BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
THỰC NGHIỆM CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP DOUBLE
STRANDED RNA VÀO NGHIÊN CỨU CHUYỂN ĐỔI
GIỚI TÍNH TÔM CÀNG XANH
Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879)
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn : Th.S BÙI THỊ LIÊN HÀ
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM HOÀNG
MSSV: 0851110091 Lớp: 08DSH4
TP. Hồ Chí Minh, 2012
Đồ án tốt nghiệp
1
MỞ ĐẦU
Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) (De Man, 1879) là một trong
những loài giáp xác thương mại rất quan trọng, được đánh bắt và nuôi trồng rộng rãi
và phân bố tự nhiên trong các ruộng lúa (New, 2005). Năm 1987, sản lượng M.
rosenbergii toàn cầu ước tính đạt khoảng 27000 tấn mỗi năm (New, 1990). Một số
lượng lớn được sản xuất ở Trung Quốc và mở rộng nhanh chóng ra Ấn Độ và
Bangladesh (New, 2005). Ngày nay, nó được nuôi rộng rãi ở các nước trên thế giới.
Trong thập kỷ qua, sản lượng trung bình mỗi năm của M. rosenbergii tăng 9-35,5%
về giá trị. Năm 1993, tổng sản lượng là 17,164 tấn, trị giá 116,799,000 USD và năm
2005 đạt 205,033 tấn với trị giá 896,263,000 USD. Việc nuôi trồng tôm càng xanh
đóng góp lớn vào ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu, cả về số lượng và giá trị. M.
rosenbergii được nuôi nhiều ở Châu Á và một số khu vực khác như Châu Phi,
Israel, Trung và Nam Mỹ (Nhan, 2009).
Tại Việt Nam, tôm càng xanh là đối tượng nuôi bản địa được nông dân ưa
thích, được nhiều địa phương xác định là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao, đặc
biệt là những khu vực nuôi tôm thương mại ở lưu vực sông Mê Kông. Do đó nhu
cầu về con giống cho việc nuôi đại trà là rất lớn.
Tuy nhiên, trong quá trình tăng trưởng, con đực thường lớn nhanh hơn con
cái. Khi chiều dài cơ thể đạt trung bình 8-14 cm và trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát
triển của con đực và con cái tương đương nhau. Nhưng khi chiều dài cơ thể vượt
quá 14 cm, con đực thường lớn nhanh hơn con cái (Lê Quang Khôi, 2009). Do ở
giai đoạn này con cái ngưng phát triển và tập trung dưỡng chất cho việc sinh sản
(Ra`anan và Cohen, 1984). Tôm đực lớn nhất có thể đạt 110 g, trong khi tôm cái lớn
nhất chỉ đạt 50 g sau 7 tháng nuôi (Lê Quang Khôi, 2009). Đây là một vấn đề gây
trở ngại lớn cho nghề nuôi tôm càng xanh thương phẩm vì con có kích thước càng
lớn thì giá thành càng cao và sản lượng thu hoạch cũng sẽ tăng cao.
Nghiên cứu của Sagi và Ra`anan trong năm 1988 đã chứng minh rằng việc
nuôi tôm càng xanh toàn đực đạt sản lượng cao hơn việc nuôi toàn cái hay đực và
cái trong cùng quần thể. Khối lượng trung bình của mỗi quần thể lần lượt là 473
Đồ án tốt nghiệp
2
g/m2, 248 g/m2 và 260 g/m2. Những nhà khoa học Ả Rập Xê Út cũng đã báo cáo
những kết quả tương tự khi tiến hành thí nghiệm nuôi tôm toàn đực, toàn cái và hỗn
hợp cả đực và cái (Siddiqui, 1997). Điều này thể hiện rằng việc nuôi tôm càng xanh
toàn đực đã làm tăng sản lượng một cách đáng kể và mang lại lợi nhuận cao hơn
việc nuôi toàn cái hay hỗn hợp đực và cái. Do đó, sự phát triển những kỹ thuật cho
việc sản xuất quần thể toàn đực là nhu cầu cần thiết cho việc nuôi tôm càng xanh.
Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh chức năng làm bất hoạt gene của
iRNA trong tế bào tôm (Estrada và ctv, 2007). Và đây là một trong những công cụ
có tiềm năng đáp ứng cho việc sản xuất ra tôm càng xanh toàn đực. Kỹ thuật bất
hoạt RNA (Guo và Kempheus, 1995) đã được sử dụng như một công cụ hiệu quả để
làm bất hoạt các sản phẩm gene bằng cách tiêm RNA mạch đôi vào trong cơ thể của
nhiều loài giáp xác (Tiu, 2007; Hiu, 2008). Ý tưởng tạo ra con cái giả bằng cách
làm bất hoạt RNA thông tin mã hóa gene tuyến đực insuline-like của tôm càng xanh
(Macrobrachium rosenbergii insuline-like androgenic gland, Mr-IAG) bằng RNA
mạch đôi (dsRNA) đã được thực hiện thành công tại quy mô phòng thí nghiệm
(Ventura và ctv, 2009). Kể từ đó, kỹ thuật bất hoạt RNA hứa hẹn như là một hướng
tiếp cận mới để tạo ra quần thể tôm toàn đực cho việc nuôi tôm càng xanh thương
mại.
Xuất phát từ những nhu cầu con giống tôm càng xanh đực từ thị trường thì
đề tài “Thực nghiệm công nghệ tổng hợp double stranded RNA vào nghiên cứu
chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man,
1879)” là cần thiết và đang được nhiều mong đợi.
Mục tiêu đề tài là ứng dụng dsRNA để tạo ra tôm càng xanh cái giả, từ con
cái giả này sẽ sản xuất ra tôm càng xanh toàn đực để đáp ứng nhu cầu cho việc nuôi
tôm càng xanh thương phẩm.
Những nội dung cần thực hiện là:
+ Tổng hợp Mr-IAG RNA mạch đôi cho kỹ thuật bất hoạt RNA.
+ Kiểm tra hiệu quả của Mr-IAG RNA mạch đôi đối với việc chuyển
đổi giới tính của tôm càng xanh với các nồng độ và tần suất tiêm khác nhau.
Đồ án tốt nghiệp
3
+ Kiểm tra ảnh hưởng của thời gian tiêm Mr-IAG RNA mạch đôi lên
sự tạo thành tôm càng xanh cái giả.
Phương pháp nghiên cứu của đề tài là thu thập thông tin từ các bài báo khoa
học đã công bố, các nghiên cứu trong và ngoài nước, thu thập các số liệu thực
nghiệm và xử lý bằng phần mềm excel.
Các kết quả đạt được của đề tài:
+ Tổng hợp thành công dsRNA bằng bộ kit Promega.
+ Khảo sát được nồng độ tiêm dsRNA 1,25 µg/g, tần suất tiêm 1
lần/tuần là có thể làm bất hoạt gene mã hóa cho hormone tuyến đực ở tôm PL25 để
tạo ra tôm càng xanh cái giả.
+ Thời gian tiêm dsRNA phải kéo dài đến khi con cái giả thành thục
sinh sản.
Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
+ Chương 1. Tổng quan: giới thiệu sơ lược về tôm càng xanh
Macrobrachium rosenbergii, tổng quan về tuyến đực, cơ chế làm bất hoạt gene của
iRNA.
+ Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: vật liệu sinh học là
tôm PL25, phương pháp tổng hợp dsRNA theo bộ kit Promega, thí nghiệm tiêm
được thực hiện với 3 nồng độ tiêm là 5 µg/g; 2,5 µg/g và 1,25 µg/g và các tần suất
tiêm là 3 lần/ tuần, 2 lần/tuần và 1 lần/tuần. Thí nghiệm thời gian tiêm được thực
hiện trong vào 4 tháng với nồng độ tiêm là 1,25 µg/g và tần suất tiêm là 1 lần/tuần.
+ Chương 3. Kết quả và thảo luận: nêu lên các kết quả đạt được là
tổng hợp được dsRNA, nồng độ và tần suất tiêm dsRNA tốt nhất, tạo được con cái
giả đến tháng thứ 4 của thí nghiệm.
+ Chương 4. Kết luận và đề nghị: một số kết quả mà đề tài đã đạt
được và đưa ra một số kiến nghị để làm hướng nghiên cứu trong tương lai.
Đồ án tốt nghiệp
4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Phân loại (New, 2002)
Tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1897), là loài đầu tiên
được biết đến trong giống Macrobrachium và được công nhận lần đầu tiên vào năm
1705. Quá trình đặt tên cho tôm càng xanh cả giống và loài đã gặp khá nhiều khó
khăn trong lịch sử. Trong quá khứ tên của giống bao gồm cả Cancer (Astacus) và
Palaemon. Trước kia, tên M. rosenbergii bao gồm Palaemon carcinus, P. dacqueti,
và P. rosenbergii và đến năm 1959 tên khoa học Macrobracchium rosenbergii xuất
hiện và được chấp nhận phổ biến ở hầu hết các nước.
Giới: Animalia
Ngành: Arthropoda
Ngành phụ: Crustacea
Lớp: Malacostraca
Bộ: Decapoda
Bộ phụ: Pleocyemata
Phân bộ: Caridea
Họ: Palaemonidae
Họ phụ: Palaemoninae
Giống: Macrobrachium
Loài: M. rosenbergii (De Man, 1879)
Tên tiếng anh: Giant freshwater prawn.
1.2. Đặc điểm sinh học của tôm càng xanh
1.2.1. Phân bố
Tôm càng xanh M. rosenbergii phân bố tự nhiên ở Đông Nam Á, các nước ở
Nam Thái Bình Dương, phía Bắc châu Đại Dương và phía Tây của các đảo Thái
Bình Dương (New và Singholka, 1982; New, 2002).
Tôm càng xanh phân bố ở tất cả các thủy vực nước ngọt và các thủy vực
nước lợ của nhiều vùng trên thế giới (Nguyễn Việt Thắng, 2003). Môi trường sống