc đường và stress oxy hóa thông qua con đường Nrf2/Glo1
23
[77]
Syzygium calophyllifo lium
[17]
Syzygium cumini
Giảm mức đường huyết ở chuột mắc bệnh đái tháo đường sau 15 ngày tác động; Chống suy giảm khối lượng cơ thể; Ổn định các chỉ số huyết học và chống oxy hóa in vivo; Bảo vệ cấu trúc gan, thận, tụy Giảm đường huyết lúc đói và HbA1c; tăng tích lũy tiết glycogen và xuất insulin; cải thiện chức năng tế bào β; giảm các chỉ số viêm.
[32]
Syzygium malaccense
xuất
Chiết xuất từ lá giàu Myricitrin/Mô hình chống đái tháo đường in vitro
PRKAG2,
Mức đường huyết; Chỉ số khối cơ thể; Chỉ số huyết học phản ánh chức năng gan, thận, tụy; Chỉ số chống oxy hóa in vivo bao gồm SOD, CAT, GST, GSH và GR Chống gia tăng đường huyết (đường huyết lúc đói, HbA1c, mức kháng insulin, nồng độ lipid bị oxy hóa, hoạt tính glucose-6-phosphatase) và các chỉ số kháng viêm Ức chế α-amylase và α- glucosidase; quá trình thu adiogenesis; hấp glucose; tiết adiponectin; biểu hiện gene trong quá trình biệt hóa tế bào tiền mô mỡ 3T3-L1
[76]
Syzygium mundagam
Các chiết xuất từ vỏ thân/Mô hình chuột mắc bệnh đái tháo đường do Streptozotocin
Ức chế hoạt động của enzyme tiêu hóa tinh bột; kích hoạt con đường tín hiệu insulin tăng cường hấp thu glucose và biệt hóa tế bào 3T3-L1. Điều hòa biểu hiện gene Akt1, PPARγ, Slc2a4, và adiponectin Chiết xuất methanol có khả năng chống oxy hóa tốt nhất; Cao chiết methanol chống lại sự gia tăng đường huyết sau ăn và có khả năng giảm mức đường huyết ở chuột mắc bệnh đái tháo đường
[400]
Syzygium polyanthum
Hiệu quả giảm đường huyết; Tác động đáng kể lên thành phần lipid máu; Tác dụng của chiết xuất thô là cao nhất thông qua tác động cộng gộp;
lượng phenolic, Hàm tannin, flavonoid; Khả năng chống oxy hóa in vitro (DPPH, ABTS, phospho-molybdenum, FRAP, Superoxide, Nitric oxide, tạo phức kim loại); Khả năng ổn định đường huyết trên chuột Chỉ số đường huyết; Hàm lượng insulin máu; Thành phần lipid máu; Hóa mô miễn dịch tế bào β; Phân tích ái lực với thụ thể protein trên mô hình in silico
[188]
Syzygium samarangen se
Chiết xuất methanol từ lá và các phân đoạn/Mô hình chuột mắc bệnh đái tháo đường do Streptozotocin và mô hình in silico Chiết xuất từ quả/Mô hình chuột mắc bệnh đái tháo đường do Streptozotocin
Giảm đường huyết; tăng khối lượng cơ thể, hàm lượng insulin huyết thanh và tuyến tụy, HOMA-B; Cải thiện chức năng tế bào β; Giảm stress oxy hóa; Giảm viêm;
insulin lượng Hàm huyết thanh, HOMA-B; Biểu hiện insulin tuyến tụy; Biểu hiện các quan liên protein apoptosis, chống oxy hóa và cytokine tiền viêm;
24
Các công bố cho thấy tiềm năng của các chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của cây
bao gồm lá, hoa, quả và hạt từ các loài Syzygium sp. trong việc cải thiện đường huyết và
các chỉ số khác liên quan bệnh đái tháo đường trên mô hình động vật. Chiết xuất từ quả
và hạt của S. cumini cho hiệu quả hạ đường huyết và tăng hàm lượng insulin cao hơn đối
chứng, trong đó chiết xuất từ hạt cho hiệu quả cao hơn từ 2% đến 3% so với quả trên mô
hình chuột gây đái tháo đường bởi sucrose [317]. Chiết xuất lá của S. cumini giảm đường
huyết, chỉ số HbA1, nồng độ lipid bị oxy hóa, hoạt tính glucose-6-phosphatase và các chỉ
số kháng viêm trên mô hình chuột gây đái tháo đường bởi alloxan [17]. Cao chiết từ lá S.
polyanthum có khả năng hạ đường huyết trên mô hình chuột gây đái tháo đường bởi
alloxan, với liều hiệu quả là 5 mg/kg [388]. Tác dụng chống đái tháo đường của chiết
xuất lá S. polyanthum nhờ khả năng ức chế α-glucosidase và chống oxy hóa với giá trị
ức chế lần lượt 41,4% và 49,4% ở nồng độ 50 µg/ml [96]. Chiết xuất lá S. samarangense
cũng cho thấy khả năng hạ đường huyết trên mô hình chuột mắc bệnh đái tháo đường
[341]. Hoạt chất vescalagin từ quả S. samarangense giúp tăng cường khả năng hấp thụ
glucose ở gan, hạ đường huyết nhanh và gia tăng hàm lượng cholesterol tỷ trọng cao
trên mô hình chuột mắc bệnh đái tháo đường [344]. Chiết xuất từ hạt S. calophyllifolium
có tác dụng ngăn chặn đáng kể tổn thương mô do đái tháo đường, bảo vệ chống lại sự
ly giải lyzosome và sự giải phóng enzyme nhờ sự có mặt của các hợp chất thứ cấp [140].
Chiết xuất từ nụ hoa S. aromaticum thể hiện khả năng chống oxy hóa mạnh, ức chế α-
glucosidase và α-amylase trong thực nghiệm in vitro [11]. Cao chiết ethanol từ nụ hoa
S. aromaticum, với liều 0,5 g/100g chế độ ăn trong 3 tuần, có hiệu quả hạ đường huyết
trên chuột mắc bệnh đái tháo đường tốt hơn pioglitazone [183]. Chiết xuất từ hạt S.
alternifolium cũng cho thấy hiệu quả giảm đường huyết trên mô hình chuột mắc bệnh
đái tháo đường tương đương glibenclamide [319].
Một số báo cáo gần đây cho thấy các chiết xuất từ vỏ thân một số loài cây thuộc chi
Trâm cũng có tiềm năng chống đái tháo đường cao, dù các công bố còn chưa nhiều
[341]. Chiết xuất methanol từ vỏ thân S. mundagam chống oxy hóa mạnh, ổn định đường
huyết sau ăn lên đến 180 phút và khả năng hạ đường huyết mạnh trên mô hình chuột đái
25
tháo đường [76]. Chiết xuất từ vỏ thân S. aromaticum có khả năng giảm độc tính do đái
tháo đường gây nên qua con đường Nrf2/Glo1 [103]. Chiết xuất từ vỏ thân S.
calophyllifolium giúp hạ đường huyết trên mô hình chuột mắc bệnh đái tháo đường sau
15 ngày điều trị ở nồng độ 100 - 200 mg/kg khối lượng cơ thể, đồng thời đưa các chỉ
tiêu huyết học và lipid máu về mức bình thường [77].
Các báo cáo chỉ ra các hợp chất có tác dụng chống đái tháo đường chứa trong các
chiết xuất từ các một số loài cây thuộc Chi Trâm có tiềm năng ứng dụng cao và các cơ
chế tác dụng liên quan. Chiết xuất nước và ethanol từ vỏ cây S. malaccense chứa tannin,
triterpenoid, glycoside và flavonoid có tác dụng hạ đường huyết trên chuột đái tháo
đường tương đương glibenclamide [37]. Các dẫn xuất myricetin, myricitrin từ lá S.
malaccense có khả năng chống oxy hóa, ức chế α-glucosidase và α-amylase [31] và thể
hiện tác dụng tương tự insulin như tăng cường hấp thu glucose, tăng tiết adiponectin và
giảm tích tụ lipid bằng cách kích hoạt con đường truyền tín hiệu insulin [32]. Thành
phần hợp chất có tiềm năng ứng dụng trong phòng chống đái tháo đường của S.cumini
(L.) Skeels bao gồm anthocyanin, glucoside, ellagic acid, isoquercetin, kaemferol và
myrecetin [35]. Sáu hoạt chất flavonoid trong chiết xuất ethanol từ lá S. aqueum có hoạt
tính ức chế α-glucosidase bao gồm myrigalone-B, myrigalone-G, phloretin, europetin-
3-O-rhamnoside, myricetin-3-O-rhamnoside và 4-hydroxybenzaldehyde [223]. Các thử
nghiệm khác về tác dụng chống đái tháo đường của các chất từ S. aromaticum như
oleanolic acid (OA) và maslinic acid (MA) trên mô hình chuột đái tháo đường cho thấy
hiệu quả tác động ức chế hoạt động của các enzyme làm tăng nồng độ glycogen [258]
hay α-glucosidase, sucrase, α-amylase, chất vận chuyển glucose (GLUT2) và chất vận
chuyển liên hợp natri-glucose (SGLT1) [192].
1.4.2. Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)
Giới: Plantae
Ngành: Angiosperms
Lớp: Eudicots
Bộ: Myrtales
Họ: Myrtaceae
Chi: Syzygium
Loài: Syzygium zeylanicum (L.) DC. (Eugenia zeylanica Wight., Myrtus zeylanica L.)
26
Trâm vỏ đỏ là cây gỗ có
kích thước trung bình, cành màu
cam, thường nứt vỏ. Lá xoan,
tròn hay tù ở gốc, đầu nhọn dài,
tù, dài 6-10 cm, rộng 25-40 mm,
sáng bóng và nhạt ở trên, nhạt
màu hơn và có khi có bột ở dưới.
Gân là phụ cách nhau cỡ 5 mm,
gân mép lá cách mép 2mm,
cuống lá rất ngắn. Cụm hoa ở
nách và ở ngọn, gần như dạng
bông gồm 3-5 hoa gần như
không cuống, lá đài cao 1 mm,
cánh hoa trắng dính nhau và
rụng một lượt. Quả hình cầu, có
sáp, màu trắng, đường kính 7
mm. Hạt đơn độc, dài 4-5 mm.
Trâm vỏ đỏ phân bố ở Trung
Quốc, Ấn Độ, Sri Lanka,
Bangladesh, Myanmar, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, và Madagascar. Ở Việt Nam chủ
yếu tập trung ở các tỉnh phía Nam, trong các quần xã thứ sinh ở độ cao thấp, dưới 1000
m so với mực nước biển, từ Kon Tum trở vào Nam (Trung tâm dữ liệu thực vật Việt
Nam). Theo kinh nghiệm dân gian, chiết xuất lá Trâm vỏ đỏ dùng để điều trị một số
bệnh lý như đau khớp, đau đầu, viêm khớp, sốt và có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm
[94]. Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu khoa học được thực hiện trên Trâm vỏ đỏ . Các hoạt
tính sinh học quý liên quan đến những nhóm hoạt chất chứa trong chiết xuất lá Trâm vỏ
đỏ là khả năng kháng viêm [27] hay chống oxy hóa [254]. Bảng 1.2 tổng hợp các nghiên
cứu và công bố về thành phần hoạt chất và các hoạt tính sinh học của Trâm vỏ đỏ.
[44]
Thành phần vi chất dinh dưỡng
Quả chứa lượng vitamin A (78,445 ± 0,0123 IU/100g), vitamin K (0,291 ± 0,001µg/ 100g) và vitamin C (18,201 ±
27
[219]
Khả năng chống oxy hóa/chống đái tháo đường
[254]
Chiết xuất nước và methanol từ 28 loài cây thuốc ở Nam/Mô Việt hình chế ức enzyme tiêu hóa tinh bột và chống oxy hóa in vitro
Ức α- chế glucosidase; Khả năng chống oxy thông quan hóa mức độ chống peroxide hóa lipid não chuột; Hàm lượng polyphenol
[26]
Nghiên cứu dược lý và hóa lý trên lá
0,003 mg/100g). Các vitamin B, vitamin D và vitamin E được tìm thấy ở dạng vết. Các loại trái cây đặc biệt giàu chất sắt; hàm lượng sắt là 1,67 ± 0,03 mg/100g. Chiết xuất lá Trâm vỏ đỏ có hoạt tính ức chế enzyme và chống oxy hóa tốt nhất trong số 4 loài cây có tiềm năng được sàng lọc; Khả năng chống oxy hóa của cao phân đoạn methanol 20% mạnh nhất; Chất chống oxy hóa tiềm năng zeylaniin A; Các chiết xuất lá Trâm vỏ đỏ giàu các hợp chất tự nhiên có giá trị dược học. Chiết xuất ethyl acetate thu nhận được nhiều hoạt chất nhất.
Thành phần hoạt chất/dược chất/phương pháp định chuẩn
Các tính thuộc dược học, vi hình thái lá, các chỉ tiêu hóa lý, thành phần các hợp chất tự nhiên
[191]
[94]
Khả năng kháng khuẩn
Thành phần tinh dầu gồm Bicyclogermacrene (25%), β- caryophyllene (20,14%), α- pinene (7,66%), α-humulene (4,25%), δ-cadinene (3,47%), (E,E)-α-farnesene (2,82%), (E)-β-ocimene (2,44%), (E,Z)- farnesol (2,25%), α-amorphene (2,05%), có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống côn trùng Chiết xuất ethyl acetate có khả năng ức chế Bacillus subitlis tốt nhất
Các chiết xuất từ lá/Mô hình kháng khuẩn in vitro
[27]
Khả năng chống oxy hóa và kháng viêm
Các chiết xuất từ lá/Mô hình chống oxy hóa và kháng viêm in vitro
Chiết xuất ethyl acetate và nước chứa hàm lượng cao các hợp chất phenolic; Chiết xuất ethyl acetate có khả năng chống oxy hóa và kháng viêm tốt nhất
[268]
Khả năng chống đái tháo đường
Chiết xuất vỏ thân/Enzyme tiêu hóa tinh bột và chuột
Ức chế tốt enzyme tiêu hóa tinh bột với độ bền hoạt tính cao với nhiệt và pH; Chống gia tăng đường huyết sau ăn và không ghi nhận tác dụng phụ
Khả năng ức chế vi khuẩn gram âm, gram dương và nấm trung Khả năng hòa gốc tự do Nitric oxide; Ức chế cyclooxygenase, 5-lipoxygenase, và khả năng chống biến tính protein Khả năng ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột và hạ đường huyết sau ăn
28
[175]
Ổn định đường huyết lúc đói và chỉ số men gan
Hạ đường huyết lúc đói ở chuột đái tháo đường ở nồng độ 400 mg/kg khối lượng cơ thể, giảm chỉ số men gan.
Về khả năng chống đái tháo đường, chiết xuất lá Trâm vỏ đỏ có hoạt tính ức chế α-
glucosidase cao nhất đạt 93% tương ứng với nồng độ cao chiết 0,8 mg /mL và khả năng
chống oxy hóa đạt 85% tương ứng nồng độ cao chiết 30 µg/mL, được đánh giá là tiềm
năng nhất trong 28 loại cây thuốc ở Việt Nam theo báo cáo của Mai et al. (2007) [219].
Chiết xuất từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ thể hiện hoạt tính ức chế α-glusodase dịch ruột của
chuột với giá trị IC50 109 µg/mL, thấp hơn đối chứng dương acarbose (IC50 540 µg/mL),
độ bền hoạt tính cao với sự thay đổi pH và nhiệt độ. Bên cạnh đó, cao chiết này còn làm
chậm quá trình tăng đường huyết sau ăn trên mô hình chuột với nồng độ 100 – 200 mg/kg
khối lượng cơ thể sau 1 – 1,5 giờ và không có tác dụng phụ [268]. Shilpa et al. (2023)
báo cáo rằng, chiết xuất methanol từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (S. zeylanicum (L.) DC)
thu thập tại Ấn Độ có hiệu quả hạ đường huyết trên mô hình chuột đái tháo đường do
alloxan và streptozotocin. Trong đó, tác giả công bố một số hợp chất phenolic acid gồm
ferulic acid/caffeic acid, gallic acid, vanillic acid, p-hydroxy benzoic acid, salicylic acid,
O-coumaric acid, 2,4-dihydroxy benzoic acid; và một số hợp chất flavonoid như
myricetin, catechin, naringenin, apigenin, umberliferon, luteolin được tìm thấy trong
chiết xuất vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ thu thập tại Ấn Độ bằng phân tích sắc ký lỏng cao áp
hiệu năng cao (UHPLC). Tuy nhiên, nghiên cứu này chưa đánh giá được mối liên hệ giữa
thành phần hoạt chất và hoạt tính sinh học của chiết xuất từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ.
Có thể thấy rằng, các nghiên cứu về khả năng chống đái tháo đường của vỏ thân cây
Trâm vỏ đỏ còn khá ít và chưa có tính hệ thống, đặc biệt hiệu quả chống đái tháo đường
trên các mô hình in vitro và in vivo còn hạn chế. Các dữ liệu về thành phần hóa học, cấu
trúc và hoạt tính sinh học cũng như mối liên hệ giữa cấu trúc – hoạt tính còn chưa được
công bố. Đồng thời, phương pháp bảo vệ các hoạt chất và nâng cao tính sinh khả dụng
của hoạt chất của cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ chưa được nghiên cứu. Vì vậy, các
nghiên cứu trong tương lai cần đánh giá toàn diện và có hệ thống về khả năng chống đái
tháo đường, thành phần hoạt chất chính và mối liên hệ với hoạt tính sinh học và khả năng
kiểm soát đường huyết, đồng thời các phương pháp nhằm nâng cao khả năng ứng dụng
cũng cần được quan tâm. Từ các nghiên cứu này, các dữ liệu khoa học về khả năng ứng 29
dụng chống đái tháo đường trong thực tiễn có thể được cung cấp đầy đủ hơn, làm nền tảng
khai thác hiệu quả giá trị dược liệu của Trâm vỏ đỏ.
1.5. Công nghệ vi bao gói các hợp chất tự nhiên ứng dụng trong phòng chống bệnh
đái tháo đường
1.5.1. Công nghệ vi bao gói các hợp chất tự nhiên
Hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên có thể bị ảnh hưởng trong quá trình
bảo quản và sử dụng do dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, oxy, nhiệt độ, độ ẩm cũng như
những liên kết kém bền khác. Ngoài ra, khả năng hòa tan trong nước thấp, kém ổn định,
và tính thấm qua màng sinh học bị hạn chế nên tính sinh khả dụng của các hợp chất tự
nhiên không cao [284].
Sự bao gói (encapsulation), quá trình bao gói các hợp chất tự nhiên/thuốc bên trong
vật liệu bao gói, là một công nghệ được tiếp cận đáng tin cậy không chỉ cho công nghiệp
thực phẩm mà còn ở lĩnh vực dinh dưỡng và sức khỏe. Công nghệ này giúp bảo vệ các
hợp chất tự nhiên trước các tác nhân gây phân hủy từ môi trường ngoài và bên trong cơ
thể, giúp duy trì độ ổn định và nâng cao hoạt tính sinh học. Ngoài ra, công nghệ này
giúp tăng tính sinh khả dụng, khả năng hòa tan, tính thấm qua màng. Đặc biệt, chúng có
thể giúp kiểm soát giải phóng các hoạt chất phù hợp với mục đích sử dụng, nhờ đó phát
huy tác dụng của thành phần hoạt chất mà ở trạng thái tự do không thể thực hiện được
[100].
Công nghệ bao gói có thể được chia làm hai nhóm dựa trên sự phân bố kích thước
của sản phẩm bao gói bao gồm: vi bao gói (microencapsulation) và nano hóa
(nanoencapsulation). Kích thước hạt vi bao dao động từ 3 đến 8000 µm, trong khi đó
hạt nano dao động từ 10 đến 1000 nm (1 μm). Sản phẩm bao gói cần đáp ứng các mục
tiêu chính bao gồm: (1) Bao gói và giải phóng chậm hoạt chất theo định hướng; (2) Bảo
vệ/duy trì tính ổn định của hoạt chất; (3) Giải phóng có kiểm soát các hoạt chất theo
định hướng cụ thể; (4) Có khả năng cấu trúc/chức năng hóa theo mục tiêu [80]
Các kỹ thuật vi bao có thể được chia thành ba nhóm chính, bao gồm: (1) Các phương
pháp vật lý: sấy phun, sấy đông khô, kết tủa dung môi siêu tới hạn, và bay hơi dung môi;
(2) Các phương pháp lý hóa: đông tụ (coacevation), liposome hóa, niosome và tạo gel
ion; (3) Các phương pháp hóa học: trùng hợp bề mặt và tạo phức phân tử [88]
30
1.5.2. Công nghệ vi bao gói các hợp chất tự nhiên bằng kỹ thuật sấy phun
1.5.2.1. Nguyên lý chung
Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật sấy phun dựa trên việc làm khô nhanh các hạt huyền
phù hoặc nhũ tương rất nhỏ bằng dòng khí nóng, các hạt này sau đó rơi xuống phần đáy
của buồng sấy và được thu hồi trong một hệ thống phù hợp (Hình 1.8) [132]. Quá trình
cơ bản gồm chuẩn bị dịch sấy phun và cấp mẫu vào hệ thống sấy, tán nhỏ tạo sương mù
(atomization) với đầu phun hoặc đĩa quay trong buồng sấy nhiệt độ cao. Các hạt sau khi
đi ra khỏi đầu phun gặp khí nóng sẽ bay hơi dung môi và được phân tách trước khi đi
vào buồng thu mẫu đã khử ẩm như cyclone hoặc túi lọc [116].
Sản phẩm bao gói (bột/hạt vi bao) có thể có hình dạng khác nhau tùy điều kiện, với
kích thước hạt thay đổi từ rất mịn (10 – 50 µm) đến rất lớn (2 – 3 mm). Để tạo hạt có
kích thước bé hơn từ khoảng 0,3 đến 5 µm, hệ thống sấy phun BUCHI Nano Spray
Dryer B-90 có thể được sử dụng với lợi thế tạo các hạt có kích thước rất mịn. Thực tế,
trong điều kiện thiết lập phù hợp, phương pháp sấy phun có thể được sử dụng trong bao
gói các hợp chất ở cấp độ vi bao với sản phẩm có kích thước hạt 2 – 25 µm hoặc cấp độ
nano hóa với sản phẩm có kích thước hạt bé hơn 5 µm (Hình 1.9) [298]
31
1.5.2.2. Các hợp chất polyphenol được vi bao gói bằng kỹ thuật sấy phun
Hầu hết polyphenol đều kém bền dưới tác dụng bất lợi của môi trường như nhiệt độ,
độ ẩm, ánh sáng, pH, oxy. Ngoài ra, các polyphenol còn dễ bị phân hủy dưới tác dụng
của các enzyme, tương tác với các thành phần phối trộn khác, dẫn đến mất hoạt tính
hoặc kém ổn định trong điều kiện tiêu hóa, suy giảm tính sinh khả dụng. Do đó, các
nghiên cứu tập trung vào các phương pháp bảo vệ polyphenol dưới các tác dụng bất lợi
trong điều kiện bảo quản, chế biến và nâng cao tính sinh khả dụng [61, 84]. Trong đó,
kỹ thuật sấy phun được quan tâm với giá thành thấp, hiệu quả bao gói tốt nhiều nhóm
hợp chất, kỹ thuật đơn giản và dễ thiết lập ở quy mô công nghiệp [84]. Một số hợp chất
polyphenol và dẫn xuất được bao gói bằng kỹ thuật sấy phun được tổng hợp ở Bảng 1.3.
Curcumin
[291]
Nâng cao độ hòa tan và tính sinh khả dụng đường uống.
HI-CAP 100 (tinh bột kháng)/maltodextrin; nhiệt độ dòng khí 185 oC; tốc độ nạp liệu 6 mL/phút;
Vanillin
và
[256]
8,5% maltodextrin 0,36% vanilin, 184 oC
Nâng cao hiệu quả vi bao, giảm độ ẩm và kích thước hạt; Bảo
hóa, oxy Chống tháo đái chống đường, kháng viêm, chống ung thư, bảo vệ gan Chống hóa, oxy chống thoái hóa tế bào thần kinh, kháng khuẩn
32
Gallic acid
[244]
vệ và lưu trữ hoạt chất tốt hơn. Bảo vệ và kiểm soát giải phóng tốt hoạt chất.
Catechin
[440]
hóa, oxy Chống kháng viêm, kháng khuẩn, chống ung thư, chống đái tháo đường hóa, oxy Chống tháo đái chống đường, kháng viêm, bảo vệ gan
Anthocyanin Chống
hóa,
[322]
oxy kháng khuẩn
Alginate và pectin 0,75 -3 % (w/v); Áp suất khí phun 0,2 MPa; Kích thước đầy phun 0,2 mm; Tốc độ nạp liệu 5 mL/phút; (0-100%, Maltodextrin (0- w/w), gum arabic 100%, w/w), Chitosan (0- 1%, w/w); Tốc độ dòng 15 mL/phút; Nhiệt độ 150 oC; Đầu phun 0,7 mm; 9% Maltodextrin và 9% Hi-maize; Nhiệt độ 40 oC
Resveratrol
[71]
tháo
Sấy phun dịch nhũ tương reveratrol được tạo thành bởi phương pháp từng giọt (drop-by-drop) và phương pháp siêu âm
Gia tăng độ ổn định của hoạt chất trong điều kiện bảo quản; Kiểm soát mức độ giải phóng hoạt chất ở dạ dày và ruột. Bảo vệ và tăng khả năng lưu trữ hoạt chất trong quá trình bảo quản. Tăng cường hiệu quả vận chuyển hoạt chất dưới tác động của điều kiện tiêu hóa. Bảo vệ hệ thống nhũ tương resveratrol, chống lại sự hao hụt và mở rộng khả năng ứng dụng.
hóa, oxy Chống kháng viêm, chống đái đường, chống béo phì, chống ung thư, bảo vệ tim mạch
1.5.2.3. Các lợi thế cơ bản của phương pháp vi bao gói sử dụng kỹ thuật sấy phun
Vi bao có thể cung cấp công cụ để bảo vệ các chiết xuất và hợp chất tự nhiên khỏi
tác động của các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện chần, đóng gói, và tự phân hủy
trong quá trình chế biến, hay các yếu tố liên quan đến tính khả dụng sinh học như liên
kết phân tử, cấu trúc hóa học, hàm lượng hoạt chất, tính hòa tan. Công nghệ vi bao một
cách tiếp cận đáng tin cậy trong công nghiệp thực phẩm, dinh dưỡng và sức khỏe, giúp
duy trì tính ổn định, hiệu quả và sinh khả dụng của các chiết xuất/hợp chất tự nhiên.
Ngoài ra, yêu cầu cải thiện cảm quan về mùi và vị của các hoạt chất tự nhiên sau khi vi
bao cũng được quan tâm [100]. Mục tiêu cơ bản của vi bao gói các hợp chất tự nhiên
được mô tả ở Hình 1.10.
33
Trong công nghệ vi bao các hợp chất tự nhiên, kỹ thuật sấy phun được sử dụng
tương đối phổ biến vì có khả năng ứng dụng rộng rãi từ nghiên cứu quy mô phòng thí
nghiệm đến khả năng mở rộng đến quy mô sản xuất công nghiệp. Đồng thời, sấy phun
có khả năng vi bao gói phổ rộng các nhóm hợp chất, đặc biệt nhóm hợp chất nhạy cảm
với nhiệt độ do quá trình làm khô diễn ra ở nhiệt độ cao trong thời gian ngắn. Ngoài ra, hiệu
suất bao gói bằng kỹ thuật sấy phun cao hơn so với các kỹ thuật vi bao gói khác [359].
Nhiều bằng chứng khoa học chứng minh khả năng sử dụng phương pháp vi bao
bằng sấy phun trong bảo vệ, duy trì, và gia tăng sự ổn định của đa dạng các hoạt chất
được vi bao. Vi bao bằng sấy phun có thể giúp bảo vệ và ngăn ngừa sự suy thoái của
thành phần có hoạt tính sinh học nhờ giảm quá trình tương tác của chúng với môi trường,
tăng thời gian bảo quản và sử dụng sản phẩm. Bên cạnh đó, phương pháp này giúp giảm
khả năng tương tác giữa hoạt chất được bao gói với các thành phần khác trong thực
phẩm khi được kết hợp, từ đó có thể gia tăng tính sinh khả dụng. Ngoài ra, vi bao bằng
sấy phun giúp tăng khả năng hòa tan, phân tán và lưu chuyển của các hoạt chất được
bao gói [100, 215].
Khả năng kiểm soát giải phóng hoạt chất tốt là một yêu cầu quan trọng đối với hạt
vi bao khi ứng dụng trong các lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm. Khả
năng này cho phép các thành phần hoạt chất phát huy tác dụng đúng thời điểm và vị trí
34
tác động đích. Ngoài khả năng bảo vệ tốt thành phần hoạt chất, kỹ thuật sấy phun còn
tạo ra các hạt vi bao có khả năng kiểm soát tốt sự giải phóng các hoạt chất. Khả năng
phối kết hợp các loại vật liệu vi bao với nhau, chức năng hóa các loại vật liệu vi bao
hiện có, tìm kiếm các loại vật liệu bao gói mới trong tự nhiên mở ra các hướng tiếp cận
mới, nhằm tạo ra các sản phẩm vi bao sấy phun có thuộc tính kiểm soát giải phóng hoạt
chất tốt hơn và hiệu quả hơn [5, 141, 215].
1.5.2.4. Khả năng ứng dụng các sản phẩm vi bao bằng sấy phun trong phòng chống đái
tháo đường
Các hợp chất tự nhiên có khả năng ứng dụng cao trong phòng chống đái tháo đường,
được minh chứng qua các thử nghiệm sàng lọc in vitro đến các tác động rõ ràng được
ghi nhận trên các mô hình in vivo. Tuy nhiên, các thử nghiệm cũng cho thấy sự khác
biệt đáng kể giữa hoạt tính in vitro và trên mô hình động vật cũng như con người. Trong
đó, sự suy giảm hoặc không thể hiện tính sinh khả dụng của các hợp chất tiềm năng là
một trong những nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt này. Tính khả dụng sinh học của các
hợp chất tự nhiên dưới tác động của các điều kiện môi trường sinh lý bệnh bị thay đổi
đáng kể, bên cạnh các chuyển hóa thông thường khác. Do đó, yêu cầu về nâng cao tính
sinh khả dụng của các hoạt chất được đặt ra và công nghệ vi bao bằng kỹ thuật sấy phun
được minh chứng có nhiều lợi thế trong mục tiêu này [84].
Trên thực tế, vi bao bằng kỹ thuật sấy phun là lựa chọn ưu tiên trong vi bao gói các
hợp chất tự nhiên có hoạt tính chống đái tháo đường, kết quả tóm tắt ở Bảng 1.3. Các
kết quả cho thấy, các hợp chất này có thể được vi bao gói tốt bằng kỹ thuật sấy phun,
sản phẩm có độ ổn định dưới các tác động môi trường, và đặc biệt là khả năng kiểm soát
giải phóng hoạt chất tốt trong điều kiện tiêu hóa. Các nghiên cứu này đề xuất rằng, các
sản phẩm sấy phun đều có tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh vực liên quan, trong đó có
phòng chống đái tháo đường. Tuy nhiên, các nghiên cứu đề cập trực tiếp đến khả năng
kiểm soát đường huyết và chống đái tháo đường của các sản phẩm sau khi bao gói vẫn
còn hạn chế [84]. Điều này mở ra các hướng nghiên cứu mới về hoạt tính chống đái tháo
đường của sản phẩm vi bao bằng sấy phun, các cơ chế tác động mới có thể xảy ra do sự
kết hợp của các hoạt chất và vật liệu vi bao gói, các hiệu quả tác động dài hạn cũng như
khả năng kiểm soát các tác dụng phụ không mong muốn của các chiết xuất/hợp chất tự
nhiên cũng có thể được quan tâm.
35
1.6. Mô hình cá ngựa vằn trong nghiên cứu đái tháo đường
1.6.1. Các lợi thế của mô hình cá ngựa vằn
Mô hình cá ngựa vằn (Zebrafish, Danio rerio), đối tượng nghiên cứu hấp dẫn trong
lĩnh vực y sinh học trong thời gian gần đây, được sử dụng rộng rãi để đánh giá tính an
toàn và khả năng hạ đường huyết của các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học một
cách hiệu quả [149]. Cá ngựa vằn có chung một số lượng đáng kể đặc tính di truyền và
một số hệ thống cơ quan tương tự như ở người. Bộ gene của cá ngựa vằn được giải trình
tự đầy đủ, cung cấp nền tảng và cơ sở quan trọng để tìm hiểu, làm rõ cơ chế sinh học
[156]. Mức độ tương đồng gene liên quan đái tháo đường ở cá ngựa vằn và con người
là gần 70%. Đặc điểm bệnh học ĐTĐ có liên quan với hoạt động bất thường của nhiều
gene, và sự điều chỉnh của chúng cho thấy độ tương đồng cao giữa cá ngựa vằn, chuột
và con người [197].
Tuyến tụy của cá ngựa vằn có cấu trúc cơ bản và thành phần tế bào tương tự như
tuyến tụy của động vật có vú, quan trọng hơn là sự tương đồng về chức năng duy trì cân
bằng glucose [173]. Đặc điểm phát sinh hình thái và cấu trúc cơ bản của tụy cá ngựa
vằn khá giống với tụy động vật có vú ở cả thành phần nội tiết và ngoại tiết. Các thành
phần nội tiết bao gồm tế bào α tiết glucagon, tế bào β tiết insulin, tế bào δ tiết
somatostatin, tế bào ε tiết ghrelin, và tế bào tuyến tụy tiết polypeptide (Pancreatic
polypeptide cells, PPCs). Các tế bào này cũng được sắp xếp tương tự như ở chuột. Tín
hiệu phân tử và cơ chế phát triển tuyến tụy cá ngựa vằn rất tương đồng với các con
đường ở động vật có vú. Ngoài tuyến tụy, sự phát triển và chức năng của hệ cơ quan liên
quan đến cân bằng glucose nội môi gồm não, gan, mô mỡ, cơ vân cũng được bảo tồn.
Đáng chú ý, cá ngựa vằn có nhiều tương đồng về sinh lý và chức năng đường tiêu hóa
với con người, cho phép xây dựng mô hình nghiên cứu mối liên hệ giữa hệ vi sinh đường
ruột và vật chủ trong các con đường chuyển hóa liên quan [407]. Các đặc điểm nêu trên
khiến cá ngựa vằn trở thành một mô hình có hiệu quả để xác định các mục tiêu điều trị
liên quan đến tác động kiểm soát đường huyết đa mục tiêu đối với nhiều mô/cơ quan
khác nhau [429].
Các báo cáo khoa học cho thấy cá ngựa vằn sẽ tăng đường huyết nếu chế độ ăn/môi
trường dinh dưỡng có hàm lượng glucose cao [64] và đường huyết cao kéo dài có liên
quan đến bệnh võng mạc và các triệu chứng bệnh lý khác, tương tự như bệnh nhân mắc
bệnh đái tháo đường [134]. Ngoài ra, cá ngựa vằn cũng đáp ứng tốt với các thuốc điều
trị bệnh đái tháo đường như glipizide hay metformin [113]. Do đó, cá ngựa vằn là một 36
mô hình nghiên cứu tiềm năng, hiệu quả về cơ chế bệnh sinh cũng như phương pháp
tiếp cận điều trị bệnh đái tháo đường [339].
Bên cạnh đó, cá ngựa vằn tương đối rẻ tiền để duy trì gây nuôi trong phòng thí
nghiệm, có thể tạo ra số lượng lớn cá thể mới và tốc độ sinh trưởng nhanh, giúp giảm
thời gian và chi phí thực nghiệm. Trên thực tế, các nghiên cứu sử dụng mô hình cá ngựa
vằn đang mở rộng nhanh chóng, trong đó có nhiều nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh của
một số bệnh phổ biến ở người như các bệnh về máu và phát sinh mạch máu, loạn dưỡng
cơ, thoái hóa thần kinh, rối loạn chuyển hóa lipid và đái tháo đường [328, 339].
1.6.2. Các nghiên cứu về rối loạn kiểm soát đường huyết và đái tháo đường trên cá
ngựa vằn
1.6.2.1. Các phương pháp gây tăng đường huyết và đái tháo đường
Các phương pháp khác nhau đã được phát triển để gây dựng các mô hình bệnh đái
tháo đường trên cá ngựa vằn bao gồm đái tháo đường tuýp 1, đái tháo đường tuýp 2
[62]. Hình 1.11 mô tả tổng quan các phương pháp gây mô hình bệnh đái tháo đường và
các nghiên cứu liên quan có thể được thực hiện trên cá ngựa vằn. Đái tháo đường tuýp
1, với đặc trưng về thoái hóa tuyến tụy, mất khả năng sản sinh insulin có thể được mô
phỏng trên cá ngựa vằn bằng các phương pháp phá hủy tế bào β sử dụng streptozotocin
hoặc alloxan, cắt bỏ hoặc chỉnh sửa các gene liên quan [62]. Trong khi đó, đái tháo
đường tuýp 2, liên quan đến các tác động của môi trường và gene gây kháng insulin,
được tạo thành bằng cách thực hiện các chế độ ăn giàu chất béo, nuôi trong môi trường
giàu glucose hoặc sử dụng công cụ chỉnh sửa gene hiện đại để mô phỏng tình trạng
kháng insulin. Trạng thái đái tháo đường dễ dàng được xác nhận bằng các công cụ phân
tích thường quy và tương đồng với các mô hình động vật khác, trong đó, sự gia tăng
đường huyết mạn tính là đặc trưng cơ bản dễ dàng được xác nhận [62].
1.6.2.2. Các nghiên cứu liên quan đái tháo đường trên cá ngựa vằn
Sự khởi phát, tiến triển và biến chứng của đái tháo đường: Phôi cá ngựa vằn phát
triển bên ngoài cơ thể, ấu trùng trong suốt cho phép theo dõi quá trình phát triển ở giai
đoạn sớm dễ dàng bằng các công nghệ hình ảnh hiện đại [170]. Động lực phát triển, sự
hình thành và phân hóa chức năng của tế bào β tuyến tụy, sự tương tác của chúng với
các mô cơ quan khác cũng được đánh giá trong thời gian thực, cung cấp các thông tin
quan trọng về sinh lý bệnh [213, 240]. Ngoài ra, tác động của đường huyết lên sự hình
thành và phát triển của các cơ quan ở giai đoạn sớm cũng có thể được quan sát dễ dàng,
từ đó có thể đánh giá được khả năng phát triển các biến chứng của đái tháo đường [198]. 37
Trên thực tế, các biến chứng do tăng đường huyết kéo dài có thể ghi nhận trên cá ngựa
vằn với tính tương đồng cao với người như mắt, thần kinh, tim mạch, thận, da, và chức
năng miễn dịch (Hình 1.11) [62].
Tác động của các gene, các con đường chuyển hóa và chức năng của mô/cơ quan:
Hệ gene và các con đường trao đổi chất cá ngựa vằn có mức độ tương đồng khá cao với
động vật có vú và con người, đặc biệt là các gene liên quan đến kiểm soát đường huyết
trong đái tháo đường [156, 430]. Các nghiên cứu hiện đại có thể can thiệp vào hệ gene
của cá ngựa vằn để tạo ra mô hình đái tháo đường hoặc nghiên cứu ảnh hưởng của một
số gene nhất định lên quá trình chuyển hóa glucose và tín hiệu insulin [342]. Ngoài ra,
bằng phương pháp tác động vào chế độ ăn hoặc dùng các hợp chất tác động phù hợp có
thể tạo nên trạng thái tăng đường huyết hoặc kháng insulin, cho phép đánh giá tác động
giữa cân bằng glucose nội môi và các phương pháp điều trị mới [64, 429, 430].
Sàng lọc thuốc điều trị đái tháo đường: Mô hình cá ngựa vằn có thể giúp sàng lọc
quy mô lớn các loại thuốc điều trị bệnh lý chuyển hóa tiềm năng, trong đó có bệnh đái
tháo đường. Các loại thuốc được sàng lọc có thể liên quan đến sự chuyển hóa glucose,
sự phát triển tế bào β tụy, tín hiệu insulin, cung cấp nền tảng để xác định các loại thuốc
mới hoặc đánh giá thêm tác động mới của các loại thuốc hiện có [367, 391].
38
Các nghiên cứu về rối loạn hành vi liên quan đái tháo đường: Hành vi cá ngựa vằn
bị ảnh hưởng bởi nồng độ glucose và tín hiệu insulin [226]. Các nhà nghiên cứu có thể
tiến hành các thử nghiệm hành vi để nghiên cứu tác động của các yếu tố liên quan đến
bệnh đái tháo đường đối với hoạt động vận động, hành vi ăn uống và chức năng nhận
thức [128].
1.7. Thực trạng và hướng tiếp cận nghiên cứu
Vai trò quan trọng của các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học đã được khẳng
định trong các nền y học cổ truyền lâu đời cho đến y học hiện đại. Ngoài công dụng làm
thuốc chữa bệnh, chúng còn cung cấp các khuôn mẫu về cấu trúc, giúp thúc đẩy phát
triển sản phẩm dược phẩm mới bằng con đường tổng hợp hóa học [108]. Do đó, cây
thuốc và các hợp chất tự nhiên là nguồn cung cấp dồi dào các hướng tiếp cận mới trong
điều trị, thu hút ngày càng nhiều các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Thị trường
thuốc chữa bệnh đái tháo đường hiện nay trên thế giới có khoảng 25% được sản xuất từ
thực vật. Hiện nay, có hơn 1.000 loài thực vật có khả năng sử dụng trong điều trị bệnh
đái tháo đường tuýp 2 trên thế giới. Trong đó, có 800 loài thu được từ kiến thức bản địa
của người dân địa phương [378].
Việt Nam là nước có nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú, đứng thứ 16 trên thế
giới về đa dạng sinh học [144]. Nền y học dân tộc Việt Nam có lịch sử phát triển lâu đời
với các bài thuốc sử dụng dược liệu có giá trị đã được kiểm chứng trong điều trị bệnh
thông thường và nan y. Từ đó, một số cây thuốc ở Việt Nam đã được nghiên cứu như lá
ổi, lá vối, lá sen, bằng lăng nước, trà xanh, khổ qua, quế, giảo cổ lam…. Trong đó một
số loài đã được nghiên cứu kỹ về thành phần hóa học, cơ chế tác dụng, và tiến hành tiêu
chuẩn hóa trên các dữ liệu khoa học. Nghiên cứu phát triển sản phẩm theo hướng hỗ trợ
điều trị đái tháo đường tuýp 2 từ nguồn cây thuốc ở Việt Nam do PGS.TS. Vũ Đức Lợi,
Trường ĐH Y dược Hà Nội, chủ trì năm 2023 đã xác định 8 loài cây có khả năng ức chế
đái tháo đường gồm: cam thảo đất (Seoparia dulics L.), húng quế (Ocimum basilicum),
thài lài trắng (Commelina diffusa Burm F.), dâu tằm (Morus alba L.), xoài (Mangifera
indica L.), chặc chìu (Tetracera scandens (L.) Merr.), dứa thơm (Pandanus
amaryllifolius). Trong đó, cây thài lài trắng đã được nghiên cứu phát triển thành công
sản phẩm hỗ trợ điều trị đái tháo đường gồm viên nang cao chiết và viêm cốm, dựa trên
dữ liệu hoa học từ 10 hoạt chất đã được phân lập.
39
Tây Nguyên là khu vực có đa dạng sinh học lớn nhất Việt Nam và là nơi có nhiều
cộng đồng sinh sống tại vùng đệm với nhiều bài thuốc dân gian quý chưa được nghiên
cứu toàn diện và có tính hệ thống. Các nghiên cứu thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh
học và Môi trường, Trường Đại học Tây Nguyên cho thấy các cây thuốc thu thập tại
Đắk Lắk có khả năng chống oxy hóa tốt và có tiềm năng phòng trị bệnh đái tháo đường.
Các nghiên cứu phát hiện một số cây thuốc thuộc Chi Chiêu Liêu (gồm Teminalia atala,
Terminalia corticosa, Terminalia bellirica), Chân Danh (Euonymus laxiflorus Champ.),
Ổi rừng (Psidium guava L.) và Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.) có khả năng
chống oxy hóa cao, làm chậm quá trình tăng đường huyết sau ăn và an toàn trên mô hình
động vật ở nồng độ có hoạt tính. Trong số đó, thành phần, cấu trúc hóa học và hoạt chất
của một số loài được nghiên cứu khá đầy đủ và đã được công bố trên các tạp chí khoa học
có uy tín [259, 262-264, 266, 269, 393].
Tác dụng chống đái tháo đường dựa trên tính an toàn cao và khả năng ứng dụng điều
trị trên lâm sàng cho bệnh nhân mắc đái tháo đường tuýp 1 và tuýp 2 của các loài thuộc
Chi Trâm đã được công bố. Tuy nhiên, các dữ liệu hiện có chủ yếu dựa trên chiết xuất
hoặc cao chiết phân đoạn, và có rất ít nghiên cứu về phân lập hoặc xác định các dẫn xuất
của hợp chất có hoạt tính sinh học [442]. Bên cạnh đó, các báo cáo chủ yếu tập trung ở
một số loài được ghi nhận hoạt tính chống đái tháo đường từ khá lâu, trong khi khả năng
này ở các loài khác cũng cần được quan tâm, khai thác thêm như S. densiflorum, S.
mundagam, và đặc biệt là S. zeylanicum (L.) DC., Trâm vỏ đỏ. Trâm vỏ đỏ thu thập tại
Đắk Lắk có tiềm năng ứng dụng hỗ trợ kiểm soát đường huyết và phòng trị đái tháo
đường cao, trong số nhiều cây thuốc được nghiên cứu và công bố trong thời gian gần
đây [259, 262-264, 266, 269, 393]. Tuy nhiên, khả năng ứng dụng của Trâm vỏ đỏ mới
chỉ được khảo sát và đánh giá bước đầu ở mức độ cao chiết/chiết xuất. Thông tin khoa
học về các hợp chất, dẫn xuất và cơ chế tác động cụ thể còn chưa được nghiên cứu đầy
đủ và có hệ thống. Bên cạnh đó, các nghiên cứu về khả năng bảo vệ hoạt tính, tăng cường
khả năng tác động trên các mô hình in vivo, đánh giá độc tính và các đánh giá chuyên sâu
hơn nhằm đưa ra cách tiếp cận ứng dụng cụ thể còn chưa được tiến hành.
Vi bao gói các chiết xuất/cao chiết có hoạt tính sinh học từ các loài cây thuộc Chi
Trâm đã bước đầu được đề cập trong thời gian gần đây và dữ liệu cho thấy những kết quả
ứng dụng tiềm năng. Maia et al. (2019) nghiên cứu bao gói chiết xuất từ vỏ quả S.
malaccense (L.) bằng phương pháp sấy phun và sấy thăng hoa. Kết quả cho thấy, hiệu
40
suất bao gói cao ở cả hai phương pháp, trong đó phương pháp sấy phun cho hiệu quả cao
gói hoạt chất cao hơn và cho kích thước hạt bé hơn, phù hợp hơn trong việc ứng dụng bao
gói cao chiết [220]. Mohamed Abdin et al. (2020) đã báo cáo về khả năng sử dụng các
dẫn xuất alginate làm vật liệu bao gói cho chiết giàu polyphenol từ hạt S. cumini với hiệu
suất bao gói 75% và sản phẩm vi bao có độ bền nhiệt cao đến 180,36 °C. Nhóm nghiên
cứu chỉ ra rằng việc sử dụng vật liệu bao gói phù hợp có thể làm gia tăng khả năng giữ ổn
định các hoạt chất polyphenol trong môi trường acid dạ dày và giúp giải phóng các hợp
chất này ở ruột [5]. Trong một báo cáo khác, Mohamed Abdin et al. (2021) đã tiến hành
bền hóa anthocynin từ S. cumini với sodium alginate, maltodextrin, chitosan và gum
arabic qua hai bước bao gói nối tiếp, hiệu suất bao gói đạt 92,4% và giảm mức độ phân
hủy anthrocyanin 3,98% [4]. Kết quả này một lần nữa chứng minh khả năng bền hóa các
hợp chất tự nhiên bằng kỹ thuật vi bao để ứng dụng trong phát triển thực phẩm chức năng.
Tuy nhiên, hoạt tính sinh học của các sản phẩm vi bao và minh chứng về khả năng
ứng dụng trên các mô hình thực nghiệm còn hạn chế. Nurliana et al. (2020) bao gói tinh
dầu từ lá S. aromaticum bằng maltodextrin và đánh giá khả năng ức chế E.coli của sản
phẩm vi bao. Kết quả cho thấy, hoạt tính kháng khuẩn thay đổi theo tỷ lệ cơ chất và vật
liệu vi bao, dẫn đến yêu cầu tối ưu hóa điều kiện vi bao, trong đó tỷ lệ cơ chất và vật liệu
bao gói cần được chú ý để sản phẩm có hoạt tính cao nhất [257]. Birje et al. (2018) sử
dụng β-cyclodextrin vi bao cao chiết từ S. aromaticum và đánh giá hoạt tính ức chế α-
glucosidase, kết quả cho thấy quá trình vi bao gói làm gia tăng hoạt tính ức chế α-
glucosidase [48]. Nghiên cứu này mở ra khả năng ứng dụng công nghệ vi bao nhằm bền
hóa, thậm chí có thể gia tăng hoạt tính của các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao trong
chi Trâm nhằm ứng dụng trong hỗ trợ kiểm soát đường huyết và phòng trị đái tháo đường.
41
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Mẫu vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ được thu thập tại Khu bảo tồn thiên nhiên Easo, Ea
Kar, Đắk Lắk vào tháng 6/2020, trên các cây có độ tuổi từ 5 – 7 năm; Quá trình thu thập
và sơ chế theo tài liệu hướng dẫn của Institute of Materia Medica - HANOI -
WHO/WPRO WHO/WPRO (Medicinal Plants in Vietnam, 1990). Sau khi thu thập, mẫu
được loại phần vỏ bần, cắt lát nhỏ và làm khô ở nhiệt độ phòng (28 – 32 °C) trong điều
kiện thông gió tích cực đến khi đạt độ ẩm không quá 8%. Sau đó mẫu được nghiền nhỏ,
°C cho đến khi sử dụng. Đặc điểm mẫu vỏ thân và bột được mô tả ở Hình 2.1
rây qua lỗ kích thước 2 mm. Bột vỏ thân được bảo quản trong túi PE đen ở nhiệt độ –30
Vật liệu bao gói chính là Maltodextrin kháng tiêu hóa (Digestion-resistant
maltodextrin, RMD, Fibersol-2) của hãng Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. (Nhật
Bản) với hàm lượng chất xơ thực phẩm hòa tan ≥ 90%, đương lượng dextrose (Dextrose
Equivalence, DE: 8-12.5). RMD có cấu trúc hóa học phân nhánh phức tạp bao gồm các
liên kết α(1-4), α(1-6), α (1-2), và α(1-3) glucoside. Cấu trúc phân nhánh này có khả
năng chống lại các enzyme tiêu hóa của con người và không được hấp thụ ở ruột non
[276]. Các vật liệu bao gói phụ gồm: Gum Arabic, α-cyclodextrin, β-cyclodextrin và γ-
cyclodextrin của hãng Wacker Chemie AG (Đức).
2.1.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy
Hóa chất: Folin-Ciocalteu reagent được mua từ hãng Merck (Đức). Gallic acid,
catechin, epicatechin, caffeine, ethyl gallate, rutin, ellagic acid, quercetin, quercitrin, 42
apigenin, chlorogenic acid, 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2′-azino-bis-(3-
ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-
2-carboxylic acid (Trolox), acarbose, 3,5-Dinitrosalicylic acid, p–nitrophenyl-α-D-
Glucopyranoside, Potassium Sodium Tartrate Tetrahydrate (PSTT) và Dinitrosalicylic
acid (DNS), α-amylase tuyến tụy và α-glucosidase nấm men của hãng Sigma-Aldrich
(St Louis, MO, Hoa Kỳ). Maltodextrin (MD, MAX1000® series) của hãng Matsutani
Chemical Industry Co., Ltd. (Nhật Bản). Sodium carbonate, ethanol, methanol và acetic
acid của hãng Xilong Scientific Co. Ltd. (Trung Quốc). Các hóa chất và thuốc thử còn
lại đạt yêu cầu ở cấp độ phân tích.
Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy hại khuẩn, Mueller-Hinton Broth (MHB)
của hãng HiMedia Laboratories (Hoa Kỳ). Môi trường nuôi cấy lợi khuẩn MRS
(Lactobacillus Agar acc. to De Man, Rogosa and Sharpe) của hãng Sigma-Aldrich (St
Louis, MO, Hoa Kỳ)
2.1.3. Vi sinh vật
Echesteria coli ATCC25923 và Staphylococcus aureus ATCC25923 được cung cấp
bởi Trung tâm tài nguyên sinh vật toàn cầu (ATCC: American Type Culture Collection):
The Global Bioresource Center, Hoa Kỳ). Lactobacillus casei được cung cấp bởi Viện
Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Cần Thơ, Việt Nam.
2.1.4. Cá ngựa vằn
Cá ngựa vằn được cung cấp bởi Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí
Minh. Thực nghiệm tiến hành trên cá ngựa vằn được tiến hành theo tuân theo “Nghị
định thư Cartagena về an toàn sinh học”, “Đạo luật về bảo tồn và sử dụng bền vững đa
dạng sinh học thông qua các quy định về sử dụng các sinh vật biến đổi gene” và “Hướng
dẫn chăm sóc và sử dụng động vật trong phòng thí nghiệm tại ngành Công nghệ sinh
học” được Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh phê duyệt vào tháng
1 năm 2013 theo quyết định số 02/QD-CNSH
43
2.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1. Đánh giá ảnh hưởng của trích ly phân đoạn đến khả năng kiểm soát đường
huyết đa mục tiêu của cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
+ Trích ly phân đoạn cao chiết thô, xác định hàm lượng polyphenol và flavonoid
tổng số của cao chiết thô và các loại cao chiết phân đoạn;
+ Đánh giá khả năng chống oxy hóa, kháng viêm, ức chế α-glucosidase và α-
amylase, kháng khuẩn và kích thích sinh trưởng lợi khuẩn của các loại cao chiết;
+ Đánh giá độc tính của các loại cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ trên mô hình cá
ngựa vằn;
+ Đánh giá khả năng kiểm soát đường huyết của cao chiết phân đoạn trên mô hình cá
ngựa vằn;
44
+ Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết tiềm năng đến hệ vi sinh đường ruột trên mô
hình in vivo;
+ Đánh giá tác động của cao chiết tiềm năng đến điều hòa biểu hiện gene liên quan
kiểm soát đường huyết trên mô hình cá ngựa vằn;
Nội dung 2. Phân lập các hợp chất, định lượng và đánh giá tương quan với hoạt tính
sinh học của các loại cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
+ Phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết
tiềm năng;
+ Định lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong các loại cao chiết;
+ Đánh giá tương quan giữa thành phần hoạt chất và hoạt tính sinh học của các loại
cao chiết;
Nội dung 3. Vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ và đánh giá khả năng kiểm soát
đường huyết đa mục tiêu của sản phẩm vi bao
+ Xác định điều kiện vi bao phù hợp bằng phương pháp sấy phun;
+ Đánh giá hoạt tính hạ đường huyết của sản phẩm vi bao trong điều kiện in vitro;
+ Đánh giá tính an toàn của sản phẩm vi bao trên mô hình cá ngựa vằn;
+ Đánh giá khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao trên mô hình cá ngựa vằn;
+ Đánh giá khả năng điều hòa biểu hiện một số gene liên quan kiểm soát đường
huyết của sản phẩm vi bao trên mô hình cá ngựa vằn;
+ Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro và in vivo của sản phẩm vi bao;
Nội dung 4. Nghiên cứu xây dựng mô hình dự đoán thời hạn bảo quản của sản phẩm vi bao
+ Đánh giá tác động của điều kiện kích thích đến sự thay đổi độ ẩm và hàm lượng
polyphenol của sản phẩm vi bao theo thời gian bảo quản;
+ Đánh giá tác động của điều kiện kích thích đến sự thay đổi hoạt tính chống oxy
hóa và ức chế enzyme của sản phẩm vi bao theo thời gian bảo quản;
+ Xây dựng mô hình dự đoán thời hạn bảo quản của sản phẩm vi bao;
45
2.3. Phương pháp nghiên cứu và chỉ tiêu đánh giá
Nội dung 1. Đánh giá ảnh hưởng của trích ly phân đoạn đến khả năng kiểm soát đường
huyết đa mục tiêu của cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
2.3.1. Phương pháp trích ly cao chiết thô và các loại cao chiết phân đoạn
2.3.1.1. Phương pháp ly trích thu cao chiết thô
Bột vỏ thân được trích ly bằng phương pháp ngâm kiệt với ethanol, định hướng ứng
dụng trong thực tiễn nhờ tính an toàn và hiệu quả trích ly cao các hợp chất của dung môi
này. Các điều kiện trích ly dựa trên các kết quả thí nghiệm thăm dò và được mô tả như
sau: Bột vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ được trích ly bằng dung môi ethanol 50% trong nước
cất với tỷ lệ bột:dung môi là 1:10 (w/v) trong 24 giờ. Quá trình lặp lại ít nhất 3 lần cho
đến khi dịch chiết thu được không còn màu đặc trưng. Các dịch trích ly được trộn đều,
lọc bỏ cặn qua giấy lọc Whatman No.1, thu dịch. Dịch thu nhận được loại bỏ dung môi
bằng thiết bị cô quay chân không IKA RV10 (IKA, Đức) ở 60 °C, sau đó làm khô hoàn
toàn bằng phương pháp sấy thăng hoa Operon (Operon FBD-5503, Hàn Quốc) ở điều
46
kiện – 56 °C, áp suất 0,001 Mbar. Cao chiết thô (hiệu suất trích ly đạt 15,67 %) được
bảo quản ở – 80 °C đến khi sử dụng.
2.3.1.2. Phương pháp trích ly phân đoạn
Cao chiết thô được phân bố trong nước cất và tiến hành trích ly phân đoạn với các
dung môi có độ phân cực khác nhau theo phương pháp được mô tả bởi Nguyen et al.
(2021) [265]. Quy trình trích ly phân đoạn được mô tả trong Hình 2.4. Phân đoạn hexane
47
(HF) được thu nhận và phần dung dịch nước còn lại tiếp tục được chiết phân đoạn với
chloroform (CF), ethyl acetate (EAF) và n-butanol (BF). Quá trình lặp lại ít nhất 3 lần
cho mỗi phân đoạn đến khi dịch chiết thu được không còn màu đặc trưng. Các phân
đoạn được thu nhận và làm khô bằng phương pháp bay hơi trong chân không. Hiệu suất
trích ly cao phân đoạn ethyl acetate và n-butanol lần lượt là 1,544% và 3,847% (hiệu
suất trích ly của phân đoạn hexane và chloroform là không đáng kể). Dung dịch nước
cuối cùng (phân đoạn nước, WF) được lọc và làm khô hoàn toàn bằng phương pháp sấy
thăng hoa ở điều kiện – 56 °C, áp suất 0,001 Mbar (Operon FBD-5503, Hàn Quốc) (hiệu
suất trích ly đạt 10,324%). Các loại cao chiết được bảo quản ở – 80 °C đến khi sử dụng.
2.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số
2.3.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định theo phương pháp Folin–Ciocalteu
[119] với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả lại bởi Nguyen và Eun (2011) [261]. Nguyên
tắc định lượng dựa trên phản ứng màu đặc trưng của các hợp chất polyphenol với thuốc
thử Folin-Ciocalteu. Hàm lượng polyphenol tổng số mô tả thông qua đường chuẩn gallic
acid, xây dựng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ở bước sóng 765 nm. Chi
tiết phương pháp mô tả ở Phụ lục 1, P.1.1.
2.3.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng số
Tổng hàm lượng flavonoid được xác định theo phương pháp so màu tiến hành bởi
Zhishen et al. (1999) [437] với một số thay đổi nhỏ được mô tả lại bởi Nguyen và Eun
(2011) [261]. Hàm lượng flavonoid được mô tả thông qua đường chuẩn quercetin, xây
dựng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ở bước sóng 510 nm. Chi tiết
phương pháp mô tả ở Phụ lục 1, P.1.2.
2.3.3. Phương pháp đánh giá một số hoạt tính sinh học trên mô hình in vitro
2.3.3.1. Phương pháp đánh giá khả năng dập tắt gốc tự do DPPH• và ABTS•+
Khả năng chống oxy hóa được đánh giá dựa trên khả năng trung hòa gốc tự do
DPPH• và ABTS•+. Nguyên tắc phương pháp dựa trên sự suy giảm hàm lượng các gốc
tự do dưới tác dụng của các chất chống oxy hóa có trong mẫu. Trong đó, khả năng trung
hòa gốc tự do DPPH• được tiến hành bằng phương pháp so màu theo Brand-Williams et
al. (1995) [51] với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả lại bởi Nguyen et al. (2016) [262].
Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ được tiến hành theo phương pháp so màu tiến
48
hành bởi Re et al. (1999) [318] với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả bởi Nguyen et al.
(2022) [260]. Chi tiết phương pháp mô tả ở Phụ lục 1, P.1.3.
2.3.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng kháng viêm in vitro
Hoạt tính kháng viêm in vitro của các loại cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ được
đánh giá thông qua khả năng ức chế biến tính albumin trứng tươi theo phương pháp
được mô tả bởi Dharmadeva et al. (2018) [98]. Chi tiết phương pháp mô tả ở Phụ lục 1,
P.1.4.
2.3.3.3. Xác định khả năng ức chế hoạt động các enzyme tiêu hóa tinh bột
Khả năng ức chế hoạt động của các enzyme tiêu hóa tinh bột, α-amylase và α-
glucosidase được xác định bằng các phương pháp được tiến hành bởi Kwon et al. (2016)
[185] với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả bởi Nguyen et al. (2016) [262]. Chi tiết
phương pháp mô tả ở Phụ lục 1, P.1.3.
2.3.3.4. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn và kích thích sinh trưởng lợi
khuẩn trong điều kiện in vitro
a. Đánh giá khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh
Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các loại cao chiết phân đoạn được đánh
giá bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch theo mô tả của Singh et al. (2016) [354]. Vi
khuẩn gram âm (Escherichia coli ATCC25922) và gram dương (Staphylococcus aureus
ATCC25923) được lựa chọn làm chủng vi khuẩn mục tiêu. Cụ thể, 100 µL dịch vi khuẩn
được phân tán đều trong môi trường Luria-Bertani (LB) rắn, giữ yên 30 phút để cố định.
Sau đó, các lỗ thạch đường kính 6 mm được chuẩn bị trước khi bổ sung 100 µL dung
dịch cao chiết với các nồng độ khác nhau. Tetracycline được chuẩn bị với nồng độ 0,1
mM làm đối chứng dương. Các đĩa nuôi cấy được ủ trong ở 37 °C trong 24h. Hoạt tính
đối kháng vi khuẩn gây bệnh của cao chiết phân đoạn được đánh giá thông qua kích
thước vùng ức chế (zone of inhibition, ZOI, mm), vùng không ghi nhận khuẩn lạc vi
khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy.
b. Xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration - MIC)
đối với vi khuẩn gây bệnh
Nồng độ ức chế tối thiểu đối với E. coli và S. aureus được xác định dựa trên phương
pháp resazurin-based turbidometric (TB) được mô tả bởi Teh et al. (2017) [371]. Chi tiết
phương pháp mô tả ở Phụ lục 1, P.1.6.
49
c. Phương pháp đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng lợi khuẩn trong điều kiện
tăng đường huyết in vitro
Hoạt tính kích thích sinh trưởng lợi khuẩn trong điều kiện tăng đường huyết in vitro
được thực hiện theo phương pháp mô tả bởi Xie et al. (2017) [410]. Mỗi giếng trên đĩa
96 giếng đáy tròn được bổ sung 255 µL môi trường nuôi cấy và 15 µL dung dịch cao
chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ ở các nồng độ khác nhau 0; 0,25; 0,50; 0,75; 1,00; 1,25;
1,50; 1,75, và 2,00 mg/mL. Tiếp theo, bổ sung 30 µL dịch huyền phù vi khuẩn (106 tế
bào/mL, độ đục tương đương 0,5 McFarland) trong môi trường thích hợp vào mỗi giếng,
sau đó ủ trong điều kiện kỵ khí 37 ± 0,5 °C (5 % CO2) trong 24 giờ. Thực nghiệm tương
tự được tiến hành với môi trường nuôi cấy chứa glucose (0,8 g/L) để đánh giá tác động
của điều kiện tăng đường huyết. Khả năng ức chế hay kích thích sự phát triển của lợi
khuẩn được đánh giá dựa trên sự khác biệt về độ đục của dịch nuôi cấy so với đối chứng
không bổ sung cao chiết. Sau 24 giờ, mật độ quang học (optical density, OD) của các
giếng được xác định ở bước sóng 600 nm sử dụng máy Microplate reader (Hidex, Turku,
Phần Lan). Sự khác biệt về OD600nm giữa các giếng bổ sung cao chiết vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ và đối chứng âm (đường cơ sở, không bổ sung cao chiết) cho biết cao chiết có khả
năng ức chế hay kích thích sinh trưởng lợi khuẩn.
2.3.4. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát đường huyết trên mô hình cá
ngựa vằn
2.3.4.1. Chế độ nuôi dưỡng cá ngựa vằn trong thí nghiệm
Cá ngựa vằn (Zebrafish, Danio rerio) được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn phòng
thí nghiệm cá ngựa vằn theo hướng dẫn của Westerfield et al. (2000)
(https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html) [399]. Nước sạch đạt chuẩn được khử chlor
trước khi cấp vào hệ thống nuôi. Cá được nuôi trong hệ thống tuần hoàn liên tục, trong
đó nước sau khi ra khỏi bể nuôi được dẫn qua hệ thống lọc ba cấp gồm lọc thô, lọc tinh,
lọc than hoạt tính và lọc UVC để giảm thiểu các tác nhân gây ô nhiễm trước khi cấp lại
vào bể nuôi. Cặn bẩn, chất thải của cá, thức ăn thừa được hút sạch hằng ngày bằng
siphon. Môi trường nuôi được giữ ở pH 6,8 – 7,0, nhiệt độ 28±1 °C, chu kỳ ánh sáng 14
giờ (sáng)/10 giờ (tối) và bơm không khí cung cấp đủ oxy. Mật độ cá được thiết lập ở
mức 12-15 con trưởng thành/4 L. Cá được cho ăn với lượng 20 mg/con/ngày thức ăn
tiêu chuẩn dành cho cá Otohime B2 (kích thước 360 – 650 µm; độ ẩm 6,3 %; hàm lượng
protein 56,3 %; béo 15,9 %; xơ 2,6 %; tro khoáng 13,5 %; Ca 2,5 %; P 2,3 %; Vit.A
50
10.000 IU/kg; Vit.D3 2.000 IU/kg; Vit.E (a-tocopherol) 1.250 mg/kg; Cu 7,0 mg/kg; Mn
31,8 mg/kg; được công bố bởi nhà sản xuất Marubeni Nisshin Feed Co., Ltd., Nhật Bản).
2.3.4.2. Phương pháp đánh giá tính an toàn của các cao chiết trên mô hình cá ngựa vằn
Đánh giá độc tính của các loại cao chiết trên mô hình cá ngựa vằn để xác định
ngưỡng an toàn khi xử lý trên mô hình đái tháo đường và hạ đường huyết sau ăn. Quá
trình tiến hành trên 2 phương pháp: Phương pháp ngâm cao chiết với dung dịch nuôi ở
cá con theo hướng dẫn của OECD 203 [272] đánh giá được độc tính của cao chiết qua
các con đường khác nhau gồm hô hấp, da, mắt và đường uống và phương pháp cho ăn
cưỡng bức theo hướng dẫn của OECD 423 [271] đánh giá độc tính cấp qua đường uống
của cao chiết. Tiến hành thử nghiệm trên cá trưởng thành 3-4 tháng tuổi, khối lượng 300
– 400 mg/con. Mỗi lô thí nghiệm được chuẩn bị với 7 con cá (3 đực và 4 cái), khối lượng
từ 0,3 - 0,6 g/con. Cá được cho ăn cao chiết với liều lượng 5.000 mg/kg cá bằng phương
pháp cho ăn cưỡng bức (force-feeding) được mô tả bởi Collymore et al. (2013) [70].
Tính an toàn của cao chiết được theo dõi tỷ lệ chết và tình trạng của cá trong 72 giờ và
tiếp tục theo dõi trong 7 ngày. Mức độ an toàn được xác định theo quy chuẩn
OECD/OCDE, 423.
Độc tính theo OECD 203 được tiến hành trên cá 5 ngày tuổi, mỗi lô thí nghiệm gồm
10 con, thí nghiệm được lặp lại 3 lần (tổng số cá là 30 con/1 nồng độ). Thí nghiệm được
tiến hành ở dãy nồng độ pha loãng nhị phân từ nồng độ giới hạn cho phép đánh giá theo
hướng dẫn là 100 mg/L dịch nuôi. Tỷ lệ cá chết sau 96 giờ ở các nồng độ khác nhau
được theo dõi và xác định giá trị 𝐿𝐷50 và nồng độ an toàn đối với cá ngựa vằn. 𝐿𝐷50 là
nồng độ gây chết 50% động vật nghiên cứu. 𝐿𝐷50 được xác định theo công thức của
Karbers như sau:
(2.1) 𝐿𝐷50 = 𝐿𝐷100 − ∑(𝑎 × 𝑏) /𝑁
trong đó, LD100 là liều thấp nhất gây chết 100% động vật thí nghiệm; N là số động vật
thí nghiệm trong 1 nhóm; a là sự khác biệt về liều giữa 2 liều liên tiếp; b là số cá thể tử
vong trung bình giữa 2 nhóm liên tiếp.
Sau khi xác định nồng độ an toàn đối với ấu trùng cá ngựa vằn, phương pháp tương
tự được tiến hành với cá ngựa vằn trưởng thành nhằm đánh giá mức độ an toàn trước
khi tiến hành các thực nghiệm tiếp theo. Cụ thể, 7 con cá ngựa vằn (3 đực, 4 cái) với
khối lượng trung bình 300-400 mg được chia vào các lô thực nghiệm ngâm cao chiết
51
với hai nồng độ: (1) Nồng độ an toàn được xác định trên ấu trùng cá và (2) nồng độ gấp
đôi nồng độ an toàn. Số lượng cá chết và các dấu hiệu bất thường khác được ghi nhận
sau 96 giờ quan sát.
2.3.4.3. Phương pháp đánh giá khả năng làm chậm gia tăng đường huyết sau ăn
Cá ngựa vằn trưởng thành (300 – 400 mg /con) được nhịn ăn trong 12 giờ trước khi
thử nghiệm. Cá sau thời gian nhịn ăn được cho vào nước lạnh ở 4 oC để hạ thân nhiệt và
gây mê. Giai đoạn gây mê được xác nhận khi cá mất thăng bằng cử động vây và không
có phản ứng. Cá gây mê được cho ăn theo phương pháp tiến hành bởi Collymore et al.
(2013) [70]. Cá được chia thành sáu nhóm thực nghiệm (10 con/nhóm) và được cho ăn
với maltodextrin, acarbose, các loại cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ theo mô tả dưới
đây:
Nhóm 1: Maltodextrin được dùng ở mức 1 mg/g khối lượng cá (MD, đối chứng âm);
Nhóm 2: Maltodextrin (1 mg/g khối lượng cá) có bổ sung cao chiết phân đoạn ethyl
acetate (75 mg/kg khối lượng cá) (Ethyl acetate fraction, EAF);
Nhóm 3: Maltodextrin (1 mg/g khối lượng cá) có bổ sung cao chiết phân đoạn n-
butanol (75 mg/kg khối lượng cá) (Butanol fraction, BF);
Nhóm 4: Maltodextrin (1 mg/g khối lượng cá) có bổ sung cao chiết phân đoạn nước
(75 mg/kg khối lượng cá) (Water fraction, WF)
Nhóm 5: Maltodextrin (1 mg/g khối lượng cá) có bổ sung cao chiết thô (75 mg/kg
khối lượng cá) (Crude extract, CE)
Nhóm 6: Maltodextrin (1 mg/g khối lượng cá) có bổ sung thuốc điều trị đái tháo
đường, acarbose (75 mg/kg khối lượng cá) (ACA, đối chứng dương);
Sau khi cho ăn 30, 60, 120 và 180 phút, máu được lấy ở tĩnh mạch đuôi bằng kim
nhỏ theo phương pháp được tiến hành bởi Zang et al. (2015) [432]. Mức đường huyết
sau ăn được xác định bằng máy đo đường huyết (MulticareIn, Biochemical Systems
International, Italia).
2.3.4.4. Phương pháp đánh giá hiệu quả hạ đường huyết trên mô hình cá ngựa vằn đái
tháo đường
Cá ngựa vằn được gây đái tháo đường bằng phương pháp cho ăn thừa (Over-feeding)
với thức ăn giàu chất béo trong vòng 8 tuần, mô tả bởi Zang et al. (2017) [430]. Cá gây
52
đái tháo đường được nuôi với khối lượng thức ăn là 120 mg/con/ngày (6 lần/ngày).
Nhóm đối chứng cho ăn theo tiêu chuẩn với khối lượng 20 mg/con/ngày (2 lần/ngày).
Trạng thái đái tháo đường được xác định bằng chỉ số đường huyết lúc đói của cá đái
tháo đường với cá đối chứng hàng tuần. Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index - BMI)
được xác định theo mô tả bởi Zang et al. (2017) [430] và đường huyết được xác định
bằng máy đo đường huyết Multicare-In (Biochemical Systems International, Italia). Cá
bị đái tháo đường khi chỉ số đường huyết và chỉ số BMI gấp ít nhất 1,5 lần cá bình
thường. Cá đái tháo đường được chia thành các lô thí nghiệm theo các nhóm, mỗi nhóm
10 con (5 đực, 5 cái) như sau:
Nhóm 1: Cá bình thường (NOR, chế độ ăn bình thường)
Nhóm 2: Cá đái tháo đường (DIA, đối chứng âm, chế độ ăn bình thường)
Nhóm 3: Cá đái tháo đường ngâm cao Ethyl acetate (10 mg/L) (EAF, chế độ ăn bình
thường)
Nhóm 4: Cá đái tháo đường ngâm cao n-Butanol (10 mg/L) (BF, chế độ ăn bình
thường)
Nhóm 5: Cá đái tháo đường ngâm cao nước (10 mg/L) (WF, chế độ ăn bình thường)
Nhóm 6: Cá đái tháo đường ngâm cao chiết thô (10 mg/L) (CE, chế độ ăn bình
thường)
Nhóm 7: Cá đái tháo đường ngâm Metformin 20 µM (MET, đối chứng dương, chế
độ ăn bình thường)
Các nhóm cá được theo dõi trong 20 ngày và máu tĩnh mạch đuôi được lấy tại các
thời điểm 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày và 20 ngày theo phương pháp Zang et al. (2013)
[431]. Mức đường huyết được đo bằng máy đo nhanh đường huyết (Multicare-In,
Biochemical Systems International, Italia).
2.3.4.5. Phương pháp đánh giá tác động của cao chiết đến hệ vi sinh vật đường ruột
của cá đái tháo đường
Sau hai giờ cho ăn, cá ngựa vằn được gây chết bằng nước đá. Sau đó, cá được khử
trùng toàn bộ bề mặt bằng ethanol 70%, và toàn bộ đường ruột của cá được thu nhận
bằng cách cẩn thận mổ và phân tách từ bụng cá. Quá trình được thực hiện trong điều
kiện vô trùng và việc phân tách được tiến hành tỉ mĩ để không bỏ sót các thành phần
đường ruột. Mẫu ruột sau đó được lưu trữ trong điều kiện vô trùng và chuyển đến trung 53
tâm phân tích. Các vùng siêu biến động V3-V4 của 16S rRNA được xác định bằng
phương pháp giải trình tự đầu cặp (paired-end sequencing) trên hệ thống giải trình tự
Illumina MiSeq (Illumina, Inc., USA), thực hiện tại Công ty TNHH Ktest Scientific, Tp.
Hồ Chí Minh, Việt Nam. Các bộ chuyển đổi, đoạn mồi và trình tự có chất lượng thấp
được loại bỏ bằng Trimmomatic ver.0.39 và Cutadapt ver.2.10. Các lần đọc được kết
hợp và xử lý để tạo ra biến thể chuỗi khuếch đại (amplicon sequence variant, ASV)
thông qua plugin q2-DADA2 và phương pháp loại bỏ nhiễu trong phần mềm QIIME2
[58]. Các loài tương ứng với ASVs được tra cứu với QIIME2 trên cơ sở dữ liệu SILVA
ver.138 SSURef Nr99 [309], sử dụng plugin phân loại tính năng q2 (the q2-feature-
classifier plugin) và kỹ thuật phân loại đồng thuận blast (the classify-consensus-blast
technique). QIIME2 được sử dụng để phân tích thành phần, biểu đồ nhiệt, phân tích chỉ
số đa dạng alpha và beta. Khi cần thiết, LefSe sẽ giúp xác định các phân loài có mật độ
khác nhau đáng kể trong một nhóm so với nhóm khác [337]. Các dự đoán chức năng
được thực hiện bằng PICRUSt2 vers.2.30b [106] và cơ sở dữ liệu MetaCyc.
2.3.4.6. Phương pháp đánh giá hiệu quả kiểm soát đường huyết qua điều hòa biểu hiện
gene liên quan đái tháo đường
Sau 20 ngày điều trị, toàn bộ cơ thể các ngựa vằn được thu nhận và bảo quản ở -80
°C để tiến hành phân tích biểu hiện gene bằng phản ứng chuỗi polymerase định lượng
gene thời gian thực (a real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR) nhằm
đánh giá tác động của cao chiết lên mức độ biểu hiện hiện gene liên quan đái tháo đường.
RNA tổng số được trích ly từ toàn bộ cơ thể cá ngựa vằn sử dụng dung dịch
TRIsureTM Reagent (Meridian Bioscience, Meridian Life Science Inc., USA) theo
hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được làm khô và hoàn nguyên trở lại trong 500 µL
nước cất không chứa RNase. Nồng độ RNA tổng số được xác định bằng máy phân tích
quang phổ SmartSpectTMPlus Spectrophotometer (Bio-rad) tại bước sóng A260/A280 nm.
RNA tổng số (5 µg) được phiên mã ngược thành cDNA chuỗi kép bằng Tetro™
Reverse Transcriptase kit và Random Hexamer primer (Meridian Bioscience, Meridian
Life Science Inc., USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm cDNA được sử
dụng để đo mức độ biểu hiện gene liên quan đến đái tháo đường thuộc các nhóm gene
liên quan sinh tổng hợp chất béo (SREBF1, ACC1, FASN), insulin và thụ thể insulin
(INS, INSRA1, INSRB1), gene liên quan hấp thu và chuyển hóa glucose (SGLT1 và
GLP1) trong phản ứng chuỗi polymerase định lượng gene thời gian thực (a real-time
54
quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR). Mức độ biểu hiện các gene được
đánh giá, sử dụng gene tham chiếu (housekeeping gene) β-actin. Danh sách các đoạn
mồi cụ thể được mô tả trong Bảng 2.1.
β-actin
Housekeeping gene
F: CTTCCCATCCATCGTGGGTC
(Gene tham chiếu)
R: AGCCTCATCACCAACGTAGC
SREBF1
Sterol regulatory element-
F: CATCCACATGGCTCTGAGTG
binding protein 1
R: CTCATCCACAAAGAAGCGGT
ACC1
Acetyl-CoA carboxylase
F: GCAAGTGTGGTTCCCTGATT
alpha
R: TCATGAAGGTCAGCGAACTG
FASN
Fatty acid synthase
F: GAGAAAGCTTGCCAAACAGG
R: GAGGGTCTTGCAGGAGACAG
INS
Insulin
F: TAAGCACTAACCCAGGCACA
R: GATTTAGGAGGAAGGAAACC
INSRA1
Insulin receptor alpha 1
F: CAACATGCCCCCTCACCACT
R: CGACACACATGTTGTTGTG
INSRB1
Insulin receptor beta 1
F: GACTGATTACTATCGCAAGGG
R: TCCAGGTATCCTCCGTCCAT
SGLT1
Sodium-dependent glucose
F: GGATTGACCTGGAGGCAGAC
cotransporters
R: GCGTTGACCACATTTCTCCA
GLP-1
Glucagon-like peptide 1
F: CAGAGGGAACTTTCTCCAACGA
R: AGTTCATACCCATTTCTCTTAGCG
qRT-PCR được thực hiện trên máy Rota-Gene Q MDx 5plex HRM (Plexus
Manufacturing Sdn Bhd, QIAGEN GmbH, Đức). Để đạt thể tích phản ứng 20 µL, 2 µL
khuôn cDNA được kết hợp với 1 µL của mỗi mồi xuôi và ngược (10 µM) và 10 µL dung
dịch 2x SensiFAST SYBR® No-ROX Kit (Meridian Bioscience, Meridian Life Science
Inc., USA). Điều kiện phản ứng được thực hiện ở 95 oC trong 2 phút, tiếp theo là 40 chu
kỳ 95 oC trong 5 giây và 65 oC trong 25 giây. Mỗi phản ứng tiến hành lặp ba lần. Ngưỡng
và đường cơ sở được xác định bằng phần mềm Rotor-Gene Q Series Software 2.3.4
(QIAGEN GmbH, Đức), và giá trị ngưỡng chu kỳ (the cycle threshold, CT) cho mỗi
mẫu được tính toán. Sau đó, mức độ biểu hiện gene được phân tích bằng phương pháp
55
2-CT theo Rao et al. (2013) [316]. Bố trí thí nghiệm được mô tả trong Bảng 2.2 và
phương pháp tính được mô tả như sau:
Gene tham chiếu
Gene mục tiêu
C
D
Ghi chú: A, B, C, D là các giá trị ngưỡng chu kỳ (the cycle threshold, CT) cho từng gene của
mỗi mẫu
Giá trị ΔCT mô tả sự giá biệt về giá trị ngưỡng chu kỳ giữa gene mục tiêu và gene
tham chiếu:
(2.2) ΔCT = CT(gene mục tiêu) − CT(gene tham chiếu)
theo ký hiệu mô tả ở Bảng 2.2, giá trị ΔCT của mẫu thực nghiệm là CTD −CTB, và giá
trị ΔCT của mẫu đối chứng là CTC −CTA. Giá trị ΔΔCT là sự khác biệt giữa giá trị ΔCT
được mô tả ở trên giữa mẫu thực nghiệm và mẫu đối chứng:
ΔΔCT = ΔCT(mẫu thực nghiệm) − ΔCT(mẫu đối chứng)
(2.3) = (CTD − CTB) − (CTC − CTA)
Kết quả cuối cùng được mô tả ở dạng mức độ biểu hiện mRNA tương đối so với
mẫu đối chứng, được chuẩn hóa bởi gene tham chiếu. Mức độ biểu hiện gene của mẫu
đối chứng được thiết lập nhận giá trị là 1 (ΔΔCT bằng 0 và do đó 20 bằng 1).
Nội dung 2: Phân lập các hợp chất, định lượng và đánh giá tương quan với hoạt
tính sinh học của các loại cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
2.3.5. Phương pháp phân lập các hợp chất tinh khiết
Cao chiết phân đoạn có tiềm năng nhất sẽ được tách qua sắc ký cột hở với pha tĩnh
là silica gel (cỡ hạt 400 – 630 nm) và pha động là dung môi thích hợp trên kết quả của
sắc ký bản mỏng TLC (Thin Layer Chromatography).
56
57
2.3.5.1. Sắc ký phân đoạn từ cao chiết phân đoạn ethyl acetate vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
Chuẩn bị mẫu: Mẫu vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ được sấy khô và xay thành bột (theo
mô tả ở mục 2.1.1. ), sau đó 5kg bột được ngâm chiết với ethanol:nước (50:50, v/v). Các
dịch thu được sau 3 lần ngâm chiết được loại bỏ dung môi, thu được 800g cao chiết thô.
Cao chiết thô sau đó được hòa tan trong nước, chiết phân đoạn lần lượt với dung môi
hexane (H), chloroform (C), ethyl acetate (Ea). Phân đoạn Ea giàu các thành phần các
hoạt chất có hoạt tính sinh học được thu nhận, loại bỏ dung môi, thu được cao chiết phân
đoạn ethyl acetate (56,04 g). Trộn mẫu cao chiết phân đoạn ethyl acetate với silica gel
theo tỉ lệ (1:1) bằng cối nghiền cho thật đều.
Chuẩn bị cột: Trương nở 120 g silica gel trong khoảng 500 mL n-hexane và khuấy
đều để loại hoàn toàn bọt khí. Chuẩn bị cột thủy tinh sạch, đường kính 8 cm, chiều cao
80 cm và gắn vào giá đỡ. Khuấy đều silica gel đã trương nở và rót vào cột, mở khóa cột
để ổn định trong khoảng 30 phút. Nạp mẫu vào đầu cột và tiến hành ly giải để tách phân
đoạn theo sơ đồ Hình 2.5
Cao ethyl acetate (SBE) (56,04 gam) được sắc ký cột (dcột x Lcột = 8x80 cm) silica
gel 400-630 nm với hệ dung môi rửa giải chloroform:methanol (C:M, 20:1; 15:1, 10:1)
thu được 13 phân đoạn (SBE01-SBE13). Phân đoạn SBE04 sắc ký cột silica gel 400-
630 nm, cột (dcột x Lcột = 3x60 cm), dung môi rửa giải, n-hexane:ethyl acetate (H:Ea,
30:1 – 1:1) thu được SBE4.1, SBE4.2, SBE4.3 và SBE4.4. Phân đoạn SBE4.1 tiếp tục
sắc ký cột silica gel 400-630 nm, cột (dcột x Lcột = 5x72 cm), dung môi rửa giải
hexane:ethyl acetate (H:Ea, 25:1) thu được hợp chất SBE1. Phân đoạn SBE4.2 tiếp tục
sắc ký cột silica gel 400-630 nm, cột (dcột x Lcột = 5x72 cm), dung môi rửa giải
hexane:ethyl acetate (H:Ea, 20:1) thu được hợp chất SBE2. Phân đoạn SBE4.3 tiếp tục
sắc ký cột silica gel 400-630 nm, cột (dcột x Lcột = 1x35 cm), dung môi rửa giải
chloroform:methanol (C:M, 15:1) thu được hợp chất SBE3. Phân đoạn SBE08 được sắc
ký cột (dcột x Lcột = 3x50 cm) silica gel 400-630 nm với dung môi rửa giải chloroform:
methanol (C:M, 20:1) thu được hợp chất SBE4 và SBE5. Phân đoạn SBE11 tiến hành
sắc ký cột (dcột x Lcột = 3x60 cm) silica gel 400-630 nm với hệ dung môi rửa giải
chloroform:methanol (C:M, 15:1) thu được 3 phân đoạn SBE11.1, SBE11.2, SBE11.3
và hợp chất SBE7. Phân đoạn SBE11.3 tiến hành sắc ký cột (dcột x Lcột = 3x60 cm) silica
gel với hệ dung môi rửa giải chloroform:methanol (C:M, 15:1) thu được SBE6. Phân
đoạn SBE12 tiến hành sắc ký cột (dcộtx Lcột = 3x60 cm) silica gel 400-630 nm với hệ
58
dung môi rửa giải chloroform:methanol (C:M, 10:1) thu được SBE8 và SBE9. Phân
đoạn SBE13 tiến hành sắc ký cột (dcộtx Lcột = 3x60 cm) silica gel 400-630 nm với hệ
dung môi rửa giải chloroform:methanol (C:M, 5:1) thu được SBE10
2.3.5.2. Xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất
Các hợp chất tinh khiết sẽ được xác định bằng kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân (1H-
NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC); phổ Noisy và Cosy để xác định cấu hình không gian,
phổ LC-MS để xác định công thức phân tử, cấu trúc phân tử và khối lượng phân tử.
2.3.6. Định lượng các hợp chất bằng sắc ký lỏng cao áp (UHPLC)
Các hợp chất polyphenol trong cao chiết được phân tích trên máy sắc kí lỏng cao áp
(Thermo-Ultimate 3000UPLC, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) dựa trên các
chất chuẩn. Quá trình phân tách chất được thực hiện bằng cột BDS Hypersil C18 với
kích thước cột 250 mm x 4,6 mm, hạt gel là 5 μm. Bộ bơm tự động được sử dụng để bơm
dung dịch cần phân tích vào hệ thống với thể tích tiêm mẫu là 5 μL, thực hiện ba lần lặp.
Các dung dịch phân tích được lọc qua màng 0,45 μm trước khi bơm vào hệ thống.
Quá trình tách chất qua cột bằng phương pháp gradient được thực hiện bằng hệ dung
môi nhị phân methanol (Merck, pha động A) và 0,1% orthophosphoric acid (Sigma-
Aldrich) trong nước Mili-Q (pha động B). Tốc độ dòng chảy pha động được thiết lập ở
1 mL/phút với gradient nồng độ thay đổi như sau: 97% B (0–0,5 phút); 97%–83% B
(0,5–8,0 phút); 83%–70% B (8,0–10,0 phút); 70%–55% B (10,0–15,0 phút); 55%–5%
B (15–20 phút); 5%–97% B (20–22 phút) và 97% B (22–23 phút). Nhiệt độ được kiểm
soát ở 30 oC và đầu dò UV ở bước sóng 265 nm. Mỗi hợp chất polyphenol được định
lượng từ phương trình đường chuẩn của các chất chuẩn dựa vào diện tích peak.
2.3.7. Phương pháp phân tích tương quan (Correlation analysis) và phân tích
thành phần chính (Principal Component Analysis, PCA)
Mối liên hệ tuyến tính giữa hàm lượng thành phần các hoạt chất với hoạt tính sinh
học và khả năng hạ đường huyết được phân tích bằng phương pháp phân tích tương
quan Pearson (Pearson’s correlation analysis). Hệ số tương quan Pearson (Pearson
correlation coefficient) (r), được sử dụng để mô tả mối liên hệ tuyến tính giữa các yếu
tố được phân tích. Giá trị r biến động trong khoảng -1, 0, và +1. Trong đó, r = -1 cho
thấy mối tương quan nghịch, r = +1 cho thấy mối tương quan thuận, r = 0 thể hiện không
có mối tương quan giữa hai yếu tố bất kỳ.
59
Thành phần tác động chính đối với các hoạt tính sinh học và mối liên hệ giữa các
các yếu tố phân tích được trực quan hóa bằng phân tích PCA. Thành phần chính (Princial
Components, PCs) được xác định dựa trên giá trị Eigen (Eigenvalues). Sự khác biệt về
giá trị phân bố trên ma trận eigenvector mô tả mối liên hệ giữa các yếu tố được phân
tích [165].
Nội dung 3: Vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ và đánh giá khả năng kiểm
soát đường huyết đa mục tiêu của sản phẩm vi bao
2.3.8. Chuẩn bị hỗn hợp sấy phun
Năm hỗn hợp khác nhau được chuẩn bị cho sấy phun theo công thức ở Bảng 2.3
được xây dựng dựa trên báo cáo của Navarro-Flores et al. (2020) [247]. Tất cả các hỗn
hợp được đồng nhất bằng máy VELP Scientifica OV5 (Ý) với tốc độ 10.000 vòng/phút
trong 10 phút và giữ ở nhiệt độ 5 °C trong 12 giờ để hòa tan hoàn toàn, đồng thời chống
lại quá trình lên men gây thoái hóa vật liệu. Nồng độ của vật liệu bao gói và cơ chất
được kiểm soát ở 20% (w:w), trong đó hàm lượng cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ là
1% (w:w).
19
-
-
-
-
1
T1
17
2
-
-
-
1
T2
17
-
2
-
-
1
T3
17
-
-
2
-
1
T4
17
-
-
-
2
1
T5
RMD: maltodextrin kháng tiêu hóa, GA: gum Arabic, αCD: α-cyclodextrin,
βCD: β-cyclodextrin, γCD: γ-cyclodextrin, SZE: cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ
đỏ, “-”: Không bổ sung
2.3.9. Phương pháp sấy phun
Hỗn hợp cao chiết và vật liệu vi bao được làm khô bằng máy sấy phun (Model YC-
015, ShangHai Pilotech, Trung Quốc) với thông số thiết lập bơm 10%, quạt hút 100%.
Nhiệt độ đầu vào và ra tương ứng là 140 °C và 97,3 °C. Tốc độ nạp mẫu là 120 mL/h.
Khấy từ được sử dụng trong suốt quá trình nạp để đảm bảo nguyên liệu luôn đồng nhất.
Sau khi sấy phun, sản phẩm bột vi bao được thu nhận, cân và đóng gói trong các túi hút
60
chân không PA/PE, 5 – 10 g bột/túi kích thước15 x 20 cm dày 90 µm, sau đó sử dụng
ngay hoặc được bảo quản ở nhiệt độ -80 °C đến khi đánh giá.
Hiệu suất sấy phun được xác định khối lượng sản phẩm thu nhận cuối cùng so với
tổng lượng chất rắn đầu vào ban đầu, tính bằng công thức:
𝐻𝑖ệ𝑢 𝑠𝑢ấ𝑡 (%) =
× 100
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑏ộ𝑡 𝑣𝑖 𝑏𝑎𝑜 𝑡ℎ𝑢 đượ𝑐(𝑔) 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑘ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐ℎấ𝑡 𝑟ắ𝑛 đầ𝑢 𝑣à𝑜 (𝑔)
(2.4)
2.3.10. Phương pháp đánh giá các tính chất hạt vi bao
2.3.10.1. Độ ẩm (Moister content, MC %) và hoạt độ nước (Water activity)
Độ ẩm của bột vi bao sau sấy phun được xác định bằng máy phân tích độ ẩm
OHAUS MB95 (OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd). Hoạt độ nước bột vi bao
được đo bằng máy phân tích HygroPalm HP23-AW-A (Rotronic AG).
2.3.10.2. Mật độ khối (Bulk density)
Mật độ khối của sản phẩm bột vi bao cao chiết được xác định theo phương pháp
được mô tả lại bởi Navarro-Flores et al. (2020) [247]. Cụ thể, 1 g bột vi bao được cân
chính xác vào ống đong 10 mL, độ chia nhỏ nhất 0,1 mL, và vortex trong 1 phút. Giá trị
mật độ khối được tính bằng tỷ lệ khối lượng trên thể tích của bột trong ống đong, đơn
vị g/cm3.
2.3.10.3. Khả năng phân tán (Dispersibility)
Khả năng phân tán của bột vi bao được đánh giá theo phương pháp được mô tả bởi
Shittu et al. (2007) [347]. Cụ thể, 10 g bột vi bao cao chiết được hòa tan trong 100 mL
nước cất ở 27 °C. Hỗn hợp được khuấy thủ công trong 1 phút và để lắng trong 30 phút
trước khi gạn lấy dịch nổi phía trên. Sau đó, mật độ của phần nổi lên trên được đánh giá
bằng cách cho dịch nổi vào bình định mức đến đủ 50 mL. Khối lượng của bình chứa
đầy dịch nổi được ghi nhận. Khối lượng của chất phân tán được xác định bằng hai lần
sự khác biệt giữa dịch nổi và lượng nước tinh khiết tương đương (50 mL). Tất cả các
phép đo được thực hiện 3 lần lặp lại bằng cân kỹ thuật số (độ chính xác 0,0001 g).
2.3.10.4. Độ hòa tan, tốc độ hấp thụ nước, và độ trương nước
Độ hòa tan (Water solubility index – WSI) được xác định theo phương pháp được
báo cáo bởi Navarro-Flores et al. (2020) [247]. Cụ thể, 1 g bột vi bao được hòa tan trong
12 mL nước cất, trộn đều và ủ trong tủ ấm trong 30 phút ở nhiệt độ 30 °C. Hỗn dịch sau
đó được ly tâm 3.500 vòng/phút trong 10 phút. Dịch nổi được thu nhận và sấy đến khối
lượng không đổi tại 105 °C. Độ hòa tan (Water solubility index – WSI), Tốc độ hấp thu 61
nước (Water absorption rate – WAR), Độ trương nước (Swelling capacity – SC) được
tính bởi công thức sau:
𝑊𝑆𝐼 =
× 100
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑘ℎô 𝑐ủ𝑎 𝑑ị𝑐ℎ 𝑛ổ𝑖 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 𝑏ộ𝑡 𝑣𝑖 𝑏𝑎𝑜
(2.5)
𝑊𝐴𝑅 =
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 ướ𝑡 𝑐ặ𝑛 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 𝑏ộ𝑡 𝑣𝑖 𝑏𝑎𝑜
(2.6)
𝑆𝐶 =
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑘ℎô 𝑐ủ𝑎 𝑑ị𝑐ℎ 𝑛ổ𝑖 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 𝑏ộ𝑡 𝑣𝑖 𝑏𝑎𝑜 (100 − 𝑊𝑆𝐼)
(2.7)
2.3.10.5. Hiệu suất vi bao
Hiệu suất vi bao được tính dựa trên phương pháp được mô tả bởi Navarro-Flores et
al. (2020) [247]. Phương pháp tính dựa trên mức chênh lệch giữa hàm lượng polyphenol
trên bề mặt và hàm lượng polyphenol tổng số. Cụ thể, 150 mg bột vi bao được trộn với
1,5 mL hỗn dịch methanol:acetic acid:nước (50:8:42, v:v:v). Hỗn hợp đồng nhất bằng
máy vortex trong 1 phút, siêu âm 2 lần trong bể siêu âm tại 25 °C trong 20 phút, sau đó
ly tâm tại 4.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi được thu nhận để xác định hàm lượng
polyphenol tổng số. Đối với hàm lượng polyphenol bề mặt, 150 mg bột vi bao được trộn
với 1,5 mL dung dịch ethanol:methanol (1:1, v:v) và đồng nhất bởi máy vortex trong 1
phút, sau đó ly tâm tốc độ 4.000 vòng/phút trong 5 phút, dịch nổi thu nhận để xác định
hàm lượng polyphenol bề mặt. Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương pháp
của Folin-Ciocalteu (1927) với chất chuẩn là gallic acid [119]. Với 𝑃𝐶𝑇𝑆 là hàm lượng
polyphenol tổng số (mg GAE/g), 𝑃𝐶𝐵𝑀 là hàm lượng polyphenol bề mặt (mg GAE/g),
hiệu suất vi bao được tính bởi công thức:
𝑀𝐸 (%) =
× 100
𝑃𝐶𝑇𝑆 − 𝑃𝐶𝐵𝑀 𝑃𝐶 𝑇𝑆
(2.8)
2.3.10.6. Phương pháp đánh giá hình thái bột vi bao bằng kính hiển vi điện tử quét (a
scanning electron microscope, SEM)
Một lượng nhỏ bột vi bao thu được từ các công thức sấy phun khác nhau được bám
dính trên bề mặt giá đỡ mẫu. Hình thái của các hạt vi bao sau đó được quan sát bằng
kính hiển vi điện tử quét Phenom ProX (ThermoFisher Scientific, USA) ở mức điện áp
15 kV. Các ảnh thu được ở độ phóng đại từ 2800 đến 3500 được chọn để thể hiện kết
quả SEM.
62
2.3.10.7. Mô hình giải phóng hợp chất polyphenol
Mức độ giải phóng hợp chất polyphenol của hạt vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ được xác định theo phương pháp mô tả bởi Navarro-Flores et al. (2020) với một
ít cải tiến. 100 mg bột vi bao được chuẩn bị trong 25 mL nước cất, khuấy đều trên máy
khuấy từ với tốc độ không đổi (700 vòng/phút) tại nhiệt độ phòng. 5 mL hỗn dịch được
thu nhận và thay thế bằng thể tích nước cất tương đương tại các thời điểm cách nhau 5
phút. Các hỗn dịch này sau đó được ly tâm với tốc độ 9.000 vòng/phút trong 5 phút,
dịch nổi được thu nhận để định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp của Folin-
Ciocalteu (1927) với chất chuẩn là gallic acid [119].
Động học giải phóng các hoạt chất polyphenol được tính toán dựa trên các mô hình
được báo cáo bởi Assadpour et al (2017) [33], bao gồm: 𝑄𝑡 = 𝑄0 + 𝑘0𝑡 (Bậc 0) ; 𝑙𝑜𝑔𝐶𝑡 = 𝑙𝑜𝑔𝐶0 + 𝑘1𝑡 (Bậc 1) ; 𝑄𝑡 = 𝑘ℎ𝑡1/2 (Higuchi) ; 𝐶𝑃𝐶𝑅 = 𝐾𝑡𝑛 (Korsmeyer- Peppas). Trong đó, 𝑘 là hằng số mô hình, 𝑡 là thời gian (phút), 𝑄𝑡 là hàm lượng
polyphenol giải phóng tại thời điểm 𝑡 (mg/g), 𝑄0 là hàm lượng polyphenol ban đầu trong
dung dịch (thông thường 𝑄0 = 0), 𝐶𝑡 là hàm lượng polyphenol trong hạt vi bao tại thời
điểm 𝑡 (mg/g), 𝐶0 là hàm lượng ban đầu của polyphenol trong hạt vi bao (mg/g). Trong
mô hình Korsmeyer-Peppas, CPCR (%) phản ánh sự giải phóng của hợp chất
polyphenol, 𝐾 là hằng số tốc độ, 𝑛 là hệ số được dùng để mô tả cơ chế và t là thời gian
(giây). Giá trị R2 được tính cho từng mô hình. Hằng số 𝑘, 𝐾, và 𝑛 được xác định bằng
phần mềm Microsoft Excel 2019 (Microsoft Inc., USA).
2.3.11. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của sản phẩm vi bao
2.3.11.1. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của sản phẩm vi bao
Hoạt tính chống oxy hóa của của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
được đánh giá thông qua khả năng trung hòa gốc tự do DPPH• và ABTS•+. Trong đó,
khả năng trung hòa DPPH• được đánh giá bằng phương pháp so màu theo Brand-
Williams et al. (1995) [51] với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả lại bởi Nguyen et al.
(2016) [262] và khả năng năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ tiến hành theo phương pháp
so màu của Re et al. (1999) [318] với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả bởi Nguyen et
al. (2022) [260] (Chi tiết mô tả ở phụ lục 1, P.1.3). Dịch gốc của sản phẩm vi bao được
chuẩn bị bằng cách hòa tan 10 mg bột trong 1 mL nước cất và siêu âm trong 5 phút trước
khi ly tâm ở tốc độ 3.500 vòng/phút trong 10 phút. Thử nghiệm trung hòa gốc tự do của
bột vi bao được tiến hành với các nồng độ khác nhau trong khoảng 0,125 – 2 mg/mL.
63
Sự khác nhau về hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu sấy phun theo các công thức khác
nhau được so sánh thông qua giá trị trung hòa 50% gốc tự do DPPH• và ABTS•+ (IC50).
2.3.11.2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột của sản phẩm vi bao
Khả năng ức chế hoạt động của các enzyme tiêu hóa tinh bột, α-amylase và α-
glucosidase được xác định bằng các phương pháp được tiến hành bởi Kwon et al. (2016)
[185] với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả bởi Nguyen et al. (2016) [262] (Chi tiết mô
tả ở phụ lục 1, P.1.5). Trong đó, dung dịch gốc sản phẩm bột vi bao được chuẩn bị trong
nước cất ở nồng độ 10 mg/mL, siêu âm 5 phút trước khi ly tâm với tốc độ 3.500
vòng/phút trong 10 phút thu dịch thử nghiệm. Khả năng ức chế α-amylase được thử
nghiệm ở dãy nồng độ 6,25 – 100 µg/mL và ức chế α-glucosidase ở dãy nồng độ 10 –
50 µg/mL. Sự khác biệt hoạt tính của các sản phẩm vi bao sấy phun theo các công thức
khác nhau được so sánh thông qua giá trị IC50 (Half-maximal Inhibitory Concentration).
IC50 là nồng độ bột vi bao có khả năng ức chế 50% hoạt tính của enzyme.
2.3.12. Phương pháp đánh giá khả năng hạ đường huyết trên mô hình cá ngựa vằn
2.3.12.1. Đánh giá tính an toàn của sản phẩm vi bao cao chiết
Tính an toàn của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ được đánh giá
theo OECD 203 và OECD423 được mô tả ở Mục 2.3.4.2.
2.3.12.2. Đánh giá khả năng chống gia tăng đường huyết sau ăn của sản phẩm vi bao
cao chiết
Cá ngựa vằn được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn (Chi tiết mô tả Mục 2.3.4.1. ). Cá
ngựa vằn trưởng thành với trọng lượng cơ thể từ 300 đến 400 mg được nhịn đói 12 giờ
trước khi tiến hành thực nghiệm. Sau thời gian nhịn ăn, cá được gây mê trong nước lạnh
ở 4 °C. Trạng thái gây mê đạt được với dấu hiệu cá mất thăng bằng khi bơi, ngưng cử
động vây và không đáp ứng với kích thích. Cá ở trạng thái mê được phân thành 5 nhóm
thực nghiệm, 10 con/nhóm, và cho ăn cưỡng bức (force-feeding technique) theo phương
pháp mô tả bởi Collymore et al. (2013) [70] với maltodextrin (MD) là nguồn cung
đường, acarbose (ACA) thuốc chống gia tăng đường huyết là đối chứng dương, các công
thức so sánh bổ sung matodextrin kháng tiêu hóa (RMD), cao chiết thô từ vỏ thân cây
Trâm vỏ đỏ (CE) và bột vi bao cao chiết (MEP). Các công thức cho ăn được mô tả cụ
thể như sau:
64
Nhóm 1: Chỉ sử dụng Maltodextrin (1 mg/g khối lượng cá, khối lượng cá) (MD, đối
chứng âm)
Nhóm 2: Maltodextrin (1 mg/g khối lượng cá) bổ sung maltodextrin kháng tiêu hóa
(75 mg/kg khối lượng cá) (RMD)
Nhóm 3: Maltodextrin (1 mg/g khối lượng cá) bổ sung cao chiết thô Trâm vỏ đỏ (75
mg/kg khối lượng cá) (CE);
Nhóm 4: Maltodextrin (1 mg/g khối lượng cá) bổ sung bột vi bao cao chiết vỏ thân
cây Trâm vỏ đỏ (75 mg/kg khối lượng cá) (MEP)
Nhóm 5: Maltodextrin (1 mg/g khối lượng cá) bổ sung acarbose (75 mg/kg khối
lượng cá) (ACA, đối chứng dương)
Mẫu máu được thu nhận theo phương pháp được mô tả bởi Zang et al. (2015) [432]
sau 30, 60, 120 và 180 phút sau ăn. Mức đường huyết sau ăn (The postprandial blood
glucose level, PBGL) được xác định bằng máy đo nhanh đường huyết MulticareIn
(Biochemical Systems International, Italia).
2.3.12.3. Đánh giá khả năng hạ đường huyết trên mô hình cá ngựa vằn đái tháo đường
của sản phẩm vi bao
Cá ngựa vằn được gây đái tháo đường theo phương pháp cho ăn thừa kết hợp ngâm
đường theo mô tả của Zang et al. (2017) [430] và Capiotti et al. (2014) [64] (Chi tiết mô
tả ở Mục 2.3.4.4. ). Cá đái tháo đường được chia thành năm nhóm thực nghiệm, 10 con
(5 cái và 5 đực)/nhóm, trong các bể nuôi dung tích 2 L trong 20 ngày. Cá được cho ăn
chế độ tiêu chuẩn trong suốt thời gian theo dõi với 20 mg thức ăn khô/con/ngày. Các
nhóm thực nghiệm được mô tả cụ thể như sau:
Nhóm 1: Cá bình thường ngâm trong nước nuôi bình thường (NOR);
Nhóm 2: Cá đái tháo đường ngâm trong nước nuôi bình thường (DIA);
Nhóm 3: Cá đái tháo đường ngâm trong nước nuôi chứa Metformin, 20 µM (tương
3.3 mg/L) (METFO)
Nhóm 4: Cá đái tháo đường ngâm trong nước nuôi chứa cao chiết thô từ vỏ thân cây
Trâm vỏ đỏ, nồng độ 10 mg/L (CE)
Nhóm 5: Cá đái tháo đường được ngâm trong nước nuôi chứa bột vi bao cao chiết
vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ, nồng độ 20 mg/L (tương đương 0,75 mg/L cao chiết không vi
bao) (MEP)
65
Đường huyết lúc đói của cá ở các lô thực nghiệm được xác định tại các thời điểm 0,
5, 10, 15, và 20 ngày tác động sử dụng máy đo đường huyết nhanh Multicare-In
(Biochemical Systems International, Italia) theo phương pháp được mô tả bởi Zang et
al. (2015) [432].
2.3.13. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát đường huyết thông qua điều hòa
biểu hiện gene của sản phẩm vi bao cao chiết.
Mức độ biểu hiện các gene liên quan đái tháo đường trên cá ngựa vằn dưới tác dụng
của bột vi bao cao chiết được đánh giá theo phương pháp được mô tả ở Mục 2.3.4.6.
2.3.14. Phương pháp đánh giá khả năng kháng viêm của sản phẩm vi bao cao chiết
2.3.14.1. Đánh giá khả năng kháng viêm trong điều kiện in vitro
Hoạt tính kháng viêm in vitro của bột vi bao cao chiết được đánh giá theo phương
pháp được mô tả bởi Dharmadeva et al. (2018) [98] (Trình bày chi tiết ở Mục 2.3.3.2. ).
Trong đó, dung dịch thử nghiệm của bột vi bao cao chiết được chuẩn bị ở các nồng độ
pha loãng nhị phân trong khoảng từ 31,3 đến 2.000 μg/mL, nồng độ tương đương với
cao chiết không được vi bao gói từ 1,6 đến 100 μg/mL, dãy nồng độ thuốc kháng viêm
ibuprofen trong khoảng từ 200 đến 1.000 μg/mL là đối chứng dương. Mức độ ức chế
biến tính albumin trứng được so sánh với mẫu chứng không bổ sung bột vi bao/thuốc
kháng viêm thông qua độ hấp thụ bước sóng 660 nm sử dụng máy đo quang phổ UV-
VIS V-630 (Jasco, Nhật Bản).
2.3.14.2. Đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua bảo vệ ấu trùng cá ngựa vằn
Hoạt tính kháng viêm in vivo của sản phẩm vi bao cao chiết được đánh giá thông
qua khả năng bảo vệ ấu trùng cá trước tác động gây viêm của CuSO4, dựa trên phương
pháp được mô tả bởi Nguyen et al. (2020) [267] với một số điều chỉnh nhỏ để phù hợp
với điều kiện thực tế. Quá trình tạo phôi được tiến hành theo hướng dẫn của Westerfield
et al. (2000) (https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html) [399]. Phôi được thu nhận, rửa
sạch và loại bỏ các phôi hỏng bằng kính hiển vi trước khi phân phối vào các đĩa thực
nghiệm 6 giếng, mật độ 30 phôi/giếng. Phôi đạt chuẩn được duy trì ở nhiệt độ 28 ± 2 °C
trong môi trường nuôi phôi, thay mới mỗi 24 giờ để đảm bảo phôi nở hoàn toàn thành
ấu trùng sau 3 ngày thụ tinh (post-fertilization, dpf), sẵn sàng cho thực nghiệm.
Ấu trùng cá ngựa vằn 3 ngày tuổi (3 dpf) ở mật độ 30 con/giếng được kích hoạt quá
trình viêm bằng dung dịch nước nuôi chứa CuSO4 20 µM trong 2 giờ. Sau đó, ấu trùng
được ngâm với nước nuôi chứa bột vi bao cao chiết ở nồng độ 50, 100, 150 mg/L; cao
66
chiết thô không được vi bao (CE) ở nồng độ 2,5; 5,0 và 7,5 mg/L trong 24 giờ. Thực
nghiệm với nước nuôi chứa Ibuprofen 2 mg/L là đối chứng dương và nghiệm thức chỉ
sử dụng nước nuôi thông thường làm đối chứng âm. Các thực nghiệm được lặp lại 3 lần
trên các đĩa thực nghiệm 6 giếng (6-wells plate). Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ ấu trùng viêm
(%) thông qua các dấu hiệu bất thường đặc trưng trạng thái viêm so với nghiệm thức đối
chứng tại các thời điểm 2, 4, 6, và 24 giờ tác động.
Đối chứng âm (Nước nuôi)
Nồng độ 1
2,5
50
Nồng độ 2
5
100
Nồng độ 3
7,5
150
Đối chứng dương
2
2
(Ibuprofen)
Ghi chú: Mật độ ấu trùng 30 con/giếng. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ ấu trùng viêm theo thời gian 2, 4, 6, và 24 giờ tác động.
Nội dung 4. Nghiên cứu xây dựng mô hình dự đoán thời hạn bảo quản của sản phẩm
vi bao
2.3.15. Chuẩn bị mẫu bảo quản ở điều kiện cưỡng bức
Mẫu được bảo quản ở điều kiện cưỡng bức và xây dựng mô hình động học được
tiến hành theo Lago & Noreña (2017) [196] có cải tiến để phù hợp với điều kiện thực
tế. Bột sấy phun đựng trong bình thủy tinh, đặt trong hộp kín chứa dung dịch NaCl bão
hòa (tạo độ ẩm không khí khoảng 75 %) và BaCl2 bão hoà (để tạo độ ẩm không khí
khoảng 90 %). Các giá trị này được thiết lập dựa trên mức biến động trong thực tế về
độ ẩm không khí trung bình tại Việt Nam. Các hộp kín đặt trong tủ ấm với nhiệt độ
tương ứng 40 và 60 °C. Thời gian theo dõi trong 50 ngày, mẫu được thu nhận và phân
tích các chỉ tiêu theo dõi (độ ẩm bột, hàm lượng polyphenol tổng số, khả năng kháng
oxy hoá và ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột) 10 ngày/lần trong 50 ngày (Bảng 2.5).
Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định theo phương pháp Folin–Ciocalteu
[119] với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả lại bởi Nguyen và Eun (2011) [261] (Chi tiết
mô tả ở phụ lục 1, P.1.1.). Kết quả dựa vào đường chuẩn gallic acid (mgGAE/g chất khô).
67
Hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
được đánh giá thông qua khả năng trung hòa gốc tự do DPPH• và ABTS•+. Trong đó,
khả năng trung hòa DPPH• tiến hành bằng phương pháp so màu theo Brand-Williams et
al. (1995) [51] với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả lại bởi Nguyen et al. (2016) [262]
và khả năng năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ tiến hành theo phương pháp so màu của
Re et al. (1999) [318] với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả bởi Nguyen et al. (2022)
[260] (Chi tiết mô tả ở phụ lục 1, P.1.3.). Kết quả được tính theo mg Trolox tương đương
(mg TE/g chất khô) dựa vào đường chuẩn Trolox.
Khả năng ức chế hoạt động của các enzyme tiêu hóa tinh bột, α-amylase và α-
glucosidase được xác định bằng các phương pháp được tiến hành bởi Kwon et al. (2016)
[185] với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả bởi Nguyen et al. (2016) [262] (Chi tiết mô
tả ở phụ lục 1, P.1.5.). Khả năng ức chế hoạt tính α-amylase và α-glucosidase được tính
như sau:
(2.9) % Ứ 𝑐 𝑐ℎế = [(𝐴0 – 𝐴1)/𝐴0] × 100%
trong đó, 𝐴0 là độ hấp thụ của mẫu kiểm chứng (mẫu chỉ chứa dung môi hòa tan mẫu ở thời
điểm ban đầu, 𝐴1 là độ hấp thụ của mẫu thí nghiệm. Kết quả khả năng ức chế được thể hiện
thông qua IC50 là nồng độ sản phẩm vi bao có khả năng ức chế 50% hoạt tính của enzyme.
75
40
90
0
10
20
30
40
50
75
60
90
2.3.16. Phương pháp xác định các thông số động học suy giảm hoạt chất và dự đoán
thời gian bảo quản
Động học suy giảm các hợp chất tự nhiên/hoạt tính sinh học được đánh giá bằng
phương trình bậc nhất như sau:
(2.10) Ct = C0. e−kt
trong đó Ct là hàm lượng hợp chất tự nhiên/hoạt tính sinh học tại thời điểm (t); k là hằng
số tốc độ và C0 là hàm lượng hợp chất tự nhiên/hoạt tính sinh học tại thời điểm bắt đầu.
68
Thời gian phân hủy 90% (𝐷), Chu kỳ bán rã (𝑡1/2) và hệ số nhiệt động (𝑄10) được
xác định theo công thức sau:
(2.11) 𝐷 = ln (10) 𝑘
10 𝑇2−𝑇1
(2.12) 𝑡1/2 = ln (2) 𝑘
(2.13) ) 𝑄10 = ( 𝑘𝑇2 𝑘𝑇1
trong đó, 𝐷 là thời gian để một đại lượng biến đổi với thời gian theo hàm số mũ suy
giảm đạt đến lượng hơn 90% lượng ban đầu; Chu kỳ bán rã (𝑡1/2) - chu kỳ nửa phân rã
hay thời gian bán rã là thời gian cần để một đại lượng biến đổi với thời gian theo hàm
số mũ suy giảm đạt đến lượng bằng một nửa lượng ban đầu. 𝑄10 là thước đo độ nhạy
nhiệt độ của tốc độ phản ứng hóa học hoặc quá trình sinh học được xác định từ các hằng
số suy giảm ở một nhiệt độ nhất định (T) và trên 10 °C (T + 10°C) (theo Lago & Noreña,
2017) [196] . Nhiệt độ cưỡng bức tại 40 và 60 °C được sử dụng trong nghiên cứu, do đó
đại lượng 𝑄10 được xác định theo công thức (2.13), trong đó 𝑘𝑇1và 𝑘𝑇2lần lượt là hằng số suy thoái tại 40 và 60 °C (theo Cassol & Noreña, 2021) [65].
Năng lượng kích hoạt (𝐸𝑎) được ước tính từ giá trị 𝑄10 như trong biểu thức:
(2.14) 𝐸𝑎 = 2,303𝑙𝑜𝑔10(𝑄10)𝑅𝑇(𝑇 + 10) 10
trong đó: 𝑅 là hằng số khí lý tưởng (𝑅=8,314 Jmol-1 K-1) và T là nhiệt độ tuyệt đối (°K).
2.3.17. Phân tích dữ liệu nghiên cứu
Các thí nghiệm trong nghiên cứu được lặp lại ít nhất 3 lần. Số liệu được xử lý thống
kê bằng phần mềm GraphPad Prism version 10.1.2 (324) (San Diego, CA, USA). Sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05 được xác định bằng thử nghiệm Fisher’s
Least Significant Differences (LSD). Các kết quả thực nghiệm được trình bày dạng trung
bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (Standard Error of the Mean, SEM). Phân tích
tương quan (Pearson’s Correlation Analysis) và phân tích thành phần chính (Principal
Component Analysis, PCA) thực hiện bằng phần mềm R phiên bản 4.1.2 [311] với gói
FactoMineR [201].
69
3.1. Ảnh hưởng của trích ly phân đoạn đến thành phần hoạt chất và khả năng hạ
đường huyết đa mục tiêu của các loại cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
Cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ có tiềm năng chống đái tháo đường cao [268].
Tuy nhiên, thông tin khoa học về thành phần các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học
từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ còn chưa được công bố. Các hợp chất tự nhiên từ thực vật rất
đa dạng về thành phần, cấu trúc và tính chất hóa lý nên việc phân lập các hợp chất trong
hỗn hợp cao chiết rất tốn thời gian và kinh phí [360]. Nghiên cứu này tiến hành phân
lập các nhóm hợp chất dựa vào khả năng hòa tan trong các dung môi có độ phân cực
khác nhau. Quá trình trích ly phân đoạn làm tập trung các hợp chất có hoạt tính sinh học
cao về phân đoạn với dung môi phù hợp. Từ đó, phân đoạn có hoạt tính cao được sử
dụng để phân lập và xác định cấu trúc các hoạt chất làm chất đánh dấu trong nghiên cứu
và kiểm soát dược liệu.
3.1.1. Ảnh hưởng của trích ly phân đoạn đến hàm lượng polyphenol và flavonoid
tổng số
Các nghiên cứu gần đây cho thấy, polyphenol và flavonoid là nhóm các hợp chất có
hoạt tính sinh học trong hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến tim mạch, thần kinh, loãng
xương, ung thư, bệnh đường ruột và đái tháo đường [2, 56, 394]. Nhóm các hợp chất
này cũng được tìm thấy nhiều trong các loài cây thuốc thuộc chi Trâm (Syzygium sp.)
[11, 87]. Nghiên cứu này tiến hành trích ly phân đoạn cao chiết tổng từ vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ và xác định hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số của các loại cao chiết
phân đoạn, kết quả thể hiện ở Bảng 3.1. Trong đó, các phân đoạn n-hexane và
chloroform thu được lượng không đáng kể, điều đó cho thấy các hợp chất có trong cao
chiết hòa tan kém trong các dung môi không phân cực.
Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy, quá trình trích ly phân đoạn có khả năng tập trung cao
các hợp chất polyphenol và flavonoid trong các phân đoạn ethyl acetate và n-butanol
với giá trị hàm lượng tổng số lần lượt là 904,11 - 810,90 mg GAE/g và 897,66 - 710,21
mg QE/g so với cao chiết thô lần lượt là 531,64 mg GAE/g và 473,44 mg QE/g. Hàm
lượng cao của nhóm chất polyphenol trong cây Trâm vỏ đỏ cũng đã được công bố trước
đây. Nghiên cứu của Mai et al. (2007) cho thấy, tổng hàm lượng polyphenol trong lá
Trâm vỏ đỏ là cao nhất (đương lượng catechin là 251,7 mg/g chất khô) trong số bốn loài
cây có tiềm năng chống đái tháo đường gồm Trâm vỏ đỏ, Vối (Cleistocalyx operculatus),
70
Săng Máu (Horsfield amygdalina), và Vừng Quả Xoan (Careya arborea). Bốn loài cây
này được sàng lọc từ 28 loài cây thực phẩm và làm thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam
[219]. Nghiên cứu này lần đầu tiên công bố hàm lượng cao các hợp chất polyphenol và
flavonoid trong vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ. Ngoài ra, kết quả còn cho thấy rằng, nhóm chất
polyphenol và flavonoid trong vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ có khả năng hòa tan tốt trong
ethyl acetate và n-butanol. Do đó, phương pháp trích ly phân đoạn có thể làm giàu các
hợp chất này, đặc biệt là trong dung môi ethyl acetate.
CE EAF BF WF
Ghi chú: Giá trị trung bình ± SEM (n = 3). Các ký tự khác nhau (a-d) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các loại cao chiết theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05). CE: cao chiết thô; EAF: Cao chiết phân đoạn ethyl acetate; BF: cao chiết phân đoạn n-Butanol; WF: cao chiết phân đoạn nước; CK: Khối lượng khô của cao chiết; TPC: hàm lượng polyphenol tổng số; TFC: hàm lượng flavonoid tổng số; GAE: đương lượng gallic acid; QE: đương lượng quercetin;
3.1.2. Ảnh hưởng của trích ly phân đoạn đến khả năng kiểm soát đường huyết đa
mục tiêu trên mô hình in vitro của các loại cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
3.1.2.1. Hoạt tính chống oxy hóa
Các chất chống oxy hóa tự nhiên có vai trò quan trọng trong kiểm soát đường huyết
và phòng ngừa biến chứng do tăng đường huyết kéo dài nhờ khả năng bảo vệ tế bào β
tuyến tụy cũng như các tế bào thuộc mô/cơ quan khác nhau trước các tổn thương do
stress oxy hóa gây ra theo Kanwugu et al. (2022) [166]. Mối quan hệ tích cực giữa khả
năng chống oxy hóa, kháng viêm với khả năng ổn định đường huyết trong phòng chống
đái tháo đường của các loài cây thuộc chi Trâm đã được nhấn mạnh trong công bố khoa
học gần đây [31].
Kết quả Bảng 3.2 cho thấy, khả năng trung hòa gốc tự do DPPH• cũng như ABTS•+
có sự khác biệt đáng kể giữa các loại cao chiết (p < 0,05) và khả trung hòa gốc tự do
ABTS•+ cao hơn so với gốc tự do DPPH•. Khả năng trung hòa DPPH• của các loại cao
chiết EAF, CE, BF và WF lần lượt là 1,5; 1,26; 1,12 và 1,05 (g TE/g ck). Trong khi đó,
khả năng trung hòa ABTS•+ theo thứ tự giảm dần của các loại cao chiết EAF, WF, BF,
và CE lần lượt là 3,27; 1,70; 1,51 và 1,40 (g TE/g ck). 71
CE EAF
BF
WF
Ghi chú: Giá trị trung bình ± SEM (n = 3). Các ký tự khác nhau (a-d) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các loại cao chiết theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05). CE: Cao chiết thô; EAF: Cao chiết phân đoạn ethyl acetate; BF: Cao chiết phân đoạn n-Butanol; WF: Cao chiết phân đoạn nước; CK: Khối lượng khô của cao chiết; TE: Đương lượng Trolox;
Kết quả này cho thấy, các hợp chất có khả năng trung hòa DPPH• và ABTS•+ được
tập trung trong phân đoạn ethyl acetate. Kết quả này rất phù hợp với báo cáo của
Alawiyah et al. (2021) rằng, EAF từ thân gỗ S. cumini có hoạt tính chống oxy hóa cao
nhất, tiếp theo là cao chiết ethanol và cao phân đoạn hexane [19] hoặc báo cáo của Ruan
et al. (2008) rằng EAF từ lá S. cumini có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với cao
chiết methanol hoặc các cao phân đoạn nước và n-hexane [327]. Sự khác nhau trong khả
năng trung hòa DPPH• và ABTS•+ giữa các loại cao chiết có liên quan đến hàm lượng và
thành phần của các chất chống oxy hóa có trong các phân đoạn. Trong đó, khả năng
phản ánh khả năng chống oxy hóa ở phổ rộng các hợp chất thông qua trung hòa ABTS•+
so với DPPH• [118, 408] có thể giải thích cho hoạt tính trung hòa ABTS•+ tốt hơn DPPH•
của các loại cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ. Kết quả này cho thấy, cao chiết phân
đoạn ethyl acetate có thể tập trung đa dạng các thành phần hợp chất chống oxy hóa so
với các loại cao chiết còn lại. Do đó, cần có các nghiên cứu sâu hơn về các thành phần
hóa học, các hoạt chất chính trong các loại cao chiết nhằm làm rõ về khả năng chống oxy
hóa cũng như sự tương tác của chúng đến hoạt tính chống oxy hóa.
3.1.2.2. Khả năng kháng viêm in vitro
Tình trạng viêm có mối liên hệ chặt chẽ với đái tháo đường [374], đặc biệt là đái
tháo đường tuýp 2, trong đó, viêm ở các mô/cơ quan gây nên các rối loạn trong kiểm
soát đường huyết, góp phần vào sự khởi phát và tiến triển của đái tháo đường và các
biến chứng phức tạp khác [300]. Bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2 thể hiện tình trạng
viêm cận lâm sàng và có sự hiện hiện của hầu hết các chỉ thị sinh học phản ánh tình
trạng viêm toàn thân [112]. Các chỉ thị này trở thành mục tiêu của các thuốc điều trị đái
72
tháo đường, điển hình là các interleukin [374]. Các hợp chất tự nhiên từ thực vật có khả
năng kháng viêm, được chứng minh có thể ứng dụng trong điều trị đái tháo đường, góp
phần giảm các biểu hiện liên quan đến tình trạng viêm của người bệnh [178].
Sự biến tính protein tạo ra các kháng nguyên, gây nên phản ứng quá mẫn loại III và
viêm. Do đó, các nghiên cứu minh chứng rằng khả năng chống biến tính protein là cách
tiếp cận kháng viêm hiệu quả [233]. Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng viêm của các
loại cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ thông qua khả năng bảo vệ albumin trứng trước
tác nhân gây biến tính bởi nhiệt theo phương pháp mô tả bởi Dharmadeva et al. (2018)
[98]. Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, khả năng ức chế biến tính albumin của các loại cao
chiết tăng dần theo sự thay đổi nồng độ cao chiết từ 1,56 đến 50 µg/mL, sau đó giảm
xuống khi nồng độ tăng lên 100 µg/mL và có sự khác nhau đáng kể giữa các loại cao
chiết (p < 0,05). Giá trị ức chế biến tính cao nhất của các loại cao chiết EAF, BF, WF
và CE ghi nhận tại nồng độ 50 mg/mL với giá trị lần lượt là 54,43; 49,64; 36,39 và
34,61%. Trong đó, hoạt tính của EAF và BF cao hơn đáng kể so với Ibuprofen 1000
µg/mL (p < 0,01). Đáng chú ý, khi nồng độ các loại cao chiết tăng lên 100,00 µg/mL,
mức độ suy giảm hoạt tính ở các loại cao chiết khác nhau đáng kể giữa các loại cao
chiết. Trong đó, BF có sự suy giảm lớn nhất với giá trị bảo vệ chỉ còn 16,07% (giảm
33,57%), tiếp theo là WF đạt 22,39% (giảm 14%), EAF đạt 39,56% (14,87%), và CE có
mức độ giảm thấp nhất với giá trị ức chế đạt 31,85% (giảm 2,76%). Các nghiên cứu
chứng minh rằng polyphenol có hoạt tính kháng viêm thông qua khả năng bảo vệ chống
biến tính protein [98, 241, 248, 279]. Hoạt tính này đã được tìm thấy ở một số loài thuộc
chi Trâm, bao gồm S. caryophyllatum [146], S. cumini [307] và S. samarangense [154].
Theo Anopp và Bindu (2015), một số chiết xuất từ lá S. zeylanicum, có nguồn gốc từ Ấn
Độ, thể hiện hoạt tính chống biến tính protein đáng chú ý, trong đó cao chiết phân đoạn
ethyl acetate thể hiện hoạt tính cao nhất [27]. Nghiên cứu này lần đầu tiên chứng minh
tác dụng kháng viêm của chiết xuất từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ. Các kết quả cho thấy
quá trình trích ly phân đoạn ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính kháng viêm của cao chiết
vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ; sự tập trung hàm lượng cao của nhóm polyphenol trong phân
đoạn ethyl actetate nên thể hiện hoạt tính cao nhất trong số các loại cao chiết. Vì vậy,
mối tương quan giữa thành phần và hàm lượng các hoạt chất trong cao chiết đến khả
năng bảo vệ chống biến tính protein cần được làm rõ trong các nghiên cứu tiếp theo.
73
1,56
3,13
6,25
12,50
25,00
50,00
100,00
CE
4,54±0,07cF
8,29±0,05dF
17,43±0,07cE
27,60±0,04dD 32,91±0,02dB
34,61±0,03dA
31,85±0,10bC
EAF
3,39±0,06dG
13,54±0,08bF 17,78±0,05cE
44,22±0,03aC
49,20±0,03aB
54,43±0,12aA
39,56±0,19aD
36,16±0,17*
BF
7,66±0,02aG
13,94±0,02aF
23,17±0,07aD
34,49±0,05bC
46,20±0,04bB
49,64±0,01bA
16,07±0,27dE
WF
6,18±0,02bG
12,30±0,61cF
21,94±0,08bE
31,98±0,05cC
33,99±0,04cB
36,39±0,05cA
22,39±0,10cD
Ghi chú: Giá trị trung bình ± SEM (n =3). Các ký tự khác nhau (a-d) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các loại cao chiết ở cùng nồng độ (cột)
và các ký tự khác nhau (A-G) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ trong cùng cao chiết (hàng) theo Fisher’s Least Significant Difference
(LSD) test ( = 0,05). CE: Cao chiết thô; EAF: Cao chiết phân đoạn ethyl acetate; BF: Cao chiết phân đoạn n-Butanol; WF: Cao chiết phân đoạn nước;
74
3.1.2.3. Khả năng ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột
Tinh bột trong thực phẩm được thủy phân thành các phân tử glucose dưới tác dụng
của các enzyme α-amylase và α-glucosidase trước khi các phân tử này được vận chuyển
vào máu và gây tăng đường huyết sau ăn [420]. Sự ức chế hoạt động của các enzyme
này có thể làm chậm quá trình tiêu hóa và hấp thu carbohydrate, dẫn đến giảm đường
huyết sau ăn, một trong những mục tiêu quan trọng trong kiểm soát đái tháo đường
[439]. Trên thực tế, các loại thuốc có tác dụng ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột như
acarbose và voglibose được sử dụng tương đối hiệu quả trong điều trị đái tháo đường
thông qua kiểm soát sự gia tăng đường huyết sau ăn [389].
a. Hoạt tính ức chế α-amylase
Các nghiên cứu cho thấy chiết xuất thực vật có khả năng kiểm soát đường huyết
thông qua ức chế hoạt động của α-amylase [218]. Khả năng ức chế α-amylase mô tả bởi
giá trị IC50 của các loại cao chiết được thể hiện ở Bảng 3.4. Kết quả cho thấy sự khác
biệt có ý nghĩa thống kê giữa các loại cao chiết về khả năng ức chế α-amylase. Trong
đó, cao chiết thô (IC50 4,19 µg/mL) thể hiện hoạt tính ức α-amylase là cao nhất và cao
chiết ethyl acetate (IC50 12,32 µg/mL) là thấp nhất. Cao chiết thô và phân đoạn nước
WF có hoạt tính ức chế α-amylase cao hơn so với acarbose (IC50 5,91 µg/mL). Hoạt tính
ức chế α-amylase của BF không có khác biệt đáng kể với acarbose (p > 0,05). Trong khi
đó, EAF có hoạt tính ức chế α-amylase thấp nhất (12,32 μg/mL) mặc dù có giá trị TPC,
TFC và hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. Kết quả này có thể do đồng tương tác của các
hợp chất trong cao chiết nên làm cho khả năng ức chế α-amylase cao trong chiết tổng
cao hơn so với các loại cao chiết phân đoạn.
Kết quả trên phù hợp với một số nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ một số cây thuốc
thuộc chi Trâm thể hiện khả năng kiểm soát đường huyết thông qua ức chế α-amylase
[31, 223, 301]. Hoạt tính ức chế α-amylase của cao chiết thô và các cao phân đoạn từ vỏ
thân cây Trâm vỏ đỏ có thể so sánh với cao chiết từ lá Syzygium cumini (IC50 39,9
μg/mL) theo Poongunran et al. (2017) [301] hoặc cao chiết xuất từ lá Syzygium aqueum,
(IC50 8 μg/mL) theo Manaharan et al. (2012) [223]. Nghiên cứu của Cappetti et al.
(2020) cho thấy rằng hoạt tính ức chế α-amylase của các chiết xuất từ cây thuốc có thể
khác nhau phụ thuộc vào nhiều kiểu tương tác giữa các thành phần hoạt chất [63]. Sự
khác nhau về hoạt tính ức chế α-amylase giữa các loại cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ
đỏ có thể do sự khác nhau trong thành phần hoạt chất cũng như tương tác giữa chúng
trong các loại cao chiết. Sultana et al. (2020) báo cáo rằng khi các hợp chất polyphenol 75
với độ phân cực tương đồng tập trung cao trong cao chiết có thể tương tác với nhau và
ngăn cản chúng tương tác với trung tâm hoạt động của enzyme, dẫn đến giảm hoạt tính
ức chế [363]. Kết quả tương tự được báo cáo bởi Grussu et al. (2011) rằng hàm lượng
cao các hợp chất polyphenol trong quả mâm xôi vàng không làm tăng hoạt tính ức chế
α-amylase [139]. Do đó, nghiên cứu sâu hơn về thành phần hoạt chất chính cũng như
các tương tác giữa chúng trong hoạt động ức chế α-amylase là cần thiết nhằm khai thác
hiệu quả ứng dụng chống đái tháo đường của cây thuốc này.
CE EAF BF WF Acarbose (Đối chứng dương)
b. Hoạt tính ức chế α-glucosidase
Khả năng kiểm soát đường huyết và chống đái tháo đường của các chất ức chế α-
glucosidase từ thực vật đã được minh chứng qua nhiều công bố khoa học cũng như trong
thực tiễn ứng dụng theo báo cáo phân tích tổng hợp của Dirir et al. (2022) [102]. Khả
năng ức chế α-glucosidase của các loại cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ mô tả bởi giá
trị IC50 được thể hiện trong Bảng 3.4. Kết quả cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê giữa các loại cao chiết phân đoạn về khả năng ức chế α-glucosidase. Trong đó, BF
có hoạt tính ức chế enzyme cao nhất (IC50 0,37 μg/mL) và thấp nhất là cao chiết phân
đoạn nước WF (IC50 0,69 μg/mL). Hoạt tính ức chế α-glucosidase của EAF và CE không
có sự khác biệt có ý nghĩa, với giá trị IC50 lần lượt là 0,43 và 0,41 μg/mL (p > 0,05). Tất
cả các loại cao chiết đều có hoạt tính ức chế α-glucosidase cao hơn rõ rệt so với acarbose
(p < 0,05). Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu cho thấy các loại cao chiết từ
cây thuốc thuộc chi Trâm có tiềm năng chống đái tháo đường thông qua ức chế α-
glucosidase [32, 192, 223]. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của cao chiết thô và cao chiết
phân đoạn từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ có thể so sánh với cao chiết từ lá S. aqueum (EC50
11 μg/mL) theo Manaharan et al. (2012) [223], hay cao chiết từ lá S. malaccense (IC50
76
207,6 μg/mL) theo Arumugan et al. (2016) [32]. Tiềm năng chống đái tháo đường thông
qua ức chế α-glucosidase từ ruột chuột của Trâm vỏ đỏ đã được công bố trong nghiên
cứu của Mai et al. (2007), chiết xuất từ lá với IC50 là 0,1 mg/mL [219], và Nguyen et al.
(2019), chiết xuất vỏ thân với IC50 là 109 μg/mL [268]. Kết quả trong nghiên cứu này
cho thấy rằng, tiềm năng chống đái tháo đường đáng kể của các loại cao chiết từ vỏ thân
cây Trâm vỏ đỏ thông qua ức chế α-glucosidase và quá trình phân đoạn có thể tập trung
các chất ức chế α-glucosidase về một số phân đoạn nhất định, thuận lợi cho các nghiên
cứu phân tích chuyên sâu về thành phần hoạt chất cụ thể.
Theo công bố của Wang et al. (2012), hoạt chất sử dụng điều trị bệnh đái tháo đường
thông qua ức chế các enzyme thủy phân tinh bột đạt hiệu quả cao khi chúng có khả năng
ức chế α-amylase trung bình và ức chế α-glucosidase cao. Quá trình này có thể làm giảm
tác dụng phụ do giảm được quá trình lên men bất thường xảy ra trong ruột kết [397].
Các kết quả trong nghiên cứu này cho thấy, các hợp chất tiềm năng trong hỗ trợ giảm
đường huyết thông qua ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột tập trung cao ở hai phân đoạn
ethyl acetate và n-butanol. Tuy nhiên, để xác định cao chiết tiềm năng sử dụng trong kiểm
soát bệnh đái tháo đường cần có minh chứng trên các mô hình in vivo và trên lâm sàng.
3.1.2.4. Khả năng kháng hại khuẩn và kích thích sinh trưởng lợi khuẩn trong điều kiện
in vitro
a. Khả năng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn gây bệnh
Các nghiên cứu gần đây cho thấy có mối tương quan chặt chẽ giữa đái tháo đường
và nhiễm trùng gây nên bởi E. coli và S. aureus. Wiwanitkit (2011) nhấn mạnh mối liên
hệ rõ ràng giữa đái tháo đường và nhiễm trùng do E. coli, đặc biệt là bệnh nhi mắc đái
tháo đường phụ thuộc insulin, trong khi các tài liệu nghiên cứu bổ sung cho thấy nhiễm
E. coli góp phần vào sự phát triểm viêm phúc mạc ở người mắc đái tháo đường [402].
Hơn nữa, Sonkoue et al. (2022) phát hiện ra rằng bệnh nhân đái tháo đường mất cân
bằng đường huyết dễ bị nhiễm E. coli đa kháng thuốc [355]. Trong khi đó, Butrico et al.
(2023) chứng minh rằng tăng đường huyết làm nghiêm trọng thêm tình trạng nhiễm
khuẩn S. aureus [55]. Ngoài ra, Liang et al. (2023) nhấn mạnh mối liên hệ giữa tỷ lệ lưu
hành toàn cầu của S. aureus trong thực phẩm với sự phát triển của đái tháo đường và
tóm tắt các cơ chế chính liên quan đến nhiễm khuẩn S. aureus và đái tháo đường tuýp 2
[206]. Do đó, khả năng ức chế E. coli and S. aureus có thể đóng vai trò quan trọng trong
việc nâng cao hiệu quả phòng trị đái tháo đường.
77
Hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh E. coli và S. aureus mô tả trên Bảng 3.5 cho
thấy, đường kính vùng kháng khuẩn tăng dần theo chiều tăng nồng độ ở tất cả các loại
cao chiết. Trong đó, hoạt tính của EAF cao hơn đáng kể so với các loại cao chiết còn lại
ở khả năng ức chế cả hai chủng vi khuẩn (p < 0,05). Đường kính vùng kháng khuẩn
trung bình của EAF đối với E. coli và S. aureus đạt lần lượt 21,0 và 23,0 mm trong khi
các loại cao chiết còn lại đạt giá trị từ 16,5 đến 17,5 mm tại nồng độ 100 mg/mL. Kết
quả xác định giá trị nồng độ tối thiểu ức chế (Minimun Inhibitory Concentration, MIC)
mô tả ở Bảng 3.6 cho thấy có sự khác biệt đáng kể trong hoạt tính ức chế của các loại
cao chiết khác nhau đối với từng loại vi khuẩn.
Cụ thể, đối với E. coli, EAF cho thấy khả năng ức chế mạnh nhất với giá trị MIC ở
mức 3,1 mg/mL trong khi các loại cao chiết còn lại không cho thấy sự khác biệt với giá
trị MIC là 12,5 mg/mL. Trong khi đó, S. aureus cho thấy sự nhạy cảm hơn E. coli dưới
tác động các loại cao chiết, đồng thời có sự khác biệt rõ rệt giữa các loại cao chiết với
nhau. Hoạt tính ức chế S. aureus cao nhất là EAF (0,8 mg/mL), thấp nhất là WF (3,1
mg/mL). BF và CE có tác dụng tương đương với giá trị MIC ở mức 1,6 mg/mL. Kết quả
này có thể so sánh với với báo cáo của Deepika et al. (2014) cho thấy chiết xuất EAF từ
lá S. zeylanicum (L.) DC. có khả năng kháng E. coli (kích thước vùng kháng khuẩn đạt
8.3±0.11 mm tại nồng độ 25 mg/mL) nhưng không ghi nhận khả năng kháng S. aureus
[94]. Nghiên cứu này cho thấy tác dụng kháng khuẩn tốt của EAF từ vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ đối với cả hai loại vi khuẩn, đồng thời cho thấy khả năng đối kháng S. aureus
(MIC là 0,78 mg/mL) tốt hơn so với E. coli (MIC là 1,56 mg/mL) (Bảng 3.6). Kết quả
này tương đồng với báo cáo của Nagwa et al. (2019) cho thấy các chiết xuất từ lá
Moringa oleifera (L.) và hoa của Matricaria recutita (L.) có khả năng đối kháng S.
aureus mạnh hơn so với E. coli [34].
78
EAF
Echesteria coli
BF
-
7,7±0,3bG
11,5±0,3bF
14,0±0,0bE
15,0±0,0bD
16,0±0,0bC
17,0±0,0bB
27,0±0,6A
ATCC25923
WF
-
7,7±0,3bF
10,7±0,3bcE
11,8±0,1cD
14,8±0,1bC
15,5±0,0bcC
16,5±0,3bB
CE
-
7,7±0,3bG
10,5±0,3cF
12,0 ± 0,0cE
13,0 ± 0,6cD
15,0 ± 0,0cC
16,5 ± 0,3bB
EAF
8,3±0,3H
10,3±0,3aG
17,0±0,0aF
18,0±0,0aE
19,5±0,3aD
21,0±0,0aC
23,0±0,0aB
Staphylococcus
BF
-
7,7±0,3bF
12,7±0,3bE
13,5±0,3bE
14,5±0,3bD
15,5±0,3cC
17,0±0,3bB
aureus
31,3±0,7A
WF
-
7,7±0,3bF
11,3±0,3cE
13,5±0,3bD
15,5±03cC
17,0±0,0bB
17,5±0,3bB
ATCC25923
CE
-
7,7±0,3bF
10,7±0,3cE
12,0 ± 0,0cD
13,0 ± 0,0dC
16,5 ± 0,3bB
17,0 ± 0,0bB
Ghi chú: Giá trị trung bình ± SEM (n =3). Các ký tự khác nhau (a-c) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các loại cao chiết ở cùng nồng độ
(cột) và các ký tự khác nhau (A-E) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ trong cùng cao chiết (hàng) theo Fisher’s Least Significant
Difference (LSD) test ( = 0,05).
79
Echesteria coli ATCC25923
-
6,25 3,13
- -
+ +
+ +
+ +
- -
- -
- -
- -
1,56
+
+
+
+
-
-
+
-
0,78
+
+
+
+
-
+
+
+
0,39
+
+
+
+
+
+
+
+
MIC (mg/mL)
3,13
12,50
12,50
12,50
0,78
1,56
3,13
1,56
Ghi chú: CE: Cao chiết thô; EAF: Cao chiết phân đoạn ethyl acetate; BF: Cao chiết phân
đoạn n-Butanol; WF: Cao chiết phân đoạn nước; “-”, màu xanh: không ghi nhận sự phát
triển của vi khuẩn; “+”, màu đỏ: có ghi nhận sự phát triển của vi khuẩn;
Các hợp chất tự nhiên có thể đối kháng vi khuẩn gây bệnh với nhiều cơ chế khác
nhau và được xác định là nền tảng quan trọng để chống lại tình trạng kháng kháng sinh
đang gia tăng [189, 303, 326]. Một số công bố cho thấy, các hợp chất polyphenol và
flavonoid có thể ức chế vi khuẩn theo một số cơ chế như tương tác với protein màng
làm thay đổi cấu trúc và chức năng protein màng; thay đổi tính thấm của màng và cản
trở các chức năng màng gồm vận chuyển điện tử, hấp thu chất dinh dưỡng, sinh tổng
hợp nucleic acid và protein, chức năng enzyme [212]. Do đó, sự tập trung cao các hợp
chất polyphenol và flavonoid về cao chiết EAF (Bảng 3.1) có thể đã giúp nâng cao hoạt
tính kháng khuẩn của cao chiết này. Ngoài ra, mức độ nhạy cảm của S. aureus so với E.
coli có thể đến từ sự khác biệt trong cấu trúc thành tế bào [422], trong đó thành tế bào
nhiều lớp của E. coli có thể đã ngăn chặn sự xâm nhập của các hợp chất kháng khuẩn
tiềm năng từ đó giảm hiệu quả tác động của cao chiết so với S. aureus.
b. Khả năng kích thích sinh trưởng lợi khuẩn của cao chiết trong điều kiện in vitro
Theo các tài liệu khoa học, các lợi khuẩn (probiotic) có thể là một lựa chọn bổ trợ
trong điều trị đái tháo đường tuýp 2 để cải thiện tình trạng rối loạn lipid máu và thúc
đẩy cải thiện kiểm soát trao đổi chất [177]. Lactobacillus casei có thấy có những lợi ích
trong phòng chống đái tháo đường, như cải thiện khả năng đáp ứng đường huyết ở bệnh
nhân đái tháo đường tuýp 2 [187] và thay đổi thành phần hệ vi sinh đường ruột ở chuột
đái tháo đường [308].
80
Kết quả mô tả trong Bảng 3.7 cho thấy sự khác biệt đáng kể trong khả năng kích
thích sinh trưởng L. casei của các loại cao chiết và trong các điều kiện có/không bổ sung
glucose vào môi trường nuôi cấy (p < 0,05). Trong điều kiện nuôi cấy không bổ sung
glucose, khả năng kích thích sinh trưởng L. casei của EAF là lớn nhất, đạt 42,48%, thấp
nhất là CE với giá trị đạt 24,45%, WF có hoạt tính tốt hơn so với BF với giá trị lần lượt
đạt 39,66 và 26,48% tại nồng độ 2 mg/mL. Kết quả này cho thấy, khả năng kích thích
sinh trưởng L. casei của các loại cao chiết phụ thuộc vào thành phần hoạt chất và nồng
độ tác dụng, nồng độ cao có thể gây ức chế ngược.
Trong điều kiện môi trường nuôi cấy bổ sung glucose, hoạt tính kích thích sinh
trưởng L. casei của các loại cao chiết thay đổi đáng kể (p < 0,05). Cụ thể, hoạt tính của
EAF và CE tăng lên trong khi hoạt tính của BF và WF giảm đi. Hoạt tính của EAF tăng
mạnh nhất và đạt cực đại ở nồng độ 1,75 mg/mL (55,25%), trong khi đó hoạt tính của
CE tăng ở mức độ thấp hơn và đạt cực đại ở 2 mg/mL (23,56%). Ngược lại, BF và WF
giảm mạnh khả năng sinh trưởng của L. casei về mức 25,23 và 20,04% tại nồng độ 2
mg/mL. Kết quả này cho thấy, thành phần hoạt tính kích thích lợi khuẩn L. casei là một
nhóm chất nhất định được tách về phân đoạn ethyl acetate trong quá trình trích ly. Báo
cáo phân tích tổng hợp của Plamada et al (2021) cho thấy rằng các polyphenol có thể
đóng vai trò là prebiotic mới nhờ khả năng kích thích sinh trưởng của rất nhiều nhóm
lợi khuẩn trong điều kiện in vitro và in vivo [299]. Do đó, sự tập trung với hàm lượng
cao các hợp chất polyphenol về EAF (Bảng 3.1) có thể đóng vai trò quan trọng trong
việc nâng cao hiệu quả kích thích sinh trưởng lợi khuẩn của cao chiết. Ngoài ra, một
nhóm hoạt chất nhất định có thể có vai trò quan trọng hơn các nhóm khác. Do đó, việc
phân tách hoạt chất, đánh giá mối liên hệ giữa thành phần hoạt chất và hoạt tính là cần
thiết để bổ sung thêm các hiểu biết mới về cơ chế tác động kiểm soát đường huyết và
chống đái tháo đường của cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ.
81
3,31±0,14fB
7,80±0,43efC
11,59±1,39deBC 16,78±1,87dD
24,27±2,81cBC
32,75±2,74bA
43,86±1,08aB
42,48±1,44aB
7,30±0,00eAB
14,97±1,39dAB
15,30±1,21dB
26,22±1,85cB
26,77±1,15cB
28,10±0,90cB
55,25±2,91aA
47,23±2,84bA
10,58±1,30cA
11,47±1,97cBC
12,67±1,45cBC
21,29±3,25bC
22,36±1,03abC
24,83±3,03abB
25,22±4,36abD
26,48±2,23aC
-
-
-
-
-
10,40±1,24bE
11,65±0,20bF
25,23±2,05aC
10,82±0,34eA
16,71±0,88dA
24,49±1,05cA
31,28±1,12bA
32,65±2,80bA
33,50±0,29bA
39,24±1,30aC
39,66±3,68aB
-
-
-
-
-
6,91±0,92bF
16,02±1,79aE
20,04±2,19aD
-
-
-
3,70±0,04dF
10,33±0,37cE
15,60±0,11bD
18,05±0,55bE
22,45±0,76aCD
-
7,89±0,02dC
9,89±0,06dC
11,16±0,22cdE
15,19±1,06cD
19,87±1,00abC
22,01±0,39abDE
23,56±0,32aCD
Ghi chú: Giá trị trung bình ± SEM (n =3). Dấu "-": không ghi nhận hoạt tính; Non-glucose: môi trường MRS không bổ sung glucose; Glucose: Môi trường
MRS bổ sung glucose (0,8 g/L). Các ký tự khác nhau (a-f) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ khác nhau của từng cao chiết (hàng) và các
ký tự khác nhau (A-F) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các loại cao chiết trong điều kiện bổ sung và không bổ sung glucose (cột) theo Fisher’s Least
Significant Difference (LSD) test ( = 0,05).
82
3.1.3. Khả năng kiểm soát đường huyết của cao chiết trên mô hình in vivo
3.1.3.1. Đánh giá độc tính của các loại cao chiết trên mô hình cá ngựa vằn
Tính an toàn của các loại cao chiết được đánh giá nhằm xác định ngưỡng an toàn
khi xử lý trên mô hình làm chậm sự gia tăng đường huyết sau ăn, hạ đường huyết trên
cá ngựa vằn đái tháo đường và khả năng kháng viêm trên ấu trùng. Phương pháp ngâm
ấu trùng cá ngựa vằn 5 ngày tuổi và cá trưởng thành với dung dịch nuôi chứa cao chiết
theo hướng dẫn của OECD 203 nhằm đánh giá độc tính qua các con đường khác nhau
gồm hô hấp, da, mắt. Phương pháp cho ăn cưỡng bức theo hướng dẫn của OECD 423
được sử dụng để đánh giá độc tính cao chiết qua đường uống. Kết quả thể hiện trên
Bảng P2.1, Bảng P2.2 và Bảng P2.3 (Phụ lục P.2.11)
Kết quả ở Bảng P2.1 cho thấy, độ an toàn của các loại cao chiết đối với ấu trùng cá
5 ngày tuổi là khác nhau giữa các loại cao chiết. Trong đó, cao chiết phân đoạn ethyl
acetate là an toàn nhất với giá trị LD50 là 29,69 mg/L dung dịch nuôi, tiếp theo là phân
đoạn n-Butanol (LD50 là 19,69 mg/L). Cao chiết thô và phân đoạn nước có độ an toàn
thấp hơn đối với ấu trùng cá, giá trị LD50 lần lượt là 18,44 và 17,81 mg/L dung dịch
nuôi. Trích ly phân đoạn với n-hexane và chloroform có thể đã tập trung các hợp chất
gây độc về hai phân đoạn nêu trên dù rất ít. Bên cạnh đó, một số hợp chất có khả năng
gây độc như kim loại nặng có thể đã tập trung về phân đoạn nước khiến phân đoạn này
ít an toàn hơn. Kết quả cũng xác định được nồng độ an toàn đối với ấu trùng cá của các
loại cao chiết phân đoạn nước, cao thô, phân đoạn n-butanol và ethyl acetate là 10, 10,
10 và 10 mg/L. Ở các nồng độ an toàn, cá bơi bình thường và không có dấu hiệu bất
thường trong thời gian khảo sát.
Bảng P2.2 mô tả độc tính cấp bằng đường uống của cao chiết thô và các loại cao
chiết phân đoạn. Kết quả cho thấy, tất cả cá thể tham gia thử nghiệm đều sống sót và
không có dấu hiệu bất thường trong suốt thời gian theo dõi ở nồng độ thử nghiệm 2.000
mg/kg. Kết quả thử nghiệm ở nồng độ tối đa cho phép (5.000 mg/kg) cho thấy giá trị
LD50 của các loại cao chiết trong khoảng 2.000 đến 5.000 mg/kg. Khoảng giá trị này
cho thấy cao chiết đều thuộc nhóm độc tính thấp theo phân loại của OECD 423.
Bảng P2.3 cho thấy các loại cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ an toàn với cá ngựa
vằn trưởng thành ở nồng độ 10 mg/L. Kết quả này cùng với kết quả đánh giá tính an
toàn bằng đường uống (Bảng P2.2) cho thấy nồng độ cao chiết 75 mg/kg khối lượng cá
(đối với đường uống) và nồng độ cao chiết 10 mg/L dịch nuôi (ngâm) là an toàn cho các
thử nghiệm tiếp theo.
83
3.1.3.2. Khả năng làm chậm gia tăng đường huyết sau ăn
Tăng đường huyết sau ăn (postprandial hyperglycemia) đặc trưng bởi sự gia tăng
lượng đường trong máu sau bữa ăn. Các bằng chứng khoa học cho thấy, tăng đường
huyết sau ăn đóng vai trò quan trọng trong sự khởi phát và tiến triển của các biến chứng
do đái tháo đường mạn tính [67, 147]. Shiraiwa et al. (2005) báo cáo rằng sự gia tăng
đường huyết sau ăn là chỉ thị tốt hơn so với HbA1c trong đánh giá quá trình biến chứng
võng mạc ở người mắc đái tháo đường [346]. Vì vậy, kiểm soát đường huyết sau ăn
được xem là liệu pháp dự phòng và quản lý có hiệu quả các biến chứng cho bệnh nhân
đái tháo đường tuýp 2 [67, 179]. Gần đây, cá ngựa vằn được mô tả là mô hình nhiều
triển vọng để đánh giá tiềm năng chống đái tháo đường của chiết xuất dược liệu [243,
295, 296, 429]. Theo dõi lượng đường trong máu ở cá ngựa vằn có thể mô tả chính xác
trạng thái cân bằng glucose nội môi [109]. Trong nghiên cứu này, cá ngựa vằn được cho
ăn maltodextrin làm nguồn cung cấp đường bột, các công thức thực nghiệm sử dụng
maltodextrin bổ sung cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ, công thức sử dụng maltodextrin
bổ sung acarbose được sử dụng làm đối chứng dương. Hiệu quả tác dụng làm chậm quá
trình tăng đường huyết sau ăn thể hiện ở sự khác biệt có ý nghĩa về mức đường huyết
sau ăn tại các thời điểm 0, 30, 60, 120, 180 phút sau ăn (p < 0,05).
Kết quả ở Hình 3.1 cho thấy, các loại cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ làm chậm
đáng kể sự gia tăng đường huyết sau ăn trên cá ngựa vằn khoảng 12 đến 37% so với đối
chứng chỉ sử dụng maltodextrin (p < 0,05). Trong đó, đường huyết sau ăn của tất cả các
nhóm thực nghiệm đạt đỉnh cao nhất vào 60 phút sau khi ăn. Tuy nhiên, hiệu quả làm
chậm gia tăng đường huyết sau ăn là khác nhau đáng kể giữa các nhóm có bổ sung cao
chiết khác nhau theo thời gian (p < 0,05). Tác dụng làm chậm gia tăng đường huyết sau
ăn của các loại cao chiết được ghi nhận sau 30 phút cho ăn. Các loại cao chiết BF, CE và
EAF có tác dụng làm chậm đáng kể sự gia tăng đường huyết sau ăn từ 26 đến 33% (mức
đường huyết có giá trị tương ứng là 156,8; 143,6; và 141,6 mg/ L) so với đối chứng chỉ
sử dụng matodextrin (210,8 mg/dL), và tương đương với acarbose (149,8 mg/dL). Trong
khi đó, cao chiết WF có mức giảm không đáng kể (12%) so với đối chứng (p > 0,05).
Tác dụng làm chậm gia tăng đường huyết sau ăn rõ rệt nhất của các loại cao chiết
sau 60 phút cho ăn. Các nghiệm thức bổ sung WF, BF, CE và EAF làm giảm đáng kể
mức đường huyết, từ 29 đến 37 % (giá trị lần lượt là 252,0; 249,2; 248,0; 225,8 mg/dL),
so với đối chứng chỉ sử dụng maltodextrin (p < 0,05). Trong đó, các loại cao chiết BF,
CE và EAF có hoạt tính tương đương với acarbose (223,8 mg/dL) (p > 0,05) và cao
84
nước có hoạt tính thấp hơn acarbose (p > 0,05). Hiệu quả tích cực của các loại cao chiết
được duy trì sau 120 phút, với các mức đường huyết thấp hơn từ 20% (CE) đến 35%
(BF), dao động từ 130,6 đến 159,6 mg/dL, so với đối chứng sử dụng maltodextrin (199,6
mg/dL). Trong đó, hoạt tính của CE (159,6 mg/dL) thấp hơn so với BF, WF và EAF với
mức đường huyết lần lượt là 130,6, 133,8 và 133,8 mg/dL, các giá trị này cùng mức với
acarbose (138 mg/dL) (p > 0,05). Sau 180 phút, các loại cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ
đỏ vẫn thể hiện hoạt tính với mức đường huyết thấp hơn đáng kể, từ 13% (EAF) đến
19% (WF), so với đối chứng chỉ sử dụng maltodextrin (137,2 mg/dL) (p < 0,05).
Ghi chú: MD là nghiệm thức chỉ cho ăn matodextrin làm nguồn cung carbohydrate; Aca là nghiệm thức bổ sung thuốc điều trị, Acarbose; EAF, BF, WF, CE lần lượt là các nghiệm thức bổ sung cao chiết phân đoạn ethyl acetate, n-butanol, nước, và cao chiết thô. Mẫu máu được thu nhận tại các thời điểm 0, 30, 60, 120 và 180 phút sau ăn. Đồ thị mô tả dạng Box & Whichkers (min to max, n = 5). Các ký tự khác nhau (a-c) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm trong cùng một thời điểm theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05). Kết quả nghiên cứu này tương đồng với các nghiên cứu trước đây về tác dụng chống
đái tháo đường của một số cây thuốc thuộc chi Trâm thông qua kiểm soát đường huyết
sau ăn được đề cập trong báo cáo dựa trên phân tích tổng hợp nhiều nghiên cứu của
Zulcafli et al. (2020)[442]. Khathi et al., (2013) báo cáo rằng, khả năng chống gia tăng
đường huyết sau ăn trên mô hình chuột gây đái tháo đường bởi streptozotocin của chiết
xuất từ S. aromaticum liên quan mật thiết đến khả năng ức chế α-amylase và α-
glucosidase [192]. Mối liên hệ này cũng được đề cập bởi Nguyen et al. (2019) cho thấy,
chiết xuất methanol của vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ có khả năng ức chế α-glucosidase và
85
có tác dụng hạ đường huyết sau ăn đáng kể ở chuột [268]. Kết quả trong nghiên cứu này
cho thấy, hoạt tính chống gia tăng đường huyết sau ăn của các loại cao chiết từ vỏ thân
cây Trâm vỏ đỏ có thể có mối liên hệ nhất định với khả năng ức chế các enzyme tiêu
hóa tinh bột đã thảo luận ở mục 3.1.2.3. Sự khác nhau về mức độ chống tăng đường
huyết sau ăn của các loại cao chiết có thể do quá trình trích ly phân đoạn làm thay đổi
nồng độ và thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học. Ngoài ra, các tác động phức
tạp khác trong điều kiện in vivo có thể thay đổi hoạt tính của các thành phần hoạt chất
có trong cao chiết [84, 135]. Do đó, cơ chế tác động cụ thể và thành phần hoạt chất có
hoạt tính sinh học này cần được làm rõ trong các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3.3. Hiệu quả hạ đường huyết trên mô hình cá ngựa vằn đái tháo đường
Tác dụng làm chậm gia tăng đường huyết sau ăn có ý nghĩa đối với bệnh nhân đái
tháo đường được kiểm soát tốt, trong khi đó mức đường huyết lúc đói dần tăng lên khi
bệnh diễn tiến xấu [236]. Do đó, ổn định mức đường huyết lúc đói ở bệnh nhân đái tháo
đường là một mục tiêu điều trị quan trọng [92]. Capiotti et al. (2014) chứng minh rằng
sự gia tăng đường huyết lúc đói cho thấy sự suy giảm trong chuyển hóa glucose ở cá
ngựa vằn [64]. Bên cạnh đó, đường huyết lúc đói được sử dụng như một chỉ thị sinh học
quan trọng cho các mô hình cá ngựa vằn đái tháo đường [430]. Điều này cho thấy đường
huyết lúc đói ở cá ngựa vằn có thể sử dụng hiệu quả nhằm sàng lọc các hoạt chất chống
đái tháo đường tiềm năng. Trong nghiên cứu này, cá ngựa vằn đái tháo đường được xử
lý với các loại cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ và metformin (đối chứng dương).
Hiệu quả hạ đường huyết thể hiện ở sự khác biệt về giá trị trung bình mức đường huyết lúc
đói (fasting blood glucose level) ở các thời điểm 0, 5, 10, 15, và 20 ngày điều trị (p < 0,05).
Kết quả mô tả trên Hình 3.2 cho thấy mức độ tác động khác nhau đáng kể của các
loại cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ và metformin đối với mức đường huyết của cá
đái tháo đường theo thời gian trong 20 ngày điều trị. Các loại cao chiết EAF, WF, CE và
metformin cho hiệu quả giảm mức đường huyết rõ rệt so với đối chứng không điều trị
sau 5 ngày tác động, trong khi BF cho thấy hiệu quả sau 15 ngày. Trong đó, EAF cho
thấy hiệu quả giảm đường huyết nhanh nhất với giá trị 60,20 mg/dL, tương đương cá
bình thường (66,60 mg/dL) và metformin (63,60 mg/dL) sau 5 ngày tác động và duy trì
đến ngày thứ 20 (p > 0,05). BF cho thấy tác dụng chậm nhất với mức đường huyết chỉ
giảm rõ rệt sau 15 ngày, với giá trị 72,20 mg/dL. WF có hiệu quả hạ đường huyết thấp
hơn so với EAF và tốt hơn so với CE và BF sau 5 ngày tác động, tuy nhiên mức đường
huyết duy trì ổn định trong khoảng từ 71,80 mg/dL đến 76,60 mg/dLvà không giảm
86
thêm. CE cho thấy tác động ổn định hơn với mức đường huyết giảm dần đều về tương
đương với cá bình thường sau 20 ngày. Tại thời điểm 20 ngày, kết quả cho thấy EAF,
BF, CE và metformin có mức đường huyết tương đương (p > 0,05), trong khi đó WF có
giá trị cao hơn so với cá bình thường (p < 0,05). Các kết quả trên cho thấy rằng, các loại
cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ đều có tiềm năng ứng dụng như các tác nhân hạ đường
huyết hiệu quả trong điều trị đái tháo đường. Sự khác biệt về hoạt tính theo thời gian tác
động có thể phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau, trong đó, thành phần, hàm lượng hoạt
chất và các tương tác phức tạp của chúng trong cơ thể sống cần đánh giá sâu hơn trên
các mô hình khác và trên lâm sàng.
Ghi chú: NOR, DIA lần lượt là cá ngựa vằn khỏe mạnh và cá ngựa vằn đái tháo đường; MET là nghiệm thức xử lý với thuốc điều trị đái tháo đường, Metformin; EAF, BF, WF, CE lần lượt là nghiệm thức xử lý với các cao chiết phân đoạn ethyl acetate, n-butanol, nước, và cao chiết thô. Giá trị trung bình ± SEM (n = 5). Các ký tự khác nhau (a-c) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm trong cùng một thời điểm và các ký tự khác nhau (A-E) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong cùng một nhóm theo thời gian theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05).
Các kết quả nêu trên cho thấy, cao chiết phân đoạn ethyl acetate có tiềm năng chống
đái tháo đường cao nhất trong các loại cao chiết từ vỏ thân Trâm vỏ đỏ. Các thực nghiệm
tiếp theo được tiến hành nhằm đánh giá hiệu quả tác động của cao chiết phân đoạn ethyl
acetate đối với sự thay đổi hệ vi sinh đường ruột trên cá đái tháo đường và mức độ biểu
hiện của các gene liên quan kiểm soát đường huyết trong đái tháo đường.
87
3.1.4. Tiềm năng chống đái tháo đường đa mục tiêu của cao chiết phân đoạn ethyl
acetate từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
3.1.4.1. Tác động phục hồi hệ vi sinh đường ruột cá ngựa vằn đái tháo đường
Nghiên cứu này đánh giá khả năng điều chỉnh hệ vi sinh đường ruột cá ngựa vằn
trong quá trình tác động chống đái tháo đường của cao chiết phân đoạn ethyl acetat từ
vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ. Hệ vi sinh đường ruột của cá ngựa vằn ở các nhóm được phân
tích ở thời điểm 20 ngày điều trị. Trong đó, nhóm đối chứng âm bao gồm cá bình thường
và cá đái tháo đường, nhóm điều trị với metformin là đối chứng dương. Kết quả mô tả
sự phong phú các loài vi sinh vật đường ruột của cá ngựa vằn ở ba cấp độ ngành (Hình
P2.2), chi (Hình P2.3) và loài (Hình P2.4) (Phụ lục P.2.14).
Các kết quả cung cấp bằng chứng mới về tác động điều hòa hệ vi sinh đường ruột
của cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ. Hình P2.2 cho thấy có sự khác biệt đáng kể
về hệ vi sinh đường ruột giữa cá đái tháo đường và cá khỏe mạnh, đặc trưng bởi sự gia
tăng nhóm vi khuẩn Proteobacteria, phù hợp với kết quả nghiên cứu được báo cáo bởi
Okazaki et al. (2019) [277]. Các nhóm điều trị với metformin và EAF cho thấy sự khác
biệt rõ rệt hệ vi sinh đường ruột. Cụ thể, metformin gia tăng đáng để nhóm
Proteobacteria và Fusobacteria, trong khi EAF làm giảm sự hiện diện của Proteobacteria
và tăng cường nhóm Actinobacteria. Ngoài ra, chi Acinetobacter được tìm thấy trong
nhóm điều trị với metformin, trong khi chi Mycobacterium được ghi nhận trong nhóm
điều trị với EAF (Hình P2.3).
Tác động của metformin và EAF đến sự phong phú của Acinetobacter sp. và
Mycobacterium abscessus được mô tả trong Hình P2.4. Kết quả cho thấy, EAF giúp
làm giảm sự hiện diện của Acinetobacter sp., trong khi metformin có tác động ngược
lại. Ngoài ra, so với nhóm đái tháo đường không được điều trị, EAF cho thấy khả năng
làm giảm sự hiện diện của Mycobacterium abscessus, vi khuẩn gây bệnh cơ hội phổ
biến trong môi trường nuôi cá, và metformin cũng ức chế vi khuẩn này. Đáng chú ý,
nghiên cứu này cho thấy nhóm cá mắc bệnh đái tháo đường có tỷ lệ lưu hành
Mycobacterium abscessus cao hơn cá bình thường, điều này cho thấy đái tháo đường
làm tăng nguy cơ nhiễm khuẩn gây hại và EAF có khả năng giúp ngăn ngừa sự xâm
nhiễm của các vi khuẩn cơ hội và vi khuẩn gây bệnh đối với cá ngựa vằn đái tháo đường.
Kết quả này phù hợp với báo cáo của Rahman et al (2017) cho thấy các chiết xuất từ
cây thuốc có hiệu quả tác động cao trong việc chống lại sự xâm nhiễm của các vi khuẩn
88
gây bệnh cơ hội đối với cá [312]. Ngoài ra, báo cáo phân tích tổng hợp của Plamada et
al (2021) cho thấy rằng các polyphenol, nhóm chất tập trung với nồng độ cao trong EAF
do quá trình trích ly phân đoạn (Bảng 3.1), có thể vừa kích thích sinh trưởng của lợi
khuẩn, đồng thời ức chế hoạt động của hại khuẩn trên các mô hình nghiên cứu in vitro
và in vivo [299].
Biểu đồ dạng cây (minh họa ở phía trên biểu đồ nhiệt) thể hiện tương quan giữa các
mẫu phân tích, cho thấy sự phân bố vi sinh vật của cá đái tháo đường điều trị với EAF
tương đồng với cá ngựa vằn bình thường hơn so với nhóm được điều trị với metformin.
Kết quả này được củng cố ở phân tích về các con đường chuyển hóa liên quan đến hệ vi
sinh đường ruột được mô tả ở Hình P2.5. Cụ thể, nhóm điều trị với EAF cho thấy các
con đường chuyển hóa có độ tương đồng cao so với cá bình thường, trong khi phương
pháp điều trị với metformin làm thay đổi đáng kể các quá trình trao đổi chất. Nghiên
cứu mới nhất của Ezzamouri et al. (2023) cho thấy metformin tác động điều chỉnh mạnh
mẽ hệ vi sinh đường ruột của bệnh nhân đái tháo đường trong quá trình điều trị [115].
Kết quả tương tự được báo cáo bởi Silamiķele et al. (2021) trên mô hình chuột mắc đái
tháo đường tuýp 2 do chế độ ăn giàu chất béo [349]. Mối liên hệ giữa metformin với các
rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột ở người khỏe mạnh được báo cáo bởi Elbere et al.
(2018) [110]. Điều này có thể liên quan đến các rối loạn tiêu hóa, tác dụng phụ thường
thấy của metformin trong quá trình điều trị đái tháo đường. Kết quả này cho thấy cao
chiết phân đoạn ethyl acetate từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ có tác dụng khôi phục hệ vi
sinh vật đường ruột cá ngựa vằn đái tháo đường về trạng thái khỏe mạnh thay vì tạo nên
sự thay đổi đáng kể như metformin. Điều này cũng minh chứng rằng, EAF có thể là tác
nhân phòng trị đái tháo đường hiệu quả với ít tác dụng phụ hơn.
Các nghiên cứu chỉ ra rằng, các chiết xuất từ thực vật giúp điều hòa vệ vi sinh vật
đường ruột một cách tự nhiên [294]. Trong đó, thành phần các hợp chất polyphenol có
tác động chống đái tháo đường thông qua tái lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột [29,
364]. Kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng, thành phần các hợp chất polyphenol được tập
trung cao trong phân đoạn ethyl acetate có hiệu quả trong chống đái tháo đường thông
qua hệ vi sinh vật đường ruột. Do đó, việc phân lập các hợp chất là cần thiết nhằm đánh
giá các con đường tác động cụ thể trong các nghiên cứu tiếp theo.
89
3.1.4.2. Khả năng điều hòa biểu hiện gene liên quan kiểm soát đường huyết trên mô
hình cá ngựa vằn
Điều hòa biểu hiện gene đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh đái tháo
đường bằng cách tác động trực tiếp vào con đường truyền tín hiệu, làm giảm hoạt động
của insulin hay tác động gián tiếp thông qua những thay đổi về trao đổi chất và thể dịch
liên quan đến bệnh [361]. Nghiên cứu này tiến hành đánh giá tác động của cao chiết
phân đoạn ethyl acetate từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ đến biểu hiện các gene liên quan đến
quá trình sinh tổng hợp chất béo, insulin và thụ thể insulin, và các gene liên quan đến
hấp thu và con đường tín hiệu trong chuyển hóa glucose. Biểu hiện của các gene này
được đồng thời đánh giá trên các nhóm điều trị với metformin (đối chứng dương), nhóm
đái tháo đường không được điều trị (đối chứng âm), và nhóm cá bình thường (công thức
đối sánh).
a. Tác động điều hòa biểu hiện gene liên quan sinh tổng hợp chất béo
Các con đường tổng hợp chất béo (lipogenic pathways) đóng vai trò quan trọng
trong sự phát triển tình trạng kháng insulin và các rối loạn chuyển hóa liên quan đến
kháng insulin, bao gồm tăng đường huyết trong đái tháo đường [40, 281, 401]. Nghiên
cứu này tiến hành đánh giá ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn ethyl acetate đến con
đường tổng hợp chất béo thông qua điều hòa biểu hiện gene SREBF1, ACC1 và FASN.
Gene SREBF1 mã hóa cho các yếu tố phiên mã liên kết với protein điều hòa sterol
1 (Sterol regulatory element-binding protein 1) bao gồm SREBP-1a và SREBP-1c, có
chức năng điều hòa tổng hợp acid béo, triglyceride và cholesterol [15]; sự thay đổi mức
độ biểu hiện gene SREBF1 có quan hệ mật thiết đến tình trạng trao đổi chất liên quan
đái tháo đường. Theo báo cáo của Soronen et al. (2012), bệnh nhân đái tháo đường tuýp
2 sẽ dẫn đến suy giảm mức độ biểu hiện gene SREBF1 [358]. Mức độ biểu hiện thấp
của SREBF1 từ mô mỡ và cơ của bệnh nhân đái tháo đường có thể giải thích về vai trò
của hàm lượng SREBP-1c thấp đối với tình trạng kháng insulin [15]. Việc bất hoạt cả
hai đồng phân của SREBF1 trên mô hình động vật béo phì mắc đái tháo đường tuýp 2
dẫn đến những thay đổi đáng kể trong chuyển hóa carbohydrate nhưng không cải thiện
tình trạng kháng insulin [329]. Do đó, điều hòa biểu hiện gene SREBF1 có vai trò quan
trọng trong việc cải thiện tình trạng kháng insulin cũng như các quá trình trao đổi chất
khác có liên quan.
90
Ghi chú: NOR, và DIA lần lượt là nhóm cá bình thường và cá đái tháo đường. MET và EAF lần lượt là nhóm cá đái tháo đường được xử lý với metformin 20 µM và cao chiết phân đoạn ethyl acetate (10 mg/L). SREBF1: Sterol regulatory element-binding protein 1; ACC1: Acetyl- CoA carboxylase alpha; FASN: Fatty acid synthase. Khác biệt thống kê giữa các nhóm thực nghiệm thực hiện theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05). p > 0,05 (ns), p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***), p < 0,0001 (****)
Kết quả ở Hình 3.3 cho thấy mức độ biểu hiện gene SREBF1 ở nhóm cá đái tháo
đường không điều trị giảm đáng kể so với nhóm đối chứng khỏe mạnh, thể hiện sự nhất
quán đối với các nghiên cứu đã phân tích ở trên. Đáng chú ý, các nhóm điều trị với
metformin (MET) và cao chiết phân đoạn ethyl acetate (EAF) đều cải thiện đáng kể mức
độ biểu hiện gene SREBF1 so với nhóm đối chứng không điều trị và cá khỏe mạnh (p <
0,05). Trong đó, nhóm điều trị với metformin có sự gia tăng mạnh nhất về mức độ biểu
hiện SREBF1 so với đối chứng (11,6 lần), trong khi đó EAF có mức độ điều chỉnh ổn
định hơn, ở mức 3,3 lần. Hiện tại, chưa có các công bố mô tả mối liên hệ trực tiếp của
metformin cũng như các chiết xuất giàu polyphenol từ thực vật đến biểu hiện gene
SREBF1. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu này cho thấy tác động cải thiện tình trạng đái
tháo đường thông qua điều hòa biểu hiện gene SREBF1 của cao chiết giàu polyphenol
từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ.
Gene ACC1 mã hóa cho acetyl-CoA carboxylase 1, enzyme chứa biotin xúc tác cho
quá trình chuyển acetyl-CoA thành malonyl-CoA, bước giới hạn tốc độ kết hợp quá trình
chuyển hóa anaplerotic glucose với quá trình tân tạo chất béo (de novo lipogenesis)
[382]. ACC1 giữ vai trò quan trọng trong điều hòa xuất tiết glucagon, và một số bằng
chứng khoa học cho thấy có mối liên quan giữa mức độ biểu hiện gene ACC1 và đái
91
tháo đường [382]. Kirchner et al. (2016) báo cáo rằng mức độ biểu hiện mRNA của
ACC1 tăng lên ở cả bệnh nhân béo phì không mắc hoặc mắc đái tháo đường tuýp 2
[174]. Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện gene ACC1 ở cá ngựa vằn đái tháo đường
tăng gấp 3,39 lần so với nhóm khỏe mạnh (p < 0,05, Hình 3.3). Trong khi đó, nhóm xử
lý bằng EAF và metformin đều làm giảm kể đến mức độ biểu hiện gene ACC1. Cụ thể,
mức độ biểu hiện gene ở nhóm đái tháo đường được điều trị với EAF và metformin
giảm xuống lần lượt ở mức 17% và 22% so với nhóm khỏe mạnh, và không có khác biệt
đáng kể giữa hai nhóm (p < 0,05). Kết quả ngày tương đồng với báo cáo trước đây cho
thấy metformin ngăn chặn biểu hiện gene ACC1, giúp giảm sự tích tụ chất béo và quá
trình viêm trong tế bào người [412]. Bên cạnh đó, các tài liệu khoa học cho thấy khả
năng làm giảm biểu hiện gene ACC1 của các chiết xuất từ cây thuốc. Báo cáo của Kim
et al. (2009) rằng chiết xuất từ lá tía tô có thể làm giảm biểu hiện gene ACC1, từ đó làm
giảm khối lượng cơ thể và cải thiện các chỉ số mỡ máu trên mô hình động vật [171]. Parl
et al. (2015) cũng báo cáo rằng raspberry ketone, một phenolic tự nhiên, ức chế biểu
hiện các gene liên quan đến quá trình trao đổi chất béo, bao gồm gene ACC1, trên mô
hình tế bào mỡ 3T3-L1 [289]. Do đó, kết quả này cho thấy tác động của metformin trên
mô hình cá ngựa vằn có thể có cơ chế tương tự trên tế bào người, đồng thời EAF có thể
tác động đến biểu hiện gene ACC1 tương tự như metformin và các chiết xuất từ thực vật
khác đã được báo cáo.
Fatty acid synthase (FASN) là enzyme trung tâm của quá trình tân tạo mỡ, xúc tác
cho quá trình chuyển malonyl-CoA thành palmitate. Mức độ biểu hiện gene FASN có
liên hệ chặt chẽ với béo phì và đái tháo đường tuýp 2 [43]. Nghiên cứu cho thấy, biểu
hiện gen FASN có mối liên hệ phức tạp với nhiều chỉ thị sinh học của béo phì và đái tháo
đường, và có thể đóng vai trò quan trọng phản ảnh mức độ của tình trạng kháng insulin
[225, 230]. Kết quả ở Hình 3.3 cho thấy mức độ biểu hiện gene FASN ở cá ngựa vằn đái
tháo đường thấp hơn đáng kể so với cá bình thường (p < 0,05). Sự suy giảm này có thể
liên quan đến sự giảm biểu hiện gene SREBF1, gene mã hóa cho yếu tố phiên mã tác
động đến sự biểu hiện gene của các quá trình chuyển hóa chất béo bao gồm FASN [253,
278]. Nogalska et al. (2015) báo báo rằng leptin, hormone sinh ra từ mô mỡ, có thể ức
chế biểu hiện gen SREBF1 và các gene mục tiêu điều hòa của nó bao gồm FASN trong
mô mỡ của chuột [253]. Tác động tương tự của các gốc oxy nguyên tử hoạt động từ mô
mỡ (fat reative oxygen species, fROS) đến biểu hiện gene SREBF1 và FASN cũng được
báo cáo bởi Okuno et al. (2018) [278]. Mayas et al. (2010) báo cáo rằng mức độ biểu
92
hiện gene FASN có thể thay đổi, phản ánh mức độ kháng insulin của người mắc đái tháo
đường [225]. Do đó, sự suy giảm mức độ biểu hiện gene của SREBF1 và FASN ở cá
ngựa vằn đái tháo đường có thể phản ánh các rối loạn chuyển hóa phức tạp liên quan
đến tình trạng kháng insulin. Kết quả trên Hình 3.3 cho thấy, cá đái tháo đường xử lý
bằng cao chiết phân đoạn ethyl acetate (EAF) và metformin làm tăng biểu hiện gene
FASN 8,4 và 16,6 lần so với đối chứng âm (cá đái tháo đường không xử lý); 1,7 và 3,3
lần so với cá bình thường. Nghiên cứu này phù hợp với báo cáo của Chen et al. (2018)
cho thấy mức độ biểu hiện gene FASN trên tế bào mô mỡ 3T3-L11 phụ thuộc vào sự
thay đổi nồng độ metformin. Cụ thể, ở nồng độ metformin thấp (1,25 đến 2,5 mM) tăng
mức độ biểu hiện, trong khi đó, ở nồng độ metformin cao (5 và 10 mM) ức chế biểu
hiện gene FASN [82]. Kết quả này cho thấy rằng EAF có khả năng chống đái tháo đường
hiệu quả thông qua cải thiện mức độ biểu hiện gene FASN tương tự cơ chế của metformin.
b. Tác động biểu hiện gene insulin và thụ thể insulin
Insulin (INS) và thụ thể insulin (INSR) đóng vai trò quyết định đến khả năng dung
nạp và chuyển hóa glucose trong tế bào. Sự kết hợp giữa insulin và thụ thể insulin là
khởi động cho chuỗi tín hiệu phân tử giúp mở cổng tế bào để dung nạp glucose. Sự thiếu
hụt insulin hoặc suy giảm khả năng đáp ứng của tế bào với insulin (kháng insulin) là cơ
Ghi chú: NOR, và DIA lần lượt là nhóm cá bình thường và cá đái tháo đường. MET và EAF lần lượt là nhóm cá đái tháo đường được xử lý với metformin 20 µM và cao chiết phân đoạn ethyl acetate (10 mg/L). INS: insulin; INSRA1: insulin receptors-coding genes a1; INSRB1: insulin receptors-coding genes b1. Khác biệt thống kê giữa các nhóm thực nghiệm thực hiện theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05). p > 0,05 (ns), p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***), p < 0,0001 (****)
93
chế bệnh sinh cơ bản của đái tháo đường [193, 297, 325]. Nghiên cứu này tiến hành
đánh giá tác động của cao chiết phân đoạn ethyl acetate lên biểu hiện gene mã hóa
insulin (INS) và gene mã hóa các thụ thể insulin bao gồm INSRA1 và INSRB1 trên mô
hình cá ngựa vằn.
Hình 3.4 cho thấy mức độ biểu hiện khác nhau của gene INS và nhóm gene thụ thể
(INSRA1 và INSRB1) trên nhóm cá ngựa vằn đái tháo đường. Trong đó, mức độ biểu
hiện gene INS và INSRA1 tăng lên đáng kể, lần lượt gấp 12,03 và 1,82 lần so với đối
chứng cá khỏe mạnh (p < 0,01), trong khi biểu hiện gene INSRB1 giảm đáng kể, mức
độ biểu hiện tương đương 60% so với đối chứng khỏe mạnh (p < 0,05). Biểu hiện gene
INS tương đồng với báo cáo của Zang et al. (2017) cho thấy sự gia tăng trong biểu hiện
insulin ở cá ngựa vằn gây đái tháo đường bằng phương pháp cho ăn thừa (overfeeding)
[430]. Kết quả tương tự cũng được báo cáo bởi Meng et al. (2017) rằng sự gia tăng biểu
hiện gene INS trên cá ngựa vằn đái tháo đường gây nên các rối loạn trong chuyển hóa
glycolipid [231]. Trong khi đó, biểu hiện gene INSRB1 phù hợp với báo cáo của Santos
et al. (2020) ghi nhận sự suy giảm biểu hiện gene INSRB1 ở cá ngựa vằn đường huyết
cao do tiếp xúc với glucose. Sự khác biệt trong biểu hiện gen INSRA1 và INSRB1 có thể
giải thích theo báo cáo của Gong et al. (2018) rằng hai thụ thể này giữ vai trò khác nhau
trong việc duy trì cân bằng nồng độ glucose nội môi của cá ngựa vằn [137]. Bên cạnh
đó, tỷ lệ cao INSRA/INSRB liên quan mật thiết đến tình trạng kháng insulin ở bệnh
nhân đái tháo đường tuýp 2 theo báo cáo của Malakar et al. (2016) [221]. Các kết quả
trên cùng với mức đường huyết cao ở cá ngựa vằn (Hình 3.2) cho thấy có sự rối loạn
nhất định trong hệ thống tín hiệu insulin, liên quan đến tình trạng kháng insulin, đặc
trưng bởi mức insulin lưu hành cao nhưng tế bào không dung nạp được glucose dẫn đến
sự gia tăng đường huyết.
Kết quả mô tả trên Hình 3.4 cho thấy tác động khác biệt giữa EAF và metformin
trong điều hòa biểu hiện gene mã hóa insulin và các thụ thể của chúng. Cụ thể,
metformin gia tăng mạnh mức độ biểu hiện gene INS, giảm biểu hiện gene INSRA1 về
mức tương đương với cá bình thường (p > 0,05), và gia tăng mạnh biểu hiện gene
INSRB1. Trong khi đó, EAF làm giảm đáng kể biểu hiện gene INS và INSRA1, và tăng
biểu hiện gene INSRB1 ở mức độ thấp hơn so với metformin (p < 0,01). Việc duy trì
biểu hiện gene INS và INSRA1 ở mức thấp, nâng cao biểu hiện INSRB1 ở mức độ thấp
hơn so với metformin, cùng với mức đường huyết ổn định (Hình 3.2), cho thấy EAF có
thể đã cải thiện tình trạng kháng insulin ở cá đái tháo đường.
94
c. Tác động biểu hiện gene liên quan hấp thu và chuyển hóa glucose
Sự hấp thu và chuyển hóa glucose giữ vai trò quan trọng trong duy trì mức đường
huyết ổn định và cung cấp năng lượng cho cơ thể/tế bào. Quá trình hấp thu glucose qua
thành ruột cùng với việc điều tiết tiến trình dung nạp thực phẩm (cảm giác thèm ăn) và
tiêu hóa thức ăn giúp kiểm soát trình trạng tăng đường huyết sau ăn [138]. Kết quả mô
tả trên Hình 3.5 cho thấy cao chiết phân đoạn ethyl acetate từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
có thể tác động lên biểu hiện gene các gene liên quan đến quá trình hấp thu glucose qua
thành ruột (SGLT1) và các con đường tín hiệu trong chuyển hóa glucose (GLP-1).
Ghi chú: NOR, và DIA lần lượt là nhóm cá bình thường và cá đái tháo đường. MET và EAF lần lượt là nhóm cá đái tháo đường được xử lý với metformin 20 µM và cao chiết phân đoạn ethyl acetate (10 mg/L). SGLT1: the sodium-dependent glucose co-transporter; GLP-1: glucagon-like peptide 1. Khác biệt thống kê giữa các nhóm thực nghiệm thực hiện theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05). p > 0,05 (ns), p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***), p < 0,0001 (****)
Chất mang đồng vận chuyển natri-glucose (Sodium–glucose cotransporters), được
mã hóa bởi gene SGLT1, còn được gọi là SLC5A1, là một trong hai chất trung gian vận
chuyển glucose biểu mô. SGLT1 chủ yếu được tìm thấy ở tế bào biểu mô ruột, giúp hấp
thu glucose từ thức ăn [224, 321]. Sự gia tăng biểu hiện gene SGLT1 đường ruột được
ghi nhận ở nhiều mô hình bệnh đái tháo đường khác nhau như chuột nhắt và chuột cống
mắc đái tháo đường do STZ (STZ-induced diabetes), cũng như ở người mắc đái tháo
đường [199, 234, 356]. Do đó, SGLT1 là mục tiêu trong điều trị đái tháo đường nhờ tăng
cường cân bằng glucose nội môi thông qua giảm hấp thu glucose từ thức ăn qua thành
ruột [356]. Một số chất ức chế SGLT1, như Sotagliflozin và Dapagliflozin, đã được phát
95
triển thành thuốc điều trị đái tháo đường [252, 321]. Tuy nhiên, rất nhiều tác dụng phụ
khác nhau đã được ghi nhận bao gồm tiêu chảy, nguy cơ hạ đường huyết và nhiễm toang
ketone (ketoacidosis, DKA) [66]. Do đó, yêu cầu về các tác nhân kiểm soát SGLT1 hiệu
quả và an toàn hơn là cấp thiết. Kết quả trên Hình 3.5 cho thấy biểu hiện gen SGLT1 ở
nhóm cá đái tháo đường không điều trị tăng gấp 1,83 lần so với cá bình thường. Trong
khi đó, nhóm cá đái tháo đường được điều trị bằng metformin tăng mức độ biểu hiện
gene SGLT1 lên 3,76 lần, ngược lại nhóm cá điều trị với cao chiết phân đoạn ethyl
acetate (EAF) làm giảm biểu hiện gene SGLT1 và duy trì ở mức 32% so với nhóm cá
bình thường. Lenzen S. et al. (1996) báo cáo rằng điều trị bằng metformin (liều 125
mg/kg khối lượng cơ thể, hai lần mỗi ngày trong ba ngày) làm gia tăng đáng kể biểu
hiện gene SGLT1 đường ruột của chuột [200]. Kết quả trong nghiên cứu này phù hợp
với báo cáo của Horakowa et al. (2019) cho rằng metformin giúp giảm lượng glucose
vào máu bằng cách tăng hấp thu và tích lũy glucose vào tế bào biểu mô ruột [151].
Nghiên cứu này cho thấy EAF có thể kiểm soát lượng glucose xâm nhập vào máu bằng
cách trực tiếp ức chế biểu hiện gene SGLT1 thay vì cơ chế tác động của metformin. Kết
quả này có thể minh chứng rằng EAF có thể là nguồn cung cấp các chất ức chế SGLT1
mới. Do đó, nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kiểm soát hấp thu glucose thông qua ức chế
protein SGLT1 hay kiểm soát biểu hiện gene SGLT1, có thể cung cấp thông tin về cơ chế
chống đái tháo đường của Trâm vỏ đỏ.
Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) giữ vai trò quan trọng trong kiểm soát quá trình
xuất tiết insulin phụ thuộc glucose (the glucose-dependent stimulation of insulin
secretion) [242]. Sự suy giảm xuất tiết GLP-1 ở người bệnh đái tháo đường có thể góp
phần vào sự gia tăng đường huyết [208]. Việc kích thích tăng mức độ biển hiện gene
GLP-1 trong điều trị đái tháo đường đã chứng minh được hiệu quả thông qua việc tăng
tiết insulin và giảm đường huyết [275]. Kết quả mô tả trên Hình 3.5 cho thấy biểu hiện
gene GLP-1 ở cá ngựa vằn mắc đái tháo đường giảm đáng kể (p < 0,05), duy trì ở mức
32% so với cá bình thường. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy
sự gia tăng đường huyết mạn tính là giảm biểu hiện GLP-1, góp phần làm suy giảm tác
dụng của incretin [413]. Trong các nhóm cá được điều trị bằng metformin và cao chiết
ethyl acetate, sự biểu hiện gene GLP-1 gia tăng đáng kể. Trong đó, metformin và ethyl
acetate thể hiện khả năng kích thích tăng mức biểu hiện gene lên 3,85 và 1,66 lần so với
cá bình thường (p < 0,001, Hình 3.5). Kết quả này phù hợp với các báo cáo trước đây
về cơ chế tác dụng chống đái tháo đường của metformin thông qua tác động trực tiếp
96
lên khả năng xuất tiết GLP-1 trong tế bào L ở người [36] và gia tăng biểu hiện gene
GLP-1 ở hồi tràng và ruột kết của chuột [235]. Tuy nhiên, khi những bệnh nhân sử dụng
metformin lâu dài có biểu hiện tác dụng phụ như tiêu chảy và sụt cân được ghi nhận
[362]. Mizoguchi et al. (2023) cũng báo cáo rằng sự gia tăng biểu hiện gene GLP-1 được
điều hòa bởi metformin có thể góp phần gây ra các triệu chứng tiêu chảy ở chuột, tương
tự trường hợp ăn quá nhiều (overeating) [235]. Do đó, hoạt tính điều hòa tăng biểu hiện
gene GLP-1 ở mức độ thấp hơn metformin của EAF cho thấy cao chiết vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ có thể ứng dụng trong điều trị đái tháo đường với tác dụng phụ thấp hơn. Hơn
nữa, Wang et al. (2021) báo cáo rằng một số polyphenol từ cây thuốc thể hiện vai trò
nổi bật trong kiểm soát đái tháo đường tuýp 2 thông qua hệ thống tín hiệu GLP-1. Trong
đó, polyphenol có thể điều tiết sự bài tiết GLP-1 thông qua các thụ thể kết hợp G-protein
(GPCR) hoặc con đường tín hiệu cAMP, ngăn chặn hoạt động của dipeptidyl peptidase
IV (DPP-IV), hoặc điều chỉnh hệ vi sinh đường ruột [395]. Tuy nhiên, vai trò của các
chiết xuất giàu polyphenol hoặc các hoạt chất từ các cây thuốc thuộc chi Trâm trong
kiểm soát đái tháo đường thông qua các con đường nêu trên còn hạn chế [442]. Do đó,
những phát hiện của nghiên cứu này cung cấp các bằng chứng khoa học ban đầu cho
các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế chống đái tháo đường của Trâm vỏ đỏ trong tương lai.
3.2. Phân lập các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ vỏ thân cây Trâm vỏ
đỏ
3.2.1. Các hợp chất có tiềm năng kiểm soát đường huyết
3.2.1.1. Đặc điểm cấu trúc các hợp chất cô lập được
Cấu trúc hợp chất SBE1
Ellagic acid (EA), màu vàng sáng, 1H-
NMR (600 MHz, DMSO): δ 7.46 (2H, s, H-
13, H-14), 10.58 (2H, s, OH-19, OH-20),
10.795 (2H, s, OH-21, OH-22). 13C-NMR
(150 MHz, DMSO): δ 107.7 (C-9, C-4);
110.3 (C-8, C-3); 112.3 (C-13, C-14); 136.4
(C-10, C-5); 139.6 (C-11, C-16); 148.1 (C-12,
C-15); 159.2 (C-2, C-7). High-resolution
electrospray ionisation mass spectrometry
(HR-ESI-MS) (negative mode) m/z 300.9984 [M - H]-
97
Ellagic acid là polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa mạnh được tìm thấy ở nhiều
loại rau quả, có nhiều lợi ích chống lại các bệnh lý mạn tính [95]. Các nghiên cứu cho
thấy ellagic acid có khả năng chống đái tháo đường và các biến chứng thông qua nhiều
cơ chế tác động khác nhau gồm cải thiện độ nhạy insulin, ức chế sự hình thành AGEs,
chống stress oxy hóa và kháng viêm [22, 129, 222]. Theo các thử nghiệm lâm sàng được
công bố gần đây, ellagic acid có hiệu quả cải thiện trao đổi chất tổng thể [130] và các
chỉ thị sinh học liên quan ở bệnh nhân đái tháo đường [184]. Báo cáo phân tích tổng hợp
của Naraki et al. (2023) cho thấy, ellagic acid có khả năng điều hòa đường huyết lúc đói,
tăng tiết insulin và biểu hiện gene IRS1 (insulin receptor substrate protein 1), điều hòa
biểu hiện gene GLUT4 (glucose transporter 4), ức chế sự tích tụ lipid và tình trạng viêm
trong mô mỡ thông qua kiểm soát các tín hiệu adiponectin [246].
Cấu trúc hợp chất SBE2
Hợp chất SBE2 thu được dưới dạng tinh
thể hình kim màu trắng ngà, nhiệt độ nóng
chảy 240-242 °C (MeOH). SBE2 cho phản
ứng dương tính với thuốc thử FeCl3/EtOH,
chứng tỏ đây là một dẫn xuất phenol.
Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu các
proton của vòng benzen 3 lần thế tại [H 6.71
(1H, d, 1.5 Hz); 6.68 (1H, d, 8.5 Hz); 6.58 (1H, dd, 1.5 Hz và 8.5 Hz)] và vòng benzen
4 lần thế tại [H 5.88 (1H, d, 2 Hz) và 5.68 (1H, d, 2 Hz)], hai proton oxymethin tại H
4.48 (1H, d, 7.8 Hz); 3.83 (1H, m giống t) gắn vào carbon mang oxy, nhóm methylene
[H 2.36 (1H, dd, 3.5 và 17.5 Hz) và 2.63 (1H, dd, 4.5 và 17.5 Hz)].
Phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT cho thấy SBE2 có 15 carbon gồm 1 carbon
methylen sp3 tại C 27.8; 5 carbon sp2 bậc ba mang oxy [C 144.8; 144.8; 155.3; 156.1;
156.4]; 5 carbon sp2 bậc ba [C 93.8; 95.1; 114.5; 115.0; 118.4]; 2 carbon sp2 bậc bốn
[C 99.0 và 130.5] và 2 carbon bão hòa bậc ba mang oxy [C 81.0 và 66.3].
Dữ liệu phổ NMR xác nhận SBE2 là một flavanol. Phổ HMBC cho thấy proton H-2
H 4.48 và 2 proton của nhóm methylen tại [H 2.36 (1H, dd, 3.5 và 17.5 Hz) và 2.63 (1H,
dd, 4.5 và 17.5 Hz)] tương quan với carbon sp2 bậc ba mang oxy C 155.3 hẳn là C9 và 2
proton methylen là H2-4. Proton H-4 còn tương quan HMBC với C-10 tại C 99.0.
98
Vòng A của khung flavan là một vòng benzen 4 lần thế tại vị trí 1,2,3,5 ; tín hiệu
proton H 5.88 (1H, d, 2 Hz) cho tương quan HMBC với C-9, C-10 hẳn phải là H-8;
proton tại H 5.68 (1H, d, 2 Hz) ghép meta với H-8 phải là H-6. Kết hợp với phổ HSQC,
carbon C 93.8 là C-6, carbon C 95.1 là C-8. Ngoài ra proton H-8, H-6 cùng cho tương
quan với carbon mang oxy C 156.1 xác nhận đây là C-7. Tín hiệu C 156.4 chỉ tương
quan với H-6 khẳng định đây là C-5.
Trên phổ HMBC, proton H-2 tương quan với carbon sp2 bậc bốn C 130.5 hẳn là C-
1’. Hai proton H [6.71 (1H, d, 1.5 Hz); 6.59 (1H, dd, 1.5 Hz và 8.5 Hz)] cùng tương
quan với C-1’ và C-2 nên lần lượt là H-2’ và H-6’. Proton tại H 6.68 (1H, d, 8.5 Hz)
ghép ortho với H-6’ phải là H-5’. Ngoài ra, các proton H-6’, H-5’ và H-2’ cùng tương
quan với carbon C 144.4 hẳn phải là C-4’, tương quan giữa H-5’, H-2’ với carbon C
144.8 ắt hẳn là C-3’.
Phân tích kỹ tín hiệu của hai proton metylen gắn vào C-4 có dạng mũi đôi [H 2.36
(1H, dd, 3.5 và 17.5 Hz) và 2.63 (1H, dd, 4.5 và 17.5 Hz)] và proton H-3 H 3.83 (1H,
m giống t). Hằng số ghép spin của H-4 cao 17.5 Hz khẳng định H-3 nằm ở vị trí xích
đạo. Do vậy, carbon C-3 có cấu hình R.
dd, 3.5 và 17.5 Hz; H-4a) và 2.63 (1H, dd, 4.50 và 17.50 Hz, H-4b); 5.88 (1H, d, 2 Hz,
H-8); 5.68 (1H, d, 2 Hz, H-6); 6.71 (1H, d, 1.5 Hz, H-2’); 6.68 (1H, d, 8.5 Hz, H-5’);
6.59 (1H, dd, 1.5 Hz và 8.5 Hz, H-6’).
(C7); 95.1 (C8); 155.3 (C9); 99.0 (C10); 130.5 (C1’); 114.5 (C2’); 144.4 (C3’); 144.4
(C4’); 115.0 (C5’); 118.4 (C6’).
Từ các nhận định phổ nghiệm nêu trên và kết hợp với tài liệu tham khảo, hợp chất
SBE2 được nhận danh là (-)-epicatechin. Epicatechin là một flanonoid được tìm thấy
trong trà xanh với hoạt tính chống oxy hóa cao và có tác dụng tích cực trong kiểm soát
nhiều loại bệnh khác nhau, bao gồm đái tháo đường [7]. Các nghiên cứu cho thấy,
epicatechin giúp cải thiện chức năng đảo tụy và tình trạng kháng insulin [72].
Epicatechin giúp duy trì cân bằng glucose nội môi và độ nhạy insulin thông qua khả
năng chống stress oxy hóa [73]. Ngoài ra, epicatechin có khả năng kết hợp với các
polyphenol khác như catechin và rutin, ngăn ngừa gia tăng đường huyết và nguy cơ hạ
đường huyết trên chuột đái tháo đường [227]. Thử nghiệm lâm sàng được báo cáo bởi
99
Esser et al. (2018) cho thấy, epicatechin điều hòa giảm biểu hiện gene liên quan quá
trình viêm, con đường tín hiệu PPAR và quá trình tạo mỡ [114]. Dù không đề cập trực
tiếp đến đái tháo đường, nghiên cứu này cho thấy vai trò của epicatechin trong cải thiện
trao đổi chất tổng thể, bao gồm các con đường chuyển hóa có liên quan đái tháo đường.
Đáng chú ý, nghiên cứu gần đây còn cho thấy rằng epicatechin có thể giúp cải thiện
thiện đái tháo đường tuýp 2 thông qua tái cấu trúc hệ vi sinh đường ruột cũng như các
con đường tín hiệu liên quan trục gan-ruột (Gut-Liver axis) trên mô hình chuột GK [433]
Cấu trúc hợp chất SBE3
1H-NMR (600 MHz, DMSO) thể hiện các tín hiệu
Hợp chất SBE3 là chất bột màu trắng. Phổ
bao gồm: δ 7.05 (2H, s, H-2, H-6); 4.27 (2H, q, J
= 24, CH2); 1.34 (3H, t, J = 12, CH3). Phổ HR-
ESI-MS (negative mode) xác định giá trị m/z
197.0450 [M–H]-. Căn cứ theo kết quả phổ NMR
và HR-ESI-MS xác định hợp chất SBE3 là Ethyl gallate (Hình 3.8)
Ethyl gallate là một ethyl ester của gallic acid, thường được bổ sung vào thực phẩm
với vai trò là chất chống oxy hóa. Tác dụng chống đái tháo đường và béo phì của ethyl
gallate được mô tả bởi Ahn et al. (2022), trong đó ethyl gallate tăng hấp thu glucose và
giảm tích trữ chất béo ở tế bào 3T3-L1 bằng tác động đồng thời lên con đường tín hiệu
PTPN6, AMPK và PPARγ thông hòa điều hòa biểu hiện các gene liên quan [16].
Cấu trúc hợp chất SBE4
vàng, cho phản ứng dương tính với thuốc thử
FeCl3/EtOH, chứng tỏ đây là một dẫn xuất
phenol.
Phổ 13C-NMR của SBE4 có tín hiệu của
15 carbon, bao gồm carbonyl có độ dịch
chuyển hóa học ở δC 177,34; 5 nhóm methine
Hợp chất SBE4 thu được ở dạng bột màu
δC 99.3; 94.4; 116.0; 116.3 và 121.1 ppm cùng 9 carbon bậc 4. Dữ liệu phổ MS và 13C-
NMR cho thấy đây là hợp chất flavonoid.
Phổ 1H-NMR của hợp chất SBE4 cho thấy tín hiệu doublet của 2 proton ghép cặp
meta của proton vòng thơm tại δH 6.20 (1H; d; 2.0Hz) và 6.91 (1H; d; 2.0Hz) tương ứng
100
với C-6 và C-8 của vòng A. Ngoài ra còn xuất hiện doublet của proton thơm vòng B ở
δH 7.75 (1H; d; 2.0Hz); 6,91 (1H; d; 8.5 Hz) và δH 7.65 (1H; dd; 8.5; 2.5 Hz). Các dữ
liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất SBE4 tương tự như dữ liệu phổ NMR của
hợp chất quercetin [435]. Các vị trí proton và carbon của SBE4 đã được xác định dựa
trên cơ sở tương tác trên phổ HSQC và HMBC được đưa lên Hình 3.9. Các mối tương
quan chính trên phổ HMBC của hợp chất đã xác định nhận các vị trí của 5 nhóm
hydroxyl ở các vị trí 5, 7, 3, 3’, 4’ (Hình 3.9).
Trên cơ sở dữ liệu phổ 1D và 2D NMR, so sánh với dữ liệu phổ tham khảo được
công bố bởi Zhang et al. (2014) [435], SBE4 được nhận danh là quercetin. Quercetin là
hợp chất polyphenol thuộc nhóm flavonol được tìm thấy ở nhiều loài thực vật khác nhau.
Khả năng chống oxy hóa mạnh giúp quercetin có thể cải thiện nhiều bệnh lý phức tạp
liên quan đến stress oxy hóa, bao gồm đái tháo đường [23, 155]. Quercetin kích thích tế
bào tăng hấp thu glucose, điều hòa các tín hiệu quan trọng trong con đường chuyển hóa
glucose, cải thiện tình trạng kháng insulin và có hiệu quả chống lại các biến chứng của
đái tháo đường. Nghiên cứu cho thấy, quercetin điều hòa biểu hiện gene liên quan hấp
thu glucose (Glucose transporter-1,2,3,4) và tín hiệu insulin thông qua con đường
IRS1/PI3K/AKT, kháng viêm bằng cách kích hoạt eNOS ( Endothelial Nitric Oxide
Synthase) qua con đường AMPK/PI3K/AKT, chống quá trình glycate hóa qua con đường
TGFβ2/PI3K/AKT, do đó được xem là tác nhân kiểm soát đường huyết và chống đái
tháo đường đa mục tiêu [97, 131].
Cấu trúc hợp chất SBE5
Hợp chất SBE5 phân lập được dưới
dạng tinh thể hình kim màu vàng, nhiệt độ
nóng chảy 181-182 °C (MeOH). Hợp chất
này cho phản ứng dương tính với thuốc thử
FeCl3/EtOH, chứng tỏ đây là một dẫn xuất
phenol.
Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 1 vòng
benzen 4 lần thế tại [H 6.38 (1H, d, 1.8 Hz);
6.20 (1H, d, 1.8 Hz)]; 1 vòng benzen 3 lần thế tại [H 6.85 (1H, d, 8.4 Hz); 7.24 (1H, dd, 2
Hz và 8.4 Hz,) và 7.29 (1H, d, 2 Hz), một proton kiềm nối H 12.64 (1H, s); cùng các tín
hiệu proton của một phân tử đường với tín hiệu anomer đặc trưng tại H 5.25 (1H, s).
101
Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất có 21 carbon gồm 6 carbon của một phân tử đường
rhamnose và 15 carbon olefin thuộc 1 khung flavonoid. Kết hợp với kỹ thuật DEPT,
những tín hiệu carbon trên được phân loại thành 7 carbon sp2 bậc ba mang oxy [C 164.1;
161.3; 157.3; 156.4; 145.2; 148.4; 134.2]; 5 carbon olefin bậc ba [C 98.6; 93.6; 115.4;
121.1; 115.6]; 2 carbon sp2 bậc bốn [C 104.0; 120.7] và carbon carbonyl C 177.7.
Dữ kiện phổ NMR khẳng định hợp chất trên là một flavonol mang 1 phân tử đường.
Các tín hiệu proton anomer dưới dạng mũi đơn tại H 5.25 (1H, s) và tín hiệu nhóm
methyl ở trường cao tại H 0.80 (3H.,d, 6.6 Hz) trên phổ 1H NMR khẳng định phân tử
đường là rhamnose với cấu hình α. Phổ 1H NMR xuất hiện tín hiệu của một nhóm
hydroxyl kiềm nối chứng tỏ nhóm hydroxy phải gắn vào C-5. Trên phổ HMBC, tương
quan giữa proton kiềm nối với 1 carbon sp2 bậc ba C 98.6; 1 carbon sp2 bậc ba mang
oxy C 161.3; 1 carbon sp2 bậc bốn C 104.0, do đó ba carbon trên lần lượt là C-6; C-5
và C-10. Kết hợp với HSQC, proton H-6 có độ dịch chuyển hóa học H 6.20 (1H, d, 2
Hz). Proton ghép meta với proton H-6 phải là H-8 tại H 6.38 (1H, d, 2 Hz). Phổ HMBC
cũng cho thấy proton H-6 và H-8 cùng tương quan với C-10 và một carbon mang oxy
C 164.1 hẳn phải là C-7. Ngoài ra, proton H-8 còn cho tương quan HMBC với carbon
mang oxy C 156.4, điều này khẳng định tín hiệu tại C 156.4 là C-9.
Trên phổ HMBC, ba proton H 6.85 (1H, d, 8.4 Hz); H 7.29 (1H, d, 2 Hz) và H
7.24 (1H, dd, 2 Hz và 8.4 Hz) thuộc cùng một vòng benzene 3 lần thế tại vị trí 1,2,4-.
Cả 3 proton trên đều cho tương quan với carbon bậc bốn C 120.7 và carbon mang oxy
C 148.4. Do vậy hai carbon trên lần lượt là C-1’ và C-4’. Proton H 7.29 (1H, d, 2 Hz)
tương quan với C-2 và ghép meta với proton H 7.24 (1H, dd, 2 Hz và 8.4 Hz) hẳn là H-
2’, proton H 7.24 (1H, dd, 2 Hz và 8.4 Hz) tương quan với C-2 và ghép ortho với proton
H 6.85 (1H, d, 8.4 Hz) phải là H-6’, proton H 6.85 (1H, d, 8.4 Hz) còn lại là H-5’.
Phổ DEPT và 13C-NMR xác định C-6’’, C-1’’ lần lượt có độ dịch chuyển hóa học
C [17.4, 101.8]. Trên phổ HSQC, proton H [0.80 (3H, d, 6.6 Hz); 5.25(1H, s)] lần lượt
là H-6’’ và H-1’’. Ngoài ra, còn các tín hiệu proton H [3.97 (1H, s), 3.49 (1H, d, 8.4
Hz); 3.12-3.22 (1H, m); 3.12-3.16 (1H, m)] gắn với carbon có dịch chuyển hóa học
tương ứng C [69.9; 70.3; 70.5; 71.1]. Đây là tín hiệu proton và carbon của phân tử
đường α-L-rhamnose. Tương quan HMBC giũa proton anomer của đường với C-3 của
khung flavonoid khẳng định phân tử rhamnose gắn vào khung tại vị trí C-3 thông qua
liên kết O-glycoside.
102
(1H, d, 8 Hz, H-5’); 7.24 (1H, dd, 2 Hz và 8.5 Hz, H-6’); 7.29 (1H, d, 2 Hz, H-2’); 5.25
(1H, s, H-1’’). 13C-NMR, δ (ppm): 157.3 (C-2); 134.2 (C-3); 177.7 (C-4); 161.3 (C-5);
98.6 (C-6); 164.2 (C-7); 93.6 (C-8); 156.4 (C-9); 104.0 (C-10); 120.7 (C-1’); 115.6 (C-
2’); 145.2 (C-3’); 148.4 (C-4’); 115.4 (C-5’); 121.1 (C-6’); 101.8 (C-1’’).
Từ các nhận định phổ nghiệm nêu trên kết hợp so sánh báo cáo của Zhang et al.
(2014) [435], SBE5 được nhận danh là quercitrin. Quercitrin là dạng glycosyl hóa của
quercetin được tìm thấy trong nhiều loại rau quả. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, chiết
xuất thực vật giàu quercitrin có khả năng chống đái tháo đường cao. Ansari et al. (2022)
báo cáo rằng quercitrin cô lập từ vỏ thân Heritiera fomes kích thích sản xuất insulin
trong điều kiện in vitro và cải thiện chống chịu glucose và đáp ứng insulin trên chuột
[28]. Lenh et al. (2022) cho thấy chiết xuất giàu quercitrin từ Merremia tridentata (L.)
ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột trong điều kiện in vitro và hạ đường huyết hiệu quả trên
chuột đái tháo đường do alloxan [384].
Cấu trúc hợp chất SBE6
Hợp chất SBE6 thu được
ở dạng bột màu vàng, có nhiệt
độ nóng chảy 189-192 °C
(MeOH). Hợp chất này cho
phản ứng dương tính với thuốc
thử FeCl3/EtOH, chứng tỏ đây
là một dẫn xuất phenol.
Phổ 13C-NMR của hợp
chất này cho tín hiệu của 15
carbon olefin thuộc khung flavonol và 12 tín hiệu carbon của 2 phân tử đường. Phổ 1H-
NMR xuất hiện hai tín hiệu doublet tại [δH 6.38 (1H, d, 2.0 Hz); 6.19 (1H, d, 2.0 Hz)]
đặc trưng cho hai proton của vòng benzen 1,2,3,5-thế. Hai proton này lần lượt là H-8 và
H-6 của vòng A. Ba tín hiệu proton của hệ ABX [H 7.54 (1H, d, 8.5 Hz); 7.52 (1H, d,
2.0 Hz); 6.84 (1H, d, 8.5 Hz)] được gán cho H-6’, H-2’ và H-5’ của vòng B. Mặt khác,
phổ 1H-NMR và 13C-NMR của SBE6 xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của hai phân tử
đường β-D-glucose và -L-rhamnose. Phổ HMBC cho thấy proton anomer của đường
rhamnose δH 4.38 (1H, s) tương quan với C-6” của đường glucose δC 66.9, và proton
anomer của đường glucose [δH 5.34 (1H, d, 7.5 Hz)] tương quan với carbon C-3 δC 133.3
103
trên khung flavonol khẳng định phân tử đường rhamnose gắn vào đường glucose tại C-
1H-NMR, H, ppm: 7.55 (1H, dd, 8.5 và 2.0 Hz, H-6’); 7.53 (1H, d, 2.0 Hz, H-2’);
6’’ và phân tử đường glucose gắn vào phần khung flavonoid tại C-3.
6.85 (1H, d, 8.5 Hz, H-5’); 6.40 (1H, d, 2.0 Hz, H-8); 6.20 (1H, d, 2.0 Hz, H-6); 5.35
(1H, d, 7.5 Hz, H-1’’); 4.38 (1H, s, H-1’’’); 3.71 (1H, d, 10.0 Hz, H-6’’b); 3.37 (1H, m,
H-2’’’); 3.39 (1H, m, H-6’’a); 3.38 (1H, m, H-3’’’); 3.27 (1H, m, H-5’’’); 3.24 (1H, m,
H-5’’); 3.22 (1H, m, H-2’’); 3.21 (1H, m, H-3’’); 3.07 (1H, m, H-4’’’); 3.05 (1H, m, H-
13C-NMR, C, ppm: 177.3 (C-4); 164.0 (C-7); 161.1 (C-5); 156.5 (C-2); 156.3 (C-
4’’); 1.00 (3H, d, 6,0 Hz, H3-6’’’).
9); 148.3 (C-4’); 144.7 (C-3’); 133.2 (C-3); 121.5 (C-6’); 121.1 (C-1’); 116.2 (C-2’);
115.2 (C-5’); 103.9 (C-10); 101.1 (C-1’’); 100.6 (C-1’’’); 98.6 (C-6); 93.5 (C-8); 76.4
(C-3’’); 75.8 (C-5’’); 74.0 (C-2’’); 71.8 (C-4’’’); 70.5 (C-3’’’); 70.3 (C-2’’’); 69.9 (C-4”);
68.1 (C-5’’’); 66.9 (C-6’’); 17.6 (C-6’’’).
Qua phân tích các phổ thực nghiệm, kết hợp với so sánh dữ liệu của Zhang et al.
(2014) [435], SBE6 được nhận danh là Quercetin-3-O-rutinoside (Rutin). Rutin là một
flavonoid được tìm thấy trong nhiều loài thực vật, thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quan
trọng như kháng viêm, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh, gan, thận. Các cơ chế
chống đái tháo đường của rutin bao gồm ức chế hấp thu glucose ở ruột, ức chế tân tạo
đường (gluconeogenesis), tăng hấp thu glucose vào mô, kích thích sản xuất insulin và
chống suy thoái đảo tụy [133]. Nghiên cứu của Ganesan et al. (2020) cho thấy rutin có
khả năng điều hòa biểu hiện gene liên quan đến quá trình chuyển hóa nhiễm toan
(metabolic acidosis) như AQP2, AQP3 và V2R, từ đó chống lại diễn tiến biến chứng ở
thận và cơ tim ở chuột gây đái tháo đường bởi alloxan [124]. Trước đó, Saklani et al.
(2016) đã cung cấp các minh chứng cho thấy rutin có thể giảm mức độ biểu hiện gene
của các tín hiệu viêm liên quan đến diễn tiến biến chứng cơ tim do đái tháo đường như
TNF-α và CRP [333]. Đáng chú ý, sự kết hợp của rutin với các polyphenol khác như
catechin và epicatechin có hiệu quả chống gia tăng đường huyết và nguy cơ hạ đường
huyết trên chuột đái tháo đường [227]. Nghiên cứu mới nhất cho thấy, rutin có khả năng
kết hợp tốt với metformin cải thiện đáng kể chức năng thành mạch bên cạnh hiệu quả
ổn định đường huyết và lipid máu trên chuột đái tháo đường [91]. Ngoài ra, rutin còn
chống đái tháo đường gián tiếp thông qua điều hòa hệ vi sinh đường ruột của chuột đái
tháo đường [57]. Thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2 cho thấy,
104
liệu pháp bổ sung rutin cải thiện đáng kể các chỉ số trao đổi chất, kháng viêm và chống
oxy hóa [42].
Cấu trúc hợp chất SBE7
Phổ 1H-NMR cho 2 tín hiệu đặc trưng
của hệ vòng benzen đối xứng trên tại δH
8.03 (2H; d; J = 7.0 Hz; H-2’,H-6’) và δH
6.89 (2H; d; J = 7,0 Hz; H-3’, H-5’); 2 tín
hiệu proton dạng mũi đơn tại δH 6.27 (1H;
s) và δH 6.77 (1H; s) thuộc một khung
flavone; Ngoài ra còn 1 proton δH 4.69 (1H;
d; J = 8.0 Hz; H-1’’) tương ứng với proton
anomer của nhóm glycoside.
Phổ 13C-NMR, kết hợp DEPT-90 và DEPT135, cho 19 tín hiệu cộng hưởng tương
ứng với 21 carbon (có 2 tín hiệu xuất hiện với cường độ gấp đôi), bao gồm 1 carbon
nhóm carbonyl thuộc khung flavone tại δC 182.1, 8 carbon bậc 4, 11 carbon methine và
1 carbon methylene tại δC 61.2. Trong số 21 tín hiệu carbon, có 6 tín hiệu thuộc 1 phân
tử đường và 15 carbon của khung flavone.
Tương quan HMBC giữa proton δH 6.77 với các tín hiệu carbon tại δC 121.6 (C-1’);
δC 163.9 (C-2); δC 104.0 (C-10) cho thấy đây là proton H-3. Tương tự, tương quan
HMBC giữa proton δH 6.27 với tín hiệu carbon tại δC 160.3 (C-5); δC 104.6 (C-8); δC
104.0 (C-10) cho thấy đây là proton H-6. Hằng số ghép J=8.0 Hz của proton anomer H-
1’’ cùng với độ dời hóa học trong vùng 60-80 ppm của 6 tín hiệu carbon (δC 73.3; 70.8;
78.6; 70.5; 81.8 và 61.3) cho thấy đây là 1 phân tử glucose cấu hình beta. Phổ HSQC
cho tương quan proton anomer tại δH 4.69 với tín hiệu carbon 73.3 khẳng định tín hiệu
trên là carbon anomer C-1’’. Do carbon anomer xuất hiện tại từ trường cao nên có thể
nhận thấy glucoside trong phân tử SBE7 có kiểu C-glucoside. Kết hợp tương quan
HMBC giữa proton anomer δH 4.69 (H-1’’) với tín hiệu carbon δC 104.6 (C-8) khẳng
định đây là một flavone gắn đường glucose tại C-8. Thêm vào đó, tương quan HMBC
giữa δH 8.03 (H-2’, H-6’) và 6.89 (H-3’, H-5’) với carbon δC 161.1 (C-4’) cho thấy
nhóm hydroxyl gắn vào vị trí C-4’ của vòng B.
So sánh với dữ liệu phổ được công bố bởi của Zhang et al. (2014) [435], SBE7 được
xác định là Vitexin. Vitexin là một flavonoid C-glycoside có khả năng chống đái tháo
105
đường. Nghiên cứu của Ganesan et al. (2020) cho thấy vitexin giúp phục hồi chức năng
tế bào β và tín hiệu insulin thông qua điều hòa các con đường Nrf2 và NF-B [125]. Ni
et al. (2020) báo cáo cơ chế tác động ức chế α-glucosidase của vitexin tốt hơn acarbose
[250]. Báo cáo phân tích tổng hợp của Abdulai et al. (2021) cho thấy vitexin và
isovitexin có hiệu quả chống đái tháo đường và các biến chứng thông qua tác động đa
mục tiêu [6]. Kết quả tương tự được mô tả trong nghiên cứu của Zhang et al. (2023) cho
thấy, vitexin có khả năng cải thiện biến chứng thận do đái tháo đường bằng cách ức chế
ferroptosis (quá trình tự chết của tế bào phụ thuộc sắt) qua điều hòa biểu hiện glutathione
peroxidase 4 (GPX4) [434]
Cấu trúc hợp chất SBE8
Gallic acid (GA) có nhiều trong thực vật ăn được
và thảo dược, có tác dụng cải thiện các rối loạn chuyển
hóa nhờ hoạt tính chống oxy hóa và kháng viêm. Tác
dụng chống đái tháo đường và các biến chứng của GA liên quan chặt chẽ với khả năng
chống stress oxy hóa [415]. Hoạt tính kháng viêm của GA được chứng minh trong
nghiên cứu của Tanaka et al. (2020), trong đó đề cập đến khả năng ức chế phì đại tế bào
mỡ và viêm do quá trình này tạo ra, từ đó cải thiện kháng insulin [370]. Hiệu quả cải
thiện quá trình chuyển hóa chất béo và chống oxy hóa của GA được minh chứng qua
đánh giá biểu hiện gene liên quan trên mô hình chuột gây đái tháo đường được báo cáo
bởi Chao et al. (2021) [79]. Variya et al. (2020) báo cáo rằng GA từ Emblica officinalis
giúp cải thiện hiệu quả vận chuyển glucose và độ nhạy insulin qua điều hòa biểu hiện
các gene liên quan tín hiệu PPAR-γ và Akt [381]. GA còn kết hợp tốt với metformin giúp
cải thiện chuyển hóa glucose và stress oxy hóa tốt hơn chỉ sử dụng metformin hoặc GA
trên mô hình chuột đái tháo đường [270]. Hiệu quả kết hợp giữa GA và metformin được
minh chứng qua khả năng điều hòa biểu hiện các gene liên quan đến con đường tín hiệu
JAK/STAT theo báo cáo của Elekofehinti et al. (2022) [111]. Nghiên cứu của Bashar et
al. (2021) chứng minh rằng, gallic acid điều hòa tăng biểu hiện gene GLP-1, GLUT-4,
Wnt1 và β-catenin, đồng thời giảm biểu hiện gene ERK1/2/NF-κB, từ đó có khả năng
chống tổn thương gan do đái tháo đường tuýp 2 [41]
106
Cấu trúc hợp chất SBE9
Chlorogenic acid (ChA), chất bột
So sánh với dữ liệu phổ từ tài liệu đã được công bố bởi của Palierse et al. (2020)
[287], SBE9 được xác định là Chlorogenic acid (ChA). ChA là phenolic có nhiều giá trị
dược học chống đái tháo đường bao gồm hạ đường huyết, giảm mỡ máu, kháng viêm,
chống oxy hóa [418]. Jin et al. (2015) chỉ ra rằng ChlA có thể cải thiện đái tháo đường
thông qua tác động đến nhiều quá trình liên quan chuyển hóa glucose và chất béo trên
mô hình chuột db/db [163]. Tác động tương tự được báo cáo bởi Singh et al. (2021) mô
hình chuột đái tháo đường do streptozotocin [352]. Hiệu quả kiểm soát quá trình chuyển
hóa chất béo và các quá trình chống stress oxy hóa được minh chứng qua khả năng điều
hòa biểu hiện các gene như FASN (fatty acid synthase), ACC (acetyl-CoA carboxylase)
theo Huang et al. (2015)[158, 210], CEBPB và SREBP1 theo Peng et al. (2018) [293],
hay các gene liên quan con đường FXR/FGF15 theo Ye et al. (2022)[421]. Các kết quả
này có thể minh chứng cho các cơ chế chống đái tháo đường liên quan của ChlA.
Cấu trúc hợp chất SBE10
107
Catechin (Cat) có khả năng chống đái tháo
đường thông qua cải thiện kháng insulin, giảm
stress oxy hóa, điều chỉnh chức năng ty thể,
giảm căng thẳng lưới nội chất (ER), kháng
viêm, giảm hấp thu đường vào máu và điều hòa
chức năng đường ruột [398]. Nghiên cứu của Samarghandian et al. (2017) chỉ ra rằng
Cat cải thiện đái tháo đường và chống biến chứng bằng cách điều chỉnh stress oxy hóa
trên mô hình chuột đái tháo đường do streptozotocin [334]. Hiệu quả kiểm soát đường
huyết thông qua điều hòa biểu hiện các gene liên quan đến con đường chuyển hóa
glucose được báo cáo bởi Shin et al. (2020) [345], trong khi khả năng điều hòa biểu hiện
gene chống stress oxy hóa được minh chứng qua báo cáo của Zhao et al. (2022) [436].
Đáng chú ý, catechin còn cho thấy hiệu quả chống gia tăng đường huyết hiệu quả khi
kết hợp với các polyphenol khác như epicatechin và rutin trên mô hình chuột đái tháo
đường do alloxan theo Mechchate et al. (2021) [227]. Bên cạnh đó, catechin còn có tác
dụng cải thiện chuyển hóa glucose thông qua điều hòa hệ vi sinh đường ruột ở người
nghi mắc đái tháo đường tuýp 2 theo Ito et al. (2023) [159].
Trong các hợp chất cô lập được từ cao chiết phân đoạn ethyl acetate từ vỏ thân cây
Trâm vỏ đỏ, các hợp chất như gallic acid, chlorogenic acid, catechin, epicatechin,
quercetin, quercitrin, rutin, ellagic acid, ethyl gallate đã được tìm thấy trên một số loài
thuộc Chi Trâm ở các bộ phận thu hái khác nhau, tuy nhiên, vitexin rất ít phổ biến trong
Chi Trâm. Các hoạt tính liên quan đến các hoạt chất này đã được báo cáo gồm chống
oxy hóa, chống tăng sinh tế bào, kháng viêm, chống béo phì và ức chế enzyme tiêu hóa
tinh bột. Cụ thể, Vương et al. (2014) báo cáo rằng gallic acid, chlorogenic
acid, catechin và epicatechin trong quả S. paniculatum Gaertn ở Australia có khả năng
chống oxy hóa và chống tăng sinh tế bào ung thư tụy [386]. Cao chiết hạt S. cumini giàu
gallic acid, (−)-epicatechin, ellagic acid, quercetin có khả năng chống béo phì, tăng khả
năng chống chịu glucose, chống tăng lipid máu và stress oxy hóa trên mô hình chuột
gây béo phì bằng chế độ ăn giàu carbohydrate [379]. Chiết xuất hạt S. cumini với các
108
hợp chất chính là catechin, epicatechin, kaempferol, gallic, 5-caffeoylquinic, caffeic và
ferulic acid thể hiện khả năng chống oxy hóa và ức chế enzyme α-amylase và lipase
tuyến tụy [3]. Catechin hydrate và rutin hydrate là thành phần chính bên cạnh ellagic
acid và quercetin từ S. jambos ở Bangladesh có khả năng chống oxy hóa và kháng viêm
cao [152]. Quercitrin được tìm thấy trong chiết xuất lá S. attopeuense (Gagnep.) Merr.
& L.M.Perry với khả năng kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO do gây viêm bằng
lipopolysaccharide (LPS) trên tế bào RAW264.7 [380]. Chiết xuất nụ đinh hương (S.
aromaticum L.) gồm các hợp chất gallic acid, catechin, chlorogenic acid, caffeic acid,
ellagic acid, rutin, quercitrin, quercetin, kaempferol và luteolin có khả năng ức chế
enzyme tiêu hóa tinh bột và chống oxy hóa [10]. Chiết xuất lá S. brachythyrsum giàu
các thành phần polyphenol trong đó có ellagic acid, quercetin, gallic acid, ethyl gallate
có khả năng kháng viêm [85]. Đáng chú ý, các công bố về thành phần các hoạt chất nêu
trên trong các chiết xuất từ vỏ thân còn rất hạn chế. Shilpa et al. (2023) báo cáo rằng
chiết xuất methanol từ vỏ thân S. caryophyllatum (L.) Alston và Trâm vỏ đỏ (S.
zeylanicum (L.) DC) thu thập tại Ấn Độ có hiệu quả hạ đường huyết trên mô hình chuột
đái tháo đường do alloxan và streptozotocin. Trong đó, thành phần các hoạt chất được
phân tích có liên quan đến nghiên cứu này gồm gallic acid, cholorogenic acid, rutin,
catechin, quecetin. Tuy nhiên, chlorogenic acid, rutin, quercetin không tìm thấy trong
cao chiết methanol của Trâm vỏ đỏ trong nghiên cứu trên. Bên cạnh đó, mối liên hệ giữa
các hợp chất được tìm thấy với các hoạt tính sinh học của các chiết xuất này cũng không
được đề cập [175]. Do đó, các hợp chất bao gồm chlorogenic acid, epicatechin,
quercetin, quercitrin, rutin, ellagic acid, ethyl gallate từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ thu thập
tại Đắk Lắk là các ghi nhận mới trong nghiên cứu này. Ngoài ra, những phân tích về mối
liên hệ với hoạt tính sinh học của cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ trong nội dung
nghiên cứu tiếp theo sẽ cung cấp thêm các minh chứng mới về khả năng hạ đường huyết
đa mục tiêu của các hợp chất nêu trên.
3.2.2. Hàm lượng các hợp chất polyphenol trong các loại cao chiết vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ
Sau khi phân lập các hợp chất, nghiên cứu tiến hành định lượng hàm lượng các hợp
chất trong các loại cao chiết phân đoạn bằng sắc kí lỏng cao áp (UHPLC). Kết quả thể
hiện ở Bảng 3.8
109
GA
Cat
E-Cat
Caf
EG
RT
EA
Querce
560,627 ± 0,30dJ 1.5454 ± 0,19cF 7.753,74 ± 0,23bE 5.879,54 ± 0,61cA 717,77 ± 0,28cH 1.257,84 ± 0,05bI 1.866,99 ± 0,19dE 4.167,87 ± 0,11bF 3.454,38 ±0,39dC 13.714,90 ± 0,23bB 761,42 ± 0,36dG 2.344,92 ± 0,23cG 604,5 ± 0,49dI 1.048,00 ± 0,16cJ
Ap
ChA
Querci
2.296,90 ± 0,32cH 47.476,10 ± 0,14aB 2.708,73 ± 0,01bF 11.079,70 ± 0,01dA 70.040,80 ± 0, 24aA 16.876,90 ± 0,11bA 43.851,00 ± 0,01aC 4.922,62 ± 0,23aI 5.215,96 ± 0,17aH 14.301,30 ± 0,41aG 23.183,90 ± 0,15aE 3.954,62 ± 0,24aJ 1.345,67 ±0,27aK 21.945,10 ± 0,14aF 25.237,70 ± 0,27aD
5.405,4 ± 0,01dE 493,46 ± 00dI 2.657,29 ± 00cG 7.230,78 ± 0,01cC 5.603,90 ± 0,01bD 2.460,51 ± 0,01bH 447,13 ± 00bJ 8.714,81 ± 0,01cB 3.514,38 ± 0,02cE
- 9.264,81 ± 0,15bD 10.845,7 ± 0,40bC
- 4.598,40 ± 0,26dB 2.630,44 ± 0,45dD
Ghi chú: Giá trị trung bình ± SEM (n = 5). Các ký tự khác nhau (a-d) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê hàm lượng hoạt chất giữa các loại cao chiết (theo hàng) và các ký tự khác nhau (A-E) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các hoạt chất trong cùng một cao chiết (cột) theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05). CE: cao chiết thô; EAF: cao chiết phân đoạn ethyl acetate; BF: cao chiết phân đoạn n-Butanol; WF: Cao chiết phân đoạn nước; CK: Khối lượng khô của cao chiết; GA: gallic acid, Cat: catechin, E-Cat: epicatechin, Caf: Caffeine, EG: ethyl gallate, RT: rutin, EA: ellagic acid, Querce: quercetin, Querci: quercitrin, Ap: Apigenin, ChA: chlorogenic acid;
Kết quả phân tích đã xác định được sự có mặt của các hợp chất trong các loại cao
chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ gồm: Gallic acid, catechin, epicatechin, caffein, ethyl
gallate, rutin, ellagic acid, quercetin, quercitrin, apigenin và chlorogenic acid với hàm
lượng khác nhau (Bảng 3.8). Trong đó, Catechin có hàm lượng cao nhất trong CE
(11.079,7 μg/g), tiếp theo là chlorogenic acid, rutin, ellagic acid và epicatechin (5405,5
μg/g đến 8714,81 μg/g), trong khi gallic acid, ethyl gallate, quercetin và quercitrin có
hàm lượng thấp hơn (2708,73 đến 3514,38 μg/g). Caffeine và apigenin có hàm lượng
thấp nhất chiếm từ 447,13 đến 493,46 μg/g (Bảng 3.8). Hàm lượng của hầu hết các hợp
chất trong cao EAF đều cao hơn so với cao BF và cao WF. Trong đó, hàm lượng các
hợp chất trong EAF cao hơn từ 1,6 đến 17,5 lần so với cao chiết thô (CE), tuỳ theo từng
hợp chất. Gallic acid là cao nhất, tăng 17,5 lần, tiếp theo là caffeine, epicatechin,
quercitin và catechin tăng lần lượt là 9,98; 8,1; 7,2; 6,3 lần, và các hợp chất còn lại tăng
từ 1,9 đến 3,0 lần. Các hợp chất quercitrin, caffein, rutin, ethyl gallate, catechin,
epicatechin và chlorogenic acid được tập trung trong phân đoạn n-butanol (tăng từ 1,06
lần, chlorogenic acid, đến 3,1 lần, quercitrin, so với cao chiết thô). Caffeine, catechin và
110
epicatechin được tập trung chủ yếu ở phân đoạn nước (WF), tăng lần lượt là 1,45, 1,12
và 1,1 lần so với cao chiết thô (CE) (Bảng 3.8). Kết quả này cho thấy, các hợp chất có
mức độ tập trung cao trong phân đoạn ethyl acetate và chứa tất cả các thành phần được
phân tích trong cao chiết thô với hàm lượng cao.
3.2.3. Phân tích tương quan (Pearson correlation analysis) giữa các hoạt chất và
hoạt tính sinh học của cao chiết
Phân tích tương quan Pearson (r) giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số
(TPC, TFC), khả năng trung hòa DPPH•, ABTS•+, hoạt tính ức chế α-glucosidase và α-
amylase với thành phần các hợp chất polyphenol được thể hiện ở Bảng 3.9. Kết quả cho
thấy có mối liên quan chặt chẽ giữa thành phần và hàm lượng của các hợp chất tự nhiên
có hoạt tính sinh học với các hoạt tính sinh học của các loại cao chiết.
Mối tương quan rất chặt chẽ giữa TPC và TFC (r = 0,98, p < 0,001) cho thấy
flavonoid là thành phần chính của các hợp chất polyphenol chứa trong vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ. Các thành phần flavonoid cũng thể hiện mối quan hệ chặt chẽ hơn với khả năng
trung hòa gốc tự do DPPH• (r = 0,73, p < 0,001) và ABTS•+ (r = 0,78, p< 0,001) so với
TPC (với hệ số tương quan tương ứng là r = 0,62 và r = 0,67, p < 0,001). Kết quả này
111
tương đồng với các nghiên cứu trước đây cho thấy flavonoid là thành phần chính có hoạt
tính chống oxy hóa của các chiết xuất từ cây thuốc [223, 394]. Hơn nữa, mối tương quan
các hợp chất có thể giúp mô tả rõ ràng sự khác nhau trong khả năng chống oxy hóa giữa
các loại cao chiết. Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH• cho thấy mối tương quan rất
chặt chẽ (p < 0,001) với chlorogenic acid (r = 0,93), ellagic acid (r = 0,94), quercetin (r
= 0,97), và apigenin (r = 0,96), trong khi khả năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ thể hiện
tương quan lớn hơn với chlorogenic acid (r = 0,91), quercitrin (r = 0,91), ellagic acid (r
= 0,94), caffeine (r = 0,97), gallic acid (r = 0,98), catechin (r = 0,98), và epicatechin (r
= 0,98). Ethyl gallate và rutin thể hiện mối tương quan ở mức trung bình với khả năng
trung hòa gốc tự do DPPH• (hệ số tương quan tương ứng là r = 0,73 và r = 0,59, p <
0,001) và khả năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ (r = 0,72 và r = 0,52, tương ứng) mặc
dù chúng được thể hiện là thành phần chính của TPC (hệ số tương quan tương ứng là r
= 0,99 và r = 0,97, p < 0,001) và TFC (hệ số tương quan tương ứng là r = 0,98 và r =
0,93; p < 0,001) (Bảng 3.9). Những kết quả này cho thấy hàm lượng ellagic acid,
quercetin và apigenin cao hơn trong CE có thể hỗ trợ khả năng trung hòa gốc tự do
DPPH• tốt hơn so với BF, WF với hàm lượng ellagic acid, quercetin thấp hơn và không
có apigenin (Bảng 3.8). Tương tự, hàm lượng catechin, epicatechin và caffeine cao hơn
so với CE cũng như hàm lượng thành phần ưa nước khác có thể làm cho khả năng trung
hòa gốc tự do ABTS•+ của WF tốt hơn so với CE và BF.
Hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số (TPC, TFC) và khả năng ức chế
enzyme thủy phân tinh bột thể hiện mối liên hệ không nhất quán (Bảng 3.9). TPC và
TFC có hệ số tương quan (r) nhận giá trị âm ở mức trung bình với giá trị IC50 của hoạt
tính ức chế α-glucosidase, giá trị lần lượt là r = - 0,61 (p < 0,0337), và r = - 0,63 (p <
0,0292), nhưng hệ số tương quan với giá trị IC50 của hoạt tính ức chế α-amylase cho giá
trị dương với mối liên hệ chặt chẽ lần lượt là r = 0,83 và r = 0,91 (p < 0,001). Kết quả
này cho thấy vai trò khác biệt của TPC và TFC đối với khả năng ức chế α-glucosidase
và α-amylase. Đáng chú ý, phân tích mô tả mối tương quan thuận chặt chẽ giữa tất cả
các hợp chất polyphenol được phân tích với giá trị IC50 của hoạt tính ức chế α-amylase.
Điều này giúp giải thích rằng sự tập trung nồng độ cao của các hợp chất này có thể làm
giảm hoạt tính ức chế α-amylase của EAF và BF so với WF và CE (Bảng 3.8). Một số
nghiên cứu mô tả mối tương quan thuận giữa hàm lượng polyphenol và khả năng ức chế
α-amylase [3, 11, 172], tuy nhiên, trong một số trường hợp, không tìm thấy mối tương
112
quan [13]. Sultana et al. (2020) báo cáo rằng, các hợp chất polyphenol có cùng độ phân
cực tập trung ở nồng độ cao có thể tương tác với nhau, làm giảm tương tác của chúng
với trung tâm hoạt động của enzyme [363]. Theo báo cáo của Grussu et al. (2011), mức
độ tập trung cao các thành phần hợp chất polyphenol trong quả mâm xôi vàng không
làm tăng khả năng ức chế α-amylase [139]. Do đó, kết quả trong nghiên cứu này cho
thấy khả năng ức chế α-amylase của các loại cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ có thể
bị ảnh hưởng bởi sự tương tác của các hợp chất polyphenol khi ở nồng độ cao trong mẫu.
Đối với hoạt tính ức chế α-glucosidase, phân tích tương quan cho thấy chỉ có ethyl
gallate và rutin có mối tương quan có ý nghĩa, với hệ số tương quan r = - 0,68 (p <
0,016) và r = - 0,78 (p < 0,0025), trong khi các hợp chất khác cho thấy mối tương quan
không đáng kể (Bảng 3.9). Kết quả này cho thấy, các hợp chất polyphenol tác động đến
α-glucosidase ít bị ảnh hưởng do sự tập trung nồng độ cao của các hợp chất polyphenol.
Hơn nữa, ethyl gallate và rutin có thể thể hiện các thuộc tính khác biệt so với các hợp
chất polyphenol khác. Giữa chúng có mối liên hệ chặt chẽ (r = 0,97, p < 0,001), nhưng
chỉ thể hiện mối tương quan ở mức trung bình với các hợp chất khác (không bao gồm
quercitrin trong trường hợp ethyl gallate) (Bảng 3.9). Các dữ liệu này chứng minh rằng
ethyl gallate và rutin có thể đã trở nên đan xen trong quá trình trích ly phân đoạn và
những thay đổi về mức độ tập trung của chúng trong các cao phân đoạn có thể ảnh hưởng
đến hoạt tính sinh học của các loại cao chiết này.
3.2.4. Phân tích thành phần chính (Principal component analysis, PCA) về thành
phần hoạt chất và hoạt tính sinh học của cao chiết
Các kết quả phân tích thành phần chính (PCA) của các loại cao chiết từ vỏ thân cây
Trâm vỏ đỏ được mô tả trong Hình 3.16. Hai chiều mô tả giá trị riêng khoảng 94%,
chiếm phương sai 83,1% bởi Dim. 1 và 11,1% bởi Dim. 2. Nhìn chung, các loại cao
chiết phân đoạn được mô tả với sự khác biệt đáng kể đối với cao chiết thô. Do các cực
khác nhau của chúng, EAF được phân tách rõ ràng bởi Dim. 1 với WF, BF và CE. Mặt
khác, BF khác biệt với WF ở vị trí đối diện bởi Dim 2 và cả hai đều tách biệt với CE.
Những phát hiện này chỉ ra rằng thành phần các chất chuyển hóa của các loại cao chiết hoàn
toàn khác biệt. Sự khác biệt này có thể có tác động đến hoạt tính sinh học của các loại cao
chiết, mô tả bởi hướng mũi tên chỉ hoạt tính chống oxy hóa và ức chế enzyme (Hình 3.16).
So với nước, n-butanol và ethyl acetate là dung môi tốt hơn để trích ly các
polyphenol và flavonoid từ cao chiết thô. Trong số đó, ethyl acetate tập hợp hầu hết các
113
thành phần có hoạt tính chống oxy hóa cao. Những khả năng này đã được thể hiện bằng
hướng đồ thị của DPPH và ABTS ở chiều dương của Dim. 1 và Dim. 2, là cùng phía với
EAF. Trong đó, gallic acid, catechin, epicatechin, ellagic acid, quercetin, caffeine và
apigenin cho thấy vai trò chống oxy hóa tốt hơn so với chlorogenic acid, quercitrin, và
đặc biệt là ethyl gallate và rutin, được tách ra ở phía đối diện của Dim. 2 (Hình 3.16).
Ghi chú: CE: Cao chiết thô; EAF: Cao chiết phân đoạn ethyl acetate; BF: Cao chiết phân đoạn n-Butanol; WF: Cao chiết phân đoạn nước; GA: gallic acid, Cat: catechin, E-Cat: epicatechin, Caf: Caffeine, EG: ethyl gallate, RT: rutin, EA: ellagic acid, Querce: quercetin, Querci: quercitrin, Ap: Apigenin, ChA: chlorogenic acid; tổng hàm lượng polyphenol và flavonoid (TPC và TFC), các hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH• và ABTS•+ (DPPH & ABTS), các hoạt tính ức chế α-amylase và α-glucosidase (aAI & aGI)
Hướng của các hợp chất polyphenol trong Dim. 2 cũng cho thấy mức độ tập trung
và tương tác của gallic acid, catechin, epicatechin, ellagic acid, quercetin và apigenin
làm giảm hoạt tính ức chế α-amylase của EAF mạnh hơn so với ethyl gallate, rutin,
quercitrin và chlorogenic acid (Hình 3.16). Kết quả có thể giải thích rằng quá trình trích
ly phân đoạn đã làm giàu thành phần các hoạt chất và thay đổi tỷ lệ giữa chúng, do đó
ảnh hưởng đến hoạt tính ức chế α-amylase. Đối với khả năng ức chế α-glucosidase,
114
hướng ngược lại của giá trị IC50 của hoạt tính ức chế α-glucosidase cho thấy các thành
phần hoạt chất có hoạt tính này có thể được thu thập bởi phân đoạn n-butanol thay vì
phân đoạn ethyl acetate. Thật vậy, rutin và ethyl gallate tương quan với giá trị IC50 của
hoạt tính ức chế α-glucosidase theo hướng đối ngược (Hình 3.16), và chúng tương quan
rõ rệt với BF trong Dim. 2. Những phát hiện này cho thấy rằng tỷ lệ hàm lượng rutin và
ethyl gallate lớn hơn trong BF có thể làm tăng tác dụng ức chế α-glucosidase trái ngược
với EAF, có tỷ lệ rutin và ethyl gallate thấp hơn các hợp chất khác (Bảng 3.8).
Dù chưa đủ dữ liệu phân tích mối liên hệ giữa thành phần các hoạt chất trong cao
chiết với các hoạt tính trong điều kiện in vivo. Tuy nhiên, sự tập trung hàm lượng cao
các hoạt chất phân lập được về phân đoạn ethyl acetate phần nào minh chứng cho các
khả năng kiểm soát đường huyết trên cơ sở điều hòa biểu hiện gene liên quan cũng như
hệ vi sinh đường ruột của cao chiết này. Các nghiên cứu cho thấy, hầu hết các hợp chất
phân lập và phân tích được trong nghiên cứu này, đặc biệt là các phenolic như gallic
acid, chlorogenic acid, ellagic acid hay các flavonoid như quercetin, catechin, đã được
minh chứng về kiểm soát đường huyết thông qua điều hòa biểu hiện các gene liên quan
đến quá trình sinh tổng hợp chất béo, các con đường tín hiệu insulin, hấp thu và chuyển
hóa glucose (Mục 3.2.1.1. bên cạnh khả năng điều hòa hệ vi sinh đường ruột của rutin
hay epicatechin. Các nghiên cứu trong tương lai cần xác định, làm rõ hơn ảnh hưởng
của từng đơn chất cũng như những tác động liên hợp giữa các hợp chất này đối với khả
năng kiểm soát các con đường chuyển hóa thông qua biểu hiện các gene liên quan và
điều hòa hệ vi sinh đường ruột. Từ đó, đề xuất các cơ chế tác động cụ thể và các hướng
tiếp cận ứng dụng phù hợp trong thực tiễn.
Phương pháp trích ly phân đoạn có thể giúp giảm chi phí phân lập các hợp chất tinh
khiết dựa trên khả năng tập trung các hợp chất có hoạt tính cao về phân đoạn mục tiêu.
Tuy nhiên, trích ly phân đoạn sử dụng nhiều dung môi hữu cơ nên có thể ảnh hưởng đến
sức khỏe con người và ô nhiễm môi trường. Do đó, nghiên cứu phân đoạn chỉ nhằm xác
định thành phần chính thể hiện hoạt tính sinh học trong cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ
đỏ, làm chất đánh dấu trong kiểm soát dược liệu. Nghiên cứu tiếp theo ứng dụng kĩ thuật
vi bao bằng sấy phun đối với cao chiết thô Trâm vỏ đỏ nhằm nâng cao sinh khả dụng,
đồng thời giảm sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại.
115
3.3. Vi bao gói cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
Hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên có thể bị suy giảm trong quá trình bảo
quản do tác động của ánh sáng, oxy, nhiệt độ, độ ẩm. Bên cạnh đó, tính khả dụng sinh
học thấp là giới hạn cơ bản trong ứng dụng thực tiễn của hợp chất tự nhiên [284]. Vi bao
gói giúp duy trì tính ổn định về cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học, tăng tính sinh khả
dụng, độ hòa tan và tính thấm qua màng tế bào của các chiết xuất/hợp chất tự nhiên. Đặc
biệt, công nghệ này giúp bảo vệ và kiểm soát giải phóng các hoạt chất giúp nâng cao
hiệu quả tác dụng của các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học [100]. Trong đó, sấy
phun là phương pháp phù hợp nhất hiệu suất vi bao gói cao [375], nâng cao tính sinh
khả dụng của các hoạt chất được vi bao gói [100, 215], và dễ ứng dụng vào sản xuất
công nghiệp nhờ chi phí thấp.
Vật liệu vi bao gói là yếu tố quan trọng liên quan hiệu quả và tính chất của sản phẩm
vi bao gói. Vì vậy, lựa chọn vật liệu vi bao gói phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau
như bản chất của thành phần hoạt chất được vi bao gói, khả năng giải phóng hoạt chất
theo mong muốn, các yêu cầu về độ ổn định và dự kiến ứng dụng của sản phẩm. Nghiên
cứu này sử dụng vật liệu vi bao chính là maltodextrin kháng tiêu hóa (Resistant-digested
maltodextrin, RMD) nhằm vi bao gói cao chiết thô từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ ứng dụng
trong kiểm soát đường huyết. Một số công bố gần đây cho thấy, RMD có hiệu quả bao
gói cao các hợp chất tự nhiên [285]. Đặc biệt, vật liệu này còn đóng vai trò như chất xơ
[8], có tác dụng bổ trợ cho cao chiết trong kiểm soát đường huyết [160], đồng thời tác
động có lợi đến hệ vi sinh đường ruột [427]. Ngoài ra, các vật liệu vi bao gói bổ trợ gồm
gum arabic và cyclodextrin cũng được sử dụng nhằm đánh giá khả năng giúp cải thiện
hiệu quả vi bao gói. Trong đó, gum arabic được chứng minh có thể kết hợp hiệu quả với
maltodextrin hay cyclodextrin trong vi bao gói các hợp chất polyphenol [53] và giúp
chống lại sự biến đổi của chúng dưới tác dụng của enzyme tiêu hóa trong điều kiện in
vitro [9]. Trong khi đó, cyclodextrin có khả năng giúp kiểm soát giải phóng hoạt chất từ
sản phẩm vi bao gói chậm hơn trong quá trình sử dụng [306], đồng thời giúp nâng cao
hiệu quả bao gói, các thuộc tính hóa lý và hoạt tính sinh học của sản phẩm [86].
3.3.1. Điều kiện và chất mang sử dụng vi bao gói cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
Cao chiết thô Trâm vỏ đỏ (CE) được đồng nhất với các vật liệu vi bao gói bao gồm
maltodextrin kháng tiêu hóa (RMD), gum arabic (GA), α-cyclodextrin (α-CD), β-
cyclodextrin (β-CD), và γ-cyclodextrin (γ-CD) theo các công thức khác nhau mô tả ở
Bảng 2.3. Hỗn dịch sau đó được làm khô nhanh bằng kỹ thuật sấy phun và thu được sản
116
phẩm dạng bột mịn, đồng nhất. Các tính chất vật lý, đặc điểm hình thái hạt vi bao được
phân tích. Đồng thời, các hoạt tính sinh học của sản phẩm vi bao đến khả năng kiểm
soát đường huyết như chống oxy hóa và ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột được đánh giá.
Từ đó, công thức vi bao có hoạt tính cao được lựa chọn cho các thử nghiệm trên mô
hình động vật.
3.3.1.1. Các tính chất vật lý và đặc điểm hình thái hạt vi bao
Các thuộc tính lý hóa cơ bản của sản phẩm vi bao gói bao gồm độ ẩm, hoạt độ nước,
mật độ khối, độ phân tán, độ hòa tan, tỷ lệ hấp thụ nước và khả năng trương nở của các
công thức vi bao khác nhau thể hiện trong Bảng 3.10. Trong số các công thức được khảo
sát, sự kết hợp giữa maltodextrin kháng tiêu hoá và gum arabic (T2) tạo sản phẩm vi
bao có độ ẩm và hoạt độ nước thấp nhất với giá trị lần lượt là 2,98% và 0,341. Mật độ
khối của bột dao động từ 0,40 đến 0,48 g/cm3, trong đó công thức T1 và T5 có giá trị
cao nhất. Độ phân tán trong nước, thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi Shittu và
Lawal (2007) [347], ở tất cả các mẫu dao động trong khoảng 58,09% đến 62,83% và
không có sự khác biệt đáng kể giữa các công thức.
Tất cả các công thức thử nghiệm đều tạo sản phẩm có độ hòa tan cao (≥ 92,51%),
trong đó công thức T1 và T2 có giá trị cao nhất, lần lượt là 95,06% và 94,59%. Các giá
trị này tương đương với sản phẩm bột gấc được vi bao với hỗn hợp maltodextrin và gum
arabic (94,30%) theo báo cáo của Kha et al. (2014) [186], và cao hơn so với sản phẩm
vi bao các hợp chất polyphenol từ ô liu (dao động từ 79% đến 87%) trong nghiên cứu
của Paini et al. (2015) [286]. Kết quả này cho thấy, sản phẩm vi bao gói cao chiết vỏ
thân cây Trâm vỏ đỏ có khả năng hòa tan cao nên tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh
vực khác nhau. Khả năng trương nở của sản phẩm vi bao có giá trị biến động tương ứng
với độ hòa tan. Cụ thể, độ trương nở của công thức T1 và T2 là cao nhất (lần lượt là
192,60 và 175,05 mg/g), tiếp theo là các mẫu T3, T5 và T4 có giá trị thấp nhất. Kết quả
này phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy mối tương quan cao giữa độ trương
nở và khả năng hòa tan của sản phẩm vi bao [186, 247, 286]. Tốc độ hấp thu nước có
xu hướng ngược lại với khả năng trương nở và độ hòa tan giữa các sản phẩm vi bao.
Trong khi khả năng trương nở và độ hòa tan của T1 và T2 là cao nhất thì giá trị độ hấp
thu nước của chúng thấp nhất so với công thức còn lại. Ngược lại, công thức T4 có tỷ lệ
hấp thụ nước cao nhất trong khi khả năng trương nở và độ hòa tan trong nước thấp nhất.
117
RMD
3,07±0,20bc
0,402±0,001a
0,47±0,01a
58,09±1,79a
95,06±0,09a
92,61±3,81c
192,60±3,67a
RMD-GA
2,98±0,22c
0,341±0,001d
0,43±0,01b
59,82±1,43a
94,59±0,07a
93,17±0,84c
175,05±2,23b
RMD-αCD
3,31±0,32b
0,344±0,001c
0,42±0,00 b
62,83±1,63a
94,00±0,20b
116,89±2,41b
157,23±5,62c
RMD-βCD
4,24±0,20ab 4,77±0,40a
0,354±0,001b 0,345±0,001c
0,40±0,01b 0,48±0,02a
59,01±1,49a 59,29±2,24a
92,51±0,23c 93,69±0,14b
148,37±3,25a 98,65±3,98c
123,71±3,97d 148,72±3,58c
RMD-CD
Ghi chú: Giá trị trung bình ± SEM (n = 3). Các ký tự khác nhau (a-d) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các công thức (theo cột) theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05). RMD: maltodextrin kháng tiêu hóa, GA: gum Arabic, αCD: α-cyclodextrin, βCD: β-cyclodextrin, CD: - cyclodextrin.
118
Đặc điểm hình thái hạt vi bao được được mô tả trong Hình 3.17 cho thấy các hạt vi
bao (vi nang) ở các công thức đều có dạng hình cầu đường kính nhỏ hơn 10 μm. Sự
phân bố kích thước hạt và độ co (shinkage) của vi nang ở các công thức khác nhau có
sự thay đổi đáng kể. Công thức T1 cho vi nang lớn nhất và độ đồng nhất kích thước hạt
thấp nhất. Ngược lại, công thức T2 đến T5 cho thấy sự phân bố kích thước hạt đồng nhất
hơn nhưng độ co của các hạt cao hơn so với công thức T1. Ngoài ra, dạng hình cầu của
các vi nang rõ ràng hơn khi có sự kết hợp giữa maltodextrin kháng tiêu hoá và các vật
liệu bao gói khác. Sự khác biệt về đặc điểm hình thái của các vi nang trong nghiên cứu
này phù hợp nghiên cứu của Navarro-Flores et al. (2020). Tác giả báo cáo rằng, các vi
nang sử dụng hỗn hợp maltodextrin với gum arabic, pectin và protein đậu nành làm vật
liệu bao gói chiết xuất methanol chipilin (Crotalaria longirostrata) bằng cách sấy phun
cho sản phẩm có phân bố kích thước hạt đồng nhất hơn so với chỉ sử dụng maltodextrin
[247]. Kết quả tương tự được báo cáo bởi Yadav et al. (2020) với quá trình vi bao các
polyphenol chiết xuất từ hạt nho bằng cách sử dụng kết hợp maltodextrin với gum arabic
và whey protein cô đặc làm chất mang [416].
T1 T2
T4 T3 T5
kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopes - SEM)
119
3.3.1.2. Hiệu suất sấy, hiệu quả vi bao, và thành phần hoạt chất của hạt vi bao
Bảng 3.11 cho thấy hiệu quả vi bao gói và hàm lượng polyphenol tổng số của các
vi nang không khác biệt đáng kể giữa các công thức. Hiệu quả vi bao gói của các công
thức đều cao hơn 97% chứng tỏ rằng maltodextrin kháng tiêu hoá hoặc hỗn hợp
maltodextrin với các vật liệu khác đều phù hợp. Kết quả này có thể được mô tả thêm
thông qua đặc điểm hình thái hạt, tất cả các công thức vi bao gói đều tạo thành các hạt
hình cầu nguyên vẹn với bề mặt nhẵn (Hình 3.17). Trong số các công thức, sự kết hợp
giữa RMD và GA (T2) cho hiệu suất sấy cao nhất (70,50%) trong khi công thức T3
(RMD-αCD) và T4 (RMD-βCD) cho hiệu suất sấy thấp nhất. Lớp vật chất khô đáng kể
bị kẹt trên thành buồng sấy trong quá trình sấy phun sử dụng T3 và T4 có thể giải thích
hiệu suất thu hồi bột thấp.
RMD
RMD-GA
58,33±0,69c
97,87 ± 0,31a
20,97 ± 0,64a
60,00±0,96c
97,80 ± 0,18a
20,85 ± 0,13a
68,00±0,77b
97,26 ± 0,32a
20,67 ± 0,50a
RMD-CD
Ghi chú: Giá trị trung bình ± SEM (n = 3). Các ký tự khác nhau (a-d) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các công thức (theo cột) theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05). RMD: maltodextrin kháng tiêu hóa, GA: gum Arabic, αCD: α-cyclodextrin, βCD: β-cyclodextrin, CD: -cyclodextrin.
Các nghiên cứu về vi bao gói các phytochemical chỉ ra rằng, maltodextrin là một
trong những vật liệu bao gói được sử dụng phổ biến nhất. Chúng không chỉ mang lại
năng suất sấy và hiệu quả bao gói cao mà còn có chi phí hợp lý so với các vật liệu khác
[180, 283]. Ngoài ra, nhiều nghiên cứu phối trộn maltodextrin với các vật liệu khác
nhằm cải thiện tính chất cơ lý của vật liệu vi bao đã chứng minh rằng, sự kết hợp phù
hợp của chúng có thể mang lại khả năng phục hồi, chất lượng sản phẩm và bảo vệ tốt
hơn các hợp chất hoạt tính sinh học được bao gói [214, 305, 320]. Trong nghiên cứu
này, hỗn hợp maltodextrin kháng tiêu hóa và gum arabic (T2) làm tăng hiệu suất sấy so
với các công thức khác. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về vi bao
gói các polyphenol từ các nguồn tự nhiên như bã cà phê và cải ngựa (Horseradish,
Armoracia rusticana (L.)). Cụ thể, Ballesteros et al. (2017) chỉ ra rằng hỗn hợp
120
maltodextrin và gum Arabic (1:1) mang lại hiệu quả bao gói polyphenol từ bã cà phê
cao hơn so với sử dụng riêng lẻ [39]. Trong khi đó, Tomsone et al. (2020) cũng chứng
minh rằng việc đóng gói polyphenol từ nước ép cải ngựa bằng maltodextrin riêng lẻ và
trong hỗn hợp với gum arabic cho hiệu quả bao gói cao và sản phẩm có khả năng hòa
tan tốt nhất so với sử dụng protein đậu nành và tinh bột [372].
3.3.2. Động học giải phóng polyphenol từ hạt vi bao
Mặc dù hàm lượng polyphenol tổng số không khác biệt đáng kể (Bảng 3.11), các
công thức vi bao gói có khả năng giải phóng các hợp chất polyphenol vào nước khác
nhau. Sau 5 phút phân tán trong nước cất, công thức T1 giải phóng lượng polyphenol
cao nhất (6,023 mg GAE/g) (Hình 3.18),
trong khi không có sự khác biệt đáng kể giữa
các công thức còn lại. Kết quả này cho thấy,
phương pháp vi bao gói sử dụng công thức T1
có thể giúp phân tán tốt hơn các thành phần
hoạt chất vào dung dịch hoặc nền sản phẩm
khi ứng dụng thực tế trong thực phẩm hoặc
dược phẩm.
Khả năng giải phóng các hợp chất
polyphenol từ sản phẩm vi bao T1 cao hơn so
với các công thức khác có thể được giải thích
qua các đặc điểm hình thái hạt trong ảnh SEM
(Hình 3.17). Các công thức kết hợp của vật
liệu vi bao (T2 đến T5) tạo ra các vi nang hình
cầu với độ co đồng đều các mặt, thì công thức
chỉ sử dụng RMD (T1) độ co chủ yếu xuất
hiện ở một bên. Điều này cho thấy lớp thành
của các vi nang T1 ít cứng hơn so với các công
thức còn lại, do đó dễ phân tán hoạt chất hơn,
dẫn đến giải phóng nhiều polyphenol hơn.
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của
Navarro-Flores et al. (2020) về đặc điểm giải
Ghi chú: Khác biệt thống kê giữa các nhóm thực nghiệm thực hiện theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05). p > 0,05 (ns), p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001(***)
phóng polyphenol của các vi nang sử dụng
121
maltodextrin 10 DE và hỗn hợp của nó với gum arabic, protein đậu nành và pectin.
Trong đó, maltodextrin và hỗn hợp của nó với gum arabic/protein đậu nành có khả năng
giải phóng polyphenol tốt hơn so với hỗn hợp của nó với pectin, protein hạt Cajanus
cajan [247]. Kết quả tương tự cũng được báo cáo bởi Ballesteros et al. (2017) trong
nghiên cứu sự kết hợp maltodextrin với các vật liệu khác nhau trong quá trình vi bao
polyphenol từ bã cà phê bằng phương pháp sấy phun và đông khô, cho thấy tốc độ giải
phóng polyphenol cao hơn từ vi nang sử dụng hỗn hợp maltodextrin và gum arabic (1:1)
thay vì sử dụng riêng lẻ [39]. Sự giải phóng tốt polyphenol từ các vi nang sử dụng hỗn
hợp maltodextrin và gum arabic có thể do kích thước hạt nhỏ, dẫn đến tổng diện tích
tiếp xúc bề mặt với dung môi lớn hơn [161].
K
R2
k
R2
k
R2
n
R2
RMD
K-value (s-1) 0,956 0,961 0,953 0,917 0,963
0,616 0,997 0,609 0,997 0,562 0,996 0,570 0,987 0,588 0,997
Ghi chú: RMD: maltodextrin kháng tiêu hóa, GA: gum Arabic, αCD: α-cyclodextrin, βCD: β- cyclodextrin, CD: -cyclodextrin.
Để mô tả động học giải phóng polyphenol từ các sản phẩm vi nang khác nhau, sử
dụng các mô hình phân tích bậc 0, bậc 1, Higuchi và Korsmeyer-Peppas. Các thông số
mô hình động học mô tả thử nghiệm giải phóng polyphenol in vitro được trình bày trong
phóng hoạt chất của các vi nang, với giá trị R2 cao hơn 0,93. Mô hình Higuchi là phù
hợp nhất để mô tả động học giải phóng polyphenol từ các vi nang T1 và T2, trong khi
mô hình bậc nhất phù hợp hơn đối với các vi nang T3, T4 và T5.
3.3.3. Hoạt tính hạ đường huyết in vitro của sản phẩm vi bao
3.3.3.1. Khả năng chống oxy hóa
Khả năng chống oxy hóa của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
được đánh giá thông qua khả năng trung hòa gốc tự do DPPH• và ABTS•+ (Bảng 3.13).
Kết quả cho thấy khả năng chống oxy hóa của các sản phẩm vi bao gói có liên quan chặt
chẽ đến mức độ các polyphenol được giải phóng. Cụ thể, hoạt tính trung hòa gốc tự do
DPPH• và ABTS•+ của vi nang T1 là cao nhất và vi nang T2 là thấp nhất.
122
T1
RMD
T2
RMD-GA
T3
RMD- αCD
T4
RMD- βCD
T5
1,46±0,03a 1,40±0,01a 1,31±0,03bc 1,42±0,04a
1,35 ± 0,03a 1,26 ± 0,01bc 1,26 ± 0,02bc 1,30 ± 0,03ab
RMD-CD
Ghi chú: Giá trị trung bình ± SEM (n = 3). Các ký tự khác nhau (a-c) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các công thức (theo cột) theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05).
Các nghiên cứu chỉ ra rằng, việc lựa chọn vật liệu thích hợp để bao gói các chiết
xuất từ thực vật đóng vai trò quan trọng trong việc lưu giữ các hoạt chất và hoạt tính
chống oxy hóa của sản phẩm [47, 194, 424]. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng,
maltodextrin là một trong những vật liệu hiệu quả và tiết kiệm chi phí nhất để bao gói
các phytochemical có hoạt tính sinh học nhưng khả năng nhũ hóa kém là hạn chế cơ bản
trong bao gói các hợp chất kỵ nước và dễ bay hơi. Do đó, hỗn hợp maltodextrin với gum
arabic và cyclodextrin cho thấy tác dụng bảo vệ và khả năng chống oxy hóa của vi nang
tốt hơn [60, 320]. Tuy nhiên, trái ngược với các kết quả nghiên cứu trên, khả năng chống
oxy hóa của các vi nang sử dụng kết hợp maltodextrin kháng tiêu hoá với gum arabic
và cyclodextrin cho thấy khả năng chống oxy hóa thấp hơn so với sử dụng RMD làm
vật liệu bao gói duy nhất. Các nghiên cứu trước đây giải thích rằng việc phối trộn các
vật liệu khác nhau giúp bảo vệ các hoạt chất tốt hơn do sự hình thành các lớp thành dày
và cứng hơn [148]. Tuy nhiên, điều này có thể ngăn cản sự giải phóng các chất chống
oxy hóa của các công thức kết hợp khi hoàn nguyên và do đó làm giảm hoạt tính chống
oxy hóa của chúng.
3.3.3.2. Khả năng ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột
Khả năng hạ đường huyết in vitro của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ được đánh giá thông qua hoạt tính ức chế hoạt động của α-amylase và α-
glucosidase. Kết quả trình bày trong Bảng 3.14 cho thấy dịch phân tán từ các hạt vi bao
có tác dụng ức chế cao đối với hoạt động của cả hai enzyme. Giá trị IC50 của hoạt tính
ức chế α-amylase từ 48,78 đến 59,56 μg/ml và α-glucosidase từ 22,2 đến 31,0 μg/ml.
Các vi nang T1 và T3 thể hiện hoạt tính ức chế α-amylase tương đương, cao nhất so với
123
các công thức còn lại (p < 0,05). Đối với khả năng ức chế hoạt động của α-glucosidase,
vi nang T1 có hiệu quả cao nhất, thấp nhất là T2, và các công thức còn lại không có khác
biệt có ý nghĩa thống kê.
T1
RMD
T2
RMD-GA
T3
RMD- αCD
T4
RMD- βCD
T5
RMD-CD
Ghi chú: Giá trị trung bình ± SEM (n = 3). Các ký tự khác nhau (a-c) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các công thức (theo cột) theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05).
Các kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu mô tả ở mục 3.1.2.3. (Trang 75)
cho thấy, cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ thể hiện khả năng ức chế tốt đối với các
enzyme tiêu hóa tinh bột (Bảng 3.4), đồng thời, cũng cho thấy mối tương quan đáng kể
với hoạt tính chống oxy hóa của các sản phẩm vi bao được trình bày trong Bảng 3.13.
Các kết quả này nhất quán với các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng có mối tương quan
chặt chẽ giữa hoạt tính ức chế enzyme và chống oxy hóa của sản phẩm vi bao cao chiết
giàu polyphenol, thành phần thể hiện hoạt tính của sản phẩm [228, 314]. Ngoài ra, việc
sử dụng maltodextrin riêng lẻ hoặc kết hợp với các chất mang khác giúp duy trì hiệu quả
hoạt tính chống đái tháo đường của chiết xuất thực vật được bao gói [74, 392, 441]. Các
kết quả nghiên cứu này cho thấy maltodextrin kháng tiêu hóa rất phù hợp để vi bao gói
các thành phần hoạt chất từ cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ, tạo sản phẩm vi bao có
đặc tính chống oxy hóa và kiểm soát đường huyết cao trong điều kiện in vitro.
3.3.4. Khả năng kiểm soát đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây
Trâm vỏ đỏ trên mô hình cá ngựa vằn
3.3.4.1. Tính an toàn của sản phẩm vi bao
Tính an toàn của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ được đánh giá
trên mô hình ấu trùng cá ngựa vằn và cá trưởng thành nhằm xác định ngưỡng nồng độ
an toàn cho các thử nghiệm về khả năng kiểm soát đường huyết trên mô hình in vivo.
Trong đó, khả năng gây độc trên ấu trùng cá ngựa vằn được đánh giá theo quy trình mô
124
tả bởi OECD 203 và độc tính cấp bằng đường uống được xác định dựa trên hướng dẫn
của OECD 423. Kết quả thể hiện trên Bảng P4.1 và Bảng P4.2 (Phụ lục P.4.2)
Bảng P4.1 cho thấy sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ thể hiện tính
an toàn đối với ấu trùng cá ngựa vằn ở nồng độ thử nghiệm từ 300 mg/L trở xuống. Từ
nồng độ 350 mg/L trở lên bắt đầu có tác dụng bất lợi và gây chết 100% cá thể ở nồng
độ 450 mg/L. Giá trị LD50 được xác định là 376,67 mg/L, tương đương nồng độ cao
chiết thô không được vi bao gói là 18,83 mg/L. Giá trị này tương đương với LD50 của
cao chiết thô được xác định ở mức 18,75 mg/L (Bảng P2.1). Có thể thấy, vi bao gói không
làm thay đổi đáng kể tính an toàn của cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ đối với ấu trùng
cá ngựa vằn.
Bảng P4.2 cho thấy các sản phẩm vi bao không thể hiện tính độc đối với cá ngựa
vằn trưởng thành ở nồng độ thử nghiệm giới hạn, 5.000 mg/kg theo OECD 423. Tất cả
cá thử nghiệm đều thể hiện trạng thái khỏe mạnh, không có bất kỳ bất thường nào được
ghi nhận ở nồng độ. Theo hướng dẫn của OECD 423, các sản phẩm vi bao cao chiết vỏ
thân cây Trâm vỏ đỏ được phân vào nhóm không xác định được tính độc ở nồng độ giới
hạn (Unclassified group), cho thấy các sản phẩm vi bao đều có tính an toàn cao đối với
cá ngựa vằn được thử nghiệm trong nghiên cứu này.
Kết quả này phù hợp với đánh giá về độc tính cấp của cao chiết vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ ở trạng thái không được vi bao gói (Bảng P2.1). Các kết quả này cũng cho thấy,
sản phẩm vi bao gói có tính an toàn cao, phù hợp trong các thử nghiệm trên cá ngựa vằn.
Trong đó, các nồng độ thực nghiệm cho ăn bằng đường uống (75 mg/kg khối lượng cá)
và tác động thông qua phương pháp ngâm (20 mg/L) là an toàn đối với cá ngựa vằn.
3.3.4.2. Khả năng chống gia tăng đường huyết sau ăn của sản phẩm vi bao
Mức độ kiểm soát đường huyết sau ăn của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây
Trâm vỏ đỏ theo công thức vi bao gói với maltodextrin kháng tiêu hóa (T1) trên cá ngựa
vằn được mô trả trên Hình 3.19. Kết quả cho thấy các nghiệm thức bổ sung cao chiết
vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (CE), maltodextrin kháng tiêu hóa (RMD), bột vi bao (MEP),
và acarbose đều làm chậm đáng kể sự gia tăng đường huyết sau ăn so với nghiệm thức
đối chứng chỉ sử dụng maltodextrin làm nguồn cung cấp đường bột (MD) (p < 0,0001).
Hơn nữa, có sự khác biệt đáng kể về thời gian mỗi nhóm đạt mức đường huyết cực đại
sau ăn (Hình 3.19). Cụ thể, ở các nghiệm thức bổ sung acarbose, RMD và CE cho thấy
125
mức đường huyết sau ăn đạt cao nhất sau 60 phút. Trong khi đó, nghiệm thức bổ sung
MEP đạt mức đường huyết cao nhất sau 30 phút.
Ghi chú: MD, RMD, ACA, CE, và MEP lần lượt là nghiệm thức chỉ sử dụng maltodextrin (đối chứng âm), nghiệm thức đối chứng bổ sung maltodextrin kháng tiêu hóa, acarbose, cao chiết thô, và sản phẩm vi bao cao chiết. Giá trị trung bình ± SEM (n = 5). Các ký tự khác nhau (a-d) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm trong cùng một thời điểm và các ký tự khác nhau (A-D) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong cùng một nhóm theo thời gian theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05).
Tác dụng rõ rệt của CE và acarbose đạt được sau 30 phút cho ăn với mức đường
huyết tương đương nhau và thấp hơn đáng kể so với các nghiệm thức còn lại. Tuy nhiên,
sau 60 phút, khác biệt đáng kể giữa hai nghiệm thức trên được quan sát, trong đó
acarbose cho hiệu quả cao hơn so với CE (p < 0,0001). Trong khi đó, nghiệm thức bổ
sung MEP thể hiện hoạt tính thấp hơn CE và acarbose ở thời điểm 30 phút (p < 0,0001).
Tuy nhiên, hiệu quả giảm đường huyết sau ăn thể hiện vượt trội hơn so với các nghiệm
thức còn lại sau 60 phút (p < 0,0001). Kết quả này phù hợp với mô hình động học giải
phóng polyphenol từ hạt vi bao cao chiết. Khả năng giải phóng dần dần các hoạt chất
trong 30 phút đầu tiên có thể đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các thành phần
hoạt tính trước tác động gây suy giảm hoạt tính của hệ thống tiêu hoá, từ đó nâng cao
hiệu quả kiểm soát đường huyết sau ăn. Khả năng chống lại tác động thủy phân do
enzyme tiêu hóa của maltodextrin kháng tiêu hoá đã được chứng minh có hiệu quả trong
126
việc kiểm soát đường huyết sau ăn [211, 251]. Nghiên cứu này cũng cho thấy RMD có
thể giúp chống lại sự gia tăng đường huyết sau ăn ở mức có thể so sánh với CE và
acarbose (Hình 3.19). Tuy nhiên, khác biệt đáng kể giữa MEP và RMD, cũng như CE,
chứng tỏ tác dụng bổ trợ của RMD đối với CE trong việc kiểm soát đường huyết sau ăn.
Trong đó, các tương tác giữa RMD và các polyphenol giải phóng chậm theo thời gian
đã góp phần nâng cao hoạt tính chống lại sự gia tăng đường huyết sau ăn đáng chú ý của
MEP so với thuốc kiểm soát đái tháo đường (acarbose).
3.3.4.3. Hiệu quả hạ đường huyết của sản phẩm vi bao trên mô hình cá ngựa vằn đái
tháo đường
Kết quả ở Hình 3.20 cho thấy sự giảm đáng kể mức đường huyết lúc đói ở cá ngựa
vằn đái tháo đường được điều trị với cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (CE) và sản phẩm
vi bao cao chiết (MEP). Hiệu quả tác động của CE và MEP được quan sát thấy sau 5
ngày tác động với mức đường huyết giảm đáng kể so với nhóm không điều trị (p <
0,0001) và mức đường huyết giảm đều về mức bình thường, tương đương cá khỏe mạnh
Ghi chú: NOR, DIA, MET, CE, và MEP(T1) lần lượt là các nghiệm thức cá khỏe mạnh, các đái tháo đường không điều trị (đối chứng âm), cá đái tháo đường điều trị với metformin (đối chứng dương), cao chiết thô và sản phẩm vi bao cao chiết Trâm vỏ đỏ. Giá trị trung bình ± SEM (n = 5). Các ký tự khác nhau (a-d) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm trong cùng một thời điểm và các ký tự khác nhau (A-D) mô tả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong cùng một nhóm theo thời gian theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05).
127
sau 20 ngày tác động. Hiệu quả tác động của CE và MEP chậm hơn khi so sánh với
metformin (thuốc điều trị đái tháo đường thông dụng), với giá trị đường huyết về mức
ổn định chỉ sau 5 ngày tác động. Không có khác biệt đáng kể giữa nghiệm thức sử dụng
MEP so với CE, tuy nhiên, phương pháp điều trị với MEP cho hiệu quả điều trị ở nồng
độ tương đương thấp hơn so với CE. Cụ thể, liều dùng 20 mg/L của MEP có giá trị tương
đương liều dùng CE chỉ 1 mg/L. Kết quả này chỉ ra rằng, việc vi bao cao chiết vỏ thân
cây Trâm vỏ đỏ có thể giúp nâng cao hiệu quả kiểm soát đường huyết lúc đói trên mô
hình cá ngựa vằn đái tháo đường. Kết quả này phù hợp với các phân tích tổng hợp được
báo cáo bởi Chen et al. (2019) cho rằng, vi bao gói các hợp chất polyphenol bằng phương
pháp sấy phun có thể giúp nâng cao hiệu quả điều trị đái tháo đường tuýp 2 [84]. Hơn
nữa, việc vi bao gói các polyphenol trong các vật liệu phù hợp giúp bảo vệ các hoạt chất
này trước tác động suy thoái trong đường tiêu hóa và tạo điều kiện giải phóng hoạt chất
trong các điều kiện cụ thể giúp phát huy hiệu quả mà cao chiết ở trạng thái tự do không
thể đạt được [25].
3.3.5. Tác động của sản phẩm vi bao lên khả năng điều hòa biểu hiện gene liên quan
kiểm soát đường huyết trên mô hình cá ngựa vằn
3.3.5.1. Tác động điều hòa biểu hiện gene liên quan sinh tổng hợp chất béo
Hình 3.21 cho thấy sản phẩm vi bao cao chiết (MEP) có tác động đến điều hòa biểu
hiện các gene liên quan quá trình sinh tổng hợp chất béo ở cá đái tháo đường. Trong đó,
MEP gia tăng biểu hiện gene SREBF1, FASN và giảm biểu hiện gene ACC1. Mức độ tác
động có sự khác biệt đáng kể đối với metformin và cao chiết không được vi bao gói (CE).
Mức độ tác động đến biểu hiện gene SREBF1 của CE và MEP cao hơn đáng kể so
với metformin (p < 0,01), trái ngược với tác động của EAF (Hình 3.3). Trong đó, mức
độ tác động của MEP thấp hơn so với CE. Kết quả tương tự được quan sát đối với gene
FASN. Trong khi đó, mức độ điều hòa giảm biểu hiện gene ACC1 của MEP tương đương
với metformin và thấp hơn CE, ở mức tương đương cá bình thường (p > 0,05). Kết quả
này cho thấy sự khác biệt đáng kể trong điều hòa biểu hiện các gene liên quan đến quá
trình sinh tổng hợp chất béo của CE so với EAF, sự khác biệt có thể do tác động của quá
trình trích ly phân đoạn. Đáng chú ý, quá trình vi bao gói CE bằng maltodextrin kháng
tiêu hóa đã làm thay đổi đáng kể mức độ tác động biểu hiện gene. Sự tương đồng trong
chiều hướng kiểm soát biểu hiện gene giữa CE và MEP cho thấy hiệu quả tác động chủ
yếu đến từ thành phần hoạt chất CE được bao gói trong MEP. Tuy nhiên, sự khác biệt
128
trong mức độ cho thấy ảnh hưởng của các thành phần khác tham gia vào quá trình vi
bao gói CE, trong đó phải kể đến tương tác giữa vật liệu vi bao gói và khả năng kiểm
soát giải phóng hoạt chất.
Ghi chú: NOR, và DIA lần lượt là nhóm cá bình thường và cá đái tháo đường. MET, CE và MEP lần lượt là nhóm cá đái tháo đường được xử lý với metformin 20 µM, cao chiết thô (10 mg/L), và bột vi bao cao chiết (20 mg/L). SREBF1: Sterol regulatory element-binding protein 1; ACC1: Acetyl-CoA carboxylase alpha; FASN: Fatty acid synthase. Khác biệt thống kê giữa các nhóm thực nghiệm thực hiện theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05). p > 0,05 (ns), p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***), p < 0,0001 (****)
3.3.5.2. Tác động biểu hiện gene insulin và thụ thể insulin
và các thụ thể (INSRA1 và INSRB1) của sản phẩm vi bao cao chiết (MEP) sau 20 ngày
tác động. Sự khác biệt thể hiện trong mức độ điều hòa biểu hiện gene giữa các nhóm
điều trị và giữa các gene. Cụ thể, nhóm tác động MEP có mức điều hòa biểu hiện gene
INS tương đương với cao chiết (CE) và cá đối chứng khỏe mạnh (p > 0,05). Mức độ
điều hòa biểu hiện tương đương giữa MEP và CE cũng ghi nhận đối với gene INSRA1,
trong đó các nhóm điều trị với hai tác nhân này duy trì mức độ biểu hiện gene INSRA1
ở mức thấp hơn so với nhóm điều trị với metformin, mức độ biểu hiện tương đương cá
đối chứng bình thường (p > 0,05). Đáng chú ý, MEP và CE làm gia tăng đáng kể biểu
hiện gene INSRB1 so với đối chứng (p < 0,001), trong đó mức độ biểu hiện của nhóm
129
điều trị với MEP thấp hơn đáng kể so với CE (p < 0,01) nhưng duy trì mức độ tương
đương metformin (p > 0,05).
Các kết quả trên cho thấy tác động điều hòa biểu hiện gene INS và INSRA1 của MEP
và CE có quy luật tương đồng với tác động của EAF (mô tả ở Hình 3.4). Tuy nhiên,
MEP và CE có thể duy trì mức điều hòa INS ở mức tương đương cá bình thường trong
khi EAF có mức điều chỉnh thấp hơn đáng kể. Điều này cho thấy, sự thay đổi thành phần
hoạt chất do trích ly cũng tác động đáng kể đến điều hòa biểu hiện gene INS, hơn nữa
MEP và CE có thể kiểm soát tốt hơn nhằm duy trì mức insulin thuận lợi, tránh suy giảm
quá thấp. Mức điều hòa biểu hiện INSRA1 của MEP và CE tương đương so với EAF,
mức giảm tốt đường huyết của cá đái tháo đường (Hình 3.2 và Hình 3.20) cho thấy khả
năng gia tăng hiệu quả kết hợp giữa insulin và thụ thể của nó trong việc điều hòa đường
huyết ở cá đái tháo đường. Trong khi đó, sự gia tăng mức độ biểu hiện gene INSRB1 của
MEP và CE so với EAF có thể có nguyên nhân từ sự khác nhau trong thành phần hoạt
chất giữa CE và EAF (Bảng 3.8). Đáng chú ý, mức độ điều hòa gene INSRB1 của MEP
130
thấp hơn CE cho thấy khả năng chống lại sự gia tăng biểu hiện thái quá của CE và có
thể giúp điều chỉnh mức độ tác động của CE ở mức ổn định và an toàn hơn.
3.3.5.3. Tác động biểu hiện gene liên quan đến hấp thu và chuyển hóa glucose
Hình 3.23 cho thấy sản phẩm vi bao cao chiết (MEP) và cao chiết (CE) cho thấy
hiệu quả tác động biểu hiện gene SGLT1 và GLP-1 ở cá ngựa vằn. Trong đó, MEP và
CE điều hòa biểu hiện gene SGLT1 ở cá đái tháo đường tương đương với nhóm cá bình
thường (p > 0,05), ngược lại với metformin. MEP và CE đồng thời tăng mức độ biểu
hiện gene GLP-1 của cá đái tháo đường, ở mức thấp hơn metformin (p < 0,001). Trong
đó mức độ tác động của MEP thấp hơn đáng kể so với CE (p < 0,0001). Kết quả này
cho thấy khả năng điều hòa biểu hiện gene của MEP và CE tương đồng với khả năng
điều hòa của cao chiết phân đoạn ethyl acetate (Hình 3.5). Trong đó, mức độ điều hòa
SGLT1 của MEP ở mức tương đương với cá bình thường cho thấy hiệu quả trong khả
năng tái lập cân bằng hấp thu glucose vào máu thay vì ức chế quá mạnh hoạt động của
SGLT1. Bên cạnh đó, mức độ điều hòa tăng GLP-1 của MEP ở mức thấp hơn đáng kể
so với CE và metformin (p < 0,0001) cho thấy sản phẩm vi bao gói có thể giúp giảm bớt
131
các tác dụng phụ tương tự metformin [235, 362], có thể có do sự tăng điều hòa biểu hiện
gene GLP-1 của CE.
Nhìn chung, sản phẩm vi bao cao chiết có khả năng điều hòa biểu hiện một số gene
liên quan đến quá trình tổng hợp chất béo, hoạt động của insulin, hấp thu và chuyển hóa
đường ở cá ngựa vằn đái tháo đường. Kết hợp với các kết quả về khả năng kiểm soát
đường huyết sau ăn (Hình 3.19) và giảm đường huyết ở cá đái tháo đường (Hình 3.20)
cho thấy hiệu quả trong cải thiện trao đổi chất và tái thiết lập ổn định đường huyết liên
quan đến điều hòa biểu hiện gene của MEP. Đáng chú ý, mức độ tác động biểu hiện một
số gene như SREBF1, FASN, INSRB1, và GLP-1 thấp hơn CE cho thấy MEP có thể giúp
kiểm soát tác động của cao chiết ổn định và an toàn hơn. Kết quả này phù hợp với các
nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt đáng kể giữa hiệu quả tác động của các hợp chất
polyphenol ở trạng thái tự do với trạng thái được vi bao gói đối với các quá trình trao
đổi chất nói chung và các hoạt tính chống đái tháo đường nói riêng [84]. Do đó, vi bao
gói bằng kỹ thuật sấy phun sử dụng maltodextrin kháng tiêu hóa có thể giúp kiểm soát
hiệu quả tác động chống đái tháo đường của cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ ở cấp độ
biểu hiện gene, từ đó có thể giúp phát triển các ứng dụng hiệu quả và an toàn hơn.
3.3.6. Khả năng kháng viêm của sản phẩm vi bao
3.3.6.1. Khả năng chống biến tính protein
của CE, MEP và Ibuprofen (p < 0,001). Trong đó, MEP có tỷ lệ ức chế biến tính tối đa
là 43% ở nồng độ 1,0 mg/mL, cao hơn đáng kể so với CE ở nồng độ tương đương 0,05
mg/mL (34,61 %, p < 0,01) và ibuprofen ở nồng độ 1,0 mg/L (36 %, p < 0,05). Tương
tự như CE, kết quả cho thấy cho sự suy giảm hoạt tính chống biến tính protein của MEP
khi nồng độ tăng lên 2 mg/mL, mức độ ức chế biến tính đạt 35,64%, cao hơn đáng kể
so với hoạt tính của CE tại nồng độ tương đương 0,1 mg/mL (31,85%).
Sự tương đồng trong mối tương quan thuận giữa hoạt tính và nồng độ của MEP và
CE cho thấy hiệu quả kháng viêm của sản phẩm vi bao chủ yếu do thành phần các hợp
chất polyphenol, có hoạt tính kháng viêm và chống biến tính protein cao đã được báo
cáo [98, 241, 248, 279]. Sự gia tăng hoạt tính chống biến tính protein của MEP so với
CE có thể liên quan đến khả năng kiểm soát giải phóng hoạt chất của hạt vi bao. Trong
đó, động học tương tác của polyphenol từ hạt vi bao với protein có thể được kiểm soát
tốt hơn với trạng thái tự do, dẫn đến gia tăng hoạt tính. Kết quả nghiên cứu này lần đầu
132
tiên cho thấy hiệu quả nâng cao hoạt tính kháng viêm của cao chiết vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ thông qua phương pháp vi bao gói và đây là kết quả rất đáng chú ý nhằm phát
triển liệu pháp thảo dược mới trong điều trị đái tháo đường thông qua kiểm soát quá
trình viêm.
3.3.6.2. Khả năng bảo vệ ấu trùng cá ngựa vằn trước tác nhân gây viêm
Các bằng chứng khoa học cho thấy cá ngựa vằn là mô hình phù hợp để làm sáng tỏ
cơ chế phân tử của phản ứng viêm, đồng thời giúp sàng lọc hiệu quả các loại thuốc
kháng viêm mới. Việc ấu trùng cá ngựa vằn tiếp xúc với CuSO4 dẫn đến tăng stress oxy
hóa, di chuyển bạch cầu trung tính và tăng điều hòa các gene gây viêm, do đó, đây là tác
nhân gây viêm hiệu quả trên các mô hình ấu trùng cá ngựa vằn [411, 428]. Trong nghiên
cứu này, hoạt tính kháng viêm in vivo của cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (CE) và sản
phẩm vi bao cao chiết này (MEP) thể hiện qua khả năng bảo vệ ấu trùng cá ngựa vằn
trước tác nhân gây viêm bằng CuSO4 sau 2, 4, 6, và 24 giờ được mô tả trên Hình 3.25.
Ấu trùng sau khi xử lý với CuSO4 20 µM dẫn đến tình trạng viêm gia tăng rõ rệt từ
14% (sau 2 giờ) đến 56% sau 24 giờ. Thuốc kháng viêm không steroid (a nonsteroidal
anti-inflammatory drug, NSAID, ibuprofen), cho thấy hiệu quả kháng viêm sau 4 giờ
133
điều trị với liều 2 mg/L. Tỷ lệ viêm sau 24 giờ chỉ ở mức 24%, thấp hơn đáng kể so với
đối chứng không điều trị (p < 0,01). Kết quả này phù hợp với các báo cáo trước đây nêu
bật hiệu quả của ibuprofen trong việc giảm viêm do CuSO4 gây ra [207].
Ghi chú: CE và MEP lần lượt là nhóm cá xử lý với Cao chiết thô Trâm vỏ đỏ và Sản phẩm vi bao cao chiết. Giá trị trung bình ± SEM (n = 3). Khác biệt thống kê giữa các nhóm thực nghiệm thực hiện theo Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test ( = 0,05). p > 0,05 (ns), p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***).
Hình 3.25 cho thấy có sự phụ thuộc giữa liều lượng và thời gian điều trị trong hoạt
động kháng viêm của CE. Tình trạng viêm của ấu trùng giảm đáng kể sau 2 giờ điều trị
ở liều 5 mg/L và 7,5 mg/L. Trong khi hoạt tính ở liều 7,5 mg/L giảm theo thời gian, các
134
liều còn lại có hoạt tính nhất quán với nghiệm thức đối chứng sử dụng Ibuprofen 2 mg/L
(p < 0,05) sau 24 giờ tác động. Kết quả này cho thấy việc sử dụng CE ở liều cao có thể
ảnh hưởng đến hiệu quả kháng viêm của cao chiết. Trong khi đó, các nghiệm thức điều
trị với MEP ở nồng độ tương đương CE ở 2 mg/L, 5 mg/L, 7,5 mg/L (lần lượt là 40
mg/L, 100 mg/L, và 150 mg/L) thể hiện mô hình tác động khác so với CE. Cụ thể, hoạt
tính kháng viêm thể hiện rõ rệt sau 4 giờ tác động (chậm hơn 2 giờ so với CE), nhưng
hiệu quả điều trị ở tất cả các liều duy trì ở mức tương tự Ibuprofen 2 mg/L trong toàn bộ
thời gian tác động đến 24 giờ (Hình 3.25). Kết quả này cho thấy việc kiểm soát giải
phóng các polyphenol từ hạt vi bao có thể giúp ổn định tác dụng kháng viêm của cao
chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ. Một số nghiên cứu chứng minh tiềm năng kháng viêm
của một số cây thuốc thuộc Chi Trâm [27, 78, 146, 153]. Tuy nhiên, giải pháp hiệu quả
nhằm nâng cao khả năng ứng dụng của chúng còn chưa được công bố nhiều. Do đó, kết
quả thu được trong nghiên cứu này không chỉ mở rộng các hiểu biết về khả năng kháng
viêm của cao chiết từ Trâm vỏ đỏ mà còn cho thấy tiềm năng cao của quá trình vi bao
gói trong việc nâng cao hiệu quả ứng dụng, giảm tác dụng phụ tiềm ẩn.
3.3.7. Sự khác biệt về liên kết hóa học trong sản phẩm vi bao cao chiết
Phân tích phổi hồng ngoại (Fourier transform infrared, FTIR) của maltodextrin
kháng tiêu hóa (RMD), cao chiết thô Trâm vỏ đỏ (CE) và sản phẩm vi bao cao chiết
(MEP) cho thấy sự khác biệt trong các liên kết trước và sau khi vi bao gói (Hình 3.26)
Đối với RMD, phổ có peak rộng tại 3309 cm-1 đến từ dao động O-H stretching liên
quan đến các đơn vị glucose và fructose trong khung phân tử polysaccharide. Peak trong
khoảng 2929 cm-1 tương ứng với dao động stretching C-H của nhóm -CH2- [203], và
peak 1647 cm-1 tương ứng với dao động O-H bending của hơi ẩm hấp thụ trên tinh bột
[167]. Peak hấp thu tại 1416,41 cm-1 là dao động stretching của liên kết C-H, và peak
1366,14 cm-1 là dao động bending của liên kết C-O. Các peak 1151,18; 1076,73; và
1031,33 cm-1 là các do động của C-O stretching [310]. Các peak 924,56; 859,20; và
765,56 cm-1 là các dao động của khung pyranoid [150, 167, 205, 348]. Các peak này
phù hợp với các báo cáo trước đây về các phân tử cấu thành chính của maltodextrin
kháng tiêu hóa [310].
Phổ của CE thể hiện các peak đơn tại 3679,07 và 3327,23 cm-1, biểu thị cho các dao
động stretching của các nhóm polymetric hydroxyl (O-H), và các liên kết H-, đặc trưng
của các hợp chất polyphenol [348, 403]. Peak rộng xung quanh 3077 cm-1 đại diện cho
135
dao động stetching của nhóm =C-H stretching trong các hydrocarbon thơm và không
bão hòa. Các peak tại 2881,17 và 2779,06 cm-1 biểu thị các CH đối xứng và bất đối xứng
trong dao động stretching của nhóm -CH3 và –CH2– trong các hợp chất aliphatic hoặc -
CH3 liên kết với O hoặc N [348]. Các peak 2279,40 và 1986,26 cm-1 lần lượt đại diện
cho các nhóm chứng năng aliphatic cyanide/nitrile và isothiocyanate (-NCS) [68, 348].
Peak 1714 cm-1 biểu thị cho dao động C=O stretching của nhóm -COOH. Peak nhọn của
1599,26 và 1529,79 cm-1 tương ứng với dao động C=C-stretching trong khi 824,87 và
767.23 cm-1 biểu thị cho dao động C-H bending của các vòng thơm [68, 348, 403]. Các
peak nhọn 1450,89 và 1371,39 cm-1 biểu thị các dao động C-H bending của CH3. Các
peak 1233,57; 1100,06 và 1037,39 lần lượt biểu thị cho các dao động C-O stretching
của các nhóm alkyl aryl ether, secondary alcohol, và primary alcohol, tất cả đều liên
quan đến các hợp chất polyphenol [68, 127, 348, 403].
So sánh phổ FT-IR của MEP với RMD cho thấy sự hiện diện của các peak mới tại
3733,07; 2365,06 và 2301,36 cm-1. Peak hấp thụ ở 3733,07 cm-1 có thể tương ứng với
dao động O-H stretching của các hợp chất polyphenol, chuyển dịch từ peak 3679 cm-1
trong phổ của CE. Khoảng hấp thụ từ 2365,05 đến 2301,36 cm-1 có thể biểu thị cho các
liên kết carbon dioxide, thường được tìm thấy ở các mẫu thu được từ điều kiện áp suất
cao với khoảng hấp thụ từ 2400 đến 2300 cm-1 [302, 335]. Đáng chú ý, sự biến mất của
peak 1647 cm-1 cho thấy quá trình vi bao gói bằng sấy phun có thể giúp giảm thêm độ
136
ẩm của mẫu. Ngoài ra, sự chuyển dịch dao động C-H stretching đến số sóng cao ở tại
2935,53 và 1422,19 cm-1, trong khi dao động -OH stretching chuyển dịch đến số sóng
thấp hơn tại 3306,65 cm-1, kết hợp với sự thay đổi đáng kể cường độ của các peak này
so với RMD. Các kết quả này cho thấy sự tương tác đáng chú ý giữa các polyphenol
trong CE với RMD trong quá trình vi bao gói bằng sấy phun. Các tương tác này có khả
năng đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát giải phóng các polyphenol từ hạt vi bao,
từ đó tác động đến sự gia tăng đáng chú ý hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm và khả
năng kiểm soát đường huyết in vitro và in vivo của cao chiết trong điều kiện vi bao gói
so với trạng thái tự do, thể hiện ở Bảng 3.15.
phun giúp gia tăng hoạt tính sinh học và khả năng kiểm soát đường huyết so với cao
chiết không vi bao gói. Cụ thể, hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua khả năng trung hòa
gốc tự do DPPH• và ABTS•+ của sản phẩm vi bao tăng lên đáng kể so với cao chiết thô
(lần lượt 2,16 và 1,98 lần), trong đó hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH• sau khi vi bao
cao hơn cao chiết phân đoạn ethyl acetate 1,8 lần. Bên cạnh đó, khả năng kháng viêm
in vitro thể hiện qua khả năng chống biến tính protein tăng lên 8,75 % so với cao chiết
thô, tuy vẫn thấp hơn cao phân đoạn ethyl acetate 11,07%, nhưng đây vẫn là mức tăng
đáng kể sau khi vi bao gói. Khả năng ức chế α-amylase tăng lên đáng kể so với cao chiết
thô (2,23 lần) cho thấy vật liệu vi bao gói có thể đã thay đổi tác động của các polyphenol
với nhau và giữa polyphenol đối với α-amylase từ đó gia tăng hoạt tính ức chế. Đáng
chú ý, hiệu quả kiểm soát sự gia tăng đường huyết sau ăn của sản phẩm vi bao cao hơn
đáng kể so với cao chiết thô và cao chiết phân đoạn ethyl acetate, thể hiện ở mức độ gia
tăng đường huyết cũng như nồng độ tác động tương đương cao chiết. Mức độ gia tăng
đường huyết sau ăn 60 phút ở thực nghiệm sử dụng bột vi bao cao chiết ở chỉ ở mức
0,56 lần so với cao chiết thô và 0,61 lần so với cao phân đoạn ethyl acetate, trong khi
nồng độ tác động của bột vi bao chỉ tương đương cao chiết thô 2,81 mg /kg khối lượng
cá. Tương tự, hiệu quả kiểm soát đường huyết lúc đói ở cá ngựa vằn đái tháo đường sau
5 ngày tác động của bột vi bao là tốt hơn so với cao chiết thô trong khi nồng độ tác động
chỉ tương đương cao chiết thô 0,75 mg/L. Các kết quả trên cho thấy rằng, vi bao gói cao
chiết thô vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ bằng kỹ thuật sấy phun có thể giúp gia tăng hoạt tính
và sinh khả dụng của cao chiết thô một cách hiệu quả.
137
531,64 ± 3,64
904,11 ± 2,23
20,06 ± 0,75
Năng suất tải 75%
TPC (mgGAE/g)
1,26 ± 0,01
1,50 ± 0,05
Tăng
DPPH (gTE/g)
0,102 ± 0,001 (tương đương 2,72 gTE/g CE)
1,40 ± 0,04
3,27 ± 0,06
Tăng
ABTS (gTE/g)
0,104 ± 0,004 (tương đương 2,77 gTE/g CE)
34,61±0,03
54,43±0,12
43,36 ±0,62
Tăng
Chống biến tính protein (% ức chế)
4,19 ± 0,01
12,32 ± 0,01
Tăng
50,13±0,44 (tương đương CE 1,88 µg/mL)
Ức chế α-amylase (IC50, µg/mL)
0,41 ± 0,01
0,43 ± 0,01
Giảm
22,24 ± 0,53 (tương đương CE 0,834 µg/mL)
Ức chế α-glucosidase (IC50, µg/mL)
248,00 ± 7,93
225,80 ± 9,31
Tăng
Đường huyết sau ăn 60 phút (mg/dL)
138,20 ± 2,63 (tương đương CE 2,81 mg /kg)
88,00 ± 5,43
60,20 ± 2,63
Tăng
Đường huyết lúc đói 5 ngày (mg/dL)
79,60 ± 4,40 (tương đương CE 0,75 mg /L)
138
3.3.8. Các con đường tác động kiểm soát đường huyết trên mô hình cá ngựa vằn
của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ
Kiểm soát đường huyết là một mục tiêu quan trọng trong phòng trị đái tháo đường,
trong đó, kiểm soát sự gia tăng đường huyết sau ăn và ổn định đường huyết lúc đói ở
mức an toàn là yêu cầu bắt buộc. Sự gia tăng đường huyết trong đái tháo đường là kết
quả của các rối loạn chuyển hóa phức tạp, liên quan đến nhiều quá trình và các cơ quan
khác nhau trong cơ thể sống. Để đánh giá khả năng kiểm soát đường huyết của sản phẩm
vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ, nghiên cứu này đã tiến hành đánh giá khả năng
tiếp cận đa mục tiêu dựa trên các hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, ức chế enzyme
tiêu hóa tinh bột, và khả năng điều hòa biểu hiện các gene liên quan đến kiểm soát đường
huyết trên mô hình cá ngựa vằn của sản phẩm vi bao cao chiết, đồng thời minh chứng
bằng các hoạt tính của cao chiết không vi bao gói. Dựa trên các kết quả thực nghiệm thu
được, nghiên cứu này đề xuất một số con đường tác động của sản phẩm vi bao cao chiết
vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ trong kiểm soát đường huyết trên mô hình cá ngựa vằn, mô tả
trên Hình 3.27.
đường huyết sau ăn và ổn định đường huyết lúc đói ở mức an toàn nhờ tác động đa mục
tiêu dựa trên hoạt tính của sản phẩm vi bao và sự kiểm soát giải phóng hoạt chất. Cụ
thể, sản phẩm vi bao có thể kiểm soát lượng đường xâm nhập vào máu thông qua tác
động ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột (giảm mức độ chuyển hóa tinh bột thành đường
glucose), kiểm soát lượng đường xâm nhập vào máu qua việc giảm biểu hiện gene
SGLT1 (giảm lượng đường đi vào máu qua thành ruột), đồng thời tác động mức độ hấp
thu thức ăn thông qua cải thiện tín hiệu incretin bằng cách tăng biểu hiện gene GLP-1
(giảm cảm giác đói, giảm hấp thụ thức ăn). Bên cạnh đó, sản phẩm vi bao có thể cải
thiện hiệu quả chuyển hóa glucose thông qua việc tăng độ nhạy và giảm kháng insulin,
từ đó có thể cải thiện mức độ hấp thu và chuyển hóa glucose ở các mô/cơ quan. Mục
tiêu này có thể đạt được thông qua khả năng chống oxy hóa và kháng viêm, điều hòa
quá trình chuyển hóa giúp giảm tích lũy và giảm viêm do chất béo, hay tăng hiệu quả
kết hợp insulin và thụ thể thông qua điều hòa biểu hiện gene. Chi tiết cụ thể các con
đường tác động cần được xác định ở các nghiên cứu sâu hơn trên các mô hình phù hợp,
tuy nhiên, các dữ liệu từ nghiên cứu này có thể minh chứng cho các con đường nêu trên.
Do đó, vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ là con đường phù hợp nhằm phát triển
sản phẩm phòng chống đái tháo đường đa mục tiêu một cách an toàn và hiệu quả.
139
140
3.4. Xây dựng mô hình dự đoán thời hạn bảo quản của sản phẩm vi bao
Mối tương quan thuận giữa hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế enzyme tiêu hoá tinh
bột với hàm lượng polyphenol tổng số đã được khẳng định trong các nghiên cứu trước
đây [219, 260]. Kết quả tương đồng cũng đã được mô tả trong nghiên cứu này đối với
Trâm vỏ đỏ (Mục 3.2.3. ). Các sản phẩm chứa các thành phần hoạt chất trong quá trình
bảo quản có sự hao hụt về khối lượng và hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học
như các hợp chất polyphenol, carotenoid, vitamin… do tác động của điều kiện môi
trường gồm ánh sáng, oxy, nhiệt độ, độ ẩm [284]. Vì vậy, các phương pháp bảo quản
nhằm ổn định các hợp chất trong cao chiết cần được nghiên cứu để dự đoán thời hạn
bảo quản của sản phẩm ở các điều kiện khác nhau.
Các nghiên cứu về thời hạn bảo quản của các sản phẩm có chứa các hoạt chất thường
kéo dài và tốn kém, nên thử nghiệm trong điều kiện cưỡng bức được sử dụng nhằm tiết
kiệm chi phí. Trong đó, sản phẩm chịu tác động của các điều kiện lưu trữ bất lợi của một
hoặc nhiều yếu tố cưỡng bức như nhiệt độ, độ ẩm tương đối của không khí cao hơn mức
bình thường để đẩy nhanh quá trình hư hỏng. Các thông số nhiệt động học như hằng số
tốc độ phản ứng, thời gian bán hủy, hệ số nhiệt độ Van’t Hoff (Q10) và năng lượng kích
hoạt sẽ được xác định để từ đó xây dựng mô hình dự đoán thời hạn bảo quản phù hợp
[169]. Các nghiên cứu sử dụng các điều kiện cưỡng bức cho thấy hiệu quả trong việc
xây dựng mô hình dự đoán sự phân huỷ của các hợp chất tự nhiên đã được công bố gần
đây. Trong đó, các mô hình được xây dựng có khả năng dự đoán cao trong điều kiện bảo
quản thực tế [196, 324] .
Vi bao gói cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ bằng chất mang maltodextrin kháng
tiêu hoá sử dụng kĩ thuật sấy phun cho thấy khả năng nâng cao hoạt tính sinh học và cải
thiện kiểm soát giải phóng các hợp chất polyphenol đã được phân tích ở Mục 3.3.
Nghiên cứu này tiến hành xây dựng mô hình động học phân hủy các hợp chất polyphenol
và hoạt tính sinh học của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ dưới điều
kiện cưỡng bức (Chi tiết mô tả ở Mục 2.3.15. ). Trong đó, ảnh hưởng của nhiệt độ và
độ ẩm tương đối của môi trường đến sự thay đổi hàm lượng các hợp chất polyphenol,
hoạt tính chống oxy hóa và ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột được đánh giá, từ đó xác
định mô hình dự đoán thời gian bảo quản của sản phẩm trong điều kiện phù hợp.
141
3.4.1. Sự suy giảm hàm lượng polyphenol theo thời gian bảo quản
Các yếu tố môi trường bao gồm nhiệt độ và độ ẩm có thể thúc đẩy các phản ứng hóa
học không mong muốn, dẫn đến suy giảm hàm lượng và hoạt tính sinh học của các hợp
chất tự nhiên trong quá trình bảo quản. Vì vậy, các nghiên cứu về độ nhạy cảm của các
hoạt chất dưới tác động của các điều kiện xử lý, yếu tố môi trường được quan tâm và từ
đó tìm ra giải pháp để lưu trữ lâu dài. Tác động của nhiệt độ và độ ẩm tương đối của
môi trường đến hàm lượng polyphenol của sản phẩm vi bao cao chiết vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ được tiến hành nhằm dự đoán điều kiện bảo quản phù hợp. Sự gia tăng độ ẩm bột,
suy thoái các hợp chất polyphenol được thể hiện trên Hình 3.28.
Ghi chú: (a) Sự thay đổi độ ẩm bột sấy phun (%); (b) Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số;* TPC (Total polyphenol content): Hàm lượng polyphenol tổng số, được tính tương đương với nồng độ mg gallic acid (GAE – Gallic acid equivalent) trên 1 đơn vị khối lượng khô của bột sấy phun
142
Kết quả cho thấy độ ẩm của bột có xu hướng tăng từ ngày 0 đến ngày 50, các
nghiệm thức ở 60°C độ ẩm tăng nhanh hơn so với nghiệm thức ở 40°C. Trong đó, điều
kiện 60°C với độ ẩm 90%, sản phẩm vi bao có tốc độ hút ẩm nhanh hơn nghiệm thức
75%, với độ ẩm tăng lên lần lượt là 11 lần và 4 lần so với thời điểm bắt đầu thực nghiệm
(độ ẩm bột là 2%). Tuy nhiên, tại 40°C mức độ hút ẩm của bột ở hai điều kiện cấp ẩm
khác nhau là tương đương nhau (p < 0,01). Có thể thấy, nhiệt độ và độ ẩm tương đối của
môi trường bảo quản có sự tương tác nhất định đến mức độ hút ẩm của bột trong điều
kiện thí nghiệm, điều này có thể dẫn đến sự thay đổi trong thành phần hoạt chất và hoạt
tính sinh học của bột sấy phun.
Sự suy giảm hàm lượng polyphenol được ghi nhận ở tất cả các điều kiện thực
nghiệm. Trong đó, hàm lượng polyphenol của mẫu bảo quản ở điều kiện 40°C – 75%,
40°C – 90% và 60°C – 75% giảm dần đều theo thời gian với mức độ 10 – 13% so với
ngày 0. Đối với mẫu bảo quản ở 60°C – 90%, hàm lượng polyphenol tổng số giảm nhanh
từ ngày thứ 10 và giảm 25% so với ngày ban đầu. Có thể thấy, hàm lượng polyphenol
tổng số ổn định hơn ở điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thấp. Kết quả này phù hợp với báo
cáo của Cassol & Noreña (2021), hàm lượng polyphenol ổn định hơn khi bảo quản ở
nhiệt độ 40°C và độ ẩm môi trường 75% [65]. Theo Tonon et al. (2010), yếu tố ảnh
hưởng đến sự suy giảm polyphenol là độ ẩm tương đối của môi trường, độ ẩm cao sẽ
gây ra sự suy giảm polyphenol cao bởi vì tính di động phân tử lớn hơn khi lượng nước
trong sản phẩm tăng lên, tạo điều kiện cho các phản ứng suy thoái diễn ra nhanh hơn [373].
3.4.2. Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm vi bao
Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH• và ABTS•+ của bột sấy phun có xu hướng
giảm dần theo thời gian. Tuy nhiên, mức độ và đặc điểm suy giảm theo điều kiện lưu
trữ là khác nhau giữa hai hoạt tính này (Hình 3.29). Kết quả cho thấy, khả năng chống
oxy hóa của bột sấy phun độ ổn định cao hơn ở nhiệt độ và độ ẩm thấp; tuy nhiên, khả
năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ của sản phẩm vi bao suy giảm nhanh hơn khả năng
trung hòa gốc tự do DPPH• khi nhiệt độ và độ ẩm thay đổi. Mức độ suy giảm hoạt tính
trung hòa gốc tự do DPPH• ở nhiệt độ thấp và độ ẩm thấp là 8% (lớn 10% ở độ ẩm cao),
trong khi đó, khả năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ giảm từ 23 đến 27% ở ngày thứ 50
với cùng điều kiện. Ở nhiệt độ cao, quy luật tương tự được ghi nhận ở nhiệt độ thấp và
độ ẩm cao có mức độ suy giảm khả năng trung hòa gốc tự do DPPH• từ 26 đến 34% và
42 đến 53% đối với ABTS•+. Mối liên hệ giữa hàm lượng polyphenol và khả năng chống
143
oxy hóa của các hợp chất tự nhiên đã được chứng minh ở các kết quả nghiên cứu nêu ở
mục 3.2.3. và 3.2.4. Do đó, sự suy giảm hàm lượng polyphenol theo thời gian có thể tác
động đến khả năng chống oxy hóa của bột sấy phun.
Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH• và ABTS•+ của bột sấy phun có xu hướng
giảm dần theo thời gian. Nghiên cứu của Kuck et al. (2017) cho thấy sự suy giảm
polyphenol trong quá trình bảo quản có liên quan đến sự tạo thành các hợp chất mới
thông qua thủy phân hoặc tạo liên kết mới dẫn đến làm mất một phần khả năng chống
oxy hóa [181]. Sự suy giảm khả năng trung hoà gốc tự do DPPH• và ABTS•+ ở 40°C
thấp hơn ở 60°C ở các điều kiện độ ẩm tương đối của môi trường khác nhau. Kết quả
này tương đồng với nghiên cứu của Cassol & Noreña (2021), khả năng trung hòa gốc tự
144
do DPPH• và ABTS•+ của bột sấy phun hoa bụp giấm ổn định hơn ở điều kiện bảo quản
40°C với độ ẩm 75% so với điều kiện nhiệt độ và độ ẩm cao hơn [65].
3.4.3. Sự thay đổi hoạt tính ức chế α-amylase và α-glucosidase
Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm tương đối đến khả năng ức chế α-amylase và α-
glucosidase có quy luật khá tương đồng với sự suy giảm polyphenol và hoạt tính chống
oxy hóa (Hình 3.30). Kết quả cho thấy độ ổn định hoạt tính ức chế α-amylase tốt hơn
so với α-glucosidase trong cùng điều kiện. Đồng thời, ở nhiệt độ và độ ẩm thấp, hoạt
tính ức chế α-amylase duy trì khá ổn định với mức độ suy giảm chỉ từ 26 đến 30%, trong
khi đó khả năng ức chế α-glucosidase suy giảm từ 82 đến 88% (Hình 3.30) sau 50 ngày
Ghi chú: a) Khả năng ức chế α-amylase (αAI: α-amylase inhibtion); b) Khả năng ức chế α- glucosidase (αGI: α-glucosidase inhibtion); * Khả năng ức chế enzyme được đánh giá thông qua nồng độ ức chế 50% hoạt tính của enzyme (IC50 : The half maximal inhibitory concentration, mg/mL)
145
bảo quản. Ở điều kiện nhiệt độ cao, khả năng ức chế α-amylase chỉ bắt đầu suy giảm
mạnh từ ngày thứ 30, trong đó, độ ẩm cao hoạt tính suy giảm nhanh hơn với mức độ suy
giảm lần lượt là 61% đến 76% sau 50 ngày. Trong khi đó, hoạt tính ức chế α-glucosidase
suy giảm nhanh chóng sau 10 ngày và duy trì tốc độ suy giảm cao trong suốt thời gian
bảo quản. Tuy nhiên, độ ẩm thấp hơn vẫn cho thấy sự ổn định hoạt tính ở cả hai loại
enzyme này.
3.4.4. Động học suy giảm hàm lượng polyphenol của sản phẩm vi bao cao chiết theo
điều kiện bảo quản
Việc sử dụng các loại thực phẩm có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc
biệt là polyphenol, rất được quan tâm. Theo Kechinski et al. (2010), các yếu tố môi
trường như nhiệt độ và độ ẩm có thể thúc đẩy các phản ứng hóa học không mong muốn
trong quá trình lưu trữ do sự ổn định thấp của các hợp chất có hoạt tính sinh học [169].
Cassol & Noreña (2021) cho rằng để dự đoán được mô hình động học suy giảm của các
hợp chất có hoạt tính sinh học, việc xác định các thông số động học như hằng số tốc độ
phản ứng, thời gian bán hủy, hệ số nhiệt độ và năng lượng kích hoạt là rất quan trọng [65].
Mô hình suy giảm hàm lượng polyphenol được thể hiện trong Bảng 3.16. Kết quả
cho thấy quy luật suy giảm hàm lượng polyphenol của bột sấy phun tuân theo mô hình
động học bậc nhất (R2 > 0,8). Một số nghiên cứu công bố trước đây như Kenchinshi et
al. (2010) [169], Shaaruddin et al. (2017) [340], Cassol & Noreña (2021) [65] cũng chỉ
ra rằng, các phản ứng suy thoái thực phẩm liên quan đến sự suy giảm các hàm lượng
polyphenol và khả năng chống oxy hóa tuân theo mô hình bậc nhất. Hằng số suy thoái
(k) và giá trị bán rã theo thời gian t1/2 cho từng điều kiện nhiệt độ và độ ẩm bảo quản
được thể hiện trong Bảng 3.16. Đối với bột vi bao cao chiết, nhiệt độ thấp, độ ẩm thấp
(40°C - 75%,) giá trị k thấp (0,002), nhiệt độ cao, độ ẩm cao (60°C - 90%,) giá trị k cao
(0,006). Tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp và độ ẩm cao (40°C - 90%) giá trị k tương đương
với điều kiện ở nhiệt độ cao, độ ẩm thấp (60°C - 75%) (0,003). Hệ số R2 dao động từ
0,85 đến 0,94, R2 càng cao độ phù hợp của mô hình càng lớn. Mẫu bảo quản ở 40°C-
75% thể hiện giá trị k thấp và thời gian bán rã dài hơn (346 ngày) so với mẫu bảo quản
ở nhiệt độ 60°C-75% (231 ngày) và 60°C-90% (115 ngày). Tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp
và độ ẩm cao (40°C - 90%), giá trị k và thời gian bán rã tương đương với mẫu bảo quản
ở nhiệt độ cao với độ ẩm thấp (40°C - 75%) (0,003, 231 ngày). Kết quả này cho thấy,
nhiệt độ và độ ẩm có tương tác lẫn nhau và giá trị k càng cao thì giá trị t1/2 càng thấp,
146
tương đồng với báo cáo của Lago & Noreña (2017) [196]. Đồng thời, thời gian suy giảm
90% hàm lượng polyphenol (D) và thời gian bán rã rút ngắn 3 lần khi tăng nhiệt độ và
độ ẩm bảo quản (Bảng 3.16). Mẫu bảo quản ở điều kiện 40°C - 75% có thời gian suy
giảm 90% hàm lượng polyphenol là 1.151,29 ngày; trong khi đó, ở điều kiện 60°C -
90% thì D giảm xuống còn 383,76 ngày. Có thể thấy nếu nhiệt độ và độ ẩm cao thì các
chất hợp chất polyphenol bị phá hủy lớn và số phản ứng trong điều kiện này cũng tăng
lên. Quy luật suy thoái tương tự được ghi nhận đối với cao chiết không vi bao gói, tuy
nhiên hằng số tốc độ (k) ở tất cả các điều kiện bảo quản đều cao hơn so với bột vi bao
cao chiết. Do đó, các giá trị dự đoán thời hạn bảo quản đều thấp hơn so với bột vi bao.
Cụ thể, thời gian suy thoái 90% và 50% hoạt tính ở điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thấp
(40°C - 75%) chỉ còn 767,53 và 231,05 ngày. Đáng chú ý, sự suy thoái nhanh chóng của
cao chiết không vi bao gói ở điều kiện nhiệt độ và độ ẩm cao (60°C-90%) với thời gian
suy thoái 90% và 50% hoạt tính chỉ còn 84,27 và 25,37 ngày cho thấy vi bao gói cao
chiết có hiệu quả tăng cường bảo vệ hoạt tính của cao chiết trước các tác động gây suy
thoái từ nhiệt và ẩm.
1,2
17.562,7
Bột vi bao
1,4
30.023,6
1,15
12.460,9
Cao chiết
2,61
83.236,8
Năng lượng kích hoạt (Ea) và các giá trị Q10 phụ thuộc vào nhiệt độ bảo quản (Bảng
3.16); phản ứng xảy ra chậm ở nhiệt độ thấp và tăng lên ở nhiệt độ cao. Đối với bột vi
bao cao chiết, giá trị năng lượng kích hoạt ở điều kiện độ ẩm tương đối cao (90%) là
30.023,6 J mol-1, trong khi ở độ ẩm tương đối 75%, năng lượng kích hoạt (17.562,7 J
mol-1) thấp hơn 1,7 lần so với năng lượng kích hoạt ở độ ẩm tương đối 90%. Theo Kuck
et al. (2017), trong các phản ứng có năng lượng hoạt hóa cao, sự phụ thuộc của tốc độ
suy thoái hợp chất tự nhiên vào sự thay đổi của nhiệt độ là lớn hơn [181]. Do đó, kết
quả nghiên cứu này cho thấy sự phụ thuộc của tốc độ suy thoái hàm lượng polyphenol
147
trong bột sấy phun cao chiết vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ vào sự thay đổi của nhiệt độ ở độ
ẩm tương đối 90% là cao hơn so với 75%. Điều này có thể giải thích cho sự suy giảm
nhanh về hàm lượng polyphenol trong bột sấy phun ở các điều kiện bảo quản có độ ẩm
cao. Khi so sánh năng lượng hoạt hóa của bột tại từng điều kiện bảo quản, kết quả này
tương đồng với báo cáo của Lago & Noreña (2017) [196]. Ngoài ra, điều này còn minh
chứng cho sự suy thoái nhanh của cao chiết không vi bao với giá trị năng lượng kích hoạt ở độ
ẩm cao (90%) là 83.236,8 J mol-1, cao gấp 6,7 lần so với điều kiện độ ẩm thấp (12.460,9 J mol-1).
Tham số Q10 là một cách để mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ lên hằng số phản ứng và
biểu thị tốc độ suy giảm khi nhiệt độ tăng 10°C [169]. Giá trị Q10 cho thấy tầm quan
trọng của số lượng va chạm và liên kết phân tử; sự va chạm cung cấp nhiều năng lượng
có thể đưa các phân tử đến trạng thái kích hoạt và do đó làm tăng tốc độ suy thoái [196].
Q10 thấp và thời gian bán hủy dài trong nghiên cứu này cho thấy sự ổn định cao của bột
ở điều kiện độ ẩm tương đối và biến đổi nhiệt độ của môi trường bảo quản. Các giá trị
Q10 thu được cho thấy tại độ ẩm tương đối cao (90%) (1,4) nhạy cảm hơn so với độ ẩm
75% (1,2). Kết quả này tương đồng với báo cáo của Cassol & Noreña (2021), giá trị Q10
dao động từ 1,2 – 1,4 tại độ ẩm 75% và tại độ ẩm 90% là 1,3 – 2,1 khi bảo quản các hợp
chất từ hoa bụp giấm được sấy phun cùng với polydextrin và whey protein phân lập.
Báo cáo của Lago & Noreña (2017), khi sử dụng Gum Arabic cho thấy giá trị Q10 (1,11
– 1,12) thấp hơn và thời gian bán hủy lớn nhất điều kiện được nghiên cứu so với
polydextrin (1,15 – 1,18) [196]. Đối với cao chiết không vi bao, giá trị Q10 ở tăng lên
2,27 lần ở điều kiện độ ẩm cao so với độ ẩm thấp. Kết quả này cho thấy, cao chiết không
vi bao nhạy cảm với sự thay đổi độ ẩm hơn so với sự thay đổi nhiệt độ, đồng thời vi bao
gói có thể giảm tác động của độ ẩm đối với cao chiết.
Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy mức độ thoái hóa hoạt chất polyphenol trong
sản phẩm vi bao tuân theo quy luật hàm bật nhất, trong đó điều kiện bảo quản ở 40 °C
và độ ẩm 75%, hạt vi bao giữ được các hoạt tính sinh học ổn định nhất. Trong đó, thời
gian bán rã và suy giảm 90% hoạt tính lần lượt là 346,57 ngày và 1.151,29 ngày, cao
hơn đáng kể so với cao chiết không vi bao là 231,05 ngày và 767, 53 ngày. Sự thay đổi
hệ số nhiệt động (Q10) năng lượng kích hoạt (Ea) trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thay
đổi cho thấy vi bao gói giúp bảo vệ cao chiết tốt hơn trước tác động gây thoái hóa bởi
độ ẩm môi trường. Do đó, vi bao gói tăng hiệu quả bảo vệ thành phần hoạt chất và kéo
dài thời gian bảo quản cao chiết.
148
Kết luận
1. Phân đoạn ethyl acetate thu được nhiều hoạt chất giúp nâng cao khả năng kiểm soát
đường huyết đa mục tiêu. Khả năng này thể hiện qua hoạt tính chống oxy hóa, kháng
viêm, ức chế enzyme tiêu hóa tinh bột, chống gia tăng đường huyết sau ăn, ổn định
đường huyết lúc đói, khôi phục hệ vi sinh vật đường ruột và điều hòa biểu hiện gene
liên quan sinh tổng hợp chất béo (SREBF1, ACC1, FASN), insulin và thụ thể insulin
(INS, INSRA1, INSRB1), hấp thu và chuyển hóa glucose (SGLT1, GLP1). Các hợp
chất chính trong phân đoạn ethyl acetate gồm: ellagic acid, (-)-epicatechin, ethyl
gallate, quercetin, quercetrin, rutin, vitexin, gallic acid, chlorogenic acid, và
catechin. Trong đó, gallic acid, catechin, epicatechin, ellagic acid, quercetin,
caffeine và apigenin là các thành phần chống oxy hóa quan trọng. Ethyl gallate và
rutin là thành phần chính ức chế α-glucosidase. Tỷ lệ hàm lượng, và sự tương tác
giữa các thành phần có thể ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của cao chiết.
2. Vi bao gói cao chiết từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ với maltodextrin kháng tiêu hóa
bằng phương pháp sấy phun giúp nâng cao hiệu quả kiểm soát đường huyết đa mục
tiêu của cao chiết trên mô hình in vitro và in vivo. Tương tác giữa vật liệu bao gói
và các hợp chất trong cao chiết có thể nâng cao tính sinh khả dụng của sản phẩm vi
bao gói. Trong đó, sản phẩm vi bao có khả năng kiểm soát tốt quá trình sinh tổng
hợp chất béo thông qua điều hòa biểu hiện gene SREBF1, ACC1, và FASN; cải thiện
kháng insulin thông qua gene insulin (INS), và thụ thể insulin (INSRA1 và INSRB1);
ức chế hấp thu glucose qua thành ruột thông qua gene SGLT1 và cải thiện chuyển
hóa glucose thông qua gene GLP1. Đồng thời, mô hình dự đoán thời hạn bảo quản
sản phẩm vi bao tuân theo quy luật hàm bậc nhất: Ct = C0. e−kt. Sản phẩm vi bao ổn định ở điều kiện nhiệt độ (40 °C) và độ ẩm môi trường bảo quản (75%), với thời
gian bán rã và suy thoái 90% hoạt tính lần lượt là 346,57 ngày và 1.151,29 ngày, so
với cao chiết không vi bao lần lượt là 231,05 ngày và 767,53 ngày.
149
Kiến nghị
+ Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện sơ chế, trích ly và vi bao cao chiết để nâng cao hiệu
quả khai thác các hợp chất cũng như nâng cao hoạt tính sinh học của các hợp chất tự
nhiên từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ.
+ Nghiên cứu đánh giá các tác động của cao chiết và sản phẩm vi bao trên các mô hình
nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng để có thể phát triển thành các dạng thực phẩm
thuốc cũng như thực phẩm chức năng trong phòng chống bệnh đái tháo đường.
+ Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất một số sản phẩm thực phẩm có khả năng ổn định
đường huyết hỗ trợ phòng ngừa và điều trị đái tháo đường.
150
+ 03 (ba) bài báo đăng trên Tạp chí Khoa học quốc tế thuộc hệ thống SCIE
1. Minh-Trung Nguyen, Van-Chuyen Hoang, Minh-Dinh Tran, Quang-Vinh
Nguyen* (2022). Microencapsulation of Syzygium zeylanicum (L.) DC. extract using
spray drying: Effects of wall materials on physicochemical characteristics and biological
activities of the microcapsules. Journal of Food Processing and Preservation, 00,
e16647. https://doi.org/10.1111/jfpp.16647 (ISI – SCIE, Q2, IF 2,5)
2. Minh-Trung Nguyen, Bich Huyen Bui Thi, Shila Maskey, Minh-Dinh Tran,
Quang-Vinh Nguyen* (2023). In vitro and in vivo antioxidant and
antihyperglycemic potentials of phenolic fractions of Syzygium zeylanicum (L.)
DC trunk-bark. Food Science & Nutrition, 00, 1– 10. DOI: 10.1002/fsn3.3373.
(ISI – SCIE, Q1, IF 3,9)
3. Minh-Trung Nguyen, Thi-Bich-Huyen Bui, Van-Hung Pham, Minh-Dinh Tran,
Quang-Vinh Nguyen* (2023). Syzygium zeylanicum (L.) DC. polyphenols exhibit
anti-diabetic activity by modulation of ACC1, SGLT1, and GLP-1 genes and
restoration of gut microbiota in overfeeding and high glucose exposure-induced
diabetic zebrafish. Journal of functional foods, Volume 112, January 2024,
105921. DOI: 10.1016/j.jff.2023.105921. (ISI – SCIE, Q1, IF 5,6)
+ 02 (hai) bài báo đăng trên Tạp chí Khoa học trong nước thuộc hệ thống tính điểm
của Hội đồng Giáo sư Nhà nước
4. Nguyễn Minh Trung, Bùi Thị Bích Huyên, Nguyễn Quang Vinh* (2023). Nghiên
cứu động học suy giảm hàm lượng polyphenol và hoạt tính sinh học của bột sấy
phun cao chiết Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.) trong điều kiện cưỡng
bức. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 59(5). DOI:
10.22144/ctujos.2023.197
5. Nguyễn Minh Trung, Bùi Thị Bích Huyên, Mai Quốc Quân, Huỳnh Ngọc Phương
Dung, Nguyễn Ngọc Hà Giang, Lê Thị Thùy, Nguyễn Quang Vinh* (2023). Khả
năng hạ đường huyết, kháng oxy hóa, kháng khuẩn của cao chiết phân đoạn n-
butanol từ vỏ thân cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum L.). Tạp chí Nông nghiệp
và Phát triển Nông thôn, Số đặc biệt, Chất lượng và An toàn thực phẩm vì sức
khỏe cộng đồng, Tập I – Tháng 6/2023, tr. 335-343.
+ 01 (một) báo cáo toàn văn đăng trên Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn
quốc 2022
151
6. Nguyễn Minh Trung, Bùi Thị Bích Huyên, Nguyễn Ngọc Hà Giang, Nguyễn Quang Vinh* (2022). Thành phần hợp chất phenolic, khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kích thích sinh trưởng lợi khuẩn của cao chiết từ vỏ thân cây Trâm
vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.). Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học Toàn
quốc 2022, Đại học Tây Nguyên.
152
[1]. Aba P.E. and Asuzu I.U. (2018), "Mechanisms of actions of some bioactive anti- diabetic principles from phytochemicals of medicinal plants: A review". [2]. Abbas M., Saeed F., Anjum F.M., Afzaal M., Tufail T., Bashir M.S., Ishtiaq A., Hussain S., and Suleria H.A.R. (2017), "Natural polyphenols: An overview", International Journal of Food Properties. 20(8), pp. 1689-1699.
[3]. Abdin M., Hamed Y.S., Akhtar H.M.S., Chen D., Mukhtar S., Wan P., Riaz A., and Zeng X. (2019), "Extraction optimisation, antioxidant activity and inhibition on α‐amylase and pancreatic lipase of polyphenols from the seeds of Syzygium cumini", International Journal of Food Science & Technology. 54(6), pp. 2084-2093.
[4]. Abdin M., Salama M.A., Gawad R., Fathi M.A., and Alnadari F. (2021), "Two‐Steps of Gelation System Enhanced the Stability of Syzygium cumini Anthocyanins by Encapsulation with Sodium Alginate, Maltodextrin, Chitosan and Gum Arabic", Journal of Polymers and the Environment, pp. 1-14. [5]. Abdin M., Salama M.A., Riaz A., Akhtar H.M.S., and Elsanat S.Y. (2021), "Enhanced the entrapment and controlled release of Syzygium cumini seeds polyphenols by modifying the surface and internal organization of Alginate‐ based microcapsules", Journal of Food Processing and Preservation. 45(1), pp. e15100.
[6]. Abdulai I.L., Kwofie S.K., Gbewonyo W.S., Boison D., Puplampu J.B., and Adinortey M.B. (2021), "Multitargeted Effects of Vitexin and Isovitexin on Diabetes Mellitus and Its Complications", ScientificWorldJournal. 2021 pp. 6641128.
[7]. Abdulkhaleq L.A., Assi M.A., Noor M.H.M., Abdullah R., Saad M.Z., and Taufiq-Yap Y.H. (2017), "Therapeutic uses of epicatechin in diabetes and cancer", Vet World. 10(8), pp. 869-872.
[8]. Abellán Ruiz M.S., Barnuevo Espinosa M.D., Contreras Fernández C.J., Luque Rubia A.J., Sánchez Ayllón F., Aldeguer García M., García Santamaría C., and López Román F.J. (2016), "Digestion-resistant maltodextrin effects on colonic transit time and stool weight: a randomized controlled clinical study", Eur J Nutr. 55(8), pp. 2389-2397.
[9]. Ada, Ujić, Ikolić, emanja, Tanisavljević, Atarína, avikin, Na, Alušević, Iktor, Edović, Ubravka, Igović, Eodora, and Anković (2018), Application of gum Arabic in the production of spray-dried chokeberry polyphenols , microparticles characterisation and in vitro digestion method.
[10]. Adefegha A., Oboh G., Oyeleye I., and Osunmo K. (2015), "Alteration of starch hydrolyzing enzyme inhibitory properties, antioxidant activities, and phenolic profile of clove buds (Syzygium aromaticum L.) by cooking duration", Food Science & Nutrition. 4.
[11]. Adefegha S.A. and Oboh G. (2012), "In vitro inhibition activity of polyphenol- rich extracts from Syzygium aromaticum (L.) Merr. & Perry (Clove) buds against carbohydrate hydrolyzing enzymes linked to type 2 diabetes and Fe2+-induced lipid peroxidation in rat pancreas", Asian Pacific journal of tropical biomedicine. 2(10), pp. 774-781.
[12]. Adeghate E. and Kalász H. (2011), "Amylin analogues in the treatment of diabetes mellitus: medicinal chemistry and structural basis of its function", Open Med Chem J. 5(Suppl 2), pp. 78-81.
153
[13]. Adisakwattana S., Lerdsuwankij O., Poputtachai U., Minipun A., and Suparpprom C. (2011), "Inhibitory activity of cinnamon bark species and their combination effect with acarbose against intestinal α-glucosidase and pancreatic α-amylase", Plant Foods for Human Nutrition. 66(2), pp. 143-148.
[14]. Ahmadu T. and Ahmad K. (2021), "An Introduction to Bioactive Natural Products and General Applications", in Bioactive Natural Products for Pharmaceutical Applications, Pal Dilipkumar and Nayak Amit Kumar, Editors, Springer International Publishing: Cham. p. 41-91.
[15]. Ahmed S.A.H., Ansari S.A., Mensah-Brown E.P.K., and Emerald B.S. (2020), "The role of DNA methylation in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus", Clinical Epigenetics. 12(1), pp. 104.
[16]. Ahn D., Kim J., Nam G., Zhao X., Kwon J., Hwang J.Y., Kim J.K., Yoon S.- Y., and Chung S.J. (2022), "Ethyl Gallate Dual-Targeting PTPN6 and PPARγ Shows Anti-Diabetic and Anti-Obese Effects", International Journal of Molecular Sciences. 23(9), pp. 5020.
[17]. Ajiboye B.O., Ojo O.A., Akuboh O.S., Abiola O.M., Idowu O., and Amuzat A.O. (2018), "Anti-Hyperglycemic and Anti-Inflammatory Activities of Polyphenolic-Rich Extract of Syzygium cumini Linn Leaves in Alloxan-Induced Diabetic Rats", J Evid Based Integr Med. 23 pp. 2515690X18770630.
[18]. Alam S., Sarker M.M.R., Sultana T.N., Chowdhury M.N.R., Rashid M.A., Chaity N.I., Zhao C., Xiao J., Hafez E.E., Khan S.A., and Mohamed I.N. (2022), "Antidiabetic Phytochemicals From Medicinal Plants: Prospective Candidates for New Drug Discovery and Development", Frontiers in Endocrinology. 13.
[19]. Alawiyah A.L. and Senania A. (2021), "Antioxidant Activity and Bioactive Compounds of Ethyl Acetate Fractions from Syzygium cumini Wood Stem", ALKIMIA: Jurnal Ilmu Kimia dan Terapan. 5(1), pp. 93-101.
[20]. Albarrán O.G. and Ampudia-Blasco F.J. (2013), "[Dapagliflozin, the first SGLT-2 inhibitor in the treatment of type 2 diabetes]", Med Clin (Barc). 141 Suppl 2 pp. 36-43.
[21]. Alonge K.M., D'Alessio D.A., and Schwartz M.W. (2021), "Brain control of blood glucose levels: implications for the pathogenesis of type 2 diabetes", Diabetologia. 64(1), pp. 5-14.
[22]. Amor A.J., Gómez-Guerrero C., Ortega E., Sala-Vila A., and Lázaro I. (2020), "Ellagic Acid as a Tool to Limit the Diabetes Burden: Updated Evidence", Antioxidants. 9(12), pp. 1226.
[23]. Anand David A.V., Arulmoli R., and Parasuraman S. (2016), "Overviews of Biological Importance of Quercetin: A Bioactive Flavonoid", Pharmacogn Rev. 10(20), pp. 84-89.
[24]. Andreasen A.S., Kelly M., Berg R.M.G., Møller K., and Pedersen B.K. (2011), "Type 2 Diabetes Is Associated with Altered NF-κB DNA Binding Activity, JNK Phosphorylation, and AMPK Phosphorylation in Skeletal Muscle after LPS", Plos One. 6(9), pp. e23999.
[25]. Annunziata G., Jimenez-Garcia M., Capo X., Moranta D., Arnone A., Tenore G.C., Sureda A., and Tejada S. (2020), "Microencapsulation as a tool to counteract the typical low bioavailability of polyphenols in the management of diabetes", Food Chem Toxicol. 139 pp. 111248.
154
[26]. Anoop M. and Bindu A. (2014), "Pharmacognostic and physico-chemical studies on leaves of Syzygium zeylanicum (L.) DC", International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research. 6(4), pp. 685-689.
[27]. Anoop M. and Bindu A. (2015), "In-vitro anti-inflammatory activity studies on Syzygium zeylanicum (L) DC leaves", International Journal of Pharma Research & Review. 4(8), pp. 18-27.
[28]. Ansari P., Flatt P.R., Harriott P., and Abdel-Wahab Y.H.A. (2022), "Insulin secretory and antidiabetic actions of Heritiera fomes bark together with isolation of active phytomolecules", Plos One. 17(3), pp. e0264632.
[29]. Anhê F.F., Desjardins Y., Pilon G., Dudonné S., Genovese M.I., Lajolo F.M., and Marette A. (2013), "Polyphenols and type 2 diabetes: A prospective review", PharmaNutrition. 1(4), pp. 105-114.
[30]. Arulselvan P., Ghofar H.A.A., Karthivashan G., Halim M.F.A., Ghafar M.S.A., and Fakurazi S. (2014), "Antidiabetic therapeutics from natural source: A systematic review", Biomedicine & Preventive Nutrition. 4(4), pp. 607-617.
[31]. Arumugam B., Manaharan T., Heng C.K., Kuppusamy U.R., and Palanisamy U.D. (2014), "Antioxidant and antiglycemic potentials of a standardized extract of Syzygium malaccense", LWT - Food Science and Technology. 59(2), pp. 707-712.
[32]. Arumugam B., Palanisamy U.D., Chua K.H., and Kuppusamy U.R. (2016), "Potential antihyperglycaemic effect of myricetin derivatives from Syzygium malaccense", Journal of Functional Foods. 22 pp. 325-336.
[33]. Assadpour E., Jafari S.-M., and Maghsoudlou Y. (2017), "Evaluation of folic acid release from spray dried powder particles of pectin-whey protein nano- capsules", International Journal of Biological Macromolecules. 95 pp. 238-247. [34]. Atef N.M., Shanab S.M., Negm S.I., and Abbas Y.A. (2019), "Evaluation of antimicrobial activity of some plant extracts against antibiotic susceptible and resistant bacterial strains causing wound infection", Bulletin of the National Research Centre. 43(1), pp. 144.
[35]. Ayyanar M. and Subash-Babu P. (2012), "Syzygium cumini (L.) Skeels: a review of its phytochemical constituents and traditional uses", Asian Pac J Trop Biomed. 2(3), pp. 240-246.
[36]. Bahne E., Sun E.W.L., Young R.L., Hansen M., Sonne D.P., Hansen J.S., Rohde U., Liou A.P., Jackson M.L., de Fontgalland D., Rabbitt P., Hollington P., Sposato L., Due S., Wattchow D.A., Rehfeld J.F., Holst J.J., Keating D.J., Vilsboll T., and Knop F.K. (2018), "Metformin-induced glucagon-like peptide- 1 secretion contributes to the actions of metformin in type 2 diabetes", JCI Insight. 3(23).
[37]. Bairy K., Sharma A., and Shalini A. (2005), "Evaluation of the hypoglycemic, hypolipidemic and hepatic glycogen raising effects of Syzygium malaccense upon streptozotocin induced diabetic rats", Journal of Natural remedies. 5(1), pp. 46-51.
[38]. Bajinka O., Tan Y., Darboe A., Ighaede-Edwards I.G., and Abdelhalim K.A. (2023), "The gut microbiota pathway mechanisms of diabetes", Amb Express. 13(1), pp. 16.
[39]. Ballesteros L.F., Ramirez M.J., Orrego C.E., Teixeira J.A., and Mussatto S.I. (2017), "Encapsulation of antioxidant phenolic compounds extracted from spent coffee grounds by freeze-drying and spray-drying using different coating materials", Food Chemistry. 237 pp. 623-631.
155
[40]. Basciano H., Federico L., and Adeli K. (2005), "Fructose, insulin resistance,
and metabolic dyslipidemia", Nutrition & metabolism. 2(1), pp. 5.
[41]. Bashar S.M., Elhadidy M.G., Mostafa A.F., Hamed B., Helmy S., and Abd- Elmoniem H.A. (2021), "Hepatoprotective effect of gallic acid against type 2- induced diabetic liver injury in male rats through modulation of fetuin-A and GLP-1 with involvement of ERK1/2/NF-κB and Wnt1/β-catenin signaling pathways", Gen Physiol Biophys. 40(3), pp. 221-234.
[42]. Bazyar H., Moradi L., Zaman F., and Zare Javid A. (2023), "The effects of rutin flavonoid supplement on glycemic status, lipid profile, atherogenic index of plasma, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), some serum inflammatory, and oxidative stress factors in patients with type 2 diabetes mellitus: A double- blind, placebo-controlled trial", Phytother Res. 37(1), pp. 271-284.
[43]. Berndt J., Kovacs P., Ruschke K., Klöting N., Fasshauer M., Schön M.R., Körner A., Stumvoll M., and Blüher M. (2007), "Fatty acid synthase gene expression in human adipose tissue: association with obesity and type 2 diabetes", Diabetologia. 50(7), pp. 1472-1480. [44]. Bhanu D.R. and Sabu K. "Analysis of micronutrients in Syzygium zeylanicum var. Zeylanicum fruits", Magnesium (Mg). 14 pp. 0.12.
[45]. Bhatt D.L., Szarek M., Steg P.G., Cannon C.P., Leiter L.A., McGuire D.K., Lewis J.B., Riddle M.C., Voors A.A., Metra M., Lund L.H., Komajda M., Testani J.M., Wilcox C.S., Ponikowski P., Lopes R.D., Verma S., Lapuerta P., and Pitt B. (2020), "Sotagliflozin in Patients with Diabetes and Recent Worsening Heart Failure", New England Journal of Medicine. 384(2), pp. 117- 128.
in
[46]. Bhatti J.S., Sehrawat A., Mishra J., Sidhu I.S., Navik U., Khullar N., Kumar S., Bhatti G.K., and Reddy P.H. (2022), "Oxidative stress the pathophysiology of type 2 diabetes and related complications: Current therapeutics strategies and future perspectives", Free Radical Biology and Medicine. 184 pp. 114-134.
[47]. Bilušić T., Drvenica I., Kalušević A., Marijanović Z., Jerković I., Mužek M.N., Bratanić A., Skroza D., Zorić Z., Pedisić S., Nedović V., and Režek Jambrak A. (2021), "Influences of freeze- and spray-drying vs. encapsulation with soy and whey proteins on gastrointestinal stability and antioxidant activity of Mediterranean aromatic herbs", International Journal of Food Science & Technology. 56(4), pp. 1582-1596.
[48]. Birje S. and Mehrotra N. (2018), "Study of in-vitro α-glucosidase inhibitory activity of Syzigium aromaticum and its herb drug interaction with acarbose and metformin".
[49]. Blaschek W. (2017), "Natural Products as Lead Compounds for Sodium Glucose Cotransporter (SGLT) Inhibitors", Planta Med. 83(12-13), pp. 985-993. [50]. Blonde L. (2010), "Current Antihyperglycemic Treatment Guidelines and Algorithms for Patients with Type 2 Diabetes Mellitus", The American Journal of Medicine. 123(3, Supplement), pp. S12-S18.
[51]. Brand-Williams W., Cuvelier M.E., and Berset C. (1995), "Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity", LWT - Food Science and Technology. 28(1), pp. 25-30. [52]. Brealey D. and Singer M. (2009), "Hyperglycemia in Critical Illness: A Review", Journal of Diabetes Science and Technology. 3(6), pp. 1250-1260.
156
[53]. Buljeta I., Pichler A., Šimunović J., and Kopjar M. (2022), "Polysaccharides as Carriers of Polyphenols: Comparison of Freeze-Drying and Spray-Drying as Encapsulation Techniques", Molecules. 27(16).
[54]. Burhans M.S., Hagman D.K., Kuzma J.N., Schmidt K.A., and Kratz M. (2018), "Contribution of Adipose Tissue Inflammation to the Development of Type 2 Diabetes Mellitus", Compr Physiol. 9(1), pp. 1-58.
[55]. Butrico C.E., Klopfenstein N., Green E.R., Johnson J.R., Peck S.H., Ibberson C.B., Serezani C.H., and Cassat J.E. (2023), "Hyperglycemia Increases Severity of Staphylococcus aureus Osteomyelitis and Influences Bacterial Genes Required for Survival in Bone", Infection and Immunity. 91(4), pp. e00529-00522.
[56]. Caban M. and Lewandowska U. (2022), "Polyphenols and the potential mechanisms of their therapeutic benefits against inflammatory bowel diseases", Journal of Functional Foods. 95 pp. 105181.
[57]. Cai C., Cheng W., Shi T., Liao Y., Zhou M., and Liao Z. (2023), "Rutin alleviates colon lesions and regulates gut microbiota in diabetic mice", Scientific Reports. 13(1), pp. 4897.
[58]. Callahan B.J., McMurdie P.J., Rosen M.J., Han A.W., Johnson A.J.A., and Holmes S.P. (2016), "DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data", Nature Methods. 13(7), pp. 581-583.
[59]. Campbell Jonathan E. and Drucker Daniel J. (2013), "Pharmacology, Physiology, and Mechanisms of Incretin Hormone Action", Cell Metabolism. 17(6), pp. 819-837. and Telis V.R.N. [60]. Cano-Higuita D.M., Vélez H.A.V.,
(2015), "Microencapsulation of turmeric oleoresin in binary and ternary blends of gum arabic, maltodextrin and modified starch", Ciência e Agrotecnologia. 39. [61]. Cao H., Saroglu O., Karadag A., Diaconeasa Z., Zoccatelli G., Conte-Junior C.A., Gonzalez-Aguilar G.A., Ou J., Bai W., Zamarioli C.M., de Freitas L.A.P., Shpigelman A., Campelo P.H., Capanoglu E., Hii C.L., Jafari S.M., Qi Y., Liao P., Wang M., Zou L., Bourke P., Simal-Gandara J., and Xiao J. (2021), "Available technologies on improving the stability of polyphenols in food processing", Food Frontiers. 2(2), pp. 109-139.
[62]. Cao Y., Chen Q., Liu Y., Jin L., and Peng R. (2023), "Research Progress on the Construction and Application of a Diabetic Zebrafish Model", International Journal of Molecular Sciences. 24(6), pp. 5195.
[63]. Capetti F., Cagliero C., Marengo A., Bicchi C., Rubiolo P., and Sgorbini B. (2020), "Bio-Guided Fractionation Driven by In Vitro α-Amylase Inhibition Assays of Essential Oils Bearing Specialized Metabolites with Potential Hypoglycemic Activity", Plants (Basel, Switzerland). 9(9).
[64]. Capiotti K.M., Antonioli R., Jr., Kist L.W., Bogo M.R., Bonan C.D., and Da Silva R.S. (2014), "Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model", Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 171 pp. 58- 65.
[65]. Cassol L. and Noreña C.P.Z. (2021), "Microencapsulation and accelerated stability testing of bioactive compounds of Hibiscus sabdariffa", Journal of Food Measurement and Characterization. 15(2), pp. 1599-1610.
[66]. Cefalo C.M.A., Cinti F., Moffa S., Impronta F., Sorice G.P., Mezza T., Pontecorvi A., and Giaccari A. (2019), "Sotagliflozin, the first dual SGLT
157
inhibitor: current outlook and perspectives", Cardiovascular Diabetology. 18(1), pp. 20. [67]. Ceriello A. (2005), "Postprandial Hyperglycemia and Diabetes Complications: Is It Time to Treat?", Diabetes. 54(1), pp. 1-7. [68]. Coates J. (2000), "Interpretation of Infrared Spectra, A Practical Approach", in Encyclopedia of Analytical Chemistry. [69]. Colegate S.M. and Molyneux R.J. (2007), Bioactive natural products: detection, isolation, and structural determination. CRC press. [70]. Collymore C., Rasmussen S., and Tolwani R.J. (2013), "Gavaging adult zebrafish", Journal of visualized experiments : JoVE,(78), pp. e50691.
[71]. Consoli L., Hubinger M.D., and Dragosavac M.M. (2023), "Encapsulation of resveratrol via spray-drying of oil-in-water emulsions produced by ultrasound or membrane emulsification", Journal of Food Engineering. 350 pp. 111488. [72]. Cremonini E., Bettaieb A., Haj F.G., Fraga C.G., and Oteiza P.I. (2016), "(- )-Epicatechin improves insulin sensitivity in high fat diet-fed mice", Arch Biochem Biophys. 599 pp. 13-21.
[73]. Cremonini E., Fraga C.G., and Oteiza P.I. (2019), "(–)-Epicatechin in the control of glucose homeostasis: Involvement of redox-regulated mechanisms", Free Radical Biology and Medicine. 130 pp. 478-488.
[74]. Ćujić-Nikolić N., Stanisavljević N., Šavikin K., Kalušević A., Nedović V., Samardžić J., and Janković T. (2019), "Chokeberry polyphenols preservation using spray drying: effect of encapsulation using maltodextrin and skimmed milk on their recovery following in vitro digestion", Journal of Microencapsulation. 36(8), pp. 693-703.
[75]. Cunningham A.L., Stephens J.W., and Harris D.A. (2021), "Gut microbiota influence in type 2 diabetes mellitus (T2DM)", Gut Pathogens. 13(1), pp. 50. [76]. Chandran R., Parimelazhagan T., and George B.P.
(2017), "Antihyperglycemic activity of the bark methanolic extract of Syzygium mundagam in diabetic rats", Alexandria Journal of Medicine. 53(4), pp. 317-324. [77]. Chandran R., Parimelazhagan T., Shanmugam S., and Thankarajan S. (2016), "Antidiabetic activity of Syzygium calophyllifolium in Streptozotocin- Nicotinamide induced Type-2 diabetic rats", Biomed Pharmacother. 82 pp. 547- 554.
[78]. Chanudom L. and Tangpong J. (2015), "Anti-Inflammation Property of Syzygium cumini (L.) Skeels on Indomethacin-Induced Acute Gastric Ulceration", Gastroenterol Res Pract. 2015 pp. 343642.
[79]. Chao J., Cheng H.-Y., Chang M.-L., Huang S.-S., Liao J.-W., Cheng Y.-C., Peng W.-H., and Pao L.-H. (2021), "Gallic Acid Ameliorated Impaired Lipid Homeostasis in a Mouse Model of High-Fat Diet—and Streptozotocin-Induced NAFLD and Diabetes through Improvement of β-oxidation and Ketogenesis", Frontiers in Pharmacology. 11.
[80]. Chaudhary V., Thakur N., Kajla P., Thakur S., and Punia S. (2021), "Application of Encapsulation Technology in Edible Films: Carrier of Bioactive Compounds", Frontiers in Sustainable Food Systems. 5(374).
[81]. Chaudhury A., Duvoor C., Reddy Dendi V.S., Kraleti S., Chada A., Ravilla R., Marco A., Shekhawat N.S., Montales M.T., Kuriakose K., Sasapu A., Beebe A., Patil N., Musham C.K., Lohani G.P., and Mirza W. (2017), "Clinical Review of Antidiabetic Drugs: Implications for Type 2 Diabetes Mellitus Management", Front Endocrinol (Lausanne). 8(6), pp. 6.
158
[82]. Chen D., Wang Y., Wu K., and Wang X. (2018), "Dual Effects of Metformin on Adipogenic Differentiation of 3T3-L1 Preadipocyte in AMPK-Dependent and Independent Manners", Int J Mol Sci. 19(6).
[83]. Chen H., Jia Y., and Guo Q. (2020), "Chapter 6 - Polysaccharides and polysaccharide complexes as potential sources of antidiabetic compounds: A review", in Studies in Natural Products Chemistry, Atta ur Rahman, Editor Elsevier. p. 199-220.
[84]. Chen L., Gnanaraj C., Arulselvan P., El-Seedi H., and Teng H. (2019), "A review on advanced microencapsulation technology to enhance bioavailability of phenolic compounds: Based on its activity in the treatment of Type 2 Diabetes", Trends in Food Science & Technology. 85 pp. 149-162.
[85]. Chen X.L., Liang P.L., Gong M.J., Xu Y., Zhang L., Qiu X.H., Zhang J., Huang Z.H., and Xu W. (2022), "Polyphenolics from Syzygium brachythyrsum Inhibits Oxidized Low-Density Lipoprotein-Induced Macrophage-Derived Foam Cell Formation and Inflammation", Foods. 11(21).
[86]. Chew S.C., Tan C.P., and Nyam K.L. (2018), "Microencapsulation of refined kenaf (Hibiscus cannabinus L.) seed oil by spray drying using β- cyclodextrin/gum arabic/sodium caseinate", Journal of Food Engineering. 237 pp. 78-85.
[87]. Chhikara N., Kaur R., Jaglan S., Sharma P., Gat Y., and Panghal A. (2018), "Bioactive compounds and pharmacological and food applications of Syzygium cumini–a review", Food & Function. 9(12), pp. 6096-6115.
[88]. Choudhury N., Meghwal M., and Das K. (2021), "Microencapsulation: An overview on concepts, methods, properties and applications in foods", Food Frontiers. 2(4), pp. 426-442.
[89]. Dadheech N. and Shapiro A.J. (2018), "Human induced pluripotent stem cells in the curative treatment of diabetes and potential impediments ahead", Cell Biology and Translational Medicine, Volume 5, pp. 25-35.
[90]. Daghlas S.A. and Mohiuddin S.S. (2023), "Biochemistry, Glycogen", in StatPearlsStatPearls Publishing Copyright © 2023, StatPearls Publishing LLC.: Treasure Island (FL) ineligible companies. Disclosure: Shamim Mohiuddin declares no relevant financial relationships with ineligible companies.
[91]. David S.R., Lai P.P.N., Chellian J., Chakravarthi S., and Rajabalaya R. (2023), "Influence of rutin and its combination with metformin on vascular functions in type 1 diabetes", Scientific Reports. 13(1), pp. 12423.
[92]. Davies M.J., D'Alessio D.A., Fradkin J., Kernan W.N., Mathieu C., Mingrone G., Rossing P., Tsapas A., Wexler D.J., and Buse J.B. (2018), "Management of Hyperglycemia in Type 2 Diabetes, 2018. A Consensus Report by the American Diabetes Association (ADA) and the European Association for the Study of Diabetes (EASD)", Diabetes Care. 41(12), pp. 2669-2701. [93]. de Paulo Farias D., de Araújo F.F., Neri-Numa I.A., and Pastore G.M. (2021), "Antidiabetic potential of dietary polyphenols: A mechanistic review", Food Research International. 145 pp. 110383.
[94]. Deepika N., Saranya J., Eganathan P., and Sujanapal P. (2014), "Antimicrobial Activity of Syzygium zeylanicum (L.) DC. and Syzygium hemisphericum (Walp.) Alston", Journal of Biologically Active Products from Nature. 4(2), pp. 120-124. [95]. Derosa G., Maffioli P., and Sahebkar A. (2016), "Ellagic Acid and Its Role in Chronic Diseases", Adv Exp Med Biol. 928 pp. 473-479.
159
[96]. Dewijanti I.D., Artanti N., Mangunwardoyo W., Hanafi M., Abbas J., Megawati M., Minarti M., Musdalifah D., and Meilawati L. (2018), Bioactivities of Syzygium polyanthum (Wight) Walp leaf extract for decreasing diabetic risk. in AIP Conference Proceedings. AIP Publishing LLC.
[97]. Dhanya R. (2022), "Quercetin for managing type 2 diabetes and its therapy", Biomedicine & into multitarget insight complications, an Pharmacotherapy. 146 pp. 112560.
[98]. Dharmadeva S., Galgamuwa L.S., Prasadinie C., and Kumarasinghe N. (2018), "In vitro anti-inflammatory activity of Ficus racemosa L. bark using albumin denaturation method", Ayu. 39(4), pp. 239-242. [99]. Dhillon S. (2019), "Dapagliflozin: A Review in Type 2 Diabetes", Drugs. 79(10), pp. 1135-1146.
[100]. Dias M.I., Ferreira I.C., and Barreiro M.F. (2015), "Microencapsulation of bioactives for food applications", Food & Function. 6(4), pp. 1035-1052. [101]. Diedisheim M., Carcarino E., Vandiedonck C., Roussel R., Gautier J.-F., and Venteclef N. (2020), "Regulation of inflammation in diabetes: From genetics to epigenomics evidence", Molecular metabolism. 41 pp. 101041.
[102]. Dirir A.M., Daou M., Yousef A.F., and Yousef L.F. (2022), "A review of alpha- glucosidase inhibitors from plants as potential candidates for the treatment of type-2 diabetes", Phytochemistry Reviews. 21(4), pp. 1049-1079.
[103]. Do M.H., Choi J., Kim Y., Ha S.K., Yoo G., and Hur J. (2020), "Syzygium aromaticum Reduces Diabetes-induced Glucotoxicity via the NRF2/Glo1 Pathway", Planta Med. 86(12), pp. 876-883.
[104]. Dominguez Avila J.A., Rodrigo Garcia J., Gonzalez Aguilar G.A., and de la Rosa L.A. (2017), "The Antidiabetic Mechanisms of Polyphenols Related to Increased Glucagon-Like Peptide-1 (GLP1) and Insulin Signaling", Molecules. 22(6), pp. 903.
[105]. Donnan K. and Segar L. (2019), "SGLT2 inhibitors and metformin: Dual antihyperglycemic therapy and the risk of metabolic acidosis in type 2 diabetes", Eur J Pharmacol. 846 pp. 23-29.
[106]. Douglas G.M., Maffei V.J., Zaneveld J.R., Yurgel S.N., Brown J.R., Taylor C.M., Huttenhower C., and Langille M.G.I. (2020), "PICRUSt2 for prediction of metagenome functions", Nature Biotechnology. 38(6), pp. 685-688.
[107]. Durazzo A., Lucarini M., Souto E.B., Cicala C., Caiazzo E., Izzo A.A., Novellino E., and Santini A. (2019), "Polyphenols: A concise overview on the chemistry, occurrence, and human health", Phytotherapy Research. 33(9), pp. 2221-2243.
[108]. Dzobo K. (2022), The Role of Natural Products as Sources of Therapeutic for Innovative Drug Discovery. Comprehensive Pharmacology. Agents 2022:408-22. doi: 10.1016/B978-0-12-820472-6.00041-4. Epub 2022 Jun 9.
[109]. Eames S.C., Philipson L.H., Prince V.E., and Kinkel M.D. (2010), "Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis", Zebrafish. 7(2), pp. 205-213.
[110]. Elbere I., Kalnina I., Silamikelis I., Konrade I., Zaharenko L., Sekace K., Radovica-Spalvina I., Fridmanis D., Gudra D., Pirags V., and Klovins J. (2018), "Association of metformin administration with gut microbiome dysbiosis in healthy volunteers", Plos One. 13(9), pp. e0204317.
[111]. Elekofehinti O.O., Ariyo E.O., Iwaloye O., and Obafemi T.O. (2022), "Co- administration of metformin and gallic acid modulates JAK/STAT signaling
160
pathway and glutathione metabolism in fructose-fed streptozotocin diabetic Rats", Phytomedicine Plus. 2(1), pp. 100181.
[112]. Elimam H., Abdulla A.M., and Taha I.M. (2019), "Inflammatory markers and control of type 2 diabetes mellitus", Diabetes Metab Syndr. 13(1), pp. 800-804. [113]. Elo B., Villano C., Govorko D., and White L. (2007), "Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds", Journal of molecular endocrinology. 38(4), pp. 433-440.
[114]. Esser D., Geleijnse J.M., Matualatupauw J.C., Dower J.I., Kromhout D., Hollman P.C.H., and Afman L.A. (2018), "Pure flavonoid epicatechin and whole genome gene expression profiles in circulating immune cells in adults with elevated blood pressure: A randomised double-blind, placebo-controlled, crossover trial", Plos One. 13(4), pp. e0194229.
[115]. Ezzamouri B., Rosario D., Bidkhori G., Lee S., Uhlen M., and Shoaie S. (2023), "Metabolic modelling of the human gut microbiome in type 2 diabetes patients in response to metformin treatment", npj Systems Biology and Applications. 9(1), pp. 2.
[116]. Fang Z. and Bhandari B. (2017), "Spray Drying of Bioactives", in Engineering Foods for Bioactives Stability and Delivery, Roos Yrjö H. and Livney Yoav D., Editors, Springer New York: New York, NY. p. 261-284.
[117]. Feingold K.R. (2000), "Oral and Injectable (Non-Insulin) Pharmacological Agents for the Treatment of Type 2 Diabetes", in Endotext, Feingold K. R., Anawalt B., Blackman M. R., Boyce A., Chrousos G., Corpas E., de Herder W. W., Dhatariya K., Dungan K., Hofland J., Kalra S., Kaltsas G., Kapoor N., Koch C., Kopp P., Korbonits M., Kovacs C. S., Kuohung W., Laferrère B., Levy M., McGee E. A., McLachlan R., New M., Purnell J., Sahay R., Shah A. S., Singer F., Sperling M. A., Stratakis C. A., Trence D. L., and Wilson D. P., Editors, MDText.com, Inc. Copyright © 2000-2023, MDText.com, Inc.: South Dartmouth (MA).
[118]. Floegel A., Kim D.-O., Chung S.-J., Koo S.I., and Chun O.K. (2011), "Comparison of ABTS/DPPH assays to measure antioxidant capacity in popular antioxidant-rich US foods", Journal of Food Composition and Analysis. 24(7), pp. 1043-1048. [119]. Folin O. and Ciocalteu V. (1927), "On tyrosine and tryptophane determinations in proteins", Journal of Biological Chemistry. 73(2), pp. 627-650.
[120]. Fonseca-Correa J.I. and Correa-Rotter R. (2021), "Sodium-Glucose Cotransporter 2 Inhibitors Mechanisms of Action: A Review", Front Med (Lausanne). 8 pp. 777861.
[121]. Furman D., Campisi J., Verdin E., Carrera-Bastos P., Targ S., Franceschi C., Ferrucci L., Gilroy D.W., Fasano A., Miller G.W., Miller A.H., Mantovani A., Weyand C.M., Barzilai N., Goronzy J.J., Rando T.A., Effros R.B., Lucia A., Kleinstreuer N., and Slavich G.M. (2019), "Chronic inflammation in the etiology of disease across the life span", Nature Medicine. 25(12), pp. 1822-1832.
[122]. Galicia-Garcia U., Benito-Vicente A., Jebari S., Larrea-Sebal A., Siddiqi H., Uribe K.B., Ostolaza H., and Martin C. (2020), "Pathophysiology of Type 2 Diabetes Mellitus", Int J Mol Sci. 21(17), pp. 6275.
161
[123]. Gan S.U., Fu Z., Sia K.C., Kon O.L., Calne R., and Lee K.O. (2019), "Development of a liver-specific Tet-off AAV8 vector for improved safety of insulin gene therapy for diabetes", J Gene Med. 21(1), pp. e3067.
[124]. Ganesan D., Albert A., Paul E., Ananthapadmanabhan K., Andiappan R., and Sadasivam S.G. (2020), "Rutin ameliorates metabolic acidosis and fibrosis in alloxan induced diabetic nephropathy and cardiomyopathy in experimental rats", Molecular and Cellular Biochemistry. 471(1), pp. 41-50.
[125]. Ganesan K., Ramkumar K.M., and Xu B. (2020), "Vitexin restores pancreatic β-cell function and insulin signaling through Nrf2 and NF-κB signaling pathways", European Journal of Pharmacology. 888 pp. 173606. [126]. García-Aguilar A. and Guillén C. (2022), "Targeting pancreatic beta cell death in type 2 diabetes by polyphenols", Frontiers in Endocrinology. 13.
[127]. García D.E., Delgado N., Aranda F.L., Toledo M.A., Cabrera-Barjas G., Sintjago E.M., Escobar-Avello D., and Paczkowski S. (2018), "Synthesis of maleilated polyflavonoids and lignin as functional bio-based building-blocks", Industrial Crops and Products. 123 pp. 154-163. [128]. Ghaddar B. and Diotel N. (2022), "Zebrafish: A New Promise to Study the Impact of Metabolic Disorders on the Brain", Int J Mol Sci. 23(10).
[129]. Ghadimi M., Foroughi F., Hashemipour S., Nooshabadi M.R., Ahmadi M.H., Yari M.G., Kavianpour M., and Haghighian H.K. (2021), "Decreased insulin resistance in diabetic patients by influencing Sirtuin1 and Fetuin-A following supplementation with ellagic acid: a randomized controlled trial", Diabetology & Metabolic Syndrome. 13(1), pp. 16.
[130]. Ghadimi M., Hashemipour S., Nooshabadi M.R., Kavianpour M., and Haghighian H.K. (2021), "The effect of Ellagic acid on sleep quality in patients with type 2 diabetes: a randomized double blind clinical trial", International Journal of Diabetes in Developing Countries. 41(1), pp. 29-36.
[131]. Ghafouri-Fard S., Shoorei H., Khanbabapour Sasi A., Taheri M., and Ayatollahi S.A. (2021), "The impact of the phytotherapeutic agent quercetin on expression of genes and activity of signaling pathways", Biomedicine & Pharmacotherapy. 141 pp. 111847.
[132]. Gharsallaoui A., Roudaut G., Chambin O., Voilley A., and Saurel R. (2007), "Applications of spray-drying in microencapsulation of food ingredients: An overview", Food Research International. 40(9), pp. 1107-1121. [133]. Ghorbani A. (2017), "Mechanisms of antidiabetic effects of flavonoid rutin", Biomed Pharmacother. 96 pp. 305-312.
[134]. Gleeson M., Connaughton V., and Arneson L.S. (2007), "Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina", Acta Diabetol. 44(3), pp. 157-163.
[135]. Golovinskaia O. and Wang C.-K. (2023), "The hypoglycemic potential of phenolics from functional foods and their mechanisms", Food Science and Human Wellness. 12(4), pp. 986-1007.
[136]. Gong L., Feng D., Wang T., Ren Y., Liu Y., and Wang J. (2020), "Inhibitors of α-amylase and α-glucosidase: Potential linkage for whole cereal foods on prevention of hyperglycemia", Food Sci Nutr. 8(12), pp. 6320-6337.
[137]. Gong Y., Zhai G., Su J., Yang B., Jin J., Liu H., Yin Z., Xie S., and Han D. (2018), "Different roles of insulin receptor a and b in maintaining blood glucose homeostasis in zebrafish", General and Comparative Endocrinology. 269 pp. 33- 45.
162
[138]. Gromova L.V., Fetissov S.O., and Gruzdkov A.A. (2021), "Mechanisms of Glucose Absorption in the Small Intestine in Health and Metabolic Diseases and Their Role in Appetite Regulation", Nutrients. 13(7).
[139]. Grussu D., Stewart D., and McDougall G.J. (2011), "Berry Polyphenols Inhibit α-Amylase in Vitro: Identifying Active Components in Rowanberry and Raspberry", Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59(6), pp. 2324-2331. [140]. Gurusamy K., Kokilavani R., and Teepa K.S. (2007), "Effect of Syzygium calophyllifolium Walp. seed extract on transaminases and phosphatases in alloxan induced diabetic rats", Ancient science of life. 27(2), pp. 28-33. [141]. Halahlah A., Piironen V., Mikkonen K.S., and Ho T.M. (2022), "Polysaccharides as wall materials in spray-dried microencapsulation of bioactive compounds: Physicochemical properties and characterization", Critical Reviews in Food Science and Nutrition, pp. 1-33.
[142]. Haluzík M., Kratochvílová H., Haluzíková D., and Mráz M. (2018), "Gut as an emerging organ for the treatment of diabetes: focus on mechanism of action of bariatric and endoscopic interventions", Journal of Endocrinology. 237(1), pp. R1-R17.
[143]. Han H.S., Kang G., Kim J.S., Choi B.H., and Koo S.H. (2016), "Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective", Exp Mol Med. 48(3), pp. e218. [144]. Handa S., Rakesh D., and Vasisht K. (2006), "Compendium of medicinal and aromatic plants Asia", ICS UNIDO Asia. 2 pp. 305.
[145]. He L., Yang F.Q., Tang P., Gao T.H., Yang C.X., Tan L., Yue P., Hua Y.N., Liu S.J., and Guo J.L. (2022), "Regulation of the intestinal flora: A potential mechanism of natural medicines in the treatment of type 2 diabetes mellitus", Biomed Pharmacother. 151 pp. 113091.
[146]. Heendeniya S., Ratnasooriya W., and Pathirana R. (2018), "In vitro investigation of anti-inflammatory activity and evaluation of phytochemical profile of Syzygium caryophyllatum", Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry. 7(1), pp. 1759-1763.
[147]. Hiyoshi T., Fujiwara M., and Yao Z. (2017), "Postprandial hyperglycemia and postprandial hypertriglyceridemia in type 2 diabetes", J Biomed Res. 33(1), pp. 1-16.
and microencapsulation properties of
[148]. Hogan S.A., McNamee B.F., O’Riordan E.D., and O’Sullivan M. (2001), sodium "Emulsification caseinate/carbohydrate blends", International Dairy Journal. 11(3), pp. 137-144. [149]. Holtta-Vuori M., Salo V.T., Nyberg L., Brackmann C., Enejder A., Panula P., and Ikonen E. (2010), "Zebrafish: gaining popularity in lipid research", Biochem J. 429(2), pp. 235-242.
[150]. Hong T., Yin J.Y., Nie S.P., and Xie M.Y. (2021), "Applications of infrared spectroscopy in polysaccharide structural analysis: Progress, challenge and perspective", Food Chem X. 12 pp. 100168.
[151]. Horakova O., Kroupova P., Bardova K., Buresova J., Janovska P., Kopecky J., and Rossmeisl M. (2019), "Metformin acutely lowers blood glucose levels by inhibition of intestinal glucose transport", Sci Rep. 9(1), pp. 6156.
[152]. Hossain H., Rahman S.E., Akbar P.N., Khan T.A., Rahman M.M., and Jahan I.A. (2016), "HPLC profiling, antioxidant and in vivo anti-inflammatory activity of the ethanol extract of Syzygium jambos available in Bangladesh", BMC Research Notes. 9(1), pp. 191.
163
[153]. Hossain H., Rahman S.E., Akbar P.N., Khan T.A., Rahman M.M., and Jahan I.A. (2016), "HPLC profiling, antioxidant and in vivo anti-inflammatory activity of the ethanol extract of Syzygium jambos available in Bangladesh", BMC Res Notes. 9(1), pp. 191.
[154]. Hossain R., Rahman M.A., Rafi M.K.J., Siddique T.A., Noman A.A., Makki A., Alelwani W., Hajjar D., and Tangpong J. (2020), "Pharmacological and ADMET-based pharmacokinetic properties of Syzygium samarangense var. parviflorum leaf extract in in vitro, in vivo and in silico models", Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca. 48(3), pp. 1155-1175.
[155]. Hosseini A., Razavi B.M., Banach M., and Hosseinzadeh H. (2021), "Quercetin and metabolic syndrome: A review", Phytotherapy Research. 35(10), pp. 5352-5364.
[156]. Howe K., Clark M.D., Torroja C.F., Torrance J., Berthelot C., Muffato M., Collins J.E., Humphray S., McLaren K., Matthews L., McLaren S., Sealy I., Caccamo M., Churcher C., Scott C., Barrett J.C., Koch R., Rauch G.J., White S., Chow W., Kilian B., Quintais L.T., Guerra-Assuncao J.A., Zhou Y., Gu Y., Yen J., Vogel J.H., Eyre T., Redmond S., Banerjee R., Chi J., Fu B., Langley E., Maguire S.F., Laird G.K., Lloyd D., Kenyon E., Donaldson S., Sehra H., Almeida-King J., Loveland J., Trevanion S., Jones M., Quail M., Willey D., Hunt A., Burton J., Sims S., McLay K., Plumb B., Davis J., Clee C., Oliver K., Clark R., Riddle C., Elliot D., Threadgold G., Harden G., Ware D., Begum S., Mortimore B., Kerry G., Heath P., Phillimore B., Tracey A., Corby N., Dunn M., Johnson C., Wood J., Clark S., Pelan S., Griffiths G., Smith M., Glithero R., Howden P., Barker N., Lloyd C., Stevens C., Harley J., Holt K., Panagiotidis G., Lovell J., Beasley H., Henderson C., Gordon D., Auger K., Wright D., Collins J., Raisen C., Dyer L., Leung K., Robertson L., Ambridge K., Leongamornlert D., McGuire S., Gilderthorp R., Griffiths C., Manthravadi D., Nichol S., Barker G., Whitehead S., Kay M., Brown J., Murnane C., Gray E., Humphries M., Sycamore N., Barker D., Saunders D., Wallis J., Babbage A., Hammond S., Mashreghi- Mohammadi M., Barr L., Martin S., Wray P., Ellington A., Matthews N., Ellwood M., Woodmansey R., Clark G., Cooper J., Tromans A., Grafham D., Skuce C., Pandian R., Andrews R., Harrison E., Kimberley A., Garnett J., Fosker N., Hall R., Garner P., Kelly D., Bird C., Palmer S., Gehring I., Berger A., Dooley C.M., Ersan-Urun Z., Eser C., Geiger H., Geisler M., Karotki L., Kirn A., Konantz J., Konantz M., Oberlander M., Rudolph- Geiger S., Teucke M., Lanz C., Raddatz G., Osoegawa K., Zhu B., Rapp A., Widaa S., Langford C., Yang F., Schuster S.C., Carter N.P., Harrow J., Ning Z., Herrero J., Searle S.M., Enright A., Geisler R., Plasterk R.H., Lee C., Westerfield M., de Jong P.J., Zon L.I., Postlethwait J.H., Nusslein-Volhard C., Hubbard T.J., Roest Crollius H., Rogers J. and Stemple D.L. (2013), "The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome", Nature. 496(7446), pp. 498-503.
[157]. Huang D.-D., Shi G., Jiang Y., Yao C., and Zhu C. (2020), "A review on the potential of Resveratrol in prevention and therapy of diabetes and diabetic complications", Biomedicine & Pharmacotherapy. 125 pp. 109767.
[158]. Huang K., Liang X.-c., Zhong Y.-l., He W.-y., and Wang Z. (2015), "5- Caffeoylquinic acid decreases diet-induced obesity in rats by modulating PPARα
164
and LXRα transcription", Journal of the Science of Food and Agriculture. 95(9), pp. 1903-1910.
[159]. Ito A., Matsui Y., Takeshita M., Katashima M., Goto C., and Kuriki K. (2023), "Gut microbiota-mediated associations of green tea and catechin intakes with glucose metabolism in individuals without type 2 diabetes mellitus: a four- season observational study with mediation analysis", Archives of Microbiology. 205(5), pp. 191.
[160]. Janaswamy S. (2014), "Encapsulation altered starch digestion: Toward developing starch-based delivery systems", Carbohydrate Polymers. 101 pp. 600-605.
[161]. Janiszewska-Turak E., Hornowska Ł., Pobiega K., Gniewosz M., and Witrowa-Rajchert D. (2021), "The influence of Lactobacillus bacteria type and kind of carrier on the properties of spray-dried microencapsules of fermented beetroot powders", International Journal of Food Science & Technology. 56(5), pp. 2166-2174.
[162]. Jideani A.I.O., Silungwe H., Takalani T.K., Omolola A.O., Udeh H.O., and Anyasi T.A. (2021), "Antioxidant-rich natural fruit and vegetable products and human health", International Journal of Food Properties. 24 pp. 41 - 67. [163]. Jin S., Chang C., Zhang L., Liu Y., Huang X., and Chen Z. (2015), "Chlorogenic Acid Improves Late Diabetes through Adiponectin Receptor Signaling Pathways in db/db Mice", Plos One. 10(4), pp. e0120842. [164]. John M., Gopinath D., and Kalra S. (2015), "Triple fixed drug combinations in type 2 diabetes", Indian J Endocrinol Metab. 19(3), pp. 311-313.
[165]. Jolliffe I.T. and Cadima J. (2016), "Principal component analysis: a review and recent developments", Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374(2065), pp. 20150202.
[166]. Kanwugu O.N., Glukhareva T.V., Danilova I.G., and Kovaleva E.G. (2022), "Natural antioxidants in diabetes treatment and management: prospects of astaxanthin", Crit Rev Food Sci Nutr. 62(18), pp. 5005-5028.
[167]. Karwasra B.L., Gill B.S., and Kaur M. (2017), "Rheological and structural properties of starches from different Indian wheat cultivars and their relationships", International Journal of Food Properties. 20(sup1), pp. S1093- S1106.
[168]. Kasetti R.B., Rajasekhar M.D., Kondeti V.K., Fatima S.S., Kumar E.G., Swapna S., Ramesh B., and Rao C.A. (2010), "Antihyperglycemic and antihyperlipidemic activities of methanol:water (4:1) fraction isolated from aqueous extract of Syzygium alternifolium seeds in streptozotocin induced diabetic rats", Food Chem Toxicol. 48(4), pp. 1078-1084.
[169]. Kechinski C.P., Guimarães P.V.R., Noreña C.P.Z., Tessaro I.C., and Marczak L.D.F. (2010), "Degradation Kinetics of Anthocyanin in Blueberry Juice during Thermal Treatment", Journal of Food Science. 75(2), pp. C173-C176. [170]. Keller P.J. (2013), "In vivo imaging of zebrafish embryogenesis", Methods. 62(3), pp. 268-278. [171]. Kim M.J. and Kim H.K. (2009), "Perilla leaf extract ameliorates obesity and dyslipidemia induced by high-fat diet", Phytother Res. 23(12), pp. 1685-1690.
[172]. Kim S., Semple S.J., Simpson B.S., and Deo P. (2020), "Antioxidant and Antiglycation Activities of Syzygium paniculatum Gaertn and Inhibition of Digestive Enzymes Relevant to Type 2 Diabetes Mellitus", Plant Foods Hum Nutr. 75(4), pp. 621-627.
165
[173]. Kinkel M.D. and Prince V.E. (2009), "On the diabetic menu: zebrafish as a
model for pancreas development and function", Bioessays. 31(2), pp. 139-152.
[174]. Kirchner H., Sinha I., Gao H., Ruby M.A., Schönke M., Lindvall J.M., Barrès R., Krook A., Näslund E., Dahlman-Wright K., and Zierath J.R. (2016), "Altered DNA methylation of glycolytic and lipogenic genes in liver from obese and type 2 diabetic patients". Molecular metabolism. 5, 171-183 DOI: 10.1016/j.molmet.2015.12.004.
[175]. Kj S., Krishnakumar G., and Hegde K. (2023), "Comparative study on the Antidiabetic activity of the bark extracts of Syzygium caryophyllatum (L.) Alston and Syzygium zeylanicum (L.) DC", The Journal of Phytopharmacology. 12 pp. 326-333.
[176]. Knudsen J.G., Hamilton A., Ramracheya R., Tarasov A.I., Brereton M., Haythorne E., Chibalina M.V., Spégel P., Mulder H., Zhang Q., Ashcroft F.M., Adam J., and Rorsman P. (2019), "Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production", Cell Metab. 29(2), pp. 430-442.e434.
[177]. Kocsis T., Molnár B., Németh D., Hegyi P., Szakács Z., Bálint A., Garami A., Soós A., Márta K., and Solymár M. (2020), "Probiotics have beneficial metabolic effects in patients with type 2 diabetes mellitus: a meta-analysis of randomized clinical trials", Scientific Reports. 10(1), pp. 11787.
[178]. Kong M., Xie K., Lv M., Li J., Yao J., Yan K., Wu X., Xu Y., and Ye D. (2021), "Anti-inflammatory phytochemicals for the treatment of diabetes and its complications: Lessons learned and future promise", Biomed Pharmacother. 133 pp. 110975.
[179]. Krentz A. and Bailey C. (2005), "Oral antidiabetic agents: Current role in type 2 diabetes mellitus", Drugs. 65 pp. 385-411.
[180]. Kuang S.S., Oliveira J.C., and Crean A.M. (2010), "Microencapsulation as a tool for incorporating bioactive ingredients into food", Crit Rev Food Sci Nutr. 50(10), pp. 951-968.
[181]. Kuck L.S., Wesolowski J.L., and Noreña C.P.Z. (2017), "Effect of temperature and relative humidity on stability following simulated gastro-intestinal digestion of microcapsules of Bordo grape skin phenolic extract produced with different carrier agents", Food Chemistry. 230 pp. 257-264.
[182]. Kunyanga C.N., Imungi J.K., Okoth M., Momanyi C., Biesalski H.K., and Vadivel V. (2011), "Antioxidant and antidiabetic properties of condensed tannins in acetonic extract of selected raw and processed indigenous food ingredients from Kenya", J Food Sci. 76(4), pp. C560-567.
[183]. Kuroda M., Mimaki Y., Ohtomo T., Yamada J., Nishiyama T., Mae T., Kishida H., and Kawada T. (2012), "Hypoglycemic effects of clove (Syzygium aromaticum flower buds) on genetically diabetic KK-Ay mice and identification of the active ingredients", J Nat Med. 66(2), pp. 394-399.
[184]. Kwok A.L.X., Balasooriya H., and Ng K. (2023), "Efficacy of ellagic acid and ellagitannins on diabetes mellitus: A meta-analysis of preclinical and clinical trials", Food Bioscience. 53 pp. 102573.
[185]. Kwon Y.-I.I., Vattem D.A., and Shetty K. (2006), "Evaluation of clonal herbs of Lamiaceae species for management of diabetes and hypertension", Asia pacific journal of clinical nutrition. 15(1), pp. 107-118.
166
[186]. Kha T.C., Nguyen M.H., Roach P.D., and Stathopoulos C.E. (2014), "Microencapsulation of Gac oil: Optimisation of spray drying conditions using response surface methodology", Powder Technology. 264 pp. 298-309. [187]. Khalili L., Alipour B., Asghari Jafar-Abadi M., Faraji I., Hassanalilou T., Mesgari Abbasi M., Vaghef-Mehrabany E., and Alizadeh Sani M. (2019), "The Effects of Lactobacillus casei on Glycemic Response, Serum Sirtuin1 and Fetuin-A Levels in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus: A Randomized Controlled Trial", Iran Biomed J. 23(1), pp. 68-77.
[188]. Khamchan A., Paseephol T., and Hanchang W. (2018), "Protective effect of wax apple (Syzygium samarangense (Blume) Merr. & L.M. Perry) against streptozotocin-induced pancreatic ß-cell damage in diabetic rats", Biomedicine & Pharmacotherapy. 108 pp. 634-645.
[189]. Khameneh B., Iranshahy M., Soheili V., and Fazly Bazzaz B.S. (2019), "Review on plant antimicrobials: a mechanistic viewpoint", Antimicrobial Resistance & Infection Control. 8(1), pp. 118.
[190]. Khan M.A.B., Hashim M.J., King J.K., Govender R.D., Mustafa H., and Al Kaabi J. (2020), "Epidemiology of Type 2 Diabetes - Global Burden of Disease and Forecasted Trends", J Epidemiol Glob Health. 10(1), pp. 107-111.
[191]. Khanh T.H., Ban P.H., and Hợi T.M. (2020), "Thành phần hóa học tinh dầu loài Tiểu sim (Rhodamnia dumetorum (Poir.) Merr. & Perry) và Trâm tích lan (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)", Bản B của Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 62(11).
[192]. Khathi A., Serumula M.R., Myburg R.B., Van Heerden F.R., and Musabayane C.T. (2013), "Effects of Syzygium aromaticum-derived triterpenes on postprandial blood glucose in streptozotocin-induced diabetic rats following carbohydrate challenge", Plos One. 8(11), pp. e81632.
[193]. Khin P.P., Lee J.H., and Jun H.-S. (2023), "Pancreatic Beta-cell Dysfunction Inflammation. 21 pp. in Type 2 Diabetes", European Journal of 1721727X231154152. [194]. Labuschagne P.
(2018), "Impact of wall material physicochemical characteristics on the stability of encapsulated phytochemicals: A review", Food Research International. 107 pp. 227-247. [195]. Laddha A.P. and Kulkarni Y.A. (2019), "Tannins and vascular complications of Diabetes: An update", Phytomedicine. 56 pp. 229-245.
[196]. Lago C.C. and Noreña C.P.Z. (2017), "Thermodynamic and kinetics study of phenolics degradation and color of yacon (Smallanthus sonchifolius) microparticles under accelerated storage conditions", Journal of Food Science and Technology. 54(13), pp. 4197-4204.
[197]. Lakstygal A.M., de Abreu M.S., Lifanov D.A., Wappler-Guzzetta E.A., Serikuly N., Alpsyshov E.T., Wang D., Wang M., Tang Z., Yan D., Demin K.A., Volgin A.D., Amstislavskaya T.G., Wang J., Song C., Alekseeva P., and Kalueff A.V. (2019), "Zebrafish models of diabetes-related CNS pathogenesis", Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 92 pp. 48-58.
[198]. Lee Y. and Yang J. (2021), "Development of a zebrafish screening model for diabetic retinopathy induced by hyperglycemia: Reproducibility verification in animal model", Biomedicine & Pharmacotherapy. 135 pp. 111201. [199]. Lehmann A. and Hornby P.J. (2016), "Intestinal SGLT1 in metabolic health and disease", Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310(11), pp. G887-898.
167
[200]. Lenzen S., Lortz S., and Tiedge M. (1996), "Effect of metformin on SGLT1, GLUT2, and GLUT5 hexose transporter gene expression in small intestine from rats", Biochem Pharmacol. 51(7), pp. 893-896. [201]. Lê S., Josse J., and Husson F. (2008), "FactoMineR: an R package for multivariate analysis", Journal of Statistical Software. 25 pp. 1-18.
[202]. Li G., Lou M., and Qi X. (2022), "A brief overview of classical natural product drug synthesis and bioactivity", Organic Chemistry Frontiers. 9(2), pp. 517-571. [203]. Li S., Lei D., Zhu Z., Cai J., Manzoli M., Jicsinszky L., Grillo G., and Cravotto G. (2021), "Complexation of maltodextrin-based inulin and green tea polyphenols via different ultrasonic pretreatment", Ultrason Sonochem. 74 pp. 105568.
[204]. Li W.Z., Stirling K., Yang J.J., and Zhang L. (2020), "Gut microbiota and diabetes: From correlation to causality and mechanism", World J Diabetes. 11(7), pp. 293-308.
[205]. Li X., Zhang Z.H., Qiao J., Qu W., Wang M.S., Gao X., Zhang C., Brennan C.S., and Qi X. (2022), "Improvement of betalains stability extracted from red dragon fruit peel by ultrasound-assisted microencapsulation with maltodextrin", Ultrason Sonochem. 82 pp. 105897.
[206]. Liang T., Liang Z., Wu S., Ding Y., Wu Q., and Gu B. (2023), "Global prevalence of Staphylococcus aureus in food products and its relationship with the occurrence and development of diabetes mellitus", Medicine Advances. 1(1), pp. 53-78.
[207]. Lieke T., Steinberg C.E.W., Meinelt T., Knopf K., and Kloas W. (2022), "Modification of the chemically induced inflammation assay reveals the Janus face of a phenol rich fulvic acid", Sci Rep. 12(1), pp. 5886. [208]. Lim G.E. and Brubaker P.L. (2006), "Glucagon-Like Peptide 1 Secretion by the L-Cell", Diabetes. 55(Supplement_2), pp. S70-S77.
[209]. Lin X., Xu Y., Pan X., Xu J., Ding Y., Sun X., Song X., Ren Y., and Shan P.F. (2020), "Global, regional, and national burden and trend of diabetes in 195 countries and territories: an analysis from 1990 to 2025", Sci Rep. 10(1), pp. 14790.
[210]. Liu L., Zhang C., Zhai M., Yu T., Pei M., Du P., Li A., Yan J., Li C., and Zhang G. (2023), "Effect of chlorogenic acid on lipid metabolism in 3T3-L1 cells induced by oxidative stress", Food Bioscience. 51 pp. 102330.
to carbohydrate foods with a
[211]. Livesey G. and Tagami H. (2009), "Interventions to lower the glycemic response low-viscosity fiber (resistant maltodextrin): meta-analysis of randomized controlled trials", The American Journal of Clinical Nutrition. 89(1), pp. 114-125.
[212]. Lobiuc A., Pavăl N.-E., Mangalagiu I.I., Gheorghiță R., Teliban G.-C., Amăriucăi-Mantu D., and Stoleru V. (2023), "Future Antimicrobials: Natural and Functionalized Phenolics", Molecules. 28(3), pp. 1114.
[213]. Lorincz R., Emfinger C.H., Walcher A., Giolai M., Krautgasser C., Remedi M.S., Nichols C.G., and Meyer D. (2018), "In vivo monitoring of intracellular Ca(2+) dynamics in the pancreatic β-cells of zebrafish embryos", Islets. 10(6), pp. 221-238. [214]. Lourenço S.C., Moldão-Martins M., and Alves V.D.
(2020), "Microencapsulation of Pineapple Peel Extract by Spray Drying Using Maltodextrin, Inulin, and Arabic Gum as Wall Matrices", Foods. 9(6).
168
[215]. Lu W., Yang X., Shen J., Li Z., Tan S., Liu W., and Cheng Z. (2021), "Choosing the appropriate wall materials for spray-drying microencapsulation of natural bioactive ingredients: Taking phenolic compounds as examples", Powder Technology. 394 pp. 562-574.
[216]. M V. and Wang K. (2021), "Dietary natural products as a potential inhibitor towards advanced glycation end products and hyperglycemic complications: A phytotherapy approaches", Biomedicine & Pharmacotherapy. 144 pp. 112336.
[217]. Ma X., Chen Z., Wang L., Wang G., Wang Z., Dong X., Wen B., and Zhang Z. (2018), "The Pathogenesis of Diabetes Mellitus by Oxidative Stress and Inflammation: Its Inhibition by Berberine", Front Pharmacol. 9 pp. 782. [218]. Mahmood N. (2014), "A review of α-amylase inhibitors on weight loss and glycemic control in pathological state such as obesity and diabetes", Comparative Clinical Pathology. 25(6), pp. 1253-1264.
[219]. Mai T.T., Thu N.N., Tien P.G., and Van Chuyen N. (2007), "Alpha-glucosidase inhibitory and antioxidant activities of Vietnamese edible plants and their relationships with polyphenol contents", J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 53(3), pp. 267-276.
[220]. Maia J.L., Dantas T.N.P., Neto B.P.d.C., Borges K.C., Lima E.C., da Mata A.L.d.M.L., de Medeiros M.d.F.D., and Pereira C.G. (2019), "Extract of spray‐dried Malay apple (Syzygium malaccense L.) skin", Journal of Food Process Engineering. 42(8), pp. e13275.
[221]. Malakar P., Chartarifsky L., Hija A., Leibowitz G., Glaser B., Dor Y., and Karni R. (2016), "Insulin receptor alternative splicing is regulated by insulin signaling and modulates beta cell survival", Scientific Reports. 6(1), pp. 31222. [222]. Maleki V., Abbaszadeh S., Seyyed Shoura S.M., Sohrabnavi A., Sepandi M., and Taghdir M. (2023), "Potential roles of ellagic acid on metabolic variables in diabetes mellitus: A systematic review", Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 50(2), pp. 121-131.
[223]. Manaharan T., Appleton D., Cheng H.M., and Palanisamy U.D. (2012), leaf extract as potential isolated from Syzygium aqueum "Flavonoids antihyperglycaemic agents", Food Chemistry. 132(4), pp. 1802-1807. [224]. Mather A. and Pollock C. (2011), "Glucose handling by the kidney", Kidney Int Suppl. 79(120), pp. S1-6.
[225]. Mayas M.D., Ortega F.J., Macías-González M., Bernal R., Gómez-Huelgas R., Fernández-Real J.M., and Tinahones F.J. (2010), "Inverse relation between FASN expression in human adipose tissue and the insulin resistance level", Nutr Metab (Lond). 7 pp. 3.
[226]. Md Razip N.N., Mohd Noor S., Norazit A., Nordin N., Sakeh N.M., and Khaza'ai H. (2022), "An Association between Insulin Resistance and Neurodegeneration in Zebrafish Larval Model (Danio rerio)", Int J Mol Sci. 23(15).
[227]. Mechchate H., Es-safi I., Haddad H., Bekkari H., Grafov A., and Bousta D. (2021), "Combination of Catechin, Epicatechin, and Rutin: Optimization of a novel complete antidiabetic formulation using a mixture design approach", The Journal of Nutritional Biochemistry. 88 pp. 108520.
[228]. Medina-Pérez G., Estefes-Duarte J.A., Afanador-Barajas L.N., Fernández- Luqueño F., Zepeda-Velásquez A.P., Franco-Fernández M.J., Peláez-Acero A., and Campos-Montiel R.G. (2020), "Encapsulation Preserves Antioxidant
169
and Antidiabetic Activities of Cactus Acid Fruit Bioactive Compounds under Simulated Digestion Conditions", Molecules. 25(23).
[229]. Melkonian E.A., Asuka E., and Schury M.P. (2023), "Physiology, Gluconeogenesis", in StatPearlsStatPearls Publishing Copyright © 2023, StatPearls Publishing LLC.: Treasure Island (FL) ineligible companies. Disclosure: Edinen Asuka declares no relevant financial relationships with ineligible companies. Disclosure: Mark Schury declares no relevant financial relationships with ineligible companies.
[230]. Menendez J.A., Vazquez-Martin A., Ortega F.J., and Fernandez-Real J.M. (2009), "Fatty Acid Synthase: Association with Insulin Resistance, Type 2 Diabetes, and Cancer", Clinical Chemistry. 55(3), pp. 425-438.
[231]. Meng X.-H., Chen B., and Zhang J.-P. (2017), "Intracellular Insulin and Impaired Autophagy in a Zebrafish model and a Cell Model of Type 2 diabetes", International Journal of Biological Sciences. 13(8), pp. 985-995.
[232]. Min S.H., Yoon J.-H., Moon S.J., Hahn S., and Cho Y.M. (2018), "Combination of sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor and dipeptidyl peptidase-4 inhibitor in type 2 diabetes: a systematic review with meta-analysis", Scientific Reports. 8(1), pp. 4466.
[233]. Mirke N.B., Shelke P.S., Malavdkar P.R., and Jagtap P.N. (2020), "In vitro protein denaturation inhibition assay of Eucalyptus globulus and Glycine max for potential anti-inflammatory activity", Innov. Pharm. Pharmacother. 8 pp. 28-31. [234]. Miyamoto K., Hase K., Taketani Y., Minami H., Oka T., Nakabou Y., and Hagihira H. (1991), "Diabetes and glucose transporter gene expression in rat small intestine", Biochem Biophys Res Commun. 181(3), pp. 1110-1117. [235]. Mizoguchi M., Takemori H., Furukawa S., Ito M., Asai M., Morino H., Miura T., Yabe D., and Shibata T. (2023), "Increased expression of glucagon- like peptide-1 and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in the ileum and colon in mouse treated with metformin", Endocr J. 70(2), pp. 149-159. [236]. Monnier L., Lapinski H., and Colette C. (2003), "Contributions of fasting and postprandial plasma glucose increments to the overall diurnal hyperglycemia of type 2 diabetic patients: variations with increasing levels of HbA(1c)", Diabetes Care. 26(3), pp. 881-885.
[237]. Moradi-Marjaneh R., Paseban M., and Sahebkar A. (2019), "Natural products with SGLT2 inhibitory activity: Possibilities of application for the treatment of diabetes", Phytotherapy Research. 33(10), pp. 2518-2530. [238]. Moreira A., Kahlenberg S., and Hornsby P. (2017), "Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for diabetes", J Mol Endocrinol. 59(3), pp. R109-R120. [239]. Moreira R.O., Cobas R., and Lopes Assis Coelho R.C. (2018), "Combination of basal insulin and GLP-1 receptor agonist: is this the end of basal insulin alone in the treatment of type 2 diabetes?", Diabetol Metab Syndr. 10 pp. 26. [240]. Moss L.G., Caplan T.V., and Moss J.B. (2013), "Imaging beta cell regeneration and interactions with islet vasculature in transparent adult zebrafish", Zebrafish. 10(2), pp. 249-257.
[241]. Moualek I., Iratni Aiche G., Mestar Guechaoui N., Lahcene S., and Houali K. (2016), "Antioxidant and anti-inflammatory activities of Arbutus unedo aqueous extract", Asian Pacific journal of tropical biomedicine. 6(11), pp. 937- 944.
[242]. Muller T.D., Finan B., Bloom S.R., D'Alessio D., Drucker D.J., Flatt P.R., Fritsche A., Gribble F., Grill H.J., Habener J.F., Holst J.J., Langhans W.,
170
Meier J.J., Nauck M.A., Perez-Tilve D., Pocai A., Reimann F., Sandoval D.A., Schwartz T.W., Seeley R.J., Stemmer K., Tang-Christensen M., Woods S.C., DiMarchi R.D., and Tschop M.H. (2019), "Glucagon-like peptide 1 (GLP-1)", Mol Metab. 30 pp. 72-130.
[243]. Muniz-Ramirez A., Garcia-Campoy A.H., Perez Gutierrez R.M., Garcia Baez E.V., and Mota Flores J.M. (2021), "Evaluation of the Antidiabetic and Antihyperlipidemic Activity of Spondias purpurea Seeds in a Diabetic Zebrafish Model", Plants (Basel, Switzerland). 10(7), pp. 1417.
[244]. Nájera-Martínez E.F., Flores-Contreras E.A., Araújo R.G., Iñiguez-Moreno M., Sosa-Hernández J.E., Iqbal H.M.N., Pastrana L.M., Melchor-Martínez E.M., and Parra-Saldívar R. (2023), "Microencapsulation of Gallic Acid Based on a Polymeric and pH-Sensitive Matrix of Pectin/Alginate", Polymers (Basel). 15(14). [245]. Nanjan M.J. and Betz J. (2014), "Resveratrol for the Management of Diabetes and its Downstream Pathologies", Eur Endocrinol. 10(1), pp. 31-35.
[246]. Naraki K., Ghasemzadeh Rahbardar M., Ajiboye B.O., and Hosseinzadeh H. (2023), "The effect of ellagic acid on the metabolic syndrome: A review article", Heliyon. 9(11).
[247]. Navarro-Flores M.J., Ventura-Canseco L.M.C., Meza-Gordillo R., Ayora- Talavera T.D.R., and Abud-Archila M. (2020), "Spray drying encapsulation of a native plant extract rich in phenolic compounds with combinations of maltodextrin and non-conventional wall materials", J Food Sci Technol. 57(11), pp. 4111-4122.
[248]. Naz R., Ayub H., Nawaz S., Islam Z.U., Yasmin T., Bano A., Wakeel A., Zia S., and Roberts T.H. (2017), "Antimicrobial activity, toxicity and anti- inflammatory potential of methanolic extracts of four ethnomedicinal plant species from Punjab, Pakistan", BMC Complement Altern Med. 17(1), pp. 302.
[249]. Negre-Salvayre A., Salvayre R., Auge N., Pamplona R., and Portero-Otin M. (2009), "Hyperglycemia and glycation in diabetic complications", Antioxid Redox Signal. 11(12), pp. 3071-3109.
[250]. Ni M., Hu X., Gong D., and Zhang G. (2020), "Inhibitory mechanism of vitexin on α-glucosidase and its synergy with acarbose", Food Hydrocolloids. 105 pp. 105824.
[251]. Nishimoto Y., Mizuguchi Y., Mori Y., Ito M., Miyazato S., Kishimoto Y., Yamada T., and Fukuda S. (2022), "Resistant Maltodextrin Intake Reduces Virulent Metabolites in the Gut Environment: A Randomized Control Study in a Japanese Cohort", Front Microbiol. 13 pp. 644146. [252]. Niu Y., Cui W., Liu R., Wang S., Ke H., Lei X., and Chen L. (2022), "Structural mechanism of SGLT1 inhibitors", Nat Commun. 13(1), pp. 6440.
[253]. Nogalska A., Sucajtys-Szulc E., and Swierczynski J. (2005), "Leptin decreases lipogenic enzyme gene expression through modification of SREBP-1c gene expression in white adipose tissue of aging rats", Metabolism. 54(8), pp. 1041- 1047.
[254]. Nomi Y., Shimizu S., Sone Y., Tuyet M.T., Gia T.P., Kamiyama M., Shibamoto T., Shindo K., and Otsuka Y. (2012), "Isolation and antioxidant activity of zeylaniin A, a new macrocyclic ellagitannin from Syzygium zeylanicum leaves", J Agric Food Chem. 60(41), pp. 10263-10269.
[255]. Norton L., Shannon C.E., Fourcaudot M., Hu C., Wang N., Ren W., Song J., Abdul-Ghani M., DeFronzo R.A., Ren J., and Jia W. (2017), "Sodium-glucose
171
co-transporter (SGLT) and glucose transporter (GLUT) expression in the kidney of type 2 diabetic subjects", Diabetes, Obesity and Metabolism. 19(9), pp. 1322- 1326. [256]. Noshad M., Mohebbi M., Koocheki A., and Shahidi F.
(2015), "Microencapsulation of vanillin by spray drying using soy protein isolate– maltodextrin as wall material", Flavour and Fragrance Journal. 30(5), pp. 387- 391.
[257]. Nurliana L., Kurniawati D., Kadir L., Dewi F., and Musta R. (2020), Effectiveness of Maltodextrin as a Coating in Microencapsulation of Clove Leaves Oil (Syzygium aromaticum) for Antibacterial Applications. in IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. IOP Publishing.
[258]. Ngubane P.S., Masola B., and Musabayane C.T. (2011), "The effects of Syzygium aromaticum-derived oleanolic acid on glycogenic enzymes in streptozotocin-induced diabetic rats", Ren Fail. 33(4), pp. 434-439.
[259]. Nguyen A.D., Nguyen Q.V., and Wang S.-L. (2017), "Porcine pancreatic α- amylase inhibitors from Euonymus laxiflorus Champ", Research on Chemical Intermediates. 43(1), pp. 259-269.
[260]. Nguyen Q.-V., Doan M.-D., Bui Thi B.-H., Nguyen M.-T., Tran Minh D., Nguyen A.-D., Le T.-M., Nguyen T.-H., Nguyen T.-D., Tran V.-C., and Hoang V.-C. (2022), "The effect of drying methods on chlorophyll, polyphenol, flavonoids, phenolic compounds contents, color and sensory properties, and in vitro antioxidant and anti-diabetic activities of dried wild guava leaves", Drying technology, pp. 1-12.
[261]. Nguyen Q.-V. and Eun J.-B. (2011), "Antioxidant activity of solvent extracts from Vietnamese medicinal plants", Journal of Medicinal Plants Research. 5(13), pp. 2798-2811.
[262]. Nguyen Q.-V., Eun J.-B., Wang S.-L., Nguyen D.H., Tran T.N., and Nguyen A.D. (2016), "Anti-oxidant and antidiabetic effect of some medicinal plants belong to Terminalia species collected in Dak Lak Province, Vietnam", Research on Chemical Intermediates. 42(6), pp. 5859-5871.
[263]. Nguyen Q.-V., Nguyen N.-H., Wang S.-L., and Nguyen A.D. (2017), "Free radical scavenging and antidiabetic activities of Euonymus laxiflorus Champ. extract", Research on Chemical Intermediates. 43(10), pp. 5615-5624.
[264]. Nguyen Q.V., Nguyen A.D., and Wang S.-L. (2017), "Screening and evaluation of α-glucosidase inhibitors from indigenous medicinal plants in Dak Lak Province, Vietnam", Research on Chemical Intermediates. 43(6), pp. 3599-3612. [265]. Nguyen Q.V., Pham V.H., and Nguyen A.D. (2021), "Antioxidant and hypoglycemic activities of various solvent fractions of methanol extract of Terminalia alata Heyne ex Roth trunk-bark", Nova Biotechnologica et Chimica. 20(1), pp. 748.
[266]. Nguyen Q.V., Wang S.-L., and Nguyen A.D. (2018), "In vitro α-glucosidase and α-amylase inhibition, and in vivo anti-hyperglycemic effects of Psidium littorale Raddi leaf extract", Research on Chemical Intermediates. 44(3), pp. 1745-1753. [267]. Nguyen T.H., Le H.D., Kim T.N.T., The H.P., Nguyen T.M., Cornet V., Lambert J., and Kestemont P. (2020), "Anti-Inflammatory and Antioxidant Properties of the Ethanol Extract of Clerodendrum cyrtophyllum Turcz in Copper Sulfate-Induced Inflammation in Zebrafish", Antioxidants (Basel). 9(3). [268]. Nguyen V.B., Wang S.-L., Nguyen T.H., Doan C.T., Tran T.N., Kuo Y.-H., Nguyen Q.V., and Nguyen A.D. (2019), "New indications of potential rat
172
intestinal α-glucosidase inhibition by Syzygium zeylanicum (L.) and its hypoglycemic effect in mice", Research on Chemical Intermediates. 45(12), pp. 6061-6071.
[269]. Nguyen V.B., Wang S.-L., Nguyen T.H., Nguyen M.T., Doan C.T., Tran T.N., Lin Z.-H., Nguyen Q.V., Kuo Y.-H., and Nguyen A.D. (2018), "Novel potent hypoglycemic compounds from Euonymus laxiflorus Champ. and their effect on reducing plasma glucose in an ICR mouse model", Molecules. 23(8), pp. 1928.
[270]. Obafemi T.O., Jaiyesimi K.F., Olomola A.A., Olasehinde O.R., Olaoye O.A., Adewumi F.D., Afolabi B.A., Adewale O.B., Akintayo C.O., and Ojo O.A. (2021), "Combined effect of metformin and gallic acid on inflammation, antioxidant status, endoplasmic reticulum (ER) stress and glucose metabolism in fructose-fed streptozotocin-induced diabetic rats", Toxicology Reports. 8 pp. 1419-1427.
[271]. OECD (2002), Test No. 423: Acute Oral toxicity - Acute Toxic Class Method. [272]. OECD (2019), Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. [273]. Oguntibeju O.O. (2019), "Type 2 diabetes mellitus, oxidative stress and inflammation: examining the links", Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 11(3), pp. 45-63.
[274]. Oh D.Y. and Olefsky J.M. (2016), "G protein-coupled receptors as targets for anti-diabetic therapeutics", Nature Reviews Drug Discovery. 15(3), pp. 161-172. [275]. Oh S., Lee M., Ko K.S., Choi S., and Kim S.W. (2003), "GLP-1 gene delivery for the treatment of type 2 diabetes", Mol Ther. 7(4), pp. 478-483. [276]. Ohkuma K. and Wakabayashi S. (2008), Fibersol‐2: A Soluble, Non‐ Digestible, Starch‐Derived Dietary Fibre.
[277]. Okazaki F., Zang L., Nakayama H., Chen Z., Gao Z.-J., Chiba H., Hui S.-P., Aoki T., Nishimura N., and Shimada Y. (2019), "Microbiome Alteration in Type 2 Diabetes Mellitus Model of Zebrafish", Scientific Reports. 9(1), pp. 867. [278]. Okuno Y., Fukuhara A., Hashimoto E., Kobayashi H., Kobayashi S., Otsuki M., and Shimomura I. (2018), "Oxidative Stress Inhibits Healthy Adipose Expansion Through Suppression of SREBF1-Mediated Lipogenic Pathway", Diabetes. 67(6), pp. 1113-1127.
[279]. Omojokun O.S., Oboh G., Ademiluyi A.O., Oladele J.O., and Boligon A.A. (2021), "Impact of drying processes on Bryophyllum pinnatum phenolic constituents and its anti-inflammatory and antioxidative activities in human erythrocytes", J Food Biochem. 45(3), pp. e13298.
[280]. Oranje P., Gouka R., Burggraaff L., Vermeer M.A., Chalet C., Duchateau G., van der Pijl P.C., Geldof M., de Roo N., Clauwaert F., Vanpaeschen T., Nicolaï J., De Bruyn T., Annaert P., IJzerman A.P., and Westen G.V.v. (2019), "Novel natural and synthetic inhibitors of solute carriers SGLT1 and SGLT2", Pharmacology Research & Perspectives. 7.
[281]. Ormazabal V., Nair S., Elfeky O., Aguayo C., Salomon C., and Zuñiga F.A. (2018), "Association between insulin resistance and the development of cardiovascular disease", Cardiovascular Diabetology. 17(1), pp. 122.
[282]. Ozery M. and Wadhwa R. (2023), "Bromocriptine", in StatPearlsStatPearls Publishing Copyright © 2023, StatPearls Publishing LLC.: Treasure Island (FL) ineligible companies. Disclosure: Roopma Wadhwa declares no relevant financial relationships with ineligible companies. [283]. Ozkan G. and Bilek S.E. (2014), "Microencapsulation of natural food colourants", International Journal of Nutrition and Food Sciences. 3 pp. 145.
173
[284]. Ozkan G., Franco P., De Marco I., Xiao J., and Capanoglu E. (2019), "A review of microencapsulation methods for food antioxidants: Principles, advantages, drawbacks and applications", Food Chem. 272 pp. 494-506. [285]. Pai D.A., Vangala V.R., Ng J.W., Ng W.K., and Tan R.B.H. (2015), "Resistant maltodextrin as a shell material for encapsulation of naringin: Production and physicochemical characterization", Journal of Food Engineering. 161 pp. 68-74. [286]. Paini M., Aliakbarian B., Casazza A.A., Lagazzo A., Botter R., and Perego P. (2015), "Microencapsulation of phenolic compounds from olive pomace using spray drying: A study of operative parameters", LWT - Food Science and Technology. 62(1, Part 1), pp. 177-186.
[287]. Palierse E., Przybylski C., Brouri D., Jolivalt C., and Coradin T. (2020), "Interactions of Calcium with Chlorogenic and Rosmarinic Acids: An Experimental and Theoretical Approach", International Journal of Molecular Sciences. 21 pp. 4948.
[288]. Pan L., Ye H., Pi X., Liu W., Wang Z., Zhang Y., and Zheng J. (2023), "Effects of several flavonoids on human gut microbiota and its metabolism by in vitro simulated fermentation", Frontiers in Microbiology. 14.
[289]. Park K.S. (2015), "Raspberry ketone, a naturally occurring phenolic compound, inhibits adipogenic and lipogenic gene expression in 3T3-L1 adipocytes", Pharm Biol. 53(6), pp. 870-875.
[290]. Patel B.K., Patel K.H., and Moochhala S.M. (2023), "Gut microbiota intervention strategies using active components from medicinal herbs to evaluate clinical efficacy of type 2 diabetes – A review", Clinical and Translational Discovery. 3(1), pp. e170.
[291]. Patel S.S., Pushpadass H.A., Franklin M.E.E., Battula S.N., and Vellingiri P. (2022), "Microencapsulation of curcumin by spray drying: Characterization and fortification of milk", J Food Sci Technol. 59(4), pp. 1326-1340.
[292]. Peng J., Lu C., Luo Y., Su X., Li S., and Ho C.T. (2024), "Hypoglycemic effects and associated mechanisms of resveratrol and related stilbenes in diet", Food Funct. 15(5), pp. 2381-2405.
[293]. Peng S.-g., Pang Y.-l., Zhu Q., Kang J.-h., Liu M.-x., and Wang Z. (2018), "Chlorogenic Acid Functions as a Novel Agonist of PPARγ2 during the Differentiation of Mouse 3T3-L1 Preadipocytes", Biomed Research International. 2018(1), pp. 8594767.
[294]. Pérez-Burillo S., Hinojosa-Nogueira D., Pastoriza S., and Rufián-Henares J.A. (2020), "Plant extracts as natural modulators of gut microbiota community structure and functionality", Heliyon. 6(11), pp. e05474.
[295]. Pérez Gutiérrez R.M., Martínez Jerónimo F.F., Contreras Soto J.G., Muñiz Ramírez A., and Estrella Mendoza M.F. (2021), "Optimization of ultrasonic- assisted extraction of polyphenols from the polyherbal formulation of Cinnamomum verum, Origanum majorana, and Origanum vulgare and their anti- diabetic capacity in zebrafish (Danio rerio)", Heliyon, pp. e08682.
[296]. Perez Gutierrez R.M., Muniz-Ramirez A., Garcia-Campoy A.H., and Mota Flores J.M. (2021), "Evaluation of the Antidiabetic Potential of Extracts of Urtica dioica, Apium graveolens, and Zingiber officinale in Mice, Zebrafish, and Pancreatic beta-Cell", Plants (Basel, Switzerland). 10(7), pp. 1438. [297]. Petersen M.C. and Shulman G.I. (2018), "Mechanisms of Insulin Action and Insulin Resistance", Physiol Rev. 98(4), pp. 2133-2223.
174
[298]. Piñón-Balderrama C.I., Leyva-Porras C., Terán-Figueroa Y., Espinosa-Solís V., Álvarez-Salas C., and Saavedra-Leos M.Z. (2020), "Encapsulation of Active Ingredients in Food Industry by Spray-Drying and Nano Spray-Drying Technologies", Processes. 8(8), pp. 889.
[299]. Plamada D. and Vodnar D.C. (2021), "Polyphenols-Gut Microbiota Interrelationship: A Transition to a New Generation of Prebiotics", Nutrients. 14(1).
in [300]. Pollack R.M., Donath M.Y., LeRoith D., and Leibowitz G. (2016), "Anti- the Treatment of Diabetes and Its Vascular
inflammatory Agents Complications", Diabetes Care. 39 Suppl 2(Supplement_2), pp. S244-252. [301]. Poongunran J., Perera H.K., Jayasinghe L., Fernando I.T., Sivakanesan R., Araya H., and Fujimoto Y. (2017), "Bioassay-guided fractionation and identification of alpha-amylase inhibitors from Syzygium cumini leaves", Pharm Biol. 55(1), pp. 206-211.
[302]. Popa R.M., Fetea F., and Socaciu C. (2021), "ATR-FTIR-MIR Spectrometry and Pattern Recognition of Bioactive Volatiles in Oily versus Microencapsulated Food Supplements: Authenticity, Quality, and Stability", Molecules. 26(16), pp. 4837.
[303]. Porras G., Chassagne F., Lyles J.T., Marquez L., Dettweiler M., Salam A.M., Samarakoon T., Shabih S., Farrokhi D.R., and Quave C.L. (2021), "Ethnobotany and the Role of Plant Natural Products in Antibiotic Drug Discovery", Chemical Reviews. 121(6), pp. 3495-3560.
[304]. Prasad C., Davis K.E., Imrhan V., Juma S., and Vijayagopal P. (2019), "Advanced Glycation End Products and Risks for Chronic Diseases: Intervening Through Lifestyle Modification", Am J Lifestyle Med. 13(4), pp. 384-404. [305]. Pudziuvelyte L., Marksa M., Jakstas V., Ivanauskas L., Kopustinskiene D.M., and Bernatoniene J. (2019), "Microencapsulation of Elsholtzia ciliata Herb Ethanolic Extract by Spray-Drying: Impact of Resistant-Maltodextrin Complemented with Sodium Caseinate, Skim Milk, and Beta-Cyclodextrin on the Quality of Spray-Dried Powders", Molecules. 24(8).
[306]. Phunpee S., Ruktanonchai U.R., Yoshii H., Assabumrungrat S., and Soottitantawat A. (2017), "Encapsulation of lemongrass oil with cyclodextrins by spray drying and its controlled release characteristics", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 81(4), pp. 718-723.
[307]. Qamar M., Akhtar S., Ismail T., Yuan Y., Ahmad N., Tawab A., Ismail A., Barnard R.T., Cooper M.A., Blaskovich M.A.T., and Ziora Z.M. (2021), "Syzygium cumini (L.),Skeels fruit extracts: In vitro and in vivo anti- inflammatory properties", J Ethnopharmacol. 271 pp. 113805.
[308]. Qu L., Ren J., Huang L., Pang B., Liu X., Liu X., Li B., and Shan Y. (2018), "Antidiabetic Effects of Lactobacillus casei Fermented Yogurt through Reshaping Gut Microbiota Structure in Type 2 Diabetic Rats", Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66(48), pp. 12696-12705.
[309]. Quast C., Pruesse E., Yilmaz P., Gerken J., Schweer T., Yarza P., Peplies J., and Glöckner F.O. (2013), "The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools", Nucleic Acids Res. 41(Database issue), pp. D590-596.
[310]. Queiroz M.B., Sousa F.R., Silva L.B.d., Alves R.M.V., and Alvim I.D. (2022), "Co-crystallized sucrose-soluble fiber matrix: Physicochemical and structural characterization", LWT. 154 pp. 112685.
175
[311]. R Core Team (2021), R: A language and environment for statistical computing.
. Vienna, Austria.: R Foundation for Statistical Computing.
[312]. Rahman M., Rahman M.M., Deb S.C., Alam M.S., Alam M.J., and Islam M.T. (2017), "Molecular Identification of Multiple Antibiotic Resistant Fish Pathogenic Enterococcus faecalis and their Control by Medicinal Herbs", Scientific Reports. 7(1), pp. 3747.
[313]. Rahman M.M., Dhar P.S., Sumaia, Anika F., Ahmed L., Islam M.R., Sultana N.A., Cavalu S., Pop O., and Rauf A. (2022), "Exploring the plant-derived bioactive substances as antidiabetic agent: An extensive review", Biomedicine & Pharmacotherapy. 152 pp. 113217. [314]. Rambaran T.F. (2020), "Nanopolyphenols: a review of their encapsulation and anti-diabetic effects", SN Applied Sciences. 2(8), pp. 1335.
[315]. Ranđelović S. and Bipat R. (2021), "A Review of Coumarins and Coumarin- Related Compounds for Their Potential Antidiabetic Effect", Clin Med Insights Endocrinol Diabetes. 14 pp. 11795514211042023.
[316]. Rao X., Huang X., Zhou Z., and Lin X. (2013), "An improvement of the 2^(- delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis", Biostat Bioinforma Biomath. 3(3), pp. 71-85.
[317]. Raza A., Butt M.S., and Suleria H.A.R. (2017), "Jamun (Syzygium cumini) seed and fruit extract attenuate hyperglycemia in diabetic rats", Asian Pacific journal of tropical biomedicine. 7(8), pp. 750-754.
[318]. Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., and Rice-Evans C. (1999), "Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay", Free Radic Biol Med. 26(9-10), pp. 1231-1237.
[319]. Resurreccion-Magno M.H., Villasenor I.M., Harada N., and Monde K. (2005), "Antihyperglycaemic flavonoids from Syzygium samarangense (Blume) Merr. and Perry", Phytother Res. 19(3), pp. 246-251.
[320]. Ribeiro A.M., Shahgol M., Estevinho B.N., and Rocha F. (2020), "Microencapsulation of Vitamin A by spray-drying, using binary and ternary blends of gum arabic, starch and maltodextrin", Food Hydrocolloids. 108 pp. 106029. [321]. Rieg T. and Vallon V. (2018), "Development of SGLT1 and SGLT2 inhibitors", Diabetologia. 61(10), pp. 2079-2086.
[322]. Righi da Rosa J., Nunes G.L., Motta M.H., Fortes J.P., Cezimbra Weis G.C., Rychecki Hecktheuer L.H., Muller E.I., Ragagnin de Menezes C., and Severo da Rosa C. (2019), "Microencapsulation of anthocyanin compounds extracted from blueberry (Vaccinium spp.) by spray drying: Characterization, stability and simulated gastrointestinal conditions", Food Hydrocolloids. 89 pp. 742-748. [323]. Röder P.V., Wu B., Liu Y., and Han W. (2016), "Pancreatic regulation of glucose homeostasis", Exp Mol Med. 48(3), pp. e219.
[324]. Rodríguez-Mena A., Ochoa-Martínez L.A., González- Herrera S.M., Rutiaga-Quiñones O.M., and Morales-Castro J. (2021), "Degradation kinetics and thermodynamic analysis of betalains on microencapsulated beetroot juice using maltodextrin and sweet potato starch", Scientia Agropecuaria. 12(3), pp. 311-317.
[325]. Roep B.O., Thomaidou S., van Tienhoven R., and Zaldumbide A. (2021), "Type 1 diabetes mellitus as a disease of the β-cell (do not blame the immune system?)", Nat Rev Endocrinol. 17(3), pp. 150-161.
176
[326]. Rossiter S.E., Fletcher M.H., and Wuest W.M. (2017), "Natural Products as Platforms To Overcome Antibiotic Resistance", Chemical Reviews. 117(19), pp. 12415-12474.
[327]. Ruan Z.P., Zhang L.L., and Lin Y.M. (2008), "Evaluation of the Antioxidant Activity of Syzygium cumini Leaves", Molecules. 13(10), pp. 2545-2556. [328]. Rubinstein A.L. (2003), "Zebrafish: from disease modeling to drug discovery", Curr Opin Drug Discov Devel. 6(2), pp. 218-223.
[329]. Ruiz R., Jideonwo V., Ahn M., Surendran S., Tagliabracci V.S., Hou Y., Gamble A., Kerner J., Irimia-Dominguez J.M., Puchowicz M.A., DePaoli- Roach A., Hoppel C., Roach P., and Morral N. (2014), "Sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1) is required to regulate glycogen synthesis and gluconeogenic gene expression in mouse liver", J Biol Chem. 289(9), pp. 5510-5517.
[330]. Rungratanawanich W., Qu Y., Wang X., Essa M.M., and Song B.-J. (2021), "Advanced glycation end products (AGEs) and other adducts in aging-related diseases and alcohol-mediated tissue injury", Experimental & molecular medicine. 53(2), pp. 168-188.
[331]. Ruud J., Steculorum S.M., and Brüning J.C. (2017), "Neuronal control of peripheral insulin sensitivity and glucose metabolism", Nature Communications. 8(1), pp. 15259.
[332]. Saeedi P., Petersohn I., Salpea P., Malanda B., Karuranga S., Unwin N., Colagiuri S., Guariguata L., Motala A.A., Ogurtsova K., Shaw J.E., Bright D., Williams R., and Committee I.D.F.D.A. (2019), "Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: Results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9(th) edition", Diabetes Res Clin Pract. 157 pp. 107843.
[333]. Saklani R., Gupta S.K., Mohanty I.R., Kumar B., Srivastava S., and Mathur R. (2016), "Cardioprotective effects of rutin via alteration in TNF-α, CRP, and BNP levels coupled with antioxidant effect in STZ-induced diabetic rats", Molecular and Cellular Biochemistry. 420(1), pp. 65-72.
[334]. Samarghandian S., Azimi-Nezhad M., and Farkhondeh T. (2017), "Catechin Treatment Ameliorates Diabetes and Its Complications in Streptozotocin- Induced Diabetic Rats", Dose Response. 15(1), pp. 1559325817691158. [335]. Schädle T., Pejcic B., and Mizaikoff B. (2016), "Monitoring dissolved carbon dioxide and methane in brine environments at high pressure using IR-ATR spectroscopy", Analytical Methods. 8(4), pp. 756-762.
[336]. Scheithauer T.P.M., Rampanelli E., Nieuwdorp M., Vallance B.A., Verchere C.B., van Raalte D.H., and Herrema H. (2020), "Gut Microbiota as a Trigger for Metabolic Inflammation in Obesity and Type 2 Diabetes", Front Immunol. 11 pp. 571731.
[337]. Segata N., Izard J., Waldron L., Gevers D., Miropolsky L., Garrett W.S., and Huttenhower C. (2011), "Metagenomic biomarker discovery and explanation", Genome Biol. 12(6), pp. R60.
restoring [338]. Semwal D.K., Kumar A., Aswal S., Chauhan A., and Semwal R.B. (2021), "Protective and therapeutic effects of natural products against diabetes mellitus via their dysfunction", regenerating pancreatic β-cells and Phytotherapy Research. 35(3), pp. 1218-1229. [339]. Seth A., Stemple D.L., and Barroso I. (2013), "The emerging use of zebrafish to model metabolic disease", Dis Model Mech. 6(5), pp. 1080-1088.
177
[340]. Shaaruddin S., Ghazali H.M., Hamed Mirhosseini S., and Muhammad K. (2017), "Stability of betanin in pitaya powder and confection as affected by resistant maltodextrin", LWT. 84 pp. 129-134.
[341]. Shahreen S., Banik J., Hafiz A., Rahman S., Zaman A.T., Shoyeb M.A., Chowdhury M.H., and Rahmatullah M. (2012), "Antihyperglycemic activities of leaves of three edible fruit plants (Averrhoa carambola, Ficus hispida and Syzygium samarangense) of Bangladesh", Afr J Tradit Complement Altern Med. 9(2), pp. 287-291.
[342]. Sharchil C., Vijay A., Ramachandran V., Bhagavatheeswaran S., Devarajan R., Koul B., Yadav D., and Balakrishnan A. (2022), "Zebrafish: A Model to Study and Understand the Diabetic Nephropathy and Other Microvascular Complications of Type 2 Diabetes Mellitus", Vet Sci. 9(7).
[343]. Shen N., Wang T., Gan Q., Liu S., Wang L., and Jin B. (2022), "Plant flavonoids: Classification, distribution, biosynthesis, and antioxidant activity", Food Chemistry. 383 pp. 132531.
[344]. Shen S.C. and Chang W.C. (2013), "Hypotriglyceridemic and hypoglycemic effects of vescalagin from Pink wax apple [Syzygium samarangense (Blume) Merrill and Perry cv. Pink] in high-fructose diet-induced diabetic rats", Food Chem. 136(2), pp. 858-863.
[345]. Shin B.C., Chung J.H., and Kim H.L. (2020), "Protective effects of catechin on gene expression of glucose metabolism in Streptozotocin-induced diabetic nephropathy in rats", Nephrology Dialysis Transplantation. 35(Supplement_3). [346]. Shiraiwa T., Kaneto H., Miyatsuka T., Kato K., Yamamoto K., Kawashima A., Kanda T., Suzuki M., Imano E., Matsuhisa M., Hori M., and Yamasaki Y. (2005), "Postprandial Hyperglycemia Is a Better Predictor of the Progression of Diabetic Retinopathy Than HbA1c in Japanese Type 2 Diabetic Patients", Diabetes Care. 28 pp. 2806-2807. [347]. Shittu T. and Lawal M. (2007), "Factors affecting instant properties of powdered cocoa beverages", Food Chemistry. 100(1), pp. 91-98. [348]. Shurvell H.F. and Chalmers J.M. (2001), "Spectra– Structure Correlations in the Mid‐ and Far‐Infrared", in Handbook of Vibrational Spectroscopy.
[349]. Silamiķele L., Silamiķelis I., Ustinova M., Kalniņa Z., Elbere I., Petrovska R., Kalniņa I., and Kloviņš J. (2021), "Metformin Strongly Affects Gut Microbiome Composition in High-Fat Diet-Induced Type 2 Diabetes Mouse Model of Both Sexes", Frontiers in Endocrinology. 12.
[350]. Silver B., Ramaiya K., Andrew S.B., Fredrick O., Bajaj S., Kalra S., Charlotte B.M., Claudine K., and Makhoba A. (2018), "EADSG Guidelines: Insulin Therapy in Diabetes", Diabetes Ther. 9(2), pp. 449-492. [351]. Simon K. and Wittmann I. (2019), "Can blood glucose value really be referred to as a metabolic parameter?", Rev Endocr Metab Disord. 20(2), pp. 151-160.
[352]. Singh A.K., Rana H.K., Singh V., Chand Yadav T., Varadwaj P., and Pandey A.K. (2021), "Evaluation of antidiabetic activity of dietary phenolic compound chlorogenic acid in streptozotocin induced diabetic rats: Molecular docking, molecular dynamics, in silico toxicity, in vitro and in vivo studies", Computers in Biology and Medicine. 134 pp. 104462.
[353]. Singh D., Shati A., Alfaifi M., Elbehairi S., Han I., and Choi E.-H. (2022), "Development of Dementia in Type 2 Diabetes Patients: Mechanisms of Insulin Resistance and Antidiabetic Drug Development", Cells. 11 pp. 3767.
178
[354]. Singh J.P., Kaur A., Singh N., Nim L., Shevkani K., Kaur H., and Arora D.S. (2016), "In vitro antioxidant and antimicrobial properties of jambolan (Syzygium cumini) fruit polyphenols", LWT - Food Science and Technology. 65 pp. 1025- 1030.
[355]. Sonkoue Lambou J.C., Noubom M., Djoumsie Gomseu B.E., Takougoum Marbou W.J., Tamokou J.D., and Gatsing D. (2022), "Multidrug-Resistant Escherichia coli Causing Urinary Tract Infections among Controlled and Uncontrolled Type 2 Diabetic Patients at Laquintinie Hospital in Douala, Cameroon", Can J Infect Dis Med Microbiol. 2022 pp. 1250264.
[356]. Song P.-a., Onishi A., Koepsell H., and Vallon V. (2016), "Sodium glucose cotransporter SGLT1 as a therapeutic target in diabetes mellitus", Expert Opinion on Therapeutic Targets. 20 pp. 1109 - 1125.
[357]. Song Q., Liu J., Dong L., Wang X., and Zhang X. (2021), "Novel advances in inhibiting advanced glycation end product formation using natural compounds", Biomedicine & Pharmacotherapy. 140 pp. 111750.
[358]. Soronen J., Laurila P.-P., Naukkarinen J., Surakka I., Ripatti S., Jauhiainen M., Olkkonen V.M., and Yki-Järvinen H. (2012), "Adipose tissue gene expression analysis reveals changes in inflammatory, mitochondrial respiratory and lipid metabolic pathways in obese insulin-resistant subjects", BMC Medical Genomics. 5(1), pp. 9.
[359]. Sosnik A. and Seremeta K.P. (2015), "Advantages and challenges of the spray- drying technology for the production of pure drug particles and drug-loaded polymeric carriers", Advances in Colloid and Interface Science. 223 pp. 40-54. [360]. Sruthi D., Dhanalakshmi M., Yashavantha Rao H.C., Parthasarathy R., and Jayabaskaran C. (2023), "Chapter 1 - Extraction, isolation, and characterization of phytochemicals, the bioactive compounds of plants", in Recent Frontiers of Phytochemicals, Pati Siddhartha, Sarkar Tanmay, and Lahiri Dibyajit, Editors, Elsevier. p. 1-8.
[361]. Suarez-Sanchez F. and Gomez-Zamudio J. (2019), "Gene Expression Modifications in Type 2 Diabetes", in The Diabetes Textbook, Rodriguez-Saldana Joel, Editor Springer International Publishing: Cham. p. 127-144.
[362]. Subramaniam K., Joseph M.P., and Babu L.A. (2021), "A Common Drug Causing a Common Side Effect at an Uncommon Time: Metformin-Induced Chronic Diarrhea and Weight Loss After Years of Treatment", Clin Diabetes. 39(2), pp. 237-240.
[363]. Sultana R., Alashi A.M., Islam K., Saifullah M., Haque C.E., and Aluko R.E. (2020), "Inhibitory Activities of Polyphenolic Extracts of Bangladeshi Vegetables against alpha-Amylase, alpha-Glucosidase, Pancreatic Lipase, Renin, and Angiotensin-Converting Enzyme", Foods. 9(7), pp. 844.
[364]. Sun C., Zhao C., Guven E.C., Paoli P., Simal-Gandara J., Ramkumar K.M., Wang S., Buleu F., Pah A., Turi V., Damian G., Dragan S., Tomas M., Khan W., Wang M., Delmas D., Portillo M.P., Dar P., Chen L., and Xiao J. (2020), "Dietary polyphenols as antidiabetic agents: Advances and opportunities", Food Frontiers. 1(1), pp. 18-44.
[365]. Sun C., Zhao C., Guven E.C., Paoli P., Simal‐Gandara J., Ramkumar K.M., Wang S., Buleu F., Pah A., and Turi V. (2020), "Dietary polyphenols as antidiabetic agents: Advances and opportunities", Food Frontiers. 1(1), pp. 18- 44.
179
[366]. Sun H., Saeedi P., Karuranga S., Pinkepank M., Ogurtsova K., Duncan B.B., Stein C., Basit A., Chan J.C.N., Mbanya J.C., Pavkov M.E., Ramachandaran A., Wild S.H., James S., Herman W.H., Zhang P., Bommer C., Kuo S., Boyko E.J., and Magliano D.J. (2022), "IDF Diabetes Atlas: Global, regional and country-level diabetes prevalence estimates for 2021 and projections for 2045", Diabetes Res Clin Pract. 183 pp. 109119.
[367]. Tabassum N., Tai H., Jung D.-W., and Williams D.R. (2015), "Fishing for Nature’s Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 pp. 287847.
[368]. Tahrani A.A., Barnett A.H., and Bailey C.J. (2013), "SGLT inhibitors in management of diabetes", Lancet Diabetes Endocrinol. 1(2), pp. 140-151. [369]. Tan S.Y., Wong J.L.M., Sim Y.J., Wong S.S., Elhassan S.A.M., Tan S.H., Lim G.P.L., Tay N.W.R., Annan N.C., and Bhattamisra S.K. (2019), "Type 1 and 2 diabetes mellitus: A review on current treatment approach and gene therapy as potential intervention", Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Reviews. 13(1), pp. 364-372.
[370]. Tanaka M., Sugama A., Sumi K., Shimizu K., Kishimoto Y., Kondo K., and Iida K. (2020), "Gallic acid regulates adipocyte hypertrophy and suppresses inflammatory gene expression induced by the paracrine interaction between adipocytes and macrophages in vitro and in vivo", Nutrition Research. 73 pp. 58- 66.
[371]. Teh C.H., Nazni W.A., Nurulhusna A.H., Norazah A., and Lee H.L. (2017), "Determination of antibacterial activity and minimum inhibitory concentration of larval extract of fly via resazurin-based turbidometric assay", BMC Microbiology. 17(1), pp. 36.
[372]. Tomsone L., Galoburda R., Kruma Z., Durrieu V., and Cinkmanis I. (2020), "Microencapsulation of Horseradish (Armoracia rusticana L.) Juice Using Spray-Drying", Foods. 9(9), pp. 1332.
[373]. Tonon R.V., Brabet C., and Hubinger M.D. (2010), "Anthocyanin stability and antioxidant activity of spray-dried açai (Euterpe oleracea Mart.) juice produced with different carrier agents", Food Research International. 43(3), pp. 907-914. [374]. Tsalamandris S., Antonopoulos A.S., Oikonomou E., Papamikroulis G.A., Vogiatzi G., Papaioannou S., Deftereos S., and Tousoulis D. (2019), "The Role of Inflammation in Diabetes: Current Concepts and Future Perspectives", Eur Cardiol. 14(1), pp. 50-59.
[375]. Tuyen C.K., Nguyen M.H., Roach P.D., and Stathopoulos C.E. (2014), "Microencapsulation of Gac oil: Optimisation of spray drying conditions using response surface methodology", Powder Technology. 264 pp. 298-309. [376]. Thomas M.C., Baynes J.W., Thorpe S.R., and Cooper M.E. (2005), "The role of AGEs and AGE inhibitors in diabetic cardiovascular disease", Curr Drug Targets. 6(4), pp. 453-474.
[377]. Thota S. and Akbar A. (2023), "Insulin", in StatPearlsStatPearls Publishing Copyright © 2023, StatPearls Publishing LLC.: Treasure Island (FL) ineligible companies. Disclosure: Aelia Akbar declares no relevant financial relationships with ineligible companies.
[378]. Trojan-Rodrigues M., Alves T., Soares G., and Ritter M. (2012), "Plants used as antidiabetics in popular medicine in Rio Grande do Sul, southern Brazil", Journal of Ethnopharmacology. 139(1), pp. 155-163.
180
[379]. Ulla A., Alam M.A., Sikder B., Sumi F.A., Rahman M.M., Habib Z.F., Mohammed M.K., Subhan N., Hossain H., and Reza H.M. (2017), "Supplementation of Syzygium cumini seed powder prevented obesity, glucose intolerance, hyperlipidemia and oxidative stress in high carbohydrate high fat diet induced obese rats", BMC Complement Altern Med. 17(1), pp. 289. [380]. Van Kiem P., Hai Ninh B., Huu Tai B., Xuan Nhiem N., Hai Yen P., Huy Hoang N., Thi Trang D., Thi Dung D., Van Tuyen N., and Tuan Anh L. (2023), "Undescribed Phenolic Glycosides from Syzygium attopeuense and Their Inhibition of Nitric Oxide Production", Chem Biodivers. 20(9), pp. e202301037. [381]. Variya B.C., Bakrania A.K., and Patel S.S. (2020), "Antidiabetic potential of gallic acid from Emblica officinalis: Improved glucose transporters and insulin sensitivity through PPAR-γ and Akt signaling", Phytomedicine. 73 pp. 152906. [382]. Veprik A., Denwood G., Liu D., Bany Bakar R., Morfin V., McHugh K., Tebeka N.N., Vetterli L., Yonova-Doing E., Gribble F., Reimann F., Hoehn K.L., Hemsley P.A., Ahnfelt-Ronne J., Rorsman P., Zhang Q., de Wet H., and Cantley J. (2022), "Acetyl-CoA-carboxylase 1 (ACC1) plays a critical role in glucagon secretion", Commun Biol. 5(1), pp. 238.
[383]. Vinayagam R., Jayachandran M., and Xu B. (2016), "Antidiabetic Effects of Simple Phenolic Acids: A Comprehensive Review", Phytotherapy Research. 30(2), pp. 184-199.
[384]. Vo Van L., Pham E.C., Nguyen C.V., Duong N.T.N., Vi Le Thi T., and Truong T.N. (2022), "In vitro and in vivo antidiabetic activity, isolation of flavonoids, and in silico molecular docking of stem extract of Merremia tridentata (L.)", Biomed Pharmacother. 146 pp. 112611.
[385]. Vogt T. (2010), "Phenylpropanoid Biosynthesis", Molecular Plant. 3(1), pp. 2- 20.
[386]. Vuong Q.V., Hirun S., Chuen T.L.K., Goldsmith C.D., Bowyer M.C., Chalmers A.C., Phillips P.A., and Scarlett C.J. (2014), "Physicochemical composition, antioxidant and anti-proliferative capacity of a lilly pilly (Syzygium paniculatum) extract", Journal of Herbal Medicine. 4(3), pp. 134-140. [387]. Wachsmuth H.R., Weninger S.N., and Duca F.A. (2022), "Role of the gut– brain axis in energy and glucose metabolism", Experimental & molecular medicine. 54(4), pp. 377-392.
[388]. Wahjuni S. and Wita I.W. (2017), "Hypoglycemic and antioxidant effects of Syzygium polyanthum leaves extract on alloxan induced hyperglycemic Wistar Rats", Bali Med J. 3(3), pp. 113-116.
[389]. Waller D.G. and Sampson A.P. (2018), "40 - Diabetes mellitus", in Medical Pharmacology and Therapeutics (Fifth Edition), Waller Derek G. and Sampson Anthony P., Editors, Elsevier. p. 459-473.
[390]. Waltenberger B., Mocan A., Šmejkal K., Heiss E.H., and Atanasov A.G. (2016), "Natural Products to Counteract the Epidemic of Cardiovascular and Metabolic Disorders", Molecules. 21(6), pp. 807.
[391]. Wang G., Rajpurohit S.K., Delaspre F., Walker S.L., White D.T., Ceasrine A., Kuruvilla R., Li R.J., Shim J.S., Liu J.O., Parsons M.J., and Mumm J.S. (2015), "First quantitative high-throughput screen in zebrafish identifies novel pathways for increasing pancreatic β-cell mass", Elife. 4.
[392]. Wang L., Clardy A., Hui D., and Wu Y. (2021), "Physiochemical properties of encapsulated bitter melon juice using spray drying", Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre. 26 pp. 100278.
181
[393]. Wang S.-L., Nguyen A.D., Vo T.P.K., Zhang L.-J., Nguyen Q.V., and Kuo Y.- H. (2018), "Isolation and identification of novel α-amylase inhibitors from Euonymus laxiflorus Champ", Research on Chemical Intermediates. 44(2), pp. 1411-1424. [394]. Wang T.Y., Li Q., and Bi K.S. (2018), "Bioactive flavonoids in medicinal plants: Structure, activity and biological fate", Asian J Pharm Sci. 13(1), pp. 12-23. [395]. Wang Y., Alkhalidy H., and Liu D. (2021), "The Emerging Role of Polyphenols in the Management of Type 2 Diabetes", Molecules. 26(3).
[396]. Wang Y., Fofana B., Roy M., Ghose K., Yao X.-H., Nixon M.-S., Nair S., and Nyomba G.B.L. (2015), "Flaxseed lignan secoisolariciresinol diglucoside improves insulin sensitivity through upregulation of GLUT4 expression in diet- induced obese mice", Journal of Functional Foods. 18 pp. 1-9.
[397]. Wang Y., Huang S., Shao S., Qian L., and Xu P. (2012), "Studies on bioactivities of tea (Camellia sinensis L.) fruit peel extracts: Antioxidant activity and inhibitory potential against α-glucosidase and α-amylase in vitro", Industrial Crops and Products. 37(1), pp. 520-526.
[398]. Wen L., Wu D., Tan X., Zhong M., Xing J., Li W., Li D., and Cao F. (2022), "The Role of Catechins in Regulating Diabetes: An Update Review", Nutrients. 14(21). [399]. Westerfield M. (2000), "The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish", http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html.
[400]. Widyawati T., Yusoff N.A., Bello I., Asmawi M.Z., and Ahmad M. (2022), "Bioactivity-Guided Fractionation and Identification of Antidiabetic Compound of Syzygium polyanthum (Wight.)'s Leaf Extract in Streptozotocin-Induced Diabetic Rat Model", Molecules. 27(20). [401]. Wilcox G. (2005), "Insulin and insulin resistance", The Clinical biochemist. Reviews. 26(2), pp. 19-39. [402]. Wiwanitkit V. (2011), "Outbreak of Escherichia coli and diabetes mellitus", Indian J Endocrinol Metab. 15(Suppl 1), pp. S70-71.
[403]. Wongsa P., Phatikulrungsun P., and Prathumthong S. (2022), "FT-IR characteristics, phenolic profiles and inhibitory potential against digestive enzymes of 25 herbal infusions", Sci Rep. 12(1), pp. 6631.
[404]. Worawalai W., Doungwichitrkul T., Rangubpit W., Taweechat P., Sompornpisut P., and Phuwapraisirisan P. (2019), "Furofuran lignans as a new series of antidiabetic agents exerting α-glucosidase inhibition and radical scarvenging: Semisynthesis, kinetic study and molecular modeling", Bioorganic Chemistry. 87 pp. 783-793.
[405]. Wulffelé M.G., Kooy A., Lehert P., Bets D., Ogterop J.C., Borger van der Burg B., Donker A.J.M., and Stehouwer C.D.A. (2002), "Combination of Insulin and Metformin in the Treatment of Type 2 Diabetes", Diabetes Care. 25(12), pp. 2133-2140.
[406]. Xia F., Wen L.P., Ge B.C., Li Y.X., Li F.P., and Zhou B.J. (2021), "Gut microbiota as a target for prevention and treatment of type 2 diabetes: Mechanisms and dietary natural products", World J Diabetes. 12(8), pp. 1146- 1163.
[407]. Xia H., Chen H., Cheng X., Yin M., Yao X., Ma J., Huang M., Chen G., and Liu H. (2022), "Zebrafish: an efficient vertebrate model for understanding role of gut microbiota", Molecular Medicine. 28(1), pp. 161.
182
[408]. Xiao F., Xu T., Lu B., and Liu R. (2020), "Guidelines for antioxidant assays for
food components", Food Frontiers. 1(1), pp. 60-69.
[409]. Xiao J., Capanoglu E., Jassbi A.R., and Miron A. (2016), "Advance on the Flavonoid C-glycosides and Health Benefits", Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56(sup1), pp. S29-S45.
[410]. Xie Y., Chen J., Xiao A., and Liu L. (2017), "Antibacterial Activity of Polyphenols: Structure-Activity Relationship and Influence of Hyperglycemic Condition", Molecules. 22(11), pp. 1913.
[411]. Xie Y., Meijer A.H., and Schaaf M.J.M. (2020), "Modeling Inflammation in Zebrafish for the Development of Anti-inflammatory Drugs", Front Cell Dev Biol. 8 pp. 620984.
[412]. Xiong W., Sun K.-Y., Zhu Y., Zhang X., Zhou Y.-H., and Zou X. (2021), "Metformin alleviates inflammation through suppressing FASN-dependent palmitoylation of Akt", Cell Death & Disease. 12(10), pp. 934.
[413]. Xu G., Kaneto H., Laybutt D.R., Duvivier-Kali V.F., Trivedi N., Suzuma K., King G.L., Weir G.C., and Bonner-Weir S. (2007), "Downregulation of GLP- 1 and GIP receptor expression by hyperglycemia: possible contribution to impaired incretin effects in diabetes", Diabetes. 56(6), pp. 1551-1558.
[414]. Xu L., Li Y., Dai Y., and Peng J. (2018), "Natural products for the treatment of type 2 diabetes mellitus: Pharmacology and mechanisms", Pharmacological research. 130 pp. 451-465.
[415]. Xu Y., Tang G., Zhang C., Wang N., and Feng Y. (2021), "Gallic Acid and Diabetes Mellitus: Its Association with Oxidative Stress", Molecules. 26(23), pp. 7115.
[416]. Yadav K., Bajaj R.K., Mandal S., and Mann B. (2020), "Encapsulation of grape seed extract phenolics using whey protein concentrate, maltodextrin and gum arabica blends", Journal of Food Science and Technology. 57(2), pp. 426- 434.
[417]. Yamanouchi T. (2010), "Concomitant therapy with pioglitazone and insulin for the treatment of type 2 diabetes", Vasc Health Risk Manag. 6 pp. 189-197. [418]. Yan Y., Zhou X., Guo K., Zhou F., and Yang H. (2020), "Use of Chlorogenic Acid against Diabetes Mellitus and Its Complications", Journal of immunology research. 2020 pp. 9680508. [419]. Yang B., Covington B.A., and Chen W. (2020), "In vivo generation and regeneration of beta cells in zebrafish", Cell Regen. 9(1), pp. 9.
[420]. Yang C.-Y., Yen Y.-Y., Hung K.-C., Hsu S.-W., Lan S.-J., and Lin H.-C. (2019), "Inhibitory effects of pu-erh tea on alpha glucosidase and alpha amylase: a systemic review", Nutrition & Diabetes. 9(1), pp. 23.
[421]. Ye X., Li J., Gao Z., Wang D., Wang H., and Wu J. (2022), "Chlorogenic Acid Inhibits Lipid Deposition by Regulating the Enterohepatic FXR-FGF15 Pathway", Biomed Research International. 2022(1), pp. 4919153.
[422]. Yen L.-T., Weng C.-H., Than N.A.T., Tzeng J.-H., Jacobson A.R., Iamsaard K., Dang V.D., and Lin Y.-T. (2022), "Mode of inactivation of Staphylococcus aureus and Escherichia coli by heated oyster-shell powder", Chemical Engineering Journal. 432 pp. 134386.
[423]. Yeung A.W.K., Tzvetkov N.T., Durazzo A., Lucarini M., Souto E.B., Santini A., Gan R.Y., Jozwik A., Grzybek W., Horbanczuk J.O., Mocan A., Echeverria J., Wang D., and Atanasov A.G. (2020), "Natural products in diabetes research: quantitative literature analysis", Nat Prod Res, pp. 1-15.
183
[424]. Yilmaz M.T., Akman P.K., Bozkurt F., and Karasu S. (2021), "An effective polydopamine coating to improve stability and bioactivity of carvacrol-loaded zein nanoparticles", International Journal of Food Science & Technology. 56(11), pp. 6011-6024.
[425]. Yoder S.C., Lancaster S.M., Hullar M.A.J., and Lampe J.W. (2015), "Chapter 7 - Gut Microbial Metabolism of Plant Lignans: Influence on Human Health", in Diet-Microbe Interactions in the Gut, Tuohy Kieran and Del Rio Daniele, Editors, Academic Press: San Diego. p. 103-117. [426]. Yung J.H.M. and Giacca A. (2020), "Role of c-Jun N-terminal Kinase (JNK) in Obesity and Type 2 Diabetes", Cells. 9(3). [427]. Yusof N. (2013), Powder properties and prebiotic activity of white dragon fruit (Hylocereus undatus) juice spray-dried using resistant maltodextrin.
[428]. Zanandrea R., Bonan C.D., and Campos M.M. (2020), "Zebrafish as a model for inflammation and drug discovery", Drug Discov Today. 25(12), pp. 2201- 2211. [429]. Zang L., Maddison L.A., and Chen W. (2018), "Zebrafish as a model for obesity and diabetes", Frontiers in cell and developmental biology. 6 pp. 91.
[430]. Zang L., Shimada Y., and Nishimura N. (2017), "Development of a Novel Zebrafish Model for Type 2 Diabetes Mellitus", Sci Rep. 7(1), pp. 1461. [431]. Zang L., Shimada Y., Nishimura Y., Tanaka T., and Nishimura N. (2013), "A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish", Zebrafish. 10(3), pp. 425-432.
[432]. Zang L., Shimada Y., Nishimura Y., Tanaka T., and Nishimura N. (2015), "Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish", Journal of visualized experiments : JoVE,(102), pp. e53272.
[433]. Zeng H., Liu C., Wan L., Peng L., Wen S., Fang W., Chen H., Wang K., Yang X., Huang J., and Liu Z. (2024), "(-)-Epicatechin ameliorates type 2 diabetes mellitus by reshaping the gut microbiota and Gut-Liver axis in GK rats", Food Chem. 447 pp. 138916.
[434]. Zhang S., Zhang S., Wang H., and Chen Y. (2023), "Vitexin ameliorated diabetic nephropathy via suppressing GPX4-mediated ferroptosis", Eur J Pharmacol. 951 pp. 175787.
[435]. Zhang Y., Wang D., Yang L., Zhou D., and Zhang J. (2014), "Purification and Characterization of Flavonoids from the Leaves of Zanthoxylum bungeanum and Correlation between Their Structure and Antioxidant Activity", Plos One. 9(8), pp. e105725.
[436]. Zhao Y., Fang C., Jin C., Bao Z., Yang G., and Jin Y. (2022), "Catechin from green tea had the potential to decrease the chlorpyrifos induced oxidative stress in larval zebrafish (Danio rerio)", Pesticide Biochemistry and Physiology. 182 pp. 105028.
[437]. Zhishen J., Mengcheng T., and Jianming W. (1999), "The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals", Food Chemistry. 64(4), pp. 555-559.
[438]. Zhong F. and Jiang Y. (2019), "Endogenous Pancreatic beta Cell Regeneration: A Potential Strategy for the Recovery of beta Cell Deficiency in Diabetes", Front Endocrinol (Lausanne). 10(101), pp. 101.
[439]. Zhu S., Li J., Li W., Li S., Yang X., Liu X., and Sun L. (2022), "Enzymic catalyzing affinity to substrate affects inhibitor-enzyme binding interactions:
184
Inhibition behaviors of EGCG against starch digestion by individual and co- existing α-amylase and amyloglucosidase", Food Chemistry. 388 pp. 133047.
[440]. Zokti J.A., Sham Baharin B., Mohammed A.S., and Abas F. (2016), "Green Tea Leaves Extract: Microencapsulation, Physicochemical and Storage Stability Study", Molecules. 21(8).
[441]. Zorzenon M.R.T., Formigoni M., da Silva S.B., Hodas F., Piovan S., Ciotta S.R., Jansen C.A., Dacome A.S., Pilau E.J., Mareze-Costa C.E., Milani P.G., and Costa S.C. (2020), "Spray drying encapsulation of stevia extract with maltodextrin and evaluation of the physicochemical and functional properties of produced powders", Journal of Food Science. 85(10), pp. 3590-3600.
[442]. Zulcafli A.S., Lim C., Ling A.P., Chye S., and Koh R. (2020), "Antidiabetic Potential of Syzygium sp.: An Overview", The Yale journal of biology and medicine. 93(2), pp. 307-325.
185
Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định theo phương pháp Folin–Ciocalteu [117] với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả lại bởi Quang Vinh Nguyen và Jongbang Eun (2011) [264]. Đường chuẩn gallic được xây dựng bằng cách lấy 1 mL dung dịch gallic acid được chuẩn bị trong methanol với các nồng độ: 0,0078, 0,0156; 0,03125; 0,0625 và 0,125 mg/mL trộn với 5 mL Folin-Ciocalteu reagent (được pha loãng 10 lần) và 4 mL Na2CO3 (75 g/L), lắc đều. Độ hấp thu của dung dịch được xác định sau 30 phút ở bước sóng 765 nm bằng máy UV-VIS (V-630, Jasco, Nhật Bản). Xây dựng đường chuẩn và phương trình tương quan nồng độ gallic và độ hấp thụ. Sau đó, độ hấp thụ của các mẫu cao chiết được xác đinh theo trình tự như gallic acid, thay bằng 1 mL dịch cao chiết. Tổng hàm lượng polyphenol của cao chiết được xác định qua giá trị đương lượng gallic acid (gallic acid equivalents - GAE) dựa vào phương trình đường chuẩn đã được xây dựng. Tổng hàm lượng polyphenol được tính theo công thức:
𝐶 = 𝑐 × 𝑉/𝑚
Tổng hàm lượng flavonoid được xác định theo phương pháp so màu tiến hành bởi Zhishen et al. (1999) [442] với một số thay đổi nhỏ được mô tả lại bởi Nguyen và Eun (2011) [264]. Đường chuẩn quercetin được xây dựng bằng cách lấy 0,5 mL dung dịch quercetin trong methanol (nồng độ 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 và 0,1 mg/mL) trộn với 2,5 mL nước cất và 0,15 mL NaNO2 5% lắc đều. Sau 5 phút, bổ sung 0,3 ml AlCl3 10%. Sau 6 phút bổ sung 1mL NaOH 1M và 0,55 ml nước cất. Mật độ quang học của dịch phản ứng được xác định ở bước sóng 510 nm bằng máy quang phổ UV-VIS (V-630, Jasco, Nhật Bản). Xây dựng đường chuẩn và phương trình tương quan giữa nồng độ quercetin và độ hấp thụ. Sau đó, độ hấp thụ của các mẫu cao chiết được xác định tương tự như trên với 0,5 mL dung dịch mẫu cao chiết. Tổng hàm lượng flavonoid của cao chiết được xác định thông qua giá trị đương lượng quercetin (quercetin equivalent – QE) dựa vào đường chuẩn và xác định theo công thức:
𝐹 = 𝑓 × 𝑉/𝑚
Khả năng chống oxy hóa được đánh giá dựa trên khả năng trung hòa gốc tự do DPPH• và ABTS•+
bằng cách sử dụng các phương pháp mô tả lại bởi Nguyen et al. (2016) và Nguyen et al. (2022)
Khả năng khả năng trung hòa gốc tự do DPPH• được tiến hành theo phương pháp so màu theo Brand-Williams et al. (1995) với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả lại bởi Nguyen et al. (2016). Dung dịch DPPH• làm việc được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch DPPH• gốc với methanol (0,24 g/L) để thu được mật độ quang học 1,1 ± 0,02 ở bước sóng 515 nm. Sau đó hút 0,1 mL dung dịch cao chiết Trâm vỏ đỏ bổ sung vào 3,9 mL dung dịch làm việc DPPH• trong ống nghiệm, để trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trong phòng tối. Mật độ quang học của dung dịch phản ứng sau đó được xác định ở bước sóng 515 nm bằng máy quang phổ UV-VIS (V-630, Jasco, Nhật Bản). Mật độ quang học của mẫu trắng chứa cùng một lượng methanol và dung dịch DPPH• (đối chứng âm). Trolox được sử dụng làm chất đối chứng dương.
Khả năng năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ được tiến hành theo phương pháp so màu tiến hành bởi Re et al. (1999) với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả bởi Nguyen et al. (2022). Chuẩn bị dung dịch ABTS•+ làm việc gồm hỗn hợp ABTS•+ 7,4 mM và kali persulfate 2,6 mM và bảo quản 12 giờ trong bình tối để tạo ABTS•+ nồng độ làm việc, độ hấp thụ 1,1 ± 0,02 ở bước sóng 734 nm. Cho 1,8 mL dung dịch ABTS•+ làm việc vào ống nghiệm chứa 0,2 mL dung dịch cao chiết. Lắc đều, để phản ứng 2 giờ trong bóng tối. Độ hấp thụ được xác định bước sóng 734 nm sử dụng máy quang phổ UV-VIS (V-630, Jasco, Nhật Bản). Trolox được sử dụng làm đối chứng dương. Hoạt tính chống oxy hóa được tính theo công thức:
Hoạt tính kháng viêm in vitro của các cao chiết Trâm vỏ đỏ được đánh giá thông qua khả năng ức chế biến tính albumin trứng gà theo phương pháp được mô tả bởi Dharmadeva et al. (2018). Các cao
P-1
chiết được chuẩn bị bằng cách pha loãng nhị phân tạo thành dãy các nồng độ thay đổi trong khoảng 1,56-100 μg/mL, ibuprofen (1000 μg/mL) được sử dụng làm đối chứng dương. Ống nghiệm chứa tổng thể tích 5 mL hỗn dịch phản ứng, bao gồm 0,2 mL albumin trứng gà, 2,8 mL phosphate-buffered saline (PBS, pH 6,4), và 2 mL dung dịch cao chiết/ibuprofen đã được chuẩn bị trong nước cất hai lần. Nghiệm thức chứng âm (control) sử dụng 2 mL nước cất hai lần thay cho dịch cao chiết/ibuprofen. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều bằng cách lắc nhẹ ống nghiệm, sau đó ủ 37±2 ℃ trong 15 phút trước khi chuyển vào bể ổn nhiệt, ủ ở 70℃ trong 5 phút. Hỗn hợp sau đó được để nguội đến nhiệt độ phòng trong 15 phút trước khi xác định giá trị độ hấp thu (abs) ở bước sóng 660 nm sử dụng máy quang phổ UV-VIS (V- 630, Jasco, Nhật Bản). Phép tính dựa trên tỷ lệ ức chế biến tính dùng để mô tả mức độ bảo vệ của các cao chiết đối với albumin được xác định theo công thức:
Khả năng ức chế hoạt động của các enzyme tiêu hóa tinh bột, α-amylase và α-glucosidase được xác định bằng các phương pháp được tiến hành bởi Kwon et al. (2016) với một số điều chỉnh nhỏ được mô tả bởi Nguyen et al. (2016).
Khả năng ức chế α-amylase: Hút 200 μL của dung dịch được chuẩn bị từ dịch cao chiết với nồng độ khác nhau và 300 μL dung dịch α-amylase (2 μg/mL), ủ ở nhiệt độ 37°C trong 10 phút. Bổ sung 400 μL dung dịch tinh bột 1% trong đệm phosphate. Tiếp tục ủ ở 37°C trong 20 phút. Phản ứng kết thúc bằng cách bổ sung 2 mL 3,5-dinitrosalicylic acid. Sau đó, dung dịch phản ứng ủ thêm 10 phút trong nước sôi và làm nguội đến nhiệt độ phòng. Kết quả được so sánh với mẫu đối chứng chỉ chứa 500 μL dung dịch đệm, 400 μL dung dịch tinh bột và 2 mL 3,5-dinitrosalicylic acid (đối chứng âm). Độ hấp thụ của dịch sau phản ứng được xác định ở bước sóng 540 nm sử dụng máy quang phổ UV-VIS (V-630, Jasco, Nhật Bản). Khả năng ức chế α-glucosidase: Hút 50 μL của dung dịch được chuẩn bị từ dịch cao chiết hòa tan trong đệm phosphate 0,1 M (pH 6,9) với nồng độ khác nhau có chứa 50 μL dung dịch α-glucosidase 2 µg/mL, ủ ở nhiệt độ 37°C trong 20 phút. Bổ sung 50 μL dung dịch p–nitrophenyl-α-D-Glucopyranoside 2,5 mM trong đệm phosphate 0,1M (pH 6,9). Tiếp tục ủ ở 37°C trong 30 phút. Sau đó, tiến hành đo độ hấp thụ của dịch phản ứng ở bước sóng 405 nm bằng máy ELISA (BIO-RAD iMARK microplate reader). Kết quả được so sánh với mẫu đối chứng âm chỉ chứa 150 μL dung môi để hòa tan cao chiết.
Khả năng ức chế hoạt động của α-amylase và α-glucosidase được tính theo công thức:
Nồng độ ức chế tối thiểu đối với E. coli và S. aureus được xác định dựa trên phương pháp resazurin- based turbidometric (TB) được mô tả bởi Teh et al. (2017). Cụ thể, đĩa 96-well đáy tròn được sử dụng, các cao chiết được đánh giá hoạt tính trên mỗi chủng vi khuẩn được bố trí riêng. Cách bố trí này bao gồm một hàng dọc dùng để đánh giá độ vô trùng của môi trường nuôi cấy (đối chứng âm), một hàng dọc để kiểm tra độ vô trùng của các dịch cao chiết, một hàng dọc để kiểm tra hoạt tính của kháng sinh (đối chứng dương), và cuối cùng là một hàng dọc cho mẫu thử nghiệm (các cao chiết). Thêm 100 µL canh trường nuôi cấy vi khuẩn, Mueller-Hinton (MHB), vào các giếng theo chiều dọc. Giếng đầu tiên trong mỗi hàng dọc được bổ sung 100 µL nước cất vô trùng. Các giếng tiếp theo chứa dung dịch cao chiết ở nồng độ 256 mg/mL, nước cất vô trùng, chloramphenicol (đối với S. aureus) hoặc gentamicin (đối với E. coli) ở nồng độ 100 mg/ml và dung dịch cao chiết ở nồng độ 256 mg/ml tương ứng cho các mẫu kiểm soát độ vô trùng của môi trường nuôi cấy, các mẫu kiểm soát độ vô trùng của cao chiết, đối chứng âm (nước cất), đối chứng dương (kháng sinh), và các mẫu thử nghiệm của cao chiết.
Các giếng ban đầu được trộn đều trước khi chuyển 100 µL từ hỗn hợp này sang giếng thứ hai (2-2), trộn đều. Tiếp theo, 100 µL từ giếng thứ hai được cẩn thận chuyển qua giếng thứ ba (2-3), trộn đều. Quá trình pha loãng nối tiếp đến giếng thứ tám (2-8). Cuối cùng, 100 µL được loại bỏ khỏi giếng thứ tám. Sau đó, 5 µL huyền phù vi khuẩn pha loãng ở mật độ 1,5 x 106 tế bào/mL được đưa vào từng giếng, trừ cột kiểm soát độ vô trùng của môi trường nuôi cấy và cột kiểm soát độ vô trùng của các cao chiết. Các hỗn dịch được trộn đều. Quá trình lặp lại 3 lần cho từng cao chiết đối với từng loài vi khuẩn. Sau khi ủ 24 giờ ở 37 °C, 5 µL dung dịch resazurin (6,75 mg/ml) được cho vào các giếng, trộn đều và tiếp tục ủ thêm 4 giờ ở 37 °C. Sự thay đổi màu sắc của các giếng được quan sát và ghi nhận cẩn thận. Nồng độ thấp nhất của các cao chiết ở giếng liền trước giếng đổi màu được xác định là nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration, MIC).
P-2
TPC
1676 <0.0001 **** Yes 0.9984
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes
0.05 Mean Diff. -93.22 -421.7 -372.5 -328.5 -279.3 49.23
95.00% CI of diff. -109.7 to -76.74 -438.2 to -405.2 -388.9 to -356.0 -345.0 to -312.0 -295.7 to -262.8 32.75 to 65.71
Summary **** **** **** **** **** ***
Individual P Value <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0001
A B C D
TFC
217.6 <0.0001 **** Yes 0.9879
95.00% CI of diff. -235.8 to -139.1 -518.7 to -422.0 -472.6 to -375.8 -331.3 to -234.5 -285.1 to -188.4 -2.234 to 94.51
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes No
Mean Diff. -187.4 -470.4 -424.2 -282.9 -236.8 46.14
Summary **** **** **** **** **** ns
Individual P Value <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0590
A B C C
58.43 <0.0001 **** Yes 0.9564
Mean Diff. 0.3733 0.4567 0.2400 0.08333 -0.1333 -0.2167
95.00% CI of diff. 0.2883 to 0.4584 0.3716 to 0.5417 0.1549 to 0.3251 -0.001743 to 0.1684 -0.2184 to -0.04826 -0.3017 to -0.1316
Below threshold? Yes Yes Yes No Yes Yes
Summary **** **** *** ns ** ***
Individual P Value <0.0001 <0.0001 0.0002 0.0538 0.0068 0.0004
Fisher's LSD EAF vs. BF EAF vs. WF EAF vs. CE BF vs. WF BF vs. CE WF vs. CE Compact letter display EAF CE BF WF
A B C C
P-3
211.1 <0.0001 **** Yes 0.9875
Mean Diff. 1.760 1.567 1.863 -0.1933 0.1033 0.2967
Below threshold? Yes Yes Yes No No Yes
95.00% CI of diff. 1.564 to 1.956 1.371 to 1.763 1.667 to 2.059 -0.3895 to 0.002790 -0.09279 to 0.2995 0.1005 to 0.4928
Summary **** **** **** ns ns **
Individual P Value <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0526 0.2590 0.0082
A B B C C
Matching: Stacked Yes 0.05
SS
DF
MS
F (DFn, DFd)
P value
F (18, 42) = 2340 F (3, 42) = 7927 F (6, 14) = 24784 F (14, 42) = 2.184
P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.0258
108.7 368.0 2513 0.1014 0.04642
18 3 6 14 42
1956 1104 15078 1.420 1.950 Mean Diff.
95.00% CI of diff. Below threshold?
Summary Individual P Value
9.745 to 10.55 13.99 to 14.79 40.43 to 41.23 45.41 to 46.21 50.64 to 51.44 35.77 to 36.57 3.839 to 4.641 30.29 to 31.09 35.26 to 36.06 40.49 to 41.29 25.62 to 26.42 26.05 to 26.85 31.02 to 31.82 36.25 to 37.05 21.38 to 22.18 4.575 to 5.378 9.802 to 10.60 -5.068 to -4.265 4.825 to 5.628 -10.04 to -9.242 -15.27 to -14.47 -5.142 to -4.432 -18.40 to -17.68 -20.17 to -19.46 -13.61 to -12.90 -15.39 to -14.67 -2.132 to -1.422
10.15 14.39 40.83 45.81 51.04 36.17 4.240 30.69 35.66 40.89 26.02 26.45 31.42 36.65 21.78 4.977 10.20 -4.667 5.227 -9.643 -14.87 -4.787 -18.04 -19.82 -13.25 -15.03 -1.777
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
P-4
alpha-amylase-inhibition
7355 <0.0001 **** Yes 0.9997
Mean Diff. -6.443 -7.803 -8.127 -6.409 -1.360 -1.683 0.03467 -0.3233 1.395 1.718
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes
95.00% CI of diff. -6.565 to -6.322 -7.925 to -7.682 -8.248 to -8.005 -6.530 to -6.287 -1.482 to -1.238 -1.805 to -1.562 -0.08698 to 0.1563 -0.4450 to -0.2017 1.273 to 1.516 1.596 to 1.840
Summary **** **** **** **** **** **** ns *** **** ****
Individual P Value <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.5397 0.0001 <0.0001 <0.0001
A B B C D
alpha-glucosidase-inhibition
282.5 <0.0001 **** Yes 0.9906
95.00% CI of diff. Below threshold? Yes Yes No Yes Yes Yes
-0.08158 to -0.02509 0.2351 to 0.2916 -0.04824 to 0.008243 0.2884 to 0.3449 0.005091 to 0.06158 -0.3116 to -0.2551
Mean Diff. -0.05333 0.2633 -0.02000 0.3167 0.03333 -0.2833
Summary Individual P Value 0.0024 <0.0001 0.1411 <0.0001 0.0262 <0.0001
** **** ns **** * ****
A B B C
F (DFn, DFd) F (21, 56) = 9.613 F (7, 56) = 1831 F (3, 8) = 161.9 F (8, 56) = 1.582
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.1511
Table Analyzed Two-way RM ANOVA Assume sphericity? Alpha ANOVA table Time x Column Factor Time Column Factor Subject Residual
Zone-of- inhibition_E.coli Matching: Stacked Yes 0.05 DF 21 7 3 8 56
SS 53.17 3376 202.4 3.333 14.75
MS 2.532 482.3 67.47 0.4167 0.2634
Mean Diff. 95.00% CI of diff.
Below threshold?
Summary Individual P Value
Fisher's LSD EAF 1 mg/mL vs. 2 mg/mL 1 mg/mL vs. 12.5 mg/mL 1 mg/mL vs. 25 mg/mL 1 mg/mL vs. 50 mg/mL 1 mg/mL vs. 75 mg/mL 1 mg/mL vs. 100 mg/mL
-1.667 -6.667 -8.167 -10.67 -11.67 -12.67
-2.506 to -0.8272 -7.506 to -5.827 -9.006 to -7.327 -11.51 to -9.827 -12.51 to -10.83 -13.51 to -11.83
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
*** **** **** **** **** ****
0.0002 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
P-5
1 mg/mL vs. Tetracyline 0.1 mM 2 mg/mL vs. 12.5 mg/mL 2 mg/mL vs. 25 mg/mL 2 mg/mL vs. 50 mg/mL 2 mg/mL vs. 75 mg/mL 2 mg/mL vs. 100 mg/mL 2 mg/mL vs. Tetracyline 0.1 mM 12.5 mg/mL vs. 25 mg/mL 12.5 mg/mL vs. 50 mg/mL 12.5 mg/mL vs. 75 mg/mL 12.5 mg/mL vs. 100 mg/mL 12.5 mg/mL vs. Tetracyline 0.1 mM 25 mg/mL vs. 50 mg/mL 25 mg/mL vs. 75 mg/mL 25 mg/mL vs. 100 mg/mL 25 mg/mL vs. Tetracyline 0.1 mM 50 mg/mL vs. 75 mg/mL 50 mg/mL vs. 100 mg/mL 50 mg/mL vs. Tetracyline 0.1 mM 75 mg/mL vs. 100 mg/mL 75 mg/mL vs. Tetracyline 0.1 mM 100 mg/mL vs. Tetracyline 0.1 mM
-18.67 -5.000 -6.500 -9.000 -10.00 -11.00 -17.00 -1.500 -4.000 -5.000 -6.000 -12.00 -2.500 -3.500 -4.500 -10.50 -1.000 -2.000 -8.000 -1.000 -7.000 -6.000
-19.51 to -17.83 -5.839 to -4.161 -7.339 to -5.661 -9.839 to -8.161 -10.84 to -9.161 -11.84 to -10.16 -17.84 to -16.16 -2.339 to -0.6606 -4.839 to -3.161 -5.839 to -4.161 -6.839 to -5.161 -12.84 to -11.16 -3.339 to -1.661 -4.339 to -2.661 -5.339 to -3.661 -11.34 to -9.661 -1.839 to -0.1606 -2.839 to -1.161 -8.839 to -7.161 -1.839 to -0.1606 -7.839 to -6.161 -6.839 to -5.161
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** **** **** **** *** **** **** **** **** **** **** **** **** * **** **** * **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0007 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0204 <0.0001 <0.0001 0.0204 <0.0001 <0.0001
F (DFn, DFd) F (21, 56) = 13.23 F (7, 56) = 2329 F (3, 8) = 220.1 F (8, 56) = 1.421
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.2081
Zone-of-inhibition_S.aureus Matching: Stacked Yes 0.05 DF 21 7 3 8 56
MS 3.927 691.6 92.86 0.4219 0.2969
SS 82.46 4841 278.6 3.375 16.63
Mean Diff.
95.00% CI of diff.
Below threshold?
Summary
Individual P Value
Fisher's LSD EAF 2 mg/mL vs. 1 mg/mL 12.5 mg/mL vs. 1 mg/mL 25 mg/mL vs. 1 mg/mL
2.000 8.667 9.667
1.109 to 2.891 7.775 to 9.558 8.775 to 10.56
Yes Yes Yes
**** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001
P-6
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
10.28 to 12.06 11.78 to 13.56 13.78 to 15.56 22.11 to 23.89 5.775 to 7.558 6.775 to 8.558 8.275 to 10.06 9.775 to 11.56 11.78 to 13.56 20.11 to 21.89 0.1088 to 1.891 1.609 to 3.391 3.109 to 4.891 5.109 to 6.891 13.44 to 15.22 0.6088 to 2.391 2.109 to 3.891 4.109 to 5.891 12.44 to 14.22 0.6088 to 2.391 2.609 to 4.391 10.94 to 12.72 1.109 to 2.891 9.442 to 11.22 7.442 to 9.225
**** **** **** **** **** **** **** **** **** **** * **** **** **** **** ** **** **** **** ** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0285 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0014 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0014 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
F (DFn, DFd) F (49, 112) = 12.18 F (7, 16) = 200.1 F (7, 112) = 371.3 F (16, 112) = 1.681
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.0604
L.casei-promotion_SZL Matching: Across row Yes 0.05 DF 49 7 7 16 112
SS 3781 14914 16461 170.4 709.4
MS 77.15 2131 2352 10.65 6.334
Below
Mean Diff.
95.00% CI of diff.
threshold? Summary
Individual P Value
Fisher's LSD EAF_Non-glucose 0.25 mg/mL vs. 0.5 mg/mL 0.25 mg/mL vs. 0.75 mg/mL 0.25 mg/mL vs. 1 mg/mL 0.25 mg/mL vs. 1.25 mg/mL 0.25 mg/mL vs. 1.5 mg/mL 0.25 mg/mL vs. 1.75 mg/mL 0.25 mg/mL vs. 2 mg/mL 0.5 mg/mL vs. 0.75 mg/mL 0.5 mg/mL vs. 1 mg/mL 0.5 mg/mL vs. 1.25 mg/mL 0.5 mg/mL vs. 1.5 mg/mL 0.5 mg/mL vs. 1.75 mg/mL 0.5 mg/mL vs. 2 mg/mL 0.75 mg/mL vs. 1 mg/mL 0.75 mg/mL vs. 1.25 mg/mL 0.75 mg/mL vs. 1.5 mg/mL 0.75 mg/mL vs. 1.75 mg/mL 0.75 mg/mL vs. 2 mg/mL 1 mg/mL vs. 1.25 mg/mL 1 mg/mL vs. 1.5 mg/mL 1 mg/mL vs. 1.75 mg/mL 1 mg/mL vs. 2 mg/mL 1.25 mg/mL vs. 1.5 mg/mL 1.25 mg/mL vs. 1.75 mg/mL 1.25 mg/mL vs. 2 mg/mL 1.5 mg/mL vs. 1.75 mg/mL 1.5 mg/mL vs. 2 mg/mL
-4.490 -8.280 -13.47 -20.96 -29.44 -40.55 -39.17 -3.790 -8.980 -16.47 -24.95 -36.06 -34.68 -5.190 -12.68 -21.16 -32.27 -30.89 -7.487 -15.97 -27.08 -25.70 -8.483 -19.59 -18.22 -11.11 -9.733
-8.561 to -0.4185 -12.35 to -4.209 -17.54 to -9.399 -25.03 to -16.89 -33.51 to -25.37 -44.62 to -36.48 -43.24 to -35.10 -7.861 to 0.2815 -13.05 to -4.909 -20.54 to -12.40 -29.02 to -20.88 -40.13 to -31.99 -38.75 to -30.61 -9.261 to -1.119 -16.75 to -8.605 -25.23 to -17.09 -36.34 to -28.20 -34.96 to -26.82 -11.56 to -3.415 -20.04 to -11.90 -31.15 to -23.01 -29.77 to -21.63 -12.55 to -4.412 -23.66 to -15.52 -22.29 to -14.15 -15.18 to -7.035 -13.80 to -5.662
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
* *** **** **** **** **** **** ns **** **** **** **** **** * **** **** **** **** *** **** **** **** **** **** **** **** ****
0.0310 0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0678 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0129 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0004 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
P-7
1.373
-2.698 to 5.445
No
ns
0.5053
1.75 mg/mL vs. 2 mg/mL EAF_Glucose 0.25 mg/mL vs. 0.5 mg/mL 0.25 mg/mL vs. 0.75 mg/mL 0.25 mg/mL vs. 1 mg/mL 0.25 mg/mL vs. 1.25 mg/mL 0.25 mg/mL vs. 1.5 mg/mL 0.25 mg/mL vs. 1.75 mg/mL 0.25 mg/mL vs. 2 mg/mL 0.5 mg/mL vs. 0.75 mg/mL 0.5 mg/mL vs. 1 mg/mL 0.5 mg/mL vs. 1.25 mg/mL 0.5 mg/mL vs. 1.5 mg/mL 0.5 mg/mL vs. 1.75 mg/mL 0.5 mg/mL vs. 2 mg/mL 0.75 mg/mL vs. 1 mg/mL 0.75 mg/mL vs. 1.25 mg/mL 0.75 mg/mL vs. 1.5 mg/mL 0.75 mg/mL vs. 1.75 mg/mL 0.75 mg/mL vs. 2 mg/mL 1 mg/mL vs. 1.25 mg/mL 1 mg/mL vs. 1.5 mg/mL 1 mg/mL vs. 1.75 mg/mL 1 mg/mL vs. 2 mg/mL 1.25 mg/mL vs. 1.5 mg/mL 1.25 mg/mL vs. 1.75 mg/mL 1.25 mg/mL vs. 2 mg/mL 1.5 mg/mL vs. 1.75 mg/mL 1.5 mg/mL vs. 2 mg/mL 1.75 mg/mL vs. 2 mg/mL
-7.667 -8.003 -18.92 -19.47 -20.80 -47.95 -39.93 -0.3367 -11.25 -11.80 -13.13 -40.28 -32.26 -10.91 -11.47 -12.80 -39.95 -31.92 -0.5533 -1.883 -29.03 -21.01 -1.330 -28.48 -20.46 -27.15 -19.13 8.023
-11.74 to -3.595 -12.07 to -3.932 -22.99 to -14.85 -23.54 to -15.40 -24.87 to -16.73 -52.02 to -43.88 -44.00 to -35.86 -4.408 to 3.735 -15.32 to -7.179 -15.87 to -7.732 -17.20 to -9.062 -44.35 to -36.21 -36.33 to -28.19 -14.98 to -6.842 -15.54 to -7.395 -16.87 to -8.725 -44.02 to -35.88 -35.99 to -27.85 -4.625 to 3.518 -5.955 to 2.188 -33.10 to -24.96 -25.08 to -16.94 -5.401 to 2.741 -32.55 to -24.41 -24.53 to -16.39 -31.22 to -23.08 -23.20 to -15.06 3.952 to 12.09
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes
*** *** **** **** **** **** **** ns **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** ns ns **** **** ns **** **** **** **** ***
0.0003 0.0002 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.8702 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.7882 0.3614 <0.0001 <0.0001 0.5188 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0002
P-8
Nồng độ an toàn (mg/L)
10
10
10
10
Ghi chú: Quy trình đánh giá theo OECD 203 trên ấu trùng cá ngựa vằn (5 ngày tuổi), t = 120 (giờ), n = 10 (cá thể).
Ngày 1
3/3
3/3
3/3
3/3
0/7
0/7
0/7
0/7
Ngày 2
-
-
-
-
0/7
0/7
0/7
0/7
Ngày 3
-
-
-
-
0/7
0/7
0/7
0/7
Ngày 4
-
-
-
-
0/7
0/7
0/7
0/7
Ngày 5
-
-
-
-
0/7
0/7
0/7
0/7
Ngày 6
-
-
-
-
0/7
0/7
0/7
0/7
Ngày 7
-
-
-
-
0/7
0/7
0/7
0/7
Tổng cá chết
3
3
3
3
0
0
0
0
<5.000 <5.000
<5.000
<5.000
>2.000
>2.000
>2.000
>2.000
Nồng độ an toàn (mg/kg)
2.000 mg/kg < LD50 < 5.000 mg/kg
LD50 (mg/kg) Ghi chú: Quy trình đánh giá theo OECD 432 trên cá ngựa vằn trưởng thành (3,5 đến 4 tháng tuổi), t = 7 (ngày), n = 7 (cá thể).
Ngày 1
0/7
0/7
0/7
0/7
0/7
1/7
1/7
1/7
Ngày 2
0/7
0/7
0/7
0/7
0/7
0/6
0/6
0/6
Ngày 3
0/7
0/7
0/7
0/7
0/7
0/6
0/6
0/6
Ngày 4
0/7
0/7
0/7
0/7
0/7
0/6
0/6
0/6
Ngày 5
0/7
0/7
0/7
0/7
0/7
0/6
0/6
0/6
Ngày 6
0/7
0/7
0/7
0/7
0/7
0/6
0/6
0/6
Ngày 7
0/7
0/7
0/7
0/7
0/7
0/6
0/6
0/6
0
1
1
0
1
0
0
Tổng cá chết 0 Ghi chú: Quy trình đánh giá theo OECD 203 trên cá ngựa vằn trưởng thành (3,5 đến 4 tháng tuổi), t = 7 (ngày), n = 7 (cá thể).
P-9
EAF
WF
Time (Minutes)
Mean
SEM N Mean
SEM N Mean
SEM N Mean
SEM N
0
83.00
2.81
5
86.20
4.14
5
86.20
4.14
5
83.00
2.81
5
30
141.60
5.24
5
156.80
8.91
5
185.00
13.75
5
143.60
9.54
5
60
225.80
9.31
5
249.20
3.71
5
252.00
9.32
5
248.00
7.93
5
120
133.80
9.38
5
130.60
5.92
5
133.80
7.07
5
159.60
12.04
5
180
120.00
5.54
5
119.60
5.64
5
110.80
5.42
5
114.40
5.07
5
Aca
MD
Time (Minutes)
Mean
SEM N Mean
SEM N
0
82.60
1.89
5
85.40
2.86
5
30
149.80
7.94
5
210.80
5.30
5
60
223.80
9.88
5
356.40
13.63
5
120
138.00
3.78
5
199.60
4.92
5
180
114.60
8.75
5
9.65
137.20
F (DFn, DFd) F (20, 96) = 7.433 F (4, 96) = 451.4 F (5, 24) = 40.04 F (24, 96) = 0.9973
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.4775
DF 20 4 5 24 96
5 Posprandial Blood Glucose Level Matching: Stacked Yes 0.05 SS 42558 516951 57153 6852 27483
Summary
Mean Diff.
95.00% CI of diff.
MS 2128 129238 11431 285.5 286.3 Below threshold?
Individual P Value
2.219 to 44.58 5.019 to 47.38 1.019 to 43.38 109.4 to 151.8 -46.58 to -4.219 86.02 to 128.4 -49.38 to -7.019 83.22 to 125.6 -45.38 to -3.019 87.22 to 129.6 111.4 to 153.8
23.40 26.20 22.20 130.6 -25.40 107.2 -28.20 104.4 -24.20 108.4 132.6
* * * **** * **** ** **** * **** ****
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
0.0307 0.0158 0.0401 <0.0001 0.0192 <0.0001 0.0095 <0.0001 0.0255 <0.0001 <0.0001
58.60 142.8 50.80 37.00 84.20 -21.60 -92.00 -105.8 -13.80
**** **** **** *** **** * **** **** ns
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No
<0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0008 <0.0001 0.0463 <0.0001 <0.0001 0.2003
NOR
DIA
MET
Time (Days)
Mean
SEM N Mean
SEM N Mean
SEM N
0
65.80
3.40
5
113.20
6.72
5
113.20
6.72
5
5
66.60
3.59
5
112.80
7.07
5
63.60
3.52
5
10
62.20
4.42
5
102.60
6.23
5
62.40
3.60
5
15
60.40
2.42
5
99.20
1.69
5
57.20
1.66
5
20
53.40
3.47
5
99.20
4.73
5
58.40
2.86
5
EAF
BF
WF
CE
Time (Days)
Mean
SEM N Mean
SEM N Mean
SEM
N
SEM N Mean P-10
0
113.20
6.72
5
113.20
6.72
5
113.20
6.72
5
113.20
6.72
5
5
60.20
2.63
5
107.40
5.30
5
76.60
4.06
5
88.00
5.43
5
10
52.20
4.10
5
99.80
3.62
5
71.80
3.99
5
76.20
4.45
5
15
57.20
1.98
5
72.20
4.63
5
73.60
5.72
5
69.80
4.55
5
2.99
63.40
1.91
5
73.00
3.16
5
62.40
3.75
5
47.60
5 Fasting Blood Glucose Level
F (DFn, DFd) F (24, 112) = 5.745 F (4, 112) = 85.45 F (6, 28) = 54.59 F (28, 112) = 0.9938
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.4844
Matching: Stacked Yes 0.05 SS 14698 36435 34698 2966 11939
DF 24 4 6 28 112
MS 612.4 9109 5783 105.9 106.6 95.00% CI of diff. Below threshold?
Mean Diff.
Summary
Individual P Value
46.20 40.80 21.40 -49.20 -52.60 -36.20 -24.80 43.80 13.00 24.40 47.20 16.40 27.80 -30.80 -19.40
33.30 to 59.10 27.90 to 53.70 8.498 to 34.30 -62.10 to -36.30 -65.50 to -39.70 -49.10 to -23.30 -37.70 to -11.90 30.90 to 56.70 0.09794 to 25.90 11.50 to 37.30 34.30 to 60.10 3.498 to 29.30 14.90 to 40.70 -43.70 to -17.90 -32.30 to -6.498
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** ** **** **** **** *** **** * *** **** * **** **** **
<0.0001 <0.0001 0.0013 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0002 <0.0001 0.0483 0.0003 <0.0001 0.0131 <0.0001 <0.0001 0.0035
-53.00 -61.00 -56.00 -65.60
-65.94 to -40.06 -73.94 to -48.06 -68.94 to -43.06 -78.54 to -52.66
Yes Yes Yes Yes
**** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
-13.40 -41.00 -49.80 -35.20 -44.00 -27.60 -36.40
-26.34 to -0.4617 -53.94 to -28.06 -62.74 to -36.86 -48.14 to -22.26 -56.94 to -31.06 -40.54 to -14.66 -49.34 to -23.46
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
* **** **** **** **** **** ****
0.0425 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
-36.60 -41.40 -39.60 -40.20
-49.54 to -23.66 -54.34 to -28.46 -52.54 to -26.66 -53.14 to -27.26
Yes Yes Yes Yes
**** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
20 Table Analyzed Two-way RM ANOVA Assume sphericity? Alpha ANOVA table Time x Group Time Group Subject Residual Fisher's LSD 5 DIA vs. NOR BF vs. NOR CE vs. NOR MET vs. DIA EAF vs. DIA WF vs. DIA CE vs. DIA BF vs. MET WF vs. MET CE vs. MET BF vs. EAF WF vs. EAF CE vs. EAF WF vs. BF CE vs. BF EAF 5 vs. 0 10 vs. 0 15 vs. 0 20 vs. 0 BF 10 vs. 0 15 vs. 0 20 vs. 0 15 vs. 5 20 vs. 5 15 vs. 10 20 vs. 10 WF 5 vs. 0 10 vs. 0 15 vs. 0 20 vs. 0 CE 5 vs. 0 10 vs. 0 15 vs. 0 20 vs. 0 15 vs. 5 20 vs. 5 20 vs. 10
-25.20 -37.00 -43.40 -50.80 -18.20 -25.60 -13.80
-38.14 to -12.26 -49.94 to -24.06 -56.34 to -30.46 -63.74 to -37.86 -31.14 to -5.262 -38.54 to -12.66 -26.74 to -0.8617
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
*** **** **** **** ** *** *
0.0002 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0062 0.0002 0.0368
P-11
Ghi chú: NORMA, và DIABE lần lượt là nhóm cá bình thường và cá đái tháo đường. METFO và SZL_EAF lần lượt là nhóm cá đái tháo đường được xử lý với metformin 20 µM và cao chiết phân đoạn ethyl acetate (10 mg/L). Mỗi cột đại diện cho một mẫu duy nhất, mỗi hàng đại diện cho một nhóm vi sinh vật duy nhất. Thang sắc độ cho biết số lượng trung bình của từng nhóm có trong một mẫu, từ cao (đỏ) đến thấp (xanh lam). Sơ đồ cây ở trên hiển thị sự giống nhau của các nhóm mẫu theo mức độ phân bố vi sinh vật. Sơ đồ cây bên trái hiển thị mối quan hệ di truyền của các nhóm vi sinh vật. Ở đầu mỗi cột, các khối hình chữ nhật có nhiều màu sắc biểu thị các nhóm mẫu khác nhau.
P-12
Ghi chú: NORMA, và DIABE lần lượt là nhóm cá bình thường và cá đái tháo đường. METFO và SZL_EAF lần lượt là nhóm cá đái tháo đường được xử lý với metformin 20 µM và cao chiết phân đoạn ethyl acetate (10 mg/L). Các mẫu tương quan với các cột tương ứng với các con đường chuyển hóa sinh học. Mức độ thang màu biểu thị khả năng có các con đường trao đổi chất trong mẫu, từ cao (màu đỏ) đến thấp (màu xanh, màu xanh lá cây). Sơ đồ cây phía trên việc phân nhóm các mẫu dựa trên sự tương đồng về con đường trao đổi chất. Sơ đồ cây ở bên trái mô tả mối liên hệ giữa các con đường chuyển hóa. Ở đầu mỗi cột, các khối hình chữ nhật có nhiều màu sắc biểu thị các nhóm mẫu khác nhau.
NOR
MET
EAF
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean
3 1.020 0.2476 0.1429
3 0.4533 0.08083 0.04667
3 11.79 0.1443 0.08333
3 3.250 0.5671 0.3274
P-13
F (DFn, DFd) F (1.045, 2.090) = 716.7 F (2, 6) = 0.5559
P value P=0.0011 P=0.6005
MS 82.69 0.06413 0.1154
SREBF1 SS 248.1 0.1283 0.6923 248.9
DF 3 2 6 11 95.00% CI of diff. -0.9855 to -0.1478 10.50 to 11.05 0.4289 to 4.031 11.15 to 11.53 1.306 to 4.287 -10.21 to -6.872
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes
Summary * **** * **** * **
Individual P Value 0.0283 <0.0001 0.0335 <0.0001 0.0150 0.0021
Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR EAF vs. NOR MET vs. DIA EAF vs. DIA EAF vs. MET MET EAF NOR DIA
Mean Diff. -0.5667 10.77 2.230 11.34 2.797 -8.543 A B C D
NOR
DIA
MET
EAF
3 1.013 0.2013 0.1162
3 3.393 0.2739 0.1581
3 0.2200 0.04583 0.02646
3 0.1700 0.01732 0.01000
ACC1
F (DFn, DFd) F (1.041, 2.082) = 177.3 F (2, 6) = 0.04670
P value P=0.0048 P=0.9547
MS 6.867 0.001808 0.03872
SS DF 3 2 6 11
20.60 0.003617 0.2323 20.84
Mean Diff. 2.380 -0.7933 -0.8433 -3.173 -3.223 -0.05000
95.00% CI of diff. 1.200 to 3.560 -1.330 to -0.2569 -1.350 to -0.3365 -3.845 to -2.502 -3.898 to -2.549 -0.2051 to 0.1051
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes No
Summary * * * ** ** ns
Individual P Value 0.0130 0.0238 0.0190 0.0024 0.0024 0.2999
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR EAF vs. NOR MET vs. DIA EAF vs. DIA EAF vs. MET Compact letter display DIA NOR MET EAF
A B C C
NOR
DIA
MET
EAF
3 1.010 0.1929 0.1114
3 3.273 0.1155 0.06667
3 1.657 0.3204 0.1850
F (DFn, DFd) F (1.503, 3.006) = 129.8 F (2, 6) = 0.9181
P value P=0.0013 P=0.4489
MS 5.103 0.03611 0.03933
3 0.1967 0.03055 0.01764 FASN SS 15.31 0.07222 0.2360 15.62
DF 3 2 6 11
Mean Diff. -0.8133 2.263 0.6467 3.077 1.460 -1.617
95.00% CI of diff. -1.218 to -0.4087 1.500 to 3.027 0.006389 to 1.287 2.717 to 3.436 0.6947 to 2.225 -2.637 to -0.5966
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes
Summary * ** * *** * *
Individual P Value 0.0131 0.0061 0.0491 0.0007 0.0145 0.0208
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR EAF vs. NOR MET vs. DIA EAF vs. DIA EAF vs. MET Compact letter display MET EAF NOR DIA
A B C D
P-14
NOR
MET
EAF
3 1.023 0.2836 0.1637
3 12.03 0.7108 0.4104
3 17.74 1.647 0.9508
3 0.1500 0.04000 0.02309
F (DFn, DFd) F (1.308, 2.617) = 233.4 F (2, 6) = 0.4812
P value P=0.0012 P=0.6400
MS 221.2 0.4561 0.9478
INSULIN SS 663.6 0.9122 5.687 670.2
DF 3 2 6 11
95.00% CI of diff. 8.599 to 13.41 12.55 to 20.89 -1.668 to -0.07828 0.5616 to 10.87 -13.55 to -10.21 -21.73 to -13.46
Below threshold? Summary ** ** * * ** **
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
Individual P Value 0.0026 0.0033 0.0420 0.0412 0.0011 0.0030
Mean Diff. 11.01 16.72 -0.8733 5.713 -11.88 -17.59
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR EAF vs. NOR MET vs. DIA EAF vs. DIA EAF vs. MET Compact letter display MET DIA NOR EAF
A B C D
NOR
DIA
MET
EAF
3 0.9933 0.2335 0.1348
3 1.013 0.1877 0.1084
3 0.3433 0.1595 0.09207
F (DFn, DFd) F (3, 6) = 40.22 F (2, 6) = 1.324
P value P=0.0002 P=0.3340
MS 1.097 0.03610 0.02727
0.8067 -0.02000
3 1.820 0.05196 0.03000 INSRA1 DF SS 3 3.290 2 0.07220 6 0.1636 11 3.526 Mean Diff. 95.00% CI of diff. 0.4768 to 1.137 -0.3499 to 0.3099 -0.6700 -0.9999 to -0.3401 -1.157 to -0.4968 -0.8267 -1.807 to -1.147 -1.477 -0.6500 -0.9799 to -0.3201
Below threshold? Summary *** ns ** *** **** **
Yes No Yes Yes Yes Yes
Individual P Value 0.0010 0.8869 0.0025 0.0009 <0.0001 0.0029
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR EAF vs. NOR MET vs. DIA EAF vs. DIA EAF vs. MET Compact letter display DIA NOR MET EAF
A B B C
NOR
DIA
MET
EAF
3 1.017 0.2194 0.1267
3 15.91 0.9632 0.5561
3 3.117 0.6879 0.3972
F (DFn, DFd) F (1.421, 2.842) = 512.4 F (2, 6) = 1.727
P value P=0.0002 P=0.2557
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total
3 0.5967 0.07638 0.04410 INSRB1 SS 473.2 1.063 1.847 476.1
MS DF 3 157.7 2 0.5315 6 0.3078 11
Fisher's LSD
Mean Diff.
Below threshold?
Summary
Individual P Value
DIA vs. NOR MET vs. NOR
-0.4200 14.89
95.00% CI of diff. -0.7910 to - 0.04904 12.84 to 16.95
Yes Yes
* **
0.0396 0.0010
P-15
2.100 0.7229 to 3.477 15.31 12.99 to 17.63 2.520 0.9798 to 4.060 -12.79 -15.76 to -9.829
Yes Yes Yes Yes
* ** * **
0.0224 0.0012 0.0196 0.0029
EAF vs. NOR MET vs. DIA EAF vs. DIA EAF vs. MET Compact letter display MET EAF NOR DIA
A B C D
NOR
DIA
MET
EAF
3 1.000 0.03606 0.02082
3 3.763 0.5852 0.3379
3 0.3167 0.1185 0.06839
F (DFn, DFd) F (3, 6) = 71.48 F (2, 6) = 0.8827
P value P<0.0001 P=0.4613
MS 6.675 0.08243 0.09338
3 1.830 0.06928 0.04000 SGLT1 SS 20.02 0.1649 0.5603 20.75
DF 3 2 6 11
0.8300 2.763
Mean Diff. 95.00% CI of diff. 0.2195 to 1.441 2.153 to 3.374 -0.6833 -1.294 to -0.07281 1.933 1.323 to 2.544 -1.513 -2.124 to -0.9028 -4.057 to -2.836 -3.447
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes
Summary * **** * *** *** ****
Individual P Value 0.0159 <0.0001 0.0338 0.0002 0.0009 <0.0001
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR EAF vs. NOR MET vs. DIA EAF vs. DIA EAF vs. MET Compact letter display MET DIA NOR EAF
A B C D
NOR
DIA
MET
EAF
3 1.007 0.1457 0.08413
3 0.3133 0.05132 0.02963
3 3.847 0.1436 0.08293
3 1.663 0.1343 0.07753
F (DFn, DFd) F (3, 6) = 443.3 F (2, 6) = 0.9529
P value P<0.0001 P=0.4371
MS 7.013 0.01508 0.01582
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total
GLP-1 SS 21.04 0.03015 0.09492 21.16
DF 3 2 6 11
Mean Diff. -0.6933 2.840 0.6567 3.533 1.350 -2.183
95.00% CI of diff. -0.9446 to -0.4420 2.589 to 3.091 0.4054 to 0.9080 3.282 to 3.785 1.099 to 1.601 -2.435 to -1.932
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes
Summary Individual P Value 0.0005 <0.0001 0.0007 <0.0001 <0.0001 <0.0001
*** **** *** **** **** ****
Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR EAF vs. NOR MET vs. DIA EAF vs. DIA EAF vs. MET Compact letter display MET EAF NOR DIA
A B C D
P-16
SBE1-DMSO-1H NMR
Solv
13, 14
Solv
*
19, 20
21, 22
*
*
SBE1-DMSO-13C NMR
Solv
11, 16
4, 9
12, 15
2, 7
5, 10
13, 14 8, 3
SBE1-LC-ESI-MS (negative) spectrum
[M-H]-
P-17
SBE2-DMSO-1H NMR
SBE2-DMSO-13C NMR
SBE2-DMSO-HMBC
SBE2-DMSO-HSQC
P-18
SBE3-DMSO-1H NMR
2, 6
CH
3
CH2
Water
SBE3-LC-ESI-MS (negative) spectrum
[M-H]-
P-19
SBE4-DMSO-13C
SBE4-DMSO-1H
SBE4-HBMC
SBE4-HSQC
P-20
SBE5-DMSO-13C NMR
SBE5-DMSO-1H NMR
SBE5-HBMC
SBE5-COSY
P-21
SBE6-DMSO-13C NMR
SBE6-DMSO-1H NMR
SBE6-COSY
SBE6-HSQC
SBE6-HBMC
P-22
SBE7-DMSO-1H NMR
SBE7-DMSO-13C NMR
SBE7-DEPT90&DEPT135
P-23
SBE7-COSY
SBE7-HBMC
SBE7-HSQC
SBE8-DMSO-1H NMR
2, 6
SBE8-LC-ESI-MS (negative) spectrum
[M- H]-
Solv
Water
P-24
SBE9-DMSO-1H NMR
SBE9-DMSO-13C NMR
SBE9-DMSO-DEPT
P-25
SBE10-DMSO-1H NMR
SBE10-DMSO-13C NMR
SBE10-LC-ESI-MS (negative) spectrum
[M-H]-
P-26
P-27
P-28
F (DFn, DFd) F (30, 88) = 1717965821 F (10, 88) = 4417696174 F (3, 88) = 18268365639
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001
DF 30 10 3 88
MS 289229958 743745925 3075590073 0.1684
Phenolic-compound SS 8676898737 7437459248 9226770218 14.82
Summary Individual P Value
Mean Diff.
95.00% CI of diff. Below threshold?
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
-45179 -46916 -44767 -1736 411.8 2148
-45180 to -45179 -46916 to -46915 -44768 to -44767 -1737 to -1736 411.2 to 412.5 2147 to 2149
**** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
-53164 -57586 -58961 -4422 -5797 -1375
-53165 to -53163 -57587 to -57585 -58962 to -58960 -4423 to -4421 -5798 to -5796 -1376 to -1374
**** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
-36097 -37972 -38446 -1874 -2348 -474.1
-36098 to -36097 -37972 to -37971 -38446 to -38445 -1875 to -1874 -2349 to -2348 -474.8 to -473.5
**** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
-3665 to -3664 -4206 to -4204 -4430 to -4428 -540.7 to -539.4 -765.0 to -763.7 -225.0 to -223.6
-3665 -4205 -4429 -540.1 -764.4 -224.3
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
-1049 to -1047 -3350 to -3348 -2559 to -2558 -2302 to -2300 -1511 to -1510 789.6 to 791.0
-1048 -3349 -2559 -2301 -1511 790.3
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
-587.1 to -585.8 -10848 to -10846 -7071 to -7070 -10261 to -10260 -6485 to -6483 3776 to 3777
-586.5 -10847 -7071 -10260 -6484 3776
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
-20840 to -20838 -22423 to -22422 -17581 to -17579 -1584 to -1583 3258 to 3260 4842 to 4843
-20839 -22422 -17580 -1584 3259 4842
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
-2907 to -2906 -3351 to -3349 -1495 to -1493 -444.2 to -442.8 1412 to 1413 1855 to 1857
-2907 -3350 -1494 -443.5 1413 1856
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
-1346 to -1345
-1346
Yes
****
<0.0001
P-29
-1346 -898.5 0.000 447.1 447.1
-1346 to -1345 -899.2 to -897.9 -0.6658 to 0.6658 446.5 to 447.8 446.5 to 447.8
Yes Yes No Yes Yes
**** **** ns **** ****
<0.0001 <0.0001 >0.9999 <0.0001 <0.0001
-12680 -17347 -13230 -4666 -550.0 4116
-12681 to -12680 -17347 to -17346 -13231 to -13230 -4667 to -4666 -550.7 to -549.3 4116 to 4117
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
WF vs. EAF CE vs. EAF WF vs. BF CE vs. BF CE vs. WF ChA BF vs. EAF WF vs. EAF CE vs. EAF WF vs. BF CE vs. BF CE vs. WF Querci BF vs. EAF WF vs. EAF CE vs. EAF WF vs. BF CE vs. BF CE vs. WF
-14392 -22607 -21723 -8215 -7331 883.9
-14393 to -14391 -22608 to -22607 -21724 to -21723 -8216 to -8215 -7332 to -7331 883.3 to 884.6
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
> dimdesc(res.pca) $Dim.1 $quanti correlation p.value ChA 0.9963262 5.238081e-12 Querci 0.9825308 1.244314e-08 a_AI 0.9797474 2.593784e-08 Caf 0.9757334 6.362819e-08 Cat 0.9737675 9.362025e-08 E-Cat 0.9706076 1.644483e-07 GA 0.9705181 1.669414e-07 EA 0.9662657 3.251122e-07 TFC 0.9250652 1.639241e-05 ABTS 0.9202556 2.218896e-05 Ap 0.9177896 2.572939e-05 EG 0.9080183 4.435978e-05 DPPH 0.9023898 5.911953e-05 Querce 0.8684730 2.475520e-04 TPC 0.8543950 4.015326e-04 RT 0.7780888 2.879961e-03 $quali R2 p.value Treatment 0.9994586 2.113449e-13
$category Estimate p.value Treatment=EAF 6.263191 5.765108e-07
attr(,"class") [1] "condes" "list"
$Dim.2 $quanti correlation p.value a_GI 0.7435118 0.005576066 RT -0.6230424 0.030446061
$quali R2 p.value Treatment 0.9992969 6.010695e-13
P-30
F (DFn, DFd) F (4, 18) = 8.121
P value P=0.0006
MS 2.993 0.3686
MC(%) SS 11.97 6.635 18.61
DF 4 18 22
95.00% CI of diff. -0.9200 to 0.7267 -0.5900 to 1.057 0.3425 to 1.989 0.9280 to 2.473 -0.5719 to 1.232 0.3606 to 2.164 0.9414 to 2.653 0.03058 to 1.834 0.6114 to 2.323 -0.3211 to 1.390
Below threshold? No No Yes Yes No Yes Yes Yes Yes No
Summary ns ns ** *** ns ** *** * ** ns
Individual P Value 0.8080 0.5590 0.0081 0.0002 0.4520 0.0087 0.0003 0.0434 0.0020 0.2059
Mean Diff. -0.09667 0.2333 1.166 1.700 0.3300 1.263 1.797 0.9325 1.467 0.5345
A A B B B
Water-activity A-E
F (DFn, DFd)
P value F (4, 10) = 1952 P<0.0001
MS 0.001952 1.000e-006
SS DF 4 10 14
Mean Diff. -0.06100 -0.05800 -0.04800 -0.05700 0.003000 0.01300 0.004000 0.01000 0.001000 -0.009000
0.007808 1.000e-005 0.007818 95.00% CI of diff. -0.06282 to -0.05918 -0.05982 to -0.05618 -0.04982 to -0.04618 -0.05882 to -0.05518 0.001181 to 0.004819 0.01118 to 0.01482 0.002181 to 0.005819 0.008181 to 0.01182 -0.0008193 to 0.002819 -0.01082 to -0.007181
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes
Summary **** **** **** **** ** **** *** **** ns ****
Individual P Value <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0043 <0.0001 0.0006 <0.0001 0.2487 <0.0001
A B C C D
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 9.750
P value P=0.0018
MS 0.003510 0.0003600
Bulk-density SS 0.01404 0.003600 0.01764
DF 4 10 14
Fisher's LSD T2 vs. T1 T3 vs. T1 T4 vs. T1 T5 vs. T1 T3 vs. T2 T4 vs. T2
Mean Diff. -0.03667 -0.04667 -0.07000 0.01333 -0.01000 -0.03333
95.00% CI of diff. -0.07118 to -0.002148 -0.08118 to -0.01215 -0.1045 to -0.03548 -0.02118 to 0.04785 -0.04452 to 0.02452 -0.06785 to 0.001185
Below threshold? Yes Yes Yes No No No
Summary * * ** ns ns ns
Individual P Value 0.0395 0.0131 0.0011 0.4096 0.5331 0.0569
P-31
0.05000 -0.02333 0.06000 0.08333
0.01548 to 0.08452 -0.05785 to 0.01118 0.02548 to 0.09452 0.04882 to 0.1179
Yes No Yes Yes
** ns ** ***
0.0091 0.1629 0.0031 0.0003
A A B B B
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 1.075
P value P=0.4187
MS 9.738 9.060
Dispersibility SS 38.95 90.60 129.6
DF 4 10 14
Mean Diff. 1.730 4.740 0.9233 1.200 3.010 -0.8067 -0.5300 -3.817 -3.540 0.2767
95.00% CI of diff. Below threshold? No No No No No No No No No No
-3.746 to 7.206 -0.7360 to 10.22 -4.553 to 6.399 -4.276 to 6.676 -2.466 to 8.486 -6.283 to 4.669 -6.006 to 4.946 -9.293 to 1.659 -9.016 to 1.936 -5.199 to 5.753
Summary ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns
Individual P Value 0.4975 0.0826 0.7150 0.6359 0.2487 0.7495 0.8336 0.1515 0.1803 0.9126
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 37.82
P value P<0.0001
MS 2.852 0.07541
WSI(%) SS 11.41 0.7541 12.16
DF 4 10 14
95.00% CI of diff. Below threshold? No -0.9696 to 0.02960 Yes -1.560 to -0.5604 Yes -3.056 to -2.057 Yes -1.870 to -0.8704 Yes -1.090 to -0.09040 Yes -2.586 to -1.587 Yes -1.400 to -0.4004 Yes -1.996 to -0.9971 No -0.8096 to 0.1896 Yes 0.6871 to 1.686
Mean Diff. -0.4700 -1.060 -2.557 -1.370 -0.5900 -2.087 -0.9000 -1.497 -0.3100 1.187
Summary ns *** **** *** * **** ** **** ns ***
Individual P Value 0.0625 0.0008 <0.0001 0.0001 0.0251 <0.0001 0.0025 <0.0001 0.1969 0.0004
A A B B C
WAR(mg/g)
SS DF
MS
F (DFn, DFd)
P value
F (4, 10) = 58.93
P<0.0001
1676 28.44
6702 284.4 6987
4 10 14
95.00% CI of diff. -9.145 to 10.26 14.58 to 33.98 46.06 to 65.46 -3.665 to 15.74 14.02 to 33.42
Below threshold? No Yes Yes No Yes
Mean Diff. 0.5567 24.28 55.76 6.037 23.72
Summary Individual P Value 0.9008 0.0002 <0.0001 0.1957 0.0003
ns *** **** ns ***
P-32
55.20 5.480 31.48 -18.24 -49.72
45.50 to 64.90 -4.221 to 15.18 21.78 to 41.18 -27.94 to -8.542 -59.42 to -40.02
Yes No Yes Yes Yes
**** ns **** ** ****
<0.0001 0.2368 <0.0001 0.0019 <0.0001
A B C C C
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 43.60
P value P<0.0001
MS 2055 47.13
SC(mg/g) SS 8220 471.3 8691
DF 4 10 14
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes
Mean Diff. -17.56 -35.37 -68.89 -43.89 -17.82 -51.34 -26.33 -33.52 -8.513 25.01
95.00% CI of diff. -30.05 to -5.067 -47.86 to -22.88 -81.38 to -56.40 -56.38 to -31.40 -30.31 to -5.327 -63.83 to -38.85 -38.82 to -13.84 -46.01 to -21.03 -21.00 to 3.977 12.52 to 37.50
Summary * **** **** **** ** **** *** *** ns **
Individual P Value 0.0107 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0098 <0.0001 0.0008 0.0001 0.1598 0.0012
A B C C D
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 45.60
P value P<0.0001
MS 83.37 1.828
Drying-yield(%) SS 333.5 18.28 351.7
DF 4 10 14
95.00% CI of diff. 1.340 to 6.260 -10.83 to -5.907 -9.160 to -4.240 -1.160 to 3.760 -14.63 to -9.707 -12.96 to -8.040 -4.960 to -0.04028 -0.7931 to 4.126 7.207 to 12.13 5.540 to 10.46
Mean Diff. 3.800 -8.367 -6.700 1.300 -12.17 -10.50 -2.500 1.667 9.667 8.000
Below threshold? Yes Yes Yes No Yes Yes Yes No Yes Yes
Summary Individual P Value 0.0063 <0.0001 0.0001 0.2662 <0.0001 <0.0001 0.0470 0.1620 <0.0001 <0.0001
** **** *** ns **** **** * ns **** ****
A B B C C
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 0.9184
P value P=0.4902
MS 0.2837 0.3089
ME(%) SS 1.135 3.089 4.224
DF 4 10 14
P-33
Mean Diff. 0.4333 0.6733 0.6033 0.06667 0.2400 0.1700 -0.3667 -0.07000 -0.6067 -0.5367
95.00% CI of diff. -0.5778 to 1.445 -0.3378 to 1.685 -0.4078 to 1.615 -0.9445 to 1.078 -0.7712 to 1.251 -0.8412 to 1.181 -1.378 to 0.6445 -1.081 to 0.9412 -1.618 to 0.4045 -1.548 to 0.4745
Below threshold? No No No No No No No No No No
Summary ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns
Individual P Value 0.3622 0.1687 0.2132 0.8861 0.6085 0.7158 0.4379 0.8805 0.2109 0.2643
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 6.488
P value P=0.0077
MS 0.9200 0.1418
PC5min(mgGAE/g) SS 3.680 1.418 5.098
DF 4 10 14
Mean Diff. -1.250 -1.057 -0.9267 -1.423 0.1933 0.3233 -0.1733 0.1300 -0.3667 -0.4967
95.00% CI of diff. -1.935 to -0.5649 -1.742 to -0.3716 -1.612 to -0.2416 -2.108 to -0.7383 -0.4917 to 0.8784 -0.3617 to 1.008 -0.8584 to 0.5117 -0.5551 to 0.8151 -1.052 to 0.3184 -1.182 to 0.1884
Below threshold? Yes Yes Yes Yes No No No No No No
Summary ** ** * *** ns ns ns ns ns ns
Individual P Value 0.0023 0.0064 0.0130 0.0009 0.5436 0.3177 0.5853 0.6814 0.2606 0.1373
A B B B B
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 1.134
P value P=0.3943
MS 0.9586 0.8450
TPC(mgGAE/g) SS 3.834 8.450 12.28
DF 4 10 14
Mean Diff. -0.4156 0.9081 0.7878 0.6157 1.324 1.203 1.031 -0.1203 -0.2924 -0.1721
95.00% CI of diff. -2.088 to 1.257 -0.7643 to 2.580 -0.8845 to 2.460 -1.057 to 2.288 -0.3487 to 2.996 -0.4690 to 2.876 -0.6410 to 2.704 -1.793 to 1.552 -1.965 to 1.380 -1.844 to 1.500
Below threshold? No No No No No No No No No No
Summary ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns
Individual P Value 0.5920 0.2541 0.3186 0.4311 0.1083 0.1399 0.1994 0.8759 0.7051 0.8233
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 7.992
P value P=0.0037
MS 0.01769 0.002213
DPPH_IC50(mg/mL) SS 0.07076 0.02213 0.09289
DF 4 10 14
Fisher's LSD T2 vs. T1 T3 vs. T1 T4 vs. T1 T5 vs. T1
Mean Diff. 0.1833 0.1200 0.03333 0.1433
95.00% CI of diff. 0.09774 to 0.2689 0.03441 to 0.2056 -0.05226 to 0.1189 0.05774 to 0.2289
Below threshold? Yes Yes No Yes
Summary *** * ns **
Individual P Value 0.0008 0.0108 0.4059 0.0039
P-34
-0.06333 -0.1500 -0.04000 -0.08667 0.02333 0.1100
-0.1489 to 0.02226 -0.2356 to -0.06441 -0.1256 to 0.04559 -0.1723 to -0.001077 -0.06226 to 0.1089 0.02441 to 0.1956
No Yes No Yes No Yes
ns ** ns * ns *
0.1302 0.0029 0.3223 0.0477 0.5571 0.0169
A A A B B
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 6.796
P value P=0.0065
MS 0.007340 0.001080
ABTS_IC50(mg/mL) DF 4 10 14
SS 0.02936 0.01080 0.04016
Mean Diff. 0.1300 0.03667 0.03667 0.07667 -0.09333 -0.09333 -0.05333 0.000 0.04000 0.04000
95.00% CI of diff. 0.07021 to 0.1898 -0.02312 to 0.09645 -0.02312 to 0.09645 0.01688 to 0.1365 -0.1531 to -0.03355 -0.1531 to -0.03355 -0.1131 to 0.006454 -0.05979 to 0.05979 -0.01979 to 0.09979 -0.01979 to 0.09979
Below threshold? Yes No No Yes Yes Yes No No No No
Summary *** ns ns * ** ** ns ns ns ns
Individual P Value 0.0007 0.2017 0.2017 0.0170 0.0059 0.0059 0.0749 >0.9999 0.1669 0.1669
A A B B C B C C
aAI_IC50(ug/mL)
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 23.34
P value P<0.0001
MS 72.14 3.091
SS DF 4 10 14
288.6 30.91 319.5
Mean Diff. 5.897 -1.353 8.423 9.433 -7.250 2.527 3.537 9.777 10.79 1.010
95.00% CI of diff. 2.698 to 9.095 -4.552 to 1.845 5.225 to 11.62 6.235 to 12.63 -10.45 to -4.052 -0.6717 to 5.725 0.3383 to 6.735 6.578 to 12.98 7.588 to 13.99 -2.188 to 4.208
Below threshold? Yes No Yes Yes Yes No Yes Yes Yes No
Summary ** ns *** **** *** ns * **** **** ns
Individual P Value 0.0021 0.3680 0.0002 <0.0001 0.0005 0.1089 0.0335 <0.0001 <0.0001 0.4977
A A B B C C
aGI_IC50(ug/mL)
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 50.96
P value P<0.0001
SS DF 4 10
128.5 6.302
MS 32.12 0.6302
P-35
134.8
14
95.00% CI of diff. Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No No
7.336 to 10.22 5.152 to 8.041 4.239 to 7.128 4.819 to 7.708 -3.628 to -0.7391 -4.541 to -1.652 -3.961 to -1.072 -2.358 to 0.5309 -1.778 to 1.111 -0.8643 to 2.024
Mean Diff. 8.780 6.597 5.683 6.263 -2.183 -3.097 -2.517 -0.9133 -0.3333 0.5800
Summary Individual P Value <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0071 0.0007 0.0030 0.1892 0.6183 0.3919
**** **** **** **** ** *** ** ns ns ns
A B B B C
24
0/30
0/30
1/30
10/30
30/30
48
0/30
0/30
1/29
10/20
-
7/10
72
0/30
0/30
0/28
-
0/3
0/30 0/30
0/30 0/30
0/28 2/30
27/30
- 30/30
Ghi chú: Quy trình đánh giá theo OECD 203 trên ấu trùng cá ngựa vằn (3-5 ngày tuổi), t = 96 (giờ), n = 30 (cá thể).
Ngày 1
0/7
Ngày 2
0/7
Ngày 3
0/7
Ngày 4
0/7
Ngày 5
0/7
Ngày 6
0/7
Ngày 7
0/7
5.000
Ghi chú: Quy trình đánh giá theo OECD 432 trên cá ngựa vằn trưởng thành (3,5 đến 4 tháng tuổi), t = 7 (ngày), n = 7 (cá thể).
P-36
SZLCE 83.00 137.8 246.6 159.6 114.4 148.3
ACAR 72.60 139.8 211.8 128.0 104.6 131.4
SZLMEP Row means 79.24 170.7 232.5 153.2 118.9 150.9
83.40 179.0 138.2 138.2 108.6 129.5
F (DFn, DFd) F (16, 80) = 154.9 F (4, 80) = 2249 F (4, 20) = 499.4 F (20, 80) = 0.6837
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.8307
SS 91000 330278 50131 501.9 2936
DF 16 4 4 20 80
MS 5687 82569 12533 25.10 36.71 Below threshold?
Summary
Mean Diff.
Individual P Value
95.00% CI of diff.
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0010 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** *** **** **** **** **** ****
-117.0 -129.6 -94.80 -203.2 -12.60 22.20 -86.20 34.80 -73.60 -108.4
-124.4 to -109.6 -137.0 to -122.2 -102.2 to -87.44 -210.6 to -195.8 -19.96 to -5.242 14.84 to 29.56 -93.56 to -78.84 27.44 to 42.16 -80.96 to -66.24 -115.8 to -101.0
87.97 to 103.2 47.17 to 62.43 47.17 to 62.43 17.57 to 32.83 -48.43 to -33.17 -48.43 to -33.17 -78.03 to -62.77 -7.625 to 7.625 -37.23 to -21.97 -37.23 to -21.97
95.60 54.80 54.80 25.20 -40.80 -40.80 -70.40 0.000 -29.60 -29.60
**** **** **** **** **** **** **** ns **** ****
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 >0.9999 <0.0001 <0.0001
Row means 103.7 82.12 76.24 72.00 67.52 80.32
SZLMEP 113.2 79.60 77.80 73.40 64.20 81.64
METFO 113.2 63.60 62.40 57.20 58.40 70.96
DIABE 113.2 112.8 102.6 99.20 99.20 105.4
SZLCE 113.2 88.00 76.20 69.80 62.40 81.92
NORM 65.80 66.60 62.20 60.40 53.40 61.68
F (DFn, DFd) F (16, 80) = 4.552 F (4, 80) = 47.60 F (4, 20) = 64.33 F (20, 80) = 0.9875
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.4858
Table Analyzed ANOVA table Time x Group Time Group Subject Residual
DIABETIC TREATMENT FBGL (MG/DL) SS 7656 20013 26709 2076 8409
DF 16 4 4 20 80
MS 478.5 5003 6677 103.8 105.1
Mean Diff.
95.00% CI of diff.
Below threshold?
Summary
Individual P Value
Fisher's LSD 5 DIABE vs. NORM METFO vs. NORM SZLCE vs. NORM SZLMEP vs. NORM METFO vs. DIABE SZLCE vs. DIABE SZLMEP vs. DIABE SZLCE vs. METFO
46.20 -3.000 21.40 13.00 -49.20 -24.80 -33.20 24.40
33.35 to 59.05 -15.85 to 9.849 8.551 to 34.25 0.1515 to 25.85 -62.05 to -36.35 -37.65 to -11.95 -46.05 to -20.35 11.55 to 37.25
Yes No Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** ns ** * **** *** **** ***
<0.0001 0.6442 0.0013 0.0474 <0.0001 0.0002 <0.0001 0.0003
P-37
* ns
Yes No
16.00 -8.400
0.0152 0.1976
3.151 to 28.85 -21.25 to 4.449
32.95 to 58.65 -7.849 to 17.85 -3.849 to 21.85 -2.049 to 23.65 -53.65 to -27.95 -49.65 to -23.95 -47.85 to -22.15 -8.849 to 16.85 -7.049 to 18.65 -11.05 to 14.65
<0.0001 0.4419 0.1677 0.0985 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.5382 0.3726 0.7816
45.80 5.000 9.000 10.80 -40.80 -36.80 -35.00 4.000 5.800 1.800
**** ns ns ns **** **** **** ns ns ns
Yes No No No Yes Yes Yes No No No
NOR
DIA
MET
CE
MEP
3 1.020 0.2476 0.1429
3 0.4533 0.08083 0.04667
3 11.79 0.1443 0.08333
3 23.30 0.9808 0.5663
3 14.45 0.1443 0.08333
F (DFn, DFd) F (1.007, 2.013) = 1160 F (2, 8) = 0.4591
P value P=0.0008 P=0.6475
MS 278.7 0.1103 0.2403
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total
SREBF1 SS 1115 0.2207 1.922 1117
DF 4 2 8 14
95.00% CI of diff. -0.9855 to -0.1478 10.50 to 11.05 19.28 to 25.29 12.54 to 14.33 11.15 to 11.53 20.22 to 25.48 13.47 to 14.53 8.776 to 14.24 2.039 to 3.281 -10.96 to -6.737
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
Summary * **** *** *** **** *** **** ** ** **
Individual P Value 0.0283 <0.0001 0.0010 0.0002 <0.0001 0.0007 <0.0001 0.0030 0.0029 0.0031
Mean Diff. -0.5667 10.77 22.28 13.43 11.34 22.85 14.00 11.51 2.660 -8.850
Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR CE vs. NOR MEP vs. NOR MET vs. DIA CE vs. DIA MEP vs. DIA CE vs. MET MEP vs. MET MEP vs. CE Compact letter display CE MEP MET NOR DIA
A B C D E
NOR
MET
CE
MEP
3 1.013 0.2013 0.1162
3 3.393 0.2739 0.1581
3 0.2200 0.04583 0.02646
3 1.013 0.4283 0.2473
3 0.3100 0.05292 0.03055
F (DFn, DFd) F (4, 8) = 74.03 F (2, 8) = 0.5227
P value P<0.0001 P=0.6119
MS 4.974 0.03512 0.06720
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total
ACC1 SS 19.90 0.07024 0.5376 20.51
DF 4 2 8 14
Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR CE vs. NOR MEP vs. NOR MET vs. DIA
Mean Diff. 2.380 -0.7933 0.000 -0.7033 -3.173
95.00% CI of diff. 1.892 to 2.868 -1.281 to -0.3053 -0.4881 to 0.4881 -1.191 to -0.2153 -3.661 to -2.685
Below threshold? Yes Yes No Yes Yes
Summary **** ** ns * ****
Individual P Value <0.0001 0.0056 >0.9999 0.0105 <0.0001
P-38
-2.380 -3.083 0.7933 0.09000 -0.7033
-2.868 to -1.892 -3.571 to -2.595 0.3053 to 1.281 -0.3981 to 0.5781 -1.191 to -0.2153
Yes Yes Yes No Yes
**** **** ** ns *
<0.0001 <0.0001 0.0056 0.6819 0.0105
CE vs. DIA MEP vs. DIA CE vs. MET MEP vs. MET MEP vs. CE Compact letter display DIA NOR CE MEP MET
A B B C C
NOR
DIA
MET
CE
MEP
3 1.010 0.1929 0.1114
3 0.1967 0.03055 0.01764
3 3.273 0.1155 0.06667
3 4.123 0.2829 0.1633
3 2.563 0.1504 0.08686
F (DFn, DFd) F (1.400, 2.801) = 204.1 F (2, 8) = 0.02998
P value P=0.0010 P=0.9706
MS 7.805 0.001147 0.03825
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total
SS 31.22 0.002293 0.3060 31.53
FASN DF 4 2 8 14
95.00% CI of diff. -1.218 to -0.4087 1.500 to 3.027 2.042 to 4.184 1.149 to 1.957 2.717 to 3.436 3.165 to 4.688 2.042 to 2.691 0.2380 to 1.462 -1.273 to -0.1474 -2.636 to -0.4841
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
Summary * ** ** ** *** ** ** * * *
Individual P Value 0.0131 0.0061 0.0063 0.0036 0.0007 0.0020 0.0010 0.0269 0.0323 0.0247
Mean Diff. -0.8133 2.263 3.113 1.553 3.077 3.927 2.367 0.8500 -0.7100 -1.560
Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR CE vs. NOR MEP vs. NOR MET vs. DIA CE vs. DIA MEP vs. DIA CE vs. MET MEP vs. MET MEP vs. CE Compact letter display CE MET MEP NOR DIA
A B C D E
NOR
DIA
MET
CE
MEP
3 1.023 0.2836 0.1637
3 17.74 1.647 0.9508
3 0.2333 0.06028 0.03480
3 0.4533 0.2371 0.1369
SS
3 12.03 0.7108 0.4104 INSULIN DF
MS
F (DFn, DFd)
P value
F (1.302, 2.605) = 271.7 F (2, 8) = 0.6312
P=0.0010 P=0.5565
197.0 0.4576 0.7250
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total
787.8 0.9153 5.800 794.6
4 2 8 14
Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR CE vs. NOR MEP vs. NOR MET vs. DIA CE vs. DIA MEP vs. DIA CE vs. MET MEP vs. MET
Mean Diff. 11.01 16.72 -0.7900 -0.5700 5.713 -11.80 -11.58 -17.51 -17.29
95.00% CI of diff. 8.599 to 13.41 12.55 to 20.89 -1.636 to 0.05643 -1.844 to 0.7042 0.5616 to 10.87 -13.41 to -10.18 -13.02 to -10.13 -21.65 to -13.37 -21.21 to -13.37
Below threshold? Yes Yes No No Yes Yes Yes Yes Yes
Summary ** ** ns ns * ** *** ** **
Individual P Value 0.0026 0.0033 0.0568 0.1941 0.0412 0.0010 0.0008 0.0030 0.0028
P-39
0.2200
-0.2649 to 0.7049
No
ns
0.1902
MEP vs. CE Compact letter display MET DIA NOR MEP CE
A B C C C
NOR
DIA
MET
CE
MEP
3 1.013 0.1877 0.1084
3 1.820 0.05196 0.03000
3 0.9933 0.2335 0.1348
3 0.5100 0.08888 0.05132
3 0.3233 0.1150 0.06642
F (DFn, DFd) F (4, 8) = 41.87 F (2, 8) = 0.7069
P value P<0.0001 P=0.5216
MS 1.011 0.01706 0.02414
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total
SS 4.042 0.03412 0.1931 4.270
INSRA1 DF 4 2 8 14
Mean Diff. 0.8067 -0.02000 -0.5033 -0.6900 -0.8267 -1.310 -1.497 -0.4833 -0.6700 -0.1867
95.00% CI of diff. 0.5142 to 1.099 -0.3125 to 0.2725 -0.7958 to -0.2108 -0.9825 to -0.3975 -1.119 to -0.5342 -1.603 to -1.017 -1.789 to -1.204 -0.7758 to -0.1908 -0.9625 to -0.3775 -0.4792 to 0.1058
Below threshold? Yes No Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No
Summary *** ns ** *** *** **** **** ** *** ns
Individual P Value 0.0002 0.8786 0.0041 0.0006 0.0002 <0.0001 <0.0001 0.0052 0.0007 0.1793
Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR CE vs. NOR MEP vs. NOR MET vs. DIA CE vs. DIA MEP vs. DIA CE vs. MET MEP vs. MET MEP vs. CE Compact letter display DIA NOR MET CE MEP
A B B C C
NOR
DIA
MET
CE
MEP
3 1.017 0.2194 0.1267
3 0.5967 0.07638 0.04410
3 15.91 0.9632 0.5561
3 22.02 0.5312 0.3067
3 16.70 0.2606 0.1504
F (DFn, DFd) F (1.588, 3.177) = 1059 F (2, 8) = 0.8768
P value P<0.0001 P=0.4526
MS 289.2 0.2394 0.2731
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total
INSRB1 SS 1157 0.4788 2.185 1159
DF 4 2 8 14
Mean Diff. -0.4200 14.89 21.00 15.68 15.31 21.42 16.10 6.107 0.7900 -5.317
95.00% CI of diff. -0.7910 to -0.04904 12.84 to 16.95 19.34 to 22.66 14.54 to 16.82 12.99 to 17.63 19.95 to 22.89 15.33 to 16.88 3.718 to 8.495 -2.238 to 3.818 -6.825 to -3.809
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes
Summary * ** *** *** ** *** *** ** ns **
Individual P Value 0.0396 0.0010 0.0003 0.0003 0.0012 0.0003 0.0001 0.0082 0.3783 0.0043
Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR CE vs. NOR MEP vs. NOR MET vs. DIA CE vs. DIA MEP vs. DIA CE vs. MET MEP vs. MET MEP vs. CE Compact letter display CE MEP MET
A B B
P-40
NOR DIA
C D
MEP
NOR
DIA
MET
CE
3 0.3567 0.09074 0.05239
3 0.5567 0.02309 0.01333
3 1.000 0.03606 0.02082
3 1.830 0.06928 0.04000
3 3.763 0.5852 0.3379
F (DFn, DFd) F (4, 8) = 72.72 F (2, 8) = 0.5115
P value P<0.0001 P=0.6180
MS 5.759 0.04051 0.07920
Number of values Mean Std. Deviation Std. Error of Mean Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Individual (between rows) Residual (random) Total
SS 23.04 0.08101 0.6336 23.75
SGLT1 DF 4 2 8 14
Below threshold? Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes No
Summary ** **** * ns **** *** *** **** **** ns
Individual P Value 0.0069 <0.0001 0.0232 0.0898 <0.0001 0.0002 0.0005 <0.0001 <0.0001 0.4094
95.00% CI of diff. 0.3001 to 1.360 2.233 to 3.293 -1.173 to -0.1135 -0.9732 to 0.08654 1.403 to 2.463 -2.003 to -0.9435 -1.803 to -0.7435 -3.937 to -2.877 -3.737 to -2.677 -0.3299 to 0.7299
Mean Diff. 0.8300 2.763 -0.6433 -0.4433 1.933 -1.473 -1.273 -3.407 -3.207 0.2000
Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR CE vs. NOR MEP vs. NOR MET vs. DIA CE vs. DIA MEP vs. DIA CE vs. MET MEP vs. MET MEP vs. CE Compact letter display MET DIA NOR MEP CE
A B C C D D
3 3.847 0.1436 0.08293
3 3.310 0.2100 0.1212
3 2.217 0.1620 0.09351
3 1.007 0.1457 0.08413
3 0.3133 0.05132 0.02963
F (DFn, DFd) F (4, 8) = 236.0 F (2, 8) = 0.05676
P value P<0.0001 P=0.9452
MS 6.681 0.001607 0.02831
SS 26.73 0.003213 0.2265 26.96
GLP-1 DF 4 2 8 14
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
Summary *** **** **** **** **** **** **** ** **** ****
Individual P Value 0.0010 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0045 <0.0001 <0.0001
Mean Diff. -0.6933 2.840 2.303 1.210 3.533 2.997 1.903 -0.5367 -1.630 -1.093
95.00% CI of diff. -1.010 to -0.3766 2.523 to 3.157 1.987 to 2.620 0.8932 to 1.527 3.217 to 3.850 2.680 to 3.313 1.587 to 2.220 -0.8534 to -0.2199 -1.947 to -1.313 -1.410 to -0.7766
Fisher's LSD DIA vs. NOR MET vs. NOR CE vs. NOR MEP vs. NOR MET vs. DIA CE vs. DIA MEP vs. DIA CE vs. MET MEP vs. MET MEP vs. CE Compact letter display MET CE MEP NOR DIA
A B C D E
P-41
Conc. (mg/mL)
Mean
SEM
N
0.20
28.10
0.48
3
0.40
31.27
0.34
3
0.60
33.08
0.24
3
0.80
33.77
0.84
3
1.00
36.16
0.17
3
Conc. (mg/mL)
Mean
SEM
N
Conc. (mg/mL)
Mean
SEM
N
0.001563
4.54
0.06
3
0.03125
8.29
0.01
3
0.003125
8.29
0.05
3
0.0625
14.99
0.03
3
0.00625
17.43
0.07
3
0.125
20.71
0.04
3
0.0125
27.60
0.04
3
0.25
31.75
0.02
3
0.025
32.91
0.02
3
0.5
36.30
0.11
3
0.05
34.61
0.03
3
1
43.36
0.62
3
0.1
31.85
0.10
3
2
35.64
0.58
3
F (DFn, DFd) F (6, 21) = 17.25
P value P<0.0001
MS 837.7 48.57
Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Residual (within columns) Total
SZLCE SS 5026 1020 6046
DF 6 21 27
Fisher's LSD 0.003125 vs. 0.0015625 0.00625 vs. 0.0015625 0.0125 vs. 0.0015625 0.025 vs. 0.0015625 0.05 vs. 0.0015625 0.1 vs. 0.0015625 0.00625 vs. 0.003125 0.0125 vs. 0.003125 0.025 vs. 0.003125 0.05 vs. 0.003125 0.1 vs. 0.003125 0.0125 vs. 0.00625 0.025 vs. 0.00625 0.05 vs. 0.00625 0.1 vs. 0.00625 0.025 vs. 0.0125 0.05 vs. 0.0125 0.1 vs. 0.0125 0.05 vs. 0.025 0.1 vs. 0.025 0.1 vs. 0.05
Mean Diff. 6.577 14.64 29.13 35.14 38.33 22.03 8.060 22.56 28.56 31.75 15.45 14.50 20.50 23.69 7.388 6.003 9.194 -7.107 3.191 -13.11 -16.30
95.00% CI of diff. -3.671 to 16.82 4.389 to 24.88 18.88 to 39.38 24.89 to 45.38 28.08 to 48.57 11.78 to 32.27 -2.188 to 18.31 12.31 to 32.80 18.31 to 38.81 21.50 to 42.00 5.200 to 25.70 4.247 to 24.74 10.25 to 30.75 13.44 to 33.94 -2.860 to 17.64 -4.245 to 16.25 -1.054 to 19.44 -17.35 to 3.141 -7.057 to 13.44 -23.36 to -2.862 -26.55 to -6.053
Below threshold? No Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No No No No Yes Yes
Summary ns ** **** **** **** *** ns *** **** **** ** ** *** **** ns ns ns ns ns * **
Individual P Value 0.1963 0.0073 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0002 0.1168 0.0002 <0.0001 <0.0001 0.0050 0.0078 0.0004 <0.0001 0.1487 0.2366 0.0761 0.1640 0.5243 0.0146 0.0033
F (DFn, DFd) F (6, 14) = 1550
P value P<0.0001
MS 492.3 0.3176
Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Residual (within columns) Total
MEP SS 2954 4.447 2958
DF 6 14 20
Fisher's LSD 0.0625 vs. 0.03125 0.125 vs. 0.03125 0.25 vs. 0.03125 0.5 vs. 0.03125 1 vs. 0.03125
Mean Diff. 6.698 12.42 23.46 28.01 35.07
95.00% CI of diff. 5.711 to 7.685 11.44 to 13.41 22.47 to 24.45 27.02 to 28.99 34.08 to 36.06
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes
Summary Individual P Value <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
**** **** **** **** ****
P-42
2 vs. 0.03125 0.125 vs. 0.0625 0.25 vs. 0.0625 0.5 vs. 0.0625 1 vs. 0.0625 2 vs. 0.0625 0.25 vs. 0.125 0.5 vs. 0.125 1 vs. 0.125 2 vs. 0.125 0.5 vs. 0.25 1 vs. 0.25 2 vs. 0.25 1 vs. 0.5 2 vs. 0.5 2 vs. 1
27.35 5.727 16.76 21.31 28.37 20.65 11.04 15.58 22.65 14.92 4.547 11.61 3.887 7.063 -0.6600 -7.723
26.36 to 28.33 4.740 to 6.714 15.78 to 17.75 20.32 to 22.30 27.39 to 29.36 19.66 to 21.64 10.05 to 12.02 14.60 to 16.57 21.66 to 23.63 13.94 to 15.91 3.560 to 5.534 10.62 to 12.60 2.900 to 4.874 6.076 to 8.050 -1.647 to 0.3270 -8.710 to -6.736
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes
**** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** ns ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.1735 <0.0001
F (DFn, DFd) F (4, 10) = 39.95
P value P<0.0001
MS 27.19 0.6806
Table Analyzed ANOVA table Treatment (between columns) Residual (within columns) Total
Ibuprofen SS 108.7 6.806 115.5
DF 4 10 14
Mean Diff. 3.177 4.980 5.670 8.067 1.803 2.493 4.890 0.6900 3.087 2.397
95.00% CI of diff. 1.676 to 4.678 3.479 to 6.481 4.169 to 7.171 6.566 to 9.568 0.3025 to 3.304 0.9925 to 3.994 3.389 to 6.391 -0.8108 to 2.191 1.586 to 4.588 0.8958 to 3.898
Below threshold? Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes
Summary *** **** **** **** * ** **** ns ** **
Individual P Value 0.0008 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0232 0.0041 <0.0001 0.3298 0.0010 0.0052
F (DFn, DFd) F (8, 24) = 200.4 F (4, 24) = 1758 F (2, 6) = 3597 F (6, 24) = 0.1996
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.9736
Fisher's LSD 0.4 mg/mL vs. 0.2 mg/mL 0.6 mg/mL vs. 0.2 mg/mL 0.8 mg/mL vs. 0.2 mg/mL 1.0 mg/mL vs. 0.2 mg/mL 0.6 mg/mL vs. 0.4 mg/mL 0.8 mg/mL vs. 0.4 mg/mL 1.0 mg/mL vs. 0.4 mg/mL 0.8 mg/mL vs. 0.6 mg/mL 1.0 mg/mL vs. 0.6 mg/mL 1.0 mg/mL vs. 0.8 mg/mL Table Analyzed ANOVA table Time x Column Factor Time Column Factor Subject Residual
MEP&CE&Ibuprofen SS 591.6 2595 529.9 0.4419 8.855
DF 8 4 2 6 24
MS 73.95 648.7 264.9 0.07365 0.3690
Mean Diff.
95.00% CI of diff. Below threshold?
Summary
Individual P Value
Yes Yes Yes
**** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001
-6.697 13.11 19.81
-7.625 to -5.768 12.18 to 14.04 18.88 to 20.73
Yes Yes Yes
**** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001
-3.287 10.56 13.85
-4.215 to -2.358 9.632 to 11.49 12.92 to 14.77
Yes Yes Yes
**** ** ****
<0.0001 0.0066 <0.0001
-4.153 1.327 5.480
-5.082 to -3.225 0.3984 to 2.255 4.552 to 6.408
Yes Yes No
**** **** ns
<0.0001 <0.0001 0.0692
-3.387 -2.530 0.8567
-4.315 to -2.458 -3.458 to -1.602 -0.07163 to 1.785
Yes Yes Yes
**** **** **
<0.0001 <0.0001 0.0018
-8.750 -7.197 1.553
-9.678 to -7.822 -8.125 to -6.268 0.6250 to 2.482
P-43
Control(-) 14.43 24.43 44.47 46.67 55.57 37.11
SZLCE 2 mg/L 13.33 13.33 13.33 23.33 22.23 17.11
SZLCE 5 mg/L 14.47 10.00 21.10 20.00 14.43 16.00
SZLCE 7.5 mg/L 12.20 12.20 20.00 25.57 41.10 22.21
Row means 14.22 17.55 26.00 29.11 31.56 23.69
Means 0 2 4 6 24 Column means
Ibuprofen 2 mg/L 16.67 27.78 31.11 30.00 24.45 26.00 Comparison-of- SZLCE&Ibuprofen
F (DFn, DFd) F (16, 40) = 12.18 F (4, 40) = 58.07 F (4, 10) = 34.91 F (10, 40) = 2.154
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.0421
Table Analyzed ANOVA table Time x Column Factor Time Column Factor Subject Residual
SS 2819 3360 4351 311.6 578.6
DF 16 4 4 10 40
MS 176.2 840.1 1088 31.16 14.47
Mean Diff.
95.00% CI of diff.
Below threshold?
Summary
Individual P Value
Fisher's LSD 24 Ibuprofen 2 mg/L vs. Control(-) SZLCE 2 mg/L vs. Control(-) SZLCE 5 mg/L vs. Control(-) SZLCE 7.5 mg/L vs. Control(-) SZLCE 2 mg/L vs. Ibuprofen 2 mg/L SZLCE 5 mg/L vs. Ibuprofen 2 mg/L SZLCE 7.5 mg/L vs. Ibuprofen 2 mg/L SZLCE 5 mg/L vs. SZLCE 2 mg/L SZLCE 7.5 mg/L vs. SZLCE 2 mg/L SZLCE 7.5 mg/L vs. SZLCE 5 mg/L
-31.12 -33.33 -41.13 -14.47 -2.213 -10.01 16.65 -7.800 18.87 26.67
-38.04 to -24.20 -40.25 to -26.41 -48.05 to -34.21 -21.39 to -7.546 -9.134 to 4.707 -16.93 to -3.093 9.733 to 23.57 -14.72 to -0.8798 11.95 to 25.79 19.75 to 33.59
Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** *** ns ** **** * **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0001 0.5235 0.0054 <0.0001 0.0279 <0.0001 <0.0001
Means 0 2 4 6 24 Column means
Control(-) 14.43 24.43 44.47 46.67 55.57 37.11
Ibuprofen 2 mg/L 16.67 27.78 31.11 30.00 24.45 26.00
SZLMEP 40 mg/L 15.53 21.10 24.47 27.80 30.00 23.78
SZLMEP 100 mg/L 16.67 24.43 25.57 17.80 15.57 20.01
SZLMEP 150 mg/L 14.43 22.20 24.47 18.90 18.90 19.78
Row means 15.55 23.99 30.02 28.23 28.90 25.34
F (DFn, DFd)
P value F (16, 40) = 16.85 P<0.0001 F (4, 40) = 54.63 P<0.0001 F (4, 10) = 52.69 P<0.0001 F (10, 40) = 1.481 P=0.1825
Table Analyzed ANOVA table Time x Column Factor Time Column Factor Subject Residual
Comparison-of- SZLMEP&Ibuprofen SS 2602 2109 3013 142.9 386.1
DF 16 4 4 10 40
MS 162.7 527.3 753.1 14.29 9.652
Mean Diff.
95.00% CI of diff.
Below threshold?
Summary
Individual P Value
Fisher's LSD 24 Ibuprofen 2 mg/L vs. Control(-) SZLMEP 40 mg/L vs. Control(-) SZLMEP 100 mg/L vs. Control(-) SZLMEP 150 mg/L vs. Control(-) SZLMEP 40 mg/L vs. Ibuprofen 2 mg/L SZLMEP 100 mg/L vs. Ibuprofen 2 mg/L SZLMEP 150 mg/L vs. Ibuprofen 2 mg/L SZLMEP 100 mg/L vs. SZLMEP 40 mg/L SZLMEP 150 mg/L vs. SZLMEP 40 mg/L SZLMEP 150 mg/L vs. SZLMEP 100 mg/L
-31.12 -25.57 -40.00 -36.67 5.553 -8.880 -5.547 -14.43 -11.10 3.333
-36.45 to -25.79 -30.90 to -20.23 -45.33 to -34.67 -42.00 to -31.33 0.2189 to 10.89 -14.21 to -3.546 -10.88 to -0.2122 -19.77 to -9.099 -16.43 to -5.766 -2.001 to 8.668
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No
**** **** **** **** * ** * **** *** ns
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0416 0.0016 0.0419 <0.0001 0.0001 0.2153
P-44
40oC-75%
40oC-90%
60oC-75%
60oC-90%
Thời gian (Ngày)
Mean
SEM
N
Mean
SEM
N
Mean
SEM N Mean
SEM N
0
32.05
0.01
3
32.05
0.01
3
32.05
0.01
3
32.05
0.01
3
10
30.47
0.22
3
30.71
0.38
3
31.11
0.01
3
30.77
0.00
3
20
30.44
0.05
3
29.59
0.26
3
29.71
0.18
3
26.21
0.20
3
30
29.10
0.16
3
28.17
0.09
3
29.58
0.02
3
24.51
0.13
3
40
29.00
0.05
3
27.53
0.01
3
28.90
0.15
3
24.41
0.17
3
50
28.76
0.12
0.03
3
27.66
0.02
3
24.06
0.10
3
F (DFn, DFd) F (15, 40) = 72.57 F (5, 40) = 917.2 F (3, 8) = 386.6 F (8, 40) = 1.704
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.1274
Table Analyzed ANOVA table Time x Column Factor Time Column Factor Subject Residual
3 27.73 Storage_TPC (mgGAE/g)* SS 56.65 238.7 102.9 0.7095 2.082
DF 15 5 3 8 40
MS 3.777 47.73 34.29 0.08869 0.05204
Mean Diff.
95.00% CI of diff. Below threshold?
Summary
Individual P Value
0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
-0.3959 to 0.3959 -0.3959 to 0.3959 -0.3959 to 0.3959 -0.3959 to 0.3959 -0.3959 to 0.3959 -0.3959 to 0.3959
No No No No No No
ns ns ns ns ns ns
>0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999
-1.026 -1.095 -4.701 -0.06835 -3.675 -3.607
-1.422 to -0.6305 -1.491 to -0.6989 -5.097 to -4.306 -0.4642 to 0.3275 -4.071 to -3.279 -4.003 to -3.211
Yes Yes Yes No Yes Yes
**** **** **** ns **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 0.7300 <0.0001 <0.0001
-1.580 -1.607 -2.945 -3.048 -3.287 -0.02663 -1.365 -1.468 -1.707 -1.339 -1.441 -1.681 -0.1021 -0.3417 -0.2397
-1.956 to -1.204 -1.983 to -1.230 -3.322 to -2.569 -3.424 to -2.671 -3.664 to -2.911 -0.4031 to 0.3498 -1.742 to -0.9890 -1.844 to -1.091 -2.084 to -1.331 -1.715 to -0.9624 -1.817 to -1.064 -2.057 to -1.304 -0.4785 to 0.2744 -0.7182 to 0.03473 -0.6161 to 0.1368
Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No No
**** **** **** **** **** ns **** **** **** **** **** **** ns ns ns
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.8870 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.5867 0.0740 0.2056
40oC-75%
40oC-90%
60oC-75%
60oC-90%
Thời gian (Ngày)
Mean
SEM
N Mean
SEM
N
Mean
SEM
N Mean
SEM N
0
98.99
0.33
3
98.99
0.33
3
98.99
0.33
3
98.99
0.33
3
10
92.12
0.27
3
91.15
0.09
3
90.61
0.10
3
88.16
0.44
3
20
91.80
0.35
3
91.56
0.36
3
85.53
1.18
3
81.86
0.18
3
30
91.44
0.37
3
91.56
0.37
3
86.39
0.41
3
80.83
1.53
3
40
91.59
0.47
3
91.64
0.93
3
73.63
2.23
3
68.90
0.97
3
50
89.09
0.13
3
90.66
0.46
3
72.46
0.42
3
65.25
0.72
3
P-45
F (DFn, DFd) F (15, 40) = 49.02 F (5, 40) = 346.1 F (3, 8) = 459.5 F (8, 40) = 0.8182
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.5911
Table Analyzed ANOVA table Time x Column Factor Time Column Factor Subject Residual
Storage_DPPH (mgTE/g)* SS 1245 2929 1909 11.08 67.71
DF 15 5 3 8 40
MS 82.98 585.8 636.4 1.385 1.693
Mean Diff.
95.00% CI of diff.
Below threshold?
Summary
Individual P Value
0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
-2.103 to 2.103 -2.103 to 2.103 -2.103 to 2.103 -2.103 to 2.103 -2.103 to 2.103 -2.103 to 2.103
No No No No No No
ns ns ns ns ns ns
>0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999
1.577 -16.63 -23.84 -18.20 -25.42 -7.214
-0.5266 to 3.680 -18.73 to -14.52 -25.94 to -21.74 -20.31 to -16.10 -27.52 to -23.31 -9.318 to -5.111
No Yes Yes Yes Yes Yes
ns **** **** **** **** ****
0.1383 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
-6.872 -7.195 -7.555 -7.399 -9.907 -0.3224 -0.6824 -0.5267 -3.035 -0.3600 -0.2043 -2.713 0.1557 -2.353 -2.508
-9.019 to -4.725 -9.341 to -5.048 -9.701 to -5.408 -9.546 to -5.252 -12.05 to -7.760 -2.469 to 1.825 -2.829 to 1.465 -2.674 to 1.620 -5.182 to -0.8881 -2.507 to 1.787 -2.351 to 1.943 -4.860 to -0.5658 -1.991 to 2.303 -4.500 to -0.2057 -4.655 to -0.3615
Yes Yes Yes Yes Yes No No No Yes No No Yes No Yes Yes
**** **** **** **** **** ns ns ns ** ns ns * ns * *
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.7631 0.5243 0.6228 0.0068 0.7364 0.8485 0.0146 0.8842 0.0325 0.0232
40oC-75%
40oC-90%
60oC-75%
60oC-90%
Thời gian (Ngày)
Mean
SEM
N
Mean
SEM
N
Mean
SEM N Mean
SEM N
0
107.44
1.04
3
107.44
1.04
3
107.44
1.04
3
107.44
1.04
3
10
100.61
0.65
3
93.35
1.44
3
92.30
0.27
3
92.15
0.98
3
20
98.88
0.35
3
92.33
4.32
3
91.57
1.69
3
88.04
0.70
3
30
93.35
0.37
3
87.69
1.25
3
74.15
0.90
3
65.75
1.61
3
40
91.92
0.40
3
88.26
0.26
3
75.81
0.49
3
61.47
0.60
3
50
83.40
0.90
3
77.65
1.67
3
61.93
1.95
3
49.51
1.38
3
F (DFn, DFd) F (15, 40) = 25.09 F (5, 40) = 435.3 F (3, 8) = 164.3 F (8, 40) = 1.360
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.2435
Table Analyzed ANOVA table Time x Column Factor Time Column Factor Subject Residual
Storage_ABTS (mgTE/g)* SS 2010 11623 3579 58.10 213.6
DF 15 5 3 8 40
MS 134.0 2325 1193 7.262 5.340
Mean Diff.
95.00% CI of diff.
Below threshold?
Summary
Individual P Value
0.000 0.000 0.000
-3.906 to 3.906 -3.906 to 3.906 -3.906 to 3.906
No No No
ns ns ns
>0.9999 >0.9999 >0.9999
P-46
0.000 0.000 0.000
-3.906 to 3.906 -3.906 to 3.906 -3.906 to 3.906
No No No
ns ns ns
>0.9999 >0.9999 >0.9999
-5.747 -21.47 -33.88 -15.72 -28.14 -12.42
-9.653 to -1.841 -25.38 to -17.56 -37.79 to -29.98 -19.63 to -11.82 -32.04 to -24.23 -16.32 to -8.509
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
** **** **** **** **** ****
0.0048 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
-6.831 -8.557 -14.09 -15.52 -24.04 -1.725 -7.262 -8.690 -17.21 -5.537 -6.965 -15.49 -1.428 -9.950 -8.522
-10.64 to -3.018 -12.37 to -4.743 -17.91 to -10.28 -19.33 to -11.71 -27.86 to -20.23 -5.539 to 2.088 -11.08 to -3.449 -12.50 to -4.877 -21.03 to -13.40 -9.350 to -1.723 -10.78 to -3.152 -19.30 to -11.67 -5.241 to 2.385 -13.76 to -6.137 -12.34 to -4.708
Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes
*** **** **** **** **** ns *** **** **** ** *** **** ns **** ****
0.0008 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.3659 0.0004 <0.0001 <0.0001 0.0055 0.0007 <0.0001 0.4535 <0.0001 <0.0001
40oC-75%
40oC-90%
60oC-75%
60oC-90%
Thời gian (Ngày)
Mean
SEM
N
Mean
SEM
N
Mean
SEM N Mean
SEM N
0
0.192
0.003
3
0.192
0.003
3
0.192
0.003
3
0.192
0.003
3
10
0.144
0.000
3
0.150
0.000
3
0.172
0.002
3
0.201
0.000
3
20
0.205
0.001
3
0.208
0.001
3
0.229
0.001
3
0.221
0.002
3
30
0.164
0.000
3
0.194
0.003
3
0.230
0.004
3
0.278
0.001
3
0.004
0.184
3
0.220
0.001
3
0.415
0.001
3
0.679
0.000
3
F (DFn, DFd) F (15, 40) = 2945 F (5, 40) = 12052 F (3, 8) = 8001 F (8, 40) = 1.438
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.2110
40 Table Analyzed ANOVA table Time x Column Factor Time Column Factor Subject Residual
Storage_aAI (mg/mL)* SS 0.6347 0.8659 0.4960 0.0001653 0.0005748
DF 15 5 3 8 40
MS 0.04232 0.1732 0.1653 2.066e-005 1.437e-005
Mean Diff.
95.00% CI of diff.
Below threshold?
Summary
Individual P Value
0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
-0.006446 to 0.006446 -0.006446 to 0.006446 -0.006446 to 0.006446 -0.006446 to 0.006446 -0.006446 to 0.006446 -0.006446 to 0.006446
No No No No No No
ns ns ns ns ns ns
>0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999
0.01568 0.2396 0.5708 0.2239 0.5551 0.3312
0.009238 to 0.02213 0.2332 to 0.2461 0.5644 to 0.5773 0.2175 to 0.2304 0.5487 to 0.5616 0.3248 to 0.3377
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
-0.05397 to -0.04146 0.006249 to 0.01876 -0.03410 to -0.02159
Yes Yes Yes
**** *** ****
<0.0001 0.0002 <0.0001
40 vs. 0 50 vs. 0
-0.04771 0.01250 -0.02785 - 0.007930 0.06829
-0.01419 to -0.001675 0.06204 to 0.07455
Yes Yes
* ****
0.0143 <0.0001
P-47
20 vs. 10 30 vs. 10 40 vs. 10 50 vs. 10 30 vs. 20 40 vs. 20 50 vs. 20 40 vs. 30 50 vs. 30 50 vs. 40
0.06022 0.01987 0.03978 0.1160 -0.04035 -0.02043 0.05579 0.01992 0.09614 0.07622
0.05396 to 0.06647 0.01361 to 0.02612 0.03353 to 0.04604 0.1098 to 0.1223 -0.04661 to -0.03410 -0.02669 to -0.01418 0.04953 to 0.06204 0.01366 to 0.02617 0.08989 to 0.1024 0.06997 to 0.08248
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** **** **** **** **** **** ****
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
40oC-75%
40oC-90%
60oC-75%
60oC-90%
Thời gian (Ngày)
Mean
SEM
N
Mean
SEM
N
Mean
SEM N Mean
SEM N
3
0
0.009
0.000
3
0.009
0.000
0.009
0.000
3
0.009
0.000
3
3
10
0.033
0.000
3
0.031
0.000
0.026
0.000
3
0.028
0.000
3
3
20
0.031
0.000
3
0.030
0.000
0.034
0.000
3
0.033
0.001
3
3
30
0.031
0.001
3
0.033
0.000
0.038
0.000
3
0.048
0.001
3
3
40
0.040
0.001
3
0.041
0.001
0.054
0.000
3
0.070
0.000
3
3
0.001
3
0.060
0.000
0.062
0.001
3
0.075
0.001
3
0.050
F (DFn, DFd) F (15, 40) = 135.2 F (5, 40) = 4346 F (3, 8) = 302.7 F (8, 40) = 1.615
P value P<0.0001 P<0.0001 P<0.0001 P=0.1512
DF 15 5 3 8 40
50 Table Analyzed ANOVA table Time x Column Factor Time Column Factor Subject Residual
Storage_aGI (mg/mL)* SS 0.001873 0.02008 0.001355 1.194e-005 3.696e-005
MS 0.0001249 0.004016 0.0004517 1.492e-006 9.241e-007
Below
Mean Diff.
95.00% CI of diff.
threshold? Summary
Individual P Value
No No No No No No
ns ns ns ns ns ns
0.000 6.939e-018 0.000 0.000 0.000 -6.939e-018
-0.001657 to 0.001657 -0.001657 to 0.001657 -0.001657 to 0.001657 -0.001657 to 0.001657 -0.001657 to 0.001657 -0.001657 to 0.001657
>0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999
Yes Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** ** **** ****
0.009620 0.01209 0.02474 0.002467 0.01512 0.01265
0.007963 to 0.01128 0.01043 to 0.01374 0.02308 to 0.02640 0.0008103 to 0.004124 0.01346 to 0.01678 0.01099 to 0.01431
<0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0043 <0.0001 <0.0001
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes
**** **** **** **** **** * * **** **** ns **** **** **** **** ****
0.02420 0.02219 0.02225 0.03156 0.04111 -0.002017 -0.001954 0.007356 0.01691 6.233e-005 0.009373 0.01893 0.009311 0.01887 0.009554
0.02262 to 0.02579 0.02060 to 0.02377 0.02066 to 0.02383 0.02997 to 0.03314 0.03953 to 0.04270 -0.003603 to -0.0004304 -0.003541 to -0.0003680 0.005770 to 0.008943 0.01532 to 0.01850 -0.001524 to 0.001649 0.007787 to 0.01096 0.01734 to 0.02051 0.007724 to 0.01090 0.01728 to 0.02045 0.007968 to 0.01114
<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0140 0.0170 <0.0001 <0.0001 0.9371 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
P-48
![Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống ung thư của hợp chất lai chứa khung tetrahydro-β-carboline và imidazo[1,5-a]pyridine](https://cdn.tailieu.vn/images/document/thumbnail/2025/20250807/kimphuong1001/135x160/50321754536913.jpg)
