Báo cáo tổng kết đề tài NCKH cấp trường: Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM KHOA SINH HỌC 

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG

THU NHẬN TRỨNG BÒ, HEO ĐỂ CẢI THIỆN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TRỨNG TRONG ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM Mã số: CS.2008.19.28.

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:

ThS. NGUYỄN THỊ THƯƠNG HUYỀN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2009

PHẦN MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Sự phát triển của Công nghệ sinh sản nói chung và kỹ thuật đông lạnh nói riêng đã đem lại

nhiều tiềm năng ứng dụng có ý nghĩa không chỉ về kinh tế mà còn có ý nghĩa về khoa học. Đặc

biệt, kỹ thuật đông lạnh trứng ngoài việc ứng dụng trong điều trị vô sinh còn là nền tảng cho

những nghiên cứu mới của nhân loại trong nhiều lĩnh vực: y sinh học nhằm thu nhận tế bào gốc

phôi, nhân giống vật nuôi, bảo quản nguồn gen in vitro, chuyển gen, sinh sản vô tính…

Ở nước ta trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu được triển khai nhằm nhân nhanh

đàn bò để thực hiện “Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020” do Thủ tướng chính phủ đề

ra (16/1/2008). Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn gặp khó khăn do nguồn trứng không đủ để

tiến hành các thí nghiệm nuôi chín trứng, thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro

fertilization_IVF)…Nguyên nhân của vấn đề này là do hạn chế trong việc vận chuyển và chi phí.

Do đó, cung cấp nguồn trứng có chất lượng cao với giá thành thấp đang được quan tâm.

Heo là đối tượng động vật quan trọng cho việc nghiên cứu sinh lý và bệnh học ở người. Kỹ

thuât chuyển gen đang đóng vai trò thiết yếu trong việc tạo ra heo có kiểu gen cho các hướng

nghiên cứu khác: khai thác tế bào gốc phôi, cắt phôi… Xa hơn nữa, công nghệ này còn có khả

năng ứng dụng trong Y sinh: cấy ghép cơ quan, nội tạng… Bảo quản lạnh giao tử và phôi từ heo

có thể là một phuơng pháp thay thế hữu hiệu trong việc duy trì những cá thể sinh sản nhằm bảo

tồn các kiểu gen quý hiếm. Đây là một cuộc cách mạng không chỉ với việc kiểm soát khả năng

sinh sản ở heo mà còn với sự gia tăng sử dụng heo trong các ứng dụng về công nghệ Y sinh học.

Hiện nay nguồn trứng chủ yếu được bảo quản bằng phương pháp đông lạnh, song tỷ lệ trứng

sống sau khi rã đông theo tổng kết của các chuyên gia thế giới chưa cao (bò 30%, người 10%,).

Chính điều này là làm tốn kém và hạn chế trong công việc của nhiều nước. Một trong những tác

nhân giới hạn thành công của kỹ thuật đông lạnh trứng là xảy ra tổn thương lạnh trong suốt quá

trình đông lạnh. Trứng rất dễ tổn thương khi tiếp xúc với nhiệt độ thấp của quá trình đông lạnh

và để tránh điều này bằng cách sử dụng phương pháp thủy tinh hóa (Ruffing và cs., 1993;

Martino và cs., 1996).

Trên cơ sở đó, chúng tôi mạnh dạn thực hiện đề tài “Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện

cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam”.

2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

- Thu nhận và nuôi trứng bò, heo đến giai đoạn trưởng thành (In vitro Maturaration_IVM)

- Thử nghiệm khả năng sống của trứng bò, heo trưởng thành sau khi đông lạnh bằng

phương pháp thủy tinh hóa.

3. CÁCH TIẾP CẬN ĐỀ TÀI

 Tiếp cận với nhu cầu đòi hỏi của xã hội và tầm quan trọng của vấn đề này trong cuộc

sống; đồng thời các điều kiện về kiến thức, điều kiện phòng thí nghiệm cho phép ứnng

dụng Công nghệ Sinh học.

 Tiếp cận với các chuyên gia đầu ngành để học tập, trao đổi kỹ thuật, kinh nghiệm:

Tham gia lớp học về các kỹ thuật thu nhận, nuôi, đông lạnh trứng, thụ tinh trong ống

nghiệm trên đối tượng bò heo tại Viện Chăn nuôi quốc gia, Hà Nội (tháng 05/2008) do

TS. Otoi (Người Nhật) và các cán bộ của viện đảm trách…

 Tra cứu các tài liệu liên quan trong và ngoài nước

 Tiếp cận với các kỹ thuật hiện đại: hệ thống máy đông lạnh và giải đông trứng, kỹ

thuật vi thao tác, PCR…

4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Phương pháp trực quan (nghiên cứu trực tiếp): thu nhận trứng và xử lý trứng, đông

lạnh trứng, giải đông trứng, kiểm tra, đánh giá tỷ lệ trứng sống sau khi rã đông.

 Phương pháp tổng hợp

 Phương pháp so sánh

5. PHẠM VI NGHIÊN CỨU

 Trứng bò từ các nguồn khác nhau: từ viện chăn nuôi quốc gia, lò mổ Vissan

 Trứng heo từ lò mổ Vissan Tp. HCM

6. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

 NỘI DUNG 1: Đông lạnh trứng heo trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa

trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2)

 NỘI DUNG 2: Đông lạnh trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa

trong cọng rạ (PP2)

 NỘI DUNG 3: Đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa

trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2)

7. SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI

Kết quả khoa học

Đã tiến hành thu nhận và bảo quản nguồn trứng bò, heo thu nhận từ lò mổ bằng phương

pháp thủy tinh hóa trong vi giọt và trong cọng rạ.

Kết quả sản phẩm

Đã bảo quản được số lượng trứng vượt với chỉ tiêu đề ra trong thuyết minh:

 71 cọng rạ chứa 386 trứng heo đã IVM

 36 cọng rạ chứa 197 trứng bò đã IVM

 70 cọng rạ chứa 365 trứng bò chưa trưởng thành

 305 trứng heo đã IVM trong vi giọt

 477 trứng bò chưa trưởng thành trong vi giọt

Kết quả đào tạo

02 cử nhân

 Phan Bá Quy: Thử nghiệm bảo quản trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh

hóa trong cọng rạ (vitrification)- 2008

 Nguyễn Quốc: Bảo quản trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) – 2009.

(Chuẩn bị báo cáo tốt nghiệp vào ngày 25/05/2009)

01 SV nghiên cứu khoa học đạt giải nhì cấp trường

Đỗ Hoàng Hùng: Thử nghiệm bảo quản trứng bò, heo bằng phương pháp thủy tinh hóa

trong vi giọt (microdrop vitrification) – 2009.

Kết quả bài báo, báo cáo đã công bố

 01 bài đăng trong Hội nghị Khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM, 2008 (Bảo

quản trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ)

 01 bài đăng trong Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 2008 (Bảo quản trứng bò bằng

phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ; đang chờ phản biện)

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ĐÔNG LẠNH TRỨNG

1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Khái niệm thủy tinh hóa hay toàn bộ vật chất có trạng thái trong suốt giống thủy tinh được

mô tả đầu tiên vào năm 1890, sau đó được Luyet mô tả lại vào năm 1937 (Luyet, 1937) [46].

Vào nửa cuối thập kỷ 1940, Chang đã thực hiện những nghiên cứu đầu tiên về bảo quản

phôi thỏ ở nhiệt độ thấp [3]. Đến năm 1949, Polge và cs. phát hiện ra glycerol có thể giữ được sức sống của tinh trùng gia cầm khi nhiệt độ được hạ xuống -70oC [65]. Phát hiện này mở ra khả

năng có thể bảo quản các loại tế bào và mô ở nhiệt độ thấp hơn. Smith (1952) đã đông lạnh phôi thỏ ở nhiệt độ -79oC và -196oC nhưng đạt kết quả không cao. Sau khi rã đông, chỉ có 1% số phôi

được bảo quản còn giữ được một phôi bào có khả năng tiếp tục phân chia [76].

Năm 1976, Parkening và cs. tiến hành đông lạnh trứng chuột ở -30oC và -50oC có tỉ lệ sống

đạt 51 – 56%; ở -75oC chỉ đạt 18% trứng sống [60].

Một loạt nghiên cứu của tác giả Willadsen (1977) [85], Trouson (1977) [77], Massip (1979)

[52], đã cải tiến phương pháp đông lạnh và rã đông theo phương pháp giảm từng bước một, nhằm

pha loãng các chất bảo quản lạnh, tăng nhanh tốc độ đông lạnh và rã đông mà vẫn bảo tồn sức

sống của phôi, thu được kết quả tốt ở bò và chuột. Những cải tiến này cũng hạn chế được sự biến

đổi về hình thái học của phôi. Ngày nay, việc đơn giản hóa kĩ thuật đông lạnh và rã đông theo

phương pháp một bước (one – step method) do Leibo (1980) đề xuất đã thực sự thúc đẩy việc sử

dụng phôi cũng như tinh trùng đông lạnh rộng rãi trong sản xuất. Hiệu quả cho thấy khi sử dụng

tinh đông lạnh thì sức sống của phôi đạt trên 80% và tỉ lệ thụ thai đạt 50 – 60% [40].

Đến năm 1985, Rall và Fahy đã công bố phương pháp đông lạnh cực nhanh còn gọi là

phương pháp thủy tinh hóa, bằng cách nhúng trực tiếp phôi chuột 8 tế bào vào nitơ lỏng từ nhiệt độ trên 0oC, do đó chỉ mất vài giây để đông lạnh. Và ông đã thực hiện thành công trong trữ lạnh

phôi gia súc (bò) [66]. Phương pháp này không yêu cầu những dụng cụ làm lạnh đắt tiền hay kĩ

năng đặc biệt mà có thể tiến hành rất nhanh. Mặt khác, phương pháp thủy tinh hóa đơn giản hơn

phương pháp đông lạnh thông thường. Từ đó, phương pháp thủy tinh hóa được sử dụng rộng rãi

và bây giờ được xem như là phương pháp thay thế phương pháp đông lạnh chậm.

Mặc dù, phương pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa được Rall và Fahy thực hiện

thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985 [66]. Tuy nhiên, quy trình này chỉ được

Kuleshova và Lopata ứng dụng đầu tiên trên trứng người vào năm 1999 [37] và sau đó vài tháng,

quy trình này cũng được thực hiện đầu tiên trên phôi người đang phát triển ở giai đoạn phôi nang

bởi Lane [38]. Vào ngày 20/6/1999, em bé đầu tiên trên thế giới từ phôi trữ lạnh bằng kỹ thuật

thủy tinh hóa ra đời [90].

Kỹ thuật đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa áp dụng thành công trên trứng bò

(Martino và cs.,1996) [51]. Trên chuột, tỷ lệ hình thái trứng sống sau quy trình đông lạnh và rã

đông bằng phương pháp thủy tinh hóa là 88% (Nakagata, 1989) [55]; 80% (Shaw, 1991) [72];

99% (Lane, 2001) [39]; 90% (Kim, 2007) [36]. Trên bò, tỷ lệ trứng sống sau đông lạnh và rã

đông là 85% (Otoi,1998) [58]; 87% (Asada, 2002) [12]; 88% (Men, 2002) [53]; đặc biệt Chian

(2004) thu được tỷ lệ trứng bò sống sau rã đông đạt 92% khi dùng chất bảo quản đông lạnh là

15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% dimethyl sulphoside (DMSO), và đạt 98% khi dùng

15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% propylene glycol (PG)...[17].

Vào năm 2005, Fujihira thực hiện quy trình đông lạnh và rã đông trứng heo bằng phương

pháp thủy tinh hóa sử dụng Cryotop, với nồng độ EG trong dung dịch thủy tinh hóa là 30%, thu

được tỷ lệ sống sau rã đông là 54 – 56% [24]. Trong năm này Martins R.D. và cs. đã đông lạnh

trứng bò chưa chín bằng phương pháp thủy tinh hóa, sử dụng chất bảo quản là EG và sucrose, tỷ

lệ trứng sống là 20% so với nhóm đối chứng là 74,6% [50]. Năm 2006, Cetin Yunus và Bastan

Ayhan đã bảo quản trứng bò chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa với các chất bảo

quản khác nhau, tỷ lệ sống trên 20% so với nhóm đối chứng là 79,6% [18].

Somfai và cộng sự (2006) khảo sát ảnh hưởng của Cytochalasin B trên quá trình thủy tinh

hóa trứng heo sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trên bề mặt kim loại. Họ sử dụng quy trình bổ sung CPA qua 2 bước (trong EG 4% khoảng 10 – 15 phút ở 37oC, sau đó trong dung dịch thủy

tinh hóa cuối cùng EG 35% với 5% PVP và trehalose 0.3M) [75].

Gupta và cộng sự (2007) sử dụng quy trình thủy tinh hóa tương tự với quy trình trên.

Trong thử nghiệm sử dụng trứng giai đoạn túi mầm, kết quả được cải thiện khi kết hợp sử dụng

EG và DMSO, vì vậy họ sử dụng kết hợp 2 chất này trên đối tượng trứng MII. Tuy nhiên phương

pháp này làm giảm đáng kể khả năng phát triển của trứng (chỉ 3.4% phát triển đến blastocyst so

với lô đối chứng là 20.1%) [28].

Morató và cs. (2008) đã bào quản trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa

bằng cọng rạ và cryoloop cho tỷ lệ trứng sống sau giải đông tương ứng là 88,4% và 94,5% [54].

1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã được tiến hành vào năm 1984. Phương pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 12oC/phút) sau khi khử nước cục bộ ở nhiệt độ phòng trên phôi

bò đã thành công với 63,4% (33/52) phôi phát triển trong ống nghiệm sau 48 giờ và 44,2%

(23/52) phôi nang thoát màng và tỷ lệ có thai sau khi cấy phôi đông lạnh – rã đông là 33,3%

(7/21) [3].

Năm 1990, con bê Charolais đầu tiên được sinh ra từ phôi đông lạnh nhập khẩu [2].

Năm 2003, Lưu Công Khánh và cs. đã báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng phôi

bò đông lạnh bằng glycerol [5].

- Ngày 24/05/2004, trường hợp em bé đầu tiên của Việt Nam ra đời từ trứng trữ lạnh tại

bệnh viện Từ Dũ [90].

- 2008, Nguyễn Thị Thương Huyền và cs. đã bảo quản thành công trứng bò bằng phương

pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ với tỷ lệ trứng sống so với tổng số trứng đem đông lạnh sau giải

đông 58,83% [4].

- Hiện nay các nhà khoa học đang nghiên cứu về việc bảo quản trứng ở động vật hữu nhũ,

nhằm mục đích tạo ngân hàng bảo quản giao tử cái (trứng) để phục vụ cho các nghiên cứu sâu

1.2. SINH LÝ BUỒNG TRỨNG

hơn: IVF, ICSI, cloning, chuyển gen, thu nhận tế bào gốc phôi…

1.2.1. Quá trình hình thành và phát triển nang trứng

Hình thành nang trứng là quá trình tiếp nối của các giai đoạn từ nang nguyên thủy phát triển

thành nang sơ cấp và sau đó thành nang thứ cấp, các nang này sẽ phát triển, tích lũy dịch, phồng

lên và di chuyển ra ngoài buồng trứng để chuẩn bị rụng trứng – đó là nang trứng chín (Hình 1.1).

Và quá trình phát triển này ở gia súc từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn trước rụng trứng mất

khoảng 180 ngày (Lussier và cs., 1987) [45].

Từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn tiền rụng trứng đường kính nang trứng bò tăng 30

đến 400 lần (từ 50m lên 15 đến 20mm). Trong quá trình này trứng hình thành màng trong suốt,

tích lũy một số sản phẩm cần thiết cho sự thụ tinh và các giai đoạn đầu của sự phát triển phôi.

Sau khi rụng nang trứng sẽ hình thành thể vàng.

Số lượng nang trứng dự trữ trong buồng trứng ở các loài có sự khác nhau và thoái hóa dần

trong quá trình phát triển của cá thể, càng lớn thì số nang trứng có hiệu quả càng ít. Ở bò, bê con

lúc mới sinh ra có hơn 100.000 nang trứng và số lượng này giảm dần theo độ tuổi.

Hình 1.1. Sự hình thành và phát triển nang trứng

1.2.2. Sự hình thành và phát triển của trứng

Một trứng trưởng thành và sẵn sàng cho sự thụ tinh khi nó được phóng thích từ nang trứng

trưởng thành của buồng trứng. Sự trưởng thành của trứng liên quan mật thiết với sự trưởng thành

của các nang trứng (Hình 1.2). Quá trình phát triển của trứng gồm 4 giai đoạn: Sự di chuyển của

các tế bào mầm vào cơ quan sinh dục; Sự gia tăng số lượng tế bào mầm bằng nguyên phân; Sự

giảm vật liệu di truyền bằng giảm phân; Sự trưởng thành về cấu trúc và chức năng của trứng.

Trong quá trình giảm phân của trứng có 2 giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trưởng (block):

 Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trưởng lần thứ nhất: khi trứng bước vào giai đoạn

prophase của giảm phân I, cho ra trứng sơ cấp ở giai đoạn túi mầm (Germinal

Vesicle_GV). Các trứng sẽ vượt qua giai đoạn này khi có sự xuất hiện của đỉnh LH

(Luteinizing hormone) tức khi cá thể đến tuổi trưởng thành sinh dục.

 Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trưởng lần thứ hai: khi ở giai đoạn metaphase-M

của giảm phân II (MII), cho ra trứng thứ cấp ở giai đoạn MII. Trứng chỉ vượt qua được

giai đoạn MII khi có sự thụ tinh của tinh trùng.

Hình 1.2. Cấu trúc của buồng trứng và nang trứng

Sự trưởng thành của trứng bao gồm những biến đổi ở mức tế bào để hỗ trợ cho sự thụ tinh

và thời kỳ đầu của sự phát triển phôi thai (Sirard và cs., 1989) [73]. Sự trưởng thành trứng bao

 Sự trưởng thành về nhân

gồm:

Quá trình trưởng thành trong nhân trải qua các giai đoạn: giai đoạn phá vỡ túi mầm

(Germinal Vesicle Breakdown_GVBD), cô đặc nhiễm sắc thể, hình thành thoi vô sắc, phân chia

nhiễm sắc thể tương ứng với việc tách ra của thể cực thứ I và dừng ở metaphase II. Ở bò, các

nang trưởng thành đạt kích thước từ 2 - 3mm, một số trứng có khả năng xảy ra hiện tượng GVBD

và hoàn tất quá trình giảm phân sau đó (Lonergan và cs., 1994 [42]; Fulka và Motlik., 1986 [25]).

Và khi trứng đạt đến giai đoạn metaphase II sẽ đạt đường kính là 110m. Điều này giống với

trứng thu từ nang nguyên thủy hoặc sơ cấp (chưa đạt đến kích thước khảo sát là tối ưu) không thể

tiếp tục hay hoàn tất quá trình giảm phân và sẽ không có khả năng trưởng thành nhân. Do đó, đây

là cơ sở cho việc chọn nang để thu trứng cho việc nuôi trưởng thành in vitro nhẳm đạt kết quả

 Sự trưởng thành về tế bào chất

cao nhất.

Sự trưởng thành của tế bào chất bao gồm sự thay đổi toàn diện cấu trúc để trứng tiến từ giai đoạn

túi mầm đến giai đoạn metaphase II (Shamsuddin và cs., 1993) [70]. Trong quá trình này, các bào quan

được tổ chức lại chuẩn bị cho quá trình thụ tinh và tổng hợp protein chuẩn bị cho sự phát triển của

phôi. Các ti thể thay đổi theo sự lớn lên của trứng. Khi trứng có kích thước nhỏ hơn 100mm, ti thể có

dạng cầu và định vị tại trung tâm trứng. Nhưng khi trứng có đường kính 100mm, ti thể có hình trứng và

di chuyển ra xa vị trí trung tâm, chúng có dạng hình túi và nằm tại vùng ngoại vi của trứng khi tế bào

đạt đến kích thước 110mm. Các ti thể di chuyển dọc theo các vi ống được hình thành trong tế bào chất.

Tương tự, các túi mầm sẽ di chuyển ra phía màng trong suốt khi trứng phát triển với kích thước hơn

110mm. Bộ Golgi chịu trách nhiệm hình thành các thể hạt vỏ của màng trong suốt. Và số lượng Golgi

trong trứng tăng theo đường kính của nang. Có thể dễ dàng quan sát sự thay đổi vị trí của hạt vỏ trong

suốt quá trình trưởng thành của tế bào chất. Cùng với sự thay đổi vị trí, sự thay đổi cấu trúc hạt vỏ là

hai yếu tố có ý nghĩa đặc biệt đối với sự thụ tinh của trứng. Các thể hạt vỏ di chuyển ra phía màng

trong suốt, giải phóng các chất bên trong làm cho màng trong suốt thay đổi cấu trúc, tăng kích thước

nội bộ và hạn chế sự thụ tinh đa tinh trùng (polyspermy). Do vậy, sự trưởng thành về tế bào chất là

yếu tố đánh giá gián tiếp khả năng của trứng khi thụ tinh, phân chia tế bào và phát triển đến giai

đoạn phôi nang.

1.2.3. Cấu tạo của trứng

Xung quanh trứng là lớp tế bào cumulus (granulose cell) kết hợp một cách chuyên biệt với

trứng, giữa chúng có khe nối giúp duy trì quá trình trao đổi chất của trứng. Các lớp tế bào

cumulus này vừa bảo vệ trứng, vừa cung cấp chất dinh dưỡng nuôi trứng. Đặc biệt là khi trứng

rụng, trứng không còn nguồn cung cấp chất dinh dưỡng nào khác ngoài tế bào hạt. Tiếp đến là

màng phóng xạ tỏa tròn. Bên trong màng phóng xạ là màng trong suốt của trứng, đóng vai trò rất

quan trọng trong thụ tinh. Giữa màng trong suốt và màng tế bào chính là khoảng không quanh

noãn. Trong màng tế bào chất là bào tương và nhân chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội của loài.

Hình 1.3. Tế bào trứng

Trứng chín là trứng đang ở giai đoạn metaphase II với thể cực thứ nhất. (Hình 1.3)

1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐÔNG LẠNH TRỨNG

1.3.1. Các phương pháp đông lạnh

Đông lạnh trứng là sự bảo quản thành công chức năng bình thường của trứng khi giảm nhiệt độ dưới mức phản ứng hóa học bình thường xảy ra (từ 37oC, 5%CO2 (điều kiện sinh lý) xuống - 196oC (nhiệt độ không sinh lý)).

Đông lạnh trứng có thể phân loại theo hai cách chung là đông lạnh cân bằng “equilibrium”

với phương pháp đông lạnh chậm (slow freezing) hay đông lạnh không cân bằng

“nonequilibrium” với phương pháp đông lạnh nhanh (rapid freezing) và phương pháp thủy tinh

hóa (vitrification), tùy theo tốc độ làm lạnh và chất bảo quản đông lạnh sử dụng. Tuy nhiên, bản

chất của các phương pháp này là giống nhau, cụ thể là đều có mục đích chung nhằm bảo vệ tế

bào khỏi ảnh hưởng của tinh thể đá nội bào, sự khử nước và thay đổi mạnh mẽ nồng độ chất tan ở

cả nhiệt độ cao và nhiệt độ thấp.

 Phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification)

Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh. Trong suốt

quá trình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng khối

đặc, trong suốt giống như thủy tinh (glass-like), đặc biệt không có sự hình thành tinh thể đá bên

trong mẫu tế bào, cũng như môi trường bên ngoài trong quá trình làm lạnh. [50, 54]

Phương pháp này loại trừ hạn chế của quá trình đông lạnh chậm là cần thiết bị phức tạp.

Một thuận lợi nữa của phương pháp này là khả năng sống của tế bào cao nếu điều kiện tối ưu do

không có tinh thể đá ngoại bào. Gần đây hơn, những phương pháp thủy tinh hóa cải tiến đã được

phát triển, có khả năng làm lạnh và làm ấm cực nhanh nhờ giảm thiểu thể tích của dung dịch bảo

quản. Phương pháp này hy vọng có khả năng bảo quản tế bào dễ bị tổn thương do đông lạnh.

Trong phương pháp thủy tinh hóa, tế bào cần được xử lí theo các bước đông lạnh thông

thường như cân bằng trong dung dịch bảo vệ lạnh pha loãng, ngâm trong dung dịch đông lạnh

nhanh một khoảng thời gian ngắn trước khi được làm lạnh trong nitơ lỏng. Thời gian tiếp xúc

trong dung dịch của phương pháp thủy tinh hóa không chỉ phụ thuộc vào dung dịch bảo vệ đông

lạnh mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ, cả tính thấm của tế bào và độc tính của chất bảo quản lạnh

chịu ảnh hưởng rộng bởi nhiệt độ. Tế bào được huyền phù trong một dung dịch chất bảo quản

thấm có nồng độ rất cao ở nhiệt độ phòng. Bởi vì sự hiện diện với nồng độ cao các chất bảo quản

có khả năng gây độc cho tế bào nên trứng không được phép giữ lâu tại nhiệt độ này mà thay vào

đó chỉ được cân bằng đông lạnh trong khoảng thời gian rất ngắn trước khi chúng được nhúng trực

tiếp vào nitơ lỏng. [48]

Khác với các phương pháp đông lạnh chậm và đông lạnh nhanh, trong phương pháp đông

lạnh cực nhanh, thể tích của dung dịch đông lạnh nhanh được giảm đến mức tối thiểu sử dụng

nhiều công cụ khác nhau. Ví dụ, tế bào được đặt ở đầu loop hay được đặt dính ở ống bảo quản

lạnh (cryotube hay cryoloop), ống mao dẫn mở (cọng rạ hở “open pulled straw”), hay đông lạnh

không có dụng cụ chứa (vi giọt). Mục đích của phương pháp này là làm lạnh và rã đông trứng với

thể tích tối thiểu cần cho đông lạnh nhanh. Phương pháp đông lạnh cực nhanh cũng được đưa ra

để cải tiến sự sống sót của tế bào sau khi rã đông bởi vì nhiệt độ tới hạn có thể vượt qua nhanh

chóng trước khi tế bào bị tổn thương. Tuy nhiên chất bảo quản được dùng trong kỹ thuật này có

nồng độ rất cao, có khả năng gây nên những tổn thương về cấu trúc di truyền cho tế bào. Có lẽ

đây là lý do tại sao phôi sau trữ lạnh có cấu trúc và phát triển rất tốt khi nuôi trong ống nghiệm

nhưng tỷ lệ thụ thai sau chuyển phôi vẫn còn rất thấp. Người ta cho rằng thành công của phương

pháp phụ thuộc vào loại và cách dùng chất bảo quản lạnh, cũng như thời gian tiếp xúc với chất

bảo quản lạnh trước khi chuyển thành dạng kính. Qui trình rã đông cũng phải thực hiện thật

nhanh để hạn chế hiện tượng chuyển dạng từ kính sang nước đá. Hiện tại tuy chưa thể áp dụng kỹ

thuật này vào thực tế nhưng tiềm năng của nó rất lớn vì tính đơn giản và những ưu điểm so với

kỹ thuật làm lạnh chậm đang được sử dụng. [11, 13, 48]

1.3.2. Chất bảo quản lạnh (Cryoprotective Additive_CPA)

Các chất bảo quản lạnh được sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa gần giống như trong kỹ

thuật đông lạnh chậm trước đây, nhưng nồng độ sử dụng cao hơn. Trong một dung dịch dùng để

thủy tinh hóa luôn bao gồm một hoặc hai chất bảo quản lạnh có khả năng thấm qua màng tế bào

(permeable cryoprotectant) để khử nước bên trong tế bào và một chất bảo vệ đông lạnh không có

khả năng thấm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) làm đối trọng, giúp quá trình

1.3.2.1. Các chất bảo quản thường sử dụng cho phương pháp thủy tinh hóa

khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn. [11, 13]

 Chất bảo quản lạnh có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào: ethylene glycol (được sử

dụng phổ biến nhất), propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide

(DMSO) và 1,2-propanediol (PrOH).

 Ethylene glycol (EG): Phổ biến nhất và đã được sử dụng trong quy trình thủy tinh

hóa. Chất này ít ảnh hưởng bởi nhiệt trong cơ chế vận chuyển qua màng, độc tính của nó sẽ xuất hiện vào khoảng 38oC. EG có độc tính thấp với phôi chuột, đặc biệt là phôi nang và

khuếch tán nhanh, cân bằng nhanh chóng với tế bào qua màng trong suốt và màng tế bào.

Sau khi đông lạnh trứng và phôi bằng phương pháp thủy tinh hóa bằng EG đã có sự mang

thai bình thường trên động vật và người. [11]

 Dimethyl sulfoxide (DMSO): DMSO được phát hiện vào năm 1959 như là một chất

bảo quản hiệu quả. Chất này xuyên qua màng dễ dàng hơn glycerol nhưng tính độc của nó

lại cao hơn ở nhiệt độ cao.

 Propylene glycol (PG): cũng là một chất tương tự như glycerol, nhưng nồng độ của

nó được yêu cầu thấp hơn trong chất đông lạnh, và độc hơn glycerol.

 Chất bảo quản lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào: sucrose, trehalose, glucose

và galactose.

Các saccharide khác nhau thường được sử dụng, bao gồm mono-, di- và trisaccharides.

Các monosaccharide gồm fructose, glucose, và galactose. Các disaccharide như sucrose,

trehalose và lactose. Những sucrose không thấm cũng tỏ ra là một chất đệm thấm lọc để giảm bớt

sốc thẩm thấu, giúp đẩy nước ra khỏi tế bào. Người ta đã chứng minh được nồng độ sucrose cao

(1mol/lít) thực sự không gây độc cho phôi và trứng (Kuleshova và cs., 1999) [37]. Trahelose đã

được xem là chất bổ sung của chất bảo quản đông lạnh rất có hiệu quả (Begin và cs., 2003) [14].

Cả sucrose và trehalose ức chế màng tế bào bị biến đổi bởi nhiệt độ, ổn định độ bền của enzyme

và màng tế bào. Trong một số trường hợp, trehalose còn là một chất bảo vệ tốt hơn cả sucrose.

[11]

Để đạt tỷ lệ đông lạnh cao, đòi hỏi sử dụng chất bảo quản đông lạnh nồng độ cao để làm

giảm tinh thể đá. Kết quả là với nồng độ cao có thể dẫn đến sốc thẩm thấu và gây độc hóa học.

Hai cách để làm giảm độc tính đến mức thấp nhất ở nồng độ cao: (i) Giảm bớt chất bảo quản

đông lạnh, (ii) Tăng tốc độ làm lạnh và rã đông. [54]

Trong thành phần môi trường thủy tinh hóa hiện nay, người ta thường sử dụng ethylene

glycol và một chất bảo vệ đông lạnh khác cũng có khả năng thấm qua màng tế bào (thường là

DMSO hoặc PrOH) kết hợp với sucrose. Sự kết hợp này vừa bảo đảm được khả năng thẩm thấu

qua màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng chất riêng lẻ, vừa giảm được độc tính của

1.3.2.2. Dung dịch đệm và các đại phân tử

từng thành phần riêng lẻ tác động lên tế bào khi sử dụng chúng ở nồng độ cao. [60]

Dung dịch chất bảo quản chứa nhiều hợp chất khác nhau có tác dụng bảo vệ tế bào trong

suốt quá trình đông lạnh và rã đông. Chẳng hạn như những hợp chất gồm citrate, noãn hoàng

trứng. Dung dịch bảo quản đông lạnh thường được tạo bằng cách thêm vào một lượng các hợp chất

làm thành dung dịch sinh lý giống với môi trường cấy giao tử và phôi.

 Dung dịch đệm

Dung dịch thủy tinh hóa là dung dịch chất bảo quản đông lạnh mà không bị đông đá khi làm

lạnh đến nhiệt độ rất thấp với tốc độ làm lạnh cao. Vì vậy môi trường đệm cơ bản sử dụng cho thủy

tinh hóa là đệm muối photphat hay đệm HEPES.

 Các đại phân tử

Các hợp chất đại phân tử được thêm vào dung dịch chất bảo quản đông lạnh:

polyvinylpirrolidone (PVP) nhưng không thành công trong trong đông lạnh phôi và gây độc cao

đối với phôi (Wilmut và Rowson, 1973). Polyethylene glycol (PEG) cũng được sử dụng như chất

bổ sung (Rall và Fahy, 1985), hydroxyethyl starch (HES), Ficoll. Ngoài ra, còn có các protein lớn

gồm albumin huyết thanh bò – Bovine Serum Albumin (BSA) hay huyết thanh bò mang thai –

Fetal Bovine Serum (FBS). Một loại ít phổ biến khác là các protein giảm nhiệt – Thermal

Hysteresis Proteins (THPs). [55, 66, 86]

Trong tự nhiên những tế bào chứa hàm lượng protein cao sẽ hữu ích trong quá trình thủy

tinh hóa. Thủy tinh hóa ngoại bào cần nồng độ chất bảo quản cao hơn nội bào. Việc thêm polymer

có phân tử khối lớn: PVP, polyethylene glycol (PEG) hoặc Ficoll có khả năng đẩy mạnh thủy tinh

hóa ngoại bào với nồng độ chất bảo quản đông lạnh giống như thủy tinh hóa nội bào. Hơn nữa, các

polymer có thể tạo ra chất nền nhớt trong trứng (viscous matrix), ngăn cản sự hình thành tinh thể

đá trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông.Vì thế, các đại phân tử hoạt động như chất thay thế

ngoại bào để làm tăng chất bảo quản đông lạnh bên ngoài, từ đó làm giảm độc cho tế bào. [55, 66]

1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng trứng sau khi bảo quản bằng phương pháp

thủy tinh hóa

Quá trình đông lạnh gây ra nhiều tổn thương trong cấu trúc và chức năng của trứng. Trong

đó, tổn thương lạnh và độc tính của các chất bảo quản là những bất lợi chính quyết định đến sự

bảo quản trứng thành công. Do đó, để sống sau đông lạnh, trứng phải trải qua một chuỗi co và

giãn nở thể tích. Trứng dễ bị tổn thương bởi quy trình đông lạnh: sự hình thành tinh thể đá, thẩm

thấu khi loại bỏ chất bảo quản đông lạnh khỏi tế bào. Vì vậy, việc đông lạnh chúng là rất khó

(Vincent và Johnson, 1992). Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp thủy tinh hóa tránh được sự

hình thành đá nội bào (Intracellular Ice Formation_IIF) – ảnh hưởng đến khả năng sống của trứng

sau rã đông - nhờ thay đổi thành phần nội bào từ pha lỏng sang pha rắn (Rall và Fahy, 1985;

Vajta và Kuwayama, 2006). [66, 79, 81]

Bên cạnh đó, phương pháp thủy tinh hóa dường như đe dọa đến sự sống sau đông lạnh do

nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao và yếu tố nhiệt độ thực hiện có thể gây độc cho tế bào

(Hotamisligil và cs., 1996). Ngoài ra, chất lượng trứng sau thủy tinh hóa còn phụ thuộc các yếu tố

như những biến đổi hình dạng, cấu trúc của trứng do quá trình đông lạnh và rã đông gây ra; đặc

điểm và giai đoạn phát triển của trứng thực hiện đông lạnh (Bernard A. và Fuller B.J., 1996). Kết

quả của nhiều nghiên cứu về sự sống của trứng sau đông lạnh có thể bị tác động bởi trạng thái

trưởng thành của chúng, chất lượng hay các yếu tố lý sinh trong quy trình đông lạnh đã sử dụng. Ví

dụ, khi trưởng thành, chất lượng và kích thước trứng là đặc điểm quan trọng ảnh hưởng đến kết quả

đông lạnh. [15, 29]

Phương pháp thủy tinh hóa đã được áp dụng trên phương diện lâm sàng (Kuleshova và

Lopata, 2002). Một vài điều cần lưu ý có thể dẫn tới tỷ lệ thành công thấp là chất lượng nitơ lỏng,

1.3.3.1. Biến đổi trong tế bào đông lạnh

thời gian thao tác, tốc độ đông lạnh, ảnh hưởng chất bảo quản đông lạnh…[37]

 Sự hình thành tinh thể đá

Sự hình thành tinh thể nước đá trong và ngoài tế bào là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sức

sống của tế bào trong đông lạnh. Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định dạng tinh thể nước

đá hình thành. Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thể nước đá hình thành có dạng sáu

cạnh, hình dạng của nó sẽ là hình cây thông không đồng dạng và hình cầu khi tốc độ làm lạnh

Hình 1.4. Ảnh hưởng của tốc độ đông lạnh lên sự hình thành tinh thể đá

được đẩy lên (Hình 2.4). [55, 60]

Với tốc độ làm lạnh đạt đến 20.000oC/giây, nước nguyên chất tạo băng vô định hình mà

không có dạng tinh thể. Tuy nhiên, quá trình làm ấm trong giải đông sẽ xảy ra quá trình tái tạo

tinh thể nước đá từ nhỏ đến lớn. Vì vậy, tốc độ nâng nhiệt chậm trong quá trình giải đông sẽ gây

bất lợi cho tế bào. [55, 60]

Ở môi trường đẳng trương (áp lực thẩm thấu ở khoảng 300mOm/kg), tinh thể đá thường được hình thành ở nhiệt độ -5 đến -15oC. Tuy nhiên, tinh thể nước đá chỉ được hình thành ở nhiệt độ -10oC khi trong dung dịch có các phân tử chất rắn nhỏ. Nhiệt độ càng giảm thì tinh thể đá càng tăng. Tuy nhiên, ở nhiệt độ khoảng -130oC, tất cả các chất liệu trong dung dịch đều ở dạng

hạt kết tinh hay dạng thủy tinh. Quá trình này gọi là sự kết tinh hay hiện tượng thủy tinh hóa

(vitrification). Hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đông lạnh có các chất hòa tan cũng

như các chất bảo quản có nhiệt độ đông đá thấp hơn bình thường. [55, 60]

 Sự khử nước

Sự khử nước của tế bào là rất cần thiết trong quá trình làm lạnh. Thông thường các tế bào sẽ có thể bị tổn thương ở nhiệt độ 15 đến -90oC. Một khi tế bào không được khử nước thì cấu trúc đá nội bào sẽ hình thành nếu nhiệt độ xuống dưới 0oC. Tốc độ khử nước của tế bào phụ thuộc vào

nhiều yếu tố: tính thấm nước của màng, năng lượng hoạt hóa của tính thấm và tỷ lệ diện tích bề

mặt/thể tích tế bào (S/V). Những yếu tố này thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, vì vậy, chúng

đóng vai trò quyết định trong xác định quá trình đông lạnh thích hợp nhất.

 Độ pH của dung dịch

Độ pH của dung dịch sẽ giảm theo nhiệt độ. Cân bằng acid – base của môi trường biến đổi

theo hướng tăng lực ion, làm cho các phân tử protein hòa tan trong môi trường dễ bị kết tủa

(salting out). Các chất bảo quản đông lạnh với bản chất hóa học của nó giữ vai trò quan trọng

trong việc kiểm soát biến đổi acid – base của dung dịch. Glycerol và các glycol hoạt động như

những base yếu, trong khi DMSO lại hoạt động như những base mạnh. Độ pH thích hợp nhất để

duy trì hoạt động sinh lý của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ mà tế bào được bảo quản. Người ta nhận thấy rằng, sự sống có thể tồn tại sau bảo quản ở các nhiệt độ xấp xỉ 0oC với độ pH lớn hơn

9.

 Sự hình thành bọt khí

Trong quá trình bảo quản lạnh, tế bào bị tổn thương và có thể chết vì nhiều cách khác nhau

do sự hình thành tinh thể đá. Thể tích nước bị đông lạnh sẽ tăng lên (tỷ trọng của nước đá thấp

hơn tỷ trọng của nước) dẫn đến việc bọt khí có thể hình thành khi nhiệt độ giảm xuống. Kích

thước của bọt khí thay đổi từ 25 – 100µm và tỷ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh, trong khi số lượng

làm đệm

bọt khí tỷ lệ thuận với tốc độ làm lạnh.

Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy còn sử dụng CO2

nhằm cân bằng acid – base. Khi làm lạnh thì các khí này không còn ở dạng hòa tan mà tách ra

thành những bọt khí có khả năng gây tổn thương cho tế bào. Khi tiến hành giải đông, bọt khí có

thể được hình thành và có thể phát triển thành không bào rất lớn trong nội bào, làm tế bào phồng

to quá mức và có thể bị phá hủy hoàn toàn. Sự tạo thành bọt khí xảy ra nhiều trong môi trường sử

1.3.3.2. Tính an toàn khi đông lạnh trứng trưởng thành

dụng đệm bicarbonate, vì vậy, sử dụng môi trường PBS có thể hạn chế số lượng bọt khí. [7, 9]

Nghiên cứu sử dụng trứng trưởng thành cho thấy khả năng sống của trứng sau đông lạnh

và rã đông bị ảnh hưởng bởi một số các nhân tố. Giữa các nhân tố hình thái, sự có mặt hay vắng

mặt các tế bào hạt cumulus trong suốt quá trình đông lạnh có thể tác động trực tiếp lên khả năng

sống của trứng sau rã đông. Hơn nữa, tổn hại tế bào sau rã đông gần ngưỡng gây chết sẽ ảnh

hưởng tới khả năng phát triển của chúng. Trứng trưởng thành không đồng nhất trong sự phân bố

và tổ chức các bào quan trong bào tương có thể ảnh hưởng đến kết quả của quy trình đông lạnh.

Trứng ở giai đoạn metaphase II dễ bị tổn thương lạnh do thoi vô sắc nơi nhiễm sắc thể bắt đầu xếp thẳng hàng rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp. Làm lạnh trứng trong thời gian ngắn ở 20oC

có thể gây ra sự phá vỡ không phục hồi bộ máy thoi vô sắc trong khi sự khử nước xảy ra nhanh chóng ở nhiệt độ thấp hơn 0oC. Sự sắp xếp các vi sợi thoi vô sắc thích hợp là điều cần thiết để

tách và sắp xếp đúng NST, vì vậy trứng đông lạnh càng tăng khả năng bị đa bội thể sau khi thể

cực thứ 2 bị đẩy ra ngoài. Sự đứt gãy bộ xương tế bào dẫn tới bộ xương tế bào bất bình thường,

giữ lại thể cực thứ hai, thay đổi cấu tạo và các bào quan. [64, 80]

Các vi ống của trứng có thể bị tổn thương do chất bảo quản đông lạnh và sự thay đổi của

nhiệt độ (Pickering và cs., 1990; Van Blerkom và Davis, 1994) [64, 80]. Trứng tiếp xúc với chất

bảo quản đông lạnh và thay đổi nhiệt độ có thể gây ra sự khử polymer của tubulin cùng với trứng

(Aman và Parks, 1994) [11]. Tổn thương thoi vô sắc giảm phân (meiotic spindle) có thể thay đổi

vị trí nhiễm sắc thể và hậu quả là giới hạn khả năng thụ tinh của trứng (Eroglu và cs., 1998) [23].

Liên quan đến khả năng thụ tinh không chỉ do tổn thương thoi vô sắc mà còn do khả năng bất

thường của nhiễm sắc thể (Aman và Parks, 1994) [11]. Hơn nữa, theo mô tả đầu tiên trên trứng

chuột do tác giả Magistrini và Szöllösi (1980) [48], các vi ống và thoi vô sắc giảm phân của trứng

của tất cả các loài động vật có vú không tập trung và không kết hợp khi trứng tiếp xúc với nhiệt độ gần 0oC trong khoảng vài phút (Parks và Ruffing, 1992; Vincent và Johnson, 1992) [61, 82].

Trứng cũng bị tổn thương khi tiếp xúc với các chất bảo quản đông lạnh khác nhau. Johnson và

Pickering (1987) cho thấy trường hợp trứng tiếp xúc lâu với DMSO kết quả là không tập trung

thoi sắc và nhiễm sắc thể bị phân tán [81]. Vincent và cs. (1990) cũng phát hiện ra DMSO có ảnh

hưởng lên trứng. Tuy nhiên, họ đã kết luận tổn thương là do nhiệt độ, tại nhiệt độ nào đó chất bảo

quản đông lạnh không thể thấm vào tế bào một cách nhanh chóng và vì vậy rất ít chất bảo quản

đông lạnh trong tế bào [81]. Công bố của Shaw và Trounson (1989) cho rằng propylene glycol

gây ra hoạt hóa trinh sản (parthenogenetic) trên trứng chuột – là sự hoạt hóa nhân tạo phong tỏa trạng thái dừng ở giai đoạn metaphase II. Sự hoạt hóa này xảy ra do sự tăng nồng độ Ca2+ (mà hiện tượng này chỉ có khi tinh trùng xâm nhập vào trứng). Dòng Ca2+ tăng làm giải phóng các thể

vỏ hạt của trứng, và trứng tiếp tục quá trình giảm phân để hình thành thể cực thứ 2. White và Yue

(1996), Gook và cs (1995) cũng đã chứng minh trứng người cũng gặp phải hiện tượng trên sau rã

đông. Xơ cứng màng trong hay hoạt hóa trứng gây ra bởi sự giải phóng các tế bào hạt vỏ này

(Wolf và Hamada, 1977; Gulyas và Yuan, 1985). Các hạt vỏ được giải phóng ra ngoài thành bào

tương trong suốt phản ứng màng trong suốt. Đây là phản ứng thông thường, xảy ra khi tinh trùng

xâm nhập vào trứng để thụ tinh và ngăn hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng (Wassarman, 1988).

Propylene glycol cũng được cho là nguyên nhân giải phóng hạt vỏ trước trưởng thành (Schalkoff

và cs., 1989) và phá vỡ các vi sợi (Vincent và cs., 1992). [26, 69, 83, 84, 87]

DMSO cũng tỏ ra là nguyên nhân gây xơ cứng màng trong suốt và giảm các hạt vỏ trong

trứng chuột (Vincent và cs.,1990). Những nghiên cứu sau này cho thấy rằng trứng tiếp xúc với DMSO ở nhiệt độ 20 – 37oC phủ nhận tác động trên màng trong suốt, tỷ lệ thụ tinh và tổ thức

thoi vô sắc. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng tự bản thân trứng gây ra xơ cứng màng trong suốt

[82].

1.4. Ứng dụng của đông lạnh trứng

Đông lạnh trứng là một phương pháp dùng để lưu trữ các tế bào trứng trong thời gian dài

và đang được quan tâm nhiều vì phương pháp này có nhiều ứng dụng ở cả người và động vật.

1.4.1. Ở người

Đứa bé đầu tiên trên thế giới ra đời từ trứng đông lạnh được ghi nhận vào năm 1986. Cho

đến năm 2004, thống kê cho thấy trên thế giới có khoảng 40 bé đông lạnh trứng ra đời và trên

dưới 60 trường hợp thai đang tiến triển. Tỷ lệ thai lâm sàng từ các chu kỳ trứng đông lạnh hiện

còn khá thấp và không ổn định. Người ta ước tính cần phải rã đông khoảng 100 trứng thì mới có

một trường hợp mang thai thành công. Nguyên nhân của thành công thấp có thể là: (1) Cấu trúc

di truyền đặc biệt của trứng, khi các nhiễm sắc thể đang trong giai đoạn phân chia và xếp trên

mặt phẳng xích đạo; (2) Tổn thương của các cấu trúc nội bào do quá trình trữ lạnh-rã đông; (3)

Trứng là một tế bào có kích lớn, với lượng nước bên trong chiếm khá nhiều [26].

Phương pháp đông lạnh trứng thường được sử dụng cho những trường hợp sau: Phụ nữ

còn trẻ hoặc không có bạn tình mà trứng của họ có nguy cơ bị phá hủy nặng nề do chiếu xạ, hóa

trị liệu; Lập ngân hàng trứng hỗ trợ cho các chương trình bệnh nhân không có noãn; Trong những

trường hợp không có tinh trùng để thụ tinh cần lưu trữ trứng; Phụ nữ muốn trì hoãn tuổi sinh đẻ;

Tránh những rắc rối vể mặt luật pháp, tôn giáo của đông lạnh phôi đặc biệt ở những nước mà

đông lạnh phôi không được phép thực hiện [90].

1.4.2. Ở động vật

Bảo quản giao tử cái (trứng) làm cơ sở cho các nghiên cứu, ứng dụng sâu hơn: Dùng cho

các nghiên cứu về IVF để cải thiện hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm; Việc đông lạnh trứng

giúp vận chuyển dễ dàng, hạn chế lây lan dịch bệnh; Thiết lập ngân hàng để lưu trữ nguồn di

truyền của những động vật có nguy cơ tuyệt chủng hay quý hiếm; Trao đổi mua bán dễ dàng, đặc

biệt là những loài có giá trị kinh tế cao [3, 6].

CHƯƠNG II

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NỘI DUNG 1: ĐÔNG LẠNH TRỨNG HEO TRƯỞNG THÀNH BẰNG

PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 1

2.1.1. Thu nhận mẫu buồng trứng

Chuẩn bị

 Hấp vô trùng nước muối sinh lý (0,9%), nước cất, kéo, kẹp

 Bổ sung penicillin (100IU/ml) và streptomycin (0,1mg/ml) vào nước muối sinh lý trước

khi sử dụng, để trong bình giữ ấm khoảng 33 – 35oC.

Tiến hành

Dùng kéo thu nhận buồng trứng ở phía hai bên tử cung ngay khi heo vừa được mổ, rửa

sạch cho vào nước muối sinh lý chuyển nhanh vể phòng thí nghiệm (PTN) trong khoảng 2-3

giờ. Tại PTN, chọn những buồng trứng có các nang nổi đều, kích thước trung bình khoảng 3-

6mm. Loại bỏ mỡ, rửa sạch máu bằng nước muối sinh lý đã bổ sung kháng sinh. Thực hiện

thao tác thu trứng từ buồng trứng trong tủ thao tác 30 – 60 phút.

Hình 2.2: Mẫu buồng trứng heo

2.1.2. Thu nhận và nuôi trứng

Chuẩn bị

Dụng cụ bằng kim loại được rửa sạch và hấp khử trùng ở 1210C, 1atm hơi nước trong 30

phút. Các đĩa petri và đĩa 4 giếng nhựa sử dụng một lần nên chỉ chiếu UV vỏ bọc trong 2 giờ

trước khi sử dụng. Tủ thao tác và kính hiển vi soi nổi được chiếu UV 15 phút trước khi sử dụng, chiếu

xong bật quạt hút 15 phút để hạn chế tác động có hại của tia UV còn sót lại. Chiếu UV vô trùng các

dụng cụ: đèn cồn, găng tay, đầu kim 18G, syringe 5ml, kẹp, kéo, đĩa Pétri, đĩa Φ35, Φ60, đĩa 4

giếng, dung dịch D-PBS, nước muối sinh lý, đầu tip, pipette Pasteur. Kéo pipette Pasteur với

đường kính khoảng 110 – 130µm.

Môi trường thu trứng chuẩn bị trước và ủ ấm ở 38,5oC tối thiểu 2 giờ trước khi sử dụng

(nhưng không quá 20 giờ). Môi trường chuẩn bị để thu trứng theo Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Môi trường chuẩn bị thu trứng

Tên dụng cụ Môi trường Thể tích Mục đích sử dụng

NaCl 0,9% bổ sung kháng Becher 100 ml 200 ml Rửa buồng trứng sinh

Becher 50 ml D-PBS bổ sung kháng sinh 50 ml Thu dịch nang trứng

Đĩa Petri nhựa Φ35 D-PBS 3 ml Thu trứng từ dịch nang trứng

1 giọt IVM1 rửa trứng và 3 Đĩa 4 giếng 120 µl/giọt Rửa trứng + Nuôi trứng giọt IVM1 nuôi trứng

Tiến hành

Vô trùng tay và lau lọ chứa mẫu bằng cồn 70o trước khi thao tác trong tủ vô trùng

 Đốt đèn cồn tạo không gian vô trùng, dùng kẹp gắp mẫu buồng trứng cho vào nước muối

sinh lý đã ủ ấm có bổ sung kháng sinh để rửa sạch. Sau đó gắp buồng trứng để lên miếng gạc nặn

thật sạch máu.

 Dùng kim tiêm 18G gắn vào syringe 5ml hút khoảng 1ml D-PBS có bổ sung kháng sinh,

tiến hành chọc – hút dịch trong các nang có đường kính từ 3 - 6mm, lượng D-PBS này có tác

dụng pha loãng dịch nang trứng và trứng hút được, đồng thời giữ ổn định nhiệt cho trứng thu.

Sau đó chuyển dịch nang trứng vào các đĩa Pétri nhựa (Φ35) và để lắng từ 5-10 phút trong tủ ấm 38,5oC.

 Dùng pipette Pasteur đã kéo gắn vào mouth pipette, soi tìm và phân loại trứng dưới kính

hiển vi đảo ngược hoặc kính hiển vi soi nổi. Trứng được phân loại theo nhóm tác giả Loos và cs

(1989) [43]. Chuyển trứng sang giọt môi trường IVM1 để rửa trứng và chuyển vào các giọt môi

trường nuôi. Sau 22-24 giờ, tiến hành chuyển trứng sang giọt môi trường IVM2 tiếp tục nuôi đến

42 - 44 giờ.

Trong thao tác chọc hút trứng, mặt vát của kim tiêm cần được úp xuống để tránh bỏ sót

trứng vì trứng cùng lớp tế bào hạt bao quanh bám ở đáy nang (phía cuống buồng trứng). Ngoài ra

cần chú ý đặt mũi kim vào vị trí cách nang muốn chọc hút khoảng 3-5 mm rồi từ đó đưa vào nang

Hình 2.3. Thao tác chọc hút trứng từ

Hình 2.4. Soi tìm và thu trứng bằng hệ

buồng trứng

thống kính đảo ngược

trứng và hút trứng ra tránh tình trạng áp suất lớn làm mất trứng.

2.1.3. Đánh giá trứng và lựa chọn trứng chín để đông lạnh

Chuẩn bị enzyme

 Eppendorf chứa Hyaluronidase 1mg/ml được ủ ấm ở 38,5oC trước khi sử dụng 2 giờ.

 Đĩa Petri nhựa Φ35 chứa giọt môi trường IVM1 ủ ấm trước khi sử dụng 2 giờ.

Loại cumulus và quan sát

 Tạo giọt hyaluronidase trên đĩa Petri nhựa

 Sau 42 - 44 giờ nuôi cấy, sử dụng mouth pipette có gắn pipette Pasteur chuyển trứng vào

giọt Hyaluronidase và vortex trong vòng 30 giây để loại bỏ cumulus.

 Các tế bào trứng sau khi loại cumulus gọi là các tế bào trứng trần sẽ được chuyển vào giọt

môi trường IVM1.

 Quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược, đánh giá sự trưởng thành của trứng thông qua: sự

đồng nhất về tế bào chất của trứng và sự xuất hiện thể cực thứ nhất.

 Chỉ những trứng có tế bào chất đồng đều và có thể cực thứ nhất mới được sử dụng cho quá

trình đông lạnh.

2.1.4. Đông lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1)

Chuẩn bị

 Bình nitơ lỏng, cryotube, mouth pipette có gắn pipette Pasteur, hộp xốp chứa nitơ lỏng,

kính hiển vi soi nổi

 Chuẩn bị 2 đĩa Petri nhựa Φ35: Đĩa số 1 chứa 100µl môi trường VS1 (TCM–199 +10%

FBS +10% DMSO +10% EG), đĩa số 2 chứa 300µl môi trường VS2 (TCM–199 10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose). Đặt 2 đĩa ở nhiệt độ phòng (25oC) khoảng

15 phút trước khi sử dụng.

 Rót nitơ lỏng ra hộp xốp, cho cryotube và bông gòn nhúng chìm vào nitơ.

Hình 2.5. Sơ đồ bố trí đĩa vi giọt đông lạnh

Tiến hành

-Sau khi IVM 42 – 44 giờ và đã loại bỏ cumulus, ta chọn những trứng có tế bào chất đồng đều

và có thể cực thứ nhất chuyển vào đĩa số 1 (môi trường VS1) để trong vòng 45 giây. Chuyển

trứng sang đĩa số 2 (môi trường VS2), dùng mouth pipette có gắn pipette Pasteur hút khoảng

5µl tạo vi giọt có chứa 5 – 7 trứng và nhỏ trực tiếp vào hộp xốp chứa nitơ lỏng trong vòng 25

giây. Lần lượt tạo vi giọt đông lạnh tất cả các trứng có được, sau đó dùng kẹp tìm và gắp các

vi giọt cho vào cryotube (lưu ý không bỏ sót vi giọt). Dùng bông nhét kín miệng cryotube và

Hình 2.6. Cách tạo vi giọt đông lạnh

Hình 2.8. Chuyển vi giọt vào cryotube

Hình 2.7. Nhỏ trực tiếp vi giọt vào LN2

nhanh chóng chuyển cryotube vào bình chứa nitơ lỏng để bảo quản.

2.1.5. Phương pháp giải đông các vi giọt được đông lạnh

Chuẩn bị

Chuẩn bị 1 đĩa nhựa Φ35 trống; 1 đĩa 4 giếng: giếng 1 chứa môi trường RĐ1 (TCM–199 +

10% FBS + 0,25M Sucrose), giếng 2 chứa môi trường RĐ2 (TCM–199 + 10% FBS + 0,15M

Sucrose), giếng 3 chứa môi trường RĐ3 (TCM–199 + 10% FBS), giếng 4 chứa môi trường IVM2

(dùng để đánh giá sống chết).

Tiến hành

Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong không khí 5 giây, sau đó cho vào

bể ổn nhiệt 5 giây và chuyển môi trường bên trong cọng rạ vào đĩa nhựa Φ35 trống. Chuyển

trứng sang giếng số 1 của đĩa 4 giếng chứa môi trường RĐ1, giữ khoảng 1,5 phút ở nhiệt độ phòng (25oC). Chuyển trứng qua giếng số 2 chứa môi trường RĐ2, giữ 1,5 phút ở nhiệt độ phòng.

Tiếp tục chuyển trứng vào giếng số 3 chứa môi trường RĐ3, giữ khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Sau cùng chuyển trứng sang giếng số 4 chứa môi trường IVM2, để đánh giá sự sống chết của

Hình 2.9. Thao tác đổ vi giọt ra khỏi cryotube

Hình 2.10. Sơ đồ bố trí đĩa vi giọt rã đông

trứng.

 Lưu ý:

 Mỗi lần chuyển trứng sang các giọt môi trường tương ứng, trứng sẽ bị co lại vì

vậy cần quan sát hình thái của trứng dưới kính hiển vi đảo ngược để không bị

mất mẫu.

 Thao tác nhanh, tránh làm tổn thương trứng

2.1.6. Đông lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2)

Chuẩn bị

Môi trường VS1: TCM–199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG: dùng để cần bằng trứng

Môi trường VS2: TCM–199 +10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose: dùng để bảo

quản trứng ở -196oC

Cọng rạ 0,25ml (imv, Pháp), bình nitơ lỏng

Tiến hành

Sau 22 – 24h nuôi, chọn những trứng chín đem đông lạnh theo phương pháp thủy tinh hóa

(vitrification) 2 bước: Trứng đang giữ trong môi trường C3 sẽ được cân bằng trong môi trường

VS1 (TCM–199 + 10% FBS +10% DMSO + 10% EG) 45 giây, sau đó chuyển qua môi trường

VS2 (TCM–199 +10% FBS + 20% DMSO + 20% EG +1M Sucrose) trong 25 giây. Sau đó

chuyển trứng vào cọng rạ (straw) trong vòng 30 giây.

Cách chuyển trứng vào cọng rạ như sau: hút 1 khoảng môi trường VS2, sau đó hút một

khoảng đệm khí, hút tiếp một đoạn môi trường VS2 rồi dùng mouth pipette chuyển trứng vào (5-7

trứng/cọng rạ), hút thêm khoảng đệm khí, cuối cùng hút thêm một đoạn môi trường VS2 (Hình

2.11) và hàn đầu cọng rạ bằng máy ép nhựa. Đưa thẳng cọng rạ vào bình nitơ lỏng (thao tác

Hình 2.11. Cọng rạ chứa trứng

nhanh).

Giải đông trứng

Trứng được rã đông theo 03 bước. (Xem 2.1.4)

Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong không khí 5 giây, nhúng vào nước ấm 33 – 35oC, dùng bông gòn tẩm cồn lau sạch cọng rạ, dùng kéo cắt một đầu, rồi sau đó cắt đầu

còn lại, chuyển trứng vào đĩa nhựa Φ35 trống.

Dùng mouth pipette và pipette Pasteur hút trứng từ đĩa Φ35 chuyển qua môi trường giải

đông số 1 (RĐ1) trong khoảng 1,5 phút, chuyển trứng sang môi trường RĐ2 (1,5 phút), chuyển

trứng qua môi trường RĐ3 (5 phút) ở nhiệt độ phòng. Sau cùng chuyển trứng vào đĩa chứa môi trường nuôi trứng, để trong tủ nuôi (38,5oC, 5% CO2) khoảng 2-3 tiếng để giúp trứng hồi phục

Hình 2.12. Lấy cọng rạ chứa trứng

Hình 2.13. Giải đông cọng rạ trong nước ấm

ra khỏi bình nitơ lỏng

Hình 2.14. Cắt cọng rạ chứa trứng Hình 2.15. Chuyển trứng vào môi trường RĐ

hoàn toàn trước khi đánh giá sự sống chết của trứng.

2.1.7. Đánh giá tỷ lệ sống chết của trứng

 Trứng sống: màng tế bào còn nguyên vẹn, tế bào chất sáng đều và không bị co, không bị

phân mảnh.

 Trứng chết: màng tế bào bị tổn thương trong quá trình đông lạnh, nên tế bào chất bị co

hoặc phân mảnh, màng tế bào có tể bị gãy.

2.2. NỘI DUNG 2: ĐÔNG LẠNH TRỨNG BÒ TRƯỞNG THÀNH BẰNG PHƯƠNG

Hình 2.16. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2

PHÁP THỦY TINH HÓA TRONG CỌNG RẠ (PP2)

2. 2.1. Thu nhận mẫu buồng trứng

Xem 2.1.1

2.6.2.2. Thu nhận và nuôi trứng

Chuẩn bị

NaCl 0,9%: bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml (P7794, Sigma) và Streptomicin 0,1

mg/ml (S9137, Sigma).

Dung dịch D – PBS: môi trường sử dụng để thu dịch nang trứng. Trước khi sử dụng cần bổ

sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml với Streptomicin 0,1mg/ml và ủ ấm ở 37oC.

Môi trường Flushing (FLUSH 050, FertiPro) (môi trường W2): sử dụng để rửa trứng trước

khi IVM.

TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF (môi trường C3): cần ủ ấm 38,5oC, 5%

CO2 tối thiểu hai giờ trước khi sử dụng.

Parafin lỏng (dầu khoáng) (Merck): dùng phủ vi giọt trong đĩa có tác dụng ngăn sự nhiễm,

tránh làm bốc hơi vi giọt khi để lâu trong tủ ấm, đồng thời cố định và giúp ổn định các vi giọt.

Hyaluronidase (H4272, Sigma): dạng dung dịch được sử dụng để phá các tế bào cumulus

quanh trứng khi đánh giá trứng sau khi IVM.

- Dụng cụ

Đĩa Petri d = 90mm, 60mm (Corning, Mĩ), đĩa 4 giếng (Nunc, Đức), kim 18G, syringe 5ml,

gạc vô trùng, pipette Pasteur kéo đường kính 120µm, mouth pipette, bercher, erlen…

- Thiết bị

Water bath (Memmert, Đức), kính hiển vi soi nổi (độ phóng đại tối đa 40 lần, Nikon, Nhật),

tủ ấm CO2 (Sanyo, Nhật)

 Thu nhận trứng

Thu nhận trứng bằng phương pháp chọc hút (Xem phần 2.1.2)

Việc phân loại trứng dựa vào độ dày của lớp tế bào cumulus; và chia thành 3 loại: A, B và

C. Trong đó, trứng A và B còn lớp cumulus bám vào trứng và trứng C lớp cumulus bị bong một

phần.

 Nuôi trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM)

- Dùng mouth pipette thu những trứng loại A và B (có từ 3 lớp cumulus trở lên) từ đĩa D – để rửa. PBS cho vào các giếng có môi trường W2 và C3

- Sau đó cho khoảng 20 - 30 phức hợp COC (phức hợp trứng và cumulus) vào giếng nuôi

chứa môi trường C3 (loại đĩa 4 giếng chứa 500 l/giếng và phủ dầu khoáng). Nuôi trứng trong tủ ấm ở điều kiện 38,5oC, 5% CO2, hơi nước bão hòa. Lưu ý: Môi trường C3 cần ủ ấm 38,5oC, 5%

CO2 tối thiểu hai giờ trước khi sử dụng.

- Sau 22 - 24h nuôi cấy, đánh giá sự trưởng thành của trứng bằng cách tách bỏ lớp cumulus

bằng mouth pipette và hyaluronidase. Trứng cho là trưởng thành sẽ có 1 thể cực, tế bào chất

sáng, đều, lớp cumulus giãn nở rộng

2. 2.3. Đông lạnh trứng theo phương pháp 2

Xem 2.1.6

2.3. NỘI DUNG 3: ĐÔNG LẠNH TRỨNG BÒ CHƯA TRƯỞNG THÀNH BằNG

PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA

Hình 2.17. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 3

2.3.1. Thu nhận buồng trứng

Xem phần 2.1.1.

2.3.2. Thu nhận trứng

Xem phần 2.2.2 (Không tiến hành nuôi)

2.3.3. Đông lạnh trứng

Đông lạnh trứng theo phương pháp 1 (Xem 2.1.4)

Đông lạnh trứng trong cọng rạ (Xem 2.1.6)

2.3.4. Phương pháp giải đông

Giải đông trứng đông lạnh trong vi giọt (Xem 2.1.5)

Giải đông trứng đông lạnh trong cọng rạ (Xem 2.1.6

2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU

Tất cả số liệu thu được trong nghiên cứu đều được xử lý bằng phần mềm Excel – 2007 với

độ tin cậy 95%. Dùng hàm Descriptive Statistics, t-Test Two- Sample Assuming Equal

Variances, t-Test Two- Sample Assuming Unequal Variances.

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. KẾT QUẢ NỘI DUNG 1

3.1.1. Kết quả thu nhận trứng

Trứng heo được thu nhận bằng phương pháp chọc hút (Hình 3.1), kết quả thể hiện ở Bảng

Hình 3.1. Trứng heo được thu nhận từ buồng trứng (X100)

Bảng 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo

3.1. và Biểu đồ 3.1.

Số buồng Tổng Số Số đợt TN Loại A Loại B trứng trứng trứng/buồng

41,68 ± 27,37 ±

0,69% 0,69% 10 80 1733 21,66 ± 0,27

(723 trứng) (474 trứng)

α < 0,05

Loại A

Loại B

Loại C

34.95%

41.68%

23.37%

Biểu đồ 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo từ buồng trứng

Tiến hành chọc hút 80 buồng trứng, thu được 1733 trứng các loại, như vậy trung bình thu

được 21,66 trứng/buồng. Trong đó những trứng được chọn nuôi là các trứng loại A chiếm tới

41,68% (723 trứng) và loại B đạt 23,37% (474 trứng), còn lại 34,95% (536 trứng) là trứng loại C.

Ở đây tỷ lệ trứng loại C khá cao vì thông thường lớp cumulus bao quanh trứng heo rất lỏng lẻo,

dễ bị bong ra nếu dùng lực hút và đẩy mạnh. Chính vì vậy, thao tác thu nhận trứng đòi hỏi phải

điều chỉnh lực đẩy của xi lanh để hạn chế trứng xấu. Bên cạnh đó, vì nguồn mẫu buồng trứng thu

nhận từ lò mổ nên có thể chất lượng mẫu không đảm bảo sự tương đồng về các chỉ tiêu cần thiết:

tuổi buồng trứng, chất lượng buồng trứng, kích thước nang trứng…

3.1.2. Kết quả nuôi trứng trong ống nghiệm (IVM)

Những trứng loại A và B đem nuôi cấy qua 2 môi trường VM1 và VM2 như đã trình bày ở

trên. Sau 44 giờ, thu và vortex trứng bằng hyaluronidase 0,1% để loại cumulus nhằm quan sát thể

Hình 3.2. Trứng heo với sự xuất hiện thể cực thứ nhất

Bảng 3.2. Kết quả nuôi trứng heo

cực (Hình 3.2). Thí nghiệm được tiến hành 10 đợt, kết quả ghi nhận ở Bảng 3.2. và Biểu đồ 3.2.

Số đợt TN Số trứng đem nuôi Tỷ lệ trứng chín

65,42 ± 0,79% 10 1189 (779 Trứng)

Trứng chín

Trứng chưa chín và chết

34.58%

65.42%

Biểu đồ 3.2. Kết quả nuôi trứng heo

α < 0,05

Sau 10 lần thí nghiệm, tổng số đã chọn được 1189 trứng tốt dùng để nuôi. Sau 44 – 48 giờ

nuôi cấy, có 779/1189 trứng chín, đạt tỷ lệ trung bình 65,42 ± 0,79%. Tỷ lệ này khá cao so với

tác giả Huỳnh Thị Lệ Duyên (2004) chỉ đạt 18,3%. Đồng thời khi so sánh với một số kết quả

được công bố trên thế giới thì thấy kết quả IVM trứng heo của chúng tôi cũng không có sự cách

biệt mấy: Abeydeera Lalantha R. và cs. (1998, 80 – 85%); Kazuhiro và cs. (1999) là 68%;

Yamauchi và cs. (1999, 60 - 70%); Marques và cs. (2006) là 65%; Maedomari (2007, 64,5%).

Tuy nhiên, kết quả này thấp so với các tác giả khác trên thế giới như: Iwamoto (2005, 73,00%).

Tỷ lệ trứng chín thấp hơn như thế là do các nguyên nhân sau:

- Địa điểm lấy mẫu nằm cách xa phòng thí nghiệm và thu mẫu vào đêm khuya (24giờ) nên

thời gian vận chuyển mẫu về nơi xử lý khá lâu. Bên cạnh đó, dụng cụ ổn nhiệt trong quá trình thu

mẫu do được tự chế nên không đảm bảo hệ thống ổn nhiệt trong quá trình vận chuyển mẫu. Hai

yếu tố này ảnh hưởng gián tiếp đến tỷ lệ sống, chết và sự trưởng thành của trứng trong quá trình

nuôi cấy.

- Mẫu buồng trứng thu nhận từ lò mổ nên không biết rõ độ tuổi, yếu tố di truyền của con

giống. Các trứng thu nhận từ buồng trứng có thể ở nhiều giai đoạn khác nhau của sự phát triển

nên khả năng trưởng thành của trứng diễn ra không đồng thời tại một thời điểm.

- Thao tác thu nhận trứng bằng phương pháp chọc hút cũng tác động không tốt đến trứng vì

chọc hút bằng kim 18G gây áp lực hút quá mạnh làm mất tính liên kết của phức hợp trứng –

cumulus (Cumulus – Oocyte Complex_COC) ảnh hưởng khả năng trưởng thành của trứng. Thao

tác chuyển trứng bằng hệ thống mouth pipette và pipette Pasteur còn chậm làm cho trứng phải

tiếp xúc trực tiếp với các điều kiện bất lợi của môi trường như nhiệt độ, ánh sáng trong khoảng

thời gian dài. Chính các lý do này cũng góp phần vào việc ảnh hưởng đến tỷ lệ trưởng thành của

trứng.

- Bên cạnh đó, do điều kiện phòng thí nghiệm không cho phép, kết quả là thời gian thực

hiện IVM quá lâu nên trứng một phần nào bị thoái hóa. Ngoài ra, chính tác nhân enzyme

hyaluronidase, tác động cơ học bằng máy vortex và việc hút rửa loại cumulus và enzyme bằng

pipette Pasteur đã tác động xấu đến trứng vì màng tế bào động vật rất mỏng manh, đặc biệt là

màng tế bào trứng.

3.1.3. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP1

Sử dụng số trứng metaphase II có xuất hiện thể cực đã thu nhận được từ các thí nghiệm

trên, tiến hành quy trình đông lạnh và giải đông theo trình tự các bước; ghi nhận kết quả trong

Bảng 3.3. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP1

Bảng 3.3.

Tỷ lệ Tỷ lệ Số trứng Tỷ lệ thu Số đợt TN Số vi giọt sống/thu sống/số đem ĐL hồi hồi trứng ĐL

68,25 ± 46,15 ± 29,92 ± 6,81% 5,63% 8 43 305 2,82% (216 trứng) (91 trứng)

α < 0,05

 Tỷ lệ thu hồi

Tiến hành 8 đợt thí nghiệm với tổng số trứng đem đông lạnh là 305 trứng. Tỷ lệ trứng thu

hồi sau giải đông đạt 68,25 ± 6,81%. Có tới 31,75% trứng bị thất thoát trong quá trình giải đông

(Biểu đồ 3.3). Điều này có thể được lý giải như sau:

Tỷ lệ trứng thu hồi sau giải đông

Tỷ lệ trứng thất thoát

31.75%

68.25%

Biểu đồ 3.3. Kết quả thu hồi trứng heo từ đông lạnh theo PP1

- Vi giọt đông lạnh có thể tích rất nhỏ và hơi lạnh của nitơ làm hạn chế tầm nhìn nên dẫn

đến việc rất dễ sót một số vi giọt có chứa trứng trong hộp đựng nitơ lỏng. Chính điều này làm cho

khả năng bỏ sót trứng trong quá trình thu nhận vi giọt vào cryotube rất cao.

- Môi trường thủy tinh hóa VS1 và VS2 có nồng độ các chất bảo quản cao dần làm cho hai

dung dịch này có độ nhớt đặc trưng, đặc biệt là môi trường VS2. Việc này gây khó khăn cho quá

trình thu nhận trứng vì chiết suất của môi trường thay đổi liên tục làm cho việc quan sát trứng

dưới kính hiển vi rất khó kiểm soát. Bên cạnh đó, giới hạn về thời gian xử lý trứng trong các môi

trường thủy tinh hóa rất ngắn (45 giây trong VS1 và 25 giây trong VS2) nên việc bỏ sót trứng là

không thể tránh khỏi.

- Chất bảo quản đông lạnh có tính thấm cao có thể gây ra sự thay đổi lớn về thể tích tế bào

trong suốt quá trình đông lạnh và giải đông. Bên cạnh đó, môi trường ngoại bào sẽ trở nên ưu

trương hơn bởi vì nồng độ chất tan tăng lên so với nồng độ môi trường nội bào. Vì thế nước sẽ

rời khỏi tế bào và kết quả là tế bào co lại. Đây chính là lý do trứng thường bị mất ở môi trường

thủy tinh hóa trong khi thao tác.

- Tương tự khi thu hồi trứng từ vi giọt đông lạnh trong môi trường VS2 khả năng bỏ sót

trứng là rất cao. Ngoài ra, vi giọt chứa trứng cũng thường bị sót lại trong cryotube. Hơn nữa, thao

tác giải đông chậm còn làm cho vi giọt tan ra trong cryotube gây khó khăn cho việc thu nhận

trứng và làm thất thoát một số lượng trứng không nhỏ.

 Tỷ lệ sống chết

Từ số trứng thu hồi được sau giải đông, chúng tôi tiến hành đánh giá tỷ lệ sống chết bằng

cách quan sát hình thái.

Hình 3.3. Trứng sống

Hình 3.4. Trứng có tế bào chất phân mảnh

Hình 3.5. Trứng chết do tế bào chất co lại

Tỷ lệ trứng sống sau giải đông

Tỷ lệ trứng chết

46.15%

53.85%

Biểu đồ 3. 4. Tỷ lệ sống, chết của trứng heo so với tổng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP1

Tỷ lệ trứng sống khi quan sát hình thái của tất cả các thí nghiệm còn thấp (46,15%) so với

các công trình nghiên cứu trên thế giới đã được công bố trong thời gian gần đây. Năm 2004,

Fujihira thực hiện quy trình đông lạnh và giải đông trứng heo bằng phương pháp thủy tinh hóa sử

dụng Cryotop, với nồng độ ethylene glycol (EG) trong dung dịch thủy tinh hóa là 30%, thu được tỷ lệ sống sau giải đông là 54 – 56%. Năm 2006, nhóm tác giả Gupta, Uhm và Lee - thực hiện

đông lạnh trứng heo trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa sử dụng bề mặt rắn (Solid

Surface Vitrification_SSV) có xử lý với cytochalasin B, thu đuợc tỷ lệ sống về mặt hình thái sau

giải đông hơn 60%. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chưa cao, điều này có thể giải thích như

sau:

 Chất lượng trứng nuôi chín không ổn định ở các lần thí nghiệm như đã trình bày ở trên.

 Ảnh hưởng của enzyme hyaluronidase trong quá trình vortex loại bỏ cumulus và thời gian

vortex quá mức cũng phần nào tác động đến tính toàn vẹn của màng tế bào chất.

 Phương pháp thủy tinh hóa đòi hỏi sự chính xác về thời gian, trứng chỉ tiếp xúc với các

dung dịch thủy tinh hóa trong vòng vài giây (45 giây trong VS1 và 25 giây trong VS2). Bên cạnh

đó, thao tác đông lạnh và giải đông bằng vi giọt còn khá mới, điều làm cho thời gian chuyển

trứng giữa các môi trường không đảm bảo gây ảnh hưởng không tốt đến khả năng sống của

trứng. Sự khử nước bên trong tế bào trứng xảy ra trong suốt quá trình đông lạnh rất cần cho khả

năng sống của trứng sau giải đông. Tế bào trứng hình cầu nên tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích

của trứng thấp dẫn đến lượng nước mất không hoàn toàn trong quá trình khử nước. Sử dụng

phương pháp thủy tinh hóa tránh được sự hình thành tinh thể đá nội bào nhờ thay đổi thành phần

nội bào từ pha lỏng sang pha rắn như thủy tinh, xảy ra một cách nhanh chóng. Nhưng do kỹ thuật

thao tác, thời gian xử lý trứng trong dung dịch thủy tinh hóa chưa chuẩn xác dẫn đến việc thực

hiện khâu khử nước trong môi trường VS chưa đạt, nên vẫn còn sự xuất hiện tinh thể đá bên

trong tế bào, gây đứt gãy ở màng tế bào chất và kết quả là tế bào trứng chết. Trường hợp thời

gian xử lý trứng trong dung dịch thủy tinh hóa quá lâu thì nồng độ quá cao của các chất bảo quản

cũng có khả năng gây độc và ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của trứng.

 Quy trình đông lạnh thường đòi hỏi tế bào tiếp xúc với một hay nhiều chất bảo quản đông

lạnh với nồng độ cao, nồng độ các chất này đặc biệt cao ở phương pháp thủy tinh hóa. Việc thêm

chất bảo quản đông lạnh với nồng độ cao sẽ làm dung dịch ngoại bào ưu trương hơn nhiều. Kết

quả là khi tế bào tiếp xúc với dung dịch này, sẽ có khuynh hướng lệch thể tích, có thể làm tổn hại

đến màng và ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào.

 Sự hiện diện dày đặc của các giọt lipid bên trong bào tương trứng heo là trở ngại rất lớn

cho việc đông lạnh trứng heo vì lipid làm giảm khả năng chống chịu lạnh của trứng và gây tổn

thương màng tế bào khi hạ nhiệt độ.

Bảng 3.4. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP2

3.1.4. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP2

47,54 ±

80,70 ±

38,39 ±

0,60%

1,55%

10

71

386

1,02%

(149 trứng)

(313 trứng)

α < 0,05

Tỷ lệ Tỷ lệ Số trứng Tỷ lệ thu Số đợt TN Số cọng rạ sống/thu sống/số đem ĐL hồi hồi trứng ĐL

Tỷ lệ thu hồi trứng heo sau giải đông

Tỷ lệ trứng thất thoát và chết

19.30%

80.70%

Biểu đồ 3.5. Kết quả thu hồi trứng từ đông lạnh theo PP2

Thí nghiệm được tiến hành 10 đợt với 386 trứng bảo quản trong 71 cọng rạ bằng PP2, sau

khi giải đông thu lại được 313 trứng (80,70%). Như vậy tỷ lệ thu hồi khá cao, tuy nhiên vẫn còn

gần 20% lượng trứng bị thất thoát trong quá trình thí nghiệm (Biểu đồ 3.5). Chính điều này cũng

Tỷ lệ trứng sống/thu hồi

Tỷ lệ trứng chết

47.54%

52.46%

Biểu đồ 3. 6. Tỷ lệ sống, chết của trứng heo so với tổng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP2

ảnh hưởng phần nào đến tỷ lệ sống của trứng sau giải đông.

Tỷ lệ trứng sống sau giải đông trên tổng số trứng thu hồi được chỉ đạt 47,54% (149/313

trứng). Nếu tính theo tổng số trứng đem đông lạnh thì kết tỷ lệ sống của trứng sau giải đông còn

thấp hơn nhiều, chỉ đạt 38,39%. Kết quả này cao hơn kết quả của nhóm tác giả Wu Caihong và

cs. (2006, 41,9%). Tuy nhiên, kết quả này cũng thấp hơn so với các kết quả đã được công bố trên

thế giới: Gupta và cs (2006; trên 60%); Somfai và cs (2008, 98,6%). Riêng ở Việt Nam cho đến

nay chưa có công trình nào công bố kết quả đông lạnh trứng heo. Chính vì vậy, kết quả của

chúng tôi đã bước đầu khẳng định về sự thành công trong bảo quản trứng heo.

3.1.5. Kết quả so sánh giữa 2 phương pháp thủy tinh hóa trứng heo

Bảng 3.5. So sánh kết quả đông lạnh trứng heo

Phương Số trứng Tỷ lệ sống/thu Tỷ lệ sống/số pháp thủy Tỷ lệ thu hồi đem ĐL hồi trứng ĐL tinh hóa

305 68,25 ± 6,81% 46,15 ± 5,63% 29,92 ± 2,82% Vi giọt

386 80,70 ± 1,55% 47,54 ± 0,60% 38,39 ± 1,02% Cọng rạ

PP1

PP2

80.70%

68.25%

47.54%

46.15%

ệ l ỷ T

38.39%

29.92%

90.00% 80.00% 70.00% 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00%

Tỷ lệ thu hồi

Tỷ lệ trứng sống/thu hồi

Tỷ lệ trứng sống/số trứng ĐL

Chỉ tiêu so sánh

Biểu đồ 3.7. Kết quả so sánh bảo quản trứng heo theo 2 phương pháp

α < 0,05 α > 0,05 α < 0,05 Mức ý nghĩa

Từ Bảng 3.5 vả Biểu đồ 3.7. cho thấy việc bảo quản trứng heo trưởng thành bằng PP2 có

tỷ lệ thu hồi cao hơn PP1, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (α < 0,05). Tỷ lệ trứng

sống sau giải đông so với số lượng trứng thu hồi ở cả 2 phương pháp bảo quản không có sự khác

biệt về mặt thống kê (α > 0,05). Tuy nhiên, khi xét theo tổng số trứng đem đông lạnh, thì tỷ lệ

trứng sống theo bảo quản PP2 cao hơn PP1 và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (α <

0,05). Như vậy, ta có thể chọn một trong hai phương pháp bảo quản trên để bảo quản trứng heo

trưởng thành; đồng thời cần tiến hành nghiên cứu thêm các phương pháp bảo quản khác để tìm ra

3.2. KẾT QUẢ NỘI DUNG 2

phương pháp tốt nhất.

3.2.1. Kết quả thu nhận trứng

Hình 3.6. Trứng bò thu nhận từ dịch nang trứng theo phương pháp chọc hút (X40)

Bảng 3.6. Kết quả thu nhận trứng bò

Số buồng Tổng Số Số đợt TN Loại A Loại B trứng trứng trứng/buồng

18,94 ± 56,51 ±

0,35% 1,58% 9 50 909 18,55 ± 1,12

(512 trứng) (172 trứng)

α < 0,05

Qua 9 lần thực hiện, tổng cộng có 50 buồng trứng với tổng số trứng thu được là 909 trứng,

lượng trứng trung bình trên một buồng là 18,55 ± 1,22 trứng. Kết quả này cao hơn các nghiên

cứu của Iwasaki và cs., 1987 (14,0); Lonergan và cs., 1991 (9,7).; Nguyễn Thị Ước và cs., 1999

(9,4); Nguyễn Văn Lý và cs., 2006 (14,41). Như vậy, kết quả thu được là khá cao so với một số

kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước. Tuy nhiên, kết quả này chưa cao như nghiên cứu của

Pavlok và cs. 1991 (25,87 trứng). Theo báo cáo của thế giới, số trứng thu nhận từ phương pháp

chọc hút có thể lên đến 30 trứng/buồng trứng. Kết quả của chúng tôi chưa thể đạt được như vậy

có thể do thao tác chọc-hút trong điều kiện ánh sáng hạn chế dẫn đến việc chọc sót nang trứng

chất lượng trứng, cũng như sót trứng trong quá trình soi tìm.

Sau khi tiến hành 9 đợt thí nghiệm, phân loại trên tổng số 909 trứng với kết quả như sau:

Trứng loại A có 512 trứng chiếm tỷ lệ 56,51%; trứng loại B có 172 trứng chiếm tỷ lệ 18,94%;

còn lại 225 trứng loại C chiếm 24,55%. Trứng loại A thu được cao gần gấp 3 lần trứng loại B và

gấp 2 lần trứng loại C (Biểu đồ 3.8).

Trứng loại A

Trứng loại B

Trứng loại C

24.55%

56.51%

18.94%

Biểu đồ 3.8. Kết quả thu nhận trứng bò từ mẫu buồng trứng

Tỷ lệ trứng loại A thu được cao hơn so với kết quả của Nguyễn Văn Lý và cs. năm 2003

(41,30%); của Hamano và Kuwayama năm 1993 (40,80%). Tuy nhiên, kết quả thu được vẫn còn

thấp hơn nhiều so với tỷ lệ 90% trong nghiên cứu của Iwasaki và cs. (1987) khi thu nhận trứng từ

nguồn siêu âm. Tỷ lệ trứng loại C thấp hơn kết quả của Nguyễn Văn Lý năm 2006 (28,56%).

Trong số 909 trứng được phân loại thì những trứng có khả năng dùng cho IVM là trứng loại

A và B với tổng số 684 trứng chiếm tỷ lệ 84,92%. Kết quả này cũng cao hơn nghiên cứu của

Nguyễn Văn Lý năm 2006 (76,44%). Điều này cho thấy thao tác chọc-hút trong quá trình thí

nghiệm là khá chuẩn, khi thực hiện thao tác chọc-hút nang trứng dùng lực vừa đủ để hạn chế tối

đa ảnh hưởng đến lớp cumulus. Song, để có thể tiếp tục nâng cao hơn nữa tỷ lệ trứng đem nuôi

thì cần khắc phục một số hạn chế sau:

 Nâng cao chất lượng nguồn mẫu: Đa số các bò cái giết mổ là những bò cái thải loại,

bò già hay bò có sức sinh sản yếu. Các buồng trứng thu được đôi khi có kích thước nhỏ,

không có hình dạng xác định, có thể vàng tồn lưu. Chất lượng buồng trứng ảnh hưởng đến

các kết quả IVM cũng như IVF.

 Thao tác thu trứng: Phương pháp chọc-hút cho phép thu được số lượng trứng nhiều,

nhanh; do đó làm tăng khả năng thành công khi tiến hành IVM nhờ hạn chế được các ảnh

hưởng bất lợi của môi trường: nhiệt độ, khả năng nhiễm khuẩn, ánh sáng, hàm lượng khí…

Tuy nhiên, chọc-hút có thể làm phá vỡ liên kết của COC, ảnh hưởng xấu đến hiệu quả

IVM. Chính vì vậy, thao tác nhẹ, nhanh với lực vừa đủ sẽ quyết định kết quả thu trứng.

3.2.2. Kết quả nuôi trứng bò

Chọn các trứng loại A và B đem nuôi trong môi trường C2 ở 38,5oC, 5% CO2. Sau 22-24

giờ nuôi, dựa trên độ giãn nở của lớp cumulus và sự xuất hiện thể cực thứ I để đánh giá sự trưởng

thành của trứng (Hình 3.7 và 3.8). Kết quả ghi nhận ở Bảng 3.7. và Biểu đồ 3.9.

Hình 3.7. Trứng bò sau khi IVM có

Hình 3.8. Trứng bò sau khi IVM

lớp cumulus giãn nở (X100)

xuất hiện thể cực I (X400)

Bảng 3.7. Kết quả nuôi trứng bò

Số đợt TN Số trứng đem nuôi Tỷ lệ trứng chín

84,92 ± 0,63% 9 684 (580 trứng)

Tỷ lệ trứng chín

Tỷ lệ trứng chưa chín và chết

15.08%

84.92%

Biểu đồ 3.9. Kết quả nuôi trứng bò

α < 0,05

Có tổng cộng 684 trứng đem nuôi, tỷ lệ trứng trưởng thành thu được là 84,92%. Kết quả

này cao hơn công bố của tác giả Ocana-Quero và cs. (1998; 70,1%); Nguyễn Thị Ước và cs.

(2003; 65,61%); của Nguyễn Hữu Đức và cs. (2003; 76,83%); của Nguyễn Văn Lý (2006;

76,83%). Kết quả này không khác biệt so với nghiên cứu của tác giả Edwards J. L. và cs. (2005;

83,9%). Tuy nhiên, kết quả thu được lại thấp hơn các công trình đã được công bố: Saeki K. và cs.

cs. 2003; Bols và cs. 2004, Pereira và cs. 2005, Rizos và cs. 2005, Park và cs. 2005 có tỷ

(1994; 90%); Lonergan Pat và cs. (1996; 87 – 96%); các tác giả Duque và cs. 2003, Avery và

lệ nuôi trứng chín đạt từ 70 – 90%. Như vậy, kết quả IVM trứng bò của thí nghiệm chúng

tôi cũng khá cao. Kết quả này một lần nữa khẳng định thao tác và kỹ thuật của nhóm nghiên cứu

nâng cao dần.

3.2.3. Kết quả đông lạnh trứng bò

Các trứng được cho là trưởng thành sau khi IVM dựa vào độ giãn nở của cumulus được

đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng ra theo 2 bước. Sau khi giải đông, tỷ lệ

Hình 3.9. Trứng sống sau giải đông (X100)

Hình 3.10. Trứng chết sau giải đông (X100)

Bảng 3.8. Kết quả đông lạnh trứng bò chín bằng PP2

sống chết được đánh giá theo hình thái (Hình 3.9 và 3.10), kết quả thể hiện ở Bảng 3.8.

Tỷ lệ Tỷ lệ Số trứng Tỷ lệ thu Số đợt TN Số cọng rạ sống/thu sống/số đem ĐL hồi hồi trứng ĐL

84,43 ± 79,90 ± 67,73 ± 1,84% 2,33% 9 36 197 3,18% (166 trứng) (133 trứng)

α < 0,05

Tỷ lệ trứng bò thu hồi sau giải đông

Tỷ lệ trứng thất thoát

15.57%

84.43%

Biểu đồ 3.10. Kết quả thu hồi trứng bò chín sau giải đông

Kết quả ghi nhận ở Bảng 3.8 có thể thấy số lượng trứng thu được sau giải đông đạt tỷ lệ

84,43 ± 1,84% (166/197 trứng), điều này cho phép khẳng định khả rằng sau khi đông lạnh, khả

năng thu hồi lại được số lượng trứng là khá cao. Tỷ lệ trung bình trứng sống so với tổng số trứng

thu được sau giải đông là 79,90 ± 2,33% (Biểu đồ 3.11); và so với tổng số trứng được đông lạnh

chỉ đạt 67,73%. Kết quả này còn thấp hơn nhiều so với kết quả của Otoi và cs. (1998; 85%);

Chian và cs. (2004) dùng chất bảo quản lạnh là 15% EG kết hợp với 15% DMSO, và khi dùng

15% EG kết hợp với 15% PG cho tỷ lệ trứng sống sau giải đông tới 92%; Marató (2008; 82,4%

khi dùng OPS và 91,00% khi dùng cryotop)… Riêng ở nước ta, cho đến thời điểm này chỉ mới có

công trình của Nguyễn Thị Thương Huyền và cs. công bố về đông lạnh trứng bò với tỷ lệ trứng

sống so với tổng số trứng đem đông lạnh sau giải đông là 58,83%. Như vậy, tỷ lệ trứng sống sau

Tỷ lệ trứng sống

Tỷ lệ trứng chết

20.10%

79.90%

Biểu đồ 3.11. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP2

giải đông khi sử dụng trong thí nghiệm của chúng tôi dựa vào hình thái là có thể chấp nhận được.

3.3. KẾT QUẢ NỘI DUNG 3

Bảng 3.9. Kết quả đông lạnh trứng bò bằng PP1

3.3.1. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP1

Tỷ lệ Tỷ lệ Số trứng Tỷ lệ thu Số đợt TN Số vi giọt sống/thu sống/số đem ĐL hồi hồi trứng ĐL

71,92 ± 74,34 ± 53,70 ± 1,83% 2,20% 8 68 477 2,80% (354 trứng) (255 trứng)

Tỷ lệ trứng thu hồi sau giải đông

Tỷ lệ trứng chết và thất thoát

25.66%

74.34%

Biểu đồ 3.12. Kết quả thu hồi trứng chưa chín được bảo quản theo PP1

α < 0,05

Sau 8 đợt thí nghiệm, trứng thu được sau rã đông (354/477) đạt tỷ lệ 74,34% ± 1,83; kết

quả này thấp hơn một số công trình đã công bố ở nước ngoài: 83,33% (Abdel Mohsen M.

Hammam và cs., 2005); 99,30% (Vahida Anchamparuthy và cs., 2007). Như vậy, trong nghiên

cứu của chúng tôi, có tới 25,66% trứng bị thất thoát sau rã đông (Biểu đồ 3.12). Lý giải cho điều

này cũng giống như ở phần đông lạnh trứng heo trưởng thành bằng phương pháp vi giọt: chủ yếu

do hơi nitơ che tầm nhìn làm sót các vi giọt. Tuy nhiên, hiện chưa có công trình nào trong nước

công bố về tỷ lệ thu nhận trứng bò sau bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt.

Do đó, kết quả bước đầu chúng tôi đạt được có thể chấp nhận.

Tỷ lệ trứng sống

Tỷ lệ trứng chết

28.08%

71.92%

Biểu đồ 3.13. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tổng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP1

Trứng sống sau rã đông (255/354) đạt tỷ lệ 71,92% ± 2,20% (Biểu đồ 3.13), kết quả này

cao hơn công bố của Hurtt và cs. năm 2000 với tỷ lệ trứng sống 46%. Tuy nhiên, nhóm tác giả

Hurtt và cs. đánh giá tỷ lệ sống của trứng bằng phương pháp nhuộm Hoechst 33342 trong khi

nhóm chúng tôi đánh giá bằng quan sát hình thái. Khi so sánh tiếp với công bố của Vahida

Anchamparuthy và cs. (2007; 98,9%); Dong-Hoon Kim và cs. (2007; 84%) thì rõ ràng kết quả

của chúng tôi thấp hơn nhiều.

Bảng 3.10. Kết quả đông lạnh trứng bò bằng PP2

3.3.2. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP2

Tỷ lệ Tỷ lệ Số trứng Tỷ lệ thu Số đợt TN Số cọng rạ sống/thu sống/số đem ĐL hồi hồi trứng ĐL

65,31 ± 71,72 ± 47,16 ± 3,10% 2,69% 7 70 365 3,61% (262 trứng) (172 trứng)

α < 0,05

Tỷ lệ trứng thu hồi sau giải đông

Tỷ lệ trứng thất thoát

28.28%

71.72%

Biểu đồ 3.14. Kết quả thu hồi trứng chưa chín được bảo quản theo PP2

Sau 7 đợt thí nghiệm, đã tiến hành đông lạnh được 365 trứng nhưng chỉ thu được 262 sau rã

đông đạt tỷ lệ 71,72% ± 3,10. Kết quả này cũng thấp hơn một số công trình đã công bố ở nước

ngoài: Abdel Mohsen M. Hammam và cs. (2005; 83,33%); Vahida Anchamparuthy và cs. (2007;

99,30%). Qua đây, ta thấy tỷ lệ trứng thất thoát trong quá trình giải đông tới 28,28% (Biểu đồ

3.14).

Qua quá trình tiến hành thủy tinh hóa trứng trong cọng rạ, chúng tôi nhận thấy trứng mất chủ

yếu ở giai đoạn rã đông: ngay khi lấy cọng rạ ra khỏi bình nitơ lỏng, một số cọng rạ thường bị nổ

do thay đổi nhiệt độ một cách đột ngột. Lúc đó, toàn bộ trứng trong cọng rạ không thể thu hồi

được. Ngoài ra, khi cắt cọng rạ để chuyển môi trường chứa trứng ra đĩa thu thường có hiện tượng

bọt khí tạo ra rất nhiều, chính yếu tố này làm cản trở phần nào việc tìm và thu nhận trứng. Đây là

Tỷ lệ trứng sống/thu hồi

Tỷ lệ trứng chết

34.69%

65.31%

Biểu đồ 3.15. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tổng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP2

khó khăn về kỹ thuật mà chúng tôi cần khắc phục.

Trứng sống sau rã đông qua các đợt thí nghiệm là 172/262 trứng, đạt tỷ lệ 65,31% ± 2,69;

kết quả này cũng thấp hơn công bố của Vahida Anchamparuthy và cs. (2007; 98,9%); Dong-

Hoon Kim và cs. (2007; 84%). Cũng tương tự như phương pháp thủy tinh hóa vi giọt, số trứng

chết nhiều sau đông lạnh ở phương pháp này (34,69%) do một số nguyên nhân: chất lượng trứng

không tốt, kỹ thuật tiến hành chưa chuẩn, môi trường chưa đạt yêu cầu về các thông số pH, nồng

độ…

3.3.3. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành theo 2 phương pháp thủy tinh

Bảng 3.11. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành

hóa

Phương Số trứng Tỷ lệ sống/thu Tỷ lệ sống/số pháp thủy Tỷ lệ thu hồi đem ĐL hồi trứng ĐL tinh hóa

477 74,34 ± 1,83% 71,92 ± 2,20% 53,70 ± 2,80% PP1

365 71,72 ± 3,10% 65,31 ± 2,69% 47,16 ± 3,61% PP2

PP1

PP2

ệ

l

74.34%

80.00%

71.92%

71.72%

ỷ T

65.31%

70.00%

53.70%

60.00%

47.16%

50.00%

40.00%

30.00%

20.00%

10.00%

0.00%

Tỷ lệ thu hồi

Tỷ lệ trứng sống/thu hồi

Tỷ lệ trứng sống/số trứng ĐL

Chỉ tiêu so sánh

Biểu đồ 3.16. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành

α > 0,05 α < 0,05 α > 0,05 Mức ý nghĩa

Kết quả Bảng 3.11. và Biểu đồ 3.16 cho thấy thấy:

- Tỷ lệ trứng thu được sau rã đông giữa hai phương pháp không có sự khác biệt về thống kê (α

> 0,05). Như vậy, cả hai phương pháp đều có nguy cơ mất trứng sau rã đông như nhau.

Nguyên nhân gây mất trứng ở mỗi phương pháp đã được phân tích ở phần trên.

- Tỷ lệ trứng sống sau rã đông ở hai phương pháp có khác biệt về mặt thống kê (α < 0,05). Điều

này chứng tỏ thủy tinh hóa trong vi giọt có tỷ lệ trứng sống sau rã đông cao hơn thủy tinh hóa

trong cọng rạ. Kết quả chúng tôi thu được phù hợp với lý thuyết: đông lạnh vi giọt có tốc độ

làm lạnh cực nhanh do môi trường chứa trứng tiếp xúc trực tiếp với LN2, sự thủy tinh hóa

diễn ra hoàn toàn nên tránh hình thành tinh thể đá nội và ngoại bào gây tổn thương đến trứng.

Trong khi đó, cọng rạ giữ trứng đã tạo một lớp cách nhiệt khi nhúng mẫu vào LN2, giảm phần

nào tốc độ làm lạnh mẫu, sự thủy tinh hóa có thể không hoàn toàn gây ảnh hưởng đến trứng

nhiều hơn [Dinnyes, 2006].

3.4. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn bằng phương pháp thủy tinh hóa

Bảng 3.12. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn khác nhau

trong cọng rạ

Giai đoạn Số trứng Tỷ lệ sống/thu Tỷ lệ sống/số trứng đem Tỷ lệ thu hồi đem ĐL hồi trứng ĐL ĐL

197 84,43 ± 1,84% 79,90 ± 2,33% 67,73 ± 3,18% Chín

71,72 ± 3,10% 65,31 ± 2,69% 47,16 ± 3,61% 365 Chưa chín

Chín

Chưa chín

84.43%

79.90%

71.72%

67.73%

65.31%

47.16%

ệ

l

ỷ T

90.00% 80.00% 70.00% 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00%

Tỷ lệ thu hồi

Tỷ lệ trứng sống/thu hồi

Tỷ lệ trứng sống/số trứng ĐL

Chỉ tiêu so sánh

Biểu đồ 3.17. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn khác nhau

α < 0,05 α < 0,05 α < 0,05 Mức ý nghĩa

Từ Bảng 3.12 và Biểu đồ 3.17 cho thấy việc bảo quản trứng bò đã được IVM cho kết quả

tốt hơn trứng bò ở giai đoạn túi mầm (chưa chín), tất cả sự khác biệt này đều có ý nghĩa về mặt

thống kê (α < 0,05). Theo báo cáo của các nghiên cứu trên thế giới cho rằng bảo quản trứng ở

giai đoạn túi mầm sẽ hạn chế sự tổn thương về thoi vô sắc của trứng, từ đó làm tăng khả năng

sống của trứng về sau. Như vậy, kết quả của chúng tôi thu được chưa cao như các nghiên cứu của

thế giới, song điều này đã khẳng định được phần nào sự thành công bước đầu trong lĩnh vực bảo

quản trứng ở cả hai giai đoạn. Tuy nhiên, cần tiến hành khảo sát thêm các protocol bảo quản khác

để chọn ra được protocol hiệu quả nhất trong điều kiện cho phép.

Bảng 3.13. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò, heo trưởng thành bằng PP2

3.5. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò và heo đã trưởng thành bằng PP2

Đối tượng Số trứng Tỷ lệ sống/thu Tỷ lệ sống/số Tỷ lệ thu hồi TN đem ĐL hồi trứng ĐL

197 84,43 ± 1,84% 79,90 ± 2,33% 67,73 ± 3,18% Trứng bò

386 80,70 ± 1,55% 47,54 ± 0,60% 38,39 ± 1,02% Trứng heo

Trứng bò

Trứng heo

84.43%

80.70%

79.90%

67.73%

47.54%

38.39%

ệ l ỷ T

90.00% 80.00% 70.00% 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00%

Tỷ lệ thu hồi

Tỷ lệ trứng sống/thu hồi

Tỷ lệ trứng sống/số trứng ĐL

Chỉ tiêu so sánh

Biểu đồ 3.18. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò, heo trưởng thành bằng PP2

α > 0,05 α < 0,05 α < 0,05 Mức ý nghĩa

Từ Bảng 3.13 và Biểu đồ 3.18 cho thấy tỷ lệ thu hồi trứng bò, heo ở giai đoạn trưởng

thành sau khi được bảo quản bằng PP2 là như nhau, tức là không có sự khác biệt về mặt thống kê

(α > 0,05). Tỷ lệ trứng sống sau giải đông so với số lượng trứng thu hồi cũng như tổng số trứng

đem đông lạnh đối với trứng bò cao hơn trứng heo rất nhiều, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt

thống kê (α < 0,05). Điều này có thể nói lên rằng quy trình đông lạnh này thích hợp cho việc bảo

quản trứng bò hơn là bảo quản trứng heo. Vì vậy cần tiếp tục nghiên cứu tìm ra quy trình bảo

quản trứng heo hiệu quả hơn.

CHƯƠNG IV

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Từ mục tiêu đặt ra, đề tài đã đạt được một số kết quả sau:

1. Trứng heo

 Đã thu và nuôi được 1189 trứng, tỷ lệ trứng trưởng thành 65,42 ± 0,79%.

 Bảo quản 305 trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt, tỷ lệ trứng sống so với tổng

số trứng thu hồi sau giải đông theo đánh giá hình thái đạt 46,15 ± 5,63% (91 trứng).

 Bảo quản 386 trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa trong 71 cọng rạ (0,25ml), tỷ lệ

trứng sống so với tổng số trứng thu hồi sau giải đông theo đánh giá hình thái đạt 47,54 ±

0,60% (149 trứng).

2. Trứng bò đã IVM

 Đã thu và nuôi được 684 trứng, tỷ lệ trứng trưởng thành 84,92 ± 0,63%.

 Bảo quản 197 trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa trong 36 cọng rạ (0,25ml), tỷ lệ

trứng sống so với tổng số trứng thu hồi sau giải đông theo đánh giá hình thái đạt 79,90 ±

2,33% (133 trứng).

3. Trứng bò chưa chín (giai đoạn túi mầm)

 Bảo quản 477 trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt, tỷ lệ trứng sống so với tổng

số trứng thu hồi sau giải đông theo đánh giá hình thái đạt 71,92 ± 2,20% (255 trứng).

 Bảo quản 365 trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa trong 70 cọng rạ (0,25ml), tỷ lệ

trứng sống so với tổng số trứng thu hồi sau giải đông theo đánh giá hình thái đạt 65,31 ±

4.2. KIẾN NGHỊ

2,69% (172 trứng).

(1). Cần tiến hành thu nhận, nuôi và bảo quản trứng bò, heo theo các phương pháp khác để

chọn ra phương pháp tối ưu.

(2). Nuôi chín trứng sau khi đông lạnh (đối với trứng chưa chín).

(3). Tạo phôi từ những trứng đã được đông lạnh

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Huỳnh Thị Lệ Duyên (2003). Thiết lập quy trình thụ tinh trong ống nghiệm ở heo và xác định giới tính phôi. Luận văn Thạc sỹ.

2. Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Quản Xuân Hữu, Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thuỳ Anh, Nguyễn Việt Linh, Bùi Xuân Nguyên (2003). Kết quả thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi ở bò lai Sind. Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 699-702. 3. Hoàng Kim Giao, Nguyễn Thanh Dương, Đỗ Kim Tuyên, Lưu Công Khánh, Lê Thị Thúy (1997). Công nghệ cấy truyền phôi bò. Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp, Hà Nội.

4. Nguyễn Thị Thương Huyền, Võ Thị Tuyết Nga, Nguyễn Thị Thanh xuân, hoàng Thị Bích Tuyền, Nguyễn Thị Phương Dung, Đặng Thị Thu Thủy và Phan Kim Ngọc (2008). Bảo quản trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ. Hội nghị khoa học lần thứ 6, NXB Đại học quốc gia Tp. HCM. Trang 244.

5. Lưu Công Khánh, Nguyễn Thị Thoa, Nguyễn Thị Kim Anh, Nguyễn Văn Lý, Phan Lê Sơn, Chu Thị Yến, Đặng Vũ Hòa, Hoàng kim Giao (2003). Nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng glycerol trong công nghệ cấy truyền phôi. Hội nghị CNSH toàn quốc. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 720 – 722. 6. Nguyễn Văn Lý, Nguyễn Thị Hoa, (2003). Nuôi cấy phôi bò trong ống nghiệm. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn; Tập 7; 854 – 858. 7. Nguyễn Văn Lý (2006). Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thụ tinh trong ống nghiệm bò ở Việt Nam. Luận án tiến sỹ.

8. Nguyễn Thị Ước, Nguyễn Hữu Đức, Lê Văn Ty, Bùi Linh Chi, Hoàng Nghĩa Sơn, Bùi Xuân Nguyên (1999). Sản xuất phôi bò bằng thụ tinh trong ống nghiệm. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, trang 934 – 936.

TÀI LỆU TIẾNG ANH

9. Abeydeera Lalantha R., Wang Wei-hua, Prather Randall S., and Day Billy N. (1998). Maturation In Vitro of Pig Oocytes in Protein-Free Culture Media: Fertilization and Subsequent Embryo Development In Vitro. Biology of Reproduction 58, 1316-1320.

10. Abdel_Mohsen M. Hammam, Khalied H. El-Shahat (2005). Vitrification of immature and mature buffalo oocytes in glycerol solution by a simple method. Warsaw, Poland Vol 1.

11. Aman, R.R. and J.E. Parks. (1994). Effects of cooling and rewarming on the meiotic spindle and chromosomes of in vitro-matured bovine oocytes. Biol. Reprod. 50:103-110. 12. Asada M., Fukui Y. (2000). Effect on fertilization and development by re-culture after freezing and thawing of bovine oocytes matured in vitro. Theriogeneology, 54: 889 – 898. 13. Avery, B., Strobech, L., Jacobsen, T., Bogh, I.B. and Greve, T. (2003) In vitro maturation of bovine cumulus-oocyte complexes in undiluted follicular fluid: effect on nuclear maturation, pronucleus formation and embryo development. Theriogenology 59:987-999.

14. Begin I., Bhatia B., Baldassarre H., Dinnyes A., Keefer C. L., (2003). Cryopreservation of goat oocytes and in vivo derived 2- to 4-cell embryos using the cryoloop (CLV) and solid-surface vitrification (SSV) methods. Theriogenology, 59: 1839. 15. Bernard A., Fuller B. J. (1996). Cryopreservation of human oocytes: a review of current problems and perspectives. Hum Reprod Update, 2: 193 – 207.

16. Bols, P.E.J., Leroy, J.L.M.R., Vanholder, T. and Van Som, A. (2004) A comparision of a chemical sector and a linear array transducer for ultrasound-giuded transvaginal oocyte retrieval (OPU) in the cow. Theriogenology 62: 906-914.

17. Chian Ri-Cheng, Kuwayama Masashige, Tan Leonard, Tan Justin, Kato Osamu and Nagai Takashi (2004). High survival rate of bovine oocytes matured In Vitro following

vitrification. Journal of Reproduction and Development, Vol. 50, No. 6, pages 685 – 696. 18. Cetin Y, Bastan A (2006). Cryopreservation of immat ure bovine oocytes by vitrification in straws. Anim Reprod Sci;92:29–36 19. Dinnyes A., Meng O., Polgar Z., Boonkusol D. & Somfai (2006). Cryopreservation of mammalian embryos. Acta Scientiae Veterinariae. 34:171-90. 20. Dong-Hoon Kim và cs. (2007). Vitrification of Immature Bovine Oocyte by The Microdrop Method. Journal of Reproduction and Development, Vol.53, No.4

21. Duque, P., Gomez, E., Diaz, E., Facal, N., Hidalgo, C. and Diez, C. (2003) Use of two replacemÐnt of serum during bovine embryo culture in vitro. Theriogenology 59: 889- 899.

22. Edwards J. L., A. Saxton M., Lawrence J. L., Payton R. R. and Dunlap J. R.. (2005). Exposure to a Physiologically Relevant Elevated Temperature Hastens In Vitro Maturation in Bovine Oocytes. J. Dairy Sci., 88: 4326 – 4333.

23. Eroglu, A., T. L. Toth and M. Toner. (1998). Alterations of the cytoskeleton and polyploidy induced by cryopreservation of metaphase II mouse oocytes. Fertil. Steril. 69:944-957.

24. Fujihira T, Kishida R & Fukui Y (2004). Developmental capacity of vitrified immature porcine oocytes following ICSI: effects of cytochalasin B and cryoprotectants. Cryobiology 49, pages 286–290.

25. Fulka J., Motlik J. Crozet N. (1986). Activity of maturation promoting factor in mammalian oocytes after its dilution by single and multiple fusions. Dev Biol, 118: 176. 26. Gook, D., S. Osborn, and W. Johnston. (1995). Parthenogenetic activation of human oocytes following cryopreservation using 1,2-propanediol. Hum. Reprod. 10:793-798. 27. Gulyas, B.J. and L.C. Yuan. (1985). Cortical reaction and zona hardening in mouse oocytes following exposure to ethanol. J. Exp. Zool. 233:269-276.

28. Gupta M., Uhm S., Lee H. (2006). Cryopreservation of immature and in vitro matured porcine oocytes by solid surface vitrification. Theriogenology, Volume 67, Issue 2, Pages 238-248

29. Hotamisligil S., Toner M., Powers R. D., (1996). Changes in membrane integrity, cytoskeletal structure, and developmental potential of murine oocytes after vitrification in ethylene glycol. Biol Reprod, 55: 161.

30. Hurtt A.E., Landim-Alvarenga F., Seidel G.E., Jr. and Squires E.L. (2000). Vitrification of Immature and Mature Equine and Bovine Oocytes in an Ethylene Glycol, Ficoll and Sucrose Solution using Open-Pulled Straws. Theriogenology 54: 119 – 128. 31. Iwasaki, S., Kono, T., Nakahara, T., Shioya, Y., Fukushima, M. and Hanada, A. (1987) New methods for the recovery of oocytes from bovine ovarian tissue in relation to in vitro maturation and fertilization. Japanese journal of Animal Reproduction 33, 188- 192.

32. Iwamoto M., Onishi A., Fuchimoto D., Somfai T., Takeda K., Tagami T., Hanada H. (2005). Low oxygen tension during in vitro maturation of porcine follicular oocytes improves parthenogenetic activation and subsequent development to the blastocyst stage. Theriogenology, Volume 63, Issue 5, Pages 1277-1289

33. Iwasaki, T., Kimura, E. and Totsukawa, T. (1999). Studies on a chemically defined medium for in-vitro culture of in-vitro matured and fertilised porcine oocytes. Theriogenology 51: 709-720. 34. Johnson, M.H. and S.J. Pickering. (1987). The effect of dimethylsulphoxide on the microtubular system of the mouse oocyte. Development 100:313-324.

35. Kazuhiro Kikuchi, Naomi Kashiwazaki, Junko Noguchi, Arata Shimada, Riichi Takahashi, Masumi Hirabayashi, Masao Shino, Masatsugu Ueda, and Hiroyuki Kaneko. (1999). Developmental Competence, after Transfer to Recipients, of Porcine

Oocytes Matured, Fertilized, and Cultured In Vitro. Biology of Reproduction 60. Page 336–340. 36. Kim Dong-Hoon et al cs. (2007). Vitrification of Immature Bovine Oocyte by The Microdrop Method. Journal of Reproduction and Development, Vol.53, No.4

37. Kulesshova L., Gianaroli L., Magli C., Ferraretti A., Trounson A. (1999). Birth following vitrification of a small number of human oocytes. Hum Reprod, 14: 3077 – 3079.

38. Lane M., Schoolcraft WB, Garner DK. (1999). Vitrification of mouse and human blastocysts using novel cryoloop container-less technique. Fertile Steril, 72: 1073 – 1078. 39. Lane, M. and D.K. Gardner. (2001). Vitrification of mouse oocytes using a nylon loop. Mol. Reprod. Devel. 58:342-347. 40. Leibo, S.P. (1980). Water permeability and its activation energy of fertilized and unfertilized mouse ova. J. Memb. Biol. 53:179-188.

41. Longergan, P., Vergos, E., Kinis, A., Sharif, H., Gallagher, M., Gordon, I. (1991). The effect of recovery method on the type of bovine oocyte obtained for in-vitro maturation. Theriogenology 35: 231 (abstr.). 42. Lonergan P., Carolan C. Mermillod P. (1994). Development of bovine embryos in vitro following oocyte maturation under defined conditions. Reprod Nutr Dev, 34: 329.

43. Lonergan Pat, Carolan Catherine, Langendonckt Anne Van, Donnay Isabelle, Khatir Hadj, and Mermillod Pascal (1996). Role of Epidermal Growth Factor in Bovine Oocyte Maturation and Preimplantation Embryo Development In Vitro. Biology of Reproduction 54, 1420-1429. 44. Loos, de F., van Vliet, C., van Maurik, P. and Kruip, Th.A.M. (1989) Morphology of immature bovine oocytes. Gamete Research 24: 197-204. 45. Lussier J.G., Matton P., Dufour J.J. (1987). Growth rates of follicles in the ovary of the cow. J. Reprod Fertil, 81: 301. 46. Luyet B.J. (1937). Differential Staining for Living and Dead Cells. Journal Science, Volume 85, 106

in 47. Maedomari N., Kikuchi K., Ozawa M., Noguchi J., Kaneko H., Ohnuma K., Nakai M., Shino M., Nagai T., Kashiwazaki N. (2007). Cytoplasmic glutathione regulated by cumulus cells during porcine oocyte maturation affects fertilization and embryonic vitro development Theriogenology, Volume 67, Issue 5, Pages 983-993 48. Magistrini, M. and D. Szöllösi. (1980). Effects of cold and isopropyl-N-phenylcarbamate on the second meiotic spindle of mouse oocytes. Europ. J. Cell. Biol. 22:699-707.

49. Mariana Groke Marques, Alessandra Corallo Nicacio, Viviane Purri de Oliveira, Anibal Ballarotti Nascimento, Heloisa Vasconcelos Amaral Caetano, Camilla Mota Mendes, Marco Roberto Bourg Mello, Marcella Pecora Milazzotto, Mayra Elena Ortiz D‘Avila Assumpc¸ ˜ao, Jos´e Antˆonio Visintin. (2006). In vitro maturation of pig oocytes with different media, hormone and meiosis inhibitors. Animal Reproduction Science.

50. Martins R. D., Costa1E. P., Chagas1J. S. C., Ignácio F. S., Torres C. A. A., McManus C. (2005). Effects of vitrification of immature bovine oocytes on in vitro maturation. Anim. Reprod., v.2, n.2, p.128-134. 51. Martino A., Songsasen N., Leibo SP. (1996). Develoopment into blsatocysts of bovine oocytes cryopreserved by ultra-rapid cooling. Boil Reprod, 54: 1059 – 1069.

52. Massip A., Van der Zwalmen P., Ectors F., De coster R., D’leteren G., Hanzen C. (1979). in glass ampules or French straws. Journal Deep freezing of cattle embryos Theriogenology, Volume 12, pages 79 – 84.

53. Men, H., Monson, R.L., Rutledge, J.J., (2002). Effect of meiotic stages and maturation protocols on bovine oocyte’s resistance to cryopreservation. Theriogenology 55, 1095– 1103.

54. Morató Roser, Izquierdo Dolors, Paramio Maria Teresa, Mogas Teresa (2008). Cryotops versus open-pulled straws (OPS) as carriers for the cryopreservation of bovine oocytes: Effects on spindle and chromosome configuration and embryo development. Cryobiology 57: 137–141. 55. Nakagata, N. (1989). High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. J. Reprod. Fertil. 87:479-483.

56. Ocana-Quero, J. M., Pinedo-Merlín M., Ortega- Mariscal M. and Moreno-Millán M. (1998). Influence of Human and Bovine insulin on In Vitro Maturation, Fertilization and Cleavage rates of Bovine Oocytes. Archivos de zootecnia vol. 47, núm. 177, p 85 – 93. 57. Otoi, T., Yamamoto, K., Koyama, N., Tachikawa, S., and Suzuki, T. (1997) Bovine oocyte diameter in relation to developmental competence. Theriogenology 48: 769-774. 58. Otoi, T., K. Yamamoto, N. Koyama, S. Tachikawa and T. Suzuki. (1998). Cryopreservation of mature bovine oocytes by vitrification in straws. Cryobiology 37:77- 85.

59. Park, Y.S., Kim, S.S., Kim, J.M., Park, H.D. and Byun M.D. (2005) The effects of duration of in vitro maturation of bovine oocytes on subsequent developmet, quality and transfer of embryos. Theriogenology 64:123-134.

60. Parkening T. A., Tsunoda Y. Chang M. C. (1976). Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. Journal J Exp Zool, Volume 197, pages 369. 61. Parks, J.E. and N.A. Ruffing. (1992). Factors affecting low temperature survival of mammalian oocytes. Theriogenology 37:59-73.

62. Pavlok A., Lucas-Hahn A., Niemann H. (1991). Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. Volume 31 Issue 1, Pages 63 – 67

63. Pereira, D.C., Dode, M.A.N. and Rumpf, R. (2005). Evaluation of different culture systems on the in vitro production of bovine embryos. Theriogenology 63: 1131-1141. 64. Pickering, S.J., P.R. Braude, M.H. Johnson, A. Cant and J. Currie. (1990). Transient cooling to room temperature can cause irreversible disruption ofthe meiotic spindle in the human oocyte. Fertil. Steril. 54:102-108. 65. Polge C., Smith A. U., Parkes A. S. (1949). Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Journal nature, Volume 164, page 666. 66. Rall WF, Fahy GM (1985). Ice-free cryopreservation of mouse embryo at -196oC by vitrification. Nature 313: 573 – 575.

67. Rizos, D., Burke, L., Duffy, P., Wade, M., Mee, J.F., O'Farrell, K.J., MarSiurtain, M., Boland, M.P. and Lonergan, P. (2005) Comparisions between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production in vitrro. Theriogenology 63: 939-949 68. Saeki K., Hoshi M., Leibfried-Rutledge M. L. and First N. L. (1991). In Vitro Fertilization and Development of Bovine Oocytes Matured in Serum-Free Medium. Biology of reproduction 44, 256 – 260.

69. Schalkoff, M.E., S.P. Oskowitz and R.D. Powers. (1989). Ultrastructural observations of human and mouse oocytes treated with cryopreservatives. J. In Vitro Fertil. Embryo Transf. 6:168-175.

70. Shamsuddin M., Larsson B., Gustafsson H., Rodriguez-Martinez H. (1993). In vitro development up to hatching of bovine in vitro-matured and fertilized oocytes with or without support from somatic cells. Theriogenology, 39: 1067.

71. Shaw, J.M. and A.O. Trounson. (1989). Parthenogenetic activation of unfertilized oocytes by exposure to 1,2-propanediol is influenced by temperature, oocyte age and cumulus removal. Gamete Res. 24:269-279.

72. Shaw JM., Diotallevi L., Trounson AO. (1991). A simple rapid 4.5 M dimethyl-sulfoxide freezing technique for the cryopreservation of one-cell to blastocyst stage preimplantation mouse embryos. Reprod Fertil Dev, 3: 621.

73. Sirard M. A., Florman H. M., Leibfried-Rutledge M. L., Barnes F. L., Sims M. L., First N. L. (1989). Timing of nuclear progression and protein synthesis necessary for meiotic maturation of bovine oocytes. Biol Reprod, 40: 1257.

74. Sofai Tamás, Kashiwazaki Naomi, Ozawa Manabu, Nakai Michiko, Maedomari Naoki, Noguchi Junko, Kaneko Hiroyuki, Nagai Takashi and Kikuchi Kazuhiro (2008). Effect of Centrifugation Treatment before Vitrification on the Viability of Porcine Mature Oocytes and ygotes Produced In Vitro. Journal of Reproduction and Development, Vol. 54, No. 3. pages 149 – 155.

75. Somfai T, Dinnyes A, Sage D, Marosan M, Carnwath JW, Ozawa M, et al (2006). Development to the blastocyst stage of parthenogenetically activated in vitro matured porcine oocytes after solid surface vitrification (SSV). Theriogenology [Epub ahead of print] 76. Smith, A. U. (1952). Behavior of fertilized rabbit eggs exposed to glycerol and to low temperatures. Nature 170:374–375. CrossRef, Medline

77. Trounson A. O., Willadsen S. M., Moor R. M. (1977). Reproductive function in prepubertal lambs: ovulation, embryo development and ovarian steroidogenesis. Journal J Reprod Fetil, Volume 49, Pages 69 – 75

78. Vahida Anchamparuthy (2007). Vitrification of bovine oocytes. Dissertation submitted to the Faculty of the Virginia Polytechnic Institute and State University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy In Animal Science. 79. Vajta G., Kuwayama M., (2006|). Improving cryopreservation systems. Theriogenology 65: 236–244 80. Van Blerkom, J., and P.W. Davis. (1994). Cytogenetic,

cellular, and developmentalconsequences of cryopreservation of immature and mature mouse and human oocytes. Micryoscopy Res. Tech. 27:165-193.

81. Vincent, C., S.J. Pickering, M.H. Johnson and S.J. Quick. (1990). Dimethylsulphoxide affects the organization of microfilaments in the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 26:227- 235. 82. Vincent, C. and M.H. Johnson. (1992). Cooling, cryoprotectants, and the cytoskeleton of the mammalian oocyte. Oxford Rev. Reprod. Biol. 14:73-100. 83. Wassarman, P. (1988). The mammalian ovum. Page 69 in The Physiology of Reproduction. E. Knobil and J. Neill, eds. Raven Press, New York. 84. White, K.L. and C. Yue. (1996). Intracellular receptors and agents that induce activation in bovine oocytes. Theriogenology 45:91-100. 85. Willadsen S. M. (1977). Factors affecting the survival of sheep embryos during-freezing and thawing. Journal Ciba Found Symp. Page 175 – 201 86. Wilmut, I. and L.E.A. Rowson. (1973). Experiments in the low temperature preservation of cow embryos. Vet. Rec. 92:686-690

87. Wolf, D.P. and M. Hamada. (1977). Induction of zonal and egg plasma membrane blocks to sperm penetration in mouse eggs with cortical granule exudates. Biol. Reprod. 17:350-354.

88. Wu Caihong, Rui Rong, Dai Jianjun, Zhang Chunyan, Shiqiang Ju, Xie Bing, Lu Xiao, and Zheng Xiaofeng (2006). Effects of Cryopreservation on the Developmental Competence, Ultrastructure and Cytoskeletal Structure of Porcine Oocytes. Molecular Reproduction and Development 73:1454–1462

89. Yamauchi N. and Nagai T. (1999). Male Pronuclear Formation in Denuded Porcine Oocytes After In Vitro Maturatio in the Presence of Cysteamine. Biology Of Reproduction 61, 828–833 (1999). 90. http://www.ivftudu.com.vn/

PHỤ LỤC

1. Các môi trường thu nhận và nuôi chín trứng

Nước muối sinh lý

Thành phần Nồng độ

NaCl 9,00 g/l

Penicilin 200 UI/ml

Streptomycin 200 mg/ml

Dung dịch D_PBS

Thành phần Nồng độ

NaCl 8 g/l

KCl 0.2 g/l

0.1 g/l MgCl2.6H2O

0.1 g/l CaCl2

0.2 g/l KH2PO4

1.15 g/l Na2HPO4.12H2O

Penicilin 100UI/ml

Streptomycin 100mg/ml

Môi trường TCM để nuôi trứng IVM1

Thành phần Nồng độ

TCM-199

Dịch nang trứng 10%

Natri pyruvate 0.91mM

L – cystein 0.57mM

hCG 10IU/ml

PMSG 10IU/ml

Penicilin 100UI/ml

Streptomycin 100mg/ml

Môi trường TCM để chuyển trứng sau 22-24 giờ nuôi IVM2

Thành phần Nồng độ

TCM-199

Dịch nang trứng 10%

Natri pyruvate 0.91mM

L – cystein 0.57mM

Penicilin 100UI/ml

Streptomycin 100mg/ml

Số đợt TN

loại A

Loại B

số buồng trứng 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

tổng số trứng thu được 163 170 166 173 167 176 182 174 179 183

62 66 71 69 72 73 82 74 75 79

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

47 43 44 51 45 49 54 52 46 43

2. Kết quả thu nhận trứng heo

Ty le trung A

Trung binh

21,6625 0,270063007 21,6875

Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95,0%)

41,67594 0,685733 42,21409 #N/A 2,168477 4,702293 -0,45553 -0,41313 7,018135 38,03681 45,05495 416,7594 10 1,551235

Mean Standard Error Median #N/A Mode 0,854014214 Standard Deviation 0,729340278 Sample Variance -1,185934473 Kurtosis 0,003762842 Skewness 2,5 Range 20,375 Minimum 22,875 Maximum 216,625 Sum Count 10 Confidence Level(95,0%) 0,610924965

Ty le trung B

27,36523 Mean 0,678741 Standard Error 27,39351 Median #N/A Mode 2,146367 Standard Deviation 4,606889 Sample Variance -0,80395 Kurtosis -0,43699 Skewness 6,38779 Range 23,49727 Minimum 29,88506 Maximum 273,6523 Sum 10 Count Confidence Level(95,0%)1,535418

2.1. Xứ lý số liệu về số trứng thu được trên một buồng trứng

Số đợt TN

A + B

Số trứng chín

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tổng

109 109 115 120 117 122 128 126 121 122 1189

Tỷ lệ trứng heo chín 62,39 61,47 62,61 64,17 67,52 66,39 67,19 66,67 67,77 68,03 65,42 ± 0,79

68 67 72 77 79 81 86 84 82 83 779

Ty le trung heo chin

65,41989 Mean 0,793633 Standard Error 66,53005 Median #N/A Mode 2,509689 Standard Deviation 6,298539 Sample Variance -1,57052 Kurtosis -0,57457 Skewness 6,564897 Range 61,46789 Minimum 68,03279 Maximum 654,1989 Sum Count 10 Confidence Level(95,0%)1,795323

2.2. Nuôi trứng chín

số straw

Ty le thu hoi

số trứng sống

số trứng đem đông lạnh

số trứng thu hồi sau đông lạnh

75,76 70,97 76,32 79,49 85,37 83,33 82,05 83,72 85,37 84,62

6 5 7 7 8 8 7 8 8 7 71

33 31 38 39 41 42 39 43 41 39 386

25 22 29 31 35 35 32 36 35 33 313

12 10 14 14 16 17 15 17 17 17 149

80,70 ± 1,55

2.3. Đông lạnh trứng bằng PP2

Ty le thu hoi

Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation

80,69809242 1,551320757 82,69230769 85,36585366 4,905706972

2.4. Xử lý số liệu đông lạnh trứng heo theo PP2

24,0659609 Sample Variance -0,099477945 Kurtosis -0,959819227 Skewness 14,39811172 Range 70,96774194 Minimum 85,36585366 Maximum 806,9809242 Sum 10 Count Confidence Level(95,0%) 3,509331354 Ty le song/thu hoi

Ty le song/so trung dong lanh

Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95,0%)

38,39114 1,015816 38,74296 #N/A 3,212292 10,31882 0,408826 -0,32659 11,33168 32,25806 43,58974 383,9114 10 2,297935

47,53612144 Mean 0,601537684 Standard Error 47,61111111 Median 48,57142857 Mode 1,90222918 Standard Deviation 3,618475853 Sample Variance 0,913406203 Kurtosis 0,745437488 Skewness 6,353861193 Range 45,16129032 Minimum 51,51515152 Maximum 475,3612144 Sum 10 Count Confidence Level(95,0%)1,360772778

số đợt TN số vo giọt So trung ĐL So trung thu hoi Ty le thu hoi

So trung song

1 2 3 4 5 6 7 8

32 46 57 32 14 12 11 12

55,17 86,79 78,08 100,00 66,67 60,00 39,29 60,00

8 8 10 4 3 3 4 3 43

58 53 73 32 21 20 28 20 305

21668,25 ± 6,81

15 18 21 11 9 6 8 3 91

2.5. Kết quả đông lạnh trứng heo theo PP1

Ty le song/thu hoi

Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance

46,15444088 Mean 5,625972695 Standard Error 43,00271739 Median #N/A Mode 15,91265377 Standard Deviation 253,2125501 Sample Variance -0,427632468 Kurtosis 0,592134845 Skewness 47,72727273 Range 25 Minimum 72,72727273 Maximum 369,2355271 Sum 8 Count Confidence Level(95,0%) 13,30331147

Ty le thu hoi 68,24992992 6,810105548 63,33333333 60 19,26188726 371,0203006 - 0,202388479 Kurtosis 0,311032897 Skewness 60,71428571 Range 39,28571429 Minimum 100 Maximum 545,9994394 Sum 8 Count Confidence Level(95,0%) 16,10334073

2.6. Xử lý kết quả đông lạnh trứng heo theo PP1

Ty le song/so trung ĐL

29,92438 Mean 2,821423 Standard Error 29,38356 Median #N/A Mode 7,980188 Standard Deviation 63,6834 Sample Variance 1,738241 Kurtosis -0,40411 Skewness 27,85714 Range 15 Minimum 42,85714 Maximum 239,395 Sum Count 8 Confidence Level(95,0%)6,671604

t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances

Cọng rạ

Vi giọt

Ty le thu hoi

Ty le thu hoi

68,24992992 371,0203006 8

80,69809 24,06596 10 175,8585 0 16 1,978939 0,03265 1,745884 0,065299 2,119905

Mean Variance Observations Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail

t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances

Vi giọt

Cọng rạ Ty le song/thu hoiTy le song/thu hoi 46,15444088 253,2125501 8

47,53612144 3,618475853 10 112,8158833 0 16 0,274240293 0,39370455 1,745883669 0,7874091 2,119905285

Mean Variance Observations Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail

t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances

Vi giọt

Mean Variance Observations

Cọng rạ Ty le song/so trung dong lanhTy le song/so trung ĐL 29,92438 63,6834 8

38,39114 10,31882 10

2.7. Xử lý số liệu so sánh đông lạnh trứng heo theo 2 phương pháp thủy tinh hóa

33,66582 0 16 3,07632 0,003615 1,745884 0,00723 2,119905

Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail 3. Đông lạnh trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ 3.1. Kết qủa thu nhận trứng lo TN

số buồng trứng tổng trứng

loai B

loai A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

7 6 4 6 6 5 4 6 6 50

105 84 82 112 87 106 91 132 110 909

65 47 46 67 46 55 56 64 66 512

21 15 16 21 16 22 17 23 21 172

Số trứng/buồng

18,55 Mean 1,118875648 Standard Error 18,66666667 Median #N/A Mode 3,356626944 Standard Deviation 11,26694444 Sample Variance -1,67418481 Kurtosis -0,272813353 Skewness 8,75 Range 14 Minimum 22,75 Maximum 166,95 Sum Count 9 Confidence Level(95,0%) 2,580131869

Tỷ lệ trứng loại A

Tỷ lệ trứng loại B

18,94014775 0,346444451 18,75

Mean Standard Error Median #N/A Mode 1,039333354 Standard Deviation 1,080213821 Sample Variance -0,218128265 Kurtosis 0,34529797 Skewness 3,330474557 Range 17,42424242 Minimum 20,75471698 Maximum 170,4613298 Sum Count 9 Confidence Level(95,0%) 0,798902337

56,5066442 Mean 1,56797933 Standard Error 56,097561 Median #N/A Mode 4,703938 Standard Deviation 22,1270327 Sample Variance -0,99865743 Kurtosis -0,46204462 Skewness 13,4199134 Range 48,4848485 Minimum 61,9047619 Maximum 508,559798 Sum Count 9 Confidence Level(95,0%) 3,61576682 3.2. Kết quả nuôi trứng bò

Số đợt TN

Trứng chín

tỷ lệ %

Tổng trứng đem nuôi

Tỷ lệ trứng đem nuôi

1 2 3 4 5 6 7 8 9

86 62 62 88 62 77 73 87 87

81,90 73,81 75,61 78,57 71,26 72,64 80,22 65,91 79,09

72 53 52 73 55 64 63 73 75

83,72 85,48 83,87 82,95 88,71 83,12 86,30 83,91 86,21

684 75,45 ± 1,69

58084,92 ± 0,63

Tỷ lệ trứng đem nuôi

Tỷ lệ trứng chín 84,91924 Mean 0,633776 Standard Error 83,90805 Median #N/A Mode 1,901329 Standard Deviation 3,615052 Sample Variance 0,402795 Kurtosis 0,983648 Skewness 5,755132 Range 82,95455 Minimum 88,70968 Maximum 764,2732 Sum 9 Count Confidence Level(95,0%)1,461491

75,44679 Mean 1,693808 Standard Error 75,60976 Median #N/A Mode 5,081424 Standard Deviation 25,82087 Sample Variance -0,07971 Kurtosis -0,62504 Skewness 15,99567 Range 65,90909 Minimum 81,90476 Maximum 679,0211 Sum 9 Count Confidence Level(95,0%)3,905928 3.3. Kết quả đông lạnh trứng bò

số trứng thu hồi

tỷ lệ thu hồi

số trứng sống

Tỷ lệ trứng sống

số cọng rạ

số trứng đông lạnh

tỷ lệ trứng sống/số trứng đông lạnh

77,27 78,26 79,17 90,00 80,95 90,00 86,36 90,91 86,96

64,71 72,22 78,95 83,33 82,35 83,33 84,21 85,00 85,00

50,00 56,52 62,50 75,00 66,67 75,00 72,73 77,27 73,91

22 23 24 20 21 20 22 22 23 197

17 18 19 18 17 18 19 20 20 166

11 13 15 15 14 15 16 17 17 133

67,73 ± 3,18

4 4 4 4 4 4 4 4 4 36

Tỷ lệ trứngn sống/số trứng thu hồi

Tỷ lệ thu hồi

79,90062302 Mean 2,330087323 Standard Error 83,33333333 Median 83,33333333 Mode 6,990261969 Standard Deviation 48,8637624 Sample Variance 2,024270268 Kurtosis -1,656602558 Skewness 20,29411765 Range 64,70588235 Minimum 85 Maximum 719,1056072 Sum Count 9 Confidence Level(95,0%) 5,373190998

84,4313215 Mean 1,837993699 Standard Error 86,36363636 Median 90 Mode 5,513981096 Standard Deviation 30,40398753 Sample Variance -2,042065976 Kurtosis -0,143126624 Skewness 13,63636364 Range 77,27272727 Minimum 90,90909091 Maximum 759,8818935 Sum Count 9 Confidence Level(95,0%) 4,238421066

Tỷ lệ trứng sống/số trứng ĐL

Mean 67,73349436 Standard Error 3,180744333 Median 72,72727273 Mode 75 Standard Deviation 9,542232998 Sample Variance 91,0542106 Kurtosis -0,326702762 Skewness -0,949783408 Range 27,27272727 Minimum 50 Maximum 77,27272727 Sum 609,6014493 9 Count Confidence Level(95,0%) 7,334809578 4. Kết quả đông lạnh trứng bò theo vi giọt

Đợt TN Số vi giọt

Số trứng đông lạnh Số trứng thu hồi Tỷ lệ thu hồi Số trứng sống

1 2 3 4 5 6 7 8

7 10 9 9 6 10 8 9 68

50 71 65 60 55 66 48 62 477

37 55 43 41 40 50 39 49 354

74,00 77,46 66,15 68,33 72,73 75,76 81,25 79,03 74,34 ± 1,83

28 41 27 28 27 34 30 40 255

Tỷ lệ thu hồi

74,33988435 1,829074999 74,87878788 #N/A 5,173405341 26,76412283 -0,753469629 -0,416631211 15,09615385 66,15384615 81,25 594,7190748 8 4,3250751

Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95,0%)

Tỷ lệ trứng sống/thu hồi

Tỷ lệ trứng sống/số trứng ĐL

53,69672 Mean 2,801405 Standard Error 53,75758 Median #N/A Mode 7,923569 Standard Deviation 62,78295 Sample Variance -1,00556 Kurtosis -0,08631 Skewness 22,97767 Range 41,53846 Minimum 64,51613 Maximum 429,5738 Sum 8 Count Confidence Level(95,0%) 6,62427

71,9200301 Mean 2,202956251 Standard Error 71,41906874 Median #N/A Mode 6,230901215 Standard Deviation 38,82412995 Sample Variance -0,917277014 Kurtosis 0,123887189 Skewness 18,84195539 Range 62,79069767 Minimum 81,63265306 Maximum 575,3602408 Sum 8 Count Confidence Level(95,0%) 5,209163775 5. Kết quả đông lạnh trứng bò theo cọng rạ

Đợt TN Số Sstraw Số trứng đông lạnh Số trứng thu hồi Tỷ lệ thu hồi Số trứng sống

12 10 8 8 13 8 11 70

1 2 3 4 5 6 7

61 50 44 40 70 44 56 365

48 42 30 25 47 34 36 262

78,69 84,00 68,18 62,50 67,14 77,27 64,29 71,72 ± 3,10

36 28 17 16 27 25 23 172

Tỷ lệ thu hồi

71,72452 Mean 3,101218 Standard Error 68,18182 Median #N/A Mode 8,205053 Standard Deviation 67,32289 Sample Variance -1,59993 Kurtosis 0,431313 Skewness 21,5 Range 62,5 Minimum 84 Maximum 502,0716 Sum Count 7 Confidence Level(95,0%)7,588408

Tỷ lệ trứng sống/thu hồi

Tỷ lệ trứng sống/số trứng ĐL

65,31406321 2,688458166 64

47,15911372 Mean 3,608034599 Standard Error 41,07142857 Median #N/A Mode 9,545962271 Standard Deviation 91,12539568 Sample Variance -2,62962447 Kurtosis 0,379373845 Skewness 20,44496487 Range 38,57142857 Minimum 59,01639344 Maximum 330,113796 Sum 7 Count Confidence Level(95,0%) 8,828542603

Mean Standard Error Median #N/A Mode 7,112991716 Standard Deviation 50,59465116 Sample Variance -1,2453122 Kurtosis 0,211967536 Skewness 18,33333333 Range 56,66666667 Minimum 75 Maximum 457,1984425 Sum 7 Count Confidence Level(95,0%)6,578420134 6. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành theo 2 phương pháp thủy tinh hóa t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances

Cọng rạ

Vi giọt Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ thu hồi 74,3398871,72452021 26,7641267,32289058 7

8 45,48355 0 13 0,749296 0,233511 1,770933 0,467022 2,160369

Mean Variance Observations Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances

Cọng rạ

Mean Variance Observations

Vi giọt Tỷ lệ trứng sống/thu hồiTỷ lệ trứng sống/thu hồi 65,31406321 50,59465116 7

71,9200301 38,82412995 8

44,2566782 0 13 1,918648284 0,038627266 1,770933383 0,077254532 2,160368652

Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail 7. So sánh đông lạnh trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa cọng rạ ở 2 giai đoạn khác nhau t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances

Chưa chín

Chín

Tỷ lệ thu hồi

tỷ lệ thu hồi

84,4313215 30,40398753 9

71,72452 67,32289 7 46,22637 0 14 -3,70853 0,001169 1,76131 0,002338 2,144787

Mean Variance Observations Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances

Chưa chín

Chín

Tỷ lệ trứng sống/thu hồi

79,90062302 48,8637624 9

Tỷ lệ trứng sống/thu hồi 65,31406321 50,59465116 7 49,60557187 0 14 -4,109584645 0,000531035 1,761310115 0,00106207 2,144786681

Mean Variance Observations Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances

Chưa chín Chín Tỷ lệ trứng sống/số trứng ĐLtỷ lệ trứng sống/số trứng đông lạnh 67,73349 91,05421 9

47,15911 91,1254 7 91,08472 0 14 -4,27774 0,000383 1,76131 0,000766 2,144787

Mean Variance Observations Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail 8. So sánh bảo quản trứng bò, heo đã chín bằng cọng rạ t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances

Trứng bò Trứng heo tỷ lệ thu hồi Ty le thu hoi 84,4313280,69809242 30,40399 24,0659609 10

9 0 16 1,552172 0,070088 1,745884 0,140175 2,119905

Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances

Trứng heo

Trứng bò Tỷ lệ trứng sốngTy le song/thu hoi 47,53612144 3,618475853 10

79,90062302 48,8637624 9 0 9 13,44888706 1,44997E-07 1,833112923 2,89994E-07 2,262157158

Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances

tỷ lệ trứng sống/số trứng đông lạnhTy le song/so trung dong lanh 38,39114 10,31882 10

67,73349 91,05421 9 0 10 8,787729 2,56E-06 1,812461 5,13E-06 2,228139

Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail