TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC VOÕ TRÖÔØNG TOAÛN
KHOA Y

BÀI GIẢNG MÔN HỌC
THỰC HÀNH VI SINH
Giảng viên biên soạn:
NGUYỄN THỊ THANH TUYỀN
Đơn vị: TT TH Y DƯỢC
Hậu Giang – Năm 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC VOÕ TRÖÔØNG TOAÛN
BÀI GIẢNG MÔN HỌC
Tên môn học: Thực hành Vi sinh
(Tên tiếng Anh: ……………………………….)
Trình độ: Đại học
Số đơn vị học trình:
Giờ lý thuyết:
Giờ thực hành:
Thông tin Giảng viên:
Tên Giảng viên: Nguyễn Thị Thanh Tuyền
Đơn vị:
Điện thoại:
E-mail: ntttuyen@vttu.edu.vn
1. Đề cương môn học
Tên bài học
Phần thực hành
LT
TH
1
Một số dụng cụ cở bản trong phòng thí nghiệm vi sinh.
Phương pháp khảo sát vi sinh vật. Kỹ thuật soi tươi.
4
2
Phương pháp nhuộm Gram.
4
3
Phương pháp nhuộm vi khuẩn kháng cồn kháng acid
( Phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen)
4
4
Phản ứng huyết thanh học trong chẩn đoán Kháng nguyên,
Kháng thể.
4
5
Một số nguyên tắc vô khuẩn trong thực hành vi sinh.
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
4
6
Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn.
4
7
Kỹ thuật kháng sinh đồ.
4
Tổng
2. Nội dung bài giảng chi tiết
1
Bài 1. MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI
SINH
PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT VI SINH VẬT. KỸ THUẬT SOI TƯƠI
MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Biết cách sử dụng một số dụng cụ thường gặp trong phòng thí nghiệm vi sinh: kim
cấy, vòng cấy, đèn cồn, ống nghiệm, hộp petri.
2. Biết được cấu tạo, cách sử dụng kính hiển vi quang học và cách bảo quản kính sau
khi sử dụng.
3. Thực hiện và quan sát, mô tả kết quả mẫu soi tươi. Làm quen với tiêu bản nhuộm
soi.
I. ĐÈN BUNSEN (HAY ĐÈN CỒN):
Ngọn lửa đèn Bunsen (hay đèn cồn) có 2 phần:
- Phần giữa: ít nóng, nhiệt độ khoảng 4000C. Nhiệt độ tăng dần cho đến phần
ngoài.
- Phần ngoài: nhiệt độ khoảng 17000C.
II. KIM CẤY VÀ VÒNG CẤY:
Kim cấy và vòng cấy làm bằng sợi dây kim khí chóng nóng và chóng nguội (Platin
hay Chrome). Phải nhớ đốt kim cấy và vòng cấy trước và sau khi cấy vi trùng. Phải để
kim đứng thẳng trên ngọn lửa đèn cồn để cho đầu kim ở vào phần nguội cảu đèn, rồi
mới kéo dần ra phần nóng của ngọn lửa, phải đốt cho cả kim cấy và vòng cấy nóng đỏ.
Như thế các vi khuẩn sẽ không bị bắn ra xung quanh và sẽ bị đố cháy hết.
III. ỐNG NGHIỆM:
Phải hơ nóng miệng ống nghiệm sau khi mở và trước khi đậy nút. Nút phải cặp ở ngón
tay út vào lòng bàn tay, tránh đụng vào bất cứ vật gì. Khi mở nút ống nghiệm luôn
luôn phải nghiêng ống nghiệm một góc 450 để tránh nhiễm khuẩn bên ngoài vào môi
trường. Việc lấy vi khuẩn từ các môi trường phải luôn luôn thực hiện ở gần ngọn đèn
cồn.
IV. HỘP PETRI:
Các môi trường cấy đựng trong hộp petri. Khi cấy chỉ hé mở, không được mở hết cả
hộp để tránh lây nhiễm.
V. KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC:
1. Cấu tạo kính hiển vi quang học:
Hệ thống giá đỡ:
- Bệ kính: tiếp xúc với mặt bàn.
- Ống kính: trụ tròn rỗng lắp vào trụ kính hiển vi.
- Thân kính: giữa bệ kính và ống kính.
- Khai quay: lắp ở đầu dưới ống kính, có lỗ đề lắp vật kính.
- Bàn kẹp tiêu bản.
Hệ thống phóng đại:
- Thị kính: loại 1 ống, loại 2 ống, bản chất là thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn.
Phần lớn kính hiển vi quang học dùng trong phòng thực tập vi sinh có thị kính
có độ phóng đại 10X.
- Vật kính: là bộ phận quang học chủ yếu, gồm có nhiều thấu kính ghép lại, lắp
ở khai quay. Vật kính có những bội số phóng đại khác nhau và có ghi rõ bội số
(4X, 10X, 40X, 100X). Khi dùng vật kính phóng đại bội số thấp để xem một
vật gì thì không cần phải cho dầu vào tiêu bản, nên người ta gọi vật kính đó là
vật kính khô. Khi dùng vật kính có bội số cao thì cho một giọt dầu lên tiêu bản
và vật kính đó gọi là vật kính dầu.
Hệ thống chiếu sáng:
2
- Nguồn sáng: bóng đèn hoặc gương phản chiếu, nằm trên bệ kính. Gương phản
chiếu gồm một mặt lồi và một mặt lõm có thể lộn đi lộn lại, dùng để lấy ánh
sáng.
- Tụ quang: là một loại thấu kính lồi lắp ở dưới giá để tiêu bản, có thể đưa lên
đưa xuống, dùng để tập trung ánh sáng vào tiêu bản.
Hệ thống điều chỉnh:
- Ốc đại cấp (ốc lớn) và ốc vi cấp (ốc nhỏ): để điều chỉnh tiêu cự.
- Ốc điều chỉnh bàn đặt tiêu bản.
- Ốc di chuyển tụ quang.
- Ốc đóng mở khe chắn sáng.
2. Cách sử dụng kính hiển vi quang học:
- Nhỏ giọt dầu lên lam (nếu cần).
- Đặt lam lên giá để tiêu bản.
- Di chuyển lam vào đúng vị trí.
- Chỉnh vật kính vào nấc.
- Lấy ánh sáng: bật đèn hoặc xoay gương phản chiếu để lấy ánh sáng.
- Điều chỉnh để có ánh sáng thích hợp. Để quan sát vi khuẩn trên một mẫu vật đã
nhuộm, ta cần có ánh sáng tối đa. Muốn vậy, ta cần:
+ Nâng tụ quang cực đại.
+ Mở hết khe chắn sáng.
- Xoay ốc đại cấp đến khi tìm thấy vi trường, di chuyển lam để tìm vùng phết
bệnh phẩm.
- Chuyển sang vật kính dầu, nhẹ nhàng xoay ốc đại cấp cho vật kính gần sát tiêu
bản đã được nhỏ dầu. Mắt không nhìn vào thị kính mà nhìn ngang từ bên ngoài
vào khoảng cách vật kính và tiêu bản để tránh vật kính làm vỡ lam.
- Nhìn vào thị kính, xoay ốc đại cấp cho tới khi thấy được vi trường thì dừng lại.
- Chuyển sang xoay ốc vi cấp cho tới khi hình ảnh hoàn toàn rõ nét.
3. Giữ gìn và bảo quản kính:
Cuối buổi thực tập phải lau ngay vật kính dầu.
- Hạ giá để tiêu bản xuống để tách vật kính ra khỏi tiêu bản.
- Lấy tiêu bản ra khỏi giá.
- Xoay vật kính tới vị trí dễ lau nhất.
- Dùng giấy thấm lau kính hiển vi lau thị kính trước.
- Dùng giấy thấm tẩm aceton để lau vật kính sau. Lau nhẹ nhàng theo hình xoắn
ốc.
- Xoay vật kính 10X vào nấc, hạ giá để tiêu bản xuống tối đa ( vị trí nghỉ).
- Lau sạch bụi ở phần giá để tiêu bản và bệ kính.
- Cầm kính hiển vi 2 bằng 2 tay: một tay cầm thân kính, một tay đỡ đến kính, cất
kính vào đúng vị trí trong phòng thí nghiệm.
VI. PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT VI SINH VẬT. KỸ THUẬT SOI TƯƠI:
Có rất nhiều phương pháp quan sát vi sinh vật. Trong đó, soi tươi là phương pháp đơn
giản nhất. Soi tươi giúp quan sát được hình dạng, màu sắc, tính chất di động của vi sinh
vật có trong mẫu. Thường chỉ áp dụng cho những nhóm vi sinh vật có kích thước tương
đối lớn.
Kỹ thuật soi tươi:
Sử dụng vật kính: 4x, 10x.
Hạ tụ quang cực đại.
Đóng khe chắn sáng.
Quan sát tiêu bản nhuộm soi: quan sát hình thể, tính chất bắt màu, cách sắp xếp của vi
khuẩn:
Sử dụng vật kính dầu 100x.
3
Nâng tụ quang cực đại.
Mở hết chắn sáng.
Bài 2. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM
MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Nêu được đặc điểm của tế bào vi khuẩn có liên quan đến phương pháp nhuộm
Gram.
2. Biết cách làm một phết vi khuẩn để nhuộm Gram và các bước của phương pháp
nhuộm Gram.
3. Mô tả một lame nhuộm Gram trên kính hiển vi với vật kính dầu.
I. CHUẨN BỊ MỘT PHẾT VI KHUẨN ĐỂ NHUỘM
1. Chuẩn bị lame:
- Tấm lame dùng để làm phết vi khuẩn phải được rửa sạch và lau khô.
- Hơ qua ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Tránh chạm các ngón tay vào lame.
2. Cách gắn vi khuẩn vào tấm lame:
- Dùng bút chì sáp vẽ một vòng tròn đường kính 2 cm trên lame.
- Lấy một vòng cấy vi khuẩn từ môi trường lỏng và trải mỏng trên diện tích vòng tròn
đã vẽ. Nếu vi khuẩn từ môi trường đặc (hộp thạch petri), thì ta phải đặt một vòng cấy
nước lên lame trước khi đặt vi khuẩn vào.
- Để cho lame khô tự nhiên, sau đó gắn chặt vi khuẩn lên lame bằng cách hơ lame trên
ngọn lửa đèn cồn.
II. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM:
Đây là phương pháp nhuộm cơ bản trong vi khuẩn học. Phương pháp nhuộm Gram
còn được gọi là phương pháp nhuộm kép vì trong phương pháp nhuộm
này ta sử dụng hai loại phẩm nhuộm tương phản nhau về màu sắc. Đó là tím Gentian
và hồng Safranin.
1. Nguyên tắc:
Phương pháp nhuộm căn cứ vào nguyên tắc: “chất rượu (alcool) sẽ tẩy được màu
của hợp chất “tím Gentian – iod” của vi khuẩn Gram âm.
Đặc điểm cấu trúc của tế bào vi khuẩn có liên quan đến phương pháp nhuộm
Gram:
Vi khuẩn chia làm 2 nhóm: Gram âm hoặc Gram dương tùy theo sự đáp ứng của vi
khuẩn đối với phương pháp nhuộm Gram (tên của nhà phát minh ra phương pháp
nhuộm vi khuẩn). Sự khác biệt giữa vi trùng Gram âm và Gram dương tùy thuộc
vào sự khác biệt về thành phần hóa học trong sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn.
Trong tế bào vi khuẩn Gram dương có 40 lớp peptidoglycan, chiếm đến 50% vật
liệu cấu tạo vách, còn vi khuẩn Gram âm chỉ có 1 hoặc 2 lớp peptidoglycan, chiếm
từ 5 – 10% vật liệu cấu tạo của vách.
2. Dụng cụ:
- Lamen sạch.
- Vòng cấy.
- Bộ thuốc nhuộm gồm:
+ Tím Gentian ( Crystal violet).
+ Gram’s iodine (dung dịch Lugol).
+ Cồn 950 (tẩy màu).
+ Hồng Safranin
- Bút chì sáp.
- Đèn cồn.