Các phương pháp phát hiện virus gây
bệnh cho lan
Hai loại virus chính gây hại nghiêm
trọng cho lan là virus CymMV
(Cymbidium mosaic virus) và ORSV
(Odontoglossum ringspot
virus). Việc phát hiện sớm để ngăn
ngừa và kiểm soát virus gây nhiễm là
vấn đề then chốt đặt ra cho các nhà
nông cũng như là các nhà nghiên cứu
nuôi trồng lan.
Đối với các nhà vườn lan, thì việc khó khăn và nguy hại nhất là sự gây hại nghiêm
trọng của các tác nhân gây bệnh cho cây lan, gồm có côn trùng, nấm, vi khuẩn,
virus. Trong đó, mức độ tác hại do virus gây ra là nghiêm trọng nhất vì không phát
hiện sớm ở giai đoạn đầu và mức độ lây lan cao. Trong đó hai loại virus chính gây
hại nghiêm trọng cho lan là virusCymMV (Cymbidium mosaic
virus) và ORSV (Odontoglossum ringspot virus). Do vậy, việc phát hiện sớm để
ngăn ngừa và kiểm soát virus gây nhiễm là vấn đề then chốt đặt ra cho các nhà
nông cũng như là các nhà nghiên cứu nuôi trồng lan. Mà đặc biệt là làm sao có thể
dễ dàng phát hiện và chẩn đoán sớm 2 loại virus này bằng các kỹ thuật thật đơn
giản, ít tốn kém là điều bận tâm rất lớn của các nhà nông. Cũng đã có rất nhiều
nghiên cứu tìm phương pháp tối ưu nhất để phát hiện 2 loại virus này, bao gồm
các phương pháp miễn dịch như ELISA, RIPA (rapid immunofilter paper assay);
phương pháp PCR; các test nhanh; phương pháp sắc ký;… Hiện nay, cũng có
nhiều sản phẩm đang lưu hành trên thị trường dùng để phát hiện 2 loại virus này
như: kit DAS-ELISA của hãng DSMZ (D-0187, D-0493, D-0100), các test thử
nhanh của Agdia, các kit Monoplex, Multiplex RT-PCR,…
I. Phát hiện virus gây hại lan bằng cách test thử nhanh
Các loại test thử nhanh này dùng để sàng lọc và phát hiện sớm các mẫu nghi
ngờ bị nhiễm bệnh, nhằm ngăn ngừa và kiểm soát bệnh hiệu quả. Cách sử dụng
các loại test thử này rất đơn giản, nhanh chóng và không cần đầu tư trang thiết bị
hiện đại hay kiến thức chuyên sâu như phương pháp chẩn đoán khác ELISA, PCR.
Chúng rất tiện lợi khi mang theo và thực hiện ở bất cứ nơi nào trong nhà kính hay
vườn nuôi mà không cần gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, vì vậy chúng phù hợp và
tiện lợi cho nông dân nuôi trồng lan. Giá thành so với phương pháp ELISA hay
PCR cũng ít hơn rất nhiều.
Về nguyên tắc của các test này là: dựa vào phản ứng tạo màu khi có sự hiện diện
của 1 kháng nguyên (protein màng bao của virus), kết hợp chuyên biệt với kháng
thể tạo phức hợp có màu nhìn thấy được bằng mắt thường.
Hiện nay, trên thị trường thế giới có rất nhiều dạng test kit này của các công ty nổi
tiếng, có uy tín. Ở đây tôi xin giới thiệu 1 số sản phẩm để tham khảo:
1. Kit Agdia Orchid ImmunoStrip®
Kit thử nhanh Agdia Orchid ImmunoStrip® của hãng Agdia
(www.agdia.com) là một trong những kít được sử dụng phổ biến nhất để phát hiện
đồng thời 2 loại virus gây bệnh cho thực vật, virus chính gây tác hại nghiêm trọng
cho công tác nuôi trồng lan là Cymbidium mosaic virus (CymMV) và
Odontoglossum ringspot virus (ORSV). Kit này rất tiện lợi cho việc phát hiện
đồng thời cả hai loại virus trên chỉ trong vòng ít phút. Kết quả được thể hiện rất rõ
ràng và cách sử dụng đơn giản, tiện lợi khi dùng bất cứ ở đâu trong vườn hay nhà
kính. Chỉ cần cho mẫu nghi ngờ vào túi chuyên dụng đã chứa sẵn dung dịch đệm
SEB1 của kít và đặt các que thử (strip) vào trong túi. Kết quả dương tính thể hiện
mẫu nhiễm virus khi có sự xuất hiện vạch màu trong vòng 20-30 phút khi so sánh
với mẫu đối chứng: kết quả xuất hiện 3 vạch màu là nhiễm cả 2 loại virus; test
xuất hiện 2 vạch nghĩa là chỉ nhiễm 1 loại virus (CymMV hoặc ORSV) và âm tính
khi chỉ xuất hiện 1 vạch màu (chi tiết ở hình 1):
Hình minh họa kết quả phát hiện
virus CymMV và ORSV bằng kit
Agdia (www.agdia.com)
2. Pocket Diagnostics Orchid virus screen - Cymbidium mosaic virus and
Odontoglossum ringspot virus
Sản phẩm gồm có 1 pack silica chứa 1 test phát hiện CymMV, 1 test phát hiện
ORSV, 1 ống chứa dung dịch tách chiết (extraction bottle), 1 pipett nhựa, vài vòng
bi thép sạch.
Các sản phẩm của kit Pocket Diagnostics Orchid virus screen
(http://jwund.homestead.com/pdviruskit.html)
Cách thực hiện kit này rất dễ dàng tiện dụng, không cần kinh nghiệm và dễ bảo
quản (lưu trữ ở nhiệt độ phòng, khô thoáng):
· Sử dụng mẫu lá mới nhất nghi ngờ nhiễm bệnh.
· Cắt các mẫu mô lá này thành những mảnh nhỏ có kích thước khoảng
5-7mm theo chiều rộng, và chiều dài khoảng 1-2cm, sau đó lát mỏng
các mẫu lá này theo chiều dọc. Đối với mẫu hoa, chỉ cần cắt nhỏ.
· Thực hiện 3 vạch cắt chéo ngang mẫu lá đã lát mỏng, và đặt vào
trong extraction bottle.
· Lắc trong vòng 30 giây. Lấy vài giọt mẫu sau khi lắc nhỏ vào giếng
tròn của dụng cụ test phát hiện virus.
· Trong vòng 3-5 phút kết quả xuất hiện sẽ cho biết mẫu dương tính
hay âm tính: kết quả dương tính có 2 vạch màu xuất hiện ở dòng ghi
chữ C (đối chứng) và T (virus ORSV hoặc CymMV ), kết quả âm khi
chỉ có 1 vạch ở dòng ghi chữ C.
Kết quả phát hiện virus với kit Pocket
Diagnostics Orchid virus screen
(http://jwund.homestead.com/pdviruskit.html)
II. Phát hiện virus gây hại lan bằng RT-PCR
Phát hiện virus gây hại bằng RT-PCR là một phương pháp có độ tin cậy cao hơn
các phương pháp khác. Bằng cách phát hiện sự hiện diện của 1 gene nào đó của
virus, cụ thể đối với virus CymMV và ORSV là gene CP (coat protein gene), gene
tổng hợp protein màng bao của virus. Tuy nhiên, sử dụng phương pháp này rất tốn
kém, đòi hỏi phải có phòng thí nghiệm tân tiến, có trang thiết bị hiện đại, đầy đủ,
như máy PCR, bộ điện di, máy chụp gel, các thiết bị chuyên dùng khác và hóa
chất rất đắt tiền. Và đòi hỏi người thực hiện phải có trình độ chuyên môn cao.
Qui trình thực hiện bao gồm các bước cơ bản như sau:
Tách chiết RNA:
RNA tổng số được tách chiết từ mô lá của mẫu Lan nghi ngờ và 1 mẫu thực vật
làm đối chứng theo hướng dẫn kit tách chiết (ở đây tôi trình bày tóm tắt cách sử
dụng của kit Plant Total RNA Extraction Miniprep system; Vio gene, Mỹ):
· 100mg mô lá lan được nghiền ra trong nitơ lỏng. Chuyển vào
eppendorf.
· Bổ sung 450µl RX buffer. Trộn đều.
· Lọc dung dịch qua cột (Shearing tube column).
· Rửa cột với 230µl ethanol tuyệt đối. Lọc dung dịch qua cột (Plant
total RNA tube column) của kit.
· Rửa cột 1 lần với dung dịch WF, và 2 lần với dung dịch WS.
· Hòa RNA tổng số trong 50µl nước cất 2 lần.
· Đo nồng độ RNA thu được.
· Lưu trữ -80oC đến khi dùng.
Trình tự primer:
Cặp primer tổng hợp gene CP của virus CymMV; sản phẩm có kích thước
669bp:
CymMV CP-F1: ATGGGAGAGYCCACTCCARCYCCAGC
CymMV CP-R1 TTCAGTAGGGGGTGCAGGCA.
Cặp primer tổng hợp gene CP của virus ORSV; sản phẩm có kích thước
474bp:
ORSV CP-F1 ATGTCTTACACTATTACAGACCCG.
ORSV CP-R1 GGAAGAGGTCCAAGTAAGTCC.
Cặp primer tổng hợp gene nad5 mRNA của thực vật dùng làm chứng nội;
sản phẩm có kích thước 185 bp:
mt-F2 GCTTCTTGGGGCTTCTTGTTCGATA
mt-R1 ATCTCCAGTCACCAACATTGGCAT
a. Thực hiện phản ứng Monoplex RT-PCR:
Chuẩn bị phản ứng RT:
Đối với mẫu phân tích: (Chuẩn bị mẫu đối chứng tương tự ngoại trừ không
có sản phẩm RNA của virus sau tách chiết):
Trộn từng loại 2µl RNA tổng số (virus và thực vật) (nồng độ khoảng 200ng) đã
tách chiết ở trên tương ứng với từng loại 0.5µl primer ngược (nồng độ 5µM):
· RNA của virus CymMV: sử dụng primer CymMV CP-R1.
· RNA của virus ORSV: sử dụng primer ORSV CP-R1.
· RNA của thực vật: sử dụng primer mt-R1.
Tiếp tục trộn hỗn hợp trên với 5µl nước cất 2 lần. Đun 10 phút ở 70oC, làm lạnh
ngay trên đá trong 5 phút. Tiếp tục bổ sung vào hỗn hợp RT gồm:
Nước cất 2 lần 3.25µl
Buffer (5x, Promega) 2.5µl
dNTPs (10mM) 1.25µl
RNasin (40 U/µl, Promega) 0.25µl
AMV reverse transcriptase (10 U/l, Promega) 0.25µl
Ủ phản ứng trên ở 42oC trong 60 phút. Tiếp tục bổ sung các hóa chất sau để tiến
hành phản ứng PCR: (sử dụng mỗi cặp primer cho từng mẫu RNA tương ứng):
Sản phẩm của phản ứng RT 2µl
DyNAzyme™ II DNA polymerase buffer (10x, Finnzymes Inc.) 2µl
1 cặp Primer xuôi và ngược (5µM) 2µl
dNTPs (2 mM) 2µl
DyNAzyme™ II DNA polymerase enzyme (2 U/ µl, Finnzymes Inc.) 0.4µl
Nước cất 2 lần 11.6µl.
Sau khi đã chuẩn bị, tiếp theo là đặt các phản ứng vào máy PCR và thiết lập
chương trình phản ứng như sau:
Bước 1: biến tính ở 96o C trong 5 phút.
Bước 2: 96o C trong 30 giây.
Bước 3: 52o C trong 30 giây.
Bước 4: 72o C trong 30 giây.
Lặp lại 30 chu kỳ từ Bước 2 đến Bước 4.
Bước 5: 72o C trong 7 phút.
Và cuối cùng là phân tích sản phẩm khuếch đại trên gel agarose, nhuộm gel và
quan sát trên máy đọc UV để xác định kích thước các vạch DNA xuất hiện trên gel
khi so sánh với thang chuẩn DNA ladder 1kb Plus (Invitrogen). Từ đó suy ra kết
quả.
b. Thực hiện phản ứng Multiplex RT-PCR:
Chuẩn bị và thực hiện tương tự như Monoplex RT-PCR. Tuy nhiên, có vài điều
khác biệt cần lưu ý:
Phản ứng RT:
Được chuẩn bị và thực hiện tương tự như phản ứng Monoplex RT-PCR, ngoại
trừ 3 primer ngược (primer reverse CymMV CP-R1, ORSV CP-R1 và mt-R1) là
được cho vào đồng thời trong cùng một phản ứng. Và nồng độ RNA của virus có
thể pha loãng bậc 10 thành nhiều nồng độ (10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100
fg, 10 fg và 1 fg) để xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng Multiplex RT-PCR
sau này.
