VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 22-Tháng 2 - 2010
66
ĐA HÌNH GEN Mx VÀ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐẶC THÙ ĐỐI VỚI
VAXIN H5N9 CỦA MỘT SỐ GIỐNG GÀ
Trần Xuân Hoàn*, Phạm Thị Phương Mai, Nguyễn Thị Quỳnh Châu, Trần Xuân Toàn
Nguyễn Thị Nga, Phùng Đức Tiến, Vũ Chí Cương và Jean Charles Maillard
Phòng thí nghiệm Trong điểm Tế bào động vật
*Tác giả liên hệ: Trần Xuân Hoàn Phòng thí nghiệm trong điểm tế bào động vật
Viện Chăn nuôi – Thụy Phương – Từ Liêm Hà nôi
Tel: 0986.422.026; Email: hoantranvcn@yahoo.com
ABSTRACT
Mx gene polymorhisms and specific immune responses to H5N9 vaccination in some chicken breeds
A total of 105 chickens of seven breeds: Ri, Ho, Mia, Dong Tao, Tre, H’Mong and Luong Phuong (15 chicken
for each breed) was injected with BIOFLU H5N9 vaccine at 30 age days old. After 2; 4 and 8 weeks vaccination,
antibody titers were determined by HI and ELISA. H’mong and Ho chickens presented an earlier and better
immune response to the vaccination than other chickens. Luong Phuong chicken presented a latest immune
response to the vaccination.
To study the polymorphisms in the Mx gene, two pairs of primers were used for sequencing this gene in twenty
chickens for each breed (15 vaccinated + 5 witnesses). Among 18 detected nucleotide substitutions, it was found
that two of them can induce amino acid exchanges at positions 308 (Ile → Val) and 631 (Asp → Ser ).The rates
of the resistant Mx allele (R) and sensitive allele (S) were different between chicken breeds. The association
between Mx resistant allele and antibody titers was not significant (P > 0.2). However chickens having genotype
GG388/RR2032 presented an ealier and better immune response to vaccination than those having genotypes
AA388/SS2032 or AG388/SS2032.
Key words: Mx gene polymorhisms
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chọn lọc các giống có khả năng kháng bệnh sẽ đóng vai trò quan trọng để nâng cao hiệu quả
trong chăn nuôi, cũng như góp phần đảm bảo cho chăn nuôi bền vững. Vì vậy, nghiên cứu
chọn lọc vật nuôi có khả năng kháng bệnh dựa vào chỉ thị ADN ngày càng được quan tâm.
Theo Watanabe (2007) gen Mx của chuột có khả năng kháng virus được phát hiện ra khi
chuột thí nghiệm được gây nhiễm bởi virus cúm. Các nghiên cứu tiếp theo trên gen Mx của
các giống gà khác nhau tác giả cho biết gà mang gen Mx mã hóa Asn tại vị trí 631 có khả
năng kháng virus, ngược lại nếu mã hóa Ser mẫn cảm với virus.
Ko và cs (2002) cho biết gen Mx của một số giống gà có khả năng kháng được virus influenza
và VSV ( vesicular stomatitis virus).
Ko và cs (2004) phân tích gen Mx của gà cho thấy khả năng kháng virus phụ thuộc vào sự sai
khác trình tự axit amin ở vị trí 631. Gà mang kiểu gen mã hóa axit amin Asn ở vị trí 631 có
khả năng kháng virus, nhưng gà mang kiểu gen mã hóa Ser ở vị trí 631 mẫn cảm với virus.
Seyama và cs (2006) sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP phân tích đa hình gen Mx của 36 dòng gà
từ 17 giống cho thấy tỷ lệ alen Mx kháng virus và mẫn cảm tương ứng là 59,2% và 40,8%.
Li và cs (2006) phân tích gen Mx của 15 giống gà địa phương của Trung Quốc và 4 dòng gà
thương phẩm đã chọn lọc cho biết tần số alen kháng virus của các giống bản địa từ 0,72 –
0,95. Trong khi đó tần số alen này của 4 dòng gà thương phẩm thấp hơn rõ rệt, dao động từ
0,05 - 0,27.
TRẦN XUÂN HOÀN – Đa hình gen Mx và khả năng đáp ứng miễn dịch ...
67
Do đó, nghiên cứu để xác định được mức độ đa hình gen Mx của một số giống gà nội và khả
năng đáp ứng miễn dịch của chúng sẽ là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo phục vụ
việc chọn lọc và lai tạo các giống gà có khả năng kháng bệnh, góp phần vào việc phát triển
chăn nuôi gia cầm bền vững.
VÂT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các giống gà: Ri, Hồ, Mía, H’mông, Tre, Đông Tảo, Lương phượng
được nuôi riêng biệt từ đời bố mẹ. Sau đó gà con 21 ngày tuổi được lấy máu kiểm tra kháng
thể trong huyết thanh và tách ADN làm nguyên liệu để xác định sai khác di truyền.
Gà thí nghiệm được tiêm vacxin BIOFLU H5N9 ở 30 ngày tuổi, mỗi giống 15 con. Gà đối
chứng không tiêm vacxin, mỗi giống 5 con. Sau khi tiêm vacxin 2, 4 và 8 tuần tuổi lấy huyết
thanh của gà thí nghiệm và đối chứng để xác định hiệu giá kháng thể cúm gia cầm.
Phương pháp nghiên cứu
Hiệu giá kháng thể cúm gia cầm xác định theo phương pháp HI và ELISA tại trung tâm Chẩn
đoán thú y Trung ương
Phương pháp tách chiết ADN: Tách chiết ADN được thực hiện theo kít AccuPrep® Genomic
DNA Extraction Kit của hãng Bioneer.
Phương pháp giải trình tự gen Mx: Sử dụng hai cặp mồi Mx1 và Mx2 để nhân đặc hiệu
đoạn ADN gen Mx ở gà. Kết quả PCR nhân đoạn ADN từ cặp mồi Mx1 và Mx2 có kích
thước tương ứng là 450 bp và 738 bp.
Trình tự cặp mồi Mx1 như sau:
Mồi xuôi: 5′-GAATAGCAACTCCATACCGTG-3′
Mồi ngược: 5′-GTATTAAAGGTTGCTAATG-3′
Trình tự cặp mồi Mx2 như sau:
Mồi xuôi: 5′-TGGCTGCAAAGAGACAATCA-3′
Mồi ngược: 5′-CTGGATTGTGGAGGTGAAGG-3′
Chu trình nhiệt:
Giai đoạn 1: Biến tính ADN ở nhiệt độ 95oC trong 15 phút.
Giai đoạn 2: Gồm 3 bước và lặp 30 chu kỳ. Nhiệt độ và thời gian tương ứng cho mỗi bước
như sau: 94oC trong 45 giây; 60oC trong 90 giây; 72oC trong 90 giây.
Giai đoạn 3: Kéo dài chuỗi ở nhiệt độ 72oC trong 15 phút, sau đó chuyển nhiệt độ về 4oC.
Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR: Sau khi chạy PCR để nhân đặc hiệu đoạn ADN của
gen Mx chúng tôi tiến hành kiểm tra kết quả PCR bằng điện di. Sau đó, các mẫu được tinh
sạch theo Purelink™ PCR Purification Kit của hãng Invitrogen
Phản ứng sequencing: Sản phẩm PCR làm sạch được sử dụng là nguyên liệu cho phản ứng
sequencing. Phản ứng sequencing được thực hiện theo BigDye Terminator V.3.1 Cycle
Sequencing Kit của hãng AB (Applied Biosystem).
Phương pháp tinh sạch sau phản ứng sequencing: Tinh sạch sau phản ứng sequencing được
thực hiện theo BigDye® XTerminator™- Purification Kit của hãng AB.
VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 22-Tháng 2 - 2010
68
Giải trình tự trên máy giải trình tự tự động: AB- 3130.
Các phương pháp phân tích kết quả giải trình tự
Sử lý số liệu thống kê theo phương pháp phân tích phương sai (ONE –WAY ANOVA) trên
phần mềm MINITAB 14. Sau khi giải trình tự trên máy AB-3130 thu được các file kết quả,
được đọc bởi phần mềm phân tích trình tự Sequencing Analysis version 5.2.0. Quá trình đọc
trình tự sai khác, được thực hiện nhờ phần mềm Novosnp version 2.0.3 và Stadenpacker-
PreGap4 version 1.5. Trình tự đột biến trong gen Mx đồng thời được so sánh trên
http://genome.ucsc.edu.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Khả năng đáp ứng miễn dịch của một số giống gà
Gà sau 2, 4 và 8 tuần tiêm vacxin lấy huyết thanh để xác định kháng thể cúm gia cầm bằng
phương pháp HI. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể được trình bày trong Bảng 1.
Bảng 1. Hiệu giá kháng thể cúm của một số giống gà
Giống gà Kháng thể sau khi tiêm vaxin, Log2 (Mean )
n 2 tuần n. 4 tuần n 8 tuần
Gà Ri 15 1,87a 15 5,33a 14 6,21a
Gà Hồ 15 4,00b 14 5,57a 14 5,50a
Gà Mía 15 3,93b 15 5,60a 15 5,20b
Gà Đông Tảo 15 2,53a 15 5,53a 15 5,73a
Gà Tre 15 2,13a 15 5,07 a,b 14 5,71a
Gà H’mông 15 4,07b 14 5,43a 14 5,71a
Gà Lương Phượng
15 1,33a 15 3,53b 15 4,13b
SEM - 0,42 - 0,39 - 0,36
a,b: P< 0,05
Bảng 1 cho thấy, gà H’mông và gà Hồ có lượng kháng thể sau 2 tuần tiêm vacxin cao hơn
đáng kể so với các giống gà khác (P<0,05). Kết quả này cho thấy, gà H’mông và gà Hồ có
khả năng đáp ứng miễn dịch sớm nhất trong 7 giống gà. Trong khi đó lượng kháng thể sau khi
tiêm vacxin 4 tuần của 6 giống gà nội: Ri, Hồ, Mía, Đông Tảo, Tre, H’Mông đều lớn hơn 4 và
cao hơn so với gà Lương Phượng. Hiệu giá kháng thể cúm ở các giống gà sau 4 tuần tiêm
vaxin chứng tỏ các giống gà nội đã đáp ứng tốt với vaxin H5N9, nhưng gà Lượng Phượng
chưa có khả năng đáp ứng với vacxin.
Sau 8 tuần tiêm vacxin hiệu giá kháng thể của cả 7 giống gà đều lớn hơn 4, cho chúng ta thấy
cả 7 giống đã đáp ứng tốt với vaxin H5N9. Tuy nhiên hiệu giá kháng thể cúm ở gà Lượng
Phượng vẫn thấp nhất, và có sự sai khác đáng kể so với gà: Ri, Hồ, Đông Tảo, Tre và
H’mông. Sự khác biệt về khả năng đáp ứng với vacxin BIOFLU H5N9 giữa gà nội và gà
Lương Phượng phản ánh lên sự khác biệt di truyền đáp ứng miễn dịch giữa các giống gà.
Để so sánh khả năng đáp ứng miễn dịch của 7 giống gà với vaxin H5N9, chúng tôi lập Đồ thị
phản ánh sự biến đổi hiệu giá kháng thể theo thời gian. Kết quả trình bày trong Hình1.
Hình 1 cho thấy, gà Lương Phượng có khả năng đáp ứng với vaxin H5N9 ở thời điểm khoảng
7,5 tuần sau khi tiêm vaxin. Như vậy 6 giống gà nội: H’Mông, Hồ , Mía, Đông Tảo, Ri và Tre
không chỉ đáp ứng tốt với vaxin H5N9 mà còn có khả năng đáp ứng sớm hơn so với gà
Lương Phượng.
TRẦN XUÂN HOÀN – Đa hình gen Mx và khả năng đáp ứng miễn dịch ...
69
Hình 1: Sự biến đổi hiệu giá kháng thể cúm của các giống gà.
Sự sai khác di truyền trong gen Mx của các giống gà
So sánh với trình tự gen Mx của 7 giống gà với trình tự gen Mx của gà đã được công bố
(http://genome.ucsc.edu) chúng tôi phát hiện ra có 18 điểm đa hình, nhưng trong đó chỉ có hai
điểm đa hình tại các nucleotid 1062 và 2032 thuộc vùng ADN mã hoá ( cADN) làm thay đổi
trình tự axít amin tương ứng ở vị trí 308 và 631. Hai điểm đa hình này cũng đã được phát hiện
trên các giống gà khác nhau trong nghiên cứu của Ko và CS (2002). Tuy nhiên mức độ đa
hình ở các giống là khác nhau. Kết quả trình bày trong Bảng 2.
Bảng 2. Tần số của một số điểm đa hình trong gen Mx ở một số giống gà
Vị trí nucleotide 1062 2032
Trình tự bộ ba mã hoá axít amin đã công bố GTA AGT
Axit amin mã hoá Valine Serine
Trình tự bộ ba mã hoá axít amin ở một số giống gà ATA AAT
Axit amin mã hoá Isoleucine Asparagine
Tần số alen A của gà Ri 0,375 0,500
Tần số alen A của gà Hồ 0,200 0,650
Tần số alen A của gà H’Mông 0,200 0,675
Tần số alen A của gà Đông Tảo 0,250 0,550
Tần số alen A của gà Tre 0,125 0,550
Tần số alen A của gà Mía 0,325 0,300
Tần số alen A của gà Lương Phượng 0,395 0,225
Bảng 2 cho thấy, điểm đa hình tại nucleotid 2032 có sự khác biệt đáng kể giữa các giống gà,
đặc biệt là giữa gà Lương Phượng với các giống gà nội. Theo kết quả nghiên cứu của một số
tác giả gà có trình tự nucleotid A ở vị trí 2032 sẽ mã hóa axit amin Asn tại vị trí 631 có khả
năng kháng virus (alen R có khả năng kháng virus), nhưng nếu nucleotid G thay thế cho
nucleotid A ở vị trí 2032 dẫn đến axit amin Ser thay thế Asn (alen S mẫn cảm với virus) thì gà
sẽ mẫn cảm với virus (Ko và cs, (2002, 2004), Seyama và cs, (2006), Watanabe, (2007).
VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 22-Tháng 2 - 2010
70
Kết quả trình bày trong Bảng 1 cho thấy, sự đáp ứng miễn dịch của các giống gà theo thời
gian là khác nhau, và mức độ đa hình nucleotid tại vị trí 2032 cũng khác nhau giữa các
giống gà. Tuy nhiên trong số 16 điểm đa hình trong vùng không mã hoá axít amin chúng tôi
nhận thấy tần số điểm đa hình tại nucleotid ở vị trí 388 trong intron 5 (Theo Li và cs, (2006)
DQ788615) , cũng có sự khác biệt đáng kể giữa gà Lương Phượng và các giống gà nội. Do
đó, để đánh giá ảnh hưởng của đa hình nucleotid đến khả năng đáp ứng miễn dịch của các
giống gà chúng tôi tiến hành so sánh sự sai khác trình tự của hai nucleotid ở vị trí 388 và
2032 trong số gà đã được tiêm vaxin H5N9 và tìm mối liên quan với hiệu giá kháng thể của
chúng. Tần số alen của gen Mx tại hai nucleotid ở vị trí 388 và 2032 được trình bày trong
Bảng 3.
Bảng 3. Tần số alen của gen Mx ở một số giống gà được tiêm vacxin
Giống gà n Tại nucleotid 388 Tại nucleotid 2032
G A Alen R Alen S
Gà Ri 15 0,87 0,13 0,50 0,50
Gà Hồ 15 0,93 0,07 0,60 0,40
Gà H’Mông 15 0,90 0,10 0,60 0,40
Gà Đông Tảo 15 0,97 0.03 0,53 0,47
Gà Tre 15 1,00 0 0,67 0,33
Gà Mía 15 1,00 0 0,30 0,70
Gà Lương Phượng 15 0,67 0,33 0,17 0,83
Bảng 3 cho thấy, tần số alen R có khả năng kháng virus có sự khác nhau giữa các giống gà.
Các giống gà nội đều có tần số alen R cao hơn so với gà Lương Phượng. Trong khi đó tần số
nucleotid G tại vị trí 388 của gà Lương phượng là thấp nhất. Có thể sự sai khác di truyền này
dẫn đến sự sai khác về khả năng đáp ứng miễn dịch giữa các giống gà. Để đánh giá ảnh hưởng
của từng điểm đa hình đến khả năng đáp ứng miễn dịch, chúng tôi tiến hành so sánh hiệu giá
kháng thể cúm của gà mang các trình tự nucleotid khác nhau tại hai điểm đa hình. Hiệu giá
kháng thể của gà mang alen R và S được trình bày trong Bảng 4.
Bảng 4. Hiệu giá kháng thể của gà mang các alen gen Mx khác nhau
Alen Kháng thể sau khi tiêm vacxin, Log2 (Mean )
n 2 tuần n 4 tuần n 8 tuần
Alen R 66 2,96 64 5,30 62 5,58
Alen S (Đồng hợp) 39 2,64 39 4,90 39 5,23
SEM 0,29 0,32 0,21
P 0,46 0,25 0,26
Bảng 4 cho thấy, hiệu giá kháng thể của gà mang kiểu gen đồng hợp tử SS mẫn cảm với virus
ở cả 3 thời điểm 2 tuần, 4 tuần và 8 tuần sau khi tiêm vaxin đều thấp hơn so với gà mang alen
R. Tuy nhiên, sự sai khác này không rõ rệt (P>0,05). Kết quả này cho thấy khả năng alen R có
mối liên kết với khả năng đáp ứng với vaxin H5N9 của gà.
Tần số nucleotid G tại vị trí 388 trong intron 5 của gen Mx của gà Lương Phượng là thấp
nhất. Để tìm mối liên két giữa nucleotid G với khả năng đáp ứng với vaxin, chúng tôi tiến
hành so sánh hiệu giá kháng thể của gà có kiểu gen Mx khác nhau vị trí 388. Kết quả được
trình bày tại Bảng 5.