Bài giảng liệu pháp gen

GENE THERAPY

LIỆU PHÁP GEN (LPG)

 LPG là gì?

 LPG được dùng làm gì?

 Làm sao sử dụng LPG? Hay sử dụng LPG như thế nào?

 Việc ứng dụng LPG: thành tựu và thất bại?

 Thuận lợi và hạn chế của LPG?

 …

LIỆU PHÁP GEN (LPG)

 Sửa chữa gen bệnh

 Thay gen bệnh bằng gen lành

 Ức chế sự biểu hiện của gen bệnh

 Tiêu diệt tế bào (TB) bệnh

LPG - CHUYỂN GEN LÀNH VÀO MÔ BỆNH

Bệnh máu khó đông do thiếu/hư YTĐM số IX ở chó

BT: máu đông trong 8-10 phút

Bệnh: máu đông trong 50-60 phút

QT CG 1 giờ, Biểu hiện trong 15 tháng, Đông máu trong 20 phút

TS. Kenneth Brinkhous (ĐH North Carolina)

VLDT cần chuyển

Phương pháp

Chiến lược chuyển

2. Phương pháp CG

1. Chiến lược CG

3. VLDT cần chuyển

 Vector virus (VR)

 Trực tiếp: In vivo

 Gen lành

 Vector không VR

 Nhiều giai đoạn:

 Gen gây chết

 PP vật lí: vi tiêm, bắn

Ex vivo  in vivo

 Antisense

nucleic

gen

acid

Một bộ bao gồm:

TB nhận thường là TB sinh dưỡng chưa biệt hóa.

Gen

Promoter mạnh

Gen chọn lọc

Plasmid/ VR vector

CÁC CHIẾN LƯỢC CG

• In vivo

• Vector chuyển chứa các trình tự gen mục tiêu được đưa trực tiếp

vào bệnh nhân, và được thiết kế cho tế bào/mô đích

• Được kiểm soát như các sản phẩm sinh học/CNSH khác, theo

• Ex vivo

hướng dẫn của FDA

• Tế bào biến đổi di truyền bằng vector ex vivo và được đưa vào cơ

thể bệnh nhân

• Được kiểm soát như các tế bào ghép, theo hướng dẫn của FDA

CÁC CHIẾN LƯỢC CG

1. VLDT được truyền trực tiếp vào cơ thể

1. Đầu tiên, VLDT được chuyển vào tế

bệnh nhân;

bào được nuôi cấy in vitro

2. Khả năng kiểm soát thấp; ít thao tác;

2. Quá trình được kiểm soát; tế bào CG được chọn lọc và nuôi cấy tăng sinh; nhiều thao tác hơn

3. TB thường của tự thân BN; được

3. Chỉ dành cho những mô không phát triển in vitro; hoặc những tế bào nuôi in vitro không thể chuyển trở lại vào cơ thể

ghép trở lại vào cơ thể BN

Ex vivo In vivo

In vivo

CÁC PHƯƠNG PHÁP CG

1 Tiêm DNA trần vào khối u bằng syringe

-- DNA được phủ các hạt đạn vàng (bắn gen), không dùng trong trường hợp ung thư

2 Chuyển DNA bằng liposome

3 Các phương tiện sinh học (vector) như VR và VK VR được biến đổi DT sao cho không nhân lên khi ở bên trong cơ thể chủ và là phương tiện chuyển gen hiệu quả nhất hiện nay

Các vector chuyển gen

• Vector = tác nhân mang và chuyển vật liệu di truyền vào tế bào

• Vector có thể là

• viral (retroviral, lentiviral, adenoviral, …)

• non-viral (plasmid DNA, liposomes, …)

• Vector & và phương pháp chuyển

• Nâng cao sự biểu hiện gen phù hợp với nhu cầu

• Nâng cao hiệu quả chuyển gen

• Hướng tiếp cận mới

• Kĩ thuật “chỉnh sửa (editing)” gen Sangamo (zinc finger nucleases)

Tiêm DNA trần

LPG DNA trần

Chuyển vào trong cơ

Chuyển vào trong mạch  Gan và cơ

Dạng vòng ổn định hơn dạng plasmid không vòng

-- Theo thời gian, sự biểu hiện in vivo thấp dần

-- Rất rẻ

Vaccin DNA

LP miễn dịch ung thư

Diệt VR và VK (VC truyền thống thì tốt hơn khi có sẵn)

Chủ động

Bị động Làm tăng PUMD đã có trước đó đ/v UT

Khởi phát PUMD kháng lại KN khối u không nhận diện được

Ứng dụng vaccine DNA trần ở bệnh truyền nhiễm

Tuberculosis,

Lyme disease

Helicobacter pylori

HIV hepatitis B and C Influenza Papilloma Cytomegalovirus

Malaria

TB T nhận diện TB gan với KST sốt rét bên trong

Sản xuất IFN-gamma

IFN-gamma kích thích sự trình diện KN

www.malaria-vaccines.org.uk

Vaccin DNA

Thành phần MD quan trọng của KN sốt rét

Vài epitope có bản chất peptid Được nhận diện bởi TB T

protein có tên là thrombospondin related adhesion protein (TRAP).

Vaccin DNA mã hóa cho phần chèn có thể nhận diện miễn dịch

Bắn gen

Được sáng chế dành cho chuyển gen vào TB thực vật

Có thể ứng dụng cho TB ĐV hữu nhũ

DNA plasmid được dồn vào hạt vàng hay tungsten có kích thước 1-3 micron.

DNA hạt vàng trong da sau khi được bắn gen

Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy_DMD)

Liên kết NST X; 1/3500 trên TG

30% trường hợp có đột biến mới

Không có dystrophin, protein màng TB (xấp xỉ 0.01% protein cơ xương).

Chuyển minigen dystrophin ở chuột LDC

LPG

Không điều trị

Gen: 2.4 Mb, mRNA: 14 kb (lớn quá, không thể dùng vector) Kiểu hình Becker: chuyển không hoàn thiện trình tự

Chuyển gen dystrophin ở người

2003 Thử nghiệm phase 1

Chín BN trong ba nhóm:

Tiêm 1 liều thấp plasmid+dystrophin

Tiêm 1 liều cao plasmid+dystrophin

Xét nghiệm mô cơ

Tiêm 2 lần liều cao plasmid+dystrophin

Sự biểu hiện dystrophin 1 đến 10% ở các sợi cơ của nhóm 1 và 2, 100% ở nhóm 3

Không PUMD, không tác dụng phụ

Liposome

 Cải tiến LPG dùng DNA trần (plasmid

hay non-plasmid)

 Nâng cao tỉ lệ chuyển thành công

 Màng lipid  hiệu quả >>>: tránh thoái

biến DNA

Thuốc trị liệu

Cationic liposome

Đầu lipid tích điện +

Các giọt lipid tích điện (+) có thể tương tác với các DNA tích điện (-), bao phủ và chuyển DNA vào TB

Lipofectin, lipofectamine, lipofectase….

Liposome

Liposome nhanh chóng bị “xóa sổ” khỏi dòng máu và bị thu nạp bởi các macrophage ở gan

Trouble shooting

Các phối tử bề mặt của liposome làm giảm sự thoái biến (monosialoganglioside hay polyoxyethylene)

Liposome biến đổi

hydrophilic polyoxyethylene

Piedmont

Máu-gan

Da

Liposome biến đổi

Ruột - Đường uống

Immunoliposome – tác kích chủ động

 Kháng thể của myosin nội bào hướng liposome đến

vùng tim bị nhồi máu

 Kháng thể kháng các phân tử đặc hiệu khối u hướng

liposome đến vị trí khối u

Liposome – phương tiện LPG trong điều trị UT

Hiệu quả chuyển gen bằng Liposome

• Rẻ hơn dùng VR

• Không gây PUMD

• Đặc biệt phù hợp trong trường hợp chuyển vào mô phổi (bệnh xơ nang)

• Số lượng plasmid DNA cần nhiều hơn 100 – 1000 lần so với vector VR

Ω Tháng 1/1995: CFTR-liposome đưa vào cơ thể BN đường mũi Ω 12 BN, giảm nhẹ ở 20% BN Ω Hiệu quả tối đa vào ngày thứ 3, giảm nhanh ở ngày 7 Ω Không PUMD

Xơ nang (Cystic fibrosis_CF)

Bệnh DT gây chết ở trẻ sơ sinh (1/2000). Ít gặp ở người Châu Á và Châu Phi

Hư hỏng gen CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)

rối loạn dẫn truyền Cl- và Na+ Ở TB biểu mô ở nhiều cơ quan (tăng hấp thu Na+).

Tuyến mồ hôi (tiết nhiều muối) Phổi sx nhiều chất nhầy ( dễ nhiễm khuẩn, ho, tử vong) Tổn thương tụy (đái tháo đường)

Đường tiêu hóa (táo bón)

Xơ nang (Cystic fibrosis_CF)

CF

Bình thường

Phế nang

Pseudomonas aeruginosa >>  neutrophil >>  xơ hóa, tổn thương

Xơ nang (Cystic fibrosis_CF)

Tụy BT

CF

ᴥ Các enzyme tụy không thể giải phóng khỏi tuyến  tổn thương

ᴥ Giảm tiết insulin

ᴥ Giảm dung nạp đường  ĐTĐ

Gen CFTR (NST số 7)

27 exons, 1480 aa

ATP binding domain

CFTR

₪ Đột biến ở Delta F508

₪ 50% TH bệnh là đồng hợp tử

₪ 30% dị hợp tử

₪ Gấp cuộn không đúng, dạng nhạy cảm với protease  Bị thoái biến ngay khi vào Golgi

Vector virus

Retrovirus (RV) • Bộ gen RNA, tạo các bản sao DNA mạch đôi, có thể sát nhập vào bộ gen chủ • HIV, MoMuLV, Rous sarcoma virus

Adenovirus (AV)

VR mạch đôi DNA gây bệnh nhiễm khuẩn mắt, ruột, đường hô hấp ở người. Gây cảm lạnh

Adeno-associated virus

VR mạch đơn DNA có thể chèn VLDT của chúng vào vị trí chuyên biệt ở NST số 19

Herpes simplex virus

VR mạch đôi DNA nhiễm vào TB thần kinh

Chiến lược chung tạo vector virus

Retroviral vector

ɤ Hiệu quả xâm nhiễm cao;

là vector thường dùng để điều trị các bệnh phổ biến bằng LPG

ɤ Không thể xâm nhập vào màng nhân  chỉ xâm nhiễm khi TB đang phân chia  phù hợp cho LP điều trị UT

ɤ Gắn chèn vào BG  bền vững và

khả năng gây UT

Moloney murine leukaemia virus (Mo-MLV)

₰ Có thể nhiễm vào TB người và chuột; ₰ Chỉ nhân lên trong TB đóng gói; ₰ Vector không hoàn chỉnh không lây lan; ₰ Đoạn gen < 7.5 kb không đủ trong một số TH

LPG sử dụng RV vector trong điều trị lâm sàng

Suy giảm MD trầm trọng phối hợp Severe Combined Immunodoficiency (SCID): ADA-SCID và X-linked SCID

LPG sử dụng RV vector trong điều trị SCID

 Nhiễm khuẩn thường xuyên và điều trị KS không hiệu quả

 Không lớn, thường bị áp xe ở da và các cơ quan

 Nhược lympho bào (lymphopenia) (<200)

 Đột biến ADA (Adenosine deaminase): SCID liên kết NST 20: 25% trường hợp

 Đột biến thụ thể C-gamma của IL-7: SCID liên kết NST X



 Phân loại

70 nguyên nhân khác (không phải đơn gen)

 “Bubble”

 Ghép tủy

 LP thay thế enzyme PEG-ADA (ADAGEN): tác dụng tạm thời, đắt, thiếu

máu tán huyết, leukemia

 LPG

LPG sử dụng RV vector trong điều trị SCID-ADA

• Cuối 1970s: protein ADA được mô tả

1983: công bố trình tự gen ADA

•

1990: thử nghiệm LPG đầu tiên trên người sử dụng vector chuyển MoMLV được FDA chấp thuận

• Ashanti DeSilva, 4 tuổi

• Tế bào T được CG (MoMLV-ADA), tăng sinh (IL-2) và trưởng thành in vitro

• Điều trị lặp lại 6 – 12 tháng theo vòng đời của TB T

• Không rõ kết quả của LPG do điều trị phối hợp ADA-PEG

LPG sử dụng RV vector và TBG máu dây rốn trong điều trị SCID-ADA

Donald Kohn chẩn đoán 3 thai nhi ADA-SCID

Thu nhận máu dây rốn

Không lâu sau khi truyền TB máu dây rốn, 0.01 – 0.1% TB T ở nhũ nhi biểu hiện gen chuyển.

Khi giảm PEG-ADA, tỉ lệ TB T tăng lên 1 – 10%, gấp 100 – 1000 lần

LPG sử dụng RV vector trong điều trị X-linked SCID

Trầm trọng hơn SCID-ADA, vì không có TB B, T và NK

Thử nghiệm LPG thành công vào 2000;

8/10 BN bình phục

3.5 năm sau khi ghép TBG CG

- Không cần sống trong bong bóng khí

- Có số lượng TB T bình thường (cả CD4 và

CD8)

- Có phản ứng với miễn dịch trẻ nhỏ (uốn

ván, bạch hầu, bại liệt)

- Kháng thể sx ra đủ  không cần truyền

2/15 trường hợp mắc leukemia do gen trị liệu chèn vào gần vùng LMO2 proto-oncogene (LMO2: vai trò trong tạo mạch)

kháng thể định kì

Lentivirus

 Là RV có thể xâm nhiễm TB đang phân chia hoặc không đang phân chia vì chúng có thể đi qua màng nhân còn nguyên vẹn;

 Có thể nhiễm vào các tế bào không phân chia hoặc đã biệt hóa như TB TK, đại thực bào, Tb cơ, gan;

 Đại diện: HIV-1 (nhiễm TB Th) trong điều trị AIDS

ADENOVIRUS

• VR không có vỏ bao chứa DNA mạch đôi

thẳng, có thể chuyển gen >30 kb;

• Có thể nhiễm TB đang phân chia hoặc không

đang phân chia

• 12 sợi “anten” cho VR bám dính

• Là kí chủ thường xuyên với cơ thể người, đã được sử dụng làm vaccine, quen thuộc với hệ thống miễn dịch ở người

• Không gắn chèn vào BG chủ nhưng biểu hiện

ổn định khi TB không phân chia;

• Tính KN mạnh  gây ĐUMD mạnh

ADENOVIRUS

Jesse Gelsinger, 18 tuoåi (Pennsylvania, 1999) - Thieáu huït enzyme Ornithine transcarbamylase - cheát sau 4 ngaøy LPG - Coù theå do vector adenovirus gaây caùc phaûn öùng mieãn dòch traàm troïng

Ứng dụng LPG sử dụng ADENOVIRUS

OTC là enzyme chủ chốt trong chu trình biến dưỡng nitơ trong cơ thể

Gen mã hóa ornithine transcarbamylase (OTC) Chứng thiếu hụt OTC (liên kết NST X)

Thiếu OTC

Hyperammonemia

Ammonia là chất độc TK

Nôn mửa, hôn mê

Ứng dụng LPG sử dụng ADENOVIRUS

Jesse Gelsinger, 18 tuoåi (Pennsylvania, 1999) - Thieáu huït enzyme Ornithine transcarbamylase - cheát sau 4 ngaøy LPG

o Tỉ lệ 1/30.000 ở Mỹ

o Nặng hơn ở nam giới

o Độc tính

o Nồng độ cao ammonia

o Tái tổ hợp adenoviruxs với loại hoang

dại

Ứng dụng LPG sử dụng ADENOVIRUS

Chứng xơ vữa động mạch (Atherosclerosis): sự tạo mạch cục bộ

Mục tiêu: cải thiện dòng chảy ở chi hay tim thiếu máu bằng cách kích thích sự tạo mạch bổ sung

Tắt nghẽn

AdV chuyển VEGF-121 ở BN tắt nghẽn động mạch chi

Liều đơn Ad-VEGF tiêm vào 20 vùng cơ chi dưới

University of Michigan Health System

Moät soá nhöôïc ñieåm cuûa vector virus :

- Tính ñaëc hieäu teá baøo quaù

cao (nhaát laø caùc retrovirus)

- Kích thöôùc gene caàn ñöa

vaøo haïn cheá

- Söï gaén xen ngaãu nhieân

vaøo NST

- Taïo phaûn öùng mieãn dòch

khoâng mong muoán

Adeno-associated virus (AAV)

-- không kích thích viêm ở cơ thể chủ

-- không tạo kháng thể tự kháng nó

-- không xâm nhiễm TB không phân chia

-- chèn vào một điểm trên BG của chủ (NST 19 ở người)

LPG sử dụng AAV làm vector trong điều trị ĐTĐ ở chuột

Chuột mắc ĐTĐ do hóa chất hoặc DT

AAV

Intronless insulin gene

Glucose -sensitive promoter

Trình tự tin hiệu tiết

enhancer

Tiêm vào tĩnh mạch cửa gan

Kiểm soát đường huyết và duy trì đến 8 tháng

Gen tự sát – LPG ung thư

LPG tự sát

(113 TN ở Mỹ về LPMD UT)

54% TN là LPMD cho khối u ác tính

Chuyển gen ức chế khối u TP53

Gen tự sát – LPG ung thư

Gen tự sát Tiền thuốc Thuốc có hoạt tính

Viral thymidine kinase Ganciclovir Ganciclovir triphosphate

Cytosine deaminase 5-fluorocytosine 5-fluorouracil

Linamarase Amygdalin cyanide

nitroreductase CB 1954 nitrobenzamidine

cytotoxic drug selectively produced in the target cell.

Examples of suicide gene/prodrug combinations and the active Linamarase = beta-glucosidase, chuyển cơ chất cyanogenic glucoside, linamarin, thành glucose và cyanide Ion cyanide khuếch tán tự do xuyên màng tế bào.

GAÂY CHEÁT TEÁ BAØO BEÄNH

VÍ DUÏ VEÀ LIEÄU PHAÙP GENE TRONG UNG THÖ TUYEÁN GIAÙP

 dn-RET (dominant negative)- proto- oncogene vôùi “ñoät bieán theâm chöùc naêng” seõ baát hoaït oncoprotein bình thöôøng

 PTP (Protein Tyrosine Phosphatase) ñieàu hoøa bieåu hieän cuûa TNF (Tumor Necrosis Factor)

 Gadd45 kieåm tra chu trình teá baøo, söûa sai DNA, apoptosis

 HMGI(Y) (High Mobility Group) : Protein “nonhistone” trong nhaân ôû ÑV coù vuù coù tính linh ñoäng ñieän di cao, bieán ñoåi caáu truùc DNA vaø NSC laøm aûnh höôûng ñeán söï sao cheùp, phieân maõ, taùi toå hôïp,…, lieân quan ñeán söï hình thaønh khoái u vaø di caên

 ONYX-015 laø 1 adenovirus nhaân baûn trong teá baøo khoâng bieåu hieän p53 (protein söûa sai)

 NIS (Sodium Iodide Symporter) + hoùa trò 131I

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

LPG CHO TỪNG LOẠI BỆNH

• Bổ sung (Gene transplantation)

(dành cho BN bị mất gen) • Sửa chữa (Gene correction)

(sửa các đột biến chuyên biệt ở gen mục tiêu)

• Tăng cường (Gene augmentation)

(nâng cao sự biểu hiện gen quan tâm)

• Giết trúng đích (Targeted killing): chuyển gen hủy

diệt (tự sát) vào tế bào chuyên biệt

• Loại bỏ (Gene ablation) – ức chế sự biểu hiện của

gen mục tiêu

SÖÛA CHÖÕA SAI HOÛNG TREÂN GENE BEÄNH

• Thoâng qua taùi toå hôïp ñoàng daïng

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

Öu ñieåm : taùi laäp hoaøn toaøn tình traïng bình thöôøng Nhöôïc ñieåm : raát khoù thöïc hieän thaønh coâng

BOÅ SUNG GENE LAØNH THAY CHO GENE BEÄNH

Trong tröôøng hôïp gene beänh khoâng bieåu hieän, gene laønh ñöôïc ñöa vaøo teá baøo vaø bieåu hieän ñeå taùi laäp kieåu hình bình thöôøng

Öu ñieåm : deã thöïc hieän

Nhöôïc ñieåm :

Bieåu hieän cuûa gene khoâng ñöôïc ñieàu hoøa nhö trong ñieàu kieän bình thöôøng

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

Chæ söû duïng khi gene beänh laø laën

ÖÙC CHEÁ SÖÏ BIEÅU HIEÄN CUÛA GENE BEÄNH

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

Oligonucleotide ngaén lieân keát vôùi mRNA (maõ hoùa cho protein beänh)  öùc cheá söï dòch maõ cuûa mRNA ñoù

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

TRIPLEX FORMING OLIGONUCLEOTIDES (TFO)

TFOs lieân keát vôùi moät trình töï DNA maïch ñoâi thoâng qua lieân keát hydrogen Hoogsteen

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

RIBOZYME-SPLICEOSOME

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

Söûa chöõa ñoät bieán treân mRNA thoâng qua Ribozyme goàm 3 vuøng : maõ hoùa (coding domain), “caét noái trans” (trans splicing domain) vaø vuøng lieân keát vôùi pre-mRNA (binding domain)