Đồ án môn học công nghệ cố định Enzym và ứng dụng [mới nhất]

Ạ Ọ Ố Ồ Ố Đ I H C QU C GIA THÀNH PH H CHÍ MINH

ƯỜ Ạ Ọ TR NG Đ I H C BÁCH KHOA

Ọ Ậ Ỹ KHOA K THU T HÓA H C

ộ Ẩ ự Ệ B MÔN CÔNG NGH TH C PH M C5S CQ OỈ

Ồ

Ọ

Đ ÁN MÔN H C

Ệ Ố Ị CÔNG NGH C Đ NH ENZYM

Ứ

Ụ

YÀ NG D NG

Ả ư SVTH Ễ : NGUY N B O D

MSSV : 60700443

Ầ GYHD : TS. TR N BÍCH LAM

ồ TP H Chí Minh, 6/2011

NH? N X? T C? A GI? O VI? N H? ? NG D? N

?? ?n m ?n h?c

/V ~

Tp. H? Ch? Minh, th? ng 6 n? m 2011 Ch? k? c ? a g i? o vi? n

?? ?n m ?n h?c

Ờ Ả Ơ L I C M N

ả ơ ầ ậ ướ ẫ ỡ Tôi xin chân thành c m n TS. Tr n Bích Lam đã t n tình h ng d n và giúp đ tôi

ự ệ ố ồ ờ trong su t th i gian th c hi n đ án.

ả ơ ự ẩ ậ ầ ộ ọ ỹ ệ C m n quý th y cô b môn Công ngh Th c ph m, khoa K thu t Hóa H c, tr ườ ng

ạ ọ ạ ả ệ ứ ề ế ạ Đ i h c Bách Khoa TpHCM đã gi ng d y nhi ữ t tình và truy n đ t nh ng ki n th c quý báu

ồ ủ c a mình giúp tôi hoàn thành đ án.

ả ơ ấ ả ạ ữ ườ ồ Xin c m n t t c b n bè, nh ng ng ỡ i đã quan tâm, giúp đ tôi hoàn thành đ án

này.

ố ồ Thành ph H Chí Minh, tháng 6/2011

ễ ả ư Nguy n B o D

iii ~

?? ?n m ?n h?c

Ụ Ụ M C L C

TRANG BÌA.................................................................................................................................i

Ủ Ậ ƯỚ NH N XÉT C A GIÁO VIÊN H NG D N Ẫ .......................................................................ii

L I C M N Ờ Ả Ơ ............................................................................................................................iii

Ụ M C L C Ụ ...................................................................................................................................iv

Ụ DANH M C HÌNH ....................................................................................................................vi

Ả Ụ DANH M C B NG ...................................................................................................................vi

ươ Ồ Ch ng 1: T NG QUAN ........................................................................................................1

ố ị ử ị 11.L ch s phát tri n c a ể ủ enzym c đ nh .....................................................................................1

ơ ượ ề ố ị 12.S l c v enzym c đ nh ......................................................................................................2

ị 1.21.Đ nh nghĩa ...................................................................................................................2

ố ị ể ặ ủ 1.22.Đ c đi m c a enzym c đ nh .....................................................................................2

ượ ố ị ủ ể Ư 1.23. u nh c đi m c a enzym c đ nh ..........................................................................3

ươ 1.24.Các ph ố ị ng pháp c đ nh enzym ................................................................................3

ậ ệ ố ị 1.25.V t li u c đ nh ........................................................................................................ 5

ộ ố ế ố ả ưở ế ự ố ị 1.26.M t s y u t nh h ng đ n s c đ nh enzyme ...................................................7

ươ Ứ Ố Ị Ụ Ủ Ch ng 2: NG D NG C A ENZYM C Đ NH ................................................................9

ệ ự ứ ụ 21. ng d ng trong công ngh th c ph m ẩ ...................................................................................9

2.11.Enzym ßgalactosidase.................................................................................................9

ớ ệ ề 2.1.11.Gi i thi u v enzym ßgalactosidase .................................................................9

ậ ồ 2.1.12.Ngu n thu nh n enzym ßgalactosidase ................................................................9

ươ ố ị 2.1.13.Các ph ng pháp c đ nh enzym ßgalactosidase ...............................................10

ố ị ứ ụ ủ 2.1.14. ng d ng c a enzym ßgalactosidase c đ nh ....................................................13

ữ ủ 2.1.1.41.Th y phân lactose trong s a và lactoserum ..................................................13

ổ ọ 2.1.1.42.T ng h p GalactoOhgosaccharides (GOSs) ................................................16

2.12.Enzym lipase..............................................................................................................17

ớ ệ ề 2.L2.1. Gi i thi u v enzym hpase ................................................................................17

ậ ồ 2.L2.2. Ngu n thu nh n enzym lipase ...........................................................................17

ươ ố ị 2.1.23.Các ph ng pháp c đ nh enzym lipase .............................................................18

ệ ự ứ ụ ố ị 2.1.24. ng d ng enzym lipase c đ nh trong công ngh th c ph m ẩ ............................20

/V ~

ứ ụ ổ ọ ươ ố ị 2.1.2.41. ng d ng lipase c đ nh t ng h p các ester có h ng trái cây ...................20

?? ?n m ?n h?c

ể ả ố ị ụ ấ ụ enzyme lipase c đ nh đ s n xu t Mên t c monoacylglycerol ứ ng d ng ừ olein d u c t ầ ọ ....................................................................................................... 21

2.13.Enzym agalactosidase (raffinase)..............................................................................23

ệ ề 2.1.31.Giói thi u v enzym agalactosidase ..................................................................23

ồ ậ 2.L3.2. Ngu n thu nh n enzym agalactosidase ........................................................23

ươ ố ị 2.L3.3. Cách ph ng pháp c đ nh enzym agalactosidase.......................................23

ứ ố ị ụ ủ 2.L3.4. ng d ng c a enzym riffinase c đ nh .........................................................26

ứ ụ 22. ng d ng trong phân tích .....................................................................................................27

ề ả ế ổ ọ 2.21.T ng quan v c m bi n sinh h c (biosensor) ..........................................................27

ớ ề ả ệ ế 2.2.11.Gi i thi u v c m bi n sinh h c ọ .......................................................................27

ể ả ử ế ị 2.2.12.L ch s phát tri n c m bi n sinh h c ọ ................................................................27

2.2.13.Phân lo iạ ..............................................................................................................28

ế ố 2.2.14.Các y u t sinh h c ọ ............................................................................................29

2.2.14.L Enzym ....................................................................................................29

2.2.1.42.Kháng th ể ....................................................................................................29

2.2.1.43.Vi sinh v t ậ ...................................................................................................30

ể ộ ổ 2.2.15.B chuy n đ i (transducer) ................................................................................30

ệ ổ ể 2.2.1.51.Chuy n đ i đi n hóa ....................................................................................30

ổ ể 2.2.1.52.Chuy n đ i quang ........................................................................................30

ể ổ 2.2.1.53.Chuy n đ i nhi ệ .........................................................................................30 t

ể ể 2.2.1.54.Chuy n đ i b ng tinh th áp đi n (piezoelectric) ......................................30

ổ ằ ọ ử ụ ả oxidase và Lglutamate dehydrogenase ể ự ệ ế 2.22.C m bi n sinh h c s d ng Lglutamate ố ị c đ nh dùng đ phân tích monosodium glutamate trong th c ph m ẩ ................................31

ớ 2.2.21.Gi i thi u ệ ............................................................................................................31

ươ 2.2.22.Ph ng pháp thí nghi m ệ .....................................................................................31

2.2.2.21.Các hóa ch t s d ng ấ ử ụ ..................................................................................31

ự ố ị 2.2.2.22.S c đ nh enzym .......................................................................................31

2.2.223.Đi n c c ệ ự ......................................................................................................32

/V ~

ử 2.2.2.2A Th nghi m ệ ..........................................................................................32

?? ?n m ?n h?c

2.2.2.25.Quá trinh ph n ng ả ứ .....................................................................................33

ấ ệ ộ 2.2.22.Ó. C u hình nhi t đ và pH .......................................................................33

ị 2.2.223.Xác đ nh giá tr ị Km và Vmax.........................................................................34

/V ~

ố ị ự ổ ị 2.2.2.2.8. ủ S n đ nh c a màng c đ nh ................................................................35

?? ?n m ?n h?c

Ả KH O Ệ LI U THAM

Ụ

ố ị ọ ậ ố ủ ặ ế ỉ ườ ộ ồ ế ọ ..................................................................................33 ả ệ ộ ớ ồ ở ộ ammonium v i n ng đ t đ 25 ± 2 nhi °c có m t 2mM NADPH và lOmM

ớ ồ ộ t đ ọ ờ ế ứ ủ enzym c đ nh trên c m bi n sinh h c trong th i gian 60 ngày: TÀI .................................................................................................................................................. 36DANH M C HÌNH Hình 2.1: Mô hình biosensor.....................................................................................................27 ả .......32 Hình 2.2: Mô hình c m bi n sinh h c phân tích MSG dùng LGLODLGLDH c đ nh ụ ệ Hình 2.3: Đ ng hi u ch nh v n t c tiêu th Oxy theo n ng đ MSG c a c p LGLODL ố ị GLDH c đ nh trong c m bi n sinh h c ặ Hình 2.4: pH MSG 1.2mg/L..............’...........................’...............................................................................34 ệ ộ ở pH 7.0 v i n ng đ MSG 12mg/dL .......................................................34 Hình 2.5: Nhi ả ố ị ạ L Hình 2.6: Ho t tú i c a GLOD 25ULGLDH 143.2U; LGLOD 25ULGLDH 35U; LGLOD 25U..........................35

•

Ả Ụ DANH M C B NG

Ư ố ị ư c đi m c a các ph orng pháp c đ nh ố ị ể ư ủ ượ t các ph cmg pháp c đ nh ỹ ử ụ ủ lactose s d ng các k thu t c đ nh khác nhau ậ ố ị ứứ ả ả ả ả B ng 1.1: u Nh ắ B ng 2.1: Tóm t B ng 2.2: Th y phân ồ B ng 2.3: Ngu n vsv thu nh n enzyme........................................4 enzym Pgalactosidase.......................................13 ....................................15 ấ enzyme lipase ...............................18 ậ enzym lipase và t i ch t

Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c

ươ Ổ Ch ng 1: T NG QUAN

ố ị ử ị 11.L ch s phát tri n c a ể ủ enzym c đ nh [1]

ấ ằ ủ ấ Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho th y r ng enzym invertase c a n m men

ủ ụ ả ấ ườ ế ớ ữ ệ ề ấ (EC.3.2.1.2.6) khi h p th vào than có kh năng th y phân đ ng saccharose. Sau đó ên th gi ề i xu t hi n nhi u báo cáo v kh ả

ố ị ế ồ ằ ấ ị ướ ư ử năng c đ nh enzym b ng liên k t đ ng hóa tr trên ch t mang. Tr ộ c năm 1953 ch a có m t nghiên c u nào v ề enzym không hòa tan

ượ ứ ự ế ụ đ c ng d ng vào th c t .

ố ị ượ ư Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã c đ nh đ c m t s ộ ố enzym nh carboxy peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên

ớ ắ ầ ệ ứ ế ồ ử ụ ử ằ ị polyaminostyrene b ng liên k t đ ng hóa tr và các nghiên c u trên m i b t đ u th nghi m ng d ng qui mô pilot.

ạ ượ ể ầ ể ố ấ ạ ị ứ Năm 1954, Chang đã t o ra đ c các vi ti u c u bán th m có g n ắ enzym đ ch ng l i d ng khi đ a ơ ể ư enzym vào c th .

ệ ệ ố Năm 1963, Bemfeld và Wan đã thí nghi m thành công vi c nh t các enzym nh ư amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel

polyacrylamide.

ả ươ ố ị ế ớ Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô t ph ng pháp liên k t chéo c đ nh carboxy peptidase A v i glutaraldehyde. Cũng trong

ể ươ ể ạ năm này Chang đã tri n khai ph ng pháp t o vi nang đ nh t ố enzym carbonic anhydrase.

ự ưở ể ả ố ị ự ệ ằ Năm 1969, Wilson đã xây d ng thành công x ng th c nghi m đ s n xu t ấ glucose b ng glucoamylase c đ nh.

ữ ườ ộ ở ữ ậ ườ ầ ự ệ Năm 1969, Chibata và nh ng ng i c ng tác công ty Tanabe Seiyaku Nh t đã là nh ng ng i đ u tiên th c hi n thành công

ụ ệ ố ị ệ ả ấ ươ ố ị ủ ả ườ vi c áp d ng enzym c đ nh vào s n xu t công nghi p. Theo ph ng pháp c đ nh enzym c a các tác gi ng i Nh t, ậ enzym

ủ ấ ợ ượ ắ ử ụ ủ ế aminoacylase c a n m s i đã đ c g n vào DEAEsephadex thông qua liên k t ion và s d ng chúng cho các quá trình th y phân.

ố ị ế ộ ế ằ Năm 1970, Mosbach đã ti n hành c đ nh ba lo i ạ enzym: Pgalactosidase, hexokinase, glucophosphatase b ng hên k t c ng hóa tr ị

ạ ớ v i các h t sephadex.

ứ ể Năm 1971, Gregoriadis đã tri n khai liposome có ch a amyloglucosidase.

ữ ườ ầ ệ ố ị ế ộ Năm 1973, Chibata và các c ng tác viên cũng là nh ng ng i đ u tiên thành công trong vi c c đ nh t ậ ể ả bào vi sinh v t đ s n

ấ ế ứ ạ ấ xu t Laspartate t ừ ammonium fumarate b ng ằ gel acrylamid. T bào E.coli ch a trong gel có ho t tính aspartate r t cao.

ệ ứ ụ ế ằ ố ị ế ả Đ n năm 1987, b ng công ngh ng d ng enzym glucoisomerase c đ nh, đã ti n hành s n xu t s o ấ ữ fructose t ừ glucose theo qui

ệ ế ả ổ ượ ả ư ấ ố ị mô công nghi p. Cho đ n nay c kho ng 4,5 tri u t n s o ệ ấ ừ fructose đ c s n xu t theo ph ong pháp enzym c đ nh.

ẩ ượ ứ ụ ề ễ ố ườ Ngoài sàn ph m trên, ố ị enzym c đ nh còn đ ệ c ng d ng nhi u trong công ngh lên men, ch ng ô nhi m môi tr ả ng và c trong

y h c.ọ

ố ị 11.S lu c v ơ ợ ề enzym c đ nh

ị

1.21.Đ nh nghĩa [1] ố ị ể ể Enzym c đ nh có th hi u theo 2 nghĩa:

ượ ư ữ ẽ ể ườ ị Nghĩa h p:ẹ enzym không hòa tan là enzym đ c đ a vào nh ng pha riêng r , pha này có th tách riêng vói môi tr ng dung d ch

ứ ướ ượ ắ ư ướ ượ ử ớ phàn ng. Pha enzym không hòa tan trong n c và đ ớ c g n v i các polymer a n ọ c có tr ng l ng phân t l n.

/V ~

ố ị ấ ế ơ ể ố ờ ạ ử ụ ạ ư ậ ộ Nghĩa r ng: c c ắ ch t xúc tác c đ nh là các enzym, t bào, c th s ng tr ng thái cho phép s d ng l i. Nh v y, theo nghĩa

Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c

ồ ượ ố ị ấ ế ố ộ r ng, enzym không hòa tan bao g m c ả enzym đ ộ c c đ nh vào m t ch t mang, c ả enzym có trong t bào s ng, chúng đ ượ ố c c

ề ầ ử ụ ả ứ ự ắ ấ ọ ộ ế ị đ nh trong các bình ph n ng sinh h c có s g n k t vào m t ch t mang cho phép ta s d ng nhi u l n.

ố ị ườ ượ ắ ề ấ ằ ậ ộ ỹ Enzym không hòa tan hay enzym c đ nh th ng là nh ng ữ enzym hòa tan đ c g n vào m t ch t mang b ng nhi u k thu t khác

ấ ắ ờ ừ ạ nhau. Nh qu trình g n này mà enzym t ể tr ng thái hòa tan chuy n sang không hòa tan.

ặ ố ị ể 1.22.Đ c đi m c a

ủ enzym c đ nh [1] ư ố ị ể ặ Enzym c đ nh có đ c đi m nh sau:

ố ị ạ ườ ỏ ơ ạ ự ự ạ ạ ở ổ Ho t tính c a ủ enzym c đ nh th ng nh h n ho t tính c a ủ enzym t ủ do cùng lo i. S dĩ có s thay đ i ho t tính riêng c a

ố ị ữ enzym c đ nh là do nh ng nguyên nhân sau:

ưở ủ ự ủ ệ ấ ấ ệ ớ ệ ả •Do nh h ệ ng đi n tích c a ch t mang: khi đi n tích c a ch t mang có s khác bi t v i đi n tích c a ủ enzym thì khi g nắ

ổ ở ứ ộ ổ ấ ấ ị ự ự ấ ấ enzym vào ch t mang, c u trúc không gian c a ủ enzym có s thay đ i m c đ nh t đ nh. Chính vì s thay đ i c u trúc này mà

ơ ấ ẽ ủ ứ ế ạ ả ẫ ự ế ọ s k t h p gi a ữ enzym và c ch t s kém đi, d n đ n ho t tính c a ch ng cùng gi m.

ạ ố ị ướ ế ở ặ ị ự ế ơ ấ ị ế ấ •Do enzym b nh t vào m ng l i ho c b liên k t b i ch t mang khi n cho s ti p xúc gi a ữ enzym và c ch t b kém đi.

ị ộ ố ấ ị ư ậ Michaelis Menten nh ng có m t s sai khác nh t đ nh: ố ị ể ả ấ Enzym c đ nh hoàn toàn tuân theo đ nh lu t ự ạ •Có th x y ra s c nh tranh c ch t v i ơ ấ ớ enzym và ch t mang.

ệ ượ ả ủ ơ ấ ố ộ ả ứ ế ả ẩ ả ả ở • X y ra hi n t ng c n tr khu ch tán c a c ch t và s n ph m làm gi m t c đ ph n ng.

ố ị ườ ề ự ở ủ ụ ấ ờ Enzym c đ nh th ng có tính b n nhi ệ ơ enzym t t h n do nh có tác d ng che ch c a ch t mang.

ố ị ườ ố ư ự ạ Enzym c đ nh th ng có pH t i u không trùng v i ớ enzym t do cùng lo i.

ố ị ắ ượ ả ấ Enzym c đ nh do có ch t mang che ch n nên đ c b o v t ệ ố ơ enzym t t h n do.ự

ề ầ ỏ ơ ử ụ ả ứ ộ ề ố ị ể ễ ễ ấ ộ ủ Enzym c đ nh có th tái s d ng nhi u l n và d dàng tách ra kh i c ch t m t cách d dàng sau ph n ng và đ b n c a

ố ị enzym c đ nh cao h n ơ enzym t do.ự

ượ ố ị ể Ư 1.23. u nh c đi m c a ủ enzym c đ nh [1]

Ư ể u đi m:

ề ầ ử ụ ố ị ể ờ Enzym c đ nh có th tái s d ng nhi u l n trong th i gian dài.

ố ủ ả ứ ố ị ẫ ẩ ả ườ ấ Enzym c đ nh không l n vào trong sàn ph m cu i c a ph n ng enzym, do đó nó không gây nh h ế ng x u đ n ch t l ấ ượ ng

ệ ẩ ố ỏ ả ẩ ả s n ph m, hay nói cách khác chúng ta không t n chi phí cho vi c tách enzym ra kh i s n ph m

ể ừ ả ứ ầ ế ằ ệ ấ ơ ấ ỏ ị Có th ng ng ph n ng khi c n thi t b ng cách tách h ch t mang enzym ra kh i dung d ch c ch t.

ố ị ươ ố ề ậ ớ Enzym c đ nh t ng đ i b n v i các tác nhân v t lý và hóa h c h n ọ ơ enzym t do.ự

ễ ế ả ấ ươ ụ D dàng ti n hành quá trình s n xu t theo ph ng pháp liên t c.

ươ Nh ể c đi m:

ặ ủ ự ể ấ ả ạ S có m t c a ch t mang có th làm gi m ho t tính c a ủ enzym.

ố ườ ể ị ả ố ị ạ ạ ấ Trong đa s tr ng h p, ấ ọ enzym có th b gi m ho t m t ho t tính sau qu trình c đ nh.

ữ ữ ế ể ạ ớ ợ ạ ậ Tuy nhiên, nh ng h n ch trên là không đáng k so v i nh ng l i ích mà ố ị enzym c đ nh mang l ề i. Do v y, ngày càng có nhi u

Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c

ứ ề ố ị ố ị ư ứ ệ ấ ả nghiên c u v c đ nh enzym cũng nh ng d ng ụ enzym c đ nh vào s n xu t công nghi p.

/V ~

ươ ươ ố ị ố ị ậ ọ 1.24.Các ph Các ph ng pháp c đ nh ng pháp c đ nh enzym [1] ượ enzym đ c chia thành 2 nhóm: hóa h c và v t lý.

Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c

ả Ư ượ ể ươ ổ ị ủ c đi m c a các ph ng pháp c đ nh B ng 1.1 : u Nh enzyme [1]

ươ Ph ọ ng pháp hóa h c

ươ Ư ể ượ Ph ng pháp u đi m Nh ể c đi m

ươ Ph ắ ng pháp g n enzym ế ữ ấ ạ Ho t tính enzym có th b ể ị

ấ ằ lên ch t mang b ng liên ế ề ạ ữ ế ả ổ Liên k t gi a enzym và ch t mang là Mên k t b n, do đó h n ch t ế ố i gi m do nh ng bi n đ i v ề

ị ế ộ k t c ng hóa tr ự ấ ủ đa s m t mát enzym trong quá ấ c u trúc c a enzym trong quá

ả ứ ố ị trình ph n ng. trình c đ nh.

ươ ượ ế ấ ề Ph ắ ng pháp g n các phân ạ T o đ c Mên k t r t b n tr ướ c ự Chi phí cao, thao tác th c hiên

ử ạ ớ ấ ệ ộ t enzym l i v i nhau các t c nhân pH, nhi t đ ... ươ ứ ạ ố t ng đ i ph c t p.

ế ộ ị ằ b ng liên k t c ng hóa tr ườ ượ ố ọ Th ng đ ớ c dùng ph i h p v i ạ Ho t tính enzym có th b ể ị

ươ các ph ng pháp khác. ữ ế ả ổ gi m do nh ng bi n đ i v ề

ủ ấ c u trúc c a enzym trong qu ấ

ố ị trình c đ nh.

ươ ậ Ph ng pháp v t lý

ươ Ư ể ượ Ph ng pháp u đi m Nh ể c đi m

ự ệ ả ấ ơ Thao t c th c hi n đ n gi n. ươ Ph ắ ng pháp g n enzym ự ươ Do l c t ữ ng tác gi a enzym ấ ằ lên ch t mang b ng tác ấ ễ ả ế và ch t mang y u nên d x y ệ ế ề ố Đi u ki n ti n hành c ị đ nh nhân v t lýậ ượ ệ ra hi n t ả ấ ng nh h p ph ụ enzym ôn hòa nên không làm m tấ ử ụ trong quá trình s d ng enzym ạ ho t tính c a ủ enzym trong quá ộ ấ ố ị c đ nh do khu y tr n hay do ố ị trình c đ nh. ệ ộ ủ ổ thay đ i nhi t đ , pH c a môi ả ử ụ Có kh năng tái s ấ d ng ch t ườ tr ng.

ươ ố ả ơ Ph ng pháp nh t enzym mang. Thao tác đ n gi n. ọ ỉ ả ứ Ch thích h p cho ph n ng

ơ ấ ớ v i c ch t có kh i l ố ượ ng ả ỏ Không đòi h i ph i có các nhóm phân t ử ỏ nh .

ế ọ ớ ạ t o Mên k t nên phù h p v i

ề nhi u lo i ạ enzym.

ả ố ị ệ Hi u qu c đ nh enzym cao.

ể ố ị ồ ề Có th c đ nh đ ng thòi nhi u

/V ~

ươ Ph enzym. hoc: ng pháp hóa

Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c

ằ ạ ớ ế ộ ằ ắ G n ắ enzym lên ch t mang b ng liên k t c ng hóa tr . ị ế ộ G n các phân t ấ ử enzym l ị i v i nhau b ng liên k t c ng hóa tr .

ươ Ph ng pháp vât lý:

ế ậ ư ự ế ả ấ ằ ấ H p ph ụ enzym lên ch t mang b ng liên k t v t lý nh sau: l c mao qu n, liên k t ion,

l c ự Van der Walls....

ươ ặ Ph ng pháp nh t ể ố enzym trong khuôn gel ho c màng bao vi th .

ậ ệ ố ị 1.2.5. V t li u c đ nh [1]

ậ ệ ươ ố ị ế ố ế ị ế ệ ấ V t li u và ph ng pháp c đ nh là hai y u t ả ủ có tính ch t quy t đ nh đ n hi u qu c a

ố ị ấ ủ ậ ệ ố ị ể ặ quá trình c đ nh enzym Trong đó, không có đ c đi m, tính ch t c a v t li u c đ nh nào thích

ấ ả ớ ấ ả ọ ọ h p cho t t c các lo i ạ enzym và cũng không có enzym nào thích h p v i t ạ ậ t c các lo i v t

ệ ố ị li u c đ nh.

ế ậ ệ ể ạ ơ ậ ệ ố ị V t li u c đ nh enzym và t ậ ệ ữ bào có th chia làm hai lo i: v t li u vô c và v t li u h u

c .ơ

Vât liêu vô c :ơ

ơ ề ậ ặ ấ ộ ớ ị Đ c đi m: ể ch t mang vô c b n v i các tác đ ng bên ngoài, không b vi sinh v t ăn mòn,

ệ ắ ư ủ ườ ơ phân h y, nh ng vi c g n v i ớ enzym th ng khó khăn h n.

ụ

ư

ủ

ư

ấ

ạ

oxid mangan, oxid magie, Silicagel...

M t s ộ ố ch t mang vô ấ c ơ thông d ng nh : th y tinh x p, ố c c oxid kim lo i nh oxid nhôm,

ữ ơ Vât liêu h u c :

ơ ườ ữ ặ ấ ạ ộ ư ọ Đ c đi m: ể ch t mang h u c th ng có các nhóm ho t đ ng hóa h c nh : NH

ễ ế ắ ộ ề ủ ư ộ ớ COOH, OH, SH,... nên d k t g n v i ớ enzym nh ng đ b n v i tác đ ng c a môi tr ườ ng

ặ ệ ọ ấ ễ ị ậ ấ ậ không cao, đ c bi t các polymer sinh h c r t d b vi sinh v t xâm nh p và t n công.

nhiên: ư t polymer • Các

ậ ệ ẻ ề ể ạ ộ ộ Tinh b t là v t li u phong phú r ti n. Tinh b t dùng đ đóng m ch, diethanolamin tinh

ượ ố ị ộ b t đã đ ấ c dùng làm ch t mang c đ nh enzym nh ư lipase, glucoisomerase, trypsin,

ượ ộ ươ ủ ể ộ ứ ế amylase. Nh c đi m c a tinh b t là đ tr ng kém, thi u các nhóm ch c năng nên kh ả

ố ị ạ ộ ườ ượ ớ năng c đ nh và ho t tính ấ enzym còn th p. Tinh b t th ng đ c ghép copolymer v i các

ư ướ ể ả ấ ơ vinyl monomer a n c nh ư acrylamide, acrylic acid đ c i thi n t ệ ính ch t c lý, đ ộ

ươ ề ặ ứ ạ ở tr ng n và t o các nhóm ch c năng trên b m t.

ẫ Cellulose và d n xu t c a ấ ủ Cellulose là CMcellulose, DEAEcellulose, nitrocellulose... là

ư ữ ạ ấ ườ ỉ ử ụ ậ ệ ẻ ơ nh ng v t li u r h n so v i ớ agarose nh ng l ồ i không đ ng nh t, th ng ch s d ng ở

ậ ệ ạ ợ ượ ứ ạ d ng s i, và d ng tinh th ể (microcrystalline). Cellulose là v t li u đ c nghiên c u c ố

/V ~

ậ ệ ố ị ầ ượ ị đ nh enzym đ u tiên, các quy trình c đ nh trên v t li u này đ ứ c nghiên c u khá hoàn

Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c

ườ ượ ế ộ ể ấ ụ ế ỉ ch nh. Cellulose th ng đ ị ớ c dùng đ h p th , hên k t ion, Mên k t c ng hóa tr v i

ặ ố enzym ho c nh t trong gel.

ấ ượ ọ ậ ừ ặ ừ Chitin là h p ch t đ c Braconnot phân l p t năm 1811 và Odier đ t tên là chitin t năm

ứ ứ ể ọ ọ ụ 1823. Chitin là m t ộ polymer sinh h c có nhi u tri n v ng trong nghiên c u và ng d ng ề

ế ổ ế ọ ấ ậ ệ ố ị làm v t li u c đ nh enzym và t bào. Chitin là m t ộ polymer sinh h c r t ph bi n trong t ự

ỉ ứ nhiên, ch đ ng sau cellulose.

ấ ươ ố Chitin có c u trúc t ng t ủ ự cellulose, là m t ộ polymer c a các g c 2acetoamide2 deoxy

ở ế ớ ßDglucoza, Mên k t v i nhau b i Mên k t ầ ấ ế ßl,4glycoside. Chitin có trong thành ph n c u

ỏ ủ ỏ ế ộ ậ ệ trúc v c a côn trùng, v tôm cua, sò, vách t bào sinh v t,... ậ Chitin là m t v t M u có

ứ ứ ấ ỗ ả ấ ch a nhóm ch c OH và cho Mên k t v i ế ớ enzym, có c u trúc siêu l , có kh năng h p th ụ

ố ễ ạ ẽ ể ạ ặ ấ ỉ t t, d t o màng. ế Chitin có c u trúc m ng tinh th ch t ch , không ch có các Mên k t

ữ ấ ạ ỗ hydro hình thành trong chu i mà còn có gi a c c lóp v i ớ nhau trong m ng tinh th . ể Chitin

ỵ ướ ộ ươ ề ặ ế ệ ề ấ ỏ là m t ộ polymer k n c, đ tr ề ặ ng th p, di n tích b m t ti p xúc nh và b n v m t

ố ị ứ ề ầ ấ ọ ủ ế hóa h c. G n đây có r t nhi u nghiên c u c đ nh ằ enzym trên chitin, ch y u b ng

ươ ụ ế ầ ấ ố ị ượ ph ng pháp h p th và Mên k t công hóa tr qua c u n i glutaraldehyde. Chitin đ c tìm

ấ ế ấ ữ ủ ế ấ ợ ơ ượ ể ớ th y trong thành t bào c a n m s i. Nó là ch t h u c chi m l ng l n đ hình thành

ủ ộ ậ ỏ ươ ố nên lóp v ngoài c a đ ng v t không x ng s ng (côn trùng, giáp xác...). ặ ấ v ề m t c u trúc,

ấ ươ ự ể ệ ấ ọ chitin có c u trúc t ng t nh ư cellulose, đi m khác bi t hóa h c duy nh t là nhóm

ở ị ố ượ ế acetamido v trí s 2 trên khung ủ carbon c a chitin đ c thay th cho nhóm hydroxyl (

ờ OH) ceUulose.

ấ ủ ẫ ượ ề ạ Chitosan là d n xu t c a chitin khi đ ễ ạ c deacetyl hóa trong ki m m nh. Chitosan d t o

2. Chitosan có th c đ nh

ạ ạ ấ ỗ ể ố ị màng, t o h t, có c u trúc siêu l , có nhóm NH enzym b ngằ

ươ ụ ươ ặ ộ ị ph ấ ng pháp h p ph , ph ng pháp c ng hóa tr , ho c nh t ố enzym trong gel chitosan.

ướ ữ ơ Chitosan không tan trong n c, tan trong dung môi h u c nh ư acid formic, acid dipic, acid

ọ ọ ượ ử acetic. Chitosan là m t ộ polymer sinh h c có tr ng l ng phân t cao, có các nhóm amin

ạ ộ ấ ứ ể ọ ho t đ ng, c c nhóm hydroxyl có th tham gia phàn ng hóa h c.

ệ ạ ả ậ ị ể Anginate, carrageenan, c hai v t M u này t o gel trong dung d ch CaC Ỉ2 dùng đ nh t t ố ế

/V ~

bào, enzym.

Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c

ấ ườ ườ ả Ch t mang protein th ng là gelatin, keratin, albumin,... th ễ ạ ng có kh năng d t o

ạ ạ ớ ạ màng, t o h t, nh t ố enzym trong khuôn gel v i tác n hân đóng m ch là glutaraldehyde; nh ượ c

ủ ể ườ ề ễ h p:ơ đi m c a nhóm này là th ễ ị ng kém b n, d b nhi m khu n. ẩ • Các polymer tone

ọ ổ ượ ử ụ ố ị C c ấ polymer t ng h p đ ấ c s d ng làm ch t mang c đ nh enzym nh ư polyacrylamide,

polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polyhydroxyethylacrylate,

polystyrene,...

ủ ấ ơ ề ọ ổ ố Ư ể u đi m chung c a các polymer t ng h p này là b n, tính ch t c lý t t, hoàn toàn tr ơ

ộ ươ ẩ ố ể ề ỉ ủ ớ ự ấ v i s t n công c a vi khu n, đ tr ng t t, m t s ộ ố polymer có th đi u ch nh kích

ướ th c siêu l .ỗ

ượ ể ả ươ ọ ọ Nh c đi m là m t s ộ ố polymer có giá thành cao, kh năng t ng h p sinh h c kém,

ủ ể ườ ự ễ ườ không th phân h y trong môi tr ng t nhiên nên gây ô nhi m môi tr ng.

ộ ố ế ố ả ưở enzyme [1]

1.2.6. M t s y u t ủ ưở ế ự ố ị ng đ n s c đ nh nh h ấ mans ne c a ch t nh h Ả

ề ơ ọ ủ ư ệ ấ ấ ấ C c tính ch t lý h c c a ch t mang nh tính hòa tan, tính b n c hóa, di n tích, tính háo

ướ ỵ ướ ề ả ưở ấ ị ế ượ ượ n c và k n c,.. .đ u có nh h ng nh t đ nh đ n l ng enzym đ ế ế c liên k t, đ n

ọ ủ ấ ẫ ề tính b n và ho t ạ tính sinh h c c a các ch t d n xu t ấ enzym không tan.

ủ ả ấ ả ấ ọ ưở ế ả ẫ B n ch t hóa h c c a ch t mang cũng nh h ấ ạ ng đ n kh năng t o thành d n xu t

ớ ấ ừ ư ặ ả ấ ấ ườ enzym và t ụ i kh năng ch t mang h p ph không đ c tr ng các ch t t môi tr ả ng ph n

ng.ứ

ự ị ề ẫ ệ S đ nh v ị enzym giúp cho d n xu t ấ enzym không tan có tính b n nhi t cao h n ơ enzym

tan.

ế ự ế ụ ấ ạ Ch t mang có tác d ng h n ch s bi n tính c a ứ ố ủ enzym trong các dung môi, làm đ t n i

liên k t ế hydro và liên k t k n ế ỵ ướ c

Ả ưở nh h ủ ns c a vH

ự ệ ầ ầ ấ ồ ộ ơ ấ ấ Khi l c ion th p thì n ng đ H+ g n ch t mang tích đi n âm cao h n, còn g n ch t

ệ ươ ế ả ơ ị mang tích đi n d ng cao h n trong dung d ch. K t qu là pH t ố ư ủ enzym liên k tế i u c a

ị ớ ể ệ ẽ ấ ị ồ đ ng hóa tr v i ch t mang tích đi n âm s chuy n d ch ề sang pH ki m so v i ớ enzym hòa

ế ồ ị ớ ệ ấ ươ tan, trái l ạ ế enzym liên k t đ ng hóa tr v i ch t mang tích đi n d i n u ng thì pH t i uố ư

ể ị ẽ s chuy n d ch sang phía pH acid.

ủ ự ấ ớ ượ ấ ở ệ Khi l c ion l n thì đi n tích c a ch t mang đ c trung hòa b i các ion trái d u và pH t iố

ầ ố ố ị ư ủ enzym c đ nh g n gi ng u c a enzym hòa tan.

ưở Ả nh h ủ enzyme ne c a

ố ị ữ ả ộ Theo Poltorak, m t trong nh ng nguyên nhân làm gi m ho t đ c a ạ ộ ủ enzym c đ nh là

Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c

ữ ượ ế ự ươ s t ng tác proteinprotein gi a các phân t ử enzym đã đ c liên k t.

ọ ườ ạ ộ ị ả ủ ề ế ẩ ấ ọ Trong m i tr ớ ự ng h p đ u th y ho t đ riêng c a ch ph m b gi m đi cùng v i s

/N/ 'J /%/

ượ ượ ế ọ ộ ơ ị ệ ấ tăng l ng enzym đ c k t h p trên m t đ n v di n tích ch t mang.

Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c

Ả ưở ươ ố nh h ủ ne c a ph ns pháp c đinh

ố ị ằ ươ ụ ậ ấ ị Khi c đ nh b ng ph ng pháp h p ph v t lí, các ổ ấ enzym ít b thay đ i c u trúc không gian

ả ườ ư ế ạ ươ ế ế ử ụ do đó ft nh h ng đ n ho t tính. Nh ng do ph ng pháp này s d ng các liên k t y u nh ư

ế ị ướ ế ễ ị ả ấ liên k t k n c, liên k t hydro,... nên enzym d b gi ụ i h p ph .

ố ị ằ ươ ế ộ ử ụ ị ẽ ộ ổ ị Khi c đ nh b ng ph ư ng pháp liên k t c ng hóa tr s có đ n đ nh cao khi s d ng d ói

ư ề ố ớ ự ả ả ố ị ườ ệ các đi u ki n nh nhi ệ ộ pH, có kh năng ch ng ch u cao đ i v i s nh h t đ , ủ ng c a các

ữ ơ ậ ế ộ ị ẽ ổ dung môi h u c và các tác nhân v t lí ổ khác. Tuy nhiên, liên k t c ng h a tr s làm thay đ i

ẽ ấ ố ị ạ ạ ườ m nh m c u trúc không gian c a ủ enzym nên ho t tính c a ủ enzym c đ nh th ị ả ng b gi m đi

đáng k .ể

ố ị ằ ươ ạ ộ ộ Khi c đ nh b ng ph ng pháp bao gói, quá trình ho t đ ng c a ụ ủ enzym ph thu c vào hai

ướ ấ ọ ượ ủ ử ơ ấ ế ố y u t chính là kích th c ch t mang polyme và tr ng l ng c a phân t c ch t. Hai y u t ế ố

ủ ơ ấ ả ữ ẽ ế ấ ẩ ả ộ ơ ố này s làm gi m t c đ khu ch tán c a c ch t, s n ph m và các ch t khác. H n n a, cùng

ộ ủ ơ ẽ ệ ấ ấ ạ ồ ớ v i ho t tính xúc tác cao c a ả ủ enzym s làm xu t hi n gradient n ng đ c a c ch t và s n

ố ị ủ ề ẩ ấ ố ị ph m c a dung d ch và ch t mang ch a ứ enzym c đ nh. Đi u này làm cho các thông s công

ề ầ ệ ể ổ ế ậ ủ ngh thay đ i, đó là đi u c n đ ý khi thi t l p quy mô c a quá trình.

ươ Ố Ị Ứ Ụ Ch ng 2: NG D NG C A Ủ ENZYM C Đ NH

ệ ự ứ ụ ẩ 21. ng d ng trong công ngh th c ph m

2.11.Enzym pgalactosidase

Ịỉ 2.1.11.Giói thi u v ệ ề enzym ỉ galactos dase [2]

ủ ườ Enzym Pgalactosidase (EC.3.2.1.23) là m t ộ lactase th y phân đ ng lactose thành

ệ ử ụ ể ủ các monomer là glucose và galactose. Vi c s d ng Pgalactosidase đ th y phân lactose trong s aữ

ế ế ự ứ ữ ụ ệ ề ẩ ộ và whey là m t trong nh ng ng d ng ti m năng trong công nghi p ch bi n th c ph m và các

ẩ ể ượ ử ụ ướ ạ ố ị ặ ạ sàn ph m t ừ ữ Enzym này có th đ s a. c s d ng d ư i d ng hòa tan ho c d ng c đ nh nh ng

ể ử ụ ố ị ạ ạ ấ ả ỉ ợ ạ d ng hòa tan ch có th s d ng trong qui trình s n xu t gián đo n, còn d ng c đ nh có l i th ế

ể ử ụ ố ụ ấ ả ạ ả hon là có th s d ng t t cho c hai qui trình s n xu t gián đo n và liên t c.

ủ ệ ế ẫ ặ ầ ự M c dù h u h t các ngành công nghi p v n th y phân lactose v i ớ enzym t ư do, nh ng

ố ị ữ ự ề ộ ệ ử ụ vi c s d ng enzym Pgalactosidase c đ nh là m t lĩnh v c đáng quan tâm vì nh ng ti m năng

ủ c a nó.

ỉ ồ 2.1.12.Ngu n thu nh n ậ enzym pgalactos dase [2]

ể ượ ậ ừ ư ề ồ Enzym Pgalactosidase có th đ c thu nh n t nhi u ngu n khác nhau nh vi sinh

ự ậ ậ ộ ượ ậ ừ ậ v t, th c v t, và đ ng v t. Tuy nhiên, tính ch t c a ấ ủ enzym đ c thu nh n t ấ ồ các ngu n kh c

ậ ừ ự ự ậ ậ ồ ị nhau có s khác nhau rõ r t. ệ Enzym thu nh n t ộ ngu n th c v t và đ ng v t có giá tr kinh t ế

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ậ ừ ư ấ ậ ạ ồ ế ư ễ ề ư ử ậ th p, nh ng thu nh n t ngu n vi sinh v t l i có nhi u u th nh d dàng x lí thu nh n, t c đ ố ộ

ộ ố ậ ượ ậ ả ẩ ậ ấ ố nhân gi ng vi sinh v t cao, năng su t thu nh n s n ph m cao. M t s vi sinh v t đ c xem là

ủ ậ ồ ề ngu n thu nh n ti m năng c a lo i ạ enzym này.

ỉ Bacteria: Alicyclobac llus acidocaldarìus subsp, Rittmannii Arthrobacter sp,_Bacittus

ỉ ỉ acidocaldar us, B. circulans, B. coagulans, B. subtilis, B. megaterum, B. stearothermoph lus,

Bacteriodes polypragmatus, Bifidobacterium bifidum, B. infantis, Clostridium acetobutylicum,

c.thermosulfurogens, Corynebacterium murisepticum, Enterobacter agglomerans,E. cloaceae,

Escherichia coll, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus,L. helviticus, L.

kefiranofaciens, L. lactis, L. sporogenes, L. themophilus, L. delbrueckii, Leuconostoc citrovorum,

Pediococcus acidilact , ỉ p. pento, Propioionibacterium shermanii, Pseudomonas fluorescens,

Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, s. lactis, s. thermophius, Sulfolobus solfatarius, Thermoanaerobacter sp.,Thermus rubus, T. aquaticus, Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris.

Fungí: Alternaría alternate, A. palmi, Aspergillus foelidis, A. fonsecaeus, A. fonsecaeus, A.

Carbonarius, A. Oryzae, Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis, Fusarium monilliforme,

F. oxysporum, Mucor meihei, M. pusillus, Neurospora crassa, Penicillum canescens, p.

chrysogenum, p. expansum, Saccharopolyspora rectivergula, Scopulariapsis sp, Streptomyces

violaceus.

Yeast: Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, s. lactis,

S.fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, K.fragüis, K. lactis, K.marxianus.

ươ ố ị 2.1.13.Các ph ng pháp c đ nh enzym ßgalactosidase [2]

ươ ấữ Ph ns pháp h phu vât lý

ủ ư ấ ấ ấ ơ ố ấ ữ ơ C c ch t vô c nh nhôm, silic, th y tinh x p, đ t sét, bentonite,... ch t h u c nh ư

ự ạ ộ ượ ử ụ ụ ấ ấ cellulose, tinh b t, than ho t tính, nh a trao đ i ổ ion,... đ c s d ng làm ch t mang h p ph trong

ơ ữ ể ử ự ổ ể ị ố ị c đ nh ớ enzym. H n n a có th x lí thêm v i glutaraldehyde đ tăng s n đ nh.

ượ ố ị Enzym ßgalactosidase t ừ K. fragilis và K. lactis đ c c đ nh trên chitosan có ho t đ ạ ộ

ọ ượ ủ ế ượ ố ị ừ K. fragilis riêng 0.92.2 u/mg tr ng l ng khô c a t ạ bào. Ho t tính c a ủ enzym đ c c đ nh t

ộ ổ ố ị ư ơ ị ầ ơ ộ thì cao h n nh ng đ n đ nh c a ủ enzym c đ nh t ừ A. oryzae thì cao h n 514 l n tùy thu c vào

ươ ố ị ươ ụ ườ ậ ấ ấ ph ng pháp c đ nh. Khi dùng ph ấ ng pháp h p ph ng ạ i ta nh n th y ho t tính cao nh t thu

ượ ừ ấ ự ố ị ữ ấ ớ ơ ố đ c khi dùng enzym t n m men v i ch t mang là OstsorbDEAE. H n n a, s c đ nh t i đa

ả ố ư ế ượ ặ ị ạ ượ ở pH 5.5 và k t qu t đ t đ i u thu đ c ệ c khi có m t dung d ch đ m citrate/phosphate trong

ố ị ố ằ ươ ụ ậ ấ su t quá trình c đ nh /?galactosidase t ừ E. coli b ng ph ng pháp h p ph v t lí trên

ộ ế ị ả ứ ứ ớ ượ ố ị chromosorbW. M t thi t b ph n ng m i ch a /?galactosidase t ừ B. circulans đ c c đ nh trên

/V ~

ờ ừ ượ ử ụ ể ủ ệ ố ị màng có g làm t PVC và silica đ c s d ng đ th y phân ữ ầ lactose trong s a g y. Vi c c đ nh

Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c

ạ Ư ự ổ y galactosidase t ừ Bullera singularis trên h t Chitopearl ằ BCW 3510 (970 G /g nh a) b ng

ươ ấ ả ượ ự ệ ph ụ ơ ng pháp h p ph đ n gi n cũng đ c th c hi n.

ề ộ ứ ọ Các nghiên c u v đ ng h c c a ủ enzym ßgalactosidase t ừ Kluyveromces marxianus

ượ ố ị ữ ư ấ (Saccharomyces) lactis đ c c đ nh trên nh ng ch t mang khác nhau nh nhôm và silica đã cho

ấ ằ ố ị ọ ự ụ ả ấ ạ ấ ậ th y r ng ho t tính c a ủ enzym c đ nh ph vào b n ch t hóa h c t ủ nhiên và c u trúc v t lí c a

ấ ạ ạ ấ ạ ch t mang. Khi kích th ướ ỗ ủ c l c a các h t ch t mang tăng thì ho t tính c a ả ủ enzym gi m m nh. S ự

ễ ấ ố ị c đ nh ß galactosidase t ừ Thermus sp. di n ra r t nhanh trên PEISepabeads và DEAEAgarose.

ộ ạ ụ ấ ơ ườ ọ ủ Tuy nhiên, đ m nh h p ph thì cao h n trong tr ng h p c a PEI Sepabeads.

ị ệ ượ ố ị Enzym ßgalactosidase t ừ B. stearothermophilus ch u nhi c c đ nh trên chitosan s t đ ử

ể ủ ườ d ng ụ Tris (hydroxymethyl) phosphine (THP) và glutaraldehyde dùng đ th y phân đ ng lactose

ữ ị ệ ạ ượ ố ị ả trong s a. Kh năng ch u nhi t và ho t tính c a ủ enzym ßgalactosidase đ c c đ nh

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ượ ộ ơ ự ượ ố ị trên THP thì v t tr i h n so v i ớ enzym t do và enzym đ ằ c c đ nh b ng

ượ ố ị ấ ạ glutaraldehyde. Enzym ßgalactosidase đ c c đ nh trên THP cho th y ho t tính cao h n ơ enzym

ự ả ặ ổ ố ờ ầ t ị do khi có m t ion Ca2+ và n đ nh trong su t th i gian b o qu n ả ờ 4°c trong 6 tu n, trong khi

ự ị ấ ệ ề ạ ươ ự enzym t do b m t 31% ho t tính trong cùng đi u ki n. Hai ph ệ ạ ng pháp quy ho ch th c nghi m

ươ là ph ng pháp “Response surfacemethodology” (RSM) và “Centre composite design” (CCD) đ cượ

ể ố ư ự ố ị ậ ệ ạ dùng đ t i u s c đ nh enzym ßgalactosidase t ừ Pisum sativum trên hai v t li u khung m ng:

ấ ố ị ạ ượ ệ ạ ươ ứ Sephadex G75 và h t chitosan. Hi u su t c đ nh đ t đ c 75.66% và 75.19% t ớ ng ng v i

Sephadex G75 và chitosan.

ượ ố ị ẻ ề ấ ộ Enzym ßgalactosidase t ừ A. oryzae đ c c đ nh trên m t ch t mang r ti n concanavalin

ế ẩ ượ ụ ế ằ ấ Acellulose. Ch ph m ßgalactosidase đ c h p ph và hên k t chéo b ng Concanavalin A

ầ ạ ố ị cellulose, giúp gi ữ ạ l i 78% ho t tính ban đ u. Nhi ệ ộ ố ư ủ enzym c đ nh tăng t i u c a t đ t ừ 50°c lên

ố ị ằ ươ ụ ế ấ ng pháp h p ph và liên k t chéo gi ữ ượ đ ạ c 93% ho t tính sau 1 60°c. Enzym c đ nh b ng ph

ả ự ạ ả tháng b o qu n trong khi enzym t nhiên ch gi ỉ ữ ượ đ c 63% ho t tính.

ươ Ph ns pháp bao eói

ể ố ị ạ ườ ượ ừ ư ệ ử ự Khung m ng s d ng đ c đ nh th ng đ c làm t các nguyên li u nh Caalginate,

ư ạ ắ ộ ạ agar, kcarragenin, polyacrylamide và collagen. Tuy nhiên, m t vài khung m ng r n nh than ho t

ể ể ạ ể ố ị tính, ceramic,... cũng có th dùng đ c đ nh. Các lo i màng dùng đ nh t ố enzym đ ượ ử ụ c s d ng

ổ ế ph bi n là nylon, cellulose, polysulfone, và polyacrylmide.

ừ ấ ợ ượ ố ị Enzym ßgalactosidase t n m s i đ c c đ nh trong gel polyvinyl alcohol có tính ch uị

ệ ự ạ ế nhi t cao h n ơ enzym t do, gi ữ ượ đ c 70% ho t tính sau 24h bào K. bulgarìcus có ở 50°c. Các t

ượ ử ớ ượ ố ch a ứ enzym ßgalactosidase đ c x lí v i glutaraldehyde đ c nh t trong ử ụ alginate s d ng dung

ượ ử ế ớ ị d ch BaC ấ Ỉ2. C c h t ạ alginate thu đ c sau khi x lí ti p theo v i polyethyleneimine thì đ t đ ạ ượ c

ượ ố ị ị ộ ổ đ n đ nh cao. Enzym ßgalactosidase c a ủ E. coli cũng đ c c đ nh trong gel polyacrylamide

ớ ệ ế ấ ẫ ẩ ị thông qua vi c chu n b các d n xu t hên k t chéo c a ủ enzym v i bisimidoesters.

ế ạ ộ ượ ố T bào K. marxianus có ch a ứ lactase ho t đ ng đ c nh t toong gel calcium pectate (CPG)

ượ ứ ằ và toong gel calcium alginate (CAG) đ c làm c ng b ng polyethyleneimine và glutaraldehyde.

ế ượ ố ị ủ ơ ụ Các t bào đ c c đ nh trong CPG đã th y phân h n 80% lactose trong quá trình liên t c và bán

hên t c.ụ

ươ ố ị So sánh các ph ng pháp c đ nh enzym ßgalactosidase t ừ Thermus aquaticus cho th yấ

ệ ố ị ế ệ ể ằ ằ r ng vi c c đ nh b ng hên k t chéo sau đó nh t ấ ố enzym toong h t ạ agarose có th cho hi u su t

ố ơ ạ ộ ho t đ ng t ệ t h n. Vi c nh t ố enzym ßgalactosidase t ừ A. oryzae trong gel polyvinyl alcohol l nhạ

ườ ộ ổ ớ ự ơ ự ạ ố ẽ x p s tăng c ị ng đ n đ nh v i nhi ệ ộ pH, l c ion h n so v i t đ , ớ enzym t ợ do. Khung d ng s i

ượ ượ ứ ấ ổ đ c làm t ừ alginate và gelatin đ c b sung ch t làm c ng là glutaraldehyde c th gi ổ ể ữ ượ c đ

ự ả ạ ấ ạ 56% ho t tính c a ủ enzym trong 35 ngày mà không có b t kì s gi m ho t tính.

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ườ ấ ằ ế ậ ượ ế Ng i ta nh n th y r ng ch ph m ẩ ßgalactosidase đ ằ c liên k t chéo b ng canavalin A

ể ủ ượ ế ạ ẩ ộ ớ có th th y phân lactose v t tr i trong hàng lo t quá trình so v i các ch ph m khác vì chúng

ụ ể ạ ầ ử ụ ạ ẫ v n gi ữ ượ đ c ho t tính cao, c th là gi ữ ượ đ c 95% ho t tính sau 7 l n s d ng, và gi ữ ượ c đ

ạ ả 93% ho t tính sau 2 ngày b o qu n ả ở 4°c.

ươ Ph ấ hóa tri cone ng pháp liên k

ế ớ ứ ấ ấ Các phân t ằ ử enzym liên k t v i ch t mang thông qua c c nhóm ch c năng không n m

ạ ộ trong trung tâm ho t đ ng c a ủ enzym nh ư amino, carboxyl, hydroxyl, và sulfydryl. Các nhóm ch cứ

ấ ườ ượ ử ụ ằ ấ ạ ọ năng trên ch t mang th ng đ c ho t hóa b ng cách s d ng các ch t hóa h c nh ư cyanogen

bromide, carbodimide, và glutaraldehyde.

ượ ố ị ộ ưở Enzym t ừ A. oryzae đ c c đ nh trên b t nylon6 và zeolite. Zeolite thì không lý t ng vì

ượ ạ ượ ạ ẫ ổ l ế ạ ng liên k t t o thành ft trong khi đó nylon6 t o ra đ ấ ị c khung m ng n đ nh. Các d n xu t

ượ ạ ằ ặ ằ ạ ấ ố thu đ c ho t hóa b ng ấ diazo ho c b ng carbodiimide cho th y ho t tính cao nh t trong su t quá

ố ị ủ ủ trình c đ nh ố enzym trên th y tinh x p có ph lóp glycophase.

ượ ố ị ử ụ ấ ạ Enzym ßgalactosidase t ừ E. coli đ c c đ nh trên gelatin s d ng ch t ho t hóa là

ẫ ữ ượ ươ ứ ạ chromium (III) acetate và glutaraldehyde v n gi c t đ ng ng 25% và 22% ho t tính. Enzym

ượ ố ị ổ ị ự đ c c đ nh trên silicaalumina n đ nh h n ơ enzym t do ở pH acid.

ề ự ả ố ị ư ệ ấ ạ ẫ Các d n xu t ấ ấ ßgalactosidase c đ nh cho th y nhi u s c i thi n nh ng ho t tính kh c

ượ ạ ế ộ ề ệ ể ằ ị ủ ị nhau sau khi đ c t o đi u ki n cho liên k t c ng hóa tr đa đi m b ng cách trong dung d ch

ề ộ ượ ố ị ượ ổ ị ờ ki m m t th i gian dài, enzym đ c c đ nh trên Sepabeadsepoxyboronic đ c xem là n đ nh

ấ ố ấ ạ ộ ấ ấ ủ ệ ậ nh t. Dan xu t t t nh t r t ho t đ ng trong vi c th y phân lactose th m chí ờ 70°c.

ạ ừ ự ế ầ ồ ố G n đây s liên k t ngang c a ủ ßgalactosidase trên các h t t tính có ngu n g c khác nhau

ượ ặ ủ ớ ự ố ị ự ệ ả ạ đ c th c hi n v i s có m t c a glutaraldehyde. Ket qu là ho t tính c a ủ enzym c đ nh đ ượ c

tăng lên.

ị ệ ể ủ ườ ố ị Khi c đ nh ßgalactosidase ch u nhi t trên Sepabeads đ th y phân lactose ng ậ i ta nh n

ấ ự ứ ệ ả ữ ụ ề ệ ả ả ẩ ạ th y s c ch ệ ế enzym do s n ph m t o ra gi m, đi u này h u d ng trong vi c c i thi n hi u

ấ ạ ộ su t ho t đ ng c a ủ enzym trong công nghi p.ệ

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ắ ịỉ ỉ t các ph ố ị ươ ồ ố ị Bàng 2.1: Tóm t Ph ươ ng pháp c đ nh ố ị ng pháp c đ nh enzym galactos dase Ngu n Pgalactosidase Tác nhân c đ nh

K. fragilis and K. lactis Chitosan

A. oryzae E. coli Phenolformaldehyde resin ChromosorbW

ụ ậ ấ B. circulans H p ph v t lý Polyvinyl chloride, Silica gel

B. stearothermophilus Chitosan

A. niger Porous ceramic monolith

K. fragilis K. lact sỉ Chitosan beads CPCsilica, agarose

K. bulgaricus Alginate using BaCỈ3

E. coli Polyacrylamide gel

A. oryzae Nylon6 and zeolite Bao gói

Thermus aquaticus YT1 Agarose bead

Pénicillium expansum F3 Calcium alginate K. lactis Poly(vinylalcohol) hydrogel

Egg shells

Calcium alginate L. bulgarìcus s. anamens sỉ

ị E. coli K. lat sỉ ế ộ Liên k t c ng hóa tr Hen egg white Cotton fabric

ỉ A. n ger Magnetic polysiloxane polyvinyl

A. oryzjae alcohol Silica

ố ị ứ ủ ụ 2.1.14. ng d ng c a enzym pgalactosidase c đ nh

ủ ữ 2.1.1.41.Th y phân lactose trong s a và lactoserum [2]

ữ ượ ủ ượ ử ụ ế ế ư ệ ữ ệ S a đ c th y phân lactose đ c s d ng cho vi c ch bi n h crag li u s a, phô

ự ủ ế ế ữ ự ữ ẩ ữ mai, và s a chua. S th y phân lactose trong s a và dùng s a ch bi n th c ph m cũng ngăn

ừ ự ế ữ ữ ữ ẩ ặ ạ ơ ệ ử ụ ng a s k t tinh lactose khi đông l nh s a và sàn ph m s a cô đ c. H n n a vi c s d ng

ấ ữ ủ ẽ ả ở ữ s a đã th y phân trong s n xu t s a chua và pho mát s làm tăng quá trình acid hóa, b i vì

ủ ườ ướ ố ộ ủ ả ậ th y phân lactose th ng là b ặ c làm ch m t c đ c a quá trình, làm gi m thòi gian đông đ c

ể ấ ấ ươ ấ ượ ị ố ộ ủ ữ c a s a chua và tăng t c đ ph t tri n c u trúc và h ng v cho phó mat. Ch t l ủ ữ ng c a s a

ạ ừ ữ ượ ả ệ ể ố đông l nh và kem làm t s a cũng đ c c i thi n đáng k khi thêm enzym lactase. Nó ch ng

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ạ ự ế ườ ủ ấ ả ằ l i s k t tinh đ ng lactose b ng cách th y phân thành glucose và galactose và làm gi m c u

trúc cát s n.ạ

ủ ộ ứ ụ ọ Th y phân lactose trong whey là m t ng d ng quan tr ng khác c a ủ ßgalactosidase

ủ ệ ượ trong ngành công nghi p ch bi n s a. ế ế ữ Whey th y phân và cô đ c ặ hay whey thu đ ọ c qua l c

ể ượ ử ụ ư ấ ạ ấ ữ ả ọ ọ màng có th đ ả c s d ng nh ch t t o ng t trong s n xu t s o rau qu đóng h p và n ướ c

ả ấ gi i kh t.

ượ ố ị ổ y galactosidase t ừ ấ (Miles Chemie) đ n m c c đ nh trong gel polyvinyl alcohol

ượ ề ấ ậ ệ ự đ c nh n th y là b n nhi t hon so v i ớ enzym t do, gi đ c ạ ữ ượ 70% ho t tính sau 24h ở 50°c

ạ ủ ứ ộ ể ổ c và 5% ho t tính ở 60 °c. Th y phân đ ả ượ 75% lactose trong 56h và m c đ chuy n đ i gi m

ề ủ ử ụ ứ ầ ử ụ ố ị lactose s d ng enzym c đ nh ß 50% sau 30 l n s d ng. Các nghiên c u v th y phân

ấ ệ ộ ố ư galactosidase (Aspergillus niger) trên nh a ự phenol formaldehyde cho th y nhi t đ t i u ph ụ

ụ ự ự ư ệ ể ộ ộ ộ ồ ờ ổ thu c vào th i gian th c hi n quá trình nh ng không ph thu c vào n ng đ và s chuy n đ i

ừ lactose. Enzym /?galactosidase t A. ủ niger th y phân đ c ượ 70% lactose trong s a g y ữ ầ ở 40°c

ố ừ ấ ồ ượ trong 10 phút. Enzym ^galactosidase có ngu n g c t ố ị n m c đ nh trên hydrogel đ c dùng

ủ ự ố ị ổ ể ủ đ th y phân whey, sau 7h th y phân đ c enzym y galactosidase ượ 7075% whey. S c đ nh

ừ ượ ố ị ế ế ế ầ ả ạ t A. niger trên silica gel đã đ c kích ho t, k t qu là h u h t các ch ph m ẩ enzym c đ nh

3 và FeCỈ3 s th y phân đ

ượ ẽ ủ ượ ế ử ụ silica gel đ s d ng ạ ằ c kích ho t b ng TÌCI c 81% đ n 84% trong

ứ ị dung d ch ch a 4% lactose.

ượ ố ị ượ Enzym ßgalactosidase t ừ K. lactis đ c c đ nh trên CPCsilica (đã đ c silan hóa

ạ ớ ượ ạ ằ ể và kích ho t v i glutaraldehyde) và agarose (đ ổ c kích ho t b ng tác nhân cyanua) chuy n đ i

ượ ế ị ả ứ ể đ c 90% lactose trong thi t b ph n ng “packed bed minireactor”. y galactosidase đ ượ c

ố ồ ệ ả nh t trong gel đ ng polymer hóa Nisopropylacrylamide và acrylamide có hi u qu trong qu ấ

ấ ử ả ấ ộ ủ trình th y phân lactose lactose. Mô hình đ ng h c s ọ ử ờ 5°c cho qu trình s n xu t s a nghèo

ụ ổ ượ ể d ng cho enzym y galactosidase t ừ K. lactis cũng đ c kh o s t. ạ ả ấ Enzym c đ nh có th ho t ố ị

ở ệ ộ ấ ự ượ ữ ấ ạ ả ẩ ả ộ đ ng nhi t đ th p và áp d ng đ ặ c cho s n xu t các s n ph m s a đông l nh, ngăn ch n

ư ả ẩ ạ ả ự ế s k t tinh c a ủ lactose, tăng kh năng tiêu hóa và t o h cmg vi cho s n ph m s a. ữ Enzym ß

ử ụ galactosidase t ố ị ừ K. lact sỉ c đ nh trên v i ế ả cotton s d ng glutaraldehyde làm tác nhân liên k t

ượ ổ ượ ữ ể chéo đ ể ủ c dùng đ th y phân lactose toong s a nguyên kem và chuy n đ i đ c 95% lactose

ế ị ả ứ ạ ượ ố ị ế ộ ằ trong 2h toong thi t b ph n ng gián đo n, và khi đ ị ớ c c đ nh b ng hên k t c ng hóa tr v i

ử ụ ư ế ấ polysiloxanepolyvinyl alcohol, s d ng glutaraldehyde nh là tác nhân liên k t chéo cho th y

ạ ộ ộ ổ ộ ị ệ đ ho t đ ng cao hon và đ n đ nh nhi t cao hon so v i ớ enzym hòa tan. Vì th ế enzym này

ượ ử ụ ủ ệ ả ừ ữ ổ đ c s d ng có hi u qu trong th y phân lactose t s a. y galactosidases t ừ K. lactìs cũng

ượ ố ị ấ ạ ượ đ c c đ nh trên viên nang LentiKats polyvinylalcohol hydrogel d ng th u kính đ c

ể ả ụ ừ ạ ộ ấ d ng đ s n xu t Dgalactose t ừ lactose (200 g. L_1) trong m t quá trình gián đo n v a đ ườ ng

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ừ ồ ờ hóa v a lên men đ ng th i.

ố ị ấ ổ y galactosidase t ừ A. oryzae c đ nh trên ch t mang concanavalin Acellulose đ ượ ử c s

ể ủ ụ ữ ườ ấ ằ ậ d ng đ th y phân liên t c ụ lactose t ừ whey và s a. Ng i ta nh n th y r ng pH t ố ư ủ enzym i u c a

ư ệ ộ ố ư ố ị hòa tan và enzym c đ nh là 4.8 nh ng nhi t đ t i u tăng t ố ớ enzym cố ừ 50°c lên 60°c đ i v i

ố ị ự ổ ị ệ ầ ế ị ả ứ ị đ nh. Enzym c đ nh có s n đ nh nhi t cao h n t b ph n ng packed bed ơ ở 60°c. G n đây thi

ớ ế ấ ượ ượ ử ụ ể ủ cùng v i t bào có tính th m đ ố ừ c nh t ong alginate đ c s d ng đ th y phân lactose trong

ệ ố ệ ạ ấ ượ ố ị ụ ữ s a trong h th ng liên t c, đ t hi u su t 87.2%. ß galactosidase t A. ừ oryzae đ ằ c c đ nh b ng

ế ộ ị ớ ụ ặ ậ ấ ấ 3 kĩ thu t kh c nhau: h p ph trên celite, hên k t c ng hóa tr v i chitosan, ho c k t h p l ế ọ ạ ớ i v i

ế ế ằ ượ ấ ố ị ề ệ ớ nhau b ng liên k t chéo. Các ch ph m ẩ enzym cũng đ c so sánh v i nhau v hi u su t c đ nh,

ả ổ ộ ổ ệ ị ặ đ c tính c a ủ enzym, đ n đ nh, và hi u qu t ng h p ợ oligosaccharide. Các enzym ßgalactosidase

ượ ế ọ ạ ớ ế ằ ượ ủ ệ ệ đ c k t h p l i v i nhau b ng hên k t chéo đ ả c cho là có hi u qu trong vi c th y phân

ệ ạ ấ ượ ố ị lactose, đ t hi u su t 78% trong 12h. ß galactosidase t ừ A. oryzae đ c c đ nh trên silica, ho tạ

ị ượ ả ố ị ế ẩ ị ố ấ ư ộ ổ tính cũng nh đ n đ nh c a ủ enzym đã đ c th m đ nh, và k t qu c đ nh t t nh t thu đ ượ c

ấ ỗ ợ ử ụ ư ấ ạ ị ằ b ng c ch s d ng glutaraldehyde nh ch t h tr ổ ho t hóa và n đ nh cho enzym. Trong các

ươ ử ọ ọ ệ ọ ượ ph ng pháp x lí ử whey khác nhau (vi l c, siêu l c, x lí nhi t), siêu l c đ c xem là ph ươ ng

ơ ấ ể ả ứ ế ị ị t nh t đ i v i dung d ch c ch t đ cho vào thi ậ ổ ị ử ụ ỹ ố pháp t ả B ng 2.2 ấ ố ớ t b ph n ng. ủ : Th y phân lactose s d ng các k thu t c đ nh khác nhau

ủ ệ ấ Hi u su t Thòi gian th y phân ố ị Tác nhân c đ nh Ngu n ồ vsv ủ th y phân ỉ Fungal galactos dase Polyvinylalcohol 75% 56 h

E. coli Polyacrylamide gel 47% 6 h

K. lactis Thiosulfinate/thiosulfonae 85%90% 2.5 h

K. fragilis K. lactis Cellulose beads Cotton fabric >90% 95% 5 h 2 h

Fungal ßgalactosidase Hydrogels 70%75% K. marxianus Calcium alginate 84.8% 7 h 2.5 h

A. oryzae 89% 3 h

Concanavalin A layered calcium

alginatestarch hybrid

Bacillus stearothermophilusChitosan >80% 2 h

ổ ợ 2.I.I.42.T ng h p GalactoOligosaccharides (GOSs) [2]

ủ ạ ụ ể ổ ạ ộ Bên c nh ho t đ ng th y phân, enzym y galactosidase còn có tác d ng chuy n nhóm

ụ ủ ả ấ ợ ằ b ng cách th y phân và s n xu t ra nhi u ề oligosaccharide, các oligosaccharide tác d ng có l i cho

ườ ơ ữ ả ứ ể ượ ể ộ ậ các vi sinh v t có ít trong đ ng ru t. H n n a, ph n ng chuy n nhóm có th đ ể ắ c dùng đ g n

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ả ạ ế ấ ọ ọ ấ galactose vào h p ch t hóa h c khác, k t qu t o thành galactooligosaccharide. Do đó cho th y

ệ ả ự ề ầ ẩ ượ ẩ ấ ọ ấ ti m năng trong vi c s n xu t các thành ph n th c ph m, d ạ c ph m, và các h p ch t có ho t

ả ứ ủ ề ể ọ ồ ệ tính sinh h c khác. Các đi u ki n c a ph n ng chuy n nhóm galactose nên có n ng đ ộ lactose

ệ ộ ạ ộ ướ ả ườ ệ ộ ồ cao, nâng nhi t đ và gi m ho t đ n c trong môi tr ả ứ ng ph n ng. Nhi ộ ơ ấ t đ , n ng đ c ch t

ữ ừọ ệ ổ ồ và ngu n g c ố enzym đóng vai ò quan ng trong vi c t ng h p ọ oligosaccharide. Tuy nhiên nhả

ưở ớ ồ ầ ầ ớ h ủ ồ ng c a n ng đ ơ ộ lactose ban đ u thì l n h n. Nói chung v i n ng đ ộ lactose ban đ u càng cao

ề ượ ổ ệ ộ ể thì càng nhi u galactooligosaccharide đ ọ c t ng h p. Nhi ệ t đ cao cũng có th làm tăng hi u

ấ ổ ơ ở ệ ấ ệ ộ ộ ợ ế ổ su t t ng h p ọ oligosaccharide. Hi u su t cao h n nhi ơ t đ cao h n là m t l i th b sung khi

ả ứ ế ở ồ ti n hành ph n ng n ng đ ầ ộ lactose ban đ u cao. Do đó, enzym pgalactosidase nên đ ượ ổ c n

ờ ệ ộ ượ ướ ạ ộ ể ể ấ ị đ nh nhi t đ cao hàm l ng n c th p đ làm cho ho t đ ng chuy n nhóm galactose tăng lên.

ệ ổ ằ ổ ọ Vi c t ng h p galactooligosaccharide b ng y galactosidase t ừ A. oryzae đ ượ ố ư c t i u hóa

ệ ơ ế ả ấ ạ ấ ở ồ b i n ng đ ộ lactose, enzym, ti l c ch t. Trong quá trình s n xu t gián đo n liên ti p galacto

ệ ả ự ị oligosaccharide, hi u qu xúc tác tăng lên 190% đ i v i ố ớ enzym t do trong dung d ch, và 8500g

ượ ả ấ galactooligosaccharide trên lg enzym đ c s n xu t trong 10 đ t. ợ Enzym P galactosidase t ừ A.

304chitosan cho k t quà hi u su t t ng h p galactooligosaccharide

ượ ố ị ấ ổ ệ ế ọ oryzae đ c c đ nh trên Fe

ệ ổ ử ụ ấ ọ cao nh t là 15,5%. Vi c t ng h p galactooligosaccharide s d ng ị galactosidase t ì ừ A. oryzae cố

ượ ự ệ ượ ị đ nh trên polysiloxanepolyvinyl alcohol (mPOSPVA) đã đ c th c hi n. L ng galacto

ạ ượ ớ ượ ả ườ ả ổ oligosaccharide đ t đ c kho ng 26% (w/v) so v i l ng đ ng t ng, có kho ng 55% lactose

ượ ổ ừ ờ ồ ị ệ đ ể c chuy n đ i t dung d ch có n ng đ ộ lactose là 50% (w/v) pH 4,5 và nhi t đ ộ 40°c.

ơ ổ ượ ượ ả ệ ấ ế Trisaccharides chi m h n 81% t ng l ng GOS đ c s n xu t. Vi c hình thành GOS không b ị

ả ưở ể ở ệ ộ nh h ng đáng k b i nhi t đ và pH.

ố ị ỉ ượ ệ ố H th ng enzym c đ nh dùng polyethyleneimine, gh taraldehyde, và cotton đ c nghiên

ệ ố ự ả ấ ự ứ c u và so sánh s s n xu t galactooligosaccharide trong h th ng siêu l c ọ enzym t do và h ệ

ố ế ọ ử ụ ố ị ườ th ng s d ng ố ị ử ụ enzym c đ nh. Trong quá tr inh c đ nh s d ng k t h p PEI và GA, ng ậ i ta nh n

ế ấ ả ệ ố ạ ị ự ố ị th y kho ng 50% đ n 90% enzym b ho t hóa. H th ng enzym t do và enzym c đ nh t ươ ng

ươ ấ ấ ả ấ ấ ố ỉ đ ờ ng cho th y quá trình s n xu t GOS r t gi ng nhau, x p x 22% (w/v) và 20% (w/v) trong th i

ổ ượ ể ả gian kho ng 15 17 phút, và chuy n đ i đ c 50% lactose.

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ượ ố ị Pgalactosidase tinh khi ế ừ Buttera singularis ATCC 24193 đ t t ạ c c đ nh trên h t

ượ ử ụ ả ứ ổ Chitopearl BCW 3510 đ ọ c s d ng cho ph n ng t ng h p galactooligosaccharide (GOSs) từ

ế ị ả ứ ọ ượ ả ổ ế ấ ớ lactose trong thi t b ph n ng packed bed, k t qu t ng h p đ c 55% GOS v i năng su t 4.4 g/

ạ ộ ạ ầ ấ ấ ồ (Lh) ho t đ ng trong 15 ngày. Năng su t GOS đ t cao nh t khi n ng đ ộ lactose ban đ u là 27%

ượ ổ ớ ồ ể ầ ộ (w/w), 50% lactose đ ộ ả c chuy n đ i v i n ng đ ban đ u là 500 g/L. Trisaccharides là m t s n

ượ ạ ế ề ấ ơ ổ ượ ượ ạ ổ ẩ ph m đ c t o ra nhi u nh t, chi m h n 70% t ng l ng GOS đ c t o ra. y galactosidase t ừ

ượ ố ị ạ ượ ấ A. oryzae đ ạ c c đ nh trên h t chitosan t o ra l ổ ng trisaccharides cao nh t (17,3% trong t ng

ượ ườ ử ụ ự l ng đ ng), s d ng 20% (w/v) lactose trong vong 2h so v i đ i v i ớ ố ớ enzym t ố do và 4,6 % đ i

ế ớ ậ v i t p h p ọ enzym có liên k t chéo.

2.12.Enzym lipase

2.1.21.Giói thi u v

ộ ọ ườ ự ệ ề enzym lipase Lipase (EC 3.1.1.3) là m t h các enzym mà trong môi tr ng t nhiên chúng xúc tác cho

ả ứ ả ứ ủ ề ệ ấ các ph n ng th y phân ch t béo. Tuy nhiên, trong các đi u ki n ph n ng phù h p ọ lipase còn cho

ấ ả th y kh năng xúc tác các ph n ng ả ứ ester hóa, chuy n ể ester và ph n ng ả ứ alcoholysis [4].

ự ủ ể ạ ự S phát tri n nhanh chóng c a công ngh ệ enzym đã mang l ể ế i s quan tâm đáng k đ n

ệ ứ ụ ử ụ ả ứ ầ ấ vi c ng d ng ệ enzym lipase trong ngành công nghi p d u béo. C c ph n ng s d ng enzym

ạ ề ợ ả ứ ế ơ ọ ườ ể ử ụ lipase mang l i nhi u l i th h n các ph n ng hóa h c thông th ng. ộ Lipase có th s d ng m t

ệ ả ế ề ệ ể ề ặ ọ ở cách có hi u qu và kinh t ệ trong đi u ki n ôn hòa. Đây là đ c đi m quan tr ng b i vì đi u ki n

ắ ệ ẽ ề ả ả ứ ụ ấ ẩ ấ ọ kh c nghi t s gây ra c c ph n ng trùng h p ch t béo và sinh ra nhi u s n ph m ph . Do đó,

ạ ỏ ấ ẽ ấ ả ẩ ả ầ ọ ệ ử ụ vi c s d ng ụ ằ lipase s làm gi m nhu c u lo i b c c h p ch t màu và các s n ph m ph b ng

ươ ố ượ cách ph ng pháp t n kém năng l ng [3].

ệ ứ ụ ề ề ẫ ạ ấ Tuy nhiên, vi c ng d ng ở enzym lipase v n còn nhi u tr ng i do chi phí cao. v n đ này

ể ượ ụ ằ ử ụ ắ ể ượ có th đ c kh c ph c b ng cách s d ng ố ị enzym c đ nh, khi đó enzym lipase có th đ c tái s ử

ể ượ ậ ụ ụ ễ ả ấ d ng d dàng và qui trình s n xu t có th đ c v n hành liên t c [3].

ồ 2.1.22.Ngu n thu nh n

ậ enzym lipase ườ ươ ượ ậ ừ ộ ặ ạ ế ụ ậ ạ ng m i th Enzym lipase th ng đ c thu nh n t ủ đ ng v t (tuy n t y ho c d dày c a

ạ ặ ừ ấ ư Pénicillium spp., Aspergillus spp., Rhizopus spp., ậ ộ đ ng v t nhai l i) ho c t ợ n m s i nh (

ừ ộ ệ ậ ặ Rhizomucor spp., Mucor spp. or Candida spp...). Enzym lipase t đ ng v t có tính đ c hi u cao

ệ ả ở ị ố trong vi c gi i phóng các acid béo ố v trí s 1 và s 3 trong phân t ử triglyceride, trong khi đó các

ừ ệ ộ ặ ậ ả ồ ơ lipase t ạ ộ ngu n vi sinh v t có kh năng ho t đ ng và tính đ c hi u r ng h n [5].

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ả B ng 2.3 : Ngu n ồ vsv thu nh n ậ enzym lipase và tính ch t ấ enzyme lipase [6] Tính ch t ấ enzym Ngu n ồ vsv Nhi ệ ộ ố ư i u t đ t pH t i uố ư

Bacillus acidocaldar usỉ 70

Bacillus sp. 8.09.0 50

Bacillus strìn 60

Bacillus stearothermophìlus 8.0

Bacillus thermocatenletus 8.09.0 68 6070

Bacillus thermoleovorans 7.5 7075

Geobacillus sp. 9.0 70

Pseudomonas sp. 9.6 65

Pseudomonas sp. 90

Pyrobaculum calidifontis 11.0 90

ỷ Pyrococcus urìosus

Pyrococcus horikoshii 5.6 100 97

Pyrococcus horikoshii 7.0 95

ươ ố ị 2.I.23.Các ph ng pháp c đ nh enzym lipase

ươ Ph ấ ữ ns pháp h p hu vât lí

ươ ế ự ươ ả ơ ề ặ ậ ị Đây là ph ấ ng pháp đ n gi n nh t liên quan đ n s t ữ ng tác b m t thu n ngh ch gi a

ủ ế ự ế ấ ươ ỵ ướ ươ enzym và ch t mang. L c liên k t ch y u là các t ng tác k n c. Ph ư ng pháp này có u

ự ế ự ể ệ ấ ấ ơ ổ ề ặ ả đi m là chi phí th p, qu trình th c hi n đ n gi n và nhanh chóng; không có s bi n đ i v m t

ự ố ư ậ ấ ị ượ ủ ể hóa h c ọ enzym cũng nh ch t mang, đây là s c đinh thu n ngh ch. Nh c đi m c a ph ươ ng

ờ ề ặ ủ ấ ấ ỏ pháp này là s gi ự ả ự ả ấ enzym ra kh i ch t mang, s c n tr v m t không gian c a ch t mang i h p

ậ ệ ư ự ế ạ ặ ơ ệ và s hình thành các liên k t không đ c hi u. Các v t li u vô c nh than ho t tính, silica,... và

ự ạ ổ ể ượ ọ ố ị ậ ệ ữ ơ ư v t li u h u c nh các polymer t nhiên ho t t ng h p có th đ ấ c dùng làm ch t mang c đ nh

enzym upase [7].

Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c

ượ ấ ụ ấ ị ệ ộ Lipase đ c h p ph trên ch t mang k n c r t n đ nh đ i v i nhi

ữ ơ ố ị ủ c a dung môi h u c . Dan xu t ấ enzym lipase t

ạ ủ ấ ẫ ồ gi ữ ượ đ c 100% ho t tính sau khi trong ạ ự ỵ ướ ấ ổ ố ớ t đ và s vô ho t ừ c. antárctica B c đ nh trên Octadecyl Sepabead ữ ở và pH 7.0. Ngoài ra, d n xu t này c n gi 200h 50°c

ượ ủ ầ ạ ờ ị ở đ c ho t tính đ y đ trong th i gian dài nhi t đ (200h) trong dung d ch 50% dioxane ệ ộ 25°c ở

ặ ượ ố ị ằ ươ ư ẫ ấ ơ pH 7.0. M c dù đ c c đ nh b ng ph ụ ậ ng pháp h p ph v t lí đ n gi n ấ ả nh ng các d n xu t

ổ ị ấ ượ ố ị ế ộ ẫ ằ enzym lipase này có tính n đ nh nhi t h n các d n xu t đ c c đ nh b ng Mên k t c ng hóa tr ị

ự ị và các enzym t do trong dung d ch ệ ơ [8].

ư ế hóa tri cône Ph ome pháp liên k t

ươ ị ữ ự ế ấ ộ Ph ứ ng pháp này d a trên liên k t công hóa tr gi a ch t mang và m t vài nhóm ch c

ấ ườ ượ ạ ướ ằ năng c a ủ amino acid trên b m t c a ề ặ ủ enzym. Ch t mang th ng đ c ho t hóa tr ấ c b ng c c

ấ ặ ệ ứ ừờ ệ ử ạ ọ h p ch t đ c bi t làm cho các nhóm ch c năng nên ái đi n t m nh, các nhóm này sau đó

ả ứ ủ ạ ớ ươ ạ ượ ph n ng v i các nhóm ái nhân m nh c a Ư ể ủ enzym. u đi m c a ph ng pháp này là t o đ c các

ự ố ị ế ề ạ ượ ự ổ ữ ượ ủ ể ươ Mên k t b n v ng và s c đ nh đ t đ ị c s n đ nh cao. Nh c đi m c a ph ng pháp này là

ấ ố ị ị ả ệ ạ ạ ấ ấ chi phí cao và hi u su t c đ nh th p. Bên c nh đó, c u trúc và ho t tính c a ủ enzym b nh h ưở ng

ế ộ ạ ở ị m nh b i các Mên k t c ng hóa tr [7].

ượ ố ị ư ề ấ Lipase đã đ c c đ nh thành công trên nhi u ch t mang khác nhau nh chitosan, agarose,

ỵ ướ ử ụ ủ ấ ạ và các polypeptide k n c s d ng carbodũmide làm t c nhân ho t hóa nhóm

ố ị Ư ể ủ ạ ả mang khi c đ nh enzym lipase t ấ carboxyl c a ch t ừ c. rugosa. u đi m c a carbodũmide là có kh năng ho t hóa

ấ ộ cao và đ c tíhh th p đ i v i ố ớ enzym [9].

ủ ượ ả ứ ằ ạ Nhóm carboxyl c a yPGA (Poly(yglutamic acid)) đ ớ c ho t hóa b ng cách ph n ng v i

carbodũmide (N(3 dimethy lamino propyl) N ethylcarbo diimide hydrochloride, EDC). y PGA sau

ượ ẽ ượ ạ ệ ự ố ị ệ khi đ c ho t hóa s đ ị c cho vào dung d ch đ m có ch a ứ lipase t do. Vi c c đ nh enzym

ượ ệ ở ự ờ ệ ộ ạ lipase t c th c hi n các th i gian và nhi t đ khác nhau. Sau giai đo n này enzym ừ c. rugosa đ

ố ị ượ ử ạ ạ ầ lipase c đ nh đ ấ ấ c làm l nh khô trong m y s y thăng hoa sau đó r a l ằ i vài l n b ng nhexan.

ố ị ệ ề ố ư ạ ượ ở ạ ờ Đi u ki n c đ nh t i u đ t đ c nhi t đ ấ ệ ộ 13,3°c trong th i gian 2,3h và ho t tính cao nh t

ấ ạ ượ đ t đ c là 1196 u/gch t mang [9].

ượ ố ị ử ụ Lipase t ừ Candida Antarctica cũng đ c c đ nh trên ấ agarose và chitosan, s d ng các ch t

ấ ạ ấ ho t hóa glycidol, glutaraldehyde và epichlorohydrin. Khi dùng ch t mang là ạ ớ agarose v i ch t ho t

ạ ượ ố ị ử ấ ạ hóa glycidol đ t đ ấ c ho t tính cao nh t là 845U/g gel trong sau 72h c đ nh. Khi s dung ch t

ạ ạ ấ ớ mang là agarose và chitosan v i ch t ho t hóa là glutaraldehyde thì ho t tính cao nh t đ t đ ấ ạ ượ c

ươ ố ị ự ổ ứ ị ệ ể t ng ng là 1209U/g gel và 2716U/g gel sau 5h c đ nh. S n đ nh nhi t tăng đáng k khi so

ử ụ ấ ầ ấ ầ ử ụ sánh v i ớ enzym hòa tan, g p 20 l n khi s d ng agarose glyoxyl và g p 18 l n khi s d ng

ử ụ ấ ố ầ ầ ấ chitosanglutaraldehyde và g p 21 l n khi s d ng agaroseglutaraldehyde. D n xu t t ấ t nh t có

ấ ầ ị ự ượ ố ị ượ ạ ộ ổ đ n đ nh g p 58 l n so vói enzym t do, thu đ c khi c đ nh trên chitosan đ c ho t hóa qua 2

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ướ ứ ộ ổ ủ ẫ ử ụ ố ị ờ ị b ấ c, s d ng glycidol và glutaraldehyde, th i gian c đ nh là 72h. M c đ n đ nh c a d n xu t

ế ộ ố ị ữ ề ể ấ ờ ị ấ ố ị c đ nh tăng lên theo th i gian c đ nh, đi u này cho th y liên k t c ng hóa tr đa đi m gi a ch t

ự ự ả mang và enzym đã th c s x y ra [10].

Phươníỉ pháp bao 2Ói

ằ ươ ể ố ở ạ ể ố ị Đ c đ nh enzym b ng ph ng pháp nh t có th dùng các polyme khác nhau ạ d ng h t

ộ ươ ố nh là ư agarose, alginate và chitosan. Agarose có đ tr ng không mong mu n trong nên enzym dễ

ườ ả ứ ượ ử ụ ị ử b r a trôi trong môi tr ng ph n ng và polyme này không đ c s d ng. Alginate và chitosan

ượ ử ụ ị ằ ẩ đ c chu n b b ng cách gel hóa s d ng calcium chloride ho c ặ sodium tripolyphosphate làm tác

ấ ố ị ế ệ ớ ươ ứ nhân liên k t chéo. Hi u su t c đ nh v i chitosan và alginate t ạ ng ng là 43% và 50%. Ho t

ấ ớ tính c a ủ alginate thì th p 240 ± 33 and 220 ± 26 unit/ml so v i chitosan là 1110±51 và 1150+11

ươ ớ ạ ướ ứ ạ ượ ấ ườ ượ unit/ml t ng ng v i h t t và h t đ c s y đông khô. Do đó chitosan th ng đ ọ c ch n làm

ố ị ấ ch t mang c đ nh enzym lipase [11].

ượ ố ị ề ằ ớ ị Lipase t ộ c c đ nh b ng cách tr n đ u v i dung d ch sodium alginate, ngay

ỗ ị ượ ỏ ọ ị ằ ừ c. rugosa đ ọ sau đó h n h p dung d ch đ c nh gi t vào dung d ch CaC Ỉ2 b ng vòi phun tia, khi đó Ca

ạ ạ ượ ượ ự ế alginate d ng h t ch a ứ enzym đ c hình thành. Gel đ ữ c hình thành là do có s liên k t chéo gi a

ồ ộ ả ọ ưở Ca2+ và alginate, do đó n ng đ Ca2+ và ố alginate hai thông s quan tr ng nh h ng đ n s c ế ự ố

ố ị ồ ộ ồ ừ ị đ nh enzym lipase. Khi c đ nh n ng đ CaC Ỉ2 (50 mM), tăng n ng đ ộ alginate (t 1% lên 2%), t ỉ

ầ ượ ố ị ố ị ẽ ế ồ l ệ enzym và alginate là 1:8 thì ph n trăm enzym đ c c đ nh s tăng. N u c đ nh n ng đ ộ

ồ ộ ừ ầ ượ alginate (1%) và tăng n ng đ CaC Ỉ2 (t 50mM lên 300mM) thì ph n trăm enzym đ ố ị c c đ nh

ườ ạ ộ ố ị ư ổ ồ d ng nh không đ i. Tuy nhiên, khi tăng n ng đ ộ alginate thì ho t đ riêng c a ủ enzym c đ nh

ả ưở ề ượ ố ị ồ ẽ ả s gi m. N ng đ c a ộ ủ alginate có nh h ng nhi u đ n t l ế ỉ ệ enzym đ c c đ nh và ho t đ ạ ộ

ơ ự ả ưở ủ ồ ộ ầ ồ riêng c a ủ enzym h n s nh h ng c a n ng đ CaC Ỉ2, do đó n ng đ ộ alginate c n đ ượ ố ư i u c t

ấ ố ị ể ệ ấ ạ hóa đ hi u su t c đ nh enzym đ t cao nh t [12].

ệ ự ố ị ứ ẩ 2.I.24. ng d ng ụ enzym Upase c đ nh trong công ngh th c ph m

ố ị ổ ọ ươ ứ 2.I.2.4I. ng d ng ester có h ng trái cây [13]

ỗ ắ ượ ứ ệ ạ ươ ụ ộ ụ Upase c đ nh t ng h p các ấ ạ acid béo chu i ng n đ Các ester có c u t o c ng d ng r ng rãi trong vi c t o h ng

ạ ướ ướ ồ ố ẹ ạ cho các lo i n c ép trái cây, phô mai, bánh n ng, k o, đ u ng và kem. Hai ạ ester t o mùi lo i

ượ ổ ằ ả ứ này (nbutyl acetate và npropyl acetate) đ ọ c t ng h p b ng ể enzym thông qua ph n ng chuy n

ớ ứ ester c a ủ vinyl acetate v i hai r ượ ươ u t ng ng là nbutanol và npropanol. Hai ester này có m tặ

ự ở ư ề ạ trong t nhiên nhi u lo i trái cây khác nhau nh táo, dâu tây, lê,... Lipase t ừ Rhizopus

ượ ố ị ử ế ấ oligosporus NRRL 5905 đ c c đ nh trên silica gel s glutaraldehyde làm t c nhân liên k t chéo

ệ ươ ứ ể ổ dùng đ t ng h p ấ ạ ọ ester. Hi u su t t o thành nbutyl acetate và npropyl acetate t ng ng là 50%

ạ ượ ờ ồ và 56% đ t đ c sau 24h nhi t đ ộ enzym là 25%(w/v). Enzym lipase cố ệ ộ ở 30°c vói n ng đ

Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c

ể ượ ử ụ ẫ ỳ ấ ổ ệ ị đ nh có th đ c s d ng trong 3 chu k mà v n gi ữ ượ đ c 100% hi u su t t ng h p ọ ester. Giá tri

Km và Vmax đ

ượ ố ớ ị c xác đ nh là 227mM và 322 pmol/(g.h) đ i v i nbutyl acetate và 222mM và 385

ố ớ pmol/(g.h) đ i v i npropyl acetate.

ử ụ ồ ạ ệ ố ố ị ứ Trong phàn ng s d ng xúc t c ấ là enzym c đ nh, t n t i h th ng xúc tác hai pha do s ự

ế ự ề ế ạ ẫ ỗ ố ọ ứ không hòa tan c a ủ enzym trong h n h p phàn ng d n đ n h n ch s truy n kh i trong h ệ

ả ứ ấ ả ể ố ưở ủ ự ạ ề ố ườ ế th ng ph n ng. Đ quan s t nh h ế ng c a s h n ch truy n kh i ng i ta ti n hành thí

ệ ở ố ộ ừ ấ ổ ệ ế ấ nghi m ấ các t c đ khu y khác nhau t ọ ậ 50 đ n 300 rpm, qua đó nh n th y hi u su t t ng h p

ấ ấ ố ộ ạ đ t cao nh t khi t c đ khu y là 200 rpm.

ể ả ả ưở ố ớ ệ ổ ườ Đ kh o sát nh h ồ ng n ng đ ộ enzym đ i v i vi c t ng h p ọ ester ng ế i ta ti n hành

ớ ồ ả ứ ừ ố ị ế ph n ng v i n ng đ ộ enzym t 2.5% (w/v) (1.5U/ml) đ n 30% (w/v) (18U/ml) và c đ nh các

ọ ầ ượ ủ ỗ ấ ổ ả ứ ả ứ ệ ố ợ thông s khác c a h n h p ph n ng. Sau 24h ph n ng hi u su t t ng h p l n l t là 50% và

ươ ứ ồ 56% t ớ ng ng v i nbutyl acetate và npropyl acetate vói n ng đ ộ enzym là 25% (w/v) (15 u/ml).

ượ ố ộ ả ứ ể ả ề Khi tăng l ng enzym thì t c đ ph n ng không tăng thêm, đi u này có th gi ế i thích là do thi u

ộ ề ủ ệ ạ ộ ề ấ ớ ơ ấ ể ế ọ c ch t đ k t h p v i trung tâm ho t đ ng và khó duy trì đ b n c a h huy n phù ch t xúc tác

ồ khi n ng đ ộ enzym cao h n.ơ

ự ả ưở ủ ượ ướ ả ứ ệ ế ấ ầ ượ S nh h ng c a l ng n c ban đ u đ n hi u su t ph n ng cũng đ ể c ki m tra

ả ứ ả ứ ệ ấ ỗ ọ ằ b ng cách thêm n ướ ừ c t ấ ạ 2%20% (v/v) vào h n h p ph n ng. Hi u su t ph n ng cao nh t đ t

ượ ặ ướ ố ớ đ c khi không có m t n ố ớ c là 10% đ i v i nbutyl acetate và 13% đ i v i npropyl acetate.

ấ ẽ ả ệ ả ươ ướ Trong khi đó hi u su t s gi m kho ng 5% khi hàm l ng n c là 20%.

ả ứ ộ ố Khi tăng nhi t đ t ộ ệ ộ ừ 30°c lên 50°c thì t c đ ph n ng tăng, qua giá tr ị 50°c thì t c đố

ả ứ ả ố ớ ả ứ ộ ố ừ ế ph n ng gi m xu ng. V i nbutyl acetate t c đ ph n ng tăng t 217 đ n 410 pmol/(g.h) và

ừ ự ế tăng t 298 đ n 529 pmo (g.h).

ể ả ố ị ụ ấ ừ ầ ỉ ứ 2.I.2.42. ng d ng ụ enzyme lipase c đ nh đ s n xu t liên t c monoacylglycerol t ole n d u ọ c [14]

ượ ử ụ ổ ế ư ấ Monoacylglycerols (MAG) đ c s d ng ph bi n nh là ch t nhũ hóa trong các ngành

ự ệ ẩ ượ ấ ạ ự ệ ẩ ẩ ẩ ỹ công nghi p th c ph m, d c ph m, m ph m. Trong công nghi p th c ph m là ch t t o nhũ

ạ ướ ố ữ ẩ ạ ả cho các lo i bánh, s n ph m s a và các lo i n c s t...

ệ ượ ả ủ ằ ấ Hi n nay, MAG đ ụ ệ c s n xu t trên qui mô công nghi p b ng cách th y phân liên t c

ấ ở ệ ộ ử ụ ơ ừ ấ ườ ch t béo nhi t đ cao (220250°C), s d ng ch t xúc tác vô c ong môi tr ng khí Nit ơ ả . S n

ượ ả ấ ườ ộ ố ượ ộ ượ ể ẩ ph m đ c s n xu t theo con đ ng này có m t s nh c đi m. M t l ng ị glycerol b hao phí

ệ ộ ả ứ ụ ạ ạ ẩ ẫ ả do nhi t đ ph n ng cao h n ơ 220°c, các s n ph m ph t o gây màu s m và t o mùi không mong

ấ ạ ư ữ ệ ạ ấ ơ ố ử ấ ấ mu n. H n n a, hi u su t t o MAG là kh th p. Quá trình ch ng c t phân đo n phân t ầ là c n

ế ử ụ ự ệ ầ ạ ộ thi ấ ẩ t vì MAG s d ng trong công nghi p th c ph m c n đ tinh s ch cao, vì chúng có tính ch t

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ố ơ ề ầ ỗ ọ ươ ượ nhũ hóa t t h n các h n h p các acylglycerol. G n đây có nhi u ph ng pháp đ ứ c nghiên c u

ấ ằ ọ ọ ử ụ ể ả đ s n xu t MAG b ng ủ enzyme. Đây là quá trình th y phân ch n l c s d ng enzyme 1,3

ủ ặ ự ủ regiospecific lipase, s ự ester hóa c a các acid béo ho c s chuy n ể ester c a ủ ester c a các acid béo

ặ ầ ủ ỡ v i ớ glycerol và quá trình glycerolysis c a m ho c d u.

ấ ợ ủ ệ ử ụ ữ ệ ể ứ ụ Hi n nay, nh ng b t l i c a vi c s d ng ệ ự lipase đ ng d ng trong công ngh th c

ể ượ ẩ ề ấ ượ ử ụ ở ạ ph m là giá cà c a ủ enzyme. Đ v t qua v n đ này, lipase đ c s d ng ố ị d ng c đ nh, vì

ươ ấ ử ụ ố ị ằ ả ph ng pháp này cho phép t i s d ng enzyme. B ng cách c đ nh ấ enzyme, qua trình s n xu t

ụ ượ ự ệ ơ ươ ố ị ể ượ ự liên t c cũng đ ễ c th c hi n d dàng h n. Ph ng pháp c đ nh enzyme có th đ ệ c th c hi n

ươ ề ặ ố ị ề ấ ạ ấ ậ ặ ọ ằ b ng ph ng pháp c đ nh v t lí ho c hóa h c trên b m t ch t mang. Nhi u lo i ch t mang nh ư

ự ừ ổ ượ ử ụ ể ố ị calcium carbonate, Celite, nh a ao đ i ion và Accurel đ c s d ng đ c đ nh enzyme lipase.

ệ ủ ầ ọ ử ụ ử ụ ố ị ượ ặ Đ c bi t quá trình glycerolysis c a d u c s d ng glycerol s d ng lipase c đ nh đ c dùng đ ể

ả ứ ượ ự ế ị ả ứ ạ ả s n xu t ấ MAG. Tuy nhiên, ph n ng đ ệ c th c hi n trong thi t b ph n ng gián đo n có cánh

ấ ử ụ ệ ố ụ ả ấ ắ ượ ự ệ ư ậ khu y s d ng h th ng pha r n. Nh v y quá trinh s n xu t liên t c không đ c th c hi n.

ượ ể ượ ử ụ ể ả Trong các enzym lipase đ c có th đ c s d ng đ s n xu t ấ MAG thông qua quấ

ầ ọ ộ ổ ị trình glycerolysis c a ủ olein d u c thì enzym lipase t ừ Pseudomonas sp. enzym có đ n đ nh nhi ệ t

ấ ậ ượ ượ ể ự ố ị ệ ọ ơ ả cao và giá c ch p nh n đ c nên đ ấ c ch n đ th c hi n qu trình c đ nh. H n n a ữ lipase

ượ ố ị ấ ằ ữ ậ ấ ấ ơ đ ậ ệ ữ ơ c c đ nh trên nh ng ch t mang vô c và h u c khác nhau và nh n th y r ng c c v t li u

ị ướ ạ ủ ạ ơ ạ t o khung m ng k n c cho ho t tính th y phân d u ầ olive cao h n. Accurel EP100 (<200 m) là

ấ ể ố ị ấ ọ ch t mang phù h p nh t đ c đ nh lipase PS.

ể ượ ử ụ ể ả Trong các enzym lipase có th đ c s d ng đ s n xu t ấ MAG thông qua quá trình

ầ ọ ộ ổ ị ệ glycerolysis c a ủ olein d u c thì enzym lipase t ừ Pseudomonas sp. enzym có đ n đ nh nhi t cao

ậ ượ ượ ể ự ố ị ệ ọ ả ấ và giá c ch p nh n đ c nên đ c ch n đ th c hi n quá trình c đ nh. H n n a ơ ữ lipase đ ượ ố c c

ậ ệ ạ ữ ơ ấ ằ ữ ậ ấ ơ ị đ nh trên nh ng ch t mang vô c và h u c khác nhau và nh n th y r ng các v t li u t o khung

ị ướ ạ ủ ấ ạ ơ m ng k n c cho ho t tính th y phân d u ầ olive cao h n. Accurel EP100 (<200 m) là ch t mang

ấ ể ố ị ọ ệ ố ấ ượ ạ ỗ ọ ơ phù h p nh t đ c đ nh lipase PS. Trong h th ng gián đo n, h n h p c ch t đ ớ ộ c tr n v i

ố ị ế ị ấ ừ ớ ậ ố ồ enzyme tan ho c ặ enzyme c đ nh trong thi t b khu y t v i v n t c 300 v ng/phút. Trong h ệ

ọ ơ ấ ượ ụ ố ớ ậ ố ằ ấ ế ị ỗ th ng liên t c, h n h p c ch t đ c khu y v i v n t c 300 vòng/phút b ng thi t b khu y t ấ ừ và

ượ ư ế ị ặ ơ ộ đ c đ a vào thi t b PBR ả ằ (packedbed reactor) ho c CSTR b ng b m nhu đ ng. Quá trình ph n

ứ ượ ở ướ ư ố ớ ế ị ố ị ng đ c gi ữ ở nhi t đ c l u thông. Đ i v i thi t b PBR, enzyme c đ nh ệ ộ 45°c b i dòng n

ượ ỏ ườ ỗ ọ ơ (1500 mg) đ ộ c nén vào c t có v áo (đ ng kính trong 0.68 ấ cm, dài 25.0 cm). H n h p c ch t

ượ ộ ượ ủ ộ ớ ư ượ ỉ ả ẩ ượ ấ đ ề c tr n đ u và đ c cho vào đ nh c a c t v i l u l ng 0,02 ml/phút và s n ph m đ c l y ra

ở ộ ớ ế ị ố ị ượ ặ ộ đáy c t. V i thi t b CSTR, enzyme lipase c đ nh đ ụ ổ ỏ c đ t vào m t cái thùng hình tr c v áo

ượ ớ ố ả ẩ ấ ộ ượ c khu y v i t c đ 300 vòng/phút. S n ph m đ c cho vào ờ (4.5 cm ID, 6.0 cm height) và đ

ớ ư ượ ượ ấ ở ử ủ ỉ đ nh v i l u l ng 0.02 ml/phút và đ c l y ra c a đáy c a thi ế ị t b .

Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c

ượ ố ị ả ạ ơ Lipase đ c c đ nh trên Accurel gi ữ ượ đ ấ c h n 90% ho t tính sau 24h. Khi s n xu t

ế ị ả ứ ấ ụ MAG liên t c trong thi t b ph n ng PBR thì năng su t là 1.05x102 g MAG/U.ngày và

Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c

ạ ượ ệ ấ ứ ẹ ả ớ hi u su t trung bình đ t đ c là 14,01%, gi m nh khi tăng thòi gian phàn ng v i. Còn

ả ứ ệ ế ị ấ ươ ệ ấ ự khi ph n ng th c hi n trong thi t b CSTR thì hi u su t trung bình và năng su t t ứ ng ng là

14.34% và 1.07 X 102 g MAG/U.ngày.

2.13.Enzym agalactosidase (raffînase)

ớ ỉ 2.1.31.Gi i thi u v ệ ề enzym agalactos dase [15]

ặ ộ aDGalactosidase (aDgalactoside galactohydrolase EC 3.2.1.22) có m t r ng rãi

ự ậ ủ ậ ộ ả i phóng galactose tự trong vsv, th c v t và đ ng v t. Nhìn chung, agalactosidase th y phân và gi

ừ ự ư do t galactosylsucrose oligosaccharide trong t nhiên nh ư raffinose và stachyose cũng nh các a

ư galactoside khác nh galactolipid và galactoprotein.

ư ậ ộ ườ ủ ầ ả ổ ọ Tuy nhiên, các loài đ ng v t cũng nh con ng i không có kh năng t ng h p đ y đ a

ệ ố ườ ể ủ ụ ể ộ DGalactosidase trong h th ng đ ng ru t đ th y phân agalactoside, c th là các oligo

ư ế ế ậ ậ saccharide thu c h ộ ộ ọ Raffinose trong đ u nành cũng nh các loài đ u khác. Vì th , khi vào đ n ru t

ẽ ị ậ ạ ứ ầ già các galactoseoligosaccharide này s b các vi sinh v t t i đây lên men và gây ra ch ng đ y hoi.

ạ ỏ ệ ấ ẽ ạ ậ ậ Do đó, vi c lo i b các oligosaccharide này trong đ u nành và các lo i đ u kh c s làm tăng giá

ị ưỡ ư ả ụ ậ ẩ ả tr dinh d ng cũng nh kh năng tiêu th các s n ph m đ u.

ồ 2.1.32.Ngu n thu nh n

ể ượ ậ ừ ề ồ ậ Enzym agalactosidase có th đ ậ enzym agalactosidase [15] c thu nh n t nhi u ngu n khác ư ộ nhau nh đ ng v t,

ự ậ ậ ươ ườ ượ ả ấ ừ th c v t và vi sinh v t. Trong đó enzym th ạ ng m i th ng đ c s n xu t t ạ ồ hai ngu n: h t

cà phê còn xanh (green coffee bean) và Aspergillus niger.

ườ ử ậ ừ ậ Ngoài ra, ng i ta cũng nghiên c u thu nh n agalactosidase t ư các loài vi sinh v t nh :

Thermus sp. T2, Gibberella fujikuroi, Bacillus stearothermophilus, Streptomyces grìseoloalbus,

ỉ Streptomyces griseoloalbus, Pénicillium sp., Talaromyces flavus, Thermomyces anuginosus ,...

ươ

enzym agalactosidase C ố ươ 2.1.32.Cách ph đinh aealactosidase ố ị ng pháp c đ nh bans ph ng pháp bao eói

ượ ố ị ươ Enzym agalactosidase t ừ Aspergillus oryzae đ c c đ nh theo ph ng pháp Ates và

ị ượ ộ ị Mehmetoglu. 4 ml dung d ch sodium alginate (3.75%) đ c tr n v i 1 ớ ml dung d ch enzym đ t oể ạ

ử ấ ồ ộ ị ọ ỗ ượ ạ ọ ằ thành m t dung d ch đ ng nh t ch a 3% alginate. H n h p sau đó đ c t o gi t b ng cách nh ỏ

ọ ằ ị ở ạ ạ ượ gi t b ng kiêm tiêm vô trùng vào dung d ch CaC Ỉ2 0,2M ể ạ đ t o h t. Các h t này đ c làm 4°c

ị ầ ạ ạ ượ ử ạ ằ ướ ấ ứ c ng trong dung d ch CaC Ỉ2 trong 2h. Các h t hình c u t o thành đ c r a s ch b ng n c c t và

ượ ả ả ị đ c b o qu n trong dung d ch đ m ượ ử ụ c s d ng ệ acetate 0,2M (pH 4.8) ờ 4°c. Glutaraldehyde đ

ể ố ị ượ ế làm tác nhân liên k t chéo đ c đ nh enzym agalactosidase. H t ạ calcium alginate đ c x ử ư

ạ ượ ọ ử ằ ớ ướ trong 3 phút trong 5ml v i 1% glutaraldehyde. Các h t đ c l c và r a b ng n c vô trùng sau đó

ở ử ụ ế ượ ố ị ả b o quàn cho đ n khi đem ra s d ng. Enzym a galactosidase đ c c đ nh trong gel 4°c

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ị ấ ạ ự ố ị alginate 3% b m t 54,5% ho t tính so vói enzym t do. Ä'max và Vmax c a ủ enzym c đ nh v i c ớ ơ

57°c và pH t

ố ị ấ ch t là raffinose là 5.5mM và O.lSUml1. Nhi ệ ộ ố ư ủ enzym c đ nh là i u c a t đ t i uố ư

ạ ố là 4,5. Enzym hòa tan gi ữ ượ đ c 92% và 88% ho t tính sau 8h và 12h, trong khi đó enzym c đinh

gi ữ ượ đ c 94% và 92% [15].

ượ ố ị Enzym agalactosidase t ừ G. fujikuroi đ c c đ nh trong gel polyacrylamide theo ph ngươ

ủ pháp c a Thanunkul et al. cượ 712,5 mg acrylamide và 37,5 mg N,N’methylene bisacrylamide đ

ư ị ị ượ thêm vào 10ml dung d ch enzym agalactosidase thô. Sau đó, d ng d ch đ c bài khí chân không và

thêm 20 mg ammonium persulphate và 50 ml TEMED (NNN’N’tetramethylethylene diamine). Sau

ượ ượ khi polymer hóa các h t ạ gel thu đ c có ch a ứ enzym agalactosidase đ c cho qua rây 1000 pm và

ượ ử ằ ướ ạ đ ầ c r a vài l n b ng n c s ch. pH t ố ư ủ enzym agalactosidase hòa tan là 5,8, trong khi đó i u c a

ố ư ố ị ả pH t i u c a ằ ủ enzym c đ nh n m trong kho ng 5, 25,6. Trong kho ng ả pH 4,0 và 6,3 enzym cố

ạ ạ ự ờ ị đ nh và enzym hòa tan có ho t tính là 90%. Ho t tính c a ủ enzym t ả do gi m v ề zero nhi ệ ộ t đ

ư ở ệ ộ ố ị ạ ệ ộ ố ư ủ ầ nhi t đ đó enzym c đ nh có ho t tính là 50%. Nhi i u c a h u h t t đ t ế enzym 65°c, nh ng

ự ố ị agalactosidase trong kho ng ả do và enzym c đ nh gi ữ ượ đ c 44% 37°c và 40°c. Sau 24h, enzym t

ư ạ ự ầ do chi gi đ c enzym và 36% ho t tính, nh ng sau 3 ngày thì enzym t ạ ữ ượ 6% ho t tính ban đ u và

ầ ạ ố ị c đ nh gi đ c ữ ượ 17% ho t tính ban đ u [16].

ố ằ ươ ế C đinh aealactosidase b ne ph hóa trì cone ne pháo liên k t

ố ượ ủ ử Enzym hexameric agalactosidase t ừ Thermus sp. ch ng T2 (kh i l ng phân t 320 kDa)

ạ ộ ệ ề ạ ộ ộ ệ ộ ố ư có ho t tính cao trong m t dãy đi u ki n ho t đ ng r ng nh ư pH 5.010.0, nhi t đ t i u xung

ố ượ ể ệ ẳ ử ơ ị ở pH 7.0, đi m đ ng đi n là 5.5 và s l ng phân t ộ ể Lys trên m t ti u đ n v là quanh giá tr ị 70°c

10 [17].

ậ ố ị ế ộ ờ ị ể ồ ỹ ị ươ ố Liên k t c ng hóa tr đa đi m là k thu t c đ nh đ ng th i v trí t ộ ng đ i m t vài nhóm

ử ụ ử ụ ế ạ ắ ấ c a ủ enzym s d ng ch t mang r n có các nhóm ho t hóa và s d ng các tác nhân Hên k t chéo,

ẽ ề ườ ứ ố ị ể ể ổ ị đi u này s tăng c ng đáng k tính n đ nh c a ứ ủ enzym. Các cách th c c đ nh có th đáp ng

ầ ạ ế ộ ể ị cho yêu c u t o thành các Hên k t c ng hóa tr đa đi m:

ượ ộ ươ ệ ạ ữ Glyoxyl agarose: đ c cho là m t ph ế ộ ng pháp h u ích toong vi c t o các Hên k t c ng

ẽ ố ị ể ấ ị ự ổ ự ế ể ấ ằ ị hóa tr đa đi m. Ch t mang này s c đ nh protein tr c ti p b ng ít nh t 2 đi m do s n đ nh

ấ ủ ế ạ ươ ộ ố ị th p c a các d ng Hên k t imine gi a ữ aldehyde và amine. Theo ph ố ng pháp này, t c đ c đ nh

ề ặ ậ ộ ụ ộ ph thu c vào m t đ c a ấ ậ ộ ủ aldehyde trên b m t ch t mang và m t đ Lys trên b m t ề ặ enzym. Vì

ế ượ ố ị ể ằ ị th các phân t ử enzym đ ế ộ c c đ nh b ng Hên k t c ng hóa tr đa đi m tr ướ ế ở c h t ự các khu v c

ậ ộ có m t đ Lys cao [17].

ể ử ụ ề ạ ấ ộ ươ Glutaraldehyde: là m t ho t ch t mà có th s d ng trong nhi u ph ng pháp khác nhau:

ề ễ ặ ấ ạ ấ ổ ử ụ s d ng ti n ho t hóa ch t mang và di n ra quá trình trao đ i ion c a ủ enzym, ho c h p ph ụ

ấ ượ ử ượ ấ ụ ớ enzym trên ch t mang đ c amin hóa và x lí thêm enzym đã đ c h p ph v i glutaraldehyde đ ể

Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c

ấ ườ ố ọ ế ạ t o liên k t chéo gi a ữ enzym và ch t mang. Trong cà hai tr ng h p, cu i cùng enzym s đ ẽ ượ c

ề ặ ượ ế ấ ầ ở ệ ở ướ ầ ắ g n trên ch t mang b i nhóm Lys trên h u h t các b m t đ c tích đi n âm b i vì b c đ u tiên

ự ổ đã có s trao đ i ion [17].

ứ ấ ả ứ ữ ề ể ấ ớ Ch t mang có ch a nhóm epoxy: nh ng ch t mang này có th ph n ng v i nhi u nhóm

ấ ấ kh c nhau trên ch t mang nh ư amino, thiol, hydroxyl, imidazole, carboxylic. Tuy nhiên do khả

ơ ế ủ ố ị ữ ấ ấ ả ứ năng ph n ng c a ấ ủ enzym trên nh ng ch t mang này th p nên c ch c a qu trình c đ nh thông

ướ ướ ự ấ ả ứ ự ấ ộ qua 2 b c: tr c tiên là s h p ph ụ enzym trên ch t mang, sau đó là s ph n ng c ng hóa tr ị

ữ ấ ấ ấ ượ ấ gi a các nhóm trên c c ch t mang và các nhóm epoxy trên ch t mang đ c h p ph ụ enzym [17].

ượ ả ấ ộ M t l ng kho ng 10g ch t mang khác nhau (Sepabeads®ECEP, Sepabeads®

aminoepoxyECHFA, glyoxylagarose, MANAEagarose or MANAEagarose preactivated with

ờ ạ ề ị glutaraldehyde) d ng huy n phù trong 20ml dung d ch đ m ệ potassium phosphate 25mM có pH

ứ ườ ọ 7.0 ch a 3 IU/ml enzym agalactosidase. Trong tr ng h p Sepabeads®EC EP, enzym đ c ượ ủ

ử ụ ấ ị trong dung d ch đ m ệ sodium phosphate IM có pH 7.0 và khi s d ng ch t mang glyoxyl quá trình

ượ ự ệ ị đ c th c hi n trong dung d ch đ m ệ sodium carbonate lOOmM có pH 10.05. Trong m i tr ọ ườ ng

ề ệ ượ ế ẫ ầ ị ượ ằ ọ h p, h huy n phù đ ấ c khu y nh c b ng cách ấ ổ ẹ ở 25°c. Các d n xu t n đ nh h u h t thu đ

ế ạ ấ ố ị c đ nh enzyme trên glutaraldehyde agarose, và các ch ph m ẩ enzym có ho t tính r t cao (95%).

ẫ ấ ượ ử ụ ạ ằ Trong khi đó, các d n xu t thu đ c b ng cách s d ng aminoepoxideSepabead thì có ho t tính

ấ ơ th p h n 10% [17].

ệ ố ị ử ụ ấ ượ Vi c c đ nh agalactosidase s d ng glutaraldehyde và ch t mang đ c amin hóa có th ể

ử ụ ấ ấ ượ ượ ề ứ ả x y ra theo hai cách. Cách th nh t là s d ng ch t mang đ c amin hóa và đã đ ạ c ti n ho t

ứ ớ ướ ế ấ ấ ượ hóa v i glutaraldehyde. Cách th hai, tr c h t là h p ph ụ enzym lên ch t mang đã đ c amin

ấ ớ ứ ử ớ ớ ỉ hóa và sau đó x lí v i glutaraldehyde. V i cách th nh t, ổ ấ enzym ch trao đ i ion v i ch t mang,

ẽ ượ ố ộ ổ ử ớ ị ượ ơ cu i cùng s đ c x lí v i glutaraldehyde 0.5% (v/v) thì đ n đ nh thu đ c cao h n ph ươ ng

ứ ở ươ ụ ễ ứ pháp th hai. Trong khi đó, ph ấ ng pháp th hai, quá trình h p ph di n ra nhanh và gi ữ ượ c đ

ệ ử ư ẽ ả ạ ớ ưở ế 90% ho t tính, nh ng vi c x lí v i glutaraldehyde 0.5% s không nh h ủ ạ ng đ n ho t tính c a

enzyme [17].

ự Nhi ệ ộ ố ư ủ enzym t i u c a t đ t do là ệ ộ ố ư ủ enzym i u c a t đ t 65°c ở pH 7.0, trong khi đó nhi

ế ẩ ố ư ạ ấ ạ ầ ố ị c đ nh là ạ i u có ho t tính còn l i g p 2 l n ho t tính c n l ồ ạ ủ i c a 70°c. Ở 80°c, ch ph m t

ộ ổ ề ấ ớ ị enzym hòa tan (72% so v i 40%). Đi u này cho th y đ n đ nh nhi ệ ủ enzym c ố t c a

Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c

ặ ư ầ ổ ị đ nh cao hom enzym hòa tan. M t khác, pH t ố ư ủ enzym h u nh không thay đ i sau i u c a

ố ị khi c đ nh, pH t i u ố ư ở 25°c là 45 [17].

ố ị ứ ụ 2.I.34. ng d ng c a ủ enzym rifflnase c đ nh

ạ ậ ế ộ ủ ề ề ọ ố Các lo i đ u đóng vai trò quan tr ng trong ch đ ăn truy n th ng c a nhi u vùng trên

ế ớ ự ế ấ ấ ơ ưỡ th gi i do th c t chúng có ít ch t béo và là ngu n ồ protein, x và các vi ch t dinh d ệ ng tuy t

ậ ượ ự ề ớ ờ v i. Ngu n ậ ồ isoflavone trong đ u nành cũng nh n đ ệ c s chú ý v i vai trò ti m năng trong vi c

ư ề ị ươ ơ ữ ữ ậ ượ ế ồ đi u tr ung th và loãng x ng. H n n a, s a đ u nành đ ấ c xem là ngu n thay th chi phí th p

ở ướ ữ ể ự ổ ư ấ ưỡ ữ cho s a bò các n c đang phát i n nh là s b sung các ch t dinh d ạ ng không dung n p

ấ ả ẻ ơ ự ẻ ẩ ẩ ỏ ừ ậ ứ lactose cho tr s sinh và tr nh . Tuy nhiên, c c s n ph m th c ph m làm t ề đ u có ch a nhi u

ưỡ ạ ố ộ ế ố y u t kháng dinh d ng, m t trong s đó là h đ ộ ọ ườ Raffmose oligosaccharide. Niêm m c m t ng

ườ ủ ậ ầ ạ ộ ế ủ c a con ng i và d dày c a các loài đ ng v t thi u ế enzym a galactosidase c n thi ự ủ t cho s th y

ẽ ị ế ộ ế phân các oligosaccharide này. Vì th , khi vào đ n m t già các oligosaccharide này s b các vi

ậ ở ạ ỏ ứ ệ ầ ơ sinh v t đây lên men và gây ra ch ng đ y h i. Do đó, vi c lo i b các oligosaccharide t ừ ự th c

ẩ ừ ậ ộ ế ố ệ ệ ả ọ ị ưỡ ph m làm t đ u nành là m t y u t quan tr ng trong vi c c i thi n giá tr dinh d ủ ng c a

ọ ườ ủ ệ ể ượ ế ế ị chúng. Vi c th y phân h đ ng raffinose có th đ c ti n hành trong thi ả ứ t b ph n ng gián

ụ ạ đo n hay hên t c [15].

ế ị ả ứ ạ ườ ố ị Trong thi t b ph n ng gián đo n, ng ế i ta ti n hành ủ enzym agalactosidase c đ nh t ừ

ấ ữ ậ ờ Aspergillus oryzae trên ch t mang calcium alginate và s a đ u nành trong th i gian khác nhau là 2,

ế ươ ứ ả ủ 4, 8 và 12h, cho k t qu th y phân oligosaccharide t ớ ế ng ng là 74%, 78%, 79% và 81%. V i k t

ủ ệ ệ ấ ấ ả ờ qu đó ta th y hi u su t th y phân trong 2h là 74% trong khi đó vi c kéo dài th i gian không làm

ấ ể ệ tăng đáng k hi u su t [15].

ạ ỏ ụ ấ ượ ế Qu trình lo i b oligosaccharide liên t c đ c ti n hành trong thi ế ị “fluidized bed t b

ủ ệ ấ ươ reactor”. ứ ng ng Ở 50°c, hi u su t th y phân oligosaccharide là 90%, 78%, 74%, 52% và 35% t

ả ố ộ ấ ằ ữ ế vói t c đ dòng ch y là 40, 80, 120, 160 và ớ ố ả 200ml.1T1. Nh ng k t qu này cho th y r ng v i t c

ấ ố ủ ệ ạ ấ ấ ộ ộ đ dòng là 40ml.1T1 thì hi u su t th y phân đ t cao nh t là 90%. Qua đó cho th y t c đ dòng

ả ố ư ữ ả ố ọ ộ ưở ạ ộ ệ ế ch y t i u là m t trong nh ng thông s quan tr ng nh h ủ ả ng đ n hi u qu ho t đ ng c a

thi ế ị “fluidized bed reactor” [15]. t b

ượ Ngoài ra, enzym agalactosidase còn đ c thu nh n t ậ ừ G. fujikuroi và M. vinacea và đ cượ

ạ ỏ ệ ừ ậ ố ị c đ nh trên gel polyacrylamide cho vi c lo i b các oligosaccharide t đ u nành. ủ ử pH c a s a

ố ư ủ ố ị ậ đ u nành là 6.2Ó.4. pH t i u c a agalactosidase c đ nh t ừ G. fujikuroi là 5.25.6 và gi ữ ượ c đ

ố ư ủ ố ị ạ 90% ho t tính ở pH 6.4. Trong khi đó pH t i u c a agalactosidase c đ nh t ừ M. vinacea là 4.0

ả ứ ư ế ế ấ 4.5, vì th ph i h th p ả ạ ấ pH khi ti n hành ph n ng, nh ng khi ờ pH th p thì

S ample analyte

Bioreceptors

Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c Transducer

Signal ị ế ủ

ữ ố ị ữ ậ ỗ làm cho protein trong s a đ u nành b k t t a và làm cho s a c v chua. Do đ , a galactosidase

ọ ố ơ ệ ử ữ ậ ổ ị c đ nh t ừ G. fujikuroi là s l a ch n t t h n trong vi c x lí s a đ u nành [16]. ự ự Microelectronics

ụ ứ 22. ng d ng trong phân tích

ế ổ ọ (biosensor) ề ả 2.21.T ng quan v c m bi n sinh h c

ớ ề ả ệ ế ọ 2.2.11,Gi i thi u v c m bi n sinh h c [18]

ế ả ộ ế ị ợ ố ấ ả C m bi n sinh h c ọ (biosensor) là m t thi t b tích h p c kh năng cung c p thông tin

ị ượ ặ ị ượ ầ ử ư ặ ồ ế phân tích đ nh l ng ho c bán đ nh l ng đ c tr ng, bao g m ph n t ậ nh n bi ọ t sinh h c

ế ợ ầ ử ế ớ ộ ỉ ự (b oreceptor) k t h p tr c ti p v i m t ph n t ể chuy n đ i ổ (International Union of Pure and

Applied Chemistry).

ế ả ọ ế ị ử ụ ọ C m bi n sinh h c là thi t b s d ng các tác nhân sình h c nh ư enzym, các kháng th ,...ể

ậ ấ ạ ủ ả ệ ế ấ ặ ạ ồ ọ ể đ phát hi n, đo đ c ho c phân tích hoá ch t. Do v y c u t o c a c m bi n sinh h c bao g m 3

ImimobitìS ci ệ enzymes, Microorganisms Imanunõacie n1s DNA, whole cells

ữ

ry. amperometry Optical: Absorption,

ầ ơ ả ầ ậ ầ ầ ọ ọ thành ph n c b n: thành ph n hoá h c, thành ph n sình h c và thành ph n v t lý.

Flectrocliemical Paten t i met Flu óresceriee, reflection Piöi2TÖölöCtfiO

processing

Data

Hình 2.1: Mô hình biosensor

ị ử ế ể ọ

ượ ư ế ườ ự ả ẽ 2.2.I2.L ch s phát tri n căm bi n sinh h c [18] ư t nh là ng Giáo s Leyland D.Clark đ c bi i đi ti n phong trong lĩnh v c c m

ề ệ ự ữ ế ế ọ ố ầ bi n sinh h c. Năm 1956, ông công b bài báo đ u tiên v đi n c c oxy hoá. Nh ng năm ti p theo

ệ ấ ế ụ ạ ộ ổ ắ ở ộ ự ề ệ ả ủ ằ ông ti p t c th c hi n r t nhi u thí nghi m nh m c g ng m r ng kh năng ho t đ ng c a

ệ ượ ế ủ ả ế ề ư ả c m bi n nh phát hi n đ ộ c thêm nhi u tác nhân, nâng cao đ chính xác c a c m bi n. Vào năm

ạ ộ ề ả ế ế ộ 1962, t i h i ngh ị New York Academy of Science, ông đã thuy t trình m t bài v c m bi n sinh

ớ make electrochemical sensors (pH, polarographic, potentiometric or conductometric ị more ọ h c: ‘T

intelligent by adding enzyme transducers as membrane enclosed sandwiches”.

ế ả ọ ủ ồ C m bi n sình h c theo mô ệ ự hình c a D.Clark bao g m đi n c c oxy hóa, trên đó có màng

ổ ị ườ ả ứ gi ữ enzyme glucose oxidase c đ nh. Kh m t đ ỉ ậ ộ glucose trong môi tr ng ph n ng

Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c

ệ ự ề ặ ậ ộ ả ả ấ ộ ươ ứ gi m thì m t đ ch t oxi hóa trên b m t đi n c c cũng gi m m t cách t ự ng ng. D a

ổ ủ ồ ự ự ệ ổ ườ trên s thay đ i đó, Clark đã phát hi n ra s thay đ i c a n ng đ ộ glucose trong môi tr ầ ng c n

ể ki m tra.

ữ ủ ế ầ ầ ố Nh ng năm ti p theo, nhóm c a Guilbault và Montalvo l n đ u tiên công b chi ti ế ề t v

ệ ự ọ ự ế ạ ộ ả ế ế ệ ả ch t o thành công c m bi n sinh h c d a trên đi n c c ch a ế ứ enzyme đo đi n th , m t c m bi n

T T _

ệ ự ố ị ắ ằ ồ ộ đo n ng đ urê b ng đi n c c ch n l c ọ ọ ion NH4+, có g n màng c đ nh urease.

Urease T T _ _ _ ,.TTT+

3 + NH 4

► Urea — HCO

ả ộ ả ế ợ ắ Năm 1975, Lubber và Opitz đã mô t m t c m bi n s i quang (fiberoptic sensor) g n các

2 và O2. Cũng vào năm 1975, m t s vi khu n cũng đã đ

ấ ồ ộ ị ỉ ộ ố ẩ ể ch t ch th dùng đ đo n ng đ CO ượ c

ư ữ ệ ự ộ ồ ể ầ ồ ử ụ s d ng nh nh ng thành ph n sinh h c ọ fren các đi n c c vi sinh đ đo n ng đ c n.

ế ầ ầ ưở ủ Năm 1975, công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) l n đ u tiên bi n ý t ng c a Clark

ự ệ ệ ươ ế ả ả ầ ạ ẩ ọ thành hi n th c thông qua vi c th ng m i hóa các c m bi n sinh h c. S n ph m đ u tiên là

ế ị ự ố ầ ộ thi t b phân tích glucose d a trên hydrogen peroxide và đó cũng là c t m c đ u tiên đánh d u s ấ ự

ệ ủ ờ ố ấ ả ọ ế xu t hi n c a các c m bi n sinh h c trong đ i s ng.

Glucose oxidase _ ß D Glucose + O2 D ► Gluconic acid + H2O2

ệ ồ ả ề ả Yào năm 1982, Shichiri và các đ ng nghi p đã báo cáo và mô t v c m bi n ế “glucose in

ạ ả ế ệ ạ ầ ướ vivo”, là lo i c m bi n d ng kim đ u tiên cho các xét nghi m d i da.

ệ ặ ớ ự ủ ể ọ ệ ấ Cùng v i s phát tri n nhanh chóng c a khoa h c và công ngh , đ c bi t là c c ngành

ạ ượ ế ệ ả ọ ữ ế công ngh v t li u ệ ậ ệ nano và công ngh thông tin, c m bi n sinh h c cũng đ t đ c nh ng ti n b ộ

ượ ậ ứ ữ ẹ ế ị ằ ạ ị v ư t b c, h a h n đ a ra nh ng vi thi ẩ t b nh m xác đ nh nhanh, chính xác các lo i vi khu n,

ế ị ể ượ ẫ ấ ỏ ỡ ệ virus gây b nh. Các thi t b này cũng có th dò tìm hay phân tích l ng m u r t nh (c vài nM)

ậ ộ vói đ tin c y cao.

ạ 2.2.I2.Phân lo i [19]

ể ượ ế ả ọ ạ ự ầ ặ ọ C m bi n sinh h c có th đ c phân lo i d a vào thành ph n sinh h c ho c thà nh ph nầ

ọ ủ ổ ủ ể ể ầ chuy n đ i c a chúng. Thành ph n sinh h c c a chúng bao g m ậ ồ enzym, kháng th , vi sinh v t,

ọ mô sinh h c và bào quan.

ế ố ả ấ ầ ố ượ ữ ự ế ế ế Khi s liên k t gi a y u t c m bi n và ch t c n phân tích là bi n c đ ệ ấ c ph t hi n

ượ ọ ế ả (detected event) thì đ c g i là c m bi n ái l c ự (affinity sensor).

ự ươ ữ ế ố ấ ầ ặ ọ Khi có s t ng tác gi a y u t sinh h c và ch t c n phân tích và đi kèm ho c theo sau đó là

ộ ủ ơ ặ ả ổ ồ ẩ ấ ượ ả ọ ổ ự s thay đ i n ng đ c a c ch t ho c s n ph m thì đ ấ ế c g i là c m bi n trao đ i ch t

(metabolism sensor).

Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c

ệ ượ ạ ế ủ ấ ầ ế ố ự Khi tính hi u đ c t o ra sau s liên k t c a ch t c n phân tích và y u t ư ọ sinh h c nh ng

ọ ủ ế ố ự ế ọ ượ ế ả ọ ổ không có s thay đ i hóa h c c a y u t ả sinh h c thì c m bi n đó đ c g i là c m bi n xúc tác

(catalytic sensor).

ế ố 2.2.I.4. Các y u t ọ sinh h c

2.2.1.41.Enzym [19]

ư ố ớ ơ ệ ặ ạ Nh đã bi ấ ế enzym là protein có ho t tính xúc tác cao và đ c hi u cao đ i v i c ch t. t

ượ ử ụ ể ể ấ ầ ộ ủ ề ấ ồ Chúng đ c s d ng đ ki m soát và phân tích n ng đ c a nhi u ch t c n phân tích kh c nhau.

ị ườ ẵ ớ ộ ế ậ ợ ệ ề ế Các ch ph m ẩ enzym có s n trên th tr ng v i đ tinh khi t cao là đi u ki n thu n l ệ i cho vi c

ế ả ấ ọ ố ị ủ ế ạ ạ ả s n xu t các c m bi n sinh h c dùng enzym c đ nh. Bên c nh đó, h n ch chính c a các enzyme

ự ấ ệ ộ ẽ ả ưở ế ế ầ là pH, l c ion, các ch t kìm hãm, nhi t đ s nh h ạ ng đ n ho t tính c a ủ enzym. H u h t các

ẽ ấ ạ ệ ộ enzym s m t ho t tính khi nhi t đ trên 60°c.

ử ụ ể ử ụ C c ấ enzym s d ng đ ch t o ế ạ biosensor là các enzym oxy hóa, s d ng oxy hòa tan và

ượ ố ị ể ộ ấ ả s n xu t ra hydrogen peroxide . Enzym đ c c đ nh trên b chuy n đ i ổ (transducer) b ngằ

ươ ế ộ ụ ấ ị ươ ph ng pháp h p ph , liên k t c ng hóa tr , ph ng pháp bao gói trong khuôn gel, trong các

ệ polymer phát sinh đi n hóa (electrochemically generated polymer), trong màng lipid kép (bilipid

ặ ị ườ ượ membrane) ho c dung d ch bên trong màng ch n l c. ọ ọ Enzym th ng đ c ghép thành đôi v i b ớ ộ

ặ ộ ổ ợ ể ệ ể ổ ọ chuy n đ i đi n hóa ho c b chuy n đ i s i quang h c.

ể 2.2.1.42.Kháng th [19]

ể ấ ế ư ả Kháng th có b n ch t là c c ấ glycoprotein, do các t bào lympho B cũng nh các t ươ ng

ế ể ệ ậ ị ế ệ ấ bào (bi ệ ổ ừ t h a t lympho B) ti ễ t ra đ h mi n d ch nh n bi t và vô hi u hóa các t c nhân l ạ ,

ể ệ ể ậ ẳ ạ ẩ ỗ ỉ ch ng h n các vi khu n ho c ặ virus. M i kháng th ch có th nh n di n m t ộ epitope kháng

ể ề ấ ượ ươ ạ ượ ử ụ ộ nguyên duy nh t. Nhi u kháng th đã đ c th ng m i hóa và đ c s d ng r ng rãi trong xét

ể ượ ố ị ề ặ ộ ệ ễ ể ổ ị ươ nghi m mi n d ch. Các kháng th đ c c đ nh trên b m t b chuy n đ i theo ph ng pháp liên

ị ử ụ ứ ế ộ k t c ng hóa tr s d ng các nhóm ch c nh ư amino, carboxyl, aldehyde ho c ặ sulfhydryl.

ặ ạ ử ụ ử ụ ư ể ế ấ ố ơ C c m t h n ch khi s d ng kháng th cũng gi ng nh khi s d ng ữ enzym. H n n a

ụ ồ ề ặ ộ ổ ầ ự ể ệ ề ả ạ ố mu n tái t o và ph c h i b m t b chuy n đ i c n ph i có các đi u ki n nh ấ ư pH th p, l c ion

Ư ể ủ ể ả ấ ạ ả ơ ế ớ l n, ch t làm s ch,... u đi m c a các c m bi n kháng th là kh năng phân tích nhanh h n các

ệ ề ế ễ ễ ả ố ị ị ườ ử ụ ể ổ ộ xét nghi m mi n d ch truy n th ng. C m bi n mi n d ch th ng s d ng b chuy n đ i quang

ọ ọ h c hay âm h c.

ậ 2.2.I.43.Vi sinh v t [19]

ệ ử ụ ế ố ư ậ ọ ế ị ả ọ ự ế Vi c s d ng vi sinh v t nh là y u t sinh h c trong thi t b c m bi n sinh h c d a trên

Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c

ấ ủ ế ườ ầ ổ ườ ự ẽ ệ ổ quá trình trao đ i ch t c a chúng. Trong h u h t tr ợ ng h p, ng i ta s đo s thay đ i đi n hóa

ế ử ụ ặ ọ h c khi t bào s d ng oxy ho c CO

ế ậ ợ ế ẻ ơ ể ổ ể ơ ị T bào vi sinh v t có l i th r h n so v i ớ enzym và kháng th , có th n đ nh h n và có

ể ượ ử ụ ứ ợ ả ứ ự th đ c s d ng trong các ph n ng ph c h p có s tham gia c a ủ enzym và các cofactor. Tuy

ươ ơ ớ ươ nhiên, ph ọ ọ ng pháp này có tính ch n l c kém h n so v i ph ng pháp s ử dung enzym, có th iờ

ứ ả ơ ờ ỏ ườ ế ệ ỉ ụ ồ gian đáp ng, th i gian ph c h i dài h n và đòi h i ph i th ấ ng xuyên ti n hành hi u ch nh. Ch t

ườ ể ố ị mang th ng dùng đ c đ nh là nylon, màng cellulose nitrate, ho c ặ acetyl cellulose.

ộ 2.2.I5.B chuy n đ i ể ổ (transducer)

ể ổ ệ 2.2.1.51.Chuy n đ i đi n hóa [19]

ệ ể ệ ể ổ ổ ộ ộ ượ B chuy n đ i dòng đi n và b chuy n đ i đi n áp đ ổ ế c dùng ph bi n trong thi ế ị t b

ệ ự ượ ể ệ ể ế ầ ọ ư ạ ằ ả c m bi n sinh h c ki u đi n hóa. H u h t, các đi n c c đ ạ c làm b ng kim lo i nh b ch kim,

ậ ệ ạ ằ ả ơ ờ ệ ữ ế ỉ vàng, b c, thép không g và các v t li u b ng ậ ệ carbon. Nh ng v t li u này ph i tr đi n th mà

ả ứ ả ệ ph n ng đi n hóa x y ra.

ể ổ 2.2.1.52.Chuy n đ i quang [19]

ư ấ ạ ộ ệ ứ ự ụ ể ể ấ ổ ổ Chuy n đ i quang là chuy n đ i ho t đ ng d a trên c c hi u ng nh : h p th ánh sáng

ấ ạ ỳ nhìn th y và tia UV; phát x hu nh quang và lân quang; bioluminiscence; chemi luminiscence...

ạ ầ ể ộ ổ ọ ỉ ượ ộ B chuy n đ i quang h c là lo i đ u dò mà trên đ nh đ ố ị c c đ nh ấ enzym và m t ch t

ườ ạ ầ ứ ữ ấ ợ ỳ màu (th ng là hu nh quang). Nh ng lo i đ u dò này ch a ít nh t hai s i quang. M t s i đ ộ ợ ượ c

ể ấ ồ ộ ộ ướ ộ ợ ượ ố ớ n i v i m t ngu n sáng có th ph t ra m t dãy các b c sóng khác nhau, m t s i đ ố ớ c n i v i

ậ ộ ể ộ ổ ọ ệ ự m t diot quang đ phát hi n s thay đ i m t đ quang ở ộ ướ m t b c sóng thích h p.

ể ổ ệ 2.2.1.53.Chuy n đ i nhi t [19]

ạ ộ ệ ượ ặ ổ ỡ ự Ho t đ ng d a trên hi n t ế ng thay đ i entanpi khi hình thành ho c phá v các liên k t

ả ứ ạ ộ ư ể ể ọ ộ ổ hóa h c trong các ph n ng c a ủ enzyme. B chuy n đ i này có u đi m ho t đ ng t ố ớ ấ ả t v i t t c

ọ ọ ả ứ ể ấ ạ ổ ấ c c ph n ng. Tuy nhiên, d ng chuy n đ i này có tính ch n l c th p.

ể ổ ằ ể 2.2.1.54.Chuy n đ i b ng tinh th áp đi n ệ (piezoelectric) [19]

ổ ầ ố ạ ộ ể ẽ ự ể ổ ộ ự Chuy n đ i ho t đ ng d a trên nguyên lý: tinh th s thay đ i t n s dao đ ng khi l c

ổ ạ ư ụ ể ể ạ ờ ộ ổ ỡ tác d ng lên nó thay đ i. Chuy n đ i d ng này có u đi m là đ nh y cao (c picogam), th i gian

ể ử ụ ườ ạ ả ỏ ng l ng và khí. ả ứ ả oxidase và Lglutamate dehydrogenase ơ ộ ph n ng nhanh, kh năng c đ ng cao, có th s d ng đo đ c trong môi tr ọ ử ụ 2.21.C m bi n sinh h c s d ng Lglutamate ể ự ẩ ế ố ị c đ nh dùng đ phân tích monosodium glutamate trong th c ph m

Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c

ớ 2.2.21.Gi ệ i thi u [20]

ượ ồ ị ượ ồ ơ Glutamate là m t ộ amino acid đ ộ c xác đ nh là m t ngu n năng l ng và ngu n Nit quan

ọ ế ậ ế ạ ộ ư ậ ộ ộ tr ng cho các t bào nhân th t và t ấ bào các loài đ ng v t có vú. Nó ho t đ ng nh là m t ch t

ệ ố ề ầ ầ ươ ượ ị ẫ d n truy n các kích thích th n kinh trong h th ng th n kinh trung ng và đ c cho là ch u trách

ể ủ ệ ầ ọ ậ ớ ự ộ ố ư ệ ệ ứ nhi m cho m t s quá trình nh là h c t p, trí nh , s phát tri n c a h th n kinh. Vi c tăng m c

ủ ị ượ ứ ủ ạ ầ ố đ ộ glutamate trong d ch não t y đ c cho là nguyên nhân c a các ch ng r i lo n th n kinh nh ư

ộ ệ b nh đ t qu , b nh ỵ ệ Alzheimer’s và b nh ệ Parkinson’s. Ngoài ra, monosodium glutamate đ ượ ử c s

ổ ế ụ ấ ườ ươ ự ể ệ ẩ ế ị d ng ph bi n làm ch t tăng c ng h ng vi trong th c ph m. Do đó, vi c phát tri n thi t b đo

ườ ượ ề ậ ầ ấ ọ ộ l ng hàm l ng glutamate m t cách nhanh chóng và đáng tin c y là v n đ quan tr ng c n xem

xét và nghiên c u.ứ

ư ế ệ ả ẫ ậ ọ ổ ố ộ ỹ M t vài k thu t nh kh i ph , đi n mao d n, microdialysis và c m bi n sinh h c đã

ượ ể ể ấ ố ươ ế ả ọ đ c ph t tri n đ phân tích glutamate. Trong s các ph ng pháp đó, c m bi n sinh h c là

ươ ượ ạ ả ể ế ấ ấ ph ng pháp đ ọ ử ụ ộ c quan tâm và ph t tri n nhanh nh t. M t vài lo i c m bi n sinh h c s d ng

ể ệ ổ ượ ế ạ ụ ứ ộ b chuy n đ i dòng đi n đã đ ể c ch t o đ phát hi n ệ glutamate trong các ng d ng khác nhau

ế ế ư ự ẩ ế ượ ấ ạ nh trong ch bi n th c ph m, trong t bào đ ị c nuôi c y, trong d ch não ngo i bào (extracellular

ấ ả ọ ọ ư ế ả ầ ạ ọ ộ brain fluid). C c c m bi n sinh h c này có đ nh y và kh năng ch n l c cao, nh ng c n có các

ướ ớ ấ ả ứ ự ệ ể ẩ ọ ị b c xây d ng và ph c h p đ chu n b các đi n c c ế ự enzym. Không gi ng v i c c c m bi n ố

ế ệ ể ể ạ ả ạ ọ ổ ọ ọ ổ ượ sinh h c d ng chuy n đ i dòng đi n, c m bi n sinh h c lo i chuy n đ i quang h c đ c ch ế

ễ ử ụ ệ ạ ả ấ ơ ơ ạ t o đ n gi n h n, d s d ng và ph t hi n t ỗ i ch .

ươ ệ 2.2.22.Ph ng pháp thí nghi m

ấ ử ụ 2.2.2.21.Các hóa ch t s d ng [20]

Enzym Lglutamate oxidase (LGLOD) (EC 1.4.3.11, 63 /mg Ư protein t ừ Streptomuces sp.),

enzym Lglutamate dehydrogenase (LGLDH) ((EC 1.4.1.3, 452U/mg protein t ừ Proteus sp.),

ệ ạ ấ ị ị NADPH, màng polycarbonate (kích th ướ ỗ c l 0.4 pm), dung d ch đ m và c c lo i dung d ch khác...

ự ố ị 2.2.2.22.S c đ nh enzym [20]

ườ ử ụ ổ ứ ồ ờ ả ị Ng i ta s d ng dung d ch đ m ệ phosphate saline (PBS, pH 7.0) c ch a đ ng th i c hai

ượ ộ ượ ạ ế ớ enzym. Enzym LGLOD và LGLDH đ c tr n và sau đó đ c t o liên k t chéo v i màng

ị polycarbonate. 20pl dung d ch glutaraldehyde và 25pl bovine serum albumin (BSA) đ ượ ử ụ c s d ng

ự ổ ế ệ ả ấ ỗ ị ượ ẩ ể đ nâng cao hi u su t và s n đ nh cho c m bi n. H n h p ọ enzym đ ữ ị c chu n b vói nh ng

ượ ượ ữ ố ị hàm l ng khác nhau vói LGLDH (35143.2U) và LGLOD đ c gi c đ nh

}

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

L-GLOD + L-GLDH

ở ị ượ ử ụ giá tr 25U. Sau đó, 10 J0.1 đ ể ố ị c s d ng đ c đ nh. Màng polycarbonate sau khi cố

ượ ử ạ ư ừ ể ạ ầ ị ị đ nh đ c r a s ch vài l n dung d ch PBS đ lo i glutaraldehyde d th a và các enzym không t oạ

ế ớ ượ ả ử ị liên k t v i màng. Màng ch a ứ enzym đ c b o qu n ả ở 4°c trong dung d ch PBS ch a trong các túi

polypropylene kín khí.

ệ ự 2.2.2.22.Đi n c c [20]

ệ ự ườ ệ ự ư ử ụ ệ ấ ị Đi n c c vói đ ng kính lcm s d ng dung d ch KC1 là ch t đi n phân, đi n c c d ong

ệ ự ệ ự ằ ằ ạ ượ ủ ở làm b ng b c, đi n c c âm làm b ng vàng. Đi n c c oxy đ c ph b i m t l p ộ ớ polypropylene kị

ướ ể ả ự ướ ấ ỉ n ệ ệ c (đ b o v đi n c c trong n c) ch cho khí th m qua và m t l p ộ ớ enzym trên màng

ượ ắ ệ ố ể polycarbonate (kích th ướ ỗ c l 0.4|im) đ ệ ự ằ c g n trên đi n c c b ng h th ng “push cap”. Đ phân

ườ ớ ồ ử ụ ệ ả ộ ị tích, ng i ta s d ng dung d ch đ m b o hòa không khí v i n ng đ oxy 78 ppm ở 25°c. Dung

ượ ạ ị ệ ị d ch đ m đ ằ c lo i oxy b ng dung d ch ọ ổ ị ế ả sodium sulfite. Hình 2.2: Mô hình c m bi n sinh h c phân tích MSG dùng LGLOD—LGLDH c đ nh

ệ ử 2.2.2.2A. Th nghi m [20]

ầ ượ ỗ ầ ự ả ướ ử ụ ệ Đ u dò đ c phân c c trong kho ng 3040 phút m i l n tr c khi s d ng. Vi c th ử

ắ ầ ệ ở ồ ượ ụ ượ ằ nghi m b t đ u b ng cách thêm MSG ộ các n ng đ khác nhau. L ng oxy tiêu th đ c đo sau

ụ ạ ộ ả ố ị ỗ ượ ử ầ ể m i 2 phút. Đ khôi ph c l i đ b o hòa oxy 100%, màng c đ nh enzym đ ớ c r a vài l n v i

ướ ự ử ệ ế ế ế ầ ừ ả PBS tr c khi ti n hành l n th nghi m ti p theo. S khu ch tán oxy t ệ không khí làm gi m hi u

ụ ấ ả ủ ử ự ệ ệ ề ể ắ ấ ớ ị qu c a qu trình th nghi m khi th c hi n v i enzym trong dung d ch, đ kh c ph c v n đ này

ườ ế ệ ế ị ả ứ ủ ng ử i ta ti n hành th nghi m trong thi ằ t b ph n ng kín khí b ng th y tinh (12mL).

ườ ệ ế ườ ọ ộ ồ ớ Ng i ta ti n hành thí nghi m trong ba tr ng h p v i các n ng đ MSG khác nhau:

ơ ấ ặ ủ ự ắ • : Không tái sinh c ch t trong s v ng m t c a 2mM NADPH và lOmM ammonium.

ơ ấ ặ ủ ự A :CÓ tái sinh c ch t trong s có m t c a 2mM NADPH

ơ ấ ự ♦ ặ ủ :CÓ tái sinh c ch t trong s có m t c a 2mM NADPH và lOmM ammonium.

~ ~

NADP

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ườ ế ố ư ồ ộ ủ ậ ấ ị i u n ng đ c a NADPH và ammonium và nh n th y giá tr đáp Ng ứ ự ổ i ta cũng đã ti n hành t ấ ị NADPH ủ ặ ườ ệ ồ ỉ ậ ố ổ ị ế ả ng cho s n đ nh cao nh t là 2mM NADPH và lOmM ammonium. ộ ụ Hình 2.3: Đ ng hi u ch nh v n t c tiêu th Oxy theo n ng đ MSG c a c p LGLODL ọ GLDH c đ nh trong c m bi n sinh h c

ả ứ 2.2.2.25.Quá trình ph n ng [20]

Lglutamate + H2O ^ ^"^»ảKetoglutarate + NH3 (1) ả ơ ấ ặ ủ ả ạ ộ ủ ồ ư cofactor c a LGLDH. 0.1mg/L là n ng đ gi ệ ủ ươ ể ả ứ Ph n ng (1) x y ra khi có m t c a MSG, quá trình tái sinh c ch t không x y ra khi không có ộ ớ ặ ủ m t c a NADPH, do NADPH ho t đ ng nh là i ạ h n có th phát hi n c a ph ng trình (1).

ạ ộ ặ ủ ớ ự ả V i s có m t c a 2mM NADPH và MSG thì c hai enzym cùng ho t đ ng và MSG đ ượ c

ả ứ ư tái sinh nh trong ph n ng (2).

ượ ả ứ ứ ể ấ ơ ổ MSG đ ấ ủ c chuy n đ i thành aketoglutarate trong ph n ng th nh t và là c ch t c a

ả ứ ử ệ ườ ả ứ ệ ạ ổ ph n ng th (2). Vi c b sung NADPH vào môi tr ề ng ph n ng t o đi u ki n cho L GLDH

ả ứ ự ệ ệ ậ ị ế ộ ự ế ạ ấ th c hi n ph n ng ngh ch. Vi c nh n bi t L glutamate cung c p m t s khu ch đ i và gi ớ ạ i h n

ệ ượ ơ ượ ự ệ ế ạ ị ậ ấ phát hi n đ c xác đ nh là 0.04mg/L. S khu ch đ i túi hi u cao h n đ ặ c nh n th y khi có m t

ộ ả ả ứ ụ ủ ệ ấ ạ ẩ ồ ộ ủ c a ammoniumm t s n ph m ph c a ph n ng (1) và giói h n n ng đ ph t hi n là 0.02mg/L.

Ổ ấ ệ ộ 2.2.2.2. . C u hình nhi t đ và pH [20]

ể ế ả ạ ộ ố ệ ả ị C m bi n có th ho t đ ng t t trong kho ng pH 410 (pH dung d ch đ m citrate

/>/

ủ ủ ượ ồ phosphate: 4, 5, 6; c a sodium phosphate: 7,8; c a glycineNaOH: 9, 10) đ c đo khi n ng

}

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ủ ớ ự ổ ặ ủ ị MSG là 1.2mg/L v i s c m t c a 2mM NADPH và lOmM ammonium. đ ộ c a dung d ch

ố ư ủ ả ế ố ư ủ ả pH t i u c a c m bi n là 7.0 i u c a GLDH kho ng 8.25 ở nhi t ệ đ ộ 25±2 °c, trong khi đó pH t

ố ư ủ ả và pH t i u c a GLOD kho ng 8.0

ạ ộ ể ế ả ố ả ệ ộ ượ C m bi n cũng có th ho t đ ng t t trong kho ng nhi ế t đ (13±2 đ n 55±2 °C) đ c đo

ồ ạ ộ ế ố ệ ộ ị ả ộ MSG là 1.2mg/L. C m bi n ho t đ ng t ấ t nh t t đ 25±2 ở n ng đ ở nhi ả °c, sau giá tr này c m

ạ ờ ế ị ị ấ bi n b m t ho t t ạ ính do b vô ho t b i nhi ệ ộ t đ .

ở ệ ộ ặ ớ ồ ộ nhi t đ 25 ±2 °c có m t 2mM NADPH và lOmM ammonium v i n ng đ Hình 2.4: pH

ộ MSG 1.2mg/L ớ ồ ệ ộ ở pH 7.0 v i n ng đ MSG 12mg/dL t đ Hình 2.5: Nhi

ị 2.22.21.Xác đ nh giá tr ị Km và Y max [20]

ư ặ ố ộ ị Giá tr ị Km xác đ nh cho c p LGLODLGLDH cũng gi ng nh cho m t mình L

ố ủ ồ ộ ơ ấ ầ ủ ậ ố ả ứ ộ GLOD. V n t c ban đ u c a ph n ng là hàm s c a n ng đ c ch t theo đ ng h c ọ ‘Michaelis

ượ ị ươ Menten’. Km và Vmax đ c xác đ nh theo ph ng pháp LineweaverBurk.

ể ế ượ ặ ủ ớ ự ị Giá tr ị Km bi u ki n đ c xác đ nh là 0.445 lmM v i s có m t c a 2mM NADPH và

ị ượ ề ệ lOmM ammonium. vmaxxảc đ nh đ c trong cùng đi u ki n trên là 3.07mg/(L.min).

ề ể ế ấ ơ ỉ Gi ệ ấ ị Km và Vmax bi u ki n trong đi u ki n không tái sinh c ch t (ch có LGLOD tr

ươ ủ ứ ờ ạ ự ạ ộ ho t đ ng) t ng ng là 1.9222mM và 13.245mg/(Lmin) so v i ớ Km c a LGLOD d ng t do là

ế ượ ử ụ ấ ỉ ặ 0.21 mM. Vì th , khi c p LGLODLGLDH đ c s d ng thì giá tr ị Km tăng x p x 2

~ ~

Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c

ỉ ử ụ ộ ầ ầ l n, kh s d ng chì m t mình LGLOD thì giá tr ị K,n tăng hom 9 l n. Giá tr ị Km cao hom

ượ ớ ơ ấ ỗ ể ự thu đ ỉ ố ị c kh c đ nh enzym là do ái l c c a ả ự ủ enzym v i c ch t gi m, cũng c th là do s căn tt ở

ạ ộ ổ ị trung tâm ho t đ ng c a ủ enzym trong quá trình c đ nh.

ự ổ ị ế ị ủ 2.2.2.2.8. S n đ nh c a màng c đ nh [20]

ự ổ ủ ị ượ ẫ S n đ nh c ã màng đ c ph n tích trong chu kì 60 ngày. Màng ch a ứ enzym đ cượ

ả ị ệ ộ ả b o qu n trong dung d ch đ m ệ phosphate 0.2M, pH 7.0, nhi t đ 4°c trong tui polypropylene km

ượ ộ ầ ự ệ ễ khí. Quá trình phân tich đ ứ ặ ớ c th c hi n m i 3 ngày m t l n v i 0.8mg/L MSG. Màng ch a c p

ẫ ứ ạ ầ ớ enzym LGLODLGLDH v n gi ữ ượ đ c 80% ho t tính ban đ u sau 30 ngày ng v i GLOD=

Ư ớ ự ệ ệ ủ Ư Ư ứ ớ 25U; GLDH= 35 và 39 ngày ng v i GLOD= 25 ; GLDH= 143.2 v i s hi n di n c a 2mM

ố ị ỉ ỗ NADPH và lOmM ammonium. Trong kh đ , màng chì c đ nh enzym L GLOD (25U) gi ữ ượ c đ

ầ ạ ậ 80% ho t tính ban đ u th m chí sau 48 ngày

ạ ổ ị ế ả ọ ờ A L ủ enzym c đ nh trên c m bi n sinh h c trong th i gian 60 ngày: ữ ộ ượ ấ ằ ườ ậ Hình 2.6: Ho t tính c a GLOD 25ULGLDH143 2U; m LGLOD 25ULGLĐH 35U; ÌLGLOD 25U Trong nh ng nghiên ứ ầ c u g n đây, ng i tã nh n th y r ng m t l ỏ ng nh GLDH

ượ ố ể ự ề ặ ạ không duy trì đ c ho t ạ tính c a ủ enzym, đi u này c th là s vô ho t ho c rò r ỉ enzym. Sự

ổ ạ ộ ủ ấ ả ỉ ị n đ nh c a ủ biosensor trong quá trình b o quăn cao nh t kh ho t đ c a GLDH là 143.2U và

Ư ủ c a GLOD là 25 .

Ả

Ệ

TÀI LI U THAM KH O

1.Wolfgang Aehale, Enzymes in Industry, Copyright © 2004 WILEYVCH Verlag GmbH & Co.KGa, Weinheim. 2.Parmjit s. Panesar, Shweta Kumari, and Reeba Panesar, Potential Applications of Immobilized pGalactosidase in Food Processing Industries, SAGEHindawi Access to Research, Enzyme Research, Volume 2010, Article ID 473137, 16 pages.

3.M.L. Foresti, M.L. Ferreha, Chito sanimmobilized lipases for the catalysis of fatty acid esterifications, Enzyme and Microbial

Technology 40 (2007) 769777.

4.Yin Hoon Chew, Lee Suan Chua, Kian Kai Cheng, Mohamad Roji Sarmidi, Ramlan Abdul Aziz, Chew Tin Lee, Kinetic study on

the hydrolysis of palm olein using immobilized lipase, Biochemical Engineering Journal 39 (2008) 516520.

5.K.N. Kilcawley, M.G. Wilkinson,P.F.Fox, Determination of key enzyme activities in commercial peptidase and lipase preparations

from microbial or animal sources, Enzyme and Microbial Technology 31 (2002) 310320.

6.G.D. Haki, S.K. Rakshit, Developments in industrially important thermostable enzymes: a review, Bioresource Technology 89

(2003) 1734.

7.V . Ramachandra Murty*, Jayadev Bhat, and P. K. A. Muniswaran , Hydrolysis of Oils by Using Immobilized Lipase Enzyme: A

Review, Biotechno 1. Bioprocess Eng. 2002, 7: 5766.

8.José M. Palomo, Gloria Munoz, Gloria FernandezLorente, Cesar Mateo, Roberto FernândezLaiuente*, José M. Guis nl,ấ

Interfacial adsorption of lipases on very hydrophobic support (octadecylSepabeads) immobilization, hyperactivation and

stabilization of the open form of lipases, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 1920 (2002) 279286.

9.S.W. Chang, J.F. Shaw, K.H. Yang, S.F. Chang, C.J. Shieh, Studies of optimum conditions for covalent immobilization of

Candida rugosa lipase on poly(cglutamic acid) by RSM, Bioresource Technology 99 (2008) 28002805. 10.Dasciana s. Rodrigues, Adriano A. Mendes, Wellington s. Adriano, Luciana R.B. Goncalves,Raquel. L.c. Giordano, Multipoint covalent immobilization of microbial Upas on chitosan and agarose activated by different methods, Journal of Molecular Catalysis B:

Enzymatic 51 (2008) 100109.

Do an m on hoc T?i li?u tham kh?o ?? ?n m ?n h?c

11. ệ ả Tài li u tham kh o

ll.Seema S.Betigeri, Steven H.Neau, Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads, Biomaterials

23 (2002) 36273636.

12.Keehoon Won, Sangbum Kim, KwangJe Kim, Hong Woo Park, SangJin Moon, Optimization of lipase entrapment in Ca

alginate gel beads, Process Biochemistry 40 (2005) 21492154.

13.Paramita Mahapatra, Annapurna Kumari, Vijay Kumar Garlapati, Rintu Banerjee, Ahindra Nag, Enzymatic synthesis offruit flavor

esters by immobilized lipase from Rhizopus oligosporus optimized with response surface methodology, Journal of Molecular Catalysis

B: Enzymatic.

14.Wiphum Kaewthong, Sarote Sirisansaneeyakul, Poonsuk Prasertsan, Aran HKittikun, Continuous production of

monoacylglycerols by glycerolysis of palm olein with immobilized lipase, Process Biochemistry 40 (2005) 15251530.

15.S.J. Prashanth, V.H. Mulimani, Soymilk oligosaccharide hydrolysis by Aspergillus oryzaegalactosidase immobilized in calcium

alginate, Process Biochemistry 40 (2005) 11991205.

16.S. Thippeswamy, V.H. Mulimani, Enzymic degradation of raffinose family oligosaccharides in soymilk by immobilized a

galactosidase from Gibberella fujikuroi, Process Biochemistry 38 (2002) 635/640.

17.Miguel Filho, Benevides C. Pessela, Cesar Mateo, Alfonso V. Carrascosa, Roberto FernandezLafuente, Jose M. Guis' an,

Immobilization—stabilization of an galactosidase from Thermus sp. strain T2 by covalent immobilization on highly activated

supports: Selection of the optimal immobilization strategy, Enzyme and Microbial Technology 42 (2008) 265271.

18.Saraju P.Mohanty and Elias Kougianos ,Biosensors: A tutorial review.

19.Jose " I. Reyes De Corcuera, Ralph P. Cavalieri, Biosensors, Washington State University, Pullman, Washington, U.S.A.

20.Anjan Kumar Basu, Parimal Chattopadhyay, Utpal Roychudhuri, Runu Chakraborty, Glutamate optical biosensor based on the

immobilization of glutamate dehydrogenase in titanium dioxide solgel matrix, , Department of Food Technology and Biochemical

Engineering, Jadavpur University, Kolkata 700032, India.

Đồ án môn học: Công nghệ cố định Enzym và ứng dụng

Chủ đề:

Ồ

Ọ

Đ ÁN MÔN H C

Ệ Ố Ị CÔNG NGH C Đ NH ENZYM

Ứ

Ụ

YÀ NG D NG

ụ

ư

ủ

ư

ấ

ạ

Flectrocliemical Paten t i met Flu óresceriee, reflection Piöi2TÖölöCtfiO

Ả

Ệ

TÀI LI U THAM KH O

Tài liệu liên quan

Tài liêu mới

Xác nhận đăng nhập

Đăng nhập từ tài khoản này?

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Hỗ trợ

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi