Bài giảng Giải trình tự - ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

3
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Giải trình tự, được biên soạn gồm các nội dung chính sau: Giải trình tự hóa học; Giải trình tự Sanger – tự động; Giải trình tự thế hệ mới NGS. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Giải trình tự - ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương

GIẢI TRÌNH TỰ ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương Email: ntmnuong@hcmus.edu.vn
Nội dung 1. Giải trình tự hóa học 2. Giải trình tự Sanger – tự động 3. Giải trình tự thế hệ mới NGS 2
Tài liệu tham khảo [1] Buckingham, L. (2007). Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications (1st ed.). Philadelphia: F.A. Davis Co.
LƯỢC SỬ  Frederick Sanger (Cambridge) phát triển kỹ thuật giải trình tự dựa trên sự tổng hợp gián đoạn DNA (1977)  Walter Gilbert & Allan Maxam (Harvard) phát triển kỹ thuật giải trình tự dựa trên sự phân cắt hóa học (1977) Fred Sanger  Một số phương pháp giải trình tự mới được phát triển vào giữa và cuối những năm 1990, và thương mại hóa vào đầu những năm 2000. Các phương pháp này được gọi là “giải trình tự thế hệ tiếp theo” (Next Generation Sequencing – NGS), có khả năng giải cao gấp nhiều lần so với phương pháp Sanger. 4
PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT Nguyên lý: dựa trên sự phân cắt hóa học đặc hiệu tại các base
PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT 1. Tạo DNA mạch đơn (tạo dòng trong M13) 2. Đánh dấu đầu 5’ của DNA bằng đồng vị phóng xạ P32 3. Phân cắt hóa học tại các base trong 4 phản ứng (G, A+G, T, T+C) 4. Phân tích bằng điện di trên gel polyacrylamide 5. Phóng xạ tự ghi. Đọc kết quả - DNA mạch đơn - Kích thước trình tự ngắn, khó tự động hóa - Hóa chất độc 6
PHƯƠNG PHÁP SANGER Nguyên lý: dựa trên sự tổng hợp mạch bị dừng tại các ddNTP
PHƯƠNG PHÁP SANGER 1. Thiết lập 4 phản ứng có chứa các thành phần cần cho tổng hợp DNA (dNTP, DNA polymerase, 1 primer, mạch khuôn, 1 loại nucleotide đánh dấu phóng xạ) + 1 trong 4 loại ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP 2. Phân tích bằng điện di trên gel polyacrylamide 3. Phóng xạ tự ghi. Đọc kết quả - DNA mạch đơn - Kích thước trình tự ngắn 300-400 base (do hạn chế của enzyme, hệ thống điện di)  Các cải tiến: enzyme chịu nhiệt, bền, tương tác tốt với ddNTP và các đồng phân => cycle sequencing Nhiều phản ứng đồng thời DNA mạch đôi 8
GIẢI TRÌNH TỰ TỰ ĐỘNG Giaỉ trình tự tự động khác thủ công : - Không sử dụng đồng vị phóng xạ mà sử dụng chất phát huỳnh quang. Có 4 loại phân tử phát huỳnh quang để đánh dấu 4 loại ddNTP. - Điện di mao quản : 1 trình tự cần giải/1 mao quản 9
KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ Tốt Không tốt
code Base A Adenine C Cytosine G Guanine T (or U) Thymine (or Uracil) R A or G Y C or T S G or C W A or T K G or T M A or C B C or G or T D A or G or T H A or C or T V A or C or G N any base
GIẢI MÃ BỘ GENE NGƯỜI 2003 12
GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI NGS Một thư viện lớn gồm hàng ngàn đến hàng triệu đoạn DNA được giải trình tự đồng thời trong 1 thí nghiệm
Chuẩn bị thư viện Tạo ra một bộ sưu tập các đoạn DNA cho giải trình tự: - Tách chiết DNA - Định lượng - Đặt phản ứng cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn tạo ra các đoạn kích thước phù hợp với phương pháp GTT - Tinh sạch - Đặt phản ứng nối với các adapter - Tinh sạch chọn lọc kích thước
Multiplexing
Nhân bản
PYROSEQUENCING Roche 454 sequencing - Phát minh năm 2000 - Dừng: 2016
PYROSEQUENCING 1. Bước 1 : mồi giải trình tự bắt cặp với DNA cần giải mạch đơn. Trong phản ứng có : ATP sulfurylase, apyrase, luciferase và các cơ chất adenosine 5’phosphosulfate (APS), luciferin. 2. Bước 2 : thêm 1 trong 4 loại dNTP, DNA pol kéo dài mạch mới. Mỗi nucleotide gắn vào sẽ giải phóng pyrophosphate (PPi) ATP sulfurylase chuyển PPi thành ATP khi có mặt APS. ATP này là cơ chất cho phản ứng biến luciferin thành oxyluciferin bởi luciferase, tạo ánh sáng được ghi nhận bởi đầu đọc. Nucleotides tự do và ATP sẽ bị phân hủy bởi apyrase. Và phản ứng tái diễn với 1 loại nucleotide khác. Nhược điểm : chiều dài đoạn đọc được 300-500 nucleotides so với 800-1000 (Sanger), phức tạp, thời gian dài 20