Bài giảng công nghệ sinh học - Chuyên đề 1: Các phương pháp nghiên cứu enzyme

Chia sẻ: Chen Linong | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:32

Thêm vào BST

Báo xấu

66
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Công nghệ sinh học - Chuyên đề 1: Các phương pháp nghiên cứu enzyme cung cấp cho học viên những kiến thức về các phương pháp xác định hoạt độ enzyme: phương pháp phân tích liên tục, phương pháp phân tích gián đoạn; các phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme; phương pháp đo độ nhớt;... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng công nghệ sinh học - Chuyên đề 1: Các phương pháp nghiên cứu enzyme

Chuyên đề 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ENZYME TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 1 học
NỘI DUNG 1.1. Các phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme 2.2. Các phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch enzyme TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh học 2
1.1. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 3 học
NGUYÊN TẮC • S còn lại • P tạo thành Có thể xác định được hoạt độ enzyme nghiên cứu • Cả S và P TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh học 4
CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME • Hai phương pháp: - Phương pháp phân tích liên tục: đo cơ chất bị biến đổi hay sản phẩm tạo thành một cách liên tục theo thời gian Ứng dụng: khi không có chất hay cách làm ngưng phản ứng tức thì. Khó áp dụng - Phương pháp phân tích gián đoạn: cho E tác dụng với S sau khoảng t nhất định thì làm ngưng phản ứng Ứng dụng: rất phổ biến; tác nhân ngưng phản ứng: nhiệt độ cao, thay đổi pH, dùng chất bất hoạt enzyme TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 5 học
PHƢƠNG PHÁP ĐO ĐỘ NHỚT • Yêu cầu: độ nhớt của S phải lớn hơn nhiều so với P • Chất có M lớn thì độ nhớt càng cao: AN, protein, cellulose Nhớt kế Brookfield - USA TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 6 học
PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ UV-vis Biorad • Yêu cầu: S, P có khả năng hấp thụ ánh sáng phân cực ở các  xác định • Điều quan trọng: là xác định được  của P hoặc S • Ví dụ: NADH (340nm); Phosphoenolpyruvat – PEP (240 nm), Aa (260-280 nm),…. TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh học 7
PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ • Yêu cầu: pứ E có sự hình thành acid hoặc base • Áp dụng: xác định hoạt độ lipase • Ưu điểm: độ chính xác cao METTLER TOLEDO T70 TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 8 học
PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC • Yêu cầu: P là các chất màu có độ hấp thụ ánh sáng cực đại ở vùng nào đó • Áp dụng: xđ hoạt độ enzyme - amylase • Kiểm tra mức độ nấu malt bia TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 9 học
PHƯƠNG PHÁP HUZNH QUANG • Áp dụng: Khi các phương pháp thông thường không xác định được • Cơ sở: dựa trên sự hình thành các bức xạ của các chất đồng vị phóng xạ gắn vào S tại nhóm chức thích hợp để có thể đo độ phóng xạ (sự phân rã) của S còn lại, hay P tạo thành • Ví dụ: ATPase với cơ chất - [P32]-ATP. Sau pứ tạo thành P32 va ADP TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 10 học
ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG KHI TIẾN HÀNH XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 1 S và Cofactor ở mức độ dư thừa 2 Thời gian xác định càng ngắn càng tốt 3 Cần có sự biến đổi tuyến tính giữa [E] , t phản ứng, và mức độ chuyển hóa S TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 11 học
MỘT SỐ LƢU Ý KHI XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ HAY THỰC HIỆN PHẢN ỨNG E 1 - Chọn pH và nhiệt độ phân tích ở vùng thích hợp 2 – Lưu ý đến S, thành phần đệm, lực ion hay nồng độ muối, các chất làm bền như Ca2+, glycerol, BSA,… 3- S, E, đệm đều phải đạt cùng 1 nhiệt độ khi tiếp xúc với nhau để bắt đầu phản ứng 4-Phải luôn có mẫu kiểm tra nhất định để tránh sai số 5- Chọn cách làm ngưng phản ứng thích hợp TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 12 học
ĐƠN VỊ ĐO HOẠT ĐỘ ENZYME • Đơn vị IU (International unit) 1IU = 1 µM cơ chất/phút • Đơn vị Katal (Kat) – ít được dùng 1 kat = 1M cơ chất/ giây 1IU = (1/60). 10-6 kat = 16,66 nkcat 1 kcat = 60. 106 IU • Hoạt độ riêng (specific activity) – dùng khi tinh sạch E …được tính bằng số đơn vị hoạt độ E trên một đơn vị khối lượng (miligam hay gam) protein TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 13 học
1.2: CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 14 học
GIÁ THÀNH ENZYME PROTEASE: papain protease LIPASE: 9001-62-1 Huangpu Port etc: 300 USD/kg Dianmei: 70-80 USD/kg TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 15 học
KHU TRÚ CỦA E • Enzyme ngoại bào: e. hydrolase; tổng hợp trong TB rồi sau đó tiết ra môi trường nuôi cấy chìm,… • Enzyme nội bào: được tổng hợp và sử dụng bên trong tế bào; thường ở dạng liên hợp; “nhốt” trong các bào quan TB • Các enzyme periplasmic: E nằm ở xoang ngoài màng sinh chất nhưng trong màng TB TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 16 học
NHỮNG ĐIỀU CẦN LƢU Ý KHI TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH E CẦN TUÂN THỦ Vì E là protein: dễ mất hoạt tính sinh học nên: • Chọn dung dịch chiết thích hợp • Chọn nhiệt độ chiết: khoảng 40C • Bổ sung chất làm bền: CaCl2, MgCl2 2-5nM, glycerol 10-20% • Chất chống oxy hóa: betas-mercaptoethanol; dithiothreitol 1-5mM KHÍA CẠNH SX: - E khó giữ được hoạt tính. Nên E có hoạt tính cao thì càng đắt - Xây dựng quy trình công nghệ đơn giản nhất có thể TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 17 học
THU NHẬN CHẾ PHẨM E THÔ • Phá vỡ màng tế bào: siêu âm, dùng E (lysozyme), máy nén, sốc nhiệt, nghiền với cát thủy tinh, nghiền bi • Thu dịch chiết E: ly tâm • Cô đặc dịch chiết ở t thấp • Tủa protein: etanol, aceton, muối trung tính như ammonium sulfate TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 18 học
TÁCH TỪNG PHẦN VÀ TINH SẠCH ENZYME • Sắc kí trao đổi ion: dùng ở bước đầu • Sắc kí lọc gel: thường dùng với mẫu đã cô đặc, thể tích mẫu nhỏ • Ly tâm siêu tốc: cần có gradient nồng độ là glycerol hay saccharose • Sắc kí ái lực: nhanh chóng nhất hiện hay, khó khăn là không tìm được chất gắn thích hợp • Điện di chế phẩm: áp dụng ở quy mô rất nhỏ TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 19 học
SẮC KÍ TRAO ĐỔI ION - Thường được dùng ở bước tinh sạch ban đầu - chất nhồi (nền) là cellulose, sephadex hay sepharose được gắn các nhóm chức tích điện dương như DEAE (diethylaminoethyl), QAE (quaternaly aminoethyl), hoặc tích điện âm như CM (carboxyl methyl), SP (sulphoproxyl) - Ái lực lk giữa E với gel trao đổi ion phụ thuộc vào mức độ tích điện của mẫu - Lựa chọn pH của mt sắc kí trao đổi ion cho phép E cần tinh sạch gắn với gen hoặc không gắn TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh 20 học