Định tính Vibrio cholerae: Đề tài nghiên cứu chi tiết

ị

Vibrio cholerae

Đ nh tính

ổ

T ng quan v

ề Vibrio cholerae:

ả ườ ệ ả

ẩ i ph u ng ủ ượ i Ý Kilippo Pacini xác đ nh gây ra b nh t c công nh n r ng rãi đ n khi

ị ậ ộ ố ế ề ệ ươ

ư ươ ố ượ Vibrio cholerae đ c nhà gi ậ vào năm 1854, tuy v y khám phá c a ông không đ Robert Koch nghiên c u đ c l p sau đó ba m i năm và công b thông tin v b nh cũng nh ph ứ ộ ậ ng pháp phong ch ng.

ế ứ ủ

ẩ ế ố ứ ệ ơ ươ ị

ự ấ ng cho th y các y u t ặ ư ệ ố ộ h u h t có liên quan đ n th c ph m. M t nghiên c u b nh ch ng c a Vi n gây nguy c cao là: ăn th t chó,m m

ả ầ ị ố ễ t là m t s h i s n nh cá, sò, c, h n đ ơ ẩ ụ ứ ế ẩ

ộ ố ả ả ụ ố ệ ầ ộ ệ ế ệ B nh t ắ ể ệ Trung V sinh d ch t ế ượ ắ ừ ả c b t t tôm, rau s ng, rau qu ... đ c bi ơ ồ ớ n i ô nhi m hay dùng tay b n, d ng c ăn u ng d b n, th c ăn ti p xúc v i ru i, ặ nh ng, chu t, dán,.. làm lây lan m m b nh.

ớ ả ắ ả ườ i có kho ng 35 tri u c m c t , 100.000120.000 t ng h p t ợ ử

ỏ ộ

ng pháp phân tích vi khu n ườ i tiêu dùng và c ng đ ng, ề Vibrio ố ặ ẩ Vibrio cholerae ồ ề ng pháp truy n th ng ho c

c ph t hi n thông qua nhi u ph ị ươ ử ọ ệ ờ Hàng năm trên th i gi ươ ệ ể ậ vong. Vì v y, vi c tìm hi u quy trình, ph ệ ứ ế ể ả ấ ầ t đ b o v s c kh e cho ng là r t c n thi ệ ấ ể ượ cholerae có th đ ễ ng pháp mi n d ch và sinh h c phân t ph ươ khác nhau.

ộ ộ

ự

ạ

ẩ

ẩ 1.1. Tình tr ng ng đ c th c ph m do vi khu n Vibrio cholerae

ị ả ế ớ Tình hình d ch t trên th gi i

ả ầ ả ượ đ c nói đ n t th i Hippocrates và Sanskrit, đ

ượ ứ

ầ c mô t ượ ườ ả ượ c John Snow ch ng minh đ c năm 1849. Trong vòng g n 200 năm qua loài ng ở ầ l n đ u tiên b i ề ủ c vai trò lây truy n c a ụ ạ i đã tr i qua 7 v đ i

ế ừ ờ ệ B nh t Garcia Huerto năm 1563 và đ ướ ướ c n n ả ị : d ch t

ắ ầ ừ Ấ ộ l n th nh t (1816 1826): B t đ u t Bengal sau lan sang n Đ ,

ả ầ ạ Đ i dich t ố ứ ấ ể Trung Qu c và bi n Caspian.

ứ

ố ử ườ ế ổ ố ổ ị i ch t trong t ng s 650.000 dân), t ng s t

ị

ả ầ ạ ị Đ i d ch t l n th hai(1829 !826): Naawm1831 d ch lan sang Luân Đôn (6.536 ế ườ i ch t, Pái (20.000 ng ng vong ướ c Pháp là 100.000 nguwoif. Sau d ch lan sang Liên Xô, Quebec, Ontario toàn n và New York.

ở l n th a ba (1852 1860): xay ra

ạ ị Đ i d ch t ệ ế Ở ả ề ườ ư i t Luân Đôn làm 10.738 ng ủ nhi u vùng c a Liên Xô, làm ở ị vong. D ch x y ra

ả ầ ư ườ i ch t. hàng tri u ng ố ế Chicago làm ch t 5,5% dân s .

ị ở (1863 1875): D ch x y ra ch y u là Châu Au và Châu

ầ ả ườ ứ ư ạ ị Đ i d ch l n th t ở ị Phi. D ch x y ra ả Luân Đôn làm 5.596 ng ủ ế ế i ch t.

ả ầ ứ ở Hamburg làm

ế ố ở ườ ạ ị Đ i d ch t 8.600 ng ả ị l n th năm (1881 1896): Năm 1892 d hj x y ra ớ ụ ị i ch t. Đây là v d ch l n cu i cùng Châu Âu.

ứ ề ả

ị ở Châu Âu gi m đi do các đi u ki n ặ ố ủ ề ỏ ư ả ả ầ l n th sáu (18991923): D ch ẫ ị ố ơ t h n nh ng d ch v n x y ra n ng n ệ các thành ph c a Liên

ị Đaih d ch t ề ệ v v sinh t Xô.

Đ i t

ị ữ ươ ắ ầ ở

ẩ ứ ả ủ ạ ả ầ l n th b y (1961ng ng năm b y m i): D ch b t đ u ớ

ị

ả

ở Nam M , b t đ u ủ

ừ ắ ừ ắ ớ

c a đ i d ch l n th b y là s tái t ị ả ộ coorddieent và t

ị ả i ch t, do ch ng t ứ ả ầ ả ộ ổ ợ ng xuyên ọ ố

ế ườ ả ủ ạ ị ừ ế ỹ ữ ả ỉ ố ề ể ộ ộ

ừ

ớ ợ ử ng h p t ệ vong. ả 52 n ỉ ế ố ố ớ ể i tăng lên đáng k , taawng 79% so v i năm 2005 ườ ướ c, 6.311 tr c báo cáo t ổ ế i con s này ch chi m 10% t ng s ca b nh x y ra Th gi

ẽ ả Indon ia năm ộ Ấ 1963, v i ch ng vi khu n El Tor, sau lan sang Bangladesh (1973), n Đ (1964), ậ ả Liên Xô (1966). T B c Phi d ch lan sang Italy năm 1973, Nh t B n và Nam ỹ ắ ầ ở ươ Thái Bình D ng. T 1/1991 – 9/1994, d ch x y ra Beru ườ ớ v i 1trieeuj ng O1 E1 Tor gây nên, i m c và 10.000 ng ữ ự ủ có khác m t chút so v i ch ng t h p gi a ủ ả ở ườ ch ng t El Tor. T đó đ n nay d ch x y ra th ộ ố ướ ầ m t s n c Châu Phi, Châu Á và M La Tinh. T là m t m i đe d a toàn c u ộ ế ề công c ng và là m t trong nh ng ch s v phát tri n xã h i. Năm 2006, v y t ớ ả báo cáo trên th i gi só ca t ố ượ ớ ổ v i t ng s là 236.896 đ ổ ứ ế ớ ch c Y t Theo t ự ế . trên th c t

Năm 2014 d ch t

ị ả ẫ ứ ạ ể ế ố ỹ v n có chuy n bi n ph c t p tai Trung M và các qu c gia ở

1.2. Tình hình t

Tây va Trung Phi.

ả ở ệ Vi

t Nam

ấ ầ ệ ả ầ ệ ở ớ ợ ng h p b nh

l n đ u tiên xu t hi n ừ

ố ệ ầ ệ ở ườ ả ầ ườ ệ ắ ả ượ đ El Tor l n đ u tiên xu t hi n

5.000 30.000 ng ị ướ ạ ệ

ệ ả ấ ầ ở ớ ệ B nh t t nam năm 1850 v i 2 tri u tr Vi ượ c thông báo. T năm 1910 1938, hàng năm s b nh nhân m c t đ ừ ấ ệ ộ i. B nh t dao đ ng t ư ả ả ệ x y ra d b nh t ệ ả ượ t c thông báo. Năm 1994, b nh t đ ệ c thông báo ề mi n Nam , ị ệ i d ng d ch l u hành . Hàng năm có hàng trăm b nh nhân b b nh Tây Nguyên v i 1.459 xu t hi n đ u tiên

ề ữ ệ ắ ả

ề ệ ữ ng gi a hai mi n Nam, B c, b nh t ả ả ừ ả

ả ắ ế ả ề ắ ớ đã r i rác H i Phong. T năm 1993 2004, c

ệ ấ

ậ ợ ớ ườ ng h p nào. T cu i

ươ ắ ạ ố vong. Các năm 2005 2006, c n i bùng phát

ườ ắ ươ ệ b nh nhân. Sau năm 1975, do vi c thông th ụ ị lây lan ra mi n B c và gây ra nh ng v d ch t ượ ệ ị d ch x y ra liên ti p c ba mi n B c, trung , Nam v i khoang vài nghìn ca b nh đ ườ ng báo cáo hàng năm. Tuy nhiên, b nh không bùng phát thành d ch l n, có r t ít tr ừ ố ả ướ ợ ư h p t ợ ị ng h p năm 2007,d ch l ư m c nh ng không có tr ị c không ngi nh n tr ỉ ở 19 t nh/ thành ph phía B c, hang ngàn tr ợ ử ng h p t vong.

ắ ườ

ắ ả ế ườ ,không có ng

ả , không có

ả ắ ả ế ườ ườ ả Năm 2009 đã có 930.946 ca m c tiêu chay, trong đó có ng ệ ca b nh t 479 ca m c t ng i ch t,. Năm 2008 có 453 ế ế ườ , ch t, năm 2009 có 853 ng i ch t, năm 2009 có i m c t ườ ệ ế i ch t, năm 2010 có 606 ca b nh t , trong đó có m t ng ế ắ ệ ườ i ch t. , không có ng i m c b nh t ộ i ch t, năm 2011, có ba ng

ố ả d ch tiêu ch y

ệ ắ ộ ổ ị ộ ệ ệ ề ậ

ế ế ơ ả ả ấ u d

ườ ố ẫ ố ươ ươ i bán c l y c

ề ạ i huy n Bình Chánh (TP.HCM) đã bung phát m t Cu i tháng 7/2014, t ử ị ườ ấ i m c ph i nh p vi n đi u tr , trong đó có m t b nh nhi t c p khi n h n 10 ng ệ V. ng tính vong. K t qu xét nghi m nuôi c y và PCR phát hiên m c b ế ố ấ ố ở ợ ầ ề cholerae O1 tuýp huy t thanh Inaba. Theo đi u tr ng ch đ u m i ớ Bình Đi n giáp ranh v i huyeenj Bình Chánh.

ồ ướ ễ ị trong c b c đã b nhi m vi

ố ươ u vàng có ngĩa ngu n n ộ ệ ẩ ả ồ ẩ ả ệ Vi c phát hi n vi khu n t khu n này, có kh năng lây lan tromng c ng đ ng.

ể

ặ

ủ 1.3. Đ c đi m c a Vibrio cholerae

ọ ậ ầ

ạ ư ẩ ộ ị

ơ ố ả V. cholerae có ph n ng oxidase (+), ADH(),

ả ứ ượ ườ ưở ể ứ ng ch a 03%

ượ ể ượ ng đ ứ ườ ố ề Virio cholera (còn g i là Kommabaccillus) sih v t gram âm hình que hai đ u không đ u ấ nhau t o hình d u ph y, di đ ng, s ng k khí tùy ý có kh năng lên men glucose nh ng không sinnh h i, không sinh H2S. LDC(+), lên men đ NaCl,không phát tri n đ c trong môi tr ng ch a 6, 8, 10% mu i. c sucrose, có th tăng tr c trong môi tr

ộ

ủ Vibrio ế ổ ể ủ ộ

Vibrio choleaevaf các loài thu c chi Vibrio Proteobacteria. Có hai ch ng ủ cholerae chính, ch ng c đi n và ch ng El Tor, và m t sô nhóm huy t thanh (serogroup) khác.

ộ ọ ẩ ẩ

ư ấ ờ ượ ỏ

ấ

ng nghèo dinh d ứ ướ ư ậ ợ ọ ắ Vbrio cholerae thu c h Vibrionaceae, là vi khu n có hình cong nh d u ph y, b t ộ ẩ c nh có lông, khu y màu gram âm, không có v , không sinh nha bào , di d ng d ặ ở ề ưỡ ẩ ng, pH ki m (8,5 9) và m n khu n d nuôi c y trong môi tr ố ể môi tr ườ ễ ườ ng thích h p nh trong n c, th c ăn trong các đ ng v t bi n ( cá, cua, c,sò

ẩ

ẩ ả ở ấ ượ ườ ể ố ệ ộ ấ có th s ng đ t đ th p, khu y khu n t ệ ộ t đ (85oC/ 5 phút), b i hóa ch t thông th ế c vài ngày đ n 2,3 ườ ng ng và môi tr

ể ở ấ nhi bi n,..).. nh t là ễ ị ệ ở ầ tu n. d b di nhi t axit.

ướ ủ ả c, s a, th c ph m, th y s n, côn trung,.. sinh đ c t

ộ ườ ộ ộ ố ạ ộ ặ trong d

ế ả ự ẩ ộ ố ạ ộ ố ộ ắ ru t g n vào niêm m c ru t non, ho t ế t

ẩ ả ướ ể

ữ ng tiêu hóa. Đ c t ẫ ẩ c gây tiêu ch y c p tính. Ph y khu n t ế ừ ủ ể ị ổ ấ có th chuy n hóa trong thiên ch ng không gây d ch có th thành ch ng

ả ấ ề ạ ự ủ ể nhiên , gây

ơ ướ ẩ ẩ ự ệ ễ Vibrio cholerae có m t trong n ru t và n i đ c t hóa emzyme andenylcyclase d n đ n tăng AMP vogf, làm gi m h p thu Na+, tăng ti Cl và n ọ nhiên, thay đ i tính di truy n do đ t bi n t ề ị gây d ch và kháng nhi u lo i kháng sinh. Là vi khu n ph bi n trong t ễ ả ị ị , d ch b nh d phát sinh n i n d ch t ổ ế ị ẩ c b n và th c ph m b nhi m trùng.

ượ ế c chia thành V. choleraeO1 và Vi.

ư ượ ọ V. cholerae có khòagr 140 nhóm huy t thanh và đ ế ớ Cholerae noO1(V. cholerae không ng ng k t v i O1 còn đ ủ c g i là ch ng NAG).

ượ ể ặ c phân thành 2 typ sinh h c (biotyp) d a theo đ c đi m ki u hình là

ự ể

ủ ế ể ặ ế ị ượ c phân thành 3 typ huy t thanh (sero

ọ V.cholerae O1 đ ự V. cholerae classica và V. cholerae Eltor. D a vào đ c đi m các quy t đ nh kháng V. cholerae đ nguyên A,BC c a kháng nguyên O, typ) sau:

Serotyp Ogawa ( có quy t đ nh kháng nguyên A,B).

ế ị

ế ị Serotyp Inaba ( có quy t đ nh kháng nguyên A, C0.

Serotyp Hikojima ( có ca ba quy t đ nh kháng nguyên A, B,C).

ế ị

ủ ạ ị ộ ả ở ộ Án Đ và m t

ừ V. choleraenon O1 nhóm huy t thanh O139 là th ph m gây d ch t ế ố ướ ở s n ế năm 1992 đ n nay. Châu Á t c

ẩ ờ ộ ố ả ộ ọ ố gây b nh nh đ c t t

ẩ ả ơ ( choleragen). Đây là n i đ c t ọ ượ ử ơ

là 27.000 dalton, mang đ c ố ng phân t ệ ặ ơ

ấ ệ có c u trúc Ph y khu n t ộ ồ g m hai đ n nguyên: đ n nguyên A ( tr ng l ộ ầ tính cao) và đ n nguyên B có tính kháng nguyên đ c hi u và m t c u n i A2 có tác ụ d ng kích thích tăng AMP vong ( Adenosin 3,5Cyclic môn phosphat.

ươ

ẩ Vibrio cholerae

2. Các ph

ng pháp phân tích vi khu n

ươ

ố

ề

2.1. Ph

ng pháp truy n th ng

ườ

ấ

2.1.1. Môi tr

ng nuôi c y

ươ ự ề ẩ ố

ổ ế ượ ể ị c ph bi n, ISO/TS 218721:2007 dùng đ xác

Các ph chuaamr hi n nay (ISO) cũng đã đ ị đ nh ng pháp truy n th ng xác đ nh các loài Vibrio trong th c ph m theo tiêu ệ V. cholerae.

ả ư ứ ườ ươ ươ ườ ố ớ ng pháp th ng

ướ ng dùng môi tr ề ng phân l p

ẩ ạ ủ V. cholerae trên môi tr ng dùng là TCBS, các khu n l c c a ườ ng này th

ể c peptone ki m ( alkaline saline peptone wate). Môi tr ườ ầ

ệ ượ ế ng TCBS có h n ch là không phát hi n đ ệ ế ườ ậ

ạ ẫ ườ ạ

ủ V. cholerae lên men ặ ơ ế ể

ủ ậ Ph ng ch a mu i v i pH kho ng 8.6 nh môi tr ặ tăng sinh n ươ ươ ng có th ặ ệ ấ đ c đi m là tròn bóng và có màu vàng. Tuy nhiên các phát hi n g n đay cho th y môi ườ c các ch ng tr ơ ầ ệ ộ ng đ c hi u h n c n saccharose ch m d n đ n sai sót trong phát hi n . M t môi tr ư ng t o màu ( chromogenic arga media) theo c ch enzyme nh quan tâm là môi tr chromIDTTM Vibrio arga (bioMesrieus) hay CHROMargaTM Vibrio có th phát hi n c ệ ả ch ng lên men saccharose ch m.

Nguyên t cắ

ườ ượ c tăng sinh trong môi tr

ệ ng phân bi

ặ ườ môi tr ờ ẳ

ư ư ả ứ ọ ọ ng ch n l c ọ ọ t ch n l c ị c kh ng đ nh băng ọ ườ ậ ượ ng phân l p d ườ ế ọ V. ng tăng sinh ch n lcoj cho

ậ

ẩ ạ ẽ

ườ ẩ ạ ế ậ i khu n l c. N u vi sinh v t không lên men đ ượ ườ c đ

c surose trong môi tr ướ ng bên d ẩ ạ ị ẫ ộ ượ ng m u xác đ nh ( 10g ho c 25g) đ M t l ậ ừ ấ ặ đ c tr ng. C y phân l p t ng tăng sinh sang môi tr ươ ẩ ạ ấ ặ đ c tr ng. C y khu n l c nghi ng trên môi tr các ph n ng sinh hóa và huy t thanh h c . Môi tr cholerae là TCBS ( Thiosalphate Citrate Bile Sucrose Argar). Các vi sinh v t lên men ượ ng này s cho khu n l c màu vàng và làm axits hóa môi d ẽ ươ tr ng sucrose s cho khu n l c mù xanh.

ươ

ệ

ạ

2.2. Ph

ng pháp phân tích hi n đ i

ươ

ễ

ị

ọ

2.2.1. Ph

ng pháp mi n d ch h c – ELISA ( Enzyme Linked

Immunosorbent Assays)

ậ ệ ệ ể ẫ

ệ

ươ ể ng pháp này đ

ệ ự

ướ ơ ả ELISA (EnzymeLinked Immunosorben Asa) hay EIA ( Enzyme Immunosorbent) là m tộ ể ỹ ỹ k thu t sinh hóa đ phát hi n kháng th hay kháng nguyên trong m xét nghi m. k ậ ệ ể ể ượ ử ụ c s d ng đ phát hi n b nh phát sáng V. harveyi trên tôm, thu t ELISA có th đ ượ ẫ ấ ả ị t c các dòng Vibrio spp. Ph m u nuwowcsvaf có th xác đ nh t c ể ệ ủ ặ ắ ự th c hi n d a trên nguyentawcs b t dính đ c hi u c a kháng nguyên và kháng th và ồ g m các b c c b n sau:

Kháng nguyên ch a bi

ư ế ượ ắ ộ ề ặ c g n trên m t b m t. t đ

Kháng th bi Enzyme.

ể ế ướ ượ ề ặ ữ ể ượ ắ c đ t tr c “r a” qua b m t đó. Kháng th này đ c g n

ẽ ế

ượ ố ớ ệ Thêm vào c ch t (substance): enzyme s bi n đ i c ch t này và t o tín hi u c phát ra c. Đ i v i các EL

ứ m u ch a kháng nguyên kháng th . S hi n di n c a ph c h p kháng

ườ ớ ạ ổ ơ ấ ẽ ượ ISA phát quang, ánh sáng s đ ể ự ệ ứ ợ ệ ủ ộ ng đ sáng phát ra. V i nguyên lý trên,

ế ị ặ ư ượ ự ng kháng nguyên trong

ứ ẫ ơ ấ ị ể có th xác đ nh đ ừ ẫ t ể ẽ nguyên kháng th s quy t đ nh c ị ELISA giúp xác đ nh s có m t hay không cũng nh l m u nghiên c u.

ể ế ộ

ư ả ườ ệ ạ ế ế i các gi ng c a

ể ặ ượ ố ị c c đ nh t ứ ố ị ế ệ ặ ủ ng th c c đ nh không đ c hi u:

ự ế ề ặ ắ ầ ấ Đ ti n hành ELISA c n ph i có ít nh t m t kháng th đ c hi u cho kháng nguyên ch a bi ng kháng nguyên đ t. Thông th ươ vi phi m (polystyrene microtiter plate). Ph kháng nguyên g n tr c ti p vào b m t đĩa.

ươ ứ ặ ệ ượ ắ ộ ng th c đ c hi u (“sandwich” ELISA): kháng nguyên đ ớ c g n v i m t

ể ặ ệ ầ Ph kháng th đ c hi u cho cùng kháng nguyên c n kiêm tra.

ạ

ể ả ệ ẽ ượ c thêm vào, phanr ng t o ph c h p kháng nguyên – ế ự ế ứ ợ ứ ớ c g n tr c ti p v i enzyme, tín

ọ ể ượ ắ ổ ơ ấ ẽ ệ

ế ợ ử ụ ể

ng h p s d ng kháng th th c p (secondary ị ữ ể ứ ấ ế ộ

ẽ ượ ầ ị ượ ắ c g n v i enzyme thông qua các liên k t c ng hóa tr gi a các ậ ọ c nh n sinh h c (bioconjugation ) kháng nguyên c n xác đ nh s đ

ể ứ ấ ể ặ Kháng th đ c hi u s đ ể kháng th có th x y ra. N u kháng th đ ệ hi u quang h c do enzyme làm bi n đ i c ch t s giúp phát hi n kháng nguyên ườ ầ c n ki m tra. Trong tr ớ antibody) đ ử phân t ế bi t qua kháng th th c p này.

ặ ệ ể

ẽ ượ ấ ụ

ử

ượ ờ ể ơ ấ ẽ ị ạ ị ế ớ ụ

ủ ả ứ

ướ ế

ư ấ

ươ ủ ệ ặ ộ ắ ượ c ộ c dùng r ng rãi ng pháp

ữ ướ ủ Gi a các b c c a ELISA, các protein và các kháng th không đ c hi u, kháng ể ớ ắ th không g n v i kháng nguyên s đ c l y đi nh các lo i d ch có tác d ng ướ ỉ ố ử “r a”. Sau b c “ r a” cu i cùng, ch còn kháng th liên k t v i kháng nguyên ữ ạ ượ c thêm vào, c ch t s ch u tác d ng c a enzyme liên i. Sau khi đ đ l c gi ể ứ ơ ể ế ớ k t v i kháng th trong ph c h n kháng nguyênkháng th . Ph n ng phát ơ ấ ạ ẽ ả ổ ơ ấ quang (bi n đ i c ch t ) s x y ra. Tr c đây các c ch t t o màu s c đ ượ ử ụ s d ng trong ELISA nh ng ngày nay các ch t phát quang đ ữ làm tăng tính đ c hi u và đ chính xác c a ELISA. Có nh ng ph ế ELISA nh sau: ELISA gián ti p (inderect ELISA), Sandwich ELISA, ELISA ạ c nh tranh (Competive ELISA)

ỹ ươ ự c Karl Mullis và c ng s (M )

ớ ượ ng pháp PCR (Polymer Chain Reaction) đ ộ ể ừ ộ đó đã t o nên m t tác đ ng to l n đ i v i các

ứ

ợ ố ượ ồ ể ổ ả ươ ừ ộ ự m t trình t ộ ố ớ ử ụ ặ DNA đ c bi

ủ ng pháp intro s d ng các ệ t do là enzyme polymerase, sau 2035 chu kì

ế ặ ầ 2 đ u DNA c n nhân gen

ự ệ ở t rõ các trình đ c hi u ồ ặ ế ế ặ ạ Ph ạ phát minh năm 1985 và k t ọ ế ớ nghiên c u sinh h c trên toàn th gi i. Đây là ph ớ ặ c p m i đ t ng h p s l ng l n các b n sao t ạ ộ ự d a vào ho t đ ng c a các dNTP t ượ ể có th nhân đ c khi bi ể ể (đo n khuôn) đ có th thi ầ ệ t k các c p m i đ c hi u.

ệ ể ử ụ ể ạ ậ ẩ

ệ ẩ ề ậ ờ ờ ế ỹ Hi n nay có th s d ng k thu t khu ch đ i DNA đ chu n đoán nhanh b nh ấ mà không m t nhi u th i gian đê phân l p vi khu n. do Vibrio spp trong vài gi

Nguyên t cắ

ặ ệ ươ ộ ng pháp này là phát hi n m t DNA đ c hi u cho Vibrio

ự ạ ộ

ạ ớ ừ ạ ồ ệ ắ ủ ủ ng pháp PCR d a trên ho t đ ng c a enzyme DNA polymerase trong ẽ ượ ố ổ c n i

ờ m ch khuôn.Đo n m i này sau đó s đ ớ

ủ ả ứ ộ

ể ể ự

ầ ạ ở ộ ộ

ủ ấ ớ

ộ ạ ả ẽ ạ ở

ể ộ ạ ế ạ ự ặ ệ t nào đó, ta đ c bi ồ ổ ề ả ế ế i thi u v trình t t k các m i b ượ ồ ồ hai đ u m ch bao g m m t m i xuôi (sense primer) và m t m i ng c ượ c cung c p hai ủ hai đ u, ph n ng s cho ra hàng lo t b n sao c a đo n DNA ồ ữ Nguyên t c c a ph ươ spp. Ph ợ quá trình t ng h p DNA m i t ạ ộ dài ra nh ho t đ ng c a DNA polymerase đ hình thành m t m ch m i hoàn ộ ỉ ch nh. Trong m t ph n ng PCR đ khu ch đ i m t trình t ể ố ữ ầ đó đ thi c n ph i có nh ng thông tin t ồ sung ề (antisense primer) so v i chi u phiên mã c a gene. M t khi đ ả ứ ầ ồ ổ m i b sung ắ n m gi a hai m i đó.

ạ ủ Các giai đo n c a PCR

ộ ỳ ố ế ộ ỗ ỗ

ỳ ồ ề ả ứ M t ph n ng PCR làm m t chu i nhi u chu k n i ti p nhau, m i chu k g m ba giai đo n:ạ

ế ầ ộ

ạ ế ệ ộ ứ ế ượ ự ở c bi n tính ồ nhi

ườ ị Giai đo n bi n tính: trong m t dung d ch phanr ng bao g m các thành ph n ử ầ t đ cao trong DNA đ c n thi t cho s sao chép, phân t oC. ở ầ vòng 30 gi y 1 phút, th 94 ng là

ạ ắ ặ ở ệ ộ ượ ạ ấ ồ t đ đ

ạ giai đo n này, nhi ự ệ ệ ộ ả ộ c h th p cho phép các m i t đ này giao đ ng trong kho ng t ừ

Giai đo n b t c p: ớ ắ ặ b t c p v i khuôn. Trong th c nghi m, nhi 300C700C kho ng 4060 giây. ả

ợ

0C cho DNA polymerase s ử ờ ợ ố t nh t. Th i gian tùy

ạ ổ ố ị ạ ộ ấ ệ ộ ượ Giai đo n t ng h p: nhi t đ đ ệ ụ d ng v n là polymerase ch u nhi ế c tăng lên đ n 72 ổ t ho t đ ng t ng h p t

ủ ự ế ạ ầ ườ ừ ế DNA c n khu ch đ i th ng kéo dài t 20 giây đ n

ộ ộ thu c đ dài c a trình t ề nhi u phút.

ề ầ ỗ ầ c l p l

ấ ả ứ ả ả ứ ế

ỳ ự ỳ ự ế ẫ

ớ ố ượ ở ả ứ ầ ộ

ướ ệ ấ ạ ẽ ượ ặ ạ ạ ủ ạ ượ c nhu m b i ethidium bromide và có ẩ i tia

i nhi u l n, m i l n Trong ph n ng PCR, chu k ba giai đo n s đ ấ ố làm tăng b n sao g p đôi. S khu ch đ i c a ph n ng là theo c p s nhân và ả theo tính toán, sau 30 chu k , s khu ch đ i là 106 so v i s l ng b n m u ban đ u. Sau ph n ng PCR, các DNA đ ả ể th quan sát th y thông qua đi n di s n ph m trong agarose và quan sát d UV.

ươ ể ệ ậ ẩ

ng pháp này s d ng m u dò đ phát hi n vi sinh v t trong th c ph m ệ ự ơ ở ủ ử ụ ệ ư ủ ậ ộ

ự ẫ Ph ặ ự d a trên s phát hi n m t đo n gen đ c tr ng c a vi sinh v t. C s c a vi c ử ụ s d ng m u dò là lai phân t ẫ ạ ử .

ỗ ờ ạ ắ ủ

ắ ặ ủ ườ i bình th

ằ ạ

ệ t ạ ự t đ nóng ch y c a DNA (T m) và s tái b t c p c a các đo n ộ ệ ộ ở ạ ng. M t trong t đ tr l ế ể ắ bào c c đ nh trên giá th r n và n m ngay trên t ớ ự ồ ồ ự ệ ộ ả ủ t quá nhi ổ ự nucleotide b sung khi nhi ượ ố ị ổ ạ x y ra khi đo n m i có trình t

ử ả ụ ủ ể ổ nucleotide b sung v i ệ ộ ộ t đ và khi trên DNA m c tiêu g p nhau do chuy n đ ng c a nhi

ườ ấ ấ ơ Quá trình bao g m s tách r i hai m ch đôi c a chu i xo n kép DNA khi nhi ộ ượ đ v DNA có trình t 2 m ch DNA b sung đ ự hay mô. S lai phân t ự ộ m t trình t ệ ộ nhi ặ ộ ng th p h n T m ít nh t vài đ . t đ môi tr

ụ ạ ứ Ph m vi ng d ng

ươ ể ng pháp này tham chi u theo TCVN 79051:2008 (ISO 218721:2007 dùng đ phát

ự ứ ẩ ế Ph hi n ệ V. cholerae trong th c ph m và th c ăn chăn nuôi.

Nguyên t cắ

ẩ ượ ằ ẫ ng m u

ự c th c hi n b ng cách cân m t l ọ ọ ỏ

ự ườ trong môi tr ọ ọ ườ ệ ừ ng l ng ch n l c. T đây d ch khu n đ ẩ ạ c c y ẽ ượ ị ố ộ ượ ẩ ượ ấ V. cholerae s đ ữ ng r n ch n l c. Nh ng khu n l c gi ng c thí

ị ể ệ Phát hi n ệ V. cholerae trong th c ph m đ ủ xác đ nh và nuôi ắ chuy n sang môi tr ả ứ nghi m ph n ng sinh hóa.

ườ ấ Môi tr ng và môi ch t

ụ ườ

M c đích ọ ọ Tăng sinh ch n l c

ơ ộ ẳ ị Kh ng Đ nh s b

ử ể ẳ ị Th String test sinh hóa đ kh ng đ nh

ử ể ệ ẳ ị ơ

Th nghi m sinh hóa đ kh ng đ nh s bộ

ỉ ấ Môi tr ng và hóa ch t APW (Alkaline Phosphat Water) TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose) Phân l pậ ụ ồ NA/KSA Ph c h i TSI/KIA ấ Đĩa gi y Oxidase ị Dung d ch NaCl KOH 3% Arginine dehydrolase Ornithine Decarboxylase Lysine Decarboxylase TW (Tryptone Water) ONPG Kowac’s HCL và NaOH (KOH) 10% ử ố Thu c th Indol Ch nh pH