SEMINAR VIRUS H CỌ1
7 Các phươ ng pháp ch ẩ n đoán phát hi ệ n Rotavirus :
Các ph ng pháp ch n đoán phát hi n Rotavirus bao g m:ươ ẩ ệ ồ
−Nuôi c y phân l pấ ậ
−Quan sát tr c ti p b ng kính hi n vi đi n t - Electron Microscopy (EM)ự ế ằ ể ệ ử
−Passive Latex agglutination assays (LA)(xét nghi m s dính k t b đ ng)ệ ự ế ị ộ
−Phát hi n các serotype (ki u huy t thanh) b ng th nghi m trung hòa v i khángệ ể ế ằ ử ệ ớ
th đ n dòng đ c hi u cho t ng serotype (EIA-Mabs)ể ơ ặ ệ ừ
−Electropherotyping using polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE )
−ELISA
−Reverse transcription-PCR
−Microarray trong nghiên c u v d ch t h cứ ề ị ễ ọ
Trong đó, hi n nay ELISA đ c xem là ph ng pháp thích h p cho các phòng chu nệ ượ ươ ợ ẩ
đoán b i tính nh y, tính đ c hi u khá cao và d thao tác. Tuy nhiên trong các nghiên c uở ạ ặ ệ ễ ứ
v d ch t h c c n có nh ng ph ng pháp m i nh m nâng cao hi u qu phát hi n, thúcề ị ễ ọ ầ ữ ươ ớ ằ ệ ả ệ
đ y s ra đ i c a các ph ng pháp m i nh Multiplex RT-PCR, Sequencing, Real-timeẩ ự ờ ủ ươ ớ ư
PCR …
S ti n hóa c a Rotavirus b ng nhi u c ch khác nhau là m t thách th c l n trongự ế ủ ằ ề ơ ế ộ ứ ớ
nghiên c u v d ch t h c. S lan truy n virus gi a các loài đóng vai trò quan tr ngứ ề ị ễ ọ ự ề ữ ọ
trong s đa d ng c a Rotavirus. Rotavirus có kh năng trao đ i v t ch t di truy n khiự ạ ủ ả ổ ậ ấ ề
đ ng nhi m v i m t virus khác trong m t t bào và t o ra virus m i; ho c virus tích lũyồ ễ ớ ộ ộ ế ạ ớ ặ
các đ t bi n đi m t o ra nh ng ch ng đ t bi n thoát kh i s trung hòa b i kháng th .ộ ế ể ạ ữ ủ ộ ế ỏ ự ở ể
Do đó các ph ng pháp typing virus c n ph i đu c giám sát và update thu ng xuyên. ươ ầ ả ợ ờ
Ph ng pháp EM ra đ i năm 1974 b i Flewett và ph ng pháp LA là nh ng ph ngươ ờ ở ươ ữ ươ
pháp đ u tiên đu c s d ng phát hi n Rotavirus, đ n nay thì các ph ng pháp này ítầ ợ ử ụ ệ ế ươ
đ c s d ng do t n nhi u th i gian, n ng n v thao tác và b h n ch khi s l ngượ ử ụ ố ề ờ ặ ề ề ị ạ ế ố ượ
m u l n. Thay vào đó Elisa đ c xem là s l a ch n t i u trong ch n đoán lâm sàng.ẫ ớ ượ ự ự ọ ố ư ẩ
7.1 Ph ng pháp ELISA ươ :
Có nhi u qui trình khác nhau đ phát hi n Rotavirus d a vào ELISA nh ng đ u d aề ể ệ ự ư ề ự
trên nguyên t c trung hòa gi a kháng nguyên b m t virus và các kháng th đ n dòngắ ữ ề ặ ể ơ
Cao h c khóa 20ọNhóm 14 – Vi sinh K20
SEMINAR VIRUS H CỌ2
đ c tr ng. đây xin nêu lên ph ng pháp phát hi n Group A Rotavirus, các serotypeặ ư Ở ươ ệ
c a group này và các subgroup. ủ
a/ Phát hi n nhóm A Rotavirusệ : M u phân lâm sàng đ c phân tích b ng indirectẫ ượ ằ
ELISA. M u đ c xác nh n là nhóm A Rotavirus nh s d ng ELISA d a vào khángẫ ượ ậ ờ ử ụ ự
th đ n dòng đ c hi u cho group A (Mab-YO-156 và YO-2C2 (kháng th cho ph n ngể ơ ặ ệ ể ả ứ
chéo v i protein VP4). M u huy t thanh đ c v i các kháng th đ n dòng, các Mabsớ ẫ ế ượ ủ ớ ể ơ
này s b t l y các kháng nguyên virus sau đó ng i ta b sung kháng th đa dòng đ cẽ ắ ấ ườ ổ ể ặ
hi u cho t ng serotype có g n v i Biotin đ phát hi n ệ ừ ắ ớ ể ệ b sung peroxidase g nổ ắ
streptavidine 37ủoC trong 1h b sung o-phenylenediamine ph n ng đ c th c hi nổ ả ứ ượ ự ệ
37ởoC trong 30 phút ng ng ph n ng b ng acid sulphuric. Đ h p thu đu c đo ừ ả ứ ằ ộ ấ ợ ở
492nm trong máy đ c ELISA. Ch ng + là ch ng Rotavirus Wa và m t m u không cóọ ứ ủ ộ ẫ
Rotavirus làm ch ng âm. ứ
b/ Serotyping Rotavirus : M u d ng tính v i nhóm A đ c xác đ nh tính đ c hi uẫ ươ ớ ựơ ị ặ ệ
serotype b ng ELISA s d ng các kháng th đ n dòng đ c hi u v i t ng serotype, cácằ ử ụ ể ơ ặ ệ ớ ừ
kháng th này nh n ra t ng epitope trung hòa trong protein v capsid ngoài- vp7 đ cể ậ ừ ỏ ặ
hi u cho t ng serotype. L ng Mabs đ c hi u serotype (KU6BG (serotype 1) ; S2-ệ ừ ượ ặ ệ
2G10(serotype 2); YO-lE2(serotype 3); ST-2G7 (serotype 4) ) pha loãng trong buffer
carbonate-bicarbonate. M t serotype đ c xác đ nh khi giá tr OD c a ph n ng v i Mabộ ượ ị ị ủ ả ứ ớ
t ng ng cao h n 0.5 và ít nh t g p 2 l n giá tr OD trung bình c a 3 Mabs khác ph nươ ứ ơ ấ ấ ầ ị ủ ả
ng v i cùng m u đóứ ớ ẫ
c/ Subgroup c a Rotavirusủ : subgroup c a Rotavirus đ c th c hi n b i ELISA sủ ượ ự ệ ở ử
d ng Mabs đ c hi u cho các subgroup. S2-37 (subgroup I), YO-5(subgroup II). Qui trìnhụ ặ ệ
th c hi n t ng t nh ELISA phát hi n nhóm A virus và serotype.ự ệ ươ ự ư ệ
7.2 PAGE : Electrophoretic RNA genome c a Rotavirus b ng đi n di trên gelủ ằ ệ
Polyacrylamide (ph ng pháp này ch y u dùng trong nghiên c u d ch t h cươ ủ ế ứ ị ễ ọ
Rotavirus )
Rotavirus có b gen dsRNA g m 11 đo n gói trong 3 l p v protein. Rotavirus baoộ ồ ạ ớ ỏ
g m các nhóm virus khác nhau v tính đ c hi u kháng nguyên cũng nh có đ đa d ngồ ề ặ ệ ư ộ ạ
di truy n cao. B ng ph ng pháp Polyacrilamide gel electrophoresis có tính nh y và đ cề ằ ươ ạ ặ
hi u cao nh m xác đ nh nhóm virus nào ph bi n trong c ng đ ng. Đi n di b gen c aệ ằ ị ổ ế ộ ồ ệ ộ ủ
Rotavirus cho phép phát hi n và phân lo i virus thành 2 nhóm electrophoretic profile dàiệ ạ
(L) và ng n (S) d a vào ki u hình di chuy n c a gen segment 10 và 11 trên gelắ ự ể ể ủ
Cao h c khóa 20ọNhóm 14 – Vi sinh K20
SEMINAR VIRUS H CỌ3
polyacrylamide. S thay đ i trong di đ ng c a m t ho c nhi u segment b t kỳ cũng choự ổ ộ ủ ộ ặ ề ấ
phép ta phát hi n các ch ng Rotavirus khác nhau. ệ ủ
Qui trình th c hi n ự ệ
Tách chi t RNA ế đi n di trên gel polyacrylamide ệ nhu m b cộ ạ
D a vào ki u hình trên b ng đi n di và các d li u v d ch t h c ng i ta cóự ể ả ệ ữ ệ ề ị ễ ọ ườ
th bi t s phân b cũng nh s đa d ng c a virus theo t ng th i đi m trong năm vàể ế ự ố ư ự ạ ủ ừ ờ ể
theo l a tu i cũng nh đ a lý v.v…ứ ổ ư ị
7.3 Ph ng pháp RT-PCRươ :
Nguyên nhân ra đ i :ờ
Các ph ng pháp phát hi n kháng nguyên, kháng th c a Rotavirus th ng có tínhươ ệ ể ủ ườ
đ c hi u không cao, vì v y trong nh ng nghiên c u t m soát qui mô l n ng i taặ ệ ậ ữ ứ ầ ớ ườ
thu ng phát tri n nh ng phu ng pháp hi n đ i có tính đ c hi u cao h n nh m có nh ngờ ể ữ ơ ệ ạ ặ ệ ơ ằ ữ
d li u chính xác h n qua đó có th tăng tính đ c hi u, phát hi n các tru ng h p đaữ ệ ơ ể ặ ệ ệ ờ ợ
nhi m ho c phát hi n các ch ng m i mà nh ng phu ng pháp thông thu ng không thễ ặ ệ ủ ớ ữ ơ ờ ể
phát hi n đu c. EIA-Mabs : Ph ng pháp th nghi m mi n d ch liên k t enzyme sệ ợ ươ ử ệ ễ ị ế ử
d ng các kháng th đ n dòng đã đ c s d ng trong ch n đoán lâm sàng t lâu d a vàoụ ể ơ ượ ử ụ ẩ ừ ự
nh ng kháng th đ n dòng trung hòa đ c hi u cho t ng serotype, tuy nhiên các khángữ ể ơ ặ ệ ừ
th đ n dòng này v n ch a đ y đ cho t t c các serotype d n đ n nhi u ch ng khôngể ơ ẫ ư ầ ủ ấ ả ẫ ế ề ủ
Cao h c khóa 20ọNhóm 14 – Vi sinh K20
SEMINAR VIRUS H CỌ4
th xác đ nh ki u serotype. Vì v y đ hoàn thi n h n các ph ng pháp ch n đoánể ị ể ậ ể ệ ơ ươ ẩ
ng i ta đã phát tri n các qui trình ch n đoán b ng PCR. đây xin nêu lên m t qui trìnhườ ể ẩ ằ Ở ộ
phát hi n các serotype c a group A Rotavirus b ng ph ng pháp PCR. ệ ủ ằ ươ
C s khoa h c và qui trình phát hi n b ng PCRơ ở ọ ệ ằ
Rotavirus tính đ c hi u serotype đu c xác đ nh b i protein vp7 mã hóa b i genỞ ặ ệ ợ ị ở ở
segment 9. Nh ng nghiên c u so sánh trên trình t amino acid cho th y các protein vp7ữ ứ ự ấ
c a các serotype khác nhau có 6 vùng r t khác nhau (A-F) , tuy nhiên trong cùng m tủ ấ ộ
serotype thì nh ng vùng này r t b o t n. S d ng trình t d li u c a gen 9 ng i ta đãữ ấ ả ồ ử ụ ự ữ ệ ủ ườ
thi t k nh ng m i đ c hi u cho t ng serotype và xây d ng chi n lu c serotyping b ngế ế ữ ồ ặ ệ ừ ự ế ợ ằ
PCR.
D a vào nh ng ch ng Rotavirus đã bi t serotype ng i ta t ng h p các primer đ cự ữ ủ ế ườ ổ ợ ặ
t ng cho t ng serotype: Wa (serotype 1), DS1 (serotype 2), P (serotype 3), Hochiư ừ
(serotype 4), 69M (serotype 8), W161 (serotype 9), and F45 (serotype 9, supplied by
Nobuco Ikegami, Osaka National Hospital, Osaka, Japan).
Qui Trình Thí Nghi mệ
dsRNA cDNA by reverse transcriptase PCR gen 9 PCR l n 2 v i b m i đ cầ ớ ộ ồ ặ
tr ng cho t ng serotype và m i RVG9 ư ừ ồ đi n di trên gel agarose ệ quan sát d i tiaướ
UV.
Cao h c khóa 20ọNhóm 14 – Vi sinh K20
SEMINAR VIRUS H CỌ5
Hình 16 K t qu đi n di trên gel agarose ế ả ệ
K t quế ả: 6 b m i đ c s d ng cho typing đ u cho các band có chi u dài khácộ ồ ượ ử ụ ề ề
nhau-749,652,374,583,885 và 306 bp cho các ch ng refence Wa, DS1, P, Hochi, 69M vàủ
W161 t ng ng v i các serotype 1,2,3,4,8 và 9. các b primer hoàn toàn phù h p l nươ ứ ớ ộ ợ ẫ
nhau và v i primer chung RVG9, không có hi n tu ng các primer b t l n nhau vì v y cóớ ệ ợ ắ ẫ ậ
th dùng chung v i nhau trong m t ph n ng duy nh t.ể ớ ộ ả ứ ấ
Cùng v i s phát tri n c a khoa h c k thu t ngày càng có nhi u ph ng pháp hi nớ ự ể ủ ọ ỹ ậ ề ươ ệ
đ i h n v i đ nh y và đ đ c hi u cao h n nh Realtime-RT PCR ho c microarrayạ ơ ớ ộ ạ ộ ặ ệ ơ ư ặ
đ c áp d ng trong ch n đoán th ng quy cũng nh nh ng nghiên c u v d ch t h cượ ụ ẩ ườ ư ữ ứ ề ị ễ ọ
virus. Các ph ng pháp này xu t phát t nh ng h n ch c a các ph ng pháp khác vàươ ấ ừ ữ ạ ế ủ ươ
mong mu n hoàn thi n h n các qui trình chu n đoán. Tuy nhiên chúng đ u k th aố ệ ơ ẩ ề ế ừ
nh ng tinh hoa t các ph ng pháp c b n trên đ ng th i có thêm nh ng c i ti n m i.ữ ừ ươ ơ ả ồ ờ ữ ả ế ớ
Các ph ng pháp này tuy hi n đ i h n nh ng cũng đòi h i thi t b đ t ti n cũng nh sươ ệ ạ ơ ư ỏ ế ị ắ ề ư ự
đ u t v con ng i ầ ư ề ườ
Hi n nay Đ n V Nghiên C u Lâm Sàng Đ i H c Oxford đóng t i b nh vi n nhi tệ ơ ị ứ ạ ọ ạ ệ ệ ệ
đ i cũng đang th c hi n m t đ tài v d ch t h c tiêu ch y tr em ph i h p v i B nhớ ự ệ ộ ề ề ị ễ ọ ả ẻ ố ợ ớ ệ
vi n Nhi Đ ng 1 và Nhi Đ ng 2. Và m t trong nh ng đ i t ng quan tâm c a đ tàiệ ồ ồ ộ ữ ố ượ ủ ề
nghiên c u này là Rotavirus. Chúng tôi đang phát tri n qui trình chu n đoán lâm sàngứ ể ẩ
Rotavirus b ng Realtime-RT PCR và so sánh v i 2 ph ng pháp ch n đoán khác là EIAằ ớ ươ ẩ
và ELISA ti n t i phát tri n vaccine cho tr em Vi t Nam. ế ớ ể ẻ ở ệ
4.4 M t s Test ch n đoán nhanh:ộ ố ẩ
4.4.1 Rotavirus Rapid Test
Hình 17 Rotavirus Rapid Test
Ch a kháng th đ n dòng k t h p v i vàng (red gold-conjugatedứ ể ơ ế ợ ớ
monoclonal antibodies) cch ng l i kháng nguyên VP6 c a rotavirusố ạ ủ
nhóm A, và kháng th đ c hi u rotavirus d ng l ng (solid-phaseể ự ệ ạ ỏ
specific rotavirus antibodies).
Trong test này, m u tr c tiên x lí v i dung d ch tách đ chi t chi t tách kháng nguyênẫ ướ ử ớ ị ể ế ế
c a rotavirus. Sau đó ch c n b sung d ch chi t vào b ph n ng. K t qu d ng tínhủ ỉ ầ ổ ị ế ộ ả ứ ế ả ươ
là kháng th đ c hi u hien di n trên màng s gi l i màu. Đ ng màu đ s nhìnể ặ ệ ẹ ệ ẽ ữ ạ ườ ỏ ẽ
th y đ c, d a trên l ng virus trong m u. Đ ng này xu t hi n sau 5 – 15 phút ấ ượ ự ượ ẫ ườ ấ ệ ủ ở
nhi t đ phòng.ệ ộ
4.4.2 SD BIOLINE Rotavirus
Cao h c khóa 20ọNhóm 14 – Vi sinh K20