Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Sinh viên thực hiện:

TRẦN MINH HOÀNG

MSSV: 1211100082

Lớp: 12DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là hoàn toàn

trung thực, chưa từng được ai sử dụng để công bố trong bất kì công trình nào khác.

Các thông tin, tài liệu trích dẫn trong luận án đều đã được ghi rõ nguồn gốc.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Trần Minh Hoàng

iii

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

LỜI CẢM ƠN

Trong thực tế không có sự thành công nào mà không có sự giúp đỡ từ những người

khác. Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, đánh dấu kết thúc quãng thời gian học tập

ở Trường Đại học Công nghệ TP.HCM tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ gia

đình, thầy cô, bạn bè trong suốt bốn năm qua.

Trước hết xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã tạo

cơ hội cho tôi được học tập tại trường. Cám ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học

– Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức và tâm huyết trong quá

trình giảng dạy suốt những năm qua. Xin gửi lời cám ơn đến TS. Nguyễn Thị Hai đã

cung cấp chủng nấm Trichoderma harzianum T2; cô Đỗ Thị Tuyến đã cung cấp cơ

chất β-glucan và enzyme cellulase C20032; Ths. Nguyễn Thị Ngọc Yến đã cung cấp

bào tử nấm Linh chi. Cám ơn quý thầy cô phụ trách quản lý phòng thí nghiệm Công

nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tạo điều kiện làm việc cho tôi và nhóm

thực hiện đồ án. Đặc biệt xin chân thành cám ơn TS. Nguyễn Hoài Hương, người đã

tận tình hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt

nghiệp này, nếu không có sự giúp đỡ của cô chắc chắn đồ án tốt nghiệp của tôi gặp

rất nhiều thiếu sót.

Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã có những sự giúp đỡ,

động viên trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành đồ án tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cám ơn!

Sinh viên thực hiện

Trần Minh Hoàng

iv

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ x

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. vi

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................... 1

2. Tình hình nghiên cứu ......................................................................................... 2

3. Mục đích của đề tài ............................................................................................ 2

4. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................. 3

5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 3

6. Kết quả đạt được ban đầu .................................................................................. 3

7. Hạn chế của đề tài .............................................................................................. 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 4

1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi ............................................................................ 4

1.1.1 Phân loại ....................................................................................................... 4

1.1.1.1 Phân loại theo khoa học ...................................................................... 4

1.1.1.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc ................................................. 5

1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi ......................................................... 9

1.1.2.1 Cuống nấm .......................................................................................... 9

1.1.2.2 Mũ nấm ................................................................................................ 9

1.1.2.3 Thụ tầng ............................................................................................. 10

1.1.2.4 Bào tử nấm Linh chi .......................................................................... 10

1.1.3 Chu kì sống của nấm Linh chi .................................................................. 14

1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi ............................. 15

1.1.4.1 Dinh dưỡng ........................................................................................ 15

1.1.4.2 Nhiệt độ ............................................................................................. 15

1.1.4.3 Độ ẩm ................................................................................................ 15

1.1.4.5 Không khí........................................................................................... 15

v

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

1.1.4.6 Ánh sáng .............................................................................................. 16

1.1.4.7 Trị số pH .............................................................................................. 16

1.1.5 Thành phần dược tính của nấm Linh chi .................................................. 16

1.1.5.1 Thành phần dược tính tổng quát ....................................................... 16

1.1.5.2 Triterpenoid ....................................................................................... 17

1.1.5.3 Hợp chất saponin .............................................................................. 21

1.1.5.4 Những thành phần khác .................................................................... 22

1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi ................................................................... 22

1.1.6.1 Phòng ngừa ung thư .......................................................................... 22

1.1.6.2 Tăng cường khả năng miễn dịch ....................................................... 23

1.1.6.3 Khả năng chống oxy hóa ................................................................... 24

1.1.6.4 Điều trị bệnh đái tháo đường ............................................................ 24

1.1.7 Nghiên cứu về bào tử nấm Linh chi ......................................................... 24

1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma .................................................................. 27

1.2.1 Phân loại ..................................................................................................... 27

1.2.2 Lịch sử phát triển ....................................................................................... 27

1.2.3.1 Đặc điểm hình thái ............................................................................... 28

1.2.3.2 Đặc điểm sinh trưởng ........................................................................... 29

1.2.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma ...................................... 31

1.2.4 Các hệ enzyme nấm Trichoderma sinh tổng hợp ....................................... 31

1.2.4.1 Hệ enzyme chitinase ............................................................................ 31

1.2.4.2 Hệ enzyme β – glucanase ..................................................................... 33

1.2.4.3 Hệ enzyme cellulase ............................................................................ 34

1.2.4.4 Hệ enzyme protease ............................................................................. 35

1.3 Giới thiệu về enzyme phá vách tế bào ......................................................... 36

1.3.1 . Enzyme phá vách tế bào thực vật ............................................................ 37

1.3.2 Enzyme Cellulase C20032 ......................................................................... 41

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 44

vi

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

2.1 Vật liệu – Thiết bị - Hóa chất ........................................................................... 44

2.1.1 Vật liệu ..................................................................................................... 44

2.1.2 Nơi tiến hành ............................................................................................. 44

2.1.3 Thời gian thực hiện .................................................................................. 44

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 44

2.1.4.1 Thiết bị ................................................................................................. 44

2.1.4.2 Dụng cụ ................................................................................................ 45

2.1.5 Hóa chất – Môi trường sử dụng ............................................................... 45

2.1.5.1 Hóa chất .............................................................................................. 45

2.1.5.2 Môi trường sử dụng ............................................................................ 47

2.2 Phương pháp nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi ............................ 49

2.3 Phương pháp nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch nuôi cấy .................................................................................................................. 53

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum trên môi trường thạch PDA ..................................................................................................................... 54

2.3.2 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường lỏng ...................................................................................................................... 54

2.3.3 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn ....................................................................................................................... 54

Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme chitinase trong 2.4 dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và enzyme chế phẩm C20032 .... 56

2.4.1 Dựng đường chuẩn glucosamine ............................................................. 56

2.4.2 Xác định hoạt độ enzyme chitinase ở pH và nhiệt độ khác nhau .............. 56

2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme celullase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm enzyme C20032 ........................................ 57

2.5.1 Dựng đường chuẩn glucose ..................................................................... 57

2.5.2 Phản ứng xác định hoạt tính cellulase ..................................................... 58

2.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease dịch nuôi cấy và chế phầm C20032 bằng phương pháp Anson cải tiến ............................................................ 59

2.6.1 Dựng đường chuẩn tyrosine ..................................................................... 59

vii

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

2.6.2 Phản ứng xác định hoạt tính protease ..................................................... 60

Phương pháp xác định hoạt tính β-glucanase trong dịch nuôi cấy và chế phầm 2.7 C20032 ................................................................................................................... 60

2.7.1 Dựng đường chuẩn β-glucan ................................................................... 61

2.7.2 Phản ứng xác định hoạt tính β-glucanase ................................................ 61

Phương pháp xác định protein trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma 2.8 harzianum và chế phầm C20032 bằng phương pháp Bradford ............................. 62

2.8.1 Dựng đường chuẩn Albumin .................................................................... 62

2.8.2 Xác định hàm lượng protein trong mẫu ................................................... 62

2.9 Khảo sát phá vách bào tử nấm Linh chi bằng dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và enzyme chế phẩm C20032. ............................................................. 64

2.9.1 Phương pháp xác định tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032 ................................................... 64

2.9.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. ........ 65

2.9.3 Phương pháp xác định độ ẩm bào tử nấm Linh chi ................................... 67

2.9.4 Phương pháp thay đổi nồng độ của chế phẩm C20032 kết hợp với dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum ....................................................................... 68

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 70

3.1 Kết quả định tính enzyme chitinase, β-glucanase, protease trong chế phẩm C20032 10% và dịch nuôi cấy ............................................................................... 70

3.1.1 Kết quả định tính các enzyme trong chế phẩm C20032 10% .................... 70

3.1.2 Kết quả định tính enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường nuôi cấy lỏng .................................................................................... 71

3.1.3 Kết quả định tính enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường nuôi cấy rắn ..................................................................................... 72

3.2 Kết quả định lượng hoạt tính các enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum nuôi cấy môi trường lỏng và nuôi cấy môi trường rắn và chế phẩm C20032 10% ........................................................................................................... 73

3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032 ...................................................... 75

3.3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm

viii

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Trichoderma harzianum ở điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau. ....................... 75

3.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong chế phẩm C20032 10% ..................................................................................................................... 76

3.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi khi thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10% ................................................ 77

3.5 Kết quả tỉ lệ bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi thay đổi nồng độ chế phẩm C20032 kết hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum ............................... 81

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 85

4.1 Kết luận ........................................................................................................ 85

4.2 Kiến nghị ..................................................................................................... 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 87

PHỤ LỤC .................................................................................................................... 1

ix

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

PDA: Potato Dextrose Agar

EC: Enzyme cellulase C20032

DNC: Dịch nuôi cấy

G. lucidum: Ganoderma lucidum

T.harzianum: Trichoderma harzianum

T. hamatum: Trichoderma hamatum

T. polysporum: Trichoderma polysporum

T. viride: Trichoderma viride

T. reesei: Trichoderma reeisei

B.cinerea: Botrytis cinerea

T. hamatum: Trichoderma hamatum

T. virens: Trichoderma virens

BSA: Bovine serum albumin

DD: Dung dịch

TCA: Trichloacetic acid

FC: Folin – Ciocalteu

CMC: Sodium carboxymethyl cellulose

DNS: acid – 2 – hydroxyl – 3,5 – dinitrobenzoic

MT: Môi trường

ĐC: Đối chứng

TB: Trung bình

NT: nghiệm thức

x

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

DANH MỤC BẢNG

STT Bảng Nội dung Trang

1 1.1 11

Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác nhau

2 1.2 25

So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi (2,5mg/ml)

3 1.3 Một số loại enzyme thủy phân của T. harzianum 36

4 40 1.4 Một số enzyme thương mại và thành phần enzyme trong

chế phẩm

5 1.5 41

Thông tin chế phẩm enzyme cellulase C20032 của Novozyme

6 2.1 Bảng dựng đường chuẩn glucosamine 56

7 2.2 Lập đường chuẩn glucose 58

8 2.3 Các bước xác định hoạt tính enzyme cellulase (CMCase) 58

9 2.4 Bảng bổ sung hóa chất dựng đường chuẩn tyrosine 59

10 2.5 Các bước xác định hoạt tính enzyme protease 60

11 2.6 61

Lập đường chuẩn β-glucan để xác định hoạt tính enzyme β-glucanase

12 2.7 Các bước xác định hoạt tính enzyme β-glucanase 61

13 2.8 Dựng đường chuẩn albumin (protein theo Bradford) 62

14 2.9 65

Bảng bố trí sự thay đổi tỉ lệ enzyme DNC và chế phẩm C20032 10%

15 2.10 Bảng bố trí sự thay đổi nồng độ enzyme C20032 68

16 3.1 70

Vòng phân giải các enzyme có trong chế phẩm C20032 10%

17 3.2 72

Vòng phân giải các enzyme có trong DNC T. harzianum MT nuôi cấy lỏng

iv

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

18 3.3 73

Vòng phân giải các enzyme có trong DNC T. harzianum MT nuôi cấy rắn

19 3.4 74

Kết quả hoạt tính enzyme của DNC nấm T. harzianum và chế phẩm C20032 10%

20 3.5 75

Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase ở điều kiện nhiệt độ và pH thay đổi.

21 3.6 77

Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong chế phẩm C20032 10% điều kiện pH5

22 3.7 78

Bảng kết quả % bào tử linh chi bị phá vỡ khi thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa DNC và chế phẩm C20032 10%

23 3.8 79

Bảng hoạt tính enzyme/cơ chất (U/g) của các enzyme có mặt trong hỗn hợp dịch thí nghiệm

24 3.9 81

Bảng tổng hợp tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi khi thay đổi nồng độ chế phẩm C20032

25 82

3.10 Bảng hoạt tính enzyme/cơ chất (U/g) của các enzyme có mặt trong hỗn hợp dịch thí nghiệm có sự thay đổi nồng độ enzyme chế phẩm C20032

v

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

DANH MỤC HÌNH

STT Hình Nội dung Trang

1 1.1 Xích chi Ganoderma lucidum 5

2 1.2 Thanh chi Ganoderma genus 6

3 1.3 Bạch chi Fomitopsis officinalis 6

4 1.4 Hoàng chi Laetiporus sulphureus 7

5 1.5 Hắc chi Polyporus melanopus 7

6 1.6 Tử chi Ganoderma sinense 8

7 1.7 Phân loại linh chi theo màu sắc 8

8 1.8 13

Hình thái giải phẫu thể quả nấm linh chi Ganoderma lucidum

9 1.9 13

Các kiểu bào tử đảm đặc thù của họ Linh chi Ganodermataceae

10 1.10 Chu kì sống của nấm Linh chi 14

11 19 1.11 Cấu trúc không gian của 29 loại Triterpenoids trong bào

tử nấm Linh chi

12 1.12 29 Triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi 20

13 28 1.13 Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi

trường thạch dịch chiết khoai tây PDA

14 1.14 Sợi nấm và cuống bào tử của T. harzianum 29

15 1.15 Cấu trúc chitin 31

16 1.16 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase 32

17 1.17 Cấu tạo cellulose 34

18 38 1.18 Enzyme cellulolytic xâm nhập vách tế bào qua lỗ của

vách tế bào

19 42 1.19 Nhiệt độ hoạt động tốt nhất của enzyme C20032

Novozyme

vi

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

20 1.20 pH hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme 42

21 2.1 Buồng đếm hồng cầu Neubauer 66

22 3.1 74

Biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme trong dịch nuôi cấy T.harzianum MT nuôi cấy lỏng và MT nuôi cấy rắn

23 3.2 76

Biểu đồ khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm T. harzianum ở nhiệt độ và pH khác nhau

24 3.3 77

Biểu đồ khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có trong chế phẩm C20032 10% điều kiện pH5

25 78 3.4a Bào tử nấm Linh chi soi dưới kính hiển vi khi chưa bị

phá vỡ

26 78 3.4b Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ soi dưới kính hiển vi khi

thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp ở ngày thứ 4

27 3.5 79

Biểu đồ tỉ lệ % phá vỡ của bào tử nấm linh chi khi thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa DNC và chế phẩm C20032 10%

28 3.6 82

Biểu đồ tỉ lệ % phá vỡ của bào tử nấm linh chi khi thay đổi nồng độ chế phẩm C20032

29 3.7 83

Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi soi dưới kính hiển vi ngày thứ 7 (NT1: 1DNC: 1EC10%)

30 3.8 83

Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi soi dưới kính hiển vi ngày thứ 10 (NT1: 1DNC: 1EC10%)

vii

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

STT Sơ đồ Nội dung Trang

1 2.1 Sơ đồ thực hiện thí nghiệm 50

2 2.2 51

Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme chitinase từ DNC nấm T. harzianum T2

3 2.3 52

Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi bằng enzyme DNC nấm T. harzianum T2 kết hợp chế phẩm EC 20032

4 2.4 53

Sơ đồ nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch nuôi cấy

5 2.5 64

Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa DNC và chế phẩm C20032 10%

6 2.6 69

Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi nồng độ enzyme chế phẩm C20032 kết hợp với DNC nấm T. harzianum T2

7 4.1 86

Quy trình phá vỡ vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp enzyme

viii

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Trong y học cổ truyền phương Đông, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) là một loại

dược phẩm quý, nó được sử dụng như một loại thượng dược trong các bài thuốc để

điều trị một số căn bệnh cũng như bồi bổ sức khỏe. Tuy nhiên khi sử dụng nấm Linh

chi trong việc điều trị người ta chỉ chú trọng đến việc phối hợp các vị trong bài thuốc

và nấu chúng trong nhiều giờ để tách các hoạt chất mà không chú ý đến thành phần,

các biện pháp tách chiết các hoạt chất sao cho tối ưu. Bên cạnh đó, Tây y hiện đại

cho rằng thảo dược không được xem là một loại thuốc để chữa bệnh mà chỉ có thể

được xem như một loại thực phẩm chức năng và nấm Linh chi cũng được xếp vào

loại thảo dược thực phẩm chức năng. Ngày nay, nấm Linh chi được trồng khá phổ

biển ở một số quốc gia như Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam… cho nên

việc sử dụng nấm Linh chi như một loại thực phẩm chức năng giúp hỗ trợ sức khỏe,

tăng tuổi thọ, phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh ung bướu, tim mạch, huyết áp, tiểu

đường…

Trong hai thập kỉ qua, các phương pháp phân tích khoa học hiện đại đã cho phép xác

định được một số lượng lớn các hợp chất hóa học có trong quả thể, tơ và bào tử nấm

Linh chi như: triterpenoid, steroid, polysaccharide, saponin, chất khoáng, vitamin,

amino acid, phenol… Trong đó Triterpenoid, polysaccharide được xem là thành phần

chính có nhiều hoạt tính sinh học của nấm. Mặc dù có một lượng lớn các hoạt chất

sinh học được tìm ra trong nấm Linh chi nhưng việc phân tích, chiết xuất các hoạt

chất sinh học này đa số đuợc thực hiện trên quả thể và tơ nấm, có rất ít nghiên cứu

thực hiện việc trích ly các hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi bởi bào tử được cấu

tạo bởi lớp vách đôi rất bền vững nên làm giảm khả năng chiết xuất các chất. Do đó,

việc nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi là giai đoạn quan trọng cho quá trình

phân tích thành phần các chất có trong bào tử.

Để góp phần nghiên cứu việc chiết xuất hiệu quả các hoạt chất có trong bào tử nấm

Linh chi, tôi đã tiến hành nghiên cứu phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng

phương pháp sử dụng enzyme dịch nuôi cấy từ nấm Trichoderma harzianum T2 kết

1

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

hợp với enzyme thương mại Cellulase C20032 được trình bày trong đồ án tốt nghiệp

“NGHIÊN CỨU PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI”

2. Tình hình nghiên cứu

Các công trình nghiên cứu thành phần các hợp chất có trong nấm Linh chi được thực

hiện chủ yếu trên quả thể và tơ nấm. Hội nghị nấm học thế giới 7/1994 tại Vancouver

(Canada) đã dành riêng một hội thảo về Linh chi, kết quả đã đi đến quyết định thành

lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế đầu tiên về nấm Linh chi, đặt trụ sở tại New

York (Hoa Kỳ). Do vậy, vào tháng 10/1994 Hội nghị Quốc tế đầu tiên về nấm Linh

chi đã được tổ chức tại Bắc Kinh, Trung Quốc. Tại đây quan điểm về sự tồn tại độc

lập của họ Linh chi Ganodermataceae Donk với tầm quan trọng là các nấm làm thuốc

quý. Vào tháng 7/1996, Hội nghị Quốc tế về nấm học Châu á, lại dành một trong năm

Hội thảo cho các báo cáo về Linh chi tại đại học Chiba, Nhật Bản. Tại mỗi Hội nghị

số báo cáo rất lớn, thể hiện tầm quan trọng kinh tế và sự phong phú của nấm Linh

chi.

Vào thập niên 70 – 80, bắt đầu một trào lưu khảo cứu hóa dược học các nấm Linh

chi. Chủ yếu ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan và Việt Nam. Gần đây

một số phòng thí nghiệm ở Hoa Kỳ và vùng Đông Nam á cũng bắt đầu tham gia vào

tiến trình này. Năm 1988, Nhật Bản đã điều trị thành công bệnh nhược cơ bằng Linh

chi theo nguyên tắc điều hoà miễn dịch. Bệnh viện Sơn Đông, Trung Quốc dùng

“súp” Linh chi để giải độc và bổ gan có kết quả tốt, trong 70.000 ca trên 90% khỏi

bệnh (Lui Xing Jia, 1994). Tác giả cho rằng nấm Linh chi có tác dụng tốt đối với

đường tiết niệu, điều hoà rối loạn tuần hoàn não, tránh các cơn kịch phát nghẽn mạch

và làm dịu thần kinh,…

Năm 2010, Chaiyavat Chaiyasut, Chakkrapong Kruatama and Sasithorn Sirilun đã

công bố công trình nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi bằng quá trình lên men

vi khuẩn Lactobacillus plantarum và bào tử nấm Linh chi.

3. Mục đích của đề tài

Xây dựng quy trình phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi thu dịch chiết bào tử

2

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

4. Mục tiêu của đề tài

Xây dựng quy trình phá vỡ vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp kết hợp

enzyme chế phẩm thương mại và enzyme dịch nuôi cấy nấm mốc Trichoderma

harzianum kí sinh trên nấm linh chi.

5. Phương pháp nghiên cứu

Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm

Đề tài được xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và Statisticals Analysis

Systems (SAS)

6. Kết quả đạt được ban đầu

Tìm ra được phương pháp phá vách bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp kết hợp

chế phẩm thương mại và enzyme dịch nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum

Xác định được tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi trên một lượng nhất định.

7. Hạn chế của đề tài

Tỷ lệ bào tử phá vỡ còn thấp làm hạn chế việc định lượng hoạt chất trong dịch trích

ly sau phá vỡ cũng như hiệu suất trích ly hoạt chất.

3

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi

Nấm Linh chi hay còn gọi là Linh chi thảo, nấm trường thọ, nấm lim, thuốc thần tiên,

hạnh nhĩ... Cách đây khoảng 2000 năm, nấm Linh chi đã được ghi trong sách “Thần

nông bản thảo kinh”, tác phẩm chuyên tập hợp những kinh nghiệm về dược thực vật

từ đời Hán trở về trước . Xưa kia linh chi chỉ được khai thác trong thiên nhiên nên nó

là loại thuốc quý, hiếm và rất đắt tiền. Từ đầu thế kỷ 17, nấm Linh chi đã được nuôi

trồng ở Trung Quốc, chính bởi chính giá trị dược liệu cao của chúng. Ngay từ thời

Hoàng đế, trong các thư tịch cổ đã ghi chép về giá trị của Linh chi. Trong “Bản thảo

cương mục”, các ghi chép đã chuẩn mực hơn, và nấm Linh Chi ngày càng được coi

trọng. Cho nên, dễ hiểu là các nhà Đông y Việt Nam kế tục Lý Thời Trân, đã phát

hiện ra Linh Chi ở nước ta và như Lê Quý Đôn đã chỉ rõ đó là “nguồn sản vật quý

của đất rừng Đại Nam”.

1.1.1 Phân loại

1.1.1.1 Phân loại theo khoa học

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim

(Ganodermataceae). Tên tiếng Anh là Varnished conk hay lingzhi.

Vị trí phân loại của nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2010)

- Loài: Ganoderma lucidum

- Chi: Ganoderma

- Họ: Ganodermataceae

- Bộ: Ganodermatales

- Lớp phụ: Hymenomycetidae

- Lớp: Hymenomycetes

- Ngành phụ: Basidiomycotina

- Ngành: Nấm thật – Eumycota

- Giới: Nấm – Mycota hay Fungi

Theo trình định danh, có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này. Kể từ lần đặt tên

đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học Phần Lan xác

4

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

định tên chính thức Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst đã mất đến 100 năm

(1881).

1.1.1.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc

Trong bộ “Bản thảo cương mục” (in năm 1995) của Lý Thời Trân, đại danh y Trung

Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), với màu sắc

và tên gọi khác nhau: Thanh chi, Xích chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi, Tử chi.

Xích chi: Còn được gọi với những cái tên khác như Linh chi đỏ hay đơn chi, hồng

chi có vị đắng. Tên khoa học là Ganoderma lucidum. Xích chi giúp ích tâm khí, chủ

vị, tăng trí tuệ. Sử dụng linh chi đỏ để tăng cường trí nhớ, bổ trung, phòng tránh các

bệnh tim mạch và chữa trị tức ngực.

Hình 1.1 Xích chi – Ganoderma lucidum

Thanh chi: Linh chi xanh hay long chi có màu xanh, vị chua. Tên khoa học là

Ganoderma genus. Thanh chi giúp cho sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân

thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng và thoải mái.

5

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Hình 1.2 Thanh chi Ganoderma genus

Bạch chi: Linh chi trắng hay ngọc chi có màu trắng. Tên khoa học là Fomitopsis

officinalis. Bạch chi có vị cay tính bình không độc, ích phế khí, chữa ho nghịch hơi.

Hình 1.3 Bạch chi Fomitopsis officinalis

Hoàng chi: Linh chi vàng hay kim chi, có vị ngọt, màu vàng. Tên khoa học là

Laetiporus sulphureus. Linh chi vàng có tác dụng ích tì khí, trung hòa, an thần.

6

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Hình 1.4 Hoàng chi Laetiporus sulphureus

Hắc chi: Linh chi đen hay huyền chi có màu đen và vị mặn. Tên khoa học là

Polyporus melanopus. Hắc chi có tác dụng ích thận khí, khiến cho đầu óc sản khoái

và tinh tường.

Hình 1.5 Hắc chi Polyporus melanopus

Tử chi: Linh chi tím hay Mộc chi, màu tím có vị ngọt. Tên khoa học là Ganoderma

sinense. Tử chi có tác dụng bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươi đẹp.

7

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Hình 1.6 Tử chi – Ganoderma sinense

Gần đây khi đã tìm ra được phương pháp gây giống, những nhà khoa học Nhật Bản

chứng minh được rằng những cây nấm có màu sắc khác nhau không phải vì khác loại

mà chỉ vì môi trường và điều kiện sống khác nhau. Nếu thay đổi điều kiện người ta

có thể có được sáu loại từ cùng một giống.

Hình 1.7 Phân loại linh chi theo màu sắc

8

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Ngoài cách phân loại Linh chi theo màu sắc, người ta còn có thể phân loại linh chi

theo các đặc điểm như:

 Vị trí nấm mọc trên cơ chất chủ.

- Nhóm mọc cao: tai nấm mọc từ gốc lên đến ngọn cây.

- Nhóm mọc gần đất : nấm mọc từ gốc cây chủ.

- Nhóm mọc từ đất : tai nấm mọc từ rễ cây hoặc xác mùn.

 Nhiệt độ ra nấm.

- Nhóm nhiệt độ thấp: tai nấm mọc ở nhiệt độ 20oC – 23oC.

- Nhóm nhiệt độ trung bình: tai nấm mọc ở 24oC – 26oC.

- Nhóm nhiệt độ cao: tai nấm mọc ở 27oC – 30oC

Do đó, có thể thấy rằng Linh chi không những đa dạng về chủng loại mà còn đa dạng

về sinh thái, đây là loại nấm mang tính toàn cầu (Patouillard, N. 189). Linh chi thuộc

nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại, từ khi xác lập một chi riêng là Ganoderma

Karst (1981), đến nay tính ra có tới 2000 loài và phổ biến nhất là Ganoderma lucidum

có tới 45 loại.

Ở Việt Nam, loài chuẩn Linh chi Ganoderma lucidum mới được trồng thành công

trong phòng thí nghiệm năm 1978. Năm 1994 loài nấm lim – một chủng Linh chi đỏ

đặc sắc của các rừng cây Lim miền Bắc Việt Nam đã được Phạm Văn Thụ đưa vào

nuôi trồng chủ động.

1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi

Về hình thái ngoài, chúng cũng có ít nhiều sai khác

1.1.2.1 Cuống nấm

Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3cm, cuống nấm ít

phân nhánh, đôi khi uốn khúc. Lớp vỏ cuống màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen, bóng,

không có lông phủ trên mặt tán nấm.

1.1.2.2 Mũ nấm

Mũ nấm: khi non hình trứng, lớn dần hình quạt. Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi

khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia

9

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu – vàng cam – đỏ cam – đỏ nâu – nâu tím – nâu

đen, được bao phủ bởi sợi không vách ngăn ngang xếp sít nhau kiểu hàng rào và có

đầu sợi dầy thêm ra, đường kính đoạn sợi phình to ra 8 - 10μm. Chính những tế bào

vỏ này tạo nên lớp vỏ bền vững và bóng như vecni cho nấm. Lớp vỏ láng phủ suốt

theo cuống. Kích thước tán biến động từ 2 – 30cm, dày 0,8 – 2,5cm, cuống dài từ 2,5

– 3,5cm, tròn mập hoặc mảnh (đường kính từ 0,5 – 2,2cm). phần đính cuống hoặc gồ

lên hoặc lõm như lõm rốn. Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8cm màu vàng kem – nâu nhạt –

trắng. Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc cứng và nhẹ. Hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận

cùng lớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng

phủ trên mặt trên mũ và bao quanh cuống bởi sự hình thành các chất lacate tan mạnh

trong cồn. Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước đó mà nấm chịu được

mưa, nắng. Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào tử

1.1.2.3 Thụ tầng

Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ 0,2 – 1,7 cm,

gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng – vàng ánh xanh, khoảng 3 – 5 ống/mm.

Đảm đơn bào mang 4 đảm bào tử hình trứng – trứng cụt – hình chùy, không màu, dài

16 - 22μm. Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầm (germpose) phồng căng hay

lõm thụt vào mà thành.

1.1.2.4 Bào tử nấm Linh chi

Cũng như các loài nấm khác, nấm Linh chi khi trưởng thành sẽ sản sinh ra bào tử, tức

là hạt giống hữu ích cho đời sau. Bào tử đảm thường được mô tả có dạng trứng cụt.

Đôi khi có tác giả mô tả là dạng hình trứng có đầu chóp tròn – nhọn. Thực ra đó là

do chụp phủ lớp nảy mầm hoặc phồng căng, hoặc lõm thụt vào mà tạo thành. Mỗi

bào tử được bao phủ với hai lớp tường rất khó khăn gọi là sporoderm (FDA 1.8.1999),

màu vàng mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt

dầu, kích thước bào tử rất nhỏ dao động ít nhiều khoảng từ 5-6 x 8,5 – 12 μm. Vỏ bào

tử khá dày, cỡ 0,7 – 1,2 μm, có cấu trúc phức tạp. Bào tử nấm Linh chi có hai lớp vỏ

rất cứng, khó nảy mầm. Bào tử Linh chi có chứa các thành phần giống nấm Linh chi:

Polysacharide, triterpenoid, acid béo, acid amin, vitamin, các nguyên tố vi lượng, với

10

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

hàm lượng đậm đặc hơn Linh chi từ 7 – 20 lần (Nguyễn Thị Sáu, 2014). Cho đến nay,

hơn 150 triterpenoids đã được phát hiện. Do những tiến bộ gần đây trong quang phổ

hiện đại và kỹ thuật quang phổ, một loạt các triterpenoids được phân lập từ bào tử

của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược sĩ. Từ

năm 1988 các nhà khoa học đã phân lập được 29 triterpenoids bao gồm cả cấu trúc

và hoạt tính sinh học của chúng.

Bảng 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác

nhau (Lê Xuân Thám, 1996)

Nguồn Kích thước bào tử (µm) Vùng thu mẫu

1889 Patouuillard 10 – 12 x 6 – 8 Đông Dương

1939 Imazeki 9,5 – 11 x 5,5 – 7 Nhật Bản

1964 Teng 8,5 – 11,5 x 5 – 6,5 Trung Quốc

1972 Steyaert 8,5 – 10,8 – 13 x 5,5 – 8,5 Indonesia, Úc châu

1973Pegler et al 1976 9 – 13 x 6 – 8 Anh quốc

Ryvarden 7 – 12 x 6 – 8 Bắc Âu, Phi châu

1980 Ryvarden et al 7 – 12 x 6 – 8 Đông Phi châu

1981 Kiet 7,5 – 10 x 5 – 6,5 Bắc Việt Nam

1982 Bazzalo et al 9 – 13 x 5 – 7 Argentine

1986 Melo 8,2 – 11,5 – 13,5 x 6,3 – 7,5 – 8,1 Bồ Đào Nha

1986 Gibertson et al 9 – 12 x 5,5 – 8 Bắc Mỹ

1986 Adaskaveg et al 10 – 11,8 x 6,8 – 7,8 Bắc Mỹ

1987 Petersen 7 – 8 x 6 – 7,8 Bắc Âu

1989 Zhao 9 – 11 x 6 – 7 Trung Quốc

1990 Hseu 8,5 – 11,5 x 5 – 7 Đài Loan

1994 Thu 9 – 12 x 5 – 7 Hà Bắc, Việt Nam

1994 Tham et al 8 – 10,5 x 5 – 7 Lạng Sơn Việt Nam

1996 Tham 7,5 – 11,5 x 5,5 – 7 Đà Lạt Việt Nam

Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào tử

bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ rất

11

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

mịn. Tuy vậy số lượng bào tử linh chi rất ít. Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi sẽ chỉ

thu được 1 kg bào tử.

Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về cấu tạo

tinh vi của bào tử đảm thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật, Trung

Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt. Rõ ràng kiến tạo lỗ thủng trên bề

mặt lớp vỏ ngoài là phổ biến. Lỗ nảy mầm hình tròn, khá lớn, là đặc điểm quan trọng

phổ biến ở các loài Ganoderma (đường kính 3,2 – 4,2μm). Thuật ngữ “germpore” là

tương đương định nghĩa “aperture” do Erdtman đưa ra (1952) – là chỉ vùng mà tại đó

vỏ bào tử mỏng đi rất nhiều, nơi mầm sợi nấm nguyên thủy (hay mầm ống phấn trong

trường hợp của tiểu bào tử ở thực vật) nhú ra khi nảy mầm (germination). Trên lớp

vỏ ngoài thấy rõ các trụ chống – chính là khái niệm “gai chống” theo nhiều tác giả

khác. Đỉnh các trụ nổi gồ thành các mụn cóc – gò hạt. Các trụ chống chính là tầng cột

theo phân loại của G.Erdtman (1952) (columellae), các trụ đuợc nối với nhau bởi các

vách mỏng chống từ tầng nền tới tầng phủ, chúng tạo thành các xoang rỗng của lớp

ngoài, nhờ đó tạo khả năng bảo vệ cao cho vỏ bào tử.

Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường cản

quang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học. Cấu trúc của lớp vỏ

trong cho đến nay còn chưa được biết rõ. Cần lưu ý rằng: khái niệm “gai chống nhọn”

từ màng trong đâm sát màng ngoài của hầu hết các mô tả trước đây không chính xác.

Thực chất các gai hay chính các cột chống hầu như không nhọn, mà phình đầu thành

các u lồi – và chính các u lồi này đội lớp màng phủ trong suốt ngoài cùng (episporium,

exosporium hay chính là tầng phủ tectum), tạo thành các kiến trúc gò hạt – mụn cóc

– u nhú trên bề mặt vỏ bào tử. Điều này Heim (1962), Hansen (1958), Perreau (1973),

Mims et al (1989) đã từng phân tích và thảo luận nhiều.

12

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Hình 1.8 Hình thái giải phẫu thể quả nấm linh chi Ganoderma lucidum

Hình 1.9 Các kiểu bào tử đảm đặc thù của họ Linh chi Ganodermataceae

1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào tử).

2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử xẻ múi

ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma).

Bào tử nấm Linh chi chứa các vật liệu di truyền và các chất sinh học, nó có giá trị về

dược phẩm lớn hơn quả thể, tuy nhiên hoạt chất trong bào tử nấm khó thu nhận, cho

nên hầu hết các kết quả nghiên cứu về Linh chi được tiến hành bằng cách sử dụng

quả thể.

13

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

1.1.3 Chu kì sống của nấm Linh chi

Hình 1.10 Chu kì sống của nấm Linh chi

Bào tử đảm đơn bội, trong điều kiện thuận lợi, nảy mầm tạo nên hệ sợi sơ cấp (primary

hyphae) - trong thực nghiệm tỷ lệ nảy mầm khá thấp ở nhiệt độ 28oC – 30oC chỉ đạt

3 – 15%. Hệ sợi sơ cấp đơn nhân, đơn bội mau chóng phát triển phối hợp với nhau

tạo thành hệ sợi thứ cấp (tức hệ sợi song hạch), phát triển và phân nhánh rất mạnh

tràn ngập khắp giá thể.

Lúc này thường có hiện tượng hình thành bào tử vô tính màng dày - rất dày

(gasterospores – Chlamydospores), chúng dễ dàng rụng ra và khi gặp điều kiện phù

hợp sẽ nảy mầm cho ra hệ sợi song hạch tái sinh. Hệ sợi thứ cấp sẽ phát triển mạnh

đạt đến giai đoạn cộng bào tức là các vách ngăn được hòa tan. Tiếp đó là giai đoạn

sợi bện kết để chuẩn bị cho sự hình thành mầm móng thể quả (primordial). Đây chính

là giai đoạn phân hóa hệ sợi. Từ hệ sợi nguyên thủy hình thành các sợi cứng màng

dày, ít phân nhánh, bện kết lại thành các cấu trúc bó được cố kết bởi các sợi bện phân

nhánh rất mạnh. Từ đó hình thành các mầm nấm màu trắng mịn vươn dài thành các

trụ tròn mập. Phần đỉnh trụ bắt đầu xòe thành tán, trong lúc lớp vỏ láng đỏ cam xuất

hiện. Tán lớn dần hình thành bào tầng và bắt đầu phát tán bào tử đảm liên tục cho đến

khi nấm già sẫm màu, khô tóp và lụi dần trong 3 – 4 tháng.

Nấm Linh Chi có thể mọc trên cây gỗ (thường là thuộc bộ đậu Fabales) sống hay đã

chết. Quả thể gặp rộ vào mùa mưa (từ tháng 5 – tháng 11), có thể trên thân cây (cuống

thường ngắn), quanh gốc cây hoặc từ các rễ cây (khi ấy cuống thường dài và có thể

14

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

phân nhánh). Nấm thường mọc tốt dưới bóng rợp, ánh sáng khuếch tán nhẹ. Do có

lớp vỏ láng đỏ. Linh Chi có thể chịu nắng rọi – khi đó thường xuất hiện lớp phấn ánh

xanh tím, có thể chịu mưa liên tục. Ở những vùng thấp rõ ràng là ưu thế của các chủng

chịu nhiệt độ cao (28oC – 35oC) như ở vùng châu thổ sông Hồng và đồng bằng sông

Cửu Long (quanh TP. Hồ Chí Minh). Ở vùng núi đồi vĩ độ cao (>1000m) thường có

các chủng ôn hòa, thích hợp nhiệt độ thấp hơn (21oC – 26oC) – như vùng Đà lạt, Sapa,

Tam Đảo, Tây Nguyên…ở nước ta. Nếu theo các tư liệu cổ thì Linh Chi của vùng

rừng sâu, núi cao được coi là linh thiêng quí giá.

1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi

1.1.4.1 Dinh dưỡng

Nguồn carbon: nguồn carbon chủ yếu là đường glucose, saccharose, maltose, tinh

bột, pectin, lignin, cellulose, hemicelluloses, từ đó chúng tổng hợp năng lượng và tạo

thành các chất cần thiết.

Nguồn nitơ hữu cơ: protein, pepton, acid amin, ngoài ra có thể hấp thu urê, muối

amon, sulphate amon. Nitơ không được quá nhiều làm cho sợi nấm mọc nhiều khó

hình thành quả thể. Trong giai đoạn sinh trưởng sợi nấm, tỉ lệ C/N là 25/1. Giai đoạn

hình thành thể quả, tỉ lệ là 30/1 hoặc 40/1.

Nguyên tố vi lượng: Ca, P, Mg, K. nguồn vi lượng đó chỉ thêm trong quá trình nuôi

cấy giống mẹ, còn khi trồng thì chúng có trong nước và nông sản phẩm.

1.1.4.2 Nhiệt độ

Thích hợp nhất là 22 – 28oC. Khi nuôi cấy tầng sâu nhiệt độ thích hợp là 28oC không

thấp hơn 27oC. Thông thường nhiệt độ thích hợp cho Linh chi phát triển là 24 – 28oC.

Nhiệt độ không nên thay đổi lớn, nếu thay đổi nấm Linh chi khó phát triển thành tán

mà ở dạng sừng hươu, dạng đuôi gà.

1.1.4.3 Độ ẩm

Hàm lượng nước môi trường thường là 65% là vừa, quá nhiều hoặc quá ít sẽ ảnh

hưởng đến sự phát triển sợi nấm. Độ ẩm không khí nên giữ ở 85 – 95%, nuôi cấy

trong phòng cần giải quyết vấn đề về độ ẩm và thông thoáng gió.

1.1.4.5 Không khí

15

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Nấm Linh chi là loài hiếu khí vì vậy cần thông gió, giữ độ ẩm và nhiệt độ thích hợp.

Khi nuôi cấy nấm trong tầng lỏng cần lắc 100 – 150 vòng/phút. Lắc mạnh dễ làm sợi

nấm đứt đoạn.

1.1.4.6 Ánh sáng

Nấm Linh chi cần ánh sáng tán xạ. Sợi nấm nuôi trong điều kiện ánh sáng từ 500 –

1200 lux.

1.1.4.7 Trị số pH

pH của môi trường nuôi nấm Linh chi là 3 – 7,5, thích hợp nhất là 5 - 6. Trong môi

trường lỏng là 4,5 – 5. Trong vật liệu trồng nấm điều chỉnh pH từ 5,8 – 6.

1.1.5 Thành phần dược tính của nấm Linh chi

1.1.5.1 Thành phần dược tính tổng quát

Trong đề tài nghiên cứu năm 2005 của Nguyễn Minh Khang, thành phần dược tính

của nấm Linh Chi được phân như sau:

- Nước: 12 – 13%

- Cellulose 54 – 56%

- Lignin: 13 – 14%

- Hợp chất nitơ 1,6 – 2,1%

- Chất béo (kể cả dạng xà phòng hóa) : 1,9 – 2%

0,08 – 0,1% - Hợp chất phenol

0,11 – 0,16% - Hợp chất Sterol toàn phần

0,3 – 1,23% - Saponin toàn phần

Theo Wachtel - Galor et al. (2011) trong nấm linh chi tươi, nước là thành phần chủ

yếu chiếm 90% khối lượng. Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10 - 40%, chất béo

chiếm từ 2 - 8%, carbonhydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm lượng

tro chiếm 8 - 10% cùng một số loại vitamin và khoáng chất khác như kali, can-xi,

phốt pho, magne, selen, sắt, kẽm, trong đó đồng chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Borchers et

al. (1999)). Trong một nghiên cứu về những thành phần của nấm, Mau et al. (2001)

đã xác định được tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm linh chi gồm: tro (1,8%),

16

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

carbonhydrate (26 - 28%), chất béo thô (3 - 5%), chất xơ (59%) và protein (7 - 8%).

Hàm lượng của protein trong nấm linh chi khoảng 7- 8%, thấp hơn so với nhiều loại

nấm khác (Chang et al. (1996); Borchers et al. (1999)). Ngoài ra trong nấm còn chứa

các glycoprotein và các polysaccharide.

Bên cạnh đó, nấm linh chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính sinh học như

các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất của chúng.

Hoạt tính sinh học của nấm linh chi có được chủ yếu là do các polysaccharide,

peptidoglycan và các triterpen mang lại (Boh et al. (2007).

1.1.5.2 Triterpenoid

Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có cấu trúc hóa học dựa trên cơ sở các phân tử

isopren liên kết lại với nhau, công thức tổng quát (C5H8)n với n ≥ 2, tuy isopren là

dẫn xuất của terpenoid nhưng pharnesyl pyrophosphate mới là chất liệu cơ bản để

sinh tổng hợp terpenoid. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2010). Terpenoid có tác dụng

chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lượng chất béo.

Triterpene là một phân lớp của terpenoid được phân bố rộng rãi trong giới động vật,

thực vật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycosid. Cấu trúc hóa học của triterpen có thể

là mạch hở 3, 4, hoặc 5 vòng với 33 khung sườn cacbon chính (Jose D. Connolly et

al. (1991)). Khối lượng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc

hóa học phức tạp và có khả năng bị oxy hóa cao (Mahato et al. (1997)); Zhou et al.

(2007)).

Trong nấm linh chi, cấu trúc hóa học của triterpene có dạng lanostane, đây là chất

tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình

thành nên các squalene mạch vòng (Haralampidis et al. (2002)). Trong quá trình chiết

xuất triterpene, người ta thường sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol,

acetone, chloroform, ether hoặc là hỗn hợp của chúng. Dịch chiết sau đó sẽ được phân

tách bằng nhiều phương pháp khác nhau, có thể dùng HPLC thông thường hoặc

HPLC pha nghịch đảo (Chen et al. (1999); Su et al. (2001)). Những triterpene đầu

tiên được Kubota phân tách từ nấm linh chi là ganoderic acid A và B (Kubota et al.

(1982)). Kể từ khi đó, hơn 100 loại triterpene cùng với cấu hình của chúng đã được

17

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

tìm ra. Trong số đó, có hơn 50 loại là đặc trưng chỉ được tìm thấy trong nấm linh chi.

Đa số các triterpene là các ganoderic và lucidenic acid, nhưng cũng có một số loại

khác như là ganoderal, ganoderiol và ganodermic acid (Jiang et al. (2008)).

Nấm linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng góp phần tạo

nên vị đắng của nấm linh chi. Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức

khỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể. Tuy

nhiên, hàm lượng triterpene trong nấm linh chi lại không ổn định. Chúng phụ thuộc

rất nhiều vào giống, loài, nơi trồng, điều kiện canh tác cũng như phương pháp chế

biến, điều này đã được thể hiện trong một nghiên cứu của Chen và Su được tiến hành

vào năm 1999 và 2001 (Chen et al. (1999); Su et al. (2001)). Cho đến nay, hơn 150

triterpenoids đã được tìm thấy từ quả thể của nấm Linh chi đại diện cho năm lớp cấu

trúc chính. So với quả thể của nấm Linh chi, các nghiên cứu về bào tử của nấm Linh

chi mới bắt đầu từ năm 1988 (Hou CY et al. (1988)), cho đến nay đã có 29 loại

triterpenoids đã được tìm thấy trong bào tử này. Với những tiến bộ gần đây trong

quang phổ và trắc phổ kỹ thuật hiện đại, một loạt các triterpenoids được phân lập từ

các bào tử của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược

sĩ. Tất cả các triterpenoids trong các bào tử của nấm Linh chi có quá trình tổng hợp

tương tự nhau, cụ thể là con đường acid mevalonic (MVA) (Bingji Ma et al. (2011)).

Các Triterpenoids này được bắt đầu từ trans - squalene và sau đó đã được thay đổi

bởi quá trình oxy hóa, giảm, khử acid, tạo vòng, sắp xếp lại, tạo ra nhiều loại cấu hình

triterpenoids trong bào tử của nấm Linh chi.

Triterpenoids được cô lập từ bào tử Linh chi cho thấy khả năng kháng HIV-1 protease,

chống khối u, và các hoạt động chống bổ sung. Triterpenoids này là thành phần hoạt

chất chính của bào tử Linh chi và biểu thị cho các hoạt tính sinh học khác nhau được

sử dụng trong dược liệu.

18

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Hình 1.11 Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi

(Bingji Ma et al. (2011))

19

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Hình 1.12 – 29 Triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma et al. (2011))

 Triterpenoids được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi

Năm triterpenoids đã được cô lập từ phần trong ether - tan của bào tử của nấm Linh

chi và trên cơ sở tính chất hóa học và dữ liệu quang phổ, acid ganopsoreric A (1),

acid ganoderic B (2), acid ganoderic C1 (3), acid ganoderic E (4) và

20

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

ganodermanontriol (5) được xác định tương ứng (Bingji Ma et al. (2011)). Thí nghiệm

dược lý cho thấy acid ganopsoreric A có có hoạt tính GTP thấp đối với gan chuột bị

tổn thương bởi CCl4 và GaNI (Chen RY et al. (1993)). Hai triterpenoids pentacyclic

mới, có tên ganosporelactone A (6) và B (7) được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi,

có thể được bắt nguồn từ khung lanostane thông qua việc hình thành liên kết C18 và

C23 (Chen RY et al. (1991)). Hai triterpenes lanostane kiểu mới, lucidumol A (8) và

β - acid ganoderic (9), cùng với một lucidumol B (10) và bảy triterpenoids đã biết,

ganodermanondiol (11), ganoderiol F (12), acid ganoderic A (13), acid ganolucidic

A (14), và 2, 3, 5. Trong số các hợp chất cô lập, các hợp chất 5, 10, 11 và 14 cho thấy

khả năng kháng virus gây suy giảm miễn dịch (kháng HIV) - 1 protease hoạt động

đáng kể với giá trị IC50 với giá trị 20 - 90 mM (Min BS et al. (1998)).

Sáu triterpenes lanostane loại oxy hóa cao mới, được gọi là ganoderic acid γ (15),

acid ganoderic δ (16), acid ganoderic ε (17), acid ganoderic ξ (18), acid ganoderic η

(19), acid ganoderic θ (20), cùng với ganolucidic axit D (21) và axit ganoderic C2

(22) được phân lập từ các bào tử nấm. Các khả năng gây độc của các hợp chất 15-21

đã được thực hiện trong ống nghiệm chống Meth - A và LLC dòng tế bào ung thư

(Min BS et al. (1998)). Một terpenoid C27 oxy hóa cao mới, lucidenic axit SP1 (23),

được phân lập từ một phần CHCl3-tan của bào tử nấm Linh chi cùng với mười một

triterpenoids, acid ganoderic C6 (24), acid ganoderic G (25), và 2, 3, 5, 8, 9, 11, 12,

13, 14

1.1.5.3 Hợp chất saponin

Saponin là một nhóm chất trao đổi thứ cấp quan trọng trong thế giới thực vật. Tên gọi

của saponin bắt nguồn từ từ sapo trong tiếng latin, có nghĩa là xà phòng. Saponin có

tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt

của dung dịch và tạo nhiều bọt. Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng.

Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao, từ 200oC trở lên và có thể trên

300oC. Saponin bị tủa bởi chì acetate, hydroxide barium, sulphate amonium nên lợi

dụng chất này để cô lập saponin. Về phương diện hóa học, saponin được xác định

gồm các cấu trúc khác nhau: triterpenoids, glucosylated steroids steroidal alkaloids.

21

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Khả năng dược tính: trị long đờm, chữa ho, chất phụ gia cho một số vaccine, thông

tiểu, kháng viêm, chống khối u.

1.1.5.4 Những thành phần khác

Tiến hành phân tích thân nấm linh chi, người ta còn tìm thấy thành phần chất khoáng

như phospho, silicon, sulfur, kali, calcium và magnesium chiếm một tỉ lệ khá cao.

Bên cạnh đó còn có sắt, nhôm, kẽm, đồng, mangan và strontium với hàm lượng thấp

hơn. Ngoài ra còn có một số kim loại nặng như chì, cadmium và thủy ngân (Chen et

al. (1998)). Trong một nghiên cứu của Chiu được tiến hành vào năm 2000, khi phân

tích nấm linh chi hoang thuộc loài Ganoderma spp, ông đã xác định được trong hàm

lượng chất khoáng của loại nấm này có chứa 10,2% là kali, calcium và magnesium.

Cũng trong một nghiên cứu khác thì Falandysz đã không tìm thấy cadmium và thủy

ngân trong những mẫu nấm linh chi, nhưng hàm lượng selenium được xác định là 72

µg/g.

Trong thành phần của nấm linh chi (Ganoderma spp) có một chất cũng nhận được rất

nhiều sự quan tâm, đó là germanium. Đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5 trong các

chất khoáng (489 µg/g) có trong nấm linh chi. Chất này tồn tại rất ít ở các loại thực

vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhân sâm, lô hội và tỏi.

Mặc dù germanium không phải là thành phần thiết yếu, nhưng chỉ cần một liều lượng

thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch, kháng khối u, chống oxy

hóa và chống đột biến (Kolesnikova et al. (1997)).

Những hợp chất khác cũng được tìm thấy trong nấm linh chi đó là các loại enzyme

như metalloprotease (đây là loại enzyme có tác dụng trì hoãn quá trình đông máu).

Ngoài ra, ergosterol (provitamin D2), các nucleoside và các nucleotide (như

adenosine và guanosine) cũng đã được tìm thấy trong nấm linh chi, đây là những hợp

chất có tác dụng ức chế thuận nghịch α-glucosidase và SKG-3.

1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi

1.1.6.1 Phòng ngừa ung thư

Nấm linh chi được sử dụng phổ biến trong quá trình hỗ trợ điều trị ung thư nhằm giúp

tăng cường khả năng miễn dịch cho các bệnh nhân bên cạnh áp dụng những liệu pháp

22

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

chữa trị thông thường. Mặc dù hiện nay quá trình điều trị bệnh ung thư đã có những

tiến bộ nhất định thông qua việc chẩn đoán bệnh sớm cũng như những phương pháp

hoá trị hiện đại, tuy nhiên việc chữa dứt điểm các căn bệnh này vẫn còn gặp rất nhiều

khó khăn thử thách (theo WHO 2008). Trong quá trình tìm kiếm những phương pháp

điều trị và những tác nhân hoá trị mới, người ta đã tìm ra trong hàng trăm loài thực

vật, trong đó có cả nấm linh chi, những hoạt chất sinh học có khả năng ngăn chặn quá

trình hình thành khối u (Wasser et al. (1999); Borchers et al. (2008)). Trong nấm linh

chi có một lượng lớn những hợp chất hoá học có thể được chiết xuất từ thân nấm, sợi

nấm và bào tử. Trong đó, các polysaccharide và triterpene là 2 nhóm hợp chất chính

trong nấm linh chi có tác dụng ngăn ngừa ung thư và ngăn chặn quá trình hình thành

khối u. Một trong những tác dụng mới được tìm thấy của dịch chiết nấm linh chi là

có khả năng hỗ trợ điều trị cho các căn bệnh mãn tính, ví dụ như bệnh ung thư và

bệnh liên quan đến gan (Bao X et al. (2005)). Những thí nghiệm trên động vật đã cho

thấy hiệu quả đáng kể trong việc ức chế sự hình thành và di căn của các tế bào ung

thư. Tuy nhiên, việc tiến hành những thí nghiệm này trên cơ thể người vẫn còn hạn

chế.

1.1.6.2 Tăng cường khả năng miễn dịch

Những tác nhân giúp làm tăng khả năng hoạt động của hệ miễn dịch cũng có tác dụng

tăng cường sức khoẻ, qua đó giúp ngăn ngừa bệnh tật. Nhiều thành phần trong nấm

linh chi đã được chứng minh có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của

các tế bào lympho, các bạch cầu đơn nhân, các tế bào NK (natural killer cells) (Bao

et al. (2001); Cao et al. (2002)). Trong một nghiên cứu của Chang et al. (2009) được

tiến hành trên chuột BALB/c cho thấy dịch chiết nấm linh chi chứa nhiều

polysaccharide có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào

spleno và hoạt tính của các đại thực bào và các tế bào NK.

Trong một nghiên cứu khác của Wang et al. (1997), polysaccharide có trong nấm linh

chi có tác dụng làm tăng khả năng hoạt động của các tế bào lympho T và các đại thực

bào, bằng cách làm tăng hàm lượng IL- 1β, TNF-α và IL-6. Cũng trong một nghiên

cứu khác, quá trình ủ của các đại thực bào và các tế bào lympho T bằng các

23

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

polysaccharide đã cho thấy hàm lượng TNF- α và INF- γ tăng lên (Zhang et al.

(1999)).

1.1.6.3 Khả năng chống oxy hóa

Những hợp chất chống oxi hoá trong thực vật có tác dụng ngăn ngừa ung thư cũng

như những căn bệnh nan y khác (Collins et al. (2005); Benzie et al. (2009)). Những

hợp chất này có tác dụng bảo vệ các thành phần có trong màng tế bào chống lại những

tổn thương do quá trình oxy hoá gây nên, qua đó giúp làm giảm những nguy cơ gây

ra đột biến và ung thư cũng như góp phần bảo vệ các tế bào miễn dịch. Những hợp

chất có trong nấm linh chi chủ yếu là các polysaccharide và các triterpene cũng có

tác dụng chống lại quá trình oxy hoá tế bào (Lee et al. (2001); Lin et al. (2002); Shi

et al. (2002); Wachtel-Galor et al. (2005))

1.1.6.4 Điều trị bệnh đái tháo đường

Những thành phần của nấm linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hạ đường

huyết đối với động vật. Các ganoderan A và B là hai polysaccharide được chiết tách

từ thân nấm linh chi, sau khi được tiêm cho chuột bị tiểu đường với liều lượng 100

mg/kg, cho thấy hàm lượng glucose trong máu giảm và tác dụng hạ đường huyết vẫn

tiếp tục kéo dài suốt 24 giờ (Hikiko et al. (1985)). Cũng trong một thí nghiệm trên

chuột, ganoderan B có tác dụng làm tăng lượng insulin, qua đó làm giảm hàm lượng

glucose trong máu và điều chỉnh quá trình tổng hợp glucose dưới tác dụng của các

enzyme có sẵn trong gan (Hikiko et al. (1989)). Trong một nghiên cứu khác cũng

được tiến hành trên chuột, người ta đã chứng minh được rằng một polysaccharide

khác có trong nấm linh chi được gọi là ganoderan C cũng có tác dụng hạ đường huyết

(Hikiko et al. (1989)).

1.1.7 Nghiên cứu về bào tử nấm Linh chi

Trong các nghiên cứu gần đây, bào tử của nấm Linh chi chứa một số hoạt chất sinh

học phong phú hơn nhiều so với trong quả thể của chúng (Chaiyavat Chaiyasut et al,

2010). Tuy nhiên, với bào tử của nấm Linh chi được cấu tạo phức tạp với 2 lớp vách

rất cứng và bền vững, hai lớp vách này có thành phần gồm silica (19,01%), canxi

(19,01%) và chitin (52,08 - 57,64%) (Jungjing et al, 2007.) nên đã làm hạn chế rất

24

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

nhiều khả năng thu nhận các hoạt chất sinh học này.

Daniel Sliva, Ph.D. et al., 2003 đã tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung

thư vú trên chuột với các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi như: bào tử còn

nguyên, bào tử bị phá vỡ, bột quả thể, dịch chiết của quả thể và bào tử với các nguồn

cung cấp khác nhau và đã thu được kết quả như bảng 1.1.2

Bảng 1.2: So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái

khác nhau của nấm Linh chi (2.5mg/mL)

Tên Nguồn gốc Thành phần Khả năng ức

chế tế bào ung

thư

Trung Quốc Bào tử còn nguyên 89.3% a Zihang

Trung Quốc Bào tử phá vỡ 71.9% b Zhongke

Trung Quốc Bào tử còn nguyên 9.5% c Jilin

d Trung Quốc Bột quả thể 54.3% Two Urn

e Đài Loan Bột quả thể 86.5% Double Crane

Mỹ Dịch chiết quả thể 99% f ReishiMax

và bào tử

Từ những nhận định và kết quả thí nghiệm nêu trên cho ta thấy việc phá vỡ bào tử

nấm Linh chi nhằm tăng khả năng dược liệu của nó cần được quan tâm. Trong những

năm gần đây đã có nhiều sáng chế tiết lộ phương pháp phá vỡ vách bào tử nấm Linh

chi. Ví dụ: patent JP52041208 tiết lộ quá trình chiết xuất các thành phần sinh học của

bào tử bằng phương pháp sử dụng biện pháp cơ học, JP2240026A tiết lộ việc sử dụng

các dung môi để phá vỡ, CN1165032 tiết lộ phương pháp phá vỡ bằng cách sử dụng

enzyme hòa tan như lysozyme, cellulose và hemicellulase, lạnh đông và dùng sóng

25

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

siêu âm. Hay theo patent CN 101596220 A của Trung Quốc, bào tử nấm Linh chi

được phá vỡ bằng một số phương pháp sinh học như: sử dụng enzyme hòa tan để thủy

phân vách bào tử hay sử dụng một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy lớp vách

này nhằm tăng cường hiệu quả sử dụng các hoạt chất sinh học có trong bào tử mà chi

phí thấp và hiệu quả tương đối cao. Cũng theo patent này ngoài biện pháp sinh học

để phá hủy lớp vách của bào tử, còn có thể sử dụng một số biện pháp hóa học như

dùng dung dịch có tính acid hay kiềm để làm bào mòn lớp vách, tuy nhiên, với phương

pháp hóa học này sẽ làm ảnh hưởng đáng kể khả năng hoạt động của các hoạt chất

sinh học có trong bào tử và dư lượng của các loại hóa chất dùng cho quá trình phá

vách bào tử có thể làm ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như sức khỏe. Ngoài ra,

một số biện pháp vật lý: sóng siêu âm, vi sóng, nhiệt độ thấp, lạnh đông… cũng được

sử dụng nhưng nhìn chung khả năng làm suy yếu lớp vách của bào tử còn thấp và chi

phí đầu tư cao.

Trong một nghiên cứu khác của Chaiyavat Chaiyasut, Chakkrapong Kruatama and

Sasithorn Sirilun năm 2010 ở Thái Lan, bào tử của nấm Linh chi được phá vỡ bằng

cách lên men với Lactobacillus plantarum với kỹ thuật rất đơn giản, ít chi phí. Nó có

thể được sử dụng để sản xuất các loại thực phẩm lên men với các lợi ích từ bào tử

nấm Linh chi và vi khuẩn lên men lactic. Trong đồ án này, tôi đã thực hiện phá vỡ

bằng phương pháp lạnh đông bào tử nấm Linh chi kết hợp sử dụng enzyme dịch nuôi

cấy từ nấm Trichoderma harzianum T2 là nấm mốc kí sinh trên nấm Linh chi cùng

với chế phẩm enzyme Cellulase C32002 của Novozyme để phá vách bào tử nấm Linh

chi.

26

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma

Trichoderma là chi nấm khá phổ biến trong tự nhiên, tuy nhiên hệ thống phân loại

của chúng chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều ý kiến khác nhau đưa ra khi

phân loại giống nấm này. Trichoderma là một chi nấm hiện diện trong đất, chúng

phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (gỗ, các loài nấm khác…), nhiều loài

trong chi này có khả năng sống cộng sinh với cây. Có thể nói Trichoderma là một

trong số những loài vi nấm được nuôi cấy thông dụng nhất. Chúng được tìm thấy ở

khắp nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Nấm Trichoderma phổ biến ở những

khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, chúng hiện diện trên rễ cây, trong đất hay

xác sinh vật đã chết, xác bã hữu cơ hay kí sinh trên các loài nấm khác. Mỗi dòng nấm

Trichoderma khác nhau sẽ yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Harman, 2000).

1.2.1 Phân loại

- Giới (Kingdom): Nấm (Fungi)

- Ngành (Phylum): Nấm túi (Ascomycota)

- Lớp (Class): Sordariomycetes

- Phân lớp (Subclass): Hypocreomycetidae

- Bộ (Order): Hypocreales

- Họ (Family): Hypocreaceae

- Chi (Genus): Trichoderma

- Loài (Species) : Trichoderma spp.

1.2.2 Lịch sử phát triển

Chủng nấm Trichoderma được phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm 1794, vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả được 3 loài:

1- Trichoderma caesium Pers. (1794).

2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794).

3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794).

Cho đến năm 1801, Persoon và Gray đã mô tả chi tiết được 7 loài nấm Trichoderma

đó là:

27

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

1- Trichoderma caesium Pers. (1794).

2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794).

3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794).

4- Trichoderma aureum Pers. (1796).

5- Trichoderma laeve Pers. (1796).

6- Trichoderma dubium Pers. (1801).

7- Trichoderma fuliginoides Pers. (1801).

Trong suốt 2 thế kỷ tiếp theo đến năm 1999 các nhà khoa học trên thế giới đã

phát hiện thêm khoảng 90 loài. Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện thêm

khoảng 50 loài mới. Cho đến năm 2013, đã có trên 150 loài nấm Trichoderma

được mô tả.

1.2.3 Đặc điểm chung của Trichoderma

1.2.3.1 Đặc điểm hình thái

Hình 1.13 – Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trường thạch dịch

chiết khoai tây (PDA)

Chủng nấm Trichoderma spp. thuộc nhóm nấm bất toàn (là những nấm sinh sản vô

tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành

28

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử), có khuẩn lạc màu lục khi tăng trưởng

có sự hiện diện của ánh sáng mặt trời. Sợi nấm của Trichoderma phân nhánh mạnh,

thường hình thành ở dạng gần như vòng tròn đồng tâm. Các sợi nấm thường mọc tạo

góc với trục chính khoảng 90 độ.

Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh

phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu

và liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy.

Hình 1.14 – Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum

Bào tử của nấm Trichoderma mịn, trơn láng có màu xanh lá cây hoặc màu vàng. Bào

tử của hầu hết các loài có hình elip, 3-5 x 2-4 µm (L/W=1.3), bào tử hình cầu

(L/W<1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài.

1.2.3.2 Đặc điểm sinh trưởng

Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp nguồn

carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là

monosaccharide, disaccharide, polysaccharide… NH3 là nguồn đạm mà nấm

Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên thường có mặt trong môi trường nuôi cấy loài nấm

này, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường có nhiều dinh

dưỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng

29

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

của Trichoderma. Nhưng muối NaCl sẽ làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của

một số loài Trichoderma, do đó trong môi trường nuôi cấy không nên có sự có mặt

của NaCl. Nồng độ CO2 cũng ảnh hưởng phần nào đến sự sinh trưởng của

Trichoderma. Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300C, có một vài loài

Trichoderma tăng trưởng được ở 350C. Một số ít phát triển tốt ở 400C (Samuels,

2000). Trichoderma phát triển tốt ở đất có độ pH từ 3,5 - 7,0 nhưng không thể phát

triển trong điều kiện pH < 3,5, phát triển tốt ở pH trung tính. Các chủng Trichoderma

có tốc độ tăng trưởng nhanh, đường kính khuẩn lạc đạt trung bình 2 cm – 9 cm sau 4

ngày nuôi cấy (Bùi Xuân Đồng, 1982).

Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau.

Ví dụ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong

môi trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum thích

hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí hậu ấm

áp.

Phần lớn các loài Trichoderma có tính cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều kiện môi

trường tự nhiên và nhân tạo dưới điều kiện tối sáng lẫn lộn hay bào tử xuất hiện trong

điều kiện sáng. Bào tử trên môi trường thạch agar dưới ánh sáng 85 Lux trong 20 -

30 giây sẽ làm tăng hiệu quả nẩy mầm. Đối với thể bào tử phialiconidio cảm ứng với

ánh sáng nhất, chúng sẽ xuất hiện nhiều dưới ánh sáng ban ngày trong khoảng 3 phút

hoặc dưới tia cực tím ở 10 - 30 giây. Một số tác giả đã công bố Trichoderma hình

thành bào tử nhiều nhất ở bước sóng từ 380 nm - 440 nm, và không hình thành bào

tử ở bước sóng dưới 254 nm và trên 1100 nm. Các bào tử cảm quang bị hạn chế phát

triển dưới sự có mặt của các hóa chất như: azaguanine, 5-fluorouracil, actiomycin D,

Cycloheximide, phenethyl alcohol và ethidum bromide,… các hóa chất này sẽ ngăn

chặn sự hình thành của các hậu mô bào tử, đây là một cấu trúc rất đặc biệt, có tiềm

năng trong phòng trừ sinh học. T. hamatum, T. hazianum, T. viride và T. virens ở

trong cả môi trường lỏng và rắn có acide thích hợp cho sự nảy mầm bào tử hơn là

môi trường trung tính.

30

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

1.2.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma

Weidling là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma.

Weidling và Emerson đã phân lập được chất độc kết tinh từ sản phẩm trao đổi chất

của Trichoderma, đó là: gliotoxin (C13H14N2S2O4).

Chất độc thứ hai do Brian và Mc. Growan công bố là virindin (C9H16O6), được sản

xuất từ T. viride. Dennis và Webstre ghi nhận Trichoderma spp. còn sinh tổng hợp

một sản phẩm trao đổi chất khác gliotoxin và virindin, đó là kháng sinh: trichlorofore

từ T. viride và T. polysporum, kháng sinh peptide từ T. harzianum.

Bên cạnh sản phẩm trao đổi chất là chất độc và kháng sinh, Trichoderma còn sinh

tổng hợp được một số các enzyme có hoạt tính sinh học mạnh như: exo và

endoglucanase, cellobiose và chitinase.

1.2.4 Các hệ enzyme nấm Trichoderma sinh tổng hợp

Trichoderma spp. có thể sinh tổng hợp đuộc nhiều loại enzyme ngoại bào như

chitinase, glucanase, xylase, lipase, pectinase, cellulase, protease… để phân hủy

nguồn xác bã thực vật và vách tế bào nấm bệnh trong đời sống hoại sinh và ký sinh

của chúng. Sau đây là một số hệ enzyme điển hình

1.2.4.1 Hệ enzyme chitinase

Chitin là polysaccharide có nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia trong hầu hết cấu

trúc polymer ở nấm và côn trùng, có công thức hóa học [C8H13NO5]n

Hình 1.15 – Cấu trúc chitin

Chitin có cấu tạo và chức năng gần giống với cellulose, trong tự nhiên chitin là chất

hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng, chitin thay thế một phần hay toàn bộ

cellulose trong thành tế bào của một số loài thực vật.

31

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Chitin là chất rắn vô định hình, không tan trong nước và hầu hết các acid, cồn, dung

môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm

đặc) hoặc bằng enzyme vi sinh vật.

Chitinase là enzyme thủy giải chitin, chitinase xúc tác cắt liên kết C1 và C4 của 2 đơn

vị β – 1,4 – N – acetyl glucosamine (GlcNac). Hệ enzyme chitinase được phân làm 3

lớp (Sahai và Manocha, (1993))

1. Chitobiosidase: enzyme này giải phóng đơn vị diacetyl chitobiose

2. Endochitinase: phân cắt liên kết bên trong cấu trúc chitin ở vị trí bất kì, phóng

thích các loại đường đa như chitotetraose, chitotriose, diacetyl chitobiose.

Endochitinase có vai trò quan trọng trong quá trình ký sinh nấm.

3. β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase phân cắt chitotetraose, chitotriose,

diacetylchitobiose thành GlcNac monomer

Glucosamin là sản phẩm phân giải cuối cùng, glucosamine là một đường khử có nhóm

amin tự do nên vừa có đặc tính của hexo monosaccharide vừa mang đặc tính của

nhóm amino.

Hình 1.16 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase

32

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Người ta đã tinh chế được rất nhiều chitinase, trong đó phổ biến nhất là endochitinase

có kích thước 42 kDa, sau đó là N – acetyl – β – D – glucosaminidase có kích thước

70 – 73 kDa. Ngoài ra còn có endochitinase 37 kDa và 33 kDa (Cruz et al, (1992)),

chitobiosidase 40 kDa, enzyme này có thể hoạt động một mình hoặc kết hợp với

enzyme endochitinase 42 kDa (Harman et al, (1993)), exochitinase 28 kDa (Deane et

al,(1998)) và β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase 102 kDa có vai trò duy nhất trong

việc gây biểu hiện các enzyme thủy phân chitin khác nhưng chưa tinh chế được

(Harman et al, (1995)).

Chitinase ở Trichoderma spp. được xem là enzyme có hoạt tính thủy phân mạnh, hoạt

động thủy phân của chitinase cũng kết hợp với các enzyme khác như β – glucanase,

sự phối hợp giữa hai enzyme này làm tăng hiệu quả hoạt động thủy phân. Mặt khác,

theo báo cáo của Lorito (1994) cho biết, có sự phối hợp tác động lên màng tế bào

giữa enzyme thủy phân chitin với các hợp chất tự nhiên cũng như chất tổng hợp.

1.2.4.2 Hệ enzyme β – glucanase

β – glucan trong vách tế bào nấm thường ở dạng β – 1,3 – glucan và nhánh là dạng

β– 1,6 – glucan. β – glucanase cũng là một enzyme quan trọng của Trichoderma spp.

trong đời sống hoại sinh và ký sinh nấm, gồm 2 lớp enzyme chính: β-1,3-glucanase

và β-1,6-glucanase

 β-1,3– glucanase: enzyme phân cắt liên kết o – glycosidic của β-1,3– glucan nhờ

2 cơ chế

1. Exo-β-1,3– glucanase phân cắt giải phóng glucose ở cuối chuỗi liên kết

polymer

2. Endo-β-1,3– glucanase cắt liên kết β ở vị trí bất kì trong chuỗi polysaccharide,

giải phóng oligosaccharide.

Trichoderma spp. phân giải β-1,3– glucan thường kết hợp giữa 2 hoạt tính exo và

endo- β-1,3– glucanase, β-1,3– glucanase có vai trò chính trong quá trình hoại sinh

và ký sinh nấm, ngoài ra β-1,3– glucanase giúp thực vật chống lại mầm bệnh.

Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo vách tế bào của các loài nấm khác nhau,

Trichoderma spp. tiết β– glucanase ở các mức độ khác nhau. Lorito năm 1994 đã tách

33

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

chiết in vitro được một endo - β-1,3– glucanase 78 kDa có khả năng ức chế sự nảy

mầm bào tử B.cinerea khi phối hợp với một GlcNAcase.

Ở một số chủng khác như T. harzianum T – 24, El-Katatny (2001) đã tách chiết được

một endo- β-1,3– glucanase có kích thước tương tự, có khả năng ức chế sự phát triển

của Sclerotium rolfsii khi kết hợp với một endochitinase 43 kDa. Lorito (1995) đã tạo

dòng gen của β-1,6– endoglucanase kích thước 43 kDa, có thể ức chế sự phát triển

của nhiều nấm bệnh khi phối hợp với các enzyme thủy phân khác.

 β-1,6– glucanase: trong điều kiện đặc biệt, Trichoderma spp. tiết β-1,6– glucanase,

enzyme này phân cắt liên kết β-1,6– glucan trong vách tế bào nấm.

1.2.4.3 Hệ enzyme cellulase

Hình 1.17 Cấu tạo cellulose

Cellulose là chất trùng hợp với tiểu đơn vị là D – glucose nối nhau bởi liên kết β –

1,4 – glycosidic, cellulose được sử dụng như một nguồn năng lượng carbon ở rất

nhiều vi sinh vật tiết ra cellulase.

Hệ enzyme cellulase ở Trichoderma spp. được phân thành 3 lớp:

1. Exo β-1,4-D-glucanase (cellobiohydrolase) hay C1 giải phóng đơn vị

cellobiosyl từ chuỗi cellulose

2. Endo β-1,4-D-glucanase hay Cx phân cắt liên kết glucosidic bên trong cấu trúc

cellulose.

3. β-1,4-D- glucosidase phân cắt cello – oligosaccharide thành glucose khử.

Quá trình thủy phân cellulose có sự phối hợp của ít nhất là hai enzyme

cellobiohydrolase, hai enzyme endoglucanase và một enzyme β-glucosidase (Hui et

34

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

al, (2001)). T reesei RUT C30 được biết là chủng có khả năng tạo nhiều cellulase, T.

harzianum T3 cũng là một chủng rất hiệu quả trong việc tạo ra nhiều loại cellulase.

1.2.4.4 Hệ enzyme protease

Theo Delgado và Janara (2000) khi khảo sát trên T. harzianum đã xác định nhiều loại

protease khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường, trong môi trường có pH thấp

và bổ sung chitin, glucose, amon… T. harzianum tiết protease acid làm tác nhân điều

hòa, đáp ứng nhu cầu phân hủy những protein ngoại bào như chitinase, glucanase,

cellulase. Ngược lại protease có tính base hoặc trung tính được T. harzianum sinh ra

trong môi trường có nguồn carbon khó bị phân hủy như vách tế bào nấm.

Theo Haab (1990) đã tách chiết được một protease acid 42 kDa không nhạy cảm với

pepsatin có liên quan đến sự giảm sút enzyme cellulase từ T.reesei QM 9414 trong

điều kiện tạo cellulase. Một nghiên cứu khác của Dunaevesky và cộng sự (2000) đã

tách chiết được một protease 73 kDa thuộc nhóm protease serin khi nuôi cấy T.

harzianum. Protease của Trichoderma spp. có tác dụng thủy phân protein vốn là một

phần của bộ khung vách tế bào.

35

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Bảng 1.3 Một số loại enzyme thủy phân của Trichoderma harzianum

Hoạt tính Giống

et al

et al

al et

73 73 64-69 28 52 42 44 42 42 40 37 36 33 31

N- acetylglucosaminidase N- acetylglucosaminidase Endochitinase Endochitinase Chitobiosidase Endochitinase Endochitinase Endochitinase Endochitinase TM T25-1 T25-1, P1a T189 TM, TY IMI206040a CECT 2413 Gv2908 O1a P1a CECT 2413 109 TM CECT 2413 TM, TY

78 74 36 17 43 110 75 β-1,3-endoglucanase β-1,3-endoglucanase β-1,3-endoglucanase β-1,6-endoglucanase β-1,3-exoglucanase β-1,3-exoglucanase P1a, CECT 2413 T24 39.1 CECT 2413 CECT 2413 T – Y

Gen Chitinase exc2 excl/nagl - - ech42 chit42 cht42 ThEn42 - - chit36 chit33 - - - - Glucanase bgn13.1 - - - b16-2 lam1.3 - Tài liệu tham khảo Haran et al (1995) Draborg (1995) Peterbauer et al (1996) Deane et al (1998) Haran et al (1995) Carsolio (1994) Garcia et al (1994) Back et al (1990) Lorito et al (1998) Harman (1993) Cruz et al (1992) Viterbo et al (2001) Haran et al (1995) Cruz et al (1992) El Katatny et al (2001) Lorito et al (1998) Lora et al (1995) Cohen – Kupiec et al (1999)

1.3 Giới thiệu về enzyme phá vách tế bào

Enzyme là protein trong tế bào, chúng được hình thành bởi các chuỗi đặc biệt của các

axit amin mà kết hợp với nhau trong hình dạng khác nhau để làm các công việc đặc

biệt như phá vỡ tạo thành đường và các phân tử chất béo, giải phóng hợp chất cao

36

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

phân tử bên trong tế bào hoặc làm ra nhiều enzyme hơn. Các enzyme khác nhau có

chức năng riêng, việc ứng dụng chức năng của từng loại enzyme có ý nghĩa lớn trong

nghiên cứu sinh học. Ngay trong các tế bào vi khuẩn nhỏ nhất có thể có khoảng 1000

loại enzyme làm việc. Việc nghiên cứu ứng dụng các enzyme này có ý nghĩa thực

tiễn với sự phát triển của khoa học đời sống, ứng dụng vào nhiều mặt kinh tế xã hội.

Hiện nay trên thị trường Việt Nam có nhiều loại chế phẩm enzyme thương mại ứng

dụng trên nhiều lĩnh vực. Ngành công nghiệp enzyme rất cần thiết cho các ngành

công nghệ thực phẩm, nước giải khát, trong phân tích y học và trong công nghiệp,

ngày nay chúng được thêm vào bột giặt để tăng hiệu quả giặt tẩy… Chế phẩm enzyme

thương mại thường được tổng hợp bởi thực vật, động vật, vi sinh vật hoặc nuôi cấy

mô động, thực vật nhưng hiện nay đa số các enzyme thường được tổng hợp nhờ quá

trình lên men vi sinh vật ở quy mô công nghiệp nhờ giá thành rẻ, hoạt tính cao, chu

kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, có thể dễ dàng điều khiển sinh tổng hợp enzyme

theo chiều hướng có lợi theo nhu cầu vì vi vật có khả năng cảm ứng với môi trường

nuôi cấy rất nhanh.

1.3.1 . Enzyme phá vách tế bào thực vật

Vách tế bào thực vật được cấu tạo bởi vách cellulose bao phủ bề mặt màng nguyên

sinh chất và không bào, bảo vệ các thành phần bên trong của tế bào. Hệ thống vách

tế bào có mối tương quan sinh lý chặt chẽ tạo ra một hệ thống thẩm thấu có hiệu lực,

vách tế bào dày lên đảm bảo cho sự cứng rắn, thực hiện được chức năng năng nâng

đỡ. Ngoài ra vách tế bào còn giữ vai trò trong một số hoạt động hấp thu, thoát hơi

nước, di chuyển và tiết. Trong quá trình hình thành vách, có nhiều thành phần hóa

học khác nhau tham gia cấu tạo nên vách tế bào, những thành phần đó là cơ chất

không định hình (matrix) có nhiều trong màng sơ cấp như pectin, hemicellulose làm

chất xây dựng bộ khung sườn của vách, những chất này sắp xếp trong mạng tinh thể

có dạng sợi. Cellulose là chất cơ sở chủ yếu để cấu trúc nên bộ khung sườn nằm trong

cơ chất của vách. Vì vậy, đối với một số enzyme phá vách tế bào thực vật, cellulose

đóng vai trò là cơ chất của quá trình thủy phân phá vách.

37

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Enzyme cellulolytic phân hủy cellulose, polymer cellulose chính là thành phần quan

trọng của màng tế bào thực vật. Nhiều vi khuẩn sản xuất phức hợp enzyme cellulolytic

gọi là cellulosomes, các enzyme cellulolytic được nấm tiết ra được gọi là cellulase.

Hình 1.18 Enzyme cellulolytic xâm nhập vách tế bào qua lỗ của vách tế bào

Dựa vào nghiên cứu của Ding và cộng sự (2013) sử dụng kính hiển vi nanomette vi

mô cho thấy các enzyme phá vách tế bào từ nấm và vi khuẩn xâm nhập vào vách tế

bào qua cấu trúc lỗ của vách, các enzyme này sử dụng cơ chất cellulose biến đổi thành

đường. Nhờ các enzyme ứng dụng tiềm năng này làm cơ sở cho sản xuất các sản

phẩm giá trị cao như ethanol hay axit hữu cơ từ các nguồn cellulose tái tạo rẻ tiền.

Những tiến bộ nhanh chóng trong nghiên cứu cellulosomes đang cung cấp thông tin

38

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

cơ bản cho sự phát triển nghiên cứu của cả in vitro và in vivo một cách hệ thống để

nghiên cứu về các phương pháp phá vách tế bào ứng dụng trong công nghiệp.

Trên thị trường Việt Nam, để phá vách tế bào chỉ có các chế phẩm enzyme cellulase

công nghiệp có nguồn gốc từ Aspergillus spp. hoặc từ Trichoderma spp. Ứng dụng

của các chế phẩm này thường được dùng để sản xuất ethanol công nghiệp hoặc axit

hữu cơ công nghiệp.

Mặc dù một số lượng lớn các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase, tuy nhiên

vi sinh vật của chủng Trichoderma và Aspergillus được sử dụng nhiều trong sản xuất

công nghiệp bởi hoạt tính mạnh chi phí sản xuất thấp, hiệu quả thu hồi cao. Một số

hãng sản xuất cũng đã ứng dụng hai chủng nấm trên để sản xuất enzyme thương mại

cung cấp cho thị trường.

39

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Bảng 1.4 Một số enzyme thương mại và thành phần enzyme trong chế phẩm

Tên enzyme Chủng vi sinh vật Enzyme hoạt động Hãng sản xuất

Sigma Poole UK Cellulase

Lysing Enzyme Trichoderma harzianum Cat No L2265 Protease

Chitinase

β-glucanase InterSpex

Lysing Enzyme Trichoderma harzianum Foster City USA Cellulase

Cat No 0412 - 1 Protease

Chitinase

Kitalase Rhizoctonia solani β-glucanase ICN FLOW

Protease

High Wycombe UK Pectinase

Cat No 153527 Amylase

ICN FLOW Cellulase

Lysing Enzyme Trichoderma harzianum Protease

High Wycombe UK Xylanase

Cat No 152338 Chitinase

Glucanex Trichoderma spp β-glucanase Nordisk

Novo Ferment Ltd

Neumatt CH

Cat No 367 - 5106

Các enzyme cellulase thương mại được áp dụng để tăng chất lượng sản phẩm thực

phẩm và thức ăn gia súc. Các nguyên liệu thực phẩm có nguồn gốc thực vật nếu được

gia công bằng chế phẩm cellulase sẽ mềm ra, làm tăng hệ số đồng hóa và chất lượng

sản phẩm được tăng lên. Enzyme cellulase thương mại cũng làm tăng hiệu suất trích

40

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

ly các chất khác nhau từ nguyên liệu thực vật như trà, cà phê, đậu nành… Enzyme

cũng làm thủy phân các nguyên liệu gỗ, phế liệu gỗ cho công nghiệp sản xuất giấy,

ethanol…

1.3.2 Enzyme Cellulase C20032

Chế phẩm enzyme cellulase C20032 là sản phẩm thương mại của Novo Nordisk. Sản

phẩm ngoài enzyme cellulase là chủ yếu còn có hệ enzyme chitinase, protease, β-

glucanase. Hệ enzyme của C20032 được coi là phù hợp để nghiên cứu phá vách bào

tử nấm Linh chi bởi hệ enzyme trong chế phẩm nhìn chung có thể đáp ứng được khả

năng phá cấu trúc vách chitin đôi của bào tử đảm nấm Linh chi.

Bảng 1.5 Thông tin chế phẩm enzyme cellulase C20032 của Novozyme

Chế phẩm Nhiệt độ tối ưu pH tối ưu Tính năng, ưu điểm

C20032 45oC – 50oC 5 – 5,5

Cải thiện quá trình thủy phân cellulose khi kết hợp với CTec2.

Hỗ trợ trong trường hợp tiền xử lý acid nhẹ hoặc kiềm.

Chuyển đổi hemicellulose để đường lên men

Hiệu quả ở nồng độ chất rắn cao.

Tương thích với nhiều nguyên liệu

Nồng độ cao và ổn định

Nguồn: Novozymes products – Novo Nordisk

41

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Hình 1.19 Nhiệt độ hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme

Nguồn: Novozymes products – Novo Nordisk

Hình 1.20. pH hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme

Nguồn: Novozymes products – Novo Nordisk

42

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Việc sử dụng enzyme cellulase C20032 của Novozyme vào ứng dụng phá vách tế

bào bào tử nấm linh chi phụ thuộc nhiều vào hệ enzyme tìm thấy trong chế phẩm.

Ngoài cellulase, các enzyme trong chế phẩm nghiên cứu còn cho thấy có sự xuất

hiện của β-glucanase, protease, chitinase.

43

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu – Thiết bị - Hóa chất

2.1.1 Vật liệu

 Mẫu thí nghiệm

- Bào tử nấm Linh chi được thu thập từ các trại nấm trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh

được cung cấp bởi Th.S Nguyễn Thị Ngọc Yến. Rây bào tử để loại bỏ một số tạp

- Giống nấm Trichoderma harzianum T2 được phân lập từ nấm Linh chi trong đồ

chất. Sấy ở nhiệt độ 40oC. Bảo quản trong điều kiện khô ráo.

án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh Hiếu (10DSH), nhận từ phòng thí nghiệm công

nghệ sinh học trường ĐH Công Nghệ Tp. HCM, cơ sở 1, 475A Điện Biên Phủ, P. 25,

Q.Bình Thạnh, Tp.HCM.

2.1.2 Nơi tiến hành

Thí nghiệm được thực hiện tại trung tâm thí nghiệm công nghệ sinh học trường ĐH

Công nghệ TP. HCM, cơ sở 475A, Điện Biên Phủ, P.25, Q. Bình Thạnh, TP.HCM

2.1.3 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ 10/03/2016 đến 15/06/2016

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ

2.1.4.1 Thiết bị

- Tủ cấy vi sinh

- Tủ lạnh

- Kính hiển vi quang học

- Autoclave

- Máy ly tâm

- Máy đo pH

- Cân phân tích

- Cân điện tử

- Bếp từ

- Máy nước cất

- Bể điều nhiệt

44

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

- Máy lắc

- Máy đo quang phổ UV

2.1.4.2 Dụng cụ

- Erlen 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml, 2000ml

- Cốc thủy tinh 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml

- Cốc sứ

- Ống đong 50ml, 100ml

- Đĩa peti

- Pipette thủy tinh 5ml, 10ml

- Micropipette 100µl, 1000µl – đầu tuýp tương ứng

- Ống ly tâm 50ml

- Ống nghiệm

- Đũa thủy tinh

- Bông thấm nước, bông không thấm nước

- Bao nylon hấp, giấy báo, dây thun

2.1.5 Hóa chất – Môi trường sử dụng

2.1.5.1 Hóa chất

- Dầu soi kính hiển vi

- Tween 80

- β – glucan (30% w/w)

- Thuốc thử Lugol

+ Iodine 1g

+ KI 2g

+ Nước cất 300 ml

Hòa tan rồi giữ trong lọ tối màu

- Bovine serum albumin (BSA) 0,1 mg/ml: Cân chính xác 10 mg albumin pha

trong 100 ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 20oC. Khi dùng pha loãng 100

lần, được dung dịch albumin có nồng độ 0,1 mg/ml.

- Dung dịch thuốc thử Bradford:

45

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

+Coomassie Brilliant Blue G – 250: 0,01g

+ Ethanol tuyệt đối 4,7g

+ Acid phosphoric 85%: 8,5g

Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai

đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.

- HCl 0,2N

- Đệm phosphate pH 7 (0,05M)

- Dung dịch casein 1%: hòa tan 1g casein vào 90 ml dung dịch đệm phosphate

0,05M. Đun tan casein, sau đó điều chỉnh pH bằng HCl 1N hoặc NaOH tới

pH=7. Chuyển sang bình định mức 100ml và bổ sung dung dịch đệm

phosphate tới vạch

- Na2CO3 6%: hòa tan 6g Na2CO3 trong nước cất, định mức tới 100ml

- Dung dịch Trichloacetic acid (TCA) 5%: Hòa tan 5g TCA trong nước cất, định

mức tới 100ml, lắc đều

- Dung dịch tyrosine 1mM (1µmol/ml): cân 181,19 mg/ml tyrosine tinh khiết

hòa tan trong dung dịch HCl 0,2N và chuyển sang bình định mức 100ml, định

mức tới vạch ta thu được dung dịch gốc 10mM. Khi sử dụng pha loãng dung

dịch gốc 10 lần bằng HCl 0,2N được dung dịch tyrosine 1mM

- Thuốc thử Folin – Ciocalteu (gọi tắt là FC): pha loãng 5 lần bằng nước cất: 1

thể tích FC gốc + 4 thể tích H2O)

- Đệm Natri acetate 0,05M

- Dung dịch Sodium carboxymethyl cellulose (CMC) 1% w/v CMC: cân chính

xác 10g CMC, hòa tan trong đệm Natri acetate 0,05M

- Dung dịch acid – 2 – hydroxyl – 3,5 – dinitrobenzoic (DNS): cân 20g DNS

cho vào beaker 2000 ml, thêm khoảng 800 ml nước cất. Đặt beaker vào chậu

nước 80oC khuấy đều; hòa tan 32g NaOH với 300 ml nước cất, thêm dung dịch

NaOH này từ từ vào dung dịch DNS, khuấy nhiệt ở 80oC. Tiếp tục thêm 600g

potassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy.

Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung dịch vào bình

46

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

định mức 2000 ml, thêm nước cất đến vạch lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS

trong chai tối màu.

- Dung dịch lactose: hòa tan 0.12g lactose monohydrate với 80 ml nước cất,

chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch lắc đều.

- Dung dịch DNS – lactose: trộn đều 150ml DNS với 50ml dung dịch lactose.

- Dịch cơ chất β – D – glucan 1%: cân chính xác 3,334g β – D – glucan hòa

trong 50 ml đệm Natri acetate 0,05M pH5, chuyển vào bình định mức 100ml,

bổ sung đệm đến vạch.

- Dung dịch Mononatri orthophosphate 0,2M: hòa tan 27,8g NaH2PO4 và định

mức đến 1000 ml.

- Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M: hòa tan 53,05g Na2HPO4.7H2O và

định mức đến 1000 ml

- Dung dịch acid acetic 0,2M: hòa tan 11,55 ml CH3COOH đặc và định mức

đến 1000 ml

- Dung dịch Natri acetate 0,2M: cân 16,4g CH3COONa hòa tan bằng nước cất

và định mức đến 1000 ml

- Dung dịch đệm pH7: hút 39,0 ml dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M

trộn với 61,0 ml dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M rồi định mức đến

200ml

- Dung dịch đệm pH6: hút 87,7 ml dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M

trộn với 12,3 ml dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M rồi định mức đến

200ml

- Dung dịch đệm pH5: hút 14,8 ml dung dịch acid acetic 0,2M trộn với 35,2 ml

dung dịch natri acetate 0,2M rồi định mức đến 100ml

- Dung dịch đệm pH4: hút 41,0 ml dung dịch acid acetic 0,2M trộn với 9,0 ml

dung dịch natri acetate 0,2M rồi định mức đến 100ml

2.1.5.2 Môi trường sử dụng

 Môi trường PDA

D-Glucose 4g

47

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Agar 4g

Dịch chiết khoai tây 200ml

Cloramphenicol 0.005g

pH: 6-7

Chuẩn bị dịch chiết khoai tây: cân 200g khoai tây được cắt hạt lựu, cho vào

cốc 2 lít, đong nước cất tới 1000ml rồi đun sôi hỗn hợp trên bếp từ. Đun sôi khoảng

10 phút rồi đem lọc lấy dịch trong.

 Môi trường tăng sinh lỏng nấm Trichoderma harzianum

- Glucose 1g

0,5 g - NH4NO3

0,5 g - MgSO4.7H2O

0,7 g - K2HPO4

0,3 g - KH2PO4

0,01 g - FeSO4.7H2O

0,001 g - ZnSO4

- Cloramphenicol 0,005 g

- Bổ sung dịch chitin huyền phù 1% đến 1 lít.

pH: 6 – 7

 Môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma harzianum

- Nấm linh chi nghiền 20g

- Malt 5g

- Dung dịch khoáng 10ml

- Cao nấm men 0,5g

- Chitin huyền phù 0,25g

- Nước bổ sung 40ml

- Độ ẩm 70%, pH5

 Pha dung dịch khoáng

0,5g + NH4NO3

0,2g + KH2PO4

48

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

+ NaCl 0,1g

0,1g + MgSO4.7H2O

Hòa tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml

 Môi trường chitin – agar 1%

Đong 100ml dịch huyền phù chitin 1% vào bình môi trường Ducan bổ sung 2g agar,

sau đó hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút, để nguội đến khoảng 50oC tiến hành đổ đĩa,

mỗi đĩa khoảng 20ml môi trường.

 Môi trường casein – agar 1%

Đong 100ml dịch casein 1% vào bình môi trường bổ sung 2g agar, sau đó hấp tiệt

trùng ở 121oC/15 phút, để nguội đến khoảng 50oC tiến hành đổ đĩa, mỗi đĩa khoảng

20ml môi trường.

 Môi trường β-glucan agar 1%

Đong 100ml dịch β-glucan 1% vào bình môi trường bổ sung 4g agar, sau đó hấp tiệt

trùng ở 121oC/15 phút, để nguội đến khoảng 50oC tiến hành đổ đĩa, mỗi đĩa khoảng

20ml môi trường.

2.2 Phương pháp nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

49

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ thực hiện thí nghiệm

Cellulase

Chitinase

Chế phẩm thương mại β-glucanase

Đo đường kính vòng phân giải Protease

Cellulase

Nuôi cấy chìm Chitinase

Nuôi cấy Trichoderma harzianum β-glucanase Sàng lọc hoạt tính enzyme để áp dụng phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi

Đo đường kính vòng phân giải Protease Nuôi cấy rắn

Xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme

Xác định tỉ lệ phối hợp enzyme chế phẩm và dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum để phá vách bào tử Linh chi

Xác định tỉ lệ phá vỡ bằng phương pháp đếm hồng cầu tế bào

Xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi khi thay đổi nồng độ của enzyme chế phẩm + dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum Xác định tỉ lệ phá vỡ bằng phương pháp đếm hồng cầu tế bào

50

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Sơ đồ 2.2 – Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme

chitinase từ dịch nuôi cấy nấm Trichoderma hazianum T2

Enzyme

pH4

pH5

pH4

pH5

pH4

pH5

pH4

pH5

pH4

pH5

pH6

pH7

pH6

pH7

pH7

pH7

pH6

pH6

pH6

pH7

70oC 30oC 40oC 60oC 50oC

Hoạt tính (U/ml)

Nhiệt độ tối ưu pH tối ưu

51

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Sơ đồ 2.3 – Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi bằng

enzyme dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 kết hợp chế phẩm enzyme

C20032

1g bào tử nấm linh chi

20ml nước cất

Lạnh đông 12 tiếng ở -4oC

Rã đông ở nhiệt độ phòng

Nước Ly tâm 4000 vòng/phút/20 phút

Thu bào tử, phối vào mỗi ống nghiệm 0,1g bào tử Ngâm bào tử trong DNC và EC 10% ở 50oC, pH5 theo các tỉ lệ

1 DNC 1DNC : 1 EC 10% 2 DNC: 1 EC10% 1DNC : 2 EC10% 1 EC 10% Đếm hồng cầu tế bào ngày 2,3,4

Đếm hồng cầu tế bào ngày 4,7,10 1DNC : 1EC 0.5% 1DNC : 1EC 1% 1DNC : 1EC 0.1% 1DNC : 1EC 5% 1DNC : 1EC 10%

52

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

2.3 Phương pháp nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch nuôi

cấy

Sơ đồ 2.4 – Sơ đồ nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch nuôi

cấy

Giống gốc

Nhân giống

Tăng sinh Tăng sinh MT rắn, 3 ngày Tăng sinh MT lỏng

Nước cất Tỉ lệ nước cất : cơ chất 10:1 Lắc 150 vòng/phút, 3 ngày Trích ly (lắc 150 vòng/phút, 24 giờ)

Tơ nấm

Lọc Lọc Bã

Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút Ly tâm 4000 vòng/ phút, 10 phút Cặn

Dịch nuôi cấy Dịch nuôi cấy

53

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum trên môi trường thạch PDA

Chuẩn bị môi trường PDA như mục 2.1.5.2 cho vào bình môi trường Ducan 200ml

rồi đem hấp khử trùng ở 1210C/1 atm/15 phút. Hấp xong, để môi trường hạ xuống

khoảng 500C rồi tiến hành đổ đĩa. Đợi thạch đông lại, tiến hành cấy điểm Trichoderma

harzianum T2 từ ống giống được phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh

Hiếu năm 2014 trường ĐH Công nghệ TP. HCM, rồi lật úp đĩa (tránh tụ nước trên bề

mặt thạch) đem ủ ở 28-320C. Sau 7 ngày nuôi nấm trên môi trường PDA chuyển sang

môi trường tăng sinh khối thu dịch enzyme nuôi cấy theo sơ đồ 2.3

2.3.2 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường lỏng

Chuẩn bị môi trường tăng sinh lỏng nấm Trichoderma hazianum như mục 2.1.5.2

phối vào erlen 1000ml 250 ml môi trường tăng sinh lỏng có huyền phù chitin 1%,

hấp tiệt trùng ở 1210C/15 phút. Để nguội khoảng 300C rồi cấy bào tử nấm

Trichoderma harzianum T2 đã nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA. Sau đó lắc 150

vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày nuôi cấy, lọc bỏ tơ nấm, đem ly tâm 4000

vòng/ phút trong 10 phút thu dịch tăng sinh loại bỏ cặn là sinh khối tơ nấm còn sót

lại.

 Phương pháp làm huyền phù chitin 1% (De-hui Dai et al, 2010): cân chính xác

5g bột chitin vào 1 bình erlen 500 ml, thêm từ từ 100 ml HCl 11M, khuấy trong 1

tiếng, ủ qua đêm ở 4oC. Sau đó, thêm vào erlen 500 ml ethanol 96% lạnh (khoảng

4oC), khuấy đều, ủ qua đêm ở 4oC. Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút thu tủa.

Rửa tủa bằng nước cất đến khi pH đạt 6. Thêm vào tủa 500 ml nước cất để được

huyền phù chitin 1%.

2.3.3 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn

Chuẩn bị môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma hazianum như mục 2.1.5.2 phối

vào erlen 1000ml môi trường tăng sinh rắn, hấp tiệt trùng ở 1210C/15 phút. Để nguội

khoảng 300C rồi cấy bào tử nấm Trichoderma harzianum T2 đã nuôi cấy 7 ngày trên

môi trường PDA. Giữ bình ở nhiệt độ phòng đem ủ ở 28-320C trong 3 ngày. Thực

hiện trích ly bằng nước cất lạnh vô trùng theo tỉ lệ nước cất/cơ chất là 10:1 có bổ sung

Tween 80 1%. Đem lắc trên máy lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ rồi lọc bỏ bã. Sau

54

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

đó đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút thu dịch tăng sinh loại bỏ cặn còn sót

lại.

2.3.4 Phương pháp định tính enzyme chitinase, β-glucanase, protease có trong dịch

nuôi cấy và chế phẩm enzyme C20032 10%

 Định tính enzyme chitinase

Tiến hành đục lỗ thạch trên đĩa petri chứa môi trường huyền phù chitin agar 1% được

chuẩn bị như mục 2.1.5.2. Mỗi đĩa môi trường chitin agar đục 4 lỗ thạch đường kính

5 mm, sau đó dùng micropipette hút 100µl dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) nhỏ

vào 3 lỗ thạch đã đục trong mỗi đĩa và 1 lỗ không nhỏ dịch nuôi cấy/(enzyme C20032

10%) để làm đối chứng. Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng phân giải của dịch nuôi

cấy/(enzyme C20032 10%) sau 48 giờ bằng thuốc thử Lugol để xác định vòng phân

giải chitin.

 Định tính enzyme β-glucanase

Tiến hành đục lỗ thạch trên đĩa petri chứa môi trường β-glucan agar 1% được chuẩn

bị như mục 2.1.5.2. Mỗi đĩa môi trường β-glucan agar đục 4 lỗ thạch đường kính 5

mm, sau đó dùng micropipette hút 100µl dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) nhỏ

vào 3 lỗ thạch đã đục trong mỗi đĩa và 1 lỗ không nhỏ dịch nuôi cấy/(enzyme C20032

10%) để làm đối chứng. Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng phân giải của dịch nuôi

cấy/(enzyme C20032 10%) sau 48 giờ bằng thuốc thử Lugol để xác định vòng phân

giải β-glucan.

 Định tính enzyme protease

Tiến hành đục lỗ thạch trên đĩa petri chứa môi trường casein agar 1% được chuẩn bị

như mục 2.1.5.2. Mỗi đĩa môi trường casein agar đục 4 lỗ thạch đường kính 5 mm,

sau đó dùng micropipette hút 100µl dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) nhỏ vào 3

lỗ thạch đã đục trong mỗi đĩa và 1 lỗ không nhỏ dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%)

để làm đối chứng. Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng phân giải của dịch nuôi

cấy/(enzyme C20032 10%) sau 48 giờ bằng thuốc thử Lugol để xác định vòng phân

giải casein.

55

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

2.4 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme chitinase trong

dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và enzyme chế phẩm C20032

2.4.1 Dựng đường chuẩn glucosamine

Bảng 2.1 Bảng dựng đường chuẩn glucosamine

Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Glucosamine 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

10mg/ml (ml)

Nước cất (ml) 10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9

Nồng độ 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

glucosamine

(mg/ml)

OD540nm

Từ các ống nghiệm trên lấy 1 ml cho vào 6 ống nghiệm đã được rửa và làm khô, thêm

vào mỗi ống 1 ml thuốc thử DNS. Đun 95oC cách thủy các ống thí nghiệm 10 phút

(có đậy nắp). Làm lạnh đến nhiệt độ phòng rồi cho 1 ml nước cất vào ống nghiệm.

Đo mật độ quang ở bước sóng 535 nm với mẫu trắng pha từ ống đối chứng.

Sau khi có các giá trị OD ở các nồng độ thì tiến hành dựng đường chuẩn glusosamine

với trục hoành là nồng độ (µmol/ml) glucosamine, trục tung là mật độ quang (OD).

Tìm phương trình biễu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa 2 giá trị: y = ax + b và hệ số

tương quan R2 nhờ phần mềm Excel.

2.4.2 Xác định hoạt độ enzyme chitinase ở pH và nhiệt độ khác nhau

- Nguyên tắc: Hoạt độ chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng

glucosamine sinh ra trong quá trình phân giải chitin. Lượng glucosamine tạo ra được

xác định theo phương pháp Elson- Morgan.

 Thực hiện:

Chuẩn bị các ống nghiệm đã được rửa sạch và làm khô

- Ống phản ứng:

• Cho vào mỗi ống nghiệm hỗn hợp phản ứng bao gồm: 3 ml huyền phù chitin

56

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

1%, 3 ml dịch enzyme và 1ml đệm pH (giá trị pH 4,5,6,7) Hỗn hợp được ủ ở

nhiệt độ phòng 30oC, 40oC, 50oC, 60oC và 70oC trong 60 phút.

• Ngưng phản ứng bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút.

• Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi

• Lấy 1 ml dịch nổi và 1 ml thuốc thử DNS cho vào 1 ống nghiệm sạch, lắc đều,

đun 95oC cách thủy trong 10 phút, rồi làm lạnh về nhiệt độ phòng.

• Thêm 1 ml nước cất, lắc đều và đo OD ở bước sóng 535 nm.

- Ống không phản ứng:

Cho 3 ml dịch enzyme vào ống nghiệm và biến tính enzyme bằng cách đun sôi

cách thủy 5 phút sau đó thêm 3 ml dịch cơ chất chitin, 1ml đệm pH (4,5,6,7) rồi

làm tương tự như các bước của ống phản ứng.

 Cách tính hoạt tính: Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase là lượng enzyme cần

thiết để giải phóng 1 µg glucosamine từ chitin huyền phù trong 1 phút ở nhiệt độ phản

ứng nhất định.

Đơn vị hoạt tính: HT(U/ml) = (a×n×v)/(t×V)

Với: a: hàm lượng glucosamine (µmol/ml) suy ra từ đường chuẩn.

n: hệ số pha loãng.

v: thể tích hỗn hợp phản ứng.

t: thời gian phản ứng (phút).

V: thể tích dịch enzyme cho vào phản ứng (ml)

2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme celullase trong dịch nuôi cấy nấm

Trichoderma harzianum và chế phẩm enzyme C20032

 Nguyên tắc: Dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) bởi

enzyme CMCase, lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-

3,5-dinitrobenzoic (DNS), màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương

pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm

2.5.1 Dựng đường chuẩn glucose

Hòa tan 100mg glucose monohydrate với 80ml nước cất và chuyển vào bình định

mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều.

57

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Thực hiện loạt 6 sống nghiệm theo bảng 2.2 sau

Bảng 2.2 Lập đường chuẩn glucose

Ống số 0 1 2 3 4 5

Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

DD glucose 1mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

DD CMC 1% trong đệm (ml) 1 1 1 1 1 1

DD DNS Lactose (ml) 2 2 2 2 2 2

Nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5

Lắc đều các ống nghiệm này, đun sôi cách thủy trong 10 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ

phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540nm

bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540nm (AG).

Vẽ đồ thị đường chuẩn dùng phần mềm excel, xác định phương trình đường chuẩn

(trendline) và hệ số tương quan R2 dạng như sau: AG=a*G+b, G = nồng độ glucose

(mg/ml)

2.5.2 Phản ứng xác định hoạt tính cellulase

Bảng 2.3 Các bước xác định hoạt tính enzyme cellulase (CMCase)

Hóa chất Ống thí nghiệm Ống đối chứng

DD enzyme (ml) 0 1

Ổn định enzyme 50oC/5 phút

CMC 1% ủ 50oC/5 phút 1 1

(ml)

Phản ứng enzyme 50oC/10 phút

DD DNS – lactose (ml) 2 2

DD Enzyme đun sôi (ml) 1 0

Đun sôi cách thủy trong 10 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước

mát

Đo mật độ quang A450nm AĐC ATN

 Tính toán kết quả: Đơn vị hoạt tính CMCase: một đơn vị CMCase là lượng enzyme

58

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

xúc tác phản ứng giải phóng 1µmol/phút glucose khi thủy phân CMC dưới điều kiện

phản ứng.

Hoạt tính CMCase: HT(U/ml) = G*(1000/180)*(1/10)*(1/1,0)*F

Với: G: nồng độ glucose (mg/ml) tạo thành trong phản ứng enzyme

1000: chuyển mg thành µg

180: phân tử lượng glucose monohydrate, chuyển µg thành µmol

10: Thời gian phản ứng (phút)

1,0: thể tích dung dịch enzyme (ml)

2.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease dịch nuôi cấy và chế phầm

C20032 bằng phương pháp Anson cải tiến

Nguyên tắc: Dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzyme protease có trong

dịch nghiên cứu, sau đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân

bằng dung dịch acid trichloacetic (TCA). Định lượng sản phẩm được tạo thành trong

phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteu. Dựa vào đồ

thị đường chuẩn Tyrosine để tính lượng sản phẩm do enzyme xúc tác tạo nên.

2.6.1 Dựng đường chuẩn tyrosine

Xây dựng đường chuẩn tyrosine theo bảng 2.4

Bảng 2.4 Bảng bổ sung hóa chất để dựng đường chuẩn tyrosine

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 0

(ĐC)

0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 DD Tyrosine chuẩn 1µmol/ml (ml)

DD HCl 0,2N (ml) 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1

5 5 5 5 5 5 DD Na2CO3 (ml)

Thuốc thử FC pha loãng (ml) 1 1 1 1 1 1

Nồng độ tyrosine (µmol/ml)

Lắc đều, để yên ở 50oC/30 phút. Đo độ hấp thu dung dịch ở 750nm lấy mẫu đối

chứng (ĐC) làm mẫu trắng (blank)

Vẽ đồ thị đường chuẩn bằng phần mềm excel, xác định phương trình đường chuẩn và

hệ số tương quan R2.

59

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

2.6.2 Phản ứng xác định hoạt tính protease

Tiến hành theo bảng 2.5

Bảng 2.5 Các bước xác định hoạt tính enzyme protease

Hóa chất Ống thí nghiệm Ống đối chứng

DD enzyme (ml) 0 1

Ổn định nhiệt độ enzyme 50oC/5 phút

Casein 1% ở 50oC (ml) 2 2

Phản ứng enzyme: ủ ở 50oC/20 phút

2,5 2,5 TCA (ml)

1 DD enzyme (ml) 0

Kết tủa cơ chất còn dư: lắc đều, ủ ở 50oC/30 phút. Lọc lấy dịch loại bỏ kết tủa.

1 Dịch lọc (ml) 1

5 5 Na2CO3 (ml)

1 FC pha loãng (ml) 1

Phản ứng tạo phức với FC Ủ 50oC/30 phút

Đo độ hấp thu ở 750nm ATN AĐC

 Tính toán kết quả

Đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm

(50oC) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm tan trong TCA, phản ứng

với thuốc thử Folin – Ciocalteau cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 750nm tương ứng

𝑋∗5,5∗𝐹

mới 1µmol tyrosine trong đường chuẩn.

𝑉∗20

Hoạt tính protease HT (U/ml) =

Với: X: nồng độ tyrosine suy ra từ đường chuẩn (µmol/ml)

5,5: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng thủy phân (ml)

V: thể tích dịch lọc đem phản ứng tạo màu (1ml)

F: hệ số pha loãng enzyme

2.7 Phương pháp xác định hoạt tính β-glucanase trong dịch nuôi cấy và chế

phầm C20032

60

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Nguyên tắc: Dựa vào sự thủy phân cơ chất β-glucan bởi enzyme β-glucanase, lượng

đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS),

màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ

kế ở bước sóng 540nm.

2.7.1 Dựng đường chuẩn β-glucan

Thực hiện theo bảng 2.6 để dựng phương trình đường chuẩn β-glucan

Bảng 2.6 Lập đường chuẩn β-glucan để xác định hoạt tính β-glucanase

Ống số 0 1 2 3 4 5

Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

DD glucose 1mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

DD β-glucan 1% trong đệm (ml) 1 1 1 1 1 1

DD DNS Lactose (ml) 2 2 2 2 2 2

Nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5

Lắc đều các ống nghiệm này, đun sôi cách thủy trong 10 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ

phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540nm

bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540nm (AG).

Vẽ đồ thị đường chuẩn dùng phần mềm excel, xác định phương trình đường chuẩn

(trendline) và hệ số tương quan R2 dạng như sau: AG=a*G+b, G = nồng độ glucose

(mg/ml)

2.7.2 Phản ứng xác định hoạt tính β-glucanase

Bảng 2.7 Các bước xác định hoạt tính enzyme β-glucanase

Hóa chất

DD enzyme (ml) Ống thí nghiệm 1 Ống đối chứng 0

Ổn định enzyme 50oC/5 phút

β-glucan 1% ủ 50oC/5 phút (ml) 1 1

Phản ứng enzyme 50oC/30 phút

DD DNS – lactose (ml) DD Enzyme đun sôi (ml) 2 0 2 1

Đun sôi cách thủy trong 10 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước mát

ATN AĐC Đo mật độ quang A450nm

61

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

 Tính toán kết quả

Đơn vị hoạt tính : một đơn vị β-glucanase là lượng enzyme xúc tác phản ứng giải

phóng 1µmol/phút glucose khi thủy phân β-glucan dưới điều kiện phản ứng.

Hoạt tính β-glucanase: HT(U/ml) = G*(1000/180)*(1/30)*(1/1,0)*F

Với: G: nồng độ glucose (mg/ml) tạo thành trong phản ứng enzyme

1000: chuyển mg thành µg

180: phân tử lượng glucose monohydrate, chuyển µg thành µmol

30: Thời gian phản ứng (phút)

1,0: thể tích dung dịch enzyme (ml)

2.8 Phương pháp xác định protein trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma

harzianum và chế phầm C20032 bằng phương pháp Bradford

2.8.1 Dựng đường chuẩn Albumin

Tiến hành theo bảng 2.8

Bảng 2.8 Dựng đường chuẩn albumin (protein theo Bradford)

Ống nghiệm (ĐC) 1 5 Mẫu 2 3 4

DD BSA 0,1mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 -

Nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 -

Mẫu phân tích pha loãng - - - - - - 1

hệ số F (ml)

Nồng độ BSA (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 -

Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2

Để yên trong 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu dung dịch ở bước sóng 595nm lấy mẫy

đối chứng làm mẫu trắng (blank). Ghi lại các giá trị đo OD. Vẽ đồ thị đường chuẩn

bằng phần mềm excel, xác định phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan R2.

2.8.2 Xác định hàm lượng protein trong mẫu

Hút 1ml dịch enzyme cần phân tích cho vào ống nghiệm thêm 2ml thuốc thử

Bradford, để yên 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595nm. Chú ý pha loãng protein

để OD nằm trong đường chuẩn.

 Tính toán kết quả:

62

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Hàm lượng protein trong dung dịch enzyme mẫu:

P (mg/ml) = (X*F)

Với: X: nồng độ protein trong mẫu phân tích (mg/ml)

F: hệ số pha loãng mẫu

63

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

2.9 Khảo sát phá vách bào tử nấm Linh chi bằng dịch nuôi cấy nấm Trichoderma

harzianum và enzyme chế phẩm C20032.

2.9.1 Phương pháp xác định tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy nấm

Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032

Sơ đồ 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy

và chế phẩm C20032 10%

1g bào tử nấm linh chi 20ml nước cất

Lạnh đông 12 tiếng ở -4oC

Rã đông ở nhiệt độ phòng

Nước Ly tâm 4000 vòng/phút/20 phút

Thu bào tử, phối vào mỗi ống nghiệm 0,1g bào tử

Ngâm bào tử trong DNC và EC 10% ở 50oC, pH5 theo các tỉ lệ

1DNC : 1 EC10% (1,5ml:1,5ml +2ml đệm) 1 DNC (1,5ml + 3,5ml đệm) 1 EC10% (1,5ml + 3,5ml đệm)

2 DNC: 1EC10% (3,0ml:1,5 ml +0,5ml đệm) 1 DNC : 2 EC10% (1,5ml:3,0 ml +0,5ml đệm)

Đếm hồng cầu tế bào ngày 2,3,4

64

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Cân 1g bào tử nấm Linh chi cho vào ống ly tâm, đong 20 ml nước cất thêm vào ống

ly tâm, để vào trong tủ đá làm lạnh đông bào tử ở - 4oC trong 12 tiếng. Sau thời gian

lạnh đông, đem bào tử rã đông ở nhiệt độ phòng, khi đá đã tan hết, ly tâm 4000 vòng/

phút trong 10 phút để tách nước, thu bào tử ướt. Phối vào mỗi ống nghiệm 0,1g bào

tử rồi ngâm bào tử trong hỗn hợp dịch nuôi cấy nấm và enzyme chế phẩm C20032

10% với các tỉ lệ thể tích khác nhau như bảng 2.9

Bảng 2.9 Bảng bố trí thay đổi tỉ lệ enzyme dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10%

Nghiệm Nghiệm Nghiệm Nghiệm Nghiệm Nghiệm

thức thức 1 thức 2 thức 3 thức 4 thức 5

(NT1) (NT2) (NT3) (NT4) (NT5)

Tỉ lệ 1 DNC 1 EC 10% 1DNC : 2DNC : 1DNC :

1EC 10% 1EC 10% 2EC 10%

Thể tích 1,5 1,5 1,5 : 1,5 3,0 : 1,5 1,5 : 3,0

(ml)

3,5 3,5 2,0 0,5 0,5 Đệm

pH5 (ml)

5 5 5 5 5 Tổng thể

tích (ml)

Đem ủ các ống nghiệm trên trong bể điều nhiệt ở 50oC trong 2, 3, 4 ngày. Thực hiện

đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu ở ngày thứ 2, 3, 4.

2.9.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu.

(Trần Thanh Phong, 2004; Nguyễn Đức Lượng, 2005)

65

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Hình 2.1 Buồng đếm hồng cầu Neubauer

Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm các vi sinh vật có kích thước rất nhỏ (nấm men,

bào tử nấm mốc…).

Nguyên tắc: Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu đó là một phiến kính hình chữ nhật,

chia thành ba khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng

nhỏ có kẻ một lưới đếm, gồm nhiều ô vuông nhỏ, mỗi ô có diện tích là 1/25 mm2, lại

được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16 ô), mỗi ô có diện tích là 1/400 mm2

và chiều sâu là 0,1mm. Như vậy thể tích của mỗi ô nhỏ là 1/400x0.1=1/4000 mm3.

Thực hiện: Bào tử nấm Linh chi sau khoảng thời gian ủ thích hợp, được lấy ra thực

hiện đếm hồng cầu. Định mức ống nghiệm chứa bào tử nấm linh chi và hỗn hợp dịch

enzyme đến 10 ml, ta được ống mẫu 100. Thực hiện pha loãng bằng cách dùng

micropipette hút 1ml từ ống mẫu 100 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh

lý ta được độ pha loãng 10-1. Lặp lại như trên cho đến khi có được các độ pha loãng

10-2, 10-3. Tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer.

Lắc đều mẫu pha loãng. Đậy lá kính lên lưới đếm. Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu,

cho một giọt vào mép lá kính, do sức mao dẫn, dịch mẫu tràn vào mặt trên lưới đếm.

Chú ý không để tạo bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh. Đặt buồng

đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3-5 phút, sau đó tiến hành đếm bào tử.

Chú ý: nồng độ dịch huyền phù mẫu pha loãng phải đảm bảo sao cho mật độ trong

mỗi ô nhỏ không được quá 10 bào tử.

Cách đếm và tính:

66

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

- Đếm số bào tử trong 4 ô W (ô W là 4 ô nằm ở 4 góc buồng đếm Neubauer),

gọi B là số bào tử trung bình trong một ô lớn W. Trong mỗi ô trung bình, đếm

tất cả những bào tử nằm gọn trong ô và những bào tử nằm ở cạnh trên và cạnh

trái. Những bào tử nằm ngay trên vạch ngoài thì đếm 2 tính 1, còn bào tử nằm

giữa 2 vạch hoặc trên 1 vạch thì 1 tính 1.

- Số bào tử trong 4 ô W là B1, B2, B3 và B4. Btrung bình = (B1+B2+B3+B4)/4

Mật độ bào tử trong mẫu là:

- Bào tử/1 mm3 = B/(1 mm2 x 0,1 mm) = Bx10

- Bào tử/1 ml = Bx1000x10

Số bào tử trong dịch mẫu là:

- Bào tử/ml = Bx1000x10xF (F là hệ số pha loãng)

Xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi là đếm bào tử còn nguyên sau khi đã xử lý

bằng hỗn hợp dịch enzyme so với bào tử chưa xử lý.

2.9.3 Phương pháp xác định độ ẩm bào tử nấm Linh chi

Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu. Cân trọng lượng

mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu.

Thực hiện: sấy chén sứ sạch ở 105oC đến khối lượng không đổi. Để nguội trong bình

hút ẩm và cân khối lượng chính xác đến 0,0001g (M). Cho vào cốc một lượng mẫu

rồi đem cân cốc chứa mẫu bằng cân phân tích với độ chính xác đến 0,0001g (M1).

Cho cốc chứa mẫu vào tủ sấy, sấy đến khối lượng không đổi trong thời gian 3 giờ.

Sau khi sấy, làm nguội trong bình hút ẩm 15 – 20 phút rồi đem cân phân tích với độ

chính xác như trên. Cho lại vào tủ sấy 105oC trong 30 phút, lấy ra làm nguội trong

bình hút ẩm 15 – 20 phút rồi đem cân đến khối lượng không đổi (M2)

Tính kết quả:

Độ ẩm theo phần trăm được tính theo công thức:

X% = (M1 – M2)/(M1 – M)x100

Với M: khối lượng cốc (g)

M1: khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g)

M2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g)

67

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

2.9.4 Phương pháp thay đổi nồng độ của chế phẩm C20032 kết hợp với dịch nuôi

cấy nấm Trichoderma harzianum

Cân 1g bào tử nấm Linh chi cho vào ống ly tâm, đong 20 ml nước cất thêm vào ống

ly tâm, để vào trong tủ đá làm lạnh đông bào tử ở - 4oC trong 12 tiếng. Sau thời gian

lạnh đông, đem bào tử rã đông ở nhiệt độ phòng, khi đá đã tan hết, ly tâm 4000 vòng/

phút trong 10 phút để tách nước, thu bào tử ướt. Phối vào mỗi ống nghiệm 0,1g bào

tử rồi ngâm trong hỗn hợp dịch nuôi cấy nấm và enzyme chế phẩm C20032 có tỉ lệ

thể tích 1 DNC : 1 EC 20032 với sự thay đổi nồng độ của chế phẩm C20032 theo

bảng 2.10

Bảng 2.10 Bảng bố trí sự thay đổi nồng độ enzyme C20032

Nghiệm Nghiệm Nghiệm Nghiệm Nghiệm Nghiệm

thức thức 1 thức 2 thức 3 thức 4 thức 5

(NT1) (NT2) (NT3) (NT4) (NT5)

Tỉ lệ 1 DNC: 1 DNC: 1 DNC : 1 DNC : 1 1 DNC : 1

1 EC 10% 1 EC 5% 1 EC 1% EC 0,5% EC 0,1%

Thể tích 1,5 : 1,5 1,5 : 1,5 1,5 : 1,5 1,5 : 1,5 1,5 : 1,5

(ml)

2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Đệm

pH5 (ml)

5 5 5 5 5 Tổng thể

tích (ml)

68

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Sơ đồ 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi nồng độ enzyme chế phẩm C20032 kết

hợp với dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum

1g bào tử nấm linh chi 20ml nước cất

Lạnh đông 12 tiếng ở -4oC

Rã đông ở nhiệt độ phòng

Nước Ly tâm 4000 vòng/phút/20 phút

Thu bào tử, phối vào mỗi ống nghiệm 0,1g bào tử

Ngâm bào tử trong DNC và EC ở 50oC, pH5 theo tỉ lệ 1:1 với sự thay đổi nồng độ EC

1 DNC : 1 EC 1% 1 DNC: 1 EC 10% 1 DNC : 1 EC 5% 1 DNC: 1 EC 0,5% 1 DNC : 1 EC 0,1%

Đếm hồng cầu tế bào ngày 4,7,10

Đem ủ các ống nghiệm trên trong bể điều nhiệt ở 50oC trong 4,7,10 ngày. Thực hiện

đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer ở ngày thứ 4,7,10. Sau đó xác định

nghiệm thức có tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi ưu thế.

69

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Kết quả định tính enzyme chitinase, β-glucanase, protease trong chế

phẩm C20032 10% và dịch nuôi cấy

3.1.1 Kết quả định tính các enzyme trong chế phẩm C20032 10%

Theo nghiên cứu của Ma Jingjing và cộng sự từ trường Đại học Vũ Hán, Trung Quốc

(2007) về phương pháp nghiên cứu phá vỡ bào tử nấm linh chi bằng máy nghiền ly

tâm tốc độ cao đã báo cáo rằng thành phần vách bào tử nấm linh chi có 19,01% Si,

19,01% Ca, 52,08% - 57,64% là chitin. Cấu trúc phức tạp của vách bào tử nấm linh

chi nhờ sự liên kết của cellulose với các thành phần trên tạo ra vách bền vững giúp

cho bào tử nấm linh chi chống chịu được tác nhân axit và kiềm, điều đó gây khó khăn

cho sự phá hủy vách bằng tác nhân oxy hóa. Các phương pháp phá vỡ vách bào tử

linh chi bằng tác nhân vật lý, hóa học, enzyme đã được đưa ra nhưng tỉ lệ phá vỡ còn

thấp, tốn kém và đắt tiền. Bằng phương pháp nghiên cứu tác nhân sinh học dựa vào

enzyme cellulase thương mại và nguyên tắc xâm nhập của enzyme trong phá vỡ vách

tế bào, quá trình nghiên cứu trước đó đã lựa chọn enzyme cellulase C20032 làm đối

tượng khảo sát nhưng vẫn chưa khẳng định rõ ràng những hệ enzyme góp phần làm

nên hiệu quả của việc phá vách. Qua đây, đồ án cần xác định rõ hơn hệ enzyme có

mặt trong chế phẩm C20032 ngoài enzyme cellulase.

Bảng 3.1 Vòng phân giải các enzyme có trong chế phẩm C20032 10%

Enzyme

Chitinase β-glucanase Protease

Chitin agar 1% (pH5) β-glucan agar 1% Casein agar 1%

Môi trường

28,33 ± 0,58 27,67 ± 0,58 27,67 ± 0,58 D – d (mm)

Ghi chú: Kích thước vòng phân giải được thể hiện dưới dạng TB ± SD

70

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Hoạt tính từng loại enzyme hiện diện trong chế phẩm C20032 được xác định dựa vào

độ lớn của vòng phân giải lỗ thạch.

ΔD = D - d (mm)

D: đường kính vòng phân giải (mm); d: đường kính lỗ thạch (mm).

Qua kết quả định tính bằng phương pháp đục lỗ thạch ở bảng 3.1, nhận thấy có sự

hiện diện của các enzyme chitinase, β-glucanase, protease trong chế phẩm C20032

ngoài enzyme cellulase. Dựa vào kết quả nghiên cứu sơ bộ của Đồng Thị Ngọc

(2015), chỉ sử dụng một loại enzyme cellulase thương mại cho hiệu quả không cao

khi phá vỡ vách bào tử nấm linh chi. Do đó cần khảo sát thêm dịch enzyme của loại

nấm Trichoderma harzianum gây bệnh trên nấm linh chi nhằm đưa ra công thức phối

hợp thích hợp với nghiên cứu.

3.1.2 Kết quả định tính enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum

môi trường nuôi cấy lỏng

Để khảo sát định tính các enzyme có trong dịch nuôi cấy lỏng, dựa vào khả năng thủy

phân cơ chất trong môi trường thạch agar, sau khi tráng dung dịch thuốc thử Lugol

nhận thấy sự có mặt của vòng phân giải trên mỗi môi trường thạch là khác nhau, qua

đó hoạt tính từng loại enzyme hiện diện trong dịch nuôi cấy cũng được xác định dựa

vào độ lớn của vòng phân giải lỗ thạch.

ΔD = D - d (mm)

D: đường kính vòng phân giải (mm); d: đường kính lỗ thạch (mm).

71

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Bảng 3.2 Vòng phân giải các enzyme có trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma

harzianum môi trường nuôi cấy lỏng

Chitinase Chitin agar 1% β-glucanase β-glucan agar 1% Protease Casein agar 1%

Enzyme Môi trường thạch

16,67 ± 0,58 17,33 ± 0,58 18,33 ± 0,58

D – d (mm) pH5

24,67 ± 0,58

D – d (mm) Ghi chú: Kích thước vòng phân giải được thể hiện dưới dạng TB ± SD

Dựa vào số liệu và hình ảnh bảng 3.2, cho thấy có sự xuất hiện vòng phân giải chitin,

β-glucan và casein. Điều này chứng tỏ dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum

cũng có sự hiện diện của enzyme chitinase, β-glucanase, protease. Riêng môi trường

thạch chitin agar 1% được điều chỉnh về pH5 thì kích thước vòng phân giải lớn hơn

khi không điều chỉnh môi trường về pH5.

3.1.3 Kết quả định tính enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum

môi trường nuôi cấy rắn

Thực hiện định tính dịch enzyme Trichoderma harzianum được nuôi cấy từ môi

trường rắn, định tính được thực hiện bằng phương pháp đục lỗ thạch trên đĩa petri

chứa cơ chất chitin, β-glucan, casein, sau 48 giờ có thể thấy kết quả như bảng 3.3

72

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Bảng 3.3 Vòng phân giải các enzyme có trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma

harzianum môi trường nuôi cấy rắn

Enzyme

Chitinase

β-glucanase Chitin agar 1% (pH5) β-glucan agar 1% Protease Casein agar 1%

Môi trường thạch

25,33 ± 0,58 16,67 ± 0,58 26,00 ± 1

D – d (mm) Ghi chú: Kích thước vòng phân giải được thể hiện dưới dạng TB ± SD

Qua kết quả định tính các enzyme chitinase, β-glucanase, protease trong dịch nuôi

cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường nuôi cấy rắn: ta thấy sau khi nhỏ thuốc

thử Lugol ở 3 lỗ thạch thí nghiệm thuốc thử không bắt màu tạo nên vòng phân giải,

lỗ thạch đối chứng bắt màu của thuốc thử cho thấy có sự hoạt động của các enzyme

trên.

Dựa vào sự so sánh ΔD của các enzyme trong chế phẩm C20032 10% với ΔD của

dịch nuôi cấy T. harzianum môi trường lỏng và môi trường rắn, nhận thấy ΔD của

chế phẩm C20032 10% lớn hơn, điều đó chứng tỏ hoạt tính các enzyme có trong chế

phẩm C20032 10% là mạnh hơn dịch nuôi cấy. Để định lượng hoạt độ của các enzyme

xem kết quả mục 3.2

3.2 Kết quả định lượng hoạt tính các enzyme trong dịch nuôi cấy nấm

Trichoderma harzianum nuôi cấy môi trường lỏng và nuôi cấy môi trường rắn

và chế phẩm C20032 10%

73

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Bảng 3.4 Kết quả hoạt tính enzyme của dịch nuôi cấy nấm và chế phẩm C20032 10%

Hoạt tính enzyme DNC môi trường DNC môi trường Chế phẩm

nuôi cấy lỏng nuôi cấy rắn C20032 10%

Chitinase (U/ml) 0,153 ± 0,002 0,179 ± 0,001 0,249 ± 0,033

β-glucanase (U/ml) 0,077 ± 0,006 0,034 ± 0,007 0,111 ± 0,049

Protease (U/ml) 0,029 ± 0,003 0,052 ± 0,007 0,037 ± 0,018

Cellulase (U/ml) 0,146 ± 0,013 0,105 ± 0,003 67,222 ± 12,108

Ghi chú: Hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD

Dựa vào bảng kết quả 3.4, bảng 3.1 và bảng 3.2 có thể thấy hoạt tính các enzyme

trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum ở môi trường nuôi cấy lỏng gần

tương đương với dịch nuôi cấy ở môi trường rắn (cơ chất bã nấm linh chi). Ta thấy

được sự chênh lệch hoạt tính của các enzyme là không đáng kể. Để lựa chọn môi

trường nuôi cấy phù hợp thì nên lựa chọn nuôi cấy lỏng là tốt hơn bởi tiết kiệm được

chi phí nguyên liệu, hóa chất.

0.2

0.179

0.18

0.153

0.16

0.146

) l

0.14

0.12

m / U

0.105

0.1

0.077

0.08

( h n í t t ạ o H

0.052

0.06

0.034

0.029

0.04

0.02

0

Chitinase (U/ml)

β-glucanase (U/ml)

Protease (U/ml)

Cellulase (U/ml)

DNC môi trường nuôi cấy lỏng

DNC môi trường nuôi cấy rắn

BIỂU ĐỒ SO SÁNH HOẠT TÍNH ENZYME DỊCH NUÔI CẤY MÔI TRƯỜNG LỎNG & DỊCH NUÔI CẤY MÔI TRƯỜNG RẮN

Hình 3.1 Biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme trong dịch nuôi cấy T. harzianum môi

trường nuôi cấy lỏng và môi trường nuôi cấy rắn

74

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm

Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032

Dựa vào kết quả định tính enzyme và nghi ngờ khả năng phá vách phụ thuộc nhiều

vào enzyme chitinase có mặt trong hệ enzyme bởi lớp chitin đôi của bào tử linh chi

là yếu tố được nghiên cứu phá vách rộng rãi bằng phương pháp enzyme.

3.3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm

Trichoderma harzianum ở điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau.

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase ở điều kiện nhiệt độ và pH

thay đổi

Nhiệt độ

pH4 Hoạt tính (U/ml) pH5 Hoạt tính (U/ml) pH6 Hoạt tính (U/ml) pH7 Hoạt tính (U/ml)

30 40 50 60 70 0,110 ± 0,003 0,151 ± 0,004 0,134 ± 0,008 0,105 ± 0,002 0,126 ± 0,012 0,157 ± 0,007 0,135 ± 0,009 0,106 ± 0,002 0,127 ± 0,010 0,170 ± 0,001 0,143 ± 0,004 0,118 ± 0,009 0,107 ± 0,003 0,150 ± 0,004 0,127 ± 0,002 0,109 ± 0,004 0,037 ± 0,014 0,084 ± 0,020 0,077 ± 0,011 0,094 ± 0,022

Ghi chú: Hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD

75

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

BIỂU ĐỒ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE TRONG DỊCH NUÔI CẤY Ở NHIỆT ĐỘ VÀ PH KHÁC NHAU

0.170

0.180

0.157

l

0.151

0.150

0.160

0.143

0.135

0.134

0.140

0.127

0.127

0.126

0.118

0.110

0.120

0.109

0.107

0.106

0.105

0.094

0.100

0.084

0.077

0.080

0.060

0.037

0.040

0.020

m / U e m y z n e h n í t t ạ o H

0.000

30

50

60

70

40 Nhiệt độ theo dõi

pH4 pH5 pH6 pH7

Hình 3.2 Biểu đồ khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm

Trichoderma harzianum ở nhiệt độ và pH khác nhau

Dựa vào kết quả bảng 3.5 và biểu đồ 3.2 có thể nhận thấy rằng nấm Trichoderma

harzianum T2 sản sinh enzyme chitinase khá tốt trong nhiều điều kiện môi trường và

nhiệt độ khác nhau. Trong đó enzyme chitinase thể hiện hoạt tính tốt nhất ở nhiệt độ

50oC, pH7 với giá trị hoạt tính 0,170 ± 0.001 (U/ml). Điều này cũng phù hợp với kết

quả nghiên cứu sơ bộ của Đồng Thị Ngọc (2015). Có thể giải thích rằng trong điều

kiện pH môi trường và nhiệt độ thích hợp enzyme chitinase phân giải cơ chất chitin

huyền phù sinh ra glucosamine, xác định lượng glucosamine bằng phương pháp Elson

– Morgan cho kết quả tương ứng với điều kiện thí nghiệm.

Do đó điều kiện thí nghiệm với enzyme chitinase từ dịch nuôi cấy được lựa chọn cho

các thí nghiệm về sau ở nhiệt độ 50oC, pH5.

3.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong chế phẩm C20032

10%

76

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong chế phẩm

C20032 10% điều kiện pH5

Nhiệt độ 30 40 50 60 70 Hoạt tính (U/ml) 0,234 ± 0,020 0,245 ± 0,043 0,248 ± 0,031 0,227 ± 0,031 0,219 ± 0,012

Ghi chú: Hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD

l

/

BIỂU ĐỒ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE TRONG CHẾ PHẨM ENZYME C20032 10%

a

a

c

b

d

m U e m y z n e

0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000

30

40

50

60

70

h n í t t ạ o H

Nhiệt độ theo dõi pH5

Hình 3.3 Biểu đồ khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có trong chế phẩm C20032

10% điều kiện pH5

Dựa vào bảng 3.6 và biểu đồ 3.3 có thể thấy enzyme chitinase có mặt trong chế phẩm

C20032 thể hiện hoạt tính tốt ở cả hai nhiệt độ 40oC và 50oC. Lựa chọn nhiệt độ 50oC

để kết hợp với enzyme dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum trong các thí

nghiệm tiếp theo là thích hợp.

3.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi khi thay đổi tỉ lệ enzyme

phối hợp giữa dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10%

Giải thích kí hiệu

NT1 NT2 NT3 NT4 NT5

1 DNC 1 EC10% 1 DNC : 1 EC10% 1 DNC:2 EC10% 2 DNC:1EC10%

77

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Hình 3.4a Bào tử nấm Linh chi soi dưới Hình 3.4b Bào tử nấm Linh chi bị phá

kính hiển vi khi chưa bị phá vỡ vỡ được soi dưới kính hiển vi khi thay

đổi tỉ lệ enzyme phối hợp ở ngày thứ 4

Bảng 3.7 Bảng kết quả % bào tử Linh chi bị phá vỡ khi thay đổi tỉ lệ enzyme phối

hợp giữa dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10%

Ngày 4

Ngày 2 0,85b ± 0,22 Ngày 3 2,49d ± 0,33 3,20d ± 0,85

0,71b ± 0,24 3,41d ± 0,64 3,91d ± 1,05

5,33a ± 1,19 13,29a ± 0,81 18,55a ± 0,85

4,19a ± 1,01 8,03b ± 0,65 10,95b ± 1,17

0,78b ± 0,33 4,98c ± 0,53 6,47c ± 0,96

NT1 (1 DNC) NT2 (1 EC10%) NT3 (1 DNC : 1 EC10%) NT4 (1 DNC : 2 EC10%) NT5 (2 DNC:1 EC10%)

Ghi chú: Tỉ lệ % phá vỡ được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột giá

trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức

ý nghĩa α=0,05 theo trắc nghiệm LSD.

78

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

TỈ LỆ PHÁ VỠ BÀO TỬ NẤM LINH CHI

25.00

)

a

20.00

%

a

15.00

b

10.00

b

c

a

c

a

( ỡ v á h p ệ l ỉ

d

d

d

5.00

d

T

b

b

b

0.00

NT1 1 DNC

NT2 1 EC 10%

NT3 1 DNC : 1 EC 10%

NT4 1 DNC : 2 EC 10%

NT5 2 DNC : 1 EC 10%

48 giờ 72 giờ 96 giờ

Hình 3.5 - Biểu đồ tỉ lệ % phá vỡ của bào tử nấm Linh chi khi thay đổi tỉ lệ enzyme

phối hợp giữa dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10%

Bảng 3.8 Bảng hoạt tính Enzyme/cơ chất (U/g) của các enzyme có mặt trong hỗn

hợp dịch thí nghiệm

Nghiệm Thức 1 (1 DNC)

Nghiệm Thức 2 (1 EC 10%)

Nghiệm Thức 3 (1 DNC : 1 EC10%)

Nghiệm Thức 4 (1 DNC:2 EC10%)

Chitinase

3.93 U/g DNC 6.40 U/g EC 10%

β-glucanase

1.98 U/g DNC 2.85 U/g EC 10%

Protease

0.75 U/g DNC 0.95 U/g EC 10% 3.93 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% 1.98 U/g DNC + 2.85 U/g EC 10% 0.75 U/g DNC + 0.95 U/g EC 10% 3.93 U/g DNC + 12.80 U/g EC 10% 1.98 U/g DNC + 5.71 U/g EC 10% 0.75 U/g DNC + 1.89 U/g EC 10%

Nghiệm Thức 5 (2DNC: 1 EC 10%) 7.86 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% 3.96 U/g DNC + 2.85 U/g EC 10% 1.49 U/g DNC+ 0.95 U/g EC 10%

Cellulase

3,75 U/g DNC 1727,69 U/g EC 10% 3,75 U/g DNC + 1727,69 U/g EC 10% 3,75 U/g DNC + 3455,37 U/g EC 10% 7,50 U/g DNC+ 1727,69 U/g EC 10%

79

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

 Nhận định: Dựa vào kết quả quan sát dưới kính hiển vi quang học, bảng 3.7, biểu

đồ 3.6 về tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi và bảng 3.8 về thành phần các hoạt tính

enzyme có mặt trong dịch thí nghiệm có thể nhận thấy rằng tỉ lệ % bào tử nấm linh

chi bị phá vỡ đạt cao nhất (18,55%) ở ngày theo dõi thứ 4 khi kết hợp dịch nuôi cấy

và chế phẩm enzyme C20032 10% theo tỉ lệ 1:1 (NT3(1 DNC : 1 EC10%)). Với việc

chỉ sử dụng một dịch nuôi cấy hay chế phẩm C20032 10% để thực hiện thí nghiệm

phá vách bào tử nấm linh chi nhận thấy kết quả thu được khá thấp (NT1(1 DNC)),

NT2(1 EC 10%)). Khi có sử dụng dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10% với các tỉ

lệ khác nhau nhận thấy bào tử nấm linh chi bị phá vách có tăng lên nhưng không đáng

kể (NT4(1 DNC:2 EC10%), NT5(2 DNC:1 EC10%)).

 Khi sử dụng dịch nuôi cấy và enzyme C20032 10% theo tỉ lệ 1:1, tỉ lệ % phá vỡ

bào tử nấm linh chi được tốt hơn có thể giải thích do tác dụng cộng hợp của hệ enzyme

trong dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032 10%. Vách bào tử

nấm linh chi là lớp vỏ đôi có thành phần chủ yếu là chitin nên việc phá vỡ phụ thuộc

nhiều vào hoạt tính enzyme chitinase. Kết quả của việc sử dụng enzyme dịch nuôi

cấy Trichoderma harzianum được phân lập từ quả thể nấm linh chi kết hợp với

enzyme cellulase C20032 10% chứng tỏ sự cần thiết của việc kết hợp này, nếu dùng

riêng lẻ một loại enzyme kết quả thu được rất thấp (biểu đồ cột NT1(1 DNC)), NT2(1

EC 10%)).

Ở cột kết quả thay đổi tỉ lệ kết hợp giữa 2 loại dịch enzyme (NT4(1 DNC:2 EC10%),

NT5(2 DNC:1 EC10%)) cũng chứng minh cho nhận định phải có sự kết hợp giữa 2

loại dịch enzyme thì hiệu quả phá vách bào tử nấm linh chi mới được cải thiện.

Phân tích kết quả ở NT4 (1 DNC : 2 EC 10%) và NT5 (2 DNC : 1 EC 10%) cho thấy

chế phẩm C20032 đóng vai trò quan trọng hơn trong dịch hỗn hợp. Khi xét về hoạt

tính enzyme chitinase/cơ chất, nhận thấy được kết quả tốt nhất là kết hợp 3,93 U/g

DNC + 6,40 U/g EC 10%, như vậy có thể nhận định chế phẩm C20032 đóng vai trò

quan trọng trong thí nghiệm. Tuy nhiên nếu không có sự kết hợp của enzyme từ dịch

nuôi cấy thì hiệu quả phá vách cũng không cao (xem cột NT2: chỉ có C20032 10%).

80

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Từ kết quả phân tích trên, để xác định thêm vai trò của chế phẩm C20032 trong thí

nghiệm phá vách bào tử nấm linh chi, nồng độ C20032 pha loãng bao nhiêu là phù

hợp để tiết kiệm nguyên liệu sử dụng sinh viên đã tiến hành thực hiện thí nghiệm

khảo sát xác định nồng độ ưu thế của enzyme chế phẩm C20032 khi kết hợp với dịch

nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum

3.5 Kết quả tỉ lệ bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi thay đổi nồng độ chế phẩm

C20032 kết hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum

Giải thích kí hiệu

NT1: 1 DNC : 1 EC 10% NT4: 1 DNC : 1 EC 0,5%

NT5: 1 DNC : 1 EC 0,1% NT2: 1 DNC : 1 EC 5%

NT3: 1 DNC : 1 EC 1%

Bảng 3.9 Bảng tổng hợp tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi khi thay đổi nồng độ chế

phẩm C20032

Ngày 4 Ngày 7 Ngày 10

18,98a ± 0,57 21,46a ± 0,96 24,45a ± 1,86

14,78b ± 0,89 17,20b ± 0,81 18,76b ± 1,54

5,19cd ± 0,86 6,47c ± 0,75 7,39cd ± 0,65

3,91cd ± 0,65 4,83d ± 0,65 6,18cd ± 0,85

2,70cd ± 0,65 3,70d ± 0,69 4,26cd ± 0,77

NT1 (1 DNC : 1 EC 10%) NT2 (1 DNC : 1 EC 5%) NT3 (1 DNC : 1 EC 1%) NT4 (1 DNC : 1 EC 0,5%) NT5 (1 DNC : 1 EC 0,1%)

Ghi chú: Tỉ lệ % phá vỡ được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột giá

trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức

ý nghĩa α=0,05 theo trắc nghiệm LSD.

81

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

TỈ LỆ PHÁ VỠ BÀO TỬ NẤM LINH CHI

30.00

a

25.00

)

b

%

a

b

20.00

ab

b

15.00

( ỡ v á h p ệ

10.00

a

l ỉ

ab

a

T

b

ab

a

b

ab

5.00

b

0.00

NT1 1 DNC : 1 EC 10%

NT2 1 DNC : 1 EC 5%

NT3 1 DNC : 1 EC 1%

NT4 1 DNC : 1 EC 0,5%

NT5 1 DNC : 1 EC 0,1%

Ngày 4 Ngày 7 Ngày 10

Hình 3.6 Biểu đồ tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi khi thay đổi nồng độ chế phẩm

C20032.

Bảng 3.10 Bảng hoạt tính Enzyme/cơ chất (U/g) của các enzyme có mặt trong hỗn

hợp dịch thí nghiệm có sự thay đổi nồng độ enzyme chế phẩm C20032

NT1 1 DNC : 1 EC 10% NT4 1 DNC : 1 EC 0,5%

Chitinase

3,93 U/g DNC + 6,40 U/g EC 10% β-glucanase 1,98 U/g

Protease

Cellulase

DNC + 2,85 U/g EC 10% 0,75 U/g DNC + 0,95 U/g EC 10% 3,75 U/g DNC + 1727,69 U/g EC 10% NT2 1 DNC : 1 EC 5% 3,93 U/g DNC + 3,20 U/g EC 5% 1,98 U/g DNC + 1,43 U/g EC 5% 0,75 U/g DNC + 0,47 U/g EC 5% 3,75 U/g DNC + 863,84 U/g EC 5% NT3 1 DNC : 1 EC 1% 3,93 U/g DNC + 0,64 U/g EC 1% 1,98 U/g DNC + 0,29 U/g EC 1% 0,75 U/g DNC + 0,09 U/g EC 1% 3,75 U/g DNC + 172,77 U/g EC 1% 3,93 U/g DNC + 0,32 U/g EC 0.5% 1,98 U/g DNC + 0,14 U/g EC 0.5% 0,75 U/g DNC + 0,05 U/g EC 0.5% 3,75 U/g DNC + 86,38 U/g EC 0.5% NT5 1 DNC : 1 EC 0,1% 3,93 U/g DNC + 0,064 U/g EC 0.1% 1,98 U/g DNC + 0,03 U/g EC 0.1% 0,75 U/g DNC + 0,01 U/g EC 0.1% 3,75 U/g DNC + 17,28 U/g EC 0.1%

82

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Hình 3.7 Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ Hình 3.8 Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ

khi soi dưới kính hiển vi ngày thứ 7 khi soi dưới kính hiển vi ngày thứ 10

(NT1: 1 DNC : 1 EC 10%) (NT1: 1 DNC : 1 EC 10%)

 Nhận định: Dựa vào kết quả quan sát dưới kính hiển vi quang học, bảng 3.9 và

biểu đồ 3.7 về tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi khi thay đổi nồng độ enzyme chế phẩm

C20032 trong hỗn hợp dịch thí nghiệm, nhận thấy bào tử nấm linh chi bị phá vỡ nhiều

nhất ở ngày thứ 10 (24,45%) khi giữ nồng độ chế phẩm C20032 ở 10%. Khi giảm

nồng độ C20032 xuống 1%, 0,5%, 0,1% thì tỉ lệ bào tử nấm linh chi bị phá vỡ không

đáng kể (NT3, NT4, NT5). Đáng chú ý ở NT2 (1 DNC : 1 EC 5%) khi giảm nồng độ

C20032 xuống 5% tỉ lệ phá vỡ đạt 18,76% ở ngày thứ 10, qua đó có thể thấy hiệu quả

phá vỡ bào tử nấm linh chi phụ thuộc nhiều vào nồng độ chế phẩm C20032.

So sánh với phương pháp nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi được trình bày

trong patent CN 1165032A bằng phương pháp dùng enzyme phá vách tế bào kết hợp

với phương pháp nghiền siêu âm thì tỉ lệ phá vách của công trình trên là khoảng hơn

80%. Với 2g bào tử họ ngâm nước ấm 24 giờ rồi dùng 100ml dịch enzyme thương

mại gồm lysozyme 1%, snailase 1,5%, cellulase 1%, hemicellulase 1%, sau khi ủ bào

tử với dịch enzyme trên trong 5 giờ, người ta đem lạnh đông bào tử đến - 20oC, rồi rã

đông, tiếp tục lặp lại 3 lần, cuối cùng dùng máy nghiền siêu âm, phương pháp của

patent CN 1165032A cho kết quả phá vỡ khoảng trên 80%. So sánh điều kiện thí

83

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

nghiệm, thiết bị máy móc và phương pháp thực hiện thì kết quả của đồ án này đạt

24,45%. Trong quá trình thực hiện thí nghiệm xảy ra hiện tượng bào tử nấm linh chi

bị lắng do điều kiện thí nghiệm ủ tĩnh trong bể điều nhiệt, làm cho dịch enzyme chỉ

tiếp xúc bề mặt phía trên lớp bào tử lắng gây hạn chế đến hiệu quả phá vách của hỗn

hợp dịch. Vì vậy, đề tài cần được khảo sát thêm ở điều kiện ủ khuấy đảo và sóng siêu

âm để xem xét cải tiến hiệu quả phương pháp.

84

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

- Enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và chế

phẩm C20032 hoạt động tốt ở 50oC, pH5.

- Chỉ sử dụng một loại dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum hoặc chế

phẩm C20032 để phá vách bào tử nấm linh chi thì hiệu quả rất thấp không

đáng kể, đòi hỏi phải có sự kết hợp cả 2 loại dịch enzyme.

- Khi kết hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và chế phẩm

C20032 ở nồng độ 10% theo tỉ lệ 1 DNC : 1 EC 10% đem ủ ở 50oC thì tỉ lệ

phá vách bào tử nấm linh chi đạt cao nhất là 24,45% trong điều kiện thí

nghiệm.

85

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Sơ đồ 4.1 Quy trình đề nghị phá vỡ vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp

enzyme

1g bào tử nấm linh chi 20ml nước cất

Lạnh đông 12 tiếng ở -4oC

Rã đông ở nhiệt độ phòng

Nước Ly tâm 4000 vòng/phút/20 phút

Ngâm bào tử trong DNC và EC 10% ở pH5 theo tỉ lệ thể tích 1:1 (15ml : 15 ml) (50oC, 10 ngày)

Bất hoạt enzyme

Trích ly bào tử

Thu chất chiết

86

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

4.2 Kiến nghị

- Khảo sát thêm phương pháp hỗ trợ tiền xử lý phá vách bào tử nấm linh chi (sử

dụng sóng siêu âm, vi sóng, sử dụng nhiệt siêu thấp kết hợp enzyme…)

- Tìm kiếm thêm một chế phẩm enzyme thương mại khác có khả năng xử lý phá

vách bào tử nấm linh chi

- Tìm kiếm thêm chủng nấm mốc kí sinh trên nấm Linh chi có khả năng sản

sinh enzyme giúp phá vách bào tử nấm hiệu quả hơn.

- Điều kiện thí nghiệm chưa đầy đủ trang thiết bị khiến kết quả thí nghiệm có

thể bị ảnh hưởng do có hiện tượng kết lắng bào tử dưới đáy ống nghiệm. Cần

khảo sát trên máy lắc điều nhiệt để so sánh kết quả.

- Nghiên cứu quy trình trích ly hoạt chất sau khi phá vách bào tử.

- Định lượng được hoạt chất sau trích ly

87

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

TÀI LIỆU THAM KHẢO

 Tài liệu tiếng Việt

1. Nguyễn Lân Dũng (2010) Công nghệ nuôi trồng nấm. Tập 2, NXB Nông

nghiệp.

2. Nguyễn Minh Khang, (2005). Khảo sát sinh trưởng nấm Linh Chi đen

(Amauroderma subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan –

Việt Nam. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nông

Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

3. Trần Thị Huỳnh Mai. Tổng quan về quy trình phá vỡ bào tử nấm linh chi và

bước đầu nghiên cứu điều kiện nảy mầm của bào tử này. Đồ án tốt nghiệp Kỹ

sư Công nghệ Sinh học, Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

4. Nguyễn Kim Phi Phụng, (2007) Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB

Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

5. Lê Xuân Thám, (1996). Nấm Linh Chi nguồn dược liệu quý ở Việt Nam. Nhà

xuất bản Mũi Cà Mau.

6. Nguyễn Thị Sáu (2014). Bài giảng công nghệ trồng và chế biến nấm, Trường

Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh.

7. Nguyễn Văn Bá và cộng sự (2005). Giáo trình môn nấm học, Viện nghiên cứu

và phát triển công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ

8. Đinh Minh Hiệp (2007). Hệ chitinase của Trichoderma và vai trò trong kiểm

soát sinh học, Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học

tự nhiên TP.HCM

9. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết. Thí nghiệm công

nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM

10. Đinh Minh Hiệp (2007). Hệ chitinase của Trichoderma và vai trò trong kiểm

soát sinh học, Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học

tự nhiên TP.HCM

11. Nguyễn Hoài Hương, Đỗ Thị Tuyến (2014). Giáo trình thực hành công nghệ

enzyme, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh.

12. Đồng Thị Ngọc (2015). Bước đầu nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi,

88

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

đồ án tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí

Minh.

13. Nguyễn Trường Thọ (2004), “Luận văn thạc sĩ Nghiên cứu sử dụng nấm mốc

Trichoderma harzianum phòng bệnh héo rũ cây dưa leo do Pythium sp.”, ĐH

 Tài liệu tiếng Anh

khoa học tự nhiên, ĐHQG. TPHCM

14. Boh B, et al. Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds.

Biotechnol Annu Rev, 2007.

15. Borchers AT, et al. Mushrooms, tumors, and immunity. Proc Soc Exp Biol

Med, 1999.

16. Báo cáo FDA 1/8/1999.

17. Borchers AT, et al. Mushrooms, tumors, and immunity. Proc Soc Exp Biol

Med, 1999.

18. Bao X, et al. Structural and immunological studies of a major polysaccharide

from spores of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. Carbohydr Res, 2005.

19. Bao XF, et al. Structural features of immunologically active polysaccharides

from Ganoderma lucidum. Phytochemistry, 2002.

20. Bingji Ma, Wei Ren, Yan Zhou, Jinchuan Ma, Yuan Ruan, and Chun-Nan

Wen, Triterpenoids from the spores of Ganoderma lucidum. N Am J Med Sci.

2011 Nov; 3(11): 495–498.

21. Chen RY, Yu DQ. Studies on the triterpenoid constituents of the spores of

Ganoderma Lucidum Karst. J Chine Pharm Sci. 1993;2(2):91–96.

22. Chen RY, Yu DQ. Application of 2D NMR techniques in the structure

determination of ganosporelactone A and B. Acta Pharm Sin. 1991;26(6):430–

436.

23. Chaiyavat Chaiyasut*, Chakkrapong Kruatama and Sasithorn Sirilun,

Breaking the spores of Ganoderma lucidum by fermentation with

Lactobacillus plantarum. Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of

Pharmacy, Chiangmai University, Thailand. Accepted 30 September, 2010.

89

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

24. Chen , Zhong JJ. p53 is important for the anti-invasion of ganoderic acid T in

human carcinoma cells. Phytomedicine, 2010.

25. Chen X, et al. Monitoring of immune responses to a herbal immuno-modulator

in patients with advanced colorectal cancer. Int Immunopharmacol. (1999).

26. Cao LZ, Lin ZB. Regulation on maturation and function of dendritic cells by

Ganoderma lucidum polysaccharides. Immunol Lett. (2002).

27. De-hui Dai, Wei-lian Hu, Guang-rong Huang and Wei Li. 2011. Purification

and characterization of a novel extracellular chitinase from thermophilic

Bacillus sp. Hu1. African Journal of Biotechnology Vol. 10(13), pp. 24762485.

28. Heim, Y. R. Li, Q. Chen, Z. Lin, D. Xia, L. Ma, 1992. Chemical studies on

immunologically active polysaccharides of Ganoderma lucidum (Leyss. Ex

Fr.) Karst. Chung – Kuo – Chung – Yao – Tsa – Chih. 17 (4):266 – 8. 256

(1992).

29. Hikino H, et al. Isolation and hypoglycemic activity of ganoderans A and B,

glycans of Ganoderma lucidum fruit bodies. Planta Med. (1985).

30. Hikino H, et al. Mechanisms of hypoglycemic activity of ganoderan B: a

glycan of Ganoderma lucidum fruit bodies. Planta Med. (1989).

31. Hansen, L. 1958. On the anatomy of the Danish species of Ganoderma. Bot.

Tidsskrifft 54:333 – 352 (1958).

32. Hou CY, Sun YT, Yan L, et al. Studies on the chemical constituents of the

spores from Ganoderma Lucidum. Acta Bot Sin. 1988;30(1):66–70.

33. Jungjing MA, Zhengyi FU, Peiyan MA, Yanli SU, Qingjie Z (2007).

Breaking and characteristics of Ganoderma lucidum spores by high speed

centrifugal shearing pulverizer. J. W uhan Univ. Tech-Mater. Sci. Ed. 22: 617-

621.

34. Jiang J, et al. Ganoderic acids suppress growth and invasive behavior of breast

cancer cells by modulating AP-1 and NF-kappaB signaling. Int J Mol Med.

(2008).

35. Jose D. Connolly, Rober A. Hill. Dictionary of terpenoid. Volume 1. Chapman

& Hall. London. 1991.

90

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

36. Lui X. J.,1994. Hepatopathy and uterofunctional Bleeding mainly Treated

with Ganoderma lucidum. Proc. 94 Inter. Sym. On Ganoderma Res., p58-9.

Beijing, China, 1994.

37. Lee I, et al. Selective cholinesterase inhibition by lanostane triterpenes from

fruiting bodies of Ganoderma lucidum. Bioorg Med Chem Lett. (2011).

38. Lin YL, et al. An immunomodulatory protein, Ling Zhi-8, induced activation

and maturation of human monocyte-derived dendritic cells by the NF-kappaB

and MAPK pathways. J Leukoc Biol. (2009).

39. Mims. C. W., and F. Seabury. 1989. Ultrastructure of tube formation and

basidiospores development in Ganoderma lucidum Mycologia 81: 754 – 764

(1989)

40. Min BS, Nakamura N, Miyashiro H, et al. Triterpenes from the spores of

Ganoderma Lucidum and their inhibitory activity against HIV-1 protease.

Chem Pharm Bull.1998;46(10):1607–1612

41. Min BS, Gao JJ, Nakamura N, et al. Triterpenes from the spores of Ganoderma

Lucidum and their cytotoxicity against meth-A and LLC tumor cells. Chem

Pharm Bull.1998;48(7):1026–1033.

42. Mau JL, Lin HC, Chen CC. Antioxidant properties of several medicinal

mushrooms. J Agric Food Chem. (2001).

43. Ma J, et al. New lanostanoids from the mushroom Ganoderma lucidum. J Nat

Prod. (2002).

44. Perreau. J. 1973. Contribution aletude des ornaments sporaux chez

Ganodermes. Rev mycol. Paris 37:241 – 252 (1973).

45. Wachtel-Galor S, Tomlinson B, Benzie IF. Ganoderma lucidum ("Lingzhi"),

a Chinese medicinal mushroom: biomarker responses in a controlled human

supplementation study. Br J Nutr. (2011).

46. Wu Y, Wang D. A new class of natural glycopeptides with sugar

moietydependent antioxidant activities derived from Ganoderma lucidum

fruiting bodies. J Proteome Res. (2009).

91

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

47. Zhao, J.D.,Zhang, X.Q., 1994. Resources and taxonomy of lingzhi Ganoderma

in China. Proc. 94 inter. Sym. On Ganoderma Res.:44 – 47. Beijing, China,

1994.

48. Richard A. Dixon, 2013, Microbiology: Break down the walls, Nature 493,

36 – 37, ISSN 0028 – 0836

49. Patent CN 1165032A, Method for breaking cell wall of Ganoderma lucidum

spore, 1997

50. Altomare, C.Norwell, W.A. Bjokman, T. Harman, G.E (1999), “Solubiliation

of phosphate and micronutrients by the plant – growth promoting and

biocontrol fungus Trichoderma harzianum Rifai 1295 – 22”, Applied and

Environmental Microbiology, pp. 2926 – 2933.

51. De la Cruz, J., Llobell, A (1999), “Purification and properties of a basis endo-

β-1,6-glucanase from the antagonistic fungus Trichoderma harzianum”,

Journal of Biochemistry, vol 265, pp.145 – 151.

52. De la Cruz, J., Pintor-Toro, J.A., Bennitez, T., LLobel, A., Romero, L., C.

(1995), “ A novel endo-β-1,3-glucanase, BGN13.1 involved in the

mycoparasitism of Trichoderma harzianum”, Journal of Bacteriology, vol

177, pp. 6397 – 6945.

53. El-Katatny, M.H., Gudelj, M., Robra, K.H., Elnaghy, M.A., Gubitz, G.M.

(2000), “Characterization of chitinase and an endo-β-1,3-glucanase from

Trichoderma harzianum”, Applied Microbiology and Biotechnology, vol 10,

pp.1 – 17

54. Harman, G.E, Howell, C.R., Viterbo, A.Chet, I., Lorito, M (2004),

“Trichoderma species – opportunistic, avirulent plant symbionts” Nature

reviews microbiology, vol. 154, pp 131 – 135

55. Lorito, M.Farkas, V., Rebuffat, S., Kubicek, C.P (1996), “Cell wall synthesis

is a major target of mycoparasitic antagonism by Trichoderma harzianum”,

Journal of Bacteriology, pp. 6328-6385

56. Lorito, M., Petebauer, C., Hayes, C.K., Harman, G.E (1994), “ Synergistic

interaction between fungal cell wall degrading enzymes and different

92

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

antifungal compounds enhances inhibition of spore germination”,

Microbiology, vol. 140, vol 178, pp 623 – 629.

 Tài liệu internet

57. https://lib.lhu.edu.vn/ViewFile/10103

58. Method ME015. Extraction of triterpenoid saponins from plants. 866-995-

5100 | mwave@milestonesci.com

59. Phytother. Res.(2008), DOI: 10.1002/ptr.2707 (Zhang

et al.). www.interscience.wiley.com

60. http://books.google.com.vn/books?id=MxFn0gNqEWMC&pg=PA113&lpg=

P

A113&dq=optimum+temperature+for+chitinase&source=bl&ots=yknWbO

MMME

&sig=pt5A8prvnO337mhdrrFw9y2lisE&hl=vi&sa=X&ei=4qOU9X5H8qws

QT5loDYCw&ved=0CEEQ6AEwAw#v=onepage&q=optimum%20te

mperature%20for%20chitinase&f=false

61. http://books.google.com.vn/books?id=SBb4AgAAQBAJ&pg=PA145&lpg=

PA

145&dq=invertase+from+trichoderma+harzianum&source=bl&ots=EdlpYo3

Hd3&

sig=G0IfLKqGeorHtG4rVeD6lgI_Id0&hl=vi&sa=X&ei=qQbAU9_2NML0

8QXp8

oKwBw&ved=0CEUQ6AEwAw#v=onepage&q=sucrose&f=false

62. http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-tim-hieu-ve-chitin-chitosan-52125/

63. https://www.flickr.com

64. https://www.shutterstock.com

65. http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.htm#TopOfPage

66. http://www.aspergillus.org.uk/content/comparison-between-five-lysing-

enzyme-preparations-protoplast-formation-aspergillus

93

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

PHỤ LỤC

Bảng phụ lục 1 - Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ dưới kính hiển vi khi thay đổi thể tích yếu tố enzyme kết hợp ở ngày thứ 2

Đối chứng NT1 NT2

NT3 0,85% ± 0,22 NT4 0,71% ± 0,24 NT5

%

5,33% ± 1,19 4,19% ± 1,01 0,78% ± 0,33

% Bảng phụ lục 2 - Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ dưới kính hiển vi khi thay đổi thể tích yếu tố enzyme kết hợp ở ngày thứ 3

Đối chứng NT1 NT2

NT3 2,49% ± 0,33 NT4 3,41% ± 0,64 NT5 %

% 13,29% ± 0,81 8,03% ± 0,65 4,98% ± 0,53

1

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Bảng phụ lục 3 - Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ dưới kính hiển vi khi thay đổi thể

tích yếu tố enzyme kết hợp ở ngày thứ 4

Đối chứng NT1 NT2

NT3 3,20% ± 0,85 NT4 3,91% ± 1,05 NT5

%

18,55% ± 0,85 10,95% ± 1,17 6,47% ± 0,96

% Bảng phụ lục 4 - Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ dưới kính hiển vi khi thay đổi nồng

độ chế phẩm C20032 ở ngày thứ 4

Đối chứng NT1 NT2

NT3 18,98% ± 0,57 NT4 14,78% ± 0,89 NT5

%

% 5,19% ± 0,86 3,91% ± 0,65 2,70% ± 0,65

2

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Bảng phụ lục 6 - Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ dưới kính hiển vi khi thay đổi nồng

độ chế phẩm C20032 ở ngày thứ 7

Đối chứng NT1 NT2

NT3 21,46% ± 0,96 NT4 17,20% ± 0,81 NT5 %

6,47% ± 0,75 4,83% ± 0,65 3,70% ± 0,69

% Bảng phụ lục 7 - Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ dưới kính hiển vi khi thay đổi nồng

độ chế phẩm C20032 ở ngày thứ 10

Đối chứng NT1 NT2

NT3 24,45% ± 1,86 NT4 18,76% ± 1,54 NT5

%

% 7,39% ± 0,65 6,18% ± 0,86 4,26% ± 0,77

3

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

KẾT QUẢ XỬ LÝ ANOVA

XỬ LÝ ANOVA ĐẾM HỒNG CẦU TẾ BÀO NGÀY 4 NGÀY 7 VÀ NGÀY 10

VỚI SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ ENZYME CHẾ PHẨM (10%, 5%, 1%, 0.5%,

0.1%)

GIẢI THÍCH NT1: 3.93 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% NT2: 3.93 U/g DNC + 3.20 U/g EC 5% NT3: 3.93 U/g DNC + 0.64 U/g EC 1% NT4: 3.93 U/g DNC + 0.32 U/g EC 0.5% NT5: 3.93 U/g DNC + 0.064 U/g EC 0.1%

KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 4

The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 1

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

Ngay4 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15

The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 2

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 639.1753733 159.7938433 295.07 <.0001

Error 10 5.4154000 0.5415400

Corrected Total 14 644.5907733

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.991599 8.076689 0.735894 9.111333

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

Ngay4 4 639.1753733 159.7938433 295.07 <.0001

4

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 3

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.54154

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 1.3388

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Ngay4

A 18.9767 3 NT1

B 14.7833 3 NT2

C 5.1867 3 NT3

C

D C 3.9100 3 NT4

D

D 2.7000 3 NT5

The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 4

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.54154

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 1.9043

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Ngay4

A 18.9767 3 NT1

B 14.7833 3 NT2

C 5.1867 3 NT3

C

D C 3.9100 3 NT4

D

D 2.7000 3 NT5

5

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 7

The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 5

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

Ngay7 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used

The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 6

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 778.5574400 194.6393600 321.16 <.0001

Error 10 6.0606000 0.6060600

Corrected Total 14 784.6180400

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.992276 7.253993 0.778499 10.73200

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

Ngay7 4 778.5574400 194.6393600 321.16 <.0001

The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 7

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.60606

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 1.4163

6

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Ngay7

A 21.4667 3 NT1

B 17.1967 3 NT2

C 6.4700 3 NT3

D 4.8300 3 NT4

D

D 3.6967 3 NT5

The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 8

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.60606

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 2.0145

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Ngay7

A 21.4667 3 NT1

B 17.1967 3 NT2

C 6.4700 3 NT3

C

D C 4.8300 3 NT4

D

D 3.6967 3 NT5

7

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 10

The SAS System 20:20 Thursday, June 20, 2016 1

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

Ngay10 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15

The SAS System 20:20 Thursday, June 20, 2016 2

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 956.2338667 239.0584667 175.57 <.0001

Error 10 13.6158667 1.3615867

Corrected Total 14 969.8497333

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.985961 9.535852 1.166870 12.23667

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

Ngay10 4 956.2338667 239.0584667 175.57 <.0001

The SAS System 20:20 Thursday, June 20, 2016 3

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 1.361587

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 2.1228

8

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Ngay10

A 24.5833 3 NT1

B 18.7633 3 NT2

C 7.3900 3 NT3

C

D C 6.1833 3 NT4

D

D 4.2633 3 NT5

The SAS System 20:20 Thursday, June 20, 2016 4

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 1.361587

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 3.0195

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Ngay10

A 24.5833 3 NT1

B 18.7633 3 NT2

C 7.3900 3 NT3

C

D C 6.1833 3 NT4

D

D 4.2633 3 NT5

9

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

XỬ LÝ ANOVA ĐẾM HỒNG CẦU TẾ BÀO NGÀY 2, NGÀY 3, NGÀY 4

VỚI SỰ THAY ĐỔI TỈ LỆ ENZYME PHỐI HỢP GIỮA DỊCH NUÔI CẤY

VÀ ENZYME CHẾ PHẨM

GIẢI THÍCH

NT1: 3.93 U/g DNC NT2: 6.40 U/g EC 10% NT3: 3.93 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% NT4: 3.93 U/g DNC + 12.8 U/g EC 10% NT5: 7.86 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10%

KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 2

The SAS System 09:20 Thursday, July 15, 2016 1

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NGAY2 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15

The SAS System 09:20 Thursday, July 15, 2016 2

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 58.97836000 14.74459000 27.93 <.0001

Error 10 5.27940000 0.52794000

Corrected Total 14 64.25776000

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.917840 30.60635 0.726595 2.374000

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NGAY2 4 58.97836000 14.74459000 27.93 <.0001

The SAS System 09:20 Thursday, July 15, 2016 3

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

10

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.52794

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 1.3219

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NGAY2

A 5.3300 3 NT3

A

A 4.1933 3 NT4

B 0.8533 3 NT1

B

B 0.7833 3 NT5

B

B 0.7100 3 NT2

The SAS System 09:20 Thursday, July 15, 2016 4

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.52794

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 1.8802

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NGAY2

A 5.3300 3 NT3

A

A 4.1933 3 NT4

B 0.8533 3 NT1

B

B 0.7833 3 NT5

B

B 0.7100 3 NT2

11

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 3

The SAS System 22:01 Thursday, June 20, 2016 1

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

Ngay3 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15

The SAS System 22:01 Thursday, June 20, 2016 2

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 229.1097733 57.2774433 153.00 <.0001

Error 10 3.7436000 0.3743600

Corrected Total 14 232.8533733

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.983923 9.493891 0.611850 6.444667

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

Ngay3 4 229.1097733 57.2774433 153.00 <.0001

The SAS System 22:01 Thursday, June 20, 2016 3

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.37436

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 1.1131

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Ngay3

A 13.2933 3 NT3

B 8.0300 3 NT4

C 5.0033 3 NT5

D 3.4100 3 NT2

D

D 2.4867 3 NT1

12

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

The SAS System 22:01 Thursday, June 20, 2016 4

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.37436

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 1.5833

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Ngay3

A 13.2933 3 NT3

B 8.0300 3 NT4

C 5.0033 3 NT5

D 3.4100 3 NT2

D

D 2.4867 3 NT1

KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 4

The SAS System 20:20 Thursday, June 20, 2016 4

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 1.361587

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 3.0195

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Ngay10

A 24.5833 3 NT1

B 18.7633 3 NT2

C 7.3900 3 NT3

C

D C 6.1833 3 NT4

D

D 4.2633 3 NT5

13

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi The SAS System 21:48 Thursday, June 20, 2016 1

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

Ngay4 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15

The SAS System 21:48 Thursday, June 20, 2016 2

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 470.0384933 117.5096233 135.53 <.0001

Error 10 8.6706000 0.8670600

Corrected Total 14 478.7090933

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.981888 10.72683 0.931161 8.680667

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

Ngay4 4 470.0384933 117.5096233 135.53 <.0001

The SAS System 21:48 Thursday, June 20, 2016 3

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.86706

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 1.694

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Ngay4

A 18.5500 3 NT3

B 10.9433 3 NT4

C 6.4667 3 NT5

D 3.9100 3 NT2

D

D 3.5333 3 NT1

14

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi The SAS System 21:48 Thursday, June 20, 2016 4

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.86706

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 2.4096

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Ngay4

A 18.5500 3 NT3

B 10.9433 3 NT4

C 6.4667 3 NT5

D 3.9100 3 NT2

D

D 3.5333 3 NT1

KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ ĐẾM HỒNG CẦU TẾ BÀO VỚI SỰ THAY

ĐỔI THỂ TÍCH DỊCH NUÔI CẤY VÀ ENZYME CHẾ PHẨM

GIẢI THÍCH

NT1: 3.93 U/g DNC NT2: 6.40 U/g EC 10% NT3: 3.93 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% NT4: 3.93 U/g DNC + 12.8 U/g EC 10% NT5: 7.86 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10%

KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 2

The SAS System 19:28 Thursday, July 5, 2016 1

The MEANS Procedure

Variable N Mean Std Dev

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

NT1 3 0.8533333 0.2150194

NT2 3 0.7100000 0.2424871

NT3 3 5.3300000 1.1889912

NT4 3 4.1933333 1.0075879

NT5 3 0.7833333 0.3251666

Ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

15

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 3

The SAS System 19:28 Thursday, July 5, 2016 2

The MEANS Procedure

Variable N Mean Std Dev

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

NT1 3 2.4866667 0.3262412

NT2 3 3.4100000 0.6400000

NT3 3 13.2933333 0.8064945

NT4 3 8.0300000 0.6513831

NT5 3 4.9733333 0.5337915

Ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 4

The SAS System 19:28 Thursday, July 5, 2016 3

The MEANS Procedure

Variable N Mean Std Dev

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

NT1 3 3.2000000 0.8500000

NT2 3 3.9100000 1.0531382

NT3 3 18.5500000 0.8500000

NT4 3 10.9433333 1.1717224

NT5 3 6.4666667 0.9617345

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ ĐẾM HỒNG CẦU TẾ BÀO VỚI SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ ENZYME CHẾ PHẨM (10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%)

GIẢI THÍCH NT1: 3.93 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% NT2: 3.93 U/g DNC + 3.20 U/g EC 5% NT3: 3.93 U/g DNC + 0.64 U/g EC 1% NT4: 3.93 U/g DNC + 0.32 U/g EC 0.5% NT5: 3.93 U/g DNC + 0.064 U/g EC 0.1%

KẾT QUẢ XỦ LÝ NGÀY 4

The SAS System 19:57 Thursday, July 5, 2016 1

The MEANS Procedure

Variable N Mean Std Dev

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

NT1 3 18.9766667 0.5669509

NT2 3 14.7833333 0.8895130

NT3 3 5.1866667 0.8639637

NT4 3 3.9100000 0.6513831

NT5 3 2.7000000 0.6513831

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

16

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

KẾT QUẢ XỦ LÝ NGÀY 7

The SAS System 19:57 Thursday, July 5, 2016 2

The MEANS Procedure

Variable N Mean Std Dev

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

NT1 3 21.4666667 0.9620984

NT2 3 17.1966667 0.8064945

NT3 3 6.4700000 0.7474624

NT4 3 4.8300000 0.6513831

NT5 3 3.6966667 0.6864644

Ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

KẾT QUẢ XỦ LÝ NGÀY 10

The SAS System 19:57 Thursday, July 5, 2016 3

The MEANS Procedure

Variable N Mean Std Dev

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

NT1 3 24.4500000 1.8610750

NT2 3 18.7633333 1.5392964

NT3 3 7.3900000 0.6513831

NT4 3 6.1833333 0.8550049

NT5 3 4.2633333 0.7682664

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

The SAS System 20:20 Thursday, July 5, 2016 1

The MEANS Procedure

Variable N Mean Std Dev

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

nhietdo30 3 0.1104865 0.0032428

nhietdo40 3 0.1261317 0.0122975

nhietdo50 3 0.1272248 0.0097314

nhietdo60 3 0.1070022 0.0031774

nhietdo70 3 0.0367013 0.0139166

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE TỪ DỊCH NUÔI CẤY NẤM TRICHODERMA T2 Ở pH VÀ NHIỆT ĐỘ KHÁC NHAU KẾT QUẢ XỬ LÝ HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE Ở PH4

17

Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi

KẾT QUẢ XỬ LÝ HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE Ở PH5

The SAS System 20:20 Thursday, July 5, 2016 2

The MEANS Procedure

Variable N Mean Std Dev

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

nhietdo30 3 0.1508634 0.0041619

nhietdo40 3 0.1568755 0.0074831

nhietdo50 3 0.1697196 0.0010518

nhietdo60 3 0.1503851 0.0038088

nhietdo70 3 0.0842517 0.0200863

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

KẾT QUẢ XỬ LÝ HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE Ở PH6

The SAS System 20:20 Thursday, July 5, 2016 3

The MEANS Procedure

Variable N Mean Std Dev

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

nhietdo30 3 0.1337151 0.0084183

nhietdo40 3 0.1349449 0.0088132

nhietdo50 3 0.1428017 0.0040076

nhietdo60 3 0.1274297 0.0018933

nhietdo70 3 0.0772148 0.0108499

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

KẾT QUẢ XỬ LÝ HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE Ở PH7

The SAS System 20:20 Thursday, July 5, 2016 4

The MEANS Procedure

Variable N Mean Std Dev

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

nhietdo30 3 0.1049526 0.0016693

nhietdo40 3 0.1057724 0.0015108

nhietdo50 3 0.1177284 0.0092663

nhietdo60 3 0.1085052 0.0040372

nhietdo70 3 0.0940214 0.0217549

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE CÓ TRONG CHẾ PHẨM CELLULASE Ở PH5

The SAS System 20:35 Thursday, July 5, 2016 1

The MEANS Procedure Variable N Mean Std Dev ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ nhietdo30 3 2.3447290 0.0204959 nhietdo40 3 2.4540404 0.0426656 nhietdo50 3 2.4813683 0.0313080 nhietdo60 3 2.2695775 0.0313080 nhietdo70 3 2.1875939 0.0118333 ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

18