PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ
NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM
TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID
GEN 16S-ARN RIBOSOM
Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh,Lê Thanh
Hoà, Nguyễn Ngọc Dũng
Viện Công nghệ Sinh học.
Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở Việt
Nam. Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vững
sinh thái ở Việt nam đã được thiết lập. Để góp phần thực
hiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồng
bằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong những
năm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000). Một trong
những nhóm vi khuẩn hữu ích cho cây lúa cần được khai
thác là vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang bởi chúng
được coi là tác nhân sinh học tiềm năng trong phòng chống
vi nấm gây bệnh cây trồng (O,Sullivan và cộng sự, 1992,
Berg và cộng sự, 2000). Các chủng pseudomonad sinh
huỳnh quang vùng rễ cây lúa đã được phân lập và chọn lọc
theo khả năng đối kháng Fusarium oxysporum, tác nhân
gây bệnh khô vằn cây lúa (Nguyễn Thị Tuyết Nhung và
cộng sự, đang in).
Do có những đặc điểm riêng hình thành trong trong suốt
qúa trình tiến hoá nên các gen sao mã các axit ARN
ribosom (ARNr) ở vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt các gen
16S- và 23 S-ARNr, được sử dụng như một công cụ trong
việc phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các
chủng vi khuẩn ( Woese, 1987). Theo Ludwig và Schleifer
( 2000) đã có tới hơn 16000 gen 16S-ARNr từ các chủng vi
khuẩn đã được xác định trình tự nucleotid.
Trong bài báo này, vị trí phân loại của chủng Ps7-1 sẽ được
trình bày trên cơ sở phân tích trình tự nucleotid gen 16S-
ARN ribosom (16S-ARNr).
I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Vi sinh vật:
Chủng phân lập Ps7-1 có nguồn gốc từ đất bám rễ cây lúa ở
Kim Chung, Đông Anh, Hà Nội và cho khả năng đối kháng
F. oxysporium cao trong điều kiện in vitro (Nguyễn Thị
Tuyết Nhung và cộng sự, đang in) và chủng E. coli DH đã
được sử dụng.
2. Các phương pháp phân loại:
a. Phương pháp phân loại theo kiểu hình:
Phương pháp phân loại vi khuẩn được chuẩn hoá API
20NE (BioMerieux Marcy, Pháp) đã được sử dụng. Theo
nhà cung cấp, hệ thống API 20NE chỉ dùng để phân loại
các nhóm vi khuẩn hình que, gram âm, không thuộc Họ
Enterobacteracae. Ngoài các đặc tính theo API 20NE, các
đặc điểm kỵ khí không bắt buộc và kháng tetraxyclin đã
được xác định. Đặc điểm kỵ khí không bắt buộc được tiến
hành theo phương pháp cấy thẳng đứng vào môi trường LB
rắn có chiều cao 10 cm trong ống nghiệm; mẫu được ủ ở 30oC và đọc kết quả sinh trưởng sau 24 và 48 giờ ủ. Tính
mẫn cảm đối với tetraxyclin (30g/ml) được tiến hành theo
phương pháp Krieg và Doebereiner (1984). Theo đó, tế bào
Ps7-1 nuôi qua đêm được ria trên môi trường LB rắn, sau
đó đặt đĩa giấy ( : 5 mm) thấm đậm dung dịch tetraxyclin
lên trên. Chủng E. coli DH5 được sử dụng làm đối chứng.
Quan sát sinh trưởng của vi khuẩn xung quanh đĩa giấy
thấm sau 24 giờ ủ.
b. Phương pháp phân loại theo kiểu gen:
-Thu ADN tổng số:
ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp Masterson
và cộng sự (1985).
-Thu nhận gen 16S-ARNr:
Gen 16S-ARNr được thu nhận bằng phản ứng nhân bản gen
(PCR) với cặp mồi có trình tự như sau. Mồi thuận chiều
Prf: 5'-GAGTTTGATCATGGCTAA-3', tương ứng với các
vị trí nucleotid 7-26 của gen 16S-ARNr từ E. coli; mồi
nghịch chiều Prr: 5'- AGGAGGTGATCCAGCC-3', tương
ứng với các vị trí 1540-1524 từ E. coli, do Genset-Oligos
Singapore, cung cấp. Hỗn hợp phản ứng nhân bản gen có
thể tích 25 l với thành phần: 16,7 l nước sạch ion, 2,5 l
đệm Taq(10x), 2,5 l dung dịch dNTP (10mM), 1,0 l dịch
mồi Prf (10mM), 1,0 l dịch mồi Prr (10mM), 1,0 l dịch
ADN khuôn và 0,3 l Taq Polymerase. Phản ứng được
thực hiện với chu trình nhiệt như sau: Giai đoạn đầu, ADN được biến tính ở 95oC trong 1 phút 30 giây, tiếp tục biến tính ở 94oC trong 1 phút, kế tiếp mồi được gắn ở nhiệt độ 52oC và phản ứng kéo dài chuỗi ở 72oC trong 1 phút 20
giây. Giai đoạn chính được lặp lại 30 lần chu kỳ nhiệt cơ
bản giống ở giai đoạn đầu, chỉ khác ở chỗ ADN được biến tính một lần ngay ở nhiệt độ 94oC trong 1 phút, tiếp sau pha cuối cùng phản ứng kéo dài chuỗi được duy trì ở 72oC trong 10 phút và sản phẩm được bảo quản ở 4oC.
Kết qủa phản ứng được kiểm tra bằng điện di agarose
0,8%. Sản phẩm nhân bản gen được gắn vào vectơ pCR2.1
theo chỉ dẫn của nhà cung cấp TA Cloning Kit, Invitrogen.
Vectơ pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR được chuyển nạp
vào dòng tế bào INVaF’ và chọn lọc khuẩn lạc theo phương
pháp kháng sinh và chỉ thị màu (SAMBROOK và
RUSSELL, 2001). ADN plasmid tái tổ hợp được tách chiết
với bộ hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit
(QIAGEN Inc.). Độ dài sản phẩm dòng hoá được kiểm tra
trên thạch agarose 0.8%, sau khi cắt ADN của plasmid tái
tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI.
3. Giải trình trình tự chuỗi nucleotid và xử lý số liệu:
Chuỗi ADN được giải trình tự trên máy giải trình tự động
ABI 377 PRISM (Perkin- Elmer) từ sản phẩm dòng hoá là
ADN của plasmid tái tổ hợp đã tiếp nhận đoạn gen 16S
ARNr. Mồi xuôi M13F (5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’)
và mồi ngược M13R (5’CAGGAAACAGCTATGAC3’)
dùng trong giải trình tự là các chuỗi cố định của vectơ và
nằm gần hai đầu biên của ADN tái tổ hợp cần giải trình.
Trong quá trình giải trình, chúng tôi thiết kế thêm một mồi
khác ký hiệu là Seq16SF
(5’CAGTGGGGAATATTGGACAAT 3') nằm cách đầu 5’
của đoạn gen 16S ARNr nghiên cứu là khoảng 300-320
nucleotid. Giải trình được thực hiện nhiều lần với số lượng
nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm thu được kết quả chính xác.
Xử lý chuỗi nucleotid bằng chương trình SeqEd1.0.3; sắp
xếp, đối chiếu trình tự tương ứng của đoạn gen bằng hệ
chương trình máy tính AsemblyLIGN 1.9; MacVector 6.5.3
(Oxford Molecular Inc.) và chương trình GENDOC 2.5
(Karl Nicholas, 1997). Giám định các chủng được thực
hiện bằng phương pháp truy cập Ngân hàng Gen thông qua
chương trình BLASTn có tại
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
4. Chọn chuỗi so sánh:
Các chuỗi nucleotid 16S ARNr của một số chủng có trình
tự tương ứng từ Pseudomonas spp. tại Ngân hàng Gen được
thu nhận bằng cách truy cập Ngân hàng Gen thông qua số
thư mục ngân hàng và được sử dụng để so sánh đối chiếu
với trình tự nucleotid từ chủng Ps7-1 (Bảng 1).
Bảng 1: Các chủng Pseudomonas spp. được dùng để so
sánh
5. Địa điểm tiến hành nghiên cứu:
Công việc tách chiết ADN tổng số, PCR, dòng hoá sản
phẩm và một phần phân tích số liệu được thực hiện tại
phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất và Phòng máy, Viện Công
nghệ Sinh học (Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công
nghệ Quốc gia, Việt Nam).
Công việc giải trình trình tự và xử lý số liệu giám định
phân tử được tiến hành tại Viện nghiên cứu Y học
Queensland (Australia).
II. KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN
1. Phân loại theo kiểu hình:
Như đã nêu, hệ thống phân loại vi khuẩn được chuẩn
hóa API 20NE là tập hợp của 21 phản ứng sinh lý sinh hoá
dùng để xác định vi khuẩn hình que, gram âm, không có
nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt, không thuộc Họ
Enterobacteracae. Kết qủa phân loại chủng Ps7-1 theo hệ
thống API 20NE cho thấy, đối với nhóm 8 phản ứng cơ
bản, chủng này cho kết qủa âm tính với khử nitrat, tạo
indol, tổng hợp urease, thủy phân esculin và tổng hợp -
galactosidase; và cho 3 kết qủa dương tính là lên men
glucose, thủy phân gelatin và tổng hợp arginin dihydrolase.
Trong tổng số 12 hợp chất cácbon đã cho, chủng Ps7-1
không có khả năng sử dụng arabinose, maltose,, malat,
citrat và phenol-axetat. Với những kết qủa như vậy, chủng
Ps7-1 được xác định bởi mã số 4156534. Đối chiếu Bảng
chỉ số Analytical Profile Index, 5th edition, BioMerieux
S.A, 1992, mã số 4156534 không tồn tại. Tuy vậy, căn cứ
vào các chứ số đầu tiên của mã số có trong bản chỉ dẫn,
chủng Ps7-1 có thể được xếp vào vị trí phân loại thuộc
giống Chromobacterium bởi mã số của các chủng có chữ
số ban đầu từ 4150 tới 4156 đều được xếp vào loài Ch.
violaceum. Theo Sneath (1984), một trong những đặc điểm
cơ bản của giống Chromobacterium là kỵ khí không bắt
buộc và mẫn cảm với tetraxyclin (30g/ml. Kết qủa xác
định những đặc tính này đối với chủng Ps7-1 cho thấy,
chủng này là hiếu khí bắt buộc và có khả năng kháng
tetraxyclin ở nồng độ đã nêu. Theo Norberto và Palleroni
(1984), đây là những đặc tính cơ bản của vi khuẩn Chi
Pseudomonas. Ngoài ra, như đã nêu, chủng Ps7-1 được
phân lập trên môi trường S1, một môi trường thể hiện tính
chọn lọc cao đối với vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh
quang (Gould và cộng sự, 1985). Chính vì vậy, đến đây có
thể tạm thời kết luận, chủng Ps7-1 khó có thể là một chủng
Chromobacterium.
2. Phân loại theo kiểu gen:
Gen 16S-ARNr từ chủng Ps7-1 đã được thu nhận bằng
phản ứng nhân bản gen PCR; trình tự của nó cũng đã được
xác định và đăng ký trong ngân hàng gen quốc tế với số thư
mục AF521651. Một phần của kết qủa giám định chủng
Ps7-1 bằng phương pháp truy cập Ngân hàng Gen thông
qua chương trình BLASTn được trình bày trong bảng 2.
Bảng 2: Trích đoạn kết qủa giám định trình tự gen 16S-
rRNA từ chủng Ps7-1
Căn cứ vào các kết qủa giám định nhận được từ ngân hàng
gen có thể khảng định rằng chủng Ps7-1 là một chủng
thuộc Chi Pseudomonas, bởi sự so sánh chuỗi trình tự
nucleotid của gen 16S-rARN từ chủng này với trình tự từ
các chủng vi khuẩn có trong ngân hàng gen cho giá trị tin
cậy cao nhất thuộc về các chủng của Chi Pseudomonas. Để
làm sáng tỏ hơn về vị trí phân loại của chủng Ps7-1, trình
tự nucleotid một đoạn gen 16S-ARN dài 648 base từ chủng
này đã được so sánh với trình tự từ một số chủng thuộc các
loài Pseudomonas khác nhau (xem Bảng 1) và kết qủa
được trình bày ở Hình 1. Theo đó, trình tự nucleotid của
phân đoạn gen 16S-ARNr từ chủng Ps 7-1 hoàn toàn đồng
nhất (648/648) với các chủng thuộc loài P. fluorescens, đạt
tỷ lệ 100%. Sai khác nucleotid giữa các loài Pseudomonas
spp. đã nêu với chủng Ps7-1 là 28/648, đạt tỷ lệ 4,3%. Đó
là các thay thế TC (vị trí 14; 58; 65; 84 và 450), CT
(vị trí 15; 77; 315 và 496), GA (vị trí 25; 57; 331; 335;
460; 505; 509 và 605), AG (vị trí 72; 78 và 320), GC
(vị trí 317), AT (vị trí 332), TGC (vị trí 333), GT
(vị trí 469), AGT (vị trí 507) và AG (vị trí 508).
Với kết qủa như vậy cho phép kết luận rằng chủng Ps7-1
thuộc loài P. fluorescenss.
Hình 1: So sánh trình tự nucleotid của một đoạn gen
ribôxom 16S - ARNr của chủng Ps7-1 với các loài
Pseudomonas đã được biết. Ghi chú: dấu chấm (.) biểu thị
sự giống nhau của trình tự nucleotid của các loài; sự sai
khác về nucleotid được thể hiện bằng chính các chữ cái ký
hiệu của chúng; PluoATCC : P. fluorescens chủng ATCC
17386; Pfluor : P. fluorescens chủng CHAO; Pchlor: P.
chlororaphis chủng DSM50083T; Pcost: P. costantinii
chủng CFBP 5705; Pficu: P. ficuserectae chủng JCM
2400T; Pman: P. mandelii chủng CIP 105273; Pmeli: P.
meliae MAFF 301463T; Psyr+gly: P. syringae pv. glycinea
chủng MAFF 302260; Psyr+pha: P. syringae pv.
phaseolicola MAFF 302282.
Việc xác định một chủng vi khuẩn dựa trên hệ thống API
20NE và phân tích trình tự gen 16S-ARNr cho kết qủa
phân loại khác nhau cũng đã được đề cập trong báo cáo
khoa học, ví dụ như chủng QC14-3-8 được xác định thuộc
loài P. aeruginosa (91,8%) theo hệ thống API 20NE, nhưng
theo phương pháp phân tích gen 16S-ARNr thì chủng này
thuộc loài P. putida (99%) (Lottmann và cộng sự , 2000).
Như vậy, ở đây sự khác nhau chỉ thể hiện ở mức độ loài,
không xẩy ra ở định loại chi. Nhưng, như đã nêu, trong
trường hợp phân loại chủng Ps7-1 theo hệ thống API 20NE
cho kết qủa cách biệt khá lớn, nếu không nói hoàn toàn
khác, so với phương pháp phân loại tự nhiên dựa vào trình
tự chuỗi nucleotid của gen 16S-ARNr, mặc dù theo nhà
cung cấp dịch vụ API 20NE, các chủng thuộc Chi
Pseudomonas là một trong nhũng đối tượng phù hợp của hệ
thống xác định được chuẩn hoá này.
Tóm lại, cùng với những đặc tính phân lập có chọn lọc,
hiếu khí bắt buộc và kháng tetraxyclin, kết quả phân tích
trình tự chuỗi nucleotid của gen 16S-ARNr cho thấy chủng
Ps7-1 là một chủng Pseudomonas, chứ không thuộc chi
Chromobacterium và có độ tương đồng cao nhất, 100%,
với loài P. fluorescens.
Công trình này được tài trợ bởi Viện Công nghệ Sinh học,
TTKHTN&CNQG và hỗ trợ bởi Hội đồng Khoa học Tự
nhiên, Bộ Khoa học Công nghệ & Môi trường, tài khóa
2002.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Anzai,Y., Kim,H., Park,J.Y., Wakabayashi,H. and
Oyaizu,H. (2000). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50,
1563-1589..
2. Berg, G., Kurze, S., Buchner, A., Wellington, E.M. and
Smalla, K., 2000. Successful strategy for the selection of
new strawberry-associated rhizobacteria antagonistic to
Verticillum wilt. Can. J. Microbil., 46, p. 1128-1137.
3. Galdzicka, M., Plassmeyer,M.L., Blaine,L.D.,
Pienta,P.A. and Gillevet, P.M.(Chưa công bố).
4. Gould, W.D., Hagedorn, C., Bardinelli, T.R. and R.M.
Zablotowicz, 1985. New selective media for Enummeration
and recovery of fluorescent Pseudomonads from Various
Habitats. Appl. Env. Microbiol., 49, p. 28-32.
5. Krieg, N.R. and Doebereiner,J., 1984. Genus
Azospirillum. In: Krieg, N.R.,& Holt, J.G. (eds): Bergey, s
Manual of Systematic Bacteriology. The Williams and
Wilkin Co., Baltimore.
6. Lottmann, J., Heuer, H., Vries, J., Mahn, A., Duering,
K., Wackernagel, W., Smalla, K., Berg, G., 2000.
Establishment of introduced antagonistic bacteria in the
rhizosphere of transgewnic potatoes and their effect on the
bacterial community. EFMS Microbiol., Ecol., 33, 41-49.
7. Ludwig, W. and Schleifer, K.H., 2000. Phylogeny of
Bacteria beyond the 16S-rRNA Standerd. Vermicon.
http:w.w.w.
ermicon.de/english/news/Science/khs99111.htm
8. Masterson, R.V., Prakash, R.K. and Arthely, A.G., 1985.
Conservation of symbiotic nitrogen fixation gene sequences
in Rhizobium japonicum and Bradyrhizobium japonicum.
J. Bacteriol., 163, 2-25.
9. Moore, E.R.B., Mau,M., Arnscheidt,A., Boettger,E.C.,
Hutson, R.A., Collins,M.D., Van de Peer,Y., De
Wachter,R. and Timmis,K.N.(1996). Syst. Appl. Microbiol.
19, 478-492.
10. Munsch, P., Alatossava,T., Marttinen,N., Meyer,J.-M.,
Christen,R. and Gardan,L. (2002). Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. đang in.
11. Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh, Vũ Thanh,
2000. Vi khuẩn cố định nitơ vi hiếu khí khu trú trong rễ lúa
ở một số địa điểm thuộc đồng bằng sông Hồng. Tuyển tập
.Những vấn đề Nghiên cứu cơ bản trong sinh học. Hội Nghị
Sinh học quốc gia, Hà Nội, Nhà XB Đại học quốc gia
Hà Nội.
12. Norberto, J. and Palleroni, 1984. Genus Pseudomonas.
In: Krieg, N.R. & Holt, J.G. (eds):
Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology. The
Williams and Wilkin, Co., Baltimore.
13. O.Sullivan, D.J., O.Gara, F., 1992. Traits of fluorescent
Pseudomonas spp. involved in suppression of plant root
pathogens. Microbiol. Rev., 56, 662-672
14. Ramette, A., Moenne-Loccoz,Y. and Defa go, G.
(2001). Mol. Plant Microbe Interact. 14 (5), 639-652
15. Sawada, H. (1997). Nộp trực tiếp vào Ngân hàng gen
16. Verhille,S., Baida,N., Dabboussi,F., Izard,D. and
Leclerc,H. (1999). Syst. Appl. Microbiol. 22, 45-58
17. Woese, C.R., 1987. Bacterial evolution. Microbiol.
Rev., 51, 221-271
SUMMARY
Taxonomical Position of the Isolate Ps7-1 capable of
Antagonism against Fusarium oxysporum based on the
Analysis of the 16S-rRNA gene nucleotide Sequence
Nguyen Thi Tuyet Nhung et al
Institute of Biotechnology
To establishing the taxonomical position of the isolate
Ps7-1, the different methods have been used. For Ps7-1,
with the API 20NE system there was the code number
4156534 which does not be present in the catalog,
nevertheles with a such code number it also could be
thought that this strain may be belong to the groupe
Chromobacterium. With the method of the 16S-rRNA gene
analysis the isolate Ps7-1 is a Pseudomonas strain and
possesses the highst homology (100%) with the P.
fluorescens. Additionally, the isolate Ps7-1 is a strictly
aerobic one and resistent to tetracyclin those are the main
characteristics of genus Pseudomonas. With such results it
may be conclused that the Ps7-1 strain belongs to P.
fluorescens and can not be a Chromobacterium.
Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Trương Nam
Hải
