CHƯƠNG 2. CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN
1. Phương pháp tách chiết DNA
2. Phương pháp điện di
3. Định lượng DNA, RNA
4. Đánh dấu nucleic acids
5. Các phương pháp lai phân tử
6. Phương pháp chuyển gene
7. Phương pháp PCR
8. Phương pháp cắt DNA
9. Phương pháp nối DNA
10. Phương pháp giải trình tự gen
1. Tách chiết DNA và RNA
3bước cơ bản cho tách chiết:
(1) Phá tế bào để giải phóng nucleic acid (phá tế bào
động vật, virus, thực vật,vi sinh vật,động vật
bằng cơ học,vật lý, enzyme hoặc lysis tế bào).
(2)Phân tách nucleic acids từ các thành phần khác
tế bào (enzyme ribonuclease, loại bỏ tạp chất…).
(3) Thu hồi nucleic acid (bằng ly tâm).
Các bước tách chiết DNA cơ bản
Phá màng tế bào
Loại bỏ protein,
màng tế bào và tạp chất
Thu DNA tổng số
Cơ học, hóa
học, vật lý
Ly tâm,
phân
tách
Ly tâm thu tủa
Loại bỏ RNA RNase
Thành phần của các đệm tách chiết
1. Hoà tan màng tế bào:chất tẩy, các muối chaotropic,
CTAB
2. Bất hoạt DNase và Rnase: chất tẩy, các chelator kim
loại, các chất khử
3. Hỗ trợ loại bỏ các hợp chất hữu cơ tồn dư:Muối,
CTAB, PVP
Vai trò một số loại hoá chất sử dụng trong tách chiết DNA
• Đệm phân giải tế bào chứa EDTA tác dụng phá vỡ màng
tế bào nhưng không ảnh hưởng đến nhân. EDTA là 1
hợp chất chelating với ion có hoá trị II như Mg2+.Mg2+ là
cofactor của Dnase nuclease →việc Mg2+ bị “bắt”bởi
EDTA sẽ làm mất hoạt tính nuclease
• Nhân sẽ được hoà trong đệm có chứa Sodium Dodecyl
Sulfate (SDS) và proteinase K. Đệm này giúp hoà tan
màng nhân và phân giải protein. Proteinase K loại bỏ hầu
hết các protein khác nhau do hoạt tính thuỷ phân