DI TRUYỀN PHÂN TỬ SỬ DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH,
CHẨN ĐOÁN, PHÂN LOẠI, PHẢ HỆ, DỊCH TỄ HỌC
VÀ DI TRUYỀN QUẦN THỂ KÝ SINH TRÙNG
MỞ ĐẦU
Tất cả mọi đặc tính sinh học của một cá thể đều được quyết định bởi hệ gen
của chúng. Hệ gen ở động vật là một tập hợp của các chuỗi nucleotide phân bố
trong các phân đoạn dài ngắn khác nhau gọi là nhiễm sắc thể (đối với hệ gen cá
thể bậc cao), hoặc là một vòng acid deoxyribonucleic (ADN) khép kín (đối với hệ
gen cá thể bậc thấp). Tính chính xác khi so sánh cấu trúc trật tự nucleotide của gen
và hệ gen các cá thể khác nhau cho phép có được sự phân biệt chính xác các đặc
tính di truyền học của cá thể và quần thể, bất luận, sản phẩm gen của chúng có thể
bị ảnh hưởng tương tác của môi trường và đồng loại. Ngày nay khảo sát và phân
tích cấu trúc gen và hệ gen của cá thể để so sánh, hay còn gọi là khai thác chỉ thị di
truyền phân tử ADN (DNA genetic markers) được coi là phương pháp tối ưu trong
nghiên cứu sinh vật nói chung và ký sinh trùng (KST) nói riêng, đặt ra một hướng
mới: hướng giám định, chẩn đoán, phân loại, nghiên cứu phả hệ tiến hoá, dịch tễ
học và di truyền quần thể bằng phương pháp sinh học phân tử(1),(2),(3),(4) .
Phương pháp khai thác chỉ thị phân tử ADN cho kết quả có độ nhạy và tính
chính xác cao, đặc biệt trong chẩn đoán phát hiện biến chủng, thậm chí trong các
cá thể đồng chủng, ngay cả khi vùng ADN nghiên cứu không cho sản phẩm gen
(non-coding region), hoặc ADN ở vùng giao gen, hay cả khi một số gen ở trạng
thái câm lặng (silent genes). Phương pháp ADN còn bao quát cả phương pháp
protein, đơn giản, vì khi cấu trúc gen trong chuỗi nucleotide đã được xác định, thì
cấu trúc protein cũng dễ dàng phân tích để đánh giá và so sánh chức năng. Sự phát
triển của kỹ thuật máy tính điện tử (computer) đã tạo dựng công cụ tin-sinh học
(bioinformatics) đa dạng và đa năng, cho phép ứng dụng phương pháp phân tích
ADN một cách hiệu quả và rộng rãi. Tuy phương pháp chỉ thị phân tử đòi hỏi
trang thiết bị đắt tiền, tốn kém và cần các nhân viên kỹ thuật có trình độ cao,
nhưng kết quả phân tích hết sức đặc hiệu và chính xác(5,12).
CHỈ THI DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA HỆ GEN
Hệ gen ty thể và chỉ thị chọn lọc
Ty thể (mitochondrion) là một bộ phận của tế bào, chứa một hệ gen riêng
gồm các gen tham gia quá trình ôxy hoá-khử, giải phóng năng lượng cho tế bào
hoạt động. Hệ gen ty thể khoảng 13-25 nghìn nucleotide, chứa 12 gen (đối với sán,
trematode và cestode; và giun, nematode) hoặc 13 gen (đối với động vật bậc cao)
mã hoá cho sản phẩm protein(4),(6),(7),(10),(11). Ngoài ra còn có 2 gen ARN ribosome,
22 gen của ARN vận chuyển, một vùng không mã hoá (non-coding region) và một
số tiểu phần khác (Hình 1). Trong một tế bào sinh vật có khoảng 200-300 ty thể
hoạt động. Hiện nay đã có hàng trăm loài có hệ gen ty thể đã được giải mã và phân
tích đầy đủ, hàng nghìn loài đã có hệ gen ty thể được giải mã một phần, cung cấp
nguyên liệu chuỗi nucleotide và axit amin cho so sánh giám định các loài cần
nghiên cứu. Do có kích thước nhỏ, lại chứa gen tối cần thiết cho hoạt động sống
của tế bào, nên ty thể được coi là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong
hệ gen phục vụ nghiên cứu về giám định, phân loại và lập phả hệ quần thể. Các
gen trong ty thể lại có hệ số biến đổi nhanh hơn hệ gen nhân tế bào 10-15 lần, nên
rất thuận lợi cho nghiên cứu về tiến hoá. Các gen của ty thể trong cùng chủng,
cùng loài, thậm chí trong các loài có quan hệ gần về sinh học có sự bảo tồn rất cao,
do vậy, bất cứ sự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu giá trị trong giám định và
phân loại.
Nghiên cứu hệ gen ty thể còn có tầm quan trọng trong chẩn đoán, điều trị
và phòng chống bệnh, vì có nhiều bệnh ở người và động vật liên quan đến sự biến
đổi ở ty thể. Đối với KST, hiểu biết đầy đủ về hệ gen ty thể, còn có giá trị định
hướng trong phòng chống, đặc biệt tìm kiếm hoá chất, hoá dược, hoặc thực
nghiệm các loại vacxin thế hệ mới. Đã có nhiều hệ gen ty thể của các loại KST
như giun đũa (Ascaris suum), giun chỉ (Onchocerca volvulus), sán máng
(Schistosoma mansoni, S. japonicum, S. mekongi, S. haematobium), sán dây
(Taenia solium, T. asiatica, T. crasiceps...), sán lá gan lớn (Fasciola hepatica, F.
gigantica), sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini), sán lá ruột
(Fasciolopsis buski)... đã được giải mã và phân tích cung cấp nguồn dữ liệu cần
thiết cho nghiên cứu giám định, phân loại, phả hệ, quần thể ký sinh trùng(9),(10),(11).
Vậy những chỉ thị nào của hệ gen ty thể là đối tượng được chọn nghiên
cứu? Thông thường, gen cox1, nad1, cob là những gen có giá trị được chọn trong
giám định và định loại các loài có họ hàng gần gũi; các gen nad3, 16S (rrnL), 12S
(rrnS), vùng không mã hoá (NR, non-coding region) được chọn trong phân loại và
so sánh biến đổi gen của các loài họ hàng xa (Hình 1). Các gen ty thể là các cấu
trúc di truyền đại diện dòng mẹ, do vậy, khi giám định các loài có khả năng lai hay
trong vùng tạp lai ngoại loài (inter-specific hybridization), nhất thiết cần xem xét
thêm chỉ thị hệ gen nhân (ví dụ ITS-2), vì gen nhân đại diện di truyền dòng bố. Từ
đó, việc phân tích dòng lai sẽ xác định được di truyền theo bố hay theo mĐ.
Hình 1. Hệ gen ty thể (A) có các chỉ thị phân tử thường sử dụng (vạch bên
dưới các gen) và sơ đồ cấu trúc tổ hợp ADN ribosome (B) của hệ gen nhân cung
cấp chỉ thị 18S và ITS-2 với các mồi thực hiện PCR.
Hệ gen nhân tế bào và hướng nghiên cứu một phần hay toàn bộ hệ gen
Trong một tế bào của cơ thể, song song tồn tại 2 hệ gen bao gồm hệ gen
nhân tế bào (nuclear genome) và hệ gen ty thể (mitochondrial genome, đối với
động vật) hoặc lạp thể (chloroplast, đối với thực vật). Hai hệ gen này đều có sản
phẩm riêng, hoạt động có tính chất vừa độc lập, vừa tương tác, và dĩ nhiên hệ gen
ty-lạp thể chịu ảnh hưởng điều hoà của hệ gen nhân tế bào.
Hệ gen nhân tế bào bao gồm hàng chục triệu đến hàng trăm triệu
nucleotide. Hệ gen nhân tế bào được phân bố trong các đơn vị sinh học gọi là
nhiễm sắc thể (NST). Số lượng NST trong mỗi một loài có khác nhau. Các gen
được phân bố tập trung trong các vùng riêng biệt gọi là các vùng mã hoá (coding
region), phần lớn vùng còn lại không chứa cấu trúc gen, gọi là vùng không mã hoá
(non-coding region). Rất khó thực hiện phản ứng PCR ở các vùng này do chúng
chứa nhiều cấu trúc lặp hoặc ở những vùng có tỷ lệ nucleotit A +T hay G+C
thường lấn át nhau, có nơi tỷ lệ A +T hay G+C đạt 90% hay ngược lại. Hơn nữa,
do không chính xác về trật tự nucleotide nên rất khó tổng hợp các primer đặc hiệu
cho phản ứng PCR. Sản phẩm PCR của các vùng ADN này thường chất lượng
không cao.
Hệ gen nhân tế bào có hệ số đột biến không cao hơn hệ gen ty thể. Tuy
nhiên, bất kỳ sự thay đổi nào của các gen quan trọng cũng dẫn đến sự biến đổi hệ
gen có tính chất đặc trưng của loài. Về phân loại mà nói, nếu chỉ chọn 1 hay vài
gen để phân tích, sẽ không cho kết quả của tiến trình tiến hoá, vì trong 1 loài các
gen cơ bản có chiều hướng bảo tồn rất cao. Do vậy phân tích gen bảo tồn trong hệ
gen của nhân chỉ có giá trị trong giám định, mà ít có giá trị trong phân loại.
Mặt khác, các vùng có cấu trúc lặp, hay những vùng có hệ số biến thái cao
trong hệ gen nhân là đối tượng phân tích để phân loại. Các phương pháp SHPT đã
trình bày (RFLP, RFLP-PCR, RAPD...) là phương tiện dễ dàng phát hiện những
vùng đặc biệt như thế này. Khi biết được cấu trúc của 1 phân đoạn ADN biến thái