BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRÊN SẢN PHẨM THỊT BÒ TẠI CHỢ HOÀNG HOA THÁM
Ngành:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : ThS. PHẠM MINH NHỰT
Sinh viên thực hiện
: VÕ THỊ HẢI YẾN
MSSV: 1191111049
Lớp: 11HSH02
TP. Hồ Chí Minh, 2013
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Hiện nay vấn đề chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) đang được
đặc biệt quan tâm bởi thực phẩm ngày càng trở nên mất an toàn cho người sử dụng.
Thực phẩm bị nhiễm hóa chất, chất tồn dư cũng như chứa đựng các vi sinh vật gây
ngộ độc đang đe dọa sức khỏe của con người. Trong đó, thịt bò là một loại thực
phẩm được sử dụng phổ biến hiện nay nhờ có thành phần dinh dưỡng cao, dễ sử
dụng trong chế biến các món ăn hằng ngày.
Tuy nhiên, thực trạng thịt bò mất an toàn đang trở thành vấn đề đáng lo ngại
do việc sử dụng thuốc thú y không đúng cách để trị bệnh cho bò đã để lại dư lượng
quá mức cho phép, ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng. Nguồn nước cho ăn
không đủ tiêu chuẩn có thể bị nhiễm bẩn bởi môi trường như một số kim loại nặng:
chì, asen khi bò ăn vào sẽ gây tích lũy trong các mô cơ làm giảm chất lượng thịt và
ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Không những vậy, quá trình giết mổ không
đảm bảo vệ sinh, việc vận chuyển, bày bán thịt bò không đúng quy định làm tăng
khả năng lây nhiễm vi sinh vật gây bệnh vào thịt. Chính vì thế, việc đánh giá chất
lượng của thịt bò sẽ giúp giảm tình trạng ngộ độc do loại thực phẩm này gây ra đối
với người tiêu dùng.
Trước tình hình thực tế đó, đồng thời để làm quen với việc nghiên cứu và vận
dụng kiến thức đã học vào thực tiễn nên chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá các
chỉ tiêu vi sinh trên sản phẩm thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám”. Đề tài này được
thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt tại Phòng thí nghiệm,
Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ
TP.HCM.
2. Mục đích
Tìm hiểu nguyên nhân biến chất và hư hỏng mẫu thịt, đánh giá một số chỉ tiêu
1
vi sinh vật trên mẫu thịt bò ở các quầy tại chợ Hoàng Hoa Thám.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
3. Mục tiêu đề tài
- Khảo sát mức độ nhiễm tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC), Coliforms và E.Coli
trên mẫu thịt bò lấy ở 10 quầy thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám.
- Đề ra các biện pháp xử lý thích hợp cho các quầy thịt bò tại chợ Hoàng Hoa
Thám.
4. Phạm vi nghiên cứu
- Tiến hành lấy mẫu thịt bò ngẫu nhiên ở 10 quầy tại chợ Hoàng Hoa Thám.
- Phân tích 3 chỉ tiêu vi sinh có khả năng hiện diện trong mẫu:
TPC
Coliforms
E.Coli
2
- Đánh giá và ghi nhận kết quả dựa trên 3 chỉ tiêu phân tích.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về thịt [9][10]
Thịt là 1 loại có giá trị dinh dưỡng cao đối với người tiêu dùng và rất thích hợp
cho sự phát triển của vsv, nhất là vi khuẩn và nấm.
1.1.1. Cấu trúc của thịt
Phụ thuộc vào vai trò, chức năng thành phần hóa học mà người ta chia ra thịt
thành các loại mô như sau: mô cơ, mô liên kết, mô xương, mô mỡ.
- Mô cơ
Đây là loại mô chiếm tỷ lệ cao nhất trong cấu tạo của thịt. Nó gồm nhiều sợi tơ
cơ xếp thành bó, các sợi cơ được cấu tạo từ miozin hoặc actin, chức năng chủ yếu
là thực hiện hoạt động co giãn.
Thành phần hóa học của mô cơ: H2O (72 - 75%), protein (18 - 21%), còn lại
các thành phần khác như: glucid, lipid, khoáng, vitamin...
- Mô liên kết
Cũng là loại mô được phân bố rộng rãi, có vai trò liên kết với các sợi tơ cơ, các
bó cơ lại với nhau tạo cấu trúc chặt chẽ cho thịt.
- Mô mỡ
Được tạo thành từ tế bào mỡ liên kết với nhau dưới dạng lưới xốp.
Lượng mô mỡ trong cấu trúc thịt nhiều hay ít phụ thuộc vào giống loài, giới
tính của nó và điều kiện môi trường.
Bảng 1.1. Tỷ lệ của các mô trong thịt bò (% tính theo khối lượng thịt xẻ)
Thịt bò Loại mô
57 - 62% Mô cơ
3 - 16% Mô mỡ
9 - 12% Mô liên kết
17 - 29% Mô xương – sụn
3
0,8 - 1% Mô máu
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Tính chất của các mô và thành phần cấu tạo của các mô đều khác nhau. Do đó
tùy theo đặc tính và tỷ lệ của các thành phần cấu tạo trong mỗi loại mô sẽ quyết
định tính chất của thịt. Người ta thừa nhận mô mỡ và mô cơ có giá trị sử dụng cao
nhất. Vì con người sử dụng thịt làm thực phẩm là để thỏa mãn nhu cầu về protein và
lipid.
1.1.2. Thành phần hóa học của thịt gồm có: [10]
Protid 20%
Lượng lipid dao động nhiều từ 1 ÷ 30%
Glucid trong thịt chỉ có rất ít.
Lượng tro khoảng 1%.
Độ đồng hóa protein thịt 96 ÷ 97%.
Về chất khoáng thịt là nguồn phospho (116 ÷ 117mg%), kali (212 ÷ 259mg%),
Fe (1,2 ÷ 2,3mg%) tập trung nhiều ở gan. Ngoài ra còn vi yếu tố Cu, Zn, Coban...
Lượng canxi trong thịt rất thấp (10 ÷ 15mg%).
Thịt là nguồn vitamin nhóm B.
- Nước
Nước chiếm 50 - 75%, là thành phần hóa học phong phú nhất trong thịt, nó là
thành phần quan trọng trong cơ thể động vật. Trong cơ thể động vật còn sống, nước
có nhiều chức năng khác như: cần thiết cho quá trình trao đổi chất, điều chỉnh nhiệt
độ, là dung môi để hòa tan các chất dinh dưỡng...
- Protein
Giá trị dinh dưỡng của thịt chủ yếu là nguồn protein. Người ta đã tìm ra 30
acid amin trong tự nhiên, trong đó có 20 loại acid amin thường được tìm thấy trong
hầu hết các protein thịt. Tất cả các acid amin không thay thế đều có thể dễ dàng tìm
thấy trong mô cơ, vì vậy thịt có giá trị sinh học cao.
Một nhóm khác có trong thịt là những chất cũng liên quan đến protein (nhưng
không phải là protein thực sự) như purines, pyrimidines và nucleopeptides. Đây là
4
những thành phần tan nhiều trong nước, có giá trị dinh dưỡng ít nhưng chúng là
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
những hợp chất sinh hóa có thể tồn tại trong dịch tiêu hóa. Chúng tạo cho thịt có
màu và mùi đặc trưng.
Ngoài ra trong thành phần của protein có myosin, actin, tropmyozin...đóng vai
trò quan trọng trong việc tạo nên những đặc tính chức năng của thịt.
- Muối khoáng, vitamin.
Ngoài ra, trong thành phần hóa học còn có muối khoáng, vitamin, các nguyên
tố đa lượng như Ca, Fe, Mg, Na...ảnh hưởng lớn đến tính chất keo của các protein
của tế bào, duy trì những hoạt động bình thường của quá trình sống và cân bằng áp
suất thẩm thấu trong tế bào và mô. Những yếu tố này có vai trò rất quan trọng trong
sự teo cơ, hồi phục cơ trong suốt quá trình sống và trong bắp cơ sau khi chết, chúng
có ảnh hưởng rất lớn đến tính chất mềm của thịt và khả năng giữ nước của thịt.
Bảng 1.2. Thành phần các chất dinh dưỡng của thịt
Chất dinh dưỡng Thịt bò loại 1
Nước (%) 70,5
Protein (%) 18
Lipid (%) 10,5
Canxi (%) 10
Phospho (mg%) 191
Sắt (mg%) 2,7
Vitamin A (mg%) 0,01
Vitamin B1 (mg%) 0,17
Vitamin B2 (mg%) 0,17
Vitamin PP (mg%) 4,22
Vitamin C (mg%) 1
1.1.3. Tính chất vật lý của thịt [1]
Tính chất vật lý của thịt cũng là một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượng
5
của thịt.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
- Màu sắc của thịt
Màu sắc của thịt là do màu sắc của cơ thịt và chất béo quyết định. Nó không
chỉ do giống loài, giới tính, tuổi, trạng thái trước lúc giết mổ gia súc và tình hình
chế biến (cắt tiết, ướp lạnh, đông kết, nóng chảy,...) quyết định mà còn chịu ảnh
hưởng của quá trình chín hóa học và thối rửa.
Màu sắc của tổ chức cơ thịt đầu tiên là do lượng hemoglobin và myoglobin
của tổ chức cơ thịt quyết định. Chất béo trong cơ thịt và hàm lượng của tổ chức liên
kết cũng là nhân tố ảnh hưởng đến màu sắc của thịt. Cơ thịt có nhiều chất béo thì
màu của nó là màu hoa quỳ nhạt, nếu lượng tổ chức liên kết nhiều thì có màu hồng
sẫm và hơi xanh nhạt.
Có nhiều nguyên nhân đột ngột làm cho màu sắc của thịt thay đổi. Thí dụ khi
ướp lạnh thì màu sắc mặt ngoài của thịt hầu như không biến đổi nhưng nếu cắt thịt
ra thì phía trong thường có màu hồng nhạt hay màu tro. Thịt giải đông và ướp đông
hai lần có màu hồng sẫm, thịt qua nhiều lần cấp đông và giải đông thì màu sắc
không đồng đều, lúc đó thịt có màu anh đào sẫm. Thịt đã thối rửa hoặc sắp thối rửa
thì có màu vàng hoặc màu tro, màu lục tối hoặc màu tro đen.
- Mùi vị của thịt
Mùi vị của thịt các loài động vật khác nhau tùy theo lượng acid béo bay hơi có
trong cơ thịt. Ví dụ cho thịt vào trong dung dịch acid sulfuric nấu sôi thì mùi vị đó
bốc lên rất rõ. Tính chất và số lượng của acid béo trong cơ thịt phụ thuộc vào giống
loài, tình hình chăn nuôi vỗ béo, giới tính, độ tuổi,... của động vật.
Nếu súc vật trước khi giết mổ đem nuôi ở chuồng có mùi đặc biệt hoặc cho ăn
thức ăn có mùi, khi làm thịt thì thịt của nó cũng có thể có mùi vị như vậy. Thí dụ:
động vật trước khi giết mổ cho uống thuốc thì thịt của nó cũng có mùi thuốc. Vì
những chất gây nên mùi vị là những chất béo có tính bay hơi do đó thịt súc vật có
mùi vị đặc biệt, nếu được để ở nơi thông gió với điều kiện bảo quản tốt thì mùi vị
hắc nặng sẽ được giảm bớt.
6
- Độ mềm của thịt (độ vững chắc)
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Độ mềm của thịt phụ thuộc vào các nhân tố của động vật khi sống và sau khi
giết. Những nhân tố khi sống gồm có: loài, giống, giới tính, tuổi và trạng thái con
vật trước lúc giết. Ngoài ra, trạng thái về số lượng và tính chất của mô liên kết, kích
thước các bó cơ và đường kính của sợi cơ...
Cấu trúc mô cơ là chỉ tiêu liên quan mật thiết với độ mềm của thịt. Cấu trúc
mềm mịn, thịt càng mềm mại.
1.2. Các dạng hư hỏng của thịt [10][11]
Thịt là môi trường giàu thức ăn cho nhiều loài vi sinh vật vì trong thịt có nhiều
nước, giàu chất dinh dưỡng nhất là protein, muối khoáng, chất kích thích tăng
trưởng... Vì vậy, thịt trong quá trình bảo quản có thể bị biến chất và hư hỏng. Thịt
tươi là thịt mới chưa biến chất, nhưng giữ thịt lâu chưa kịp tiêu thụ hoặc cất giữ ở
những điều kiện không thích hợp sẽ bị biến chất bởi các enzyme có sẵn trong thịt và
vi sinh vật, dẫn tới ôi thiu hư hỏng về trạng thái cảm quan, hình thành những chất
có hại. Những hiện tượng hư hỏng của thịt thường gặp là: nhớt (nhầy), thối rửa, lên
men chua, biến đổi sắc tố, phát sáng, có các chấm màu trên bề mặt và mùi mốc, còn
bị ôi do sự biến đổi mỡ có trong thịt.
1.2.1. Sinh nhớt
Thường xuất hiện trên bề mặt thịt ướp lạnh ở các buồng có độ ẩm không khí
tương đối cao hơn 90%. Đây là giai đoạn đầu của sự hư hỏng. Trên bề mặt thịt hình
thành một lớp dày đặc gồm có nhiều vi khuẩn khác nhau: E.Coli, Streptococcus
liquefaciens, Bacillus subtilis...
Tốc độ sinh nhớt còn phụ thuộc vào độ ẩm không khí, nhiệt độ bảo quản.
Nhiệt độ thích hợp cho bảo quản thịt là 0 - 20C và độ ẩm tương đối của không khí là
85 - 90%. Ở điều kiện này thịt không có các dấu hiệu hư hỏng trong 3 tuần lễ.
1.2.2. Thịt bị lên men chua
Do vi khuẩn lactic, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn gây thối hoặc các enzyme có
sẵn trong thịt phân hủy tạo ra mà không có sự tham gia của vi sinh vật. Trong thịt
7
có càng nhiều glycogen thì càng dễ bị chua.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Trong quá trình lên men chua, các sản phẩm lên men thường là các acid hữu
cơ, ban đầu các acid này ức chế các vi khuẩn gây thối rữa phát triển làm cho pH của
thịt giảm.
Sản phẩm của quá trình là các acid: formic, acetic, butyric, lactic... thịt bị chua
có màu xám và mùi khó chịu.
Môi trường acid kìm hãm vi sinh vật gây thối phát triển, song ở môi trường
này nấm mốc mọc rất tốt và tạo thành amoniac và các bazơ nitric làm cho môi
trường trung tính, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối phát triển (trong đó có
Proteus, Bacillus subtilis). Vì vậy, lên men chua là thời kỳ trước của quá trình thối
rữa.
1.2.3. Sự thối rữa thịt
Vi khuẩn gây thối rữa phát triển và hoạt động mạnh trên bề mặt thịt. Những vi
khuẩn này có hoạt tính proteinase cao, chính chúng tiết ra enzyme proteinase làm
phân giải protein tới các sản phẩm có mùi hôi thối như NH3. Do các vi sinh vật hiếu
khí cũng như kỵ khí phát triển sinh ra các enzyme protease phân giải protein.
Thịt các gia súc bị bệnh hoặc gầy yếu dễ bị thối rữa. Những thịt này ít
glycogen, trong thời gian thuần thục của thịt, acid lactic trong thịt ít được tạo thành
vì ít glycogen, cho nên khó kìm hãm được các vi sinh vật gây thối phát triển. Còn
trong thịt có nhiều glycogen thì acid lactic dễ được tạo thành trong quá trình bảo
quản và môi trường acid lại ức chế vi khuẩn gây thối rữa phát triển.
Bảng 1.3. Bảng quy định đánh giá chất lượng thịt
Chất lượng thịt pH của thịt Số lượng vsv trong thịt
Thịt tươi 5,9 ÷ 6,5 Một vài cầu khuẩn, không có cầu khuẩn
Thịt kém chất lượng 20-30 cầu khuẩn, một vài trực khuẩn 6,6
8
Thịt ươn Dày đặc cả trực khuẩn và cầu khuẩn 6,7
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.2.4. Sự biến màu của thịt
Dưới tác dụng của các vi khuẩn hô hấp hiếu khí, trên bề mặt thịt sẽ xuất hiện
các vết màu khác nhau dưới tác dụng của các vi khuẩn khác nhau. Màu của thịt
trong quá trình bảo quản có thể chuyển từ đỏ biến thành màu xám, nâu hoặc xanh
lục do các vi khuẩn hiếu khí phát triển trên bề mặt.
Khi mỡ bị ôi và xuất hiện peroxide, thì màu vàng sẽ biến thành màu xám tối và
sau đó trở nên tím nhạt, xanh. Nếu thịt vẫn có mùi bình thường và không tìm thấy
các độc tố, thì sau khi tẩy sạch các vết màu, vẫn có thể sử dụng bình thường.
1.2.5. Sự phát quang của thịt
Do các vi khuẩn Photobacterium phát triển trên bề mặt thịt gây ra. Đặc biệt là
khi bảo quản thịt chung với cá dễ sinh hiện tượng này. Trong thịt thối rữa không
phát quang.
1.2.6. Thịt mốc
Do các Mucor và Aspergillus... phát triển trên thịt, làm cho thịt giảm tuyệt đối
các chất hòa tan, tăng tính kiềm, làm xảy ra quá trình phân hủy protein và các chất
béo tạo acid bay hơi. Mốc mọc trên bề mặt của thịt và ăn sâu vào trong tới 2 - 5mm,
sau đó phát triển các nhánh sinh bào tử và làm cho thịt có mùi mốc, nhớt dính, biến
màu; không nên bảo quản và vận chuyển thịt mốc.
1.2.7. Thịt bị ôi do sự biến đổi mỡ có trong thịt
Vi khuẩn phân giải mỡ thúc đẩy quá trình oxi hóa của mỡ. Mỡ bị oxi hóa do
tác dụng đồng thời của ánh sáng và không khí. Một số chất béo bị ôi sau khi bị thủy
phân. Các vi khuẩn Pseudomonas, Achromobacter và một số nấm men tác dụng làm
cho mỡ bị ôi.
1.3. Các phương pháp bảo quản thịt [11]
1.3.1. Bảo quản ở nhiệt độ thấp
Bảo quản lạnh: sử dụng nhiệt độ thấp để ức chế, hạn chế vi sinh vật gây hại
phát triển và thịt vẫn giữ nguyên trạng thái, tính chất ban đầu. Ví dụ ở nhiệt độ 0 -
9
20C, ẩm độ 85 - 90% bảo quản thịt bò được 20 ngày. Tuy nhiên có những loại vi
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
khuẩn ưa lạnh còn sống sót sẽ gây hư hỏng thịt như: Pseudomonas, Lactobacillus,
Micrococcus.
Bảo quản đông lạnh: bảo quản thịt ở nhiệt độ từ -20 ÷ -180C, bảo quản bằng
phương pháp này thì thời gian bảo quản lâu và có thể kìm hãm gần hết vi sinh vật
gây hại, vi sinh vật ưa lạnh cũng giảm đáng kể. Chỉ còn dạng bào tử của vi khuẩn
chịu lạnh. Thời gian bảo quản lâu nhưng hạn chế là làm thay đổi chất lượng thịt.
Khi sử dụng cần phải phá đá nên làm thành tế bào bị vỡ ra và chất dinh dưỡng sẽ
theo nước ra ngoài. Đặc biệt là không bảo quản đông lạnh hai lần, nếu bảo quản lần
hai thì bào tử vi sinh vật chịu lạnh đã thích ứng và phát triển thành vi sinh vật sẽ
gây hư hỏng thịt.
1.3.2. Muối thịt
Dùng muối có nồng độ cao để hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây hư
hỏng. Nồng độ muối cao làm cho nước từ trong tế bào vi sinh vật ra ngoài (do sự
chênh lệch nồng độ) dẫn đến hiện tượng co nguyên sinh, vi sinh vật mất nước và
chết. Tuy nhiên nấm mốc và vi khuẩn gây bệnh cũng không chết. Khi muối thịt phải
bổ sung thêm NaNO3, đường saccharose làm cho sản phẩm thịt có màu tươi và
mềm. Ngoài ra, việc bổ sung thêm đường sẽ làm cho vi khuẩn lactic phát triển tạo
thành một lượng acid lactic nhỏ làm độ pH giảm nên sẽ ức chế vi khuẩn gây thối
rữa phát triển.
1.3.3. Sấy khô
Sấy khô: làm giảm độ ẩm của sản phẩm thịt bằng nhiệt độ sẽ hạn chế sự phát
triển của vi sinh vật hay làm chết vi sinh vật. Một số vi sinh vật sẽ chuyển sang
dạng bào tử. Nếu để sản phẩm thịt hút nước thì bào tử sẽ phát triển thành vi sinh vật
và gây hư hỏng thịt. Vì vậy để bảo quản tốt thịt cần kết hợp giữa sấy khô và muối
sơ bộ.
Xông khói: làm cho một phần nước mất đi, ngoài ra trong khói có chất sát
khuẩn là aldehyde formic nên thời gian bảo quản lâu hơn. Ta nên kết hợp muối sơ
10
bộ và xông khói.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.3.4. Đóng hộp
Nhiệt độ cao làm cho 90% vi sinh vật chết đi, bào tử cũng bị chết. Thường sử
dụng nhiệt độ cao để khử trùng vi sinh vật từ 115 - 1210C trong khoảng thời gian từ
45 - 60 phút. Sau đó kiểm tra bằng cách giữ ở 370C trong vòng 7 ngày nếu hộp nào
bị phồng lên thì ta loại ra. Một trong những loài vi sinh vật chịu nhiệt độ cao:
Clostridium botulinum, Bacillus subtilis...
1.4. Tình hình ngộ độc thực phẩm [11][12]
Theo thống kê về tình hình ngộ độc thực phẩm của Cục An toàn Vệ sinh Thực
phẩm cho thấy:
Bảng 1.4: Tình hình NĐTP và chết do NĐTP giai đoạn 2007 - 2011
Chỉ số Năm Vụ ngộ độc (vụ) Số mắc (người) Chết (người)
2007 7.329 247 55
2008 7.828 205 61
2009 5.212 152 35
2010 5.664 175 51
2011 (9 tháng) 3.857 122 17
(Số liệu từ Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm – Bộ Y Tế cung cấp)
Năm 2011 so với năm 2010 giảm 21% về số vụ; giảm 23,9% số người mắc;
giảm 15,5% số người đi viện và số tử vong giảm 62,2%.
Nguyên nhân gây NĐTP do vi sinh vật ô nhiễm vào thực phẩm giảm 15,5%,
nguyên nhân do thực phẩm ô nhiễm hóa chất tăng 55,5%, do độc tố tự nhiên giảm
41,4% và số vụ NĐTP không xác định được nguyên nhân là 16,3%. Một trong
những nguyên nhân gây NĐTP trong những năm gần đây do sử dụng phụ gia thực
phẩm không đúng quy định.
1.4.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm trong năm 2010
Thông tin từ Bộ Y Tế cho biết, trong năm 2010 toàn quốc đã xảy ra 132 vụ
ngộ độc thực phẩm với 4.676 người mắc, 3.281 người nhập viện và có 41 trường
11
hợp tử vong.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Trong quý I năm 2010, toàn quốc đã xảy ra 25 vụ ngộ độc thực phẩm với 734
người mắc, 611 người đi viện và 12 người tử vong. So sánh với 3 tháng đầu năm
2009, số vụ ngộ độc thực phẩm tăng 2 vụ (8,7%), số người tử vong cũng tăng 1
trường hợp (9%). Tuy nhiên, số người mắc có giảm308 người (29,6%) và số người
đi viện giảm 313 người (33,9%).
Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là độc tố trong tự nhiên có trong
thức ăn (44% số vụ), do vi sinh vật chiếm 28%, do hóa chất chiếm 8% và 20% số
vụ không xác định nguyên nhân.
Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử
vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ
ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Số người bị ngộ độc là 323 người với 242 người
nhập viện. So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi
viện giảm 186 người. Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người. Số vụ ngộ
độc thực phẩm có quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215
người, số người đi viện giảm 174 người. Nguyên nhân chính là do vi sinh (gồm 4
nhóm vi khuẩn chính là: Salmonella, Streptococcus, E.Coli và Staphylococcus), do
độc tố tự nhiên và hóa chất. Có 5/18 vụ ngộ độc không xác định được nguyên nhân,
do không lấy được mẫu thực phẩm lưu tại cơ sở. Trong năm 2010, hầu hết các vụ
ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xác định nhanh nguyên nhân và xử lý kịp thời,
thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xác hơn. Công tác quản lý ngộ độc thực
phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực. Mặc dù vậy, ngộ độc thực phẩm tại gia đình
chiếm gần 60% tổng số vụ ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt là ngộ độc cá
nóc, điều đó cho thấy, các vụ ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ gia đình
chưa có xu hướng giảm. Do đó, người dân cần phải nâng cao ý thức trong việc thực
hiện ATVSTP ngay chính tại bếp ăn của gia đình mình.
1.4.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm năm 2011
Trong quý I năm 2011, số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 50% và số ca tử vong
12
giảm tới 75% so với cùng kỳ năm ngoái (2010).
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Trong 5 tháng đầu năm 2011, trên cả nước xảy ra 37 vụ ngộ độc thực phẩm,
làm 1.613 người mắc, 1.513 người phải nhập viện và 8 người tử vong. Số liệu thống
kê của Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm cho thấy, trong 3 tháng đầu năm, toàn quốc
xảy ra 16 vụ ngộ độc thực phẩm với 442 người mắc và 5 người tử vong, trong đó có
1 vụ ngộ độc tập thể gồm 30 người. So với cùng kỳ năm ngoái thì số vụ ngộ độc
này giảm 10 vụ (50%), số người tử vong giảm 11 trường hợp (75%). Có nhiều
nguyên nhân xảy ra ngộ độc thực phẩm như môi trường sản xuất nông nghiệp bị ô
nhiễm, các kỹ thuật canh tác trong trồng trọt và chăn nuôi cũng như công nghệ sau
thu hoạch, lưu thông phân phối thực phẩm không đúng quy trình công nghệ...
Nhưng tình trạng quảng cáo thực phẩm sai quy định, sai sự thật khá phổ biến là
nguyên nhân chính.
1.4.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm năm 2012
Theo Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm (Bộ Y Tế), tình hình số vụ ngộ độc
thực phẩm 6 tháng đầu năm 2012 không tăng so với cùng kỳ của các năm trong giai
đoạn 2007 – 2011.
Số vụ ngộ độc thực phẩm lớn tăng 1 vụ so với cùng kỳ năm 2011. Số vụ ngộ
độc thực phẩm các bếp ăn tập thể giảm 1 vụ, số người mắc và đi viện đều giảm so
với cùng kỳ năm 2011. Số vụ ngộ độc thực phẩm dưới 30 người tăng cả số vụ, số
người mắc và tử vong. Trong đó tử vong chủ yếu do rượu không rõ nguồn gốc và
bánh trôi ngô. Tại các hộ gia đình, việc ngộ độc thực phẩm có xu hướng tăng so với
các năm trước. Đây là điều đáng lo ngại, bởi vì các hộ gia đình không phải là đối
tượng sản xuất, kinh doanh thực phẩm nên khó quản lý. Do đó, công tác tuyên
truyền cũng cần phải tập trung vào đối tượng này.
Trong 6 tháng đầu năm 2012, số vụ ngộ độc thực phẩm lớn (từ 30 người trở
lên) chỉ tăng 1 vụ. Số người chết do ngộ độc thực phẩm giảm 100%. Vụ ngộ độc
thực phẩm bếp ăn tập thể giảm 1 vụ, số mắc giảm 419 người (34,6%), số đi viện
giảm 623 người (52,1%) và không có tử vong. Số vụ ngộ độc thực phẩm có quy mô
nhỏ (dưới 30 người) tăng 24 vụ. Trong đó ngộ độc thực phẩm tại bếp ăn gia đình
13
tăng 18 vụ, số mắc tăng 497 người, số đi viện tăng 346 người và số người chết tăng
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
9 người. Trong số đó có những vụ ngộ độc thực phẩm tại đám cưới với gần 400
người mắc. Tỷ lệ các vụ ngộ độc thực phẩm có nguyên nhân từ vi sinh vật, độc tố
tăng, trong khi số vụ ngộ độc do hóa chất giảm 20%.
1.5. Các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm
1.5.1. Tác nhân hóa học
Các chất ô nhiễm trong công nghiệp và môi trường như: dioxin, các chất
phóng xạ, các kim loại nặng (chì, thủy ngân, asen, cadimi...). Các kim loại nặng
nhiễm vào thực phẩm với lượng lớn thường gây ngộ độc cấp tính và tỷ lệ tử vong
rất cao.
Các chất hóa học sử dụng trong nông nghiệp, đặc biệt là thuốc bảo vệ thực vật,
phân bón, chất kích thích tăng trưởng. Thuốc bảo vệ thực vật nhiễm vào thực phẩm
là tác nhân thường gặp trong các vụ ngộ độ gây rối loạn thần kinh trung ương, nhức
đầu, mất ngủ, giảm trí nhớ, mức độ nặng hơn có thể tổn thương thần kinh ngoại
biên dẫn đến liệt.
Một số loại phụ gia thực phẩm như màu auramin, đỏ Scarlet, Sudan III,
Rhodamin đã được thử nghiệm trên động vật xác định khả năng gây ung thư, gây
đột biến gen và đã bị loại ra khỏi danh mục các chất cho phép dùng trong chế biến
thực phẩm.
Các độc tố có sẵn trong thực phẩm gây ngộ độc: nhiều thực phẩm có chứa sẵn
các độc tố tự nhiên như chất độc solamin trong mầm khoai tây, cyanogen glucoside
có trong sắn, đậu lima hoặc mytilotoxin ở một số loài nhuyễn thể. Độc tố bufetenin
tạo thành trong da cóc rất nguy hiểm. Tetrodotoxin có trong gan, thận, cơ quan sinh
sản (buồng trứng và túi tinh), mắt, mang và da cá nóc tác động vào hệ thần kinh gây
rối loạn hoạt động chân tay, hô hấp. Ngộ độc do độc tố cá nóc thoạt đầu có cảm
giác ngứa ngáy, đau bụng dữ dội, đờ đẫn, cứng mồm, sùi bọt mép, nôn mửa, trường
hợp nặng có thể cấm khẩu, co giật, liệt hô hấp và tử vong.
1.5.2. Tác nhân sinh học gây ngộ độc trên thịt bò
14
1.5.2.1 . Tổng số vi sinh vật hiếu khí [4]
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành trong điều kiện
có sự hiện diện của oxy phân tử.
Chỉ tiêu này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi
trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc
là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới
dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc cho phép ước đoán được số lượng vi sinh vật
trong một đơn vị khối.
Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của
thực phẩm đó. Ngoài ra, chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá
chất lượng của mẫu về sự ô nhiễm vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản
của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, vận chuyển và bảo quản
thực phẩm.
1.5.2.2 .Coliforms [4]
Giới thiệu
Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị, bởi vì số lượng của chúng
hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh
khác trong thực phẩm.
Nguồn gốc
Vào cuối những năm 1800 khi Von Fritsch được mô tả Klebsiella pneumoniae
và Klebsiella rhinoscleromatis như là vi sinh vật đặc trưng được tìm thấy trong phân
người (Gedreich 978).
Năm 1885 Percy và Grace Frankland đầu tiên thường xét nghiệm vi khuẩn
trong nước ở London. Robert Koch sử dụng chất keo rắn nấu bằng phương tiện
truyền thống để đếm vi khuẩn (Hutchison và Ridgway 1977).
Đầu thập niên 1900 (Cabelli, 1977), ông cho rằng sự vắng mặt của Coliforms
như là dấu hiệu cho thấy không xuất hiện bệnh do vi khuẩn gây nên, và sau khi sản
15
xuất khí đốt với việc giới thiệu ống Durham (Durham năm 1983) thì khái niệm về vi
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
khuẩn Coliforms và các vi khuẩn khác dạng Coli được sử dụng ở nước Anh năm
1901.
Năm 1908 Bergey và Deehan xác định có 256 loài khác nhau của vi khuẩn
Coliforms.
Năm 1909 Macconkey công nhận 128 loài khác nhau của vi khuẩn Coliforms.
Đến đầu thập niên 1920, sự khác biệt của các dạng vi khuẩn Coli được đem ra
sản xuất indole, hóa lỏng gelatin, lên men đường sucrose và Voges – Proskauer
nhằm xác định sự ô nhiễm faecal (Hendricks 1978).
Năm 1938 Parr có những phát minh lên đến đỉnh điểm trong thử nghiệm
IMViC (Indole, Methyl Red, Voges – Proskauer và muối của acid Citric).
Đặc điểm
Coliforms là những trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, có phản ứng
oxidase âm tính và thể hiện hoạt tính của β-galactosidase. Vi khuẩn này có khả năng
phát triển trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính bề mặt khác có tính
ức chế tương tự, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24
– 48 giờ.
Coliforms gồm bốn chi trong họ Enterobacteriaceae: Escherichia Coli,
Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter (Metcalf và Eddy, 1991). Chúng thường có
mặt trong đường ruột động vật có vú (ví dụ: Escherichia Coli phổ biến trong đất,
trên cơ thể người).
Chúng bao gồm vi khuẩn lên men lactose như Escherichia cloacae, Citrobacter
freundii có thể tìm thấy trong phân và ngoài môi trường (nước giàu chất dinh
dưỡng, đất và động vật) cũng như trong nước uống có nồng độ các chất dinh dưỡng
tương đối cao.
Coliforms chịu nhiệt có khả năng lên men đường lactose ở 44 – 450C, nó bao
gồm Escherichia và loài Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter.
Hiện diện
Vi khuẩn Coliforms hiện diện khắp nơi, kể cả trong đất, da, thực phẩm, nước
16
sông, ao hồ, rau cải...
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Sự có mặt của chúng trong nước và rau củ được xem là một chỉ số về sự tinh
khiết của nước hay rau. Tuy nhiên chỉ số này cũng không đáng tin cậy, vì vi khuẩn
Coliforms vẫn có khả năng sống sót trong nước uống. Sự hiện diện của Coliforms
trong nước không hẳn là nước bị nhiễm phân.
Coliforms chịu nhiệt từ nơi có nguồn nước giàu chất hữu cơ như nước thải
công nghiệp từ xác thực vật thối rữa hoặc đất.
1.5.2.3. Escherichia Coli [4][14]
Phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Escherichia
Loài: E.Coli
Đặc điểm
Hình thái và đặc điểm nuôi cấy
E.Coli là trực khuẩn Gram âm, di động do có lông quanh thân, một số chủng
E.Coli có vỏ polysaccharide, không sinh bào tử.
E.Coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, phát triển dễ dàng trên
các môi trường nuôi cấy thông thường, một số có thể phát triển được ở môi trường
tổng hợp đơn giản. Thường sống trong ruột già của người và động vật và theo phân
đi ra ngoài.
Đây là những vi sinh vật có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 7 – 500C. Nhiệt
độ thích hợp 370C, pH tối ưu là 4,4, phát triển mạnh trong môi trường Mac Conkey,
EMB. Trên môi trường EMB, E.Coli cho khuẩn lạc có màu ánh kim, tròn, bờ đều,
đường kính khoảng lớn hơn 0,5µm. Trong môi trường lỏng, E.Coli làm đổi màu
môi trường, sinh hơi hoặc làm đục môi trường.
17
Đặc tính sinh hóa
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
E.Coli lên men nhiều loại đường sinh acid và sinh hơi như: glucose, lactose,
ramnose; khử nitrate thành nitric, gây nhầy nhớt hư hỏng thực phẩm, indole dương
tính, methyl red dương tính, VP âm tính, citrate âm tính, urease âm tính, H2S âm
tính.
Hình 1.1: Vi khuẩn Escherichia Coli
Yếu tố độc lực
Nhóm STEC
STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt) còn gọi là Shiga toxin (Stx) hay
Verotoxin (VT). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau
là Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự,
tạo ra nhiều Subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e, Stx2g. Một dòng STEC có thể sản
sinh Stx1, Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2.
Nhóm EPEC
Các yếu tố độc lực chính bao gồm gene eae mã hóa protein itimin cần thiết cho
việc tạo ra tổn thương dạng A/E, plasmid 50 - 70 Mda (EAP): mã hóa BFP (bundle
– forming pilus), PER (plasmid – encoded regulator) và LER (LEE – encorded
regulator). Các protein tiết: Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG và MAP
(mitochondria – associated protein), EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô
và CDT (Cytolethan distending toxin).
Nhóm ETEC
Nhóm ETEC có hai nhóm quyết định độc lực chính là độc tố ruột (enterotoxin)
18
và yếu tố định vị (colonization factor – CF).
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Độc tố ruột enterotoxin
Nhóm ETEC gồm những E.Coli tạo ra ít nhất một trong hai độc tố đường
ruột là ST và LT. ETEC gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng
nhầy ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch. Nhóm
ETEC gây tiêu chảy thông qua sự tiết độc tố đường ruột LT và ST. E.Coli
nhóm này có thể chỉ tiết độc tố LT, hoặc chỉ tiết ST, hoặc có thể tiết cả LT
và ST.
Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin – LT): độc tố LT của E.Coli là
oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố tả
(cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau
nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%),
tương đồng về receptor, hoạt tính enzyme và tác động của nó trên thú hay
nuôi cấy tế bào.
Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin – ST): ngược với LT, ST có trọng
lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả
năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành hai nhóm là STa và
STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gene mã hóa cho cả hai
nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gene mã hóa ST cũng
được tìm thấy trên transposon. STa (hay còn gọi là ST-I) được tạo bởi
ETEC và một vài vi khuẩn Gram âm khác như Yersinia enterocolitica và
V.cholerae non – O1. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu
nhiệt EAST1 của ETEC. Gần đây, còn có báo cáo cho rằng một vài dòng
của ETEC cũng có thể sản sinh độc tố EAST1 ngoài độc tố STa. Còn STb
chỉ được tìm thấy ở ETEC.
Yếu tố định vị (colonization factor – CF):
Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên
cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non
19
nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF). Gene của
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
CFA thường được mã hoá trên plasmid, cũng là nơi mã hóa cho độc tố ST
và/hoặc LT.
Nhóm EAEC
Những yếu tố độc lực chính của EAEC bao gồm các diềm bám dính kết tập
AAF (aggregative adhesion fimbriae), yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR,
protein Pet và độc tố EAST – 1 (enteroaggregative heat – stabe toxin – 1). AAF
được xem là yếu tố quyết định độc lực.
Nhóm EIEC
EIEC gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Khả
năng xâm nhập được mã hóa bởi gene trên plasmid 140 MDa. Các gene trên
plasmid này mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa: Invasion
plasmid antigen). EIEC còn có khả năng sản xuất độc tố ruột giống một số Shigella.
Gene mã hóa cho độc tố này có tên là sen (Shigella enterotoxin), cơ chế gây bệnh
giống vi khuẩn lỵ. EIEC xâm nhập vào trong tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu các
túi thực bào và nhân lên trong bào tương, phá hủy tế bào và xâm lấn sang các tế bào
khác.
Khả năng gây bệnh
Khả năng gây bệnh rất đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu, với cơ thể yếu
thì gây nhiễm khuẩn máu, gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, gây tiêu chảy.
- Bệnh tiêu chảy do E.Coli
- Các nhiễm khuẩn khác do E.Coli
E.Coli có thể gây nên nhiễm khuẩn đường tiết niệu: sự ứ đọng nước tiểu do
sỏi, thai nghén... tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu dễ
xảy ra. Mặt khác, khi thông niệu đạo, người ta có thể gây ra nhiễm khuẩn ngược
dòng.
E.Coli có thể gây ra nhiễm khuẩn đường sinh dục, nhiễm khuẩn gan mật, viêm
màng não ở trẻ còn bú, nhiễm khuẩn huyết...
20
1.5.2.4. Salmonella sp
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Salmonella
Loài: Salmonella sp
Đặc điểm
Salmonella là trực khuẩn Gram âm. Hầu hết các loài Salmonella đều có lông
xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullorum), vậy có khả năng di động, không
sinh bào tử. Có kích thước tế bào vào khoảng 0,5 - 3µm.
Salmonella là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, thích hợp ở 370C, pH tối ưu 7,2 –
7,6.
Đặc điểm sinh hóa
Salmonella lên men glucose có sinh hơi (trừ S.typhi lên men glucose không
sinh hơi), không lên men lactose, Indole âm tính, Methyl Red dương tính, VP âm
tính, Citrate thay đổi, Urease âm tính, H2S dương tính (trừ S.paratyphi A: H2S âm
tính).
Lên men sinh hơi các đường glucose, manitol, sorbitol, lên men không đều
saccharose, không lên men đường lactose, salicin, raffinose...
21
Hình 1.2: Salmonella vi khuẩn chở bệnh thương hàn
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Yếu tố độc lực
Có hai loại độc tố là nội độc tố và ngoại độc tố
Ngoại độc tố đường ruột (enterotoxin) có hai loại là LT và ST.
Độc tố LT không bền với nhiệt, LT hoạt hóa enzyme adenylcyclase trong tế
- ra khỏi tế bào, đồng
bào niêm mạc ruột, làm gia tăng c-AMP (cyclo adenosine 5-
monophosphate), c-AMP sẽ kích thích tiết Cl- và HCO3
thời ức chế Na+ vào bên trong tế bào. Hậu quả tích nước trong ống ruột dẫn
đến tiêu chảy.
Độc tố ST bền với nhiệt, cơ chế tác động tương tự như LT. ST hoạt hóa
enzyme guanosylcyclase làm tăng c-GMP (cyclo guanosine 5-
monophosphate) ở trong tế bào dẫn tới hiện tượng tiêu chảy.
1.5.2.4.4. Khả năng gây bệnh
Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng và hầu hết là do ăn phải
thức ăn bị nhiễm như thực phẩm, sữa, nước uống... Sau khi xuyên qua hàng rào acid
dạ dày, vi khuẩn di động về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp túc chui qua một
màng nhầy và vào thành ruột.
Salmonella nhiễm vào cơ thể từ hai nguồn: từ phân người hoặc động vật, từ
người bệnh. Trong đó phải kể đến tác động của động vật lông vũ, trứng và phân của
chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng hơn. Ngoài ra chuột, mèo,
ruồi cũng là tác nhân gián tiếp dẫn đến việc Salmonella lan rộng rãi hơn khi phân
của chúng nhiễm vào các thực phẩm không được bảo quản kỹ. Trong quá trình giết
mổ cũng cần đề phòng sự nhiễm Salmonella nếu không thực hiện đúng quy trình an
toàn thực phẩm.
Bệnh thương hàn
Ở nước ta, bệnh thương hàn chủ yếu do S.typhi, sau đó đến S.paratyphi A,
còn S.paratyphi B và S.paratyphi C thì ít gặp. Bệnh lây từ người này sang người
khác, qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn.
Sinh bệnh học: trực khuẩn thương hàn vào cơ thể qua đường tiêu hóa đến
22
ruột non thì chui qua niêm mạc ruột rồi vào các hạch mạc treo ruột. Ở đó chúng
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
nhân lên và một phần vi khuẩn bị dung giải, giải phóng ra nội độc tố, nội độc tố
kích thích thần kinh giao cảm ở bụng, gây tổn thương, xuất huyết tiêu hóa, có thể
gây thủng ruột.
Các bệnh khác
Các bệnh không phải thương hàn do Salmonella gây ra thường là một nhiễm
trùng giới hạn ở ống tiêu hóa trong các trường hợp nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn
mà S.typhimurium,... là tác nhân hay gặp nhất, sau đó là S.enteritidis,... Nhiễm
trùng nhiễm độc do Salmonella có thời gian nung bệnh từ 10 – 48 giờ, bệnh biểu
hiện có sốt, nôn, tiêu chảy, bệnh khỏi sau 2 – 5 ngày, không có biến chứng.
1.5.2.5 Staphylococcus aureus [7][8][15]
Phân loại
Giới: Eubacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Staphylococcaceae
Chi: Staphylococcus
Loài: S.aureus Hình 1.3: Tụ cầu vàng dưới kính hiển vi
Đặc điểm
Staphylococcus aureus (thường gọi là tụ cầu vàng) là vi khuẩn hình cầu, Gram
dương, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, không di động, sắp xếp theo mọi hướng
thành cụm giống chùm nho. S. aureus có mặt khắp nơi, thường thấy trên da, xoang
mũi, tóc…
Tạo sắc tố màu vàng sau 1 – 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ tăng
trưởng thích hợp nhất 35 – 370C. Chúng có khả năng tăng trưởng trong môi trường
chứa đến 15% NaCl. Do đó, nếu như hầu hết các vi sinh vật gây bệnh bị ức chế
trong nhóm thực phẩm có độ ẩm thấp hoặc nồng độ muối cao thì S. aureus vẫn có
23
thể sinh trưởng được. Tuy nhiên, khả năng cạnh tranh dinh dưỡng của S. aureus
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
thường yếu hơn các vi sinh vật khác. Đó là lý do S. aureus thường được tìm thấy
trong các thực phẩm đã được nấu chín hoặc đã qua chế biến.
Đặc điểm quan trọng của S. aureus có thể phân biệt được với các loài
Staphylococci khác là khả năng sinh tổng hợp coagulase và khả năng sử dụng
manitol.
Yếu tố độc lực
S. aureus tạo nhiều yếu tố độc lực:
- Protein bề mặt: thúc đẩy việc bám dính vào tế bào chủ. Ngoài ra, hầu hết
các dòng đều tạo protein gắn kết fibrinogen và fibronetin làm kích thích sự kết dính
các khối máu và mô bị chấn thương. Các protein gắn kết chất tạo keo cũng thường
gặp ở những dòng gây bệnh viêm xương tủy và viêm khớp.
- Yếu tố xâm lấn (hemolysins, leukocidin, kinase, hyaluronidase): giúp vi
khuẩn lan ra trên mô, phân hủy màng tế bào eukaryote.
Hemolysin
α – toxin (α – hemolysin): đây là độc tố khử màng mạnh nhất của S. aureus.
Nó ở dạng một monomer gắn kết với màng tế bào mẫn cảm. Ở người, tiểu
cầu và bạch cầu đặc biệt nhạy với α – toxin do chúng có thụ thể chuyên biệt
nhận diện và cho phép độc tố gắn kết hình thành lỗ nhỏ mà cation hóa trị một
có thể qua được.
β – toxin: đây là một mạch enzyme phân hủy màng giàu lipid. Thử nghiệm
đối với β – toxin là phản ứng phân hủy hồng cầu cừu.
δ – toxin: là một độc tố có peptide nhỏ. δ – toxin có thể phân hủy một số
dạng tế bào khác nhau.
Leukocidin: là protein đa thành phần, do nhiều thành phần riêng rẽ hợp lại phân
hủy màng. Leukocidin cũng phân hủy máu nhưng yếu hơn α – hemolysin.
Chỉ 2% trong tất cả các dòng S. aureus có thể tạo leukocidin, nhưng đến gần
90% các dòng phân lập từ vết xước trên da có tạo độc tố này.
Hyaluronidase: làm giảm chất gian bào của tế bào chủ và có thể giúp tụ cầu lan
24
rộng sang các vùng xung quanh.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Catalase: có chức năng bất hoạt hydrogen peroxide và các gốc tự do hình thành
do hệ thống myeloperoxidase trong tế bào chủ.
Coagulase và yếu tố gây đông: coagulase là một enzyme ngoại bào sẽ gắn với
prothrombin trong tế bào chủ hình thành phức hợp staphylothrombin.
Coagulase là một chỉ thị thường dùng để phát hiện S. aureus ở các phòng thí
nghiệm. Tuy nhiên, đa số bằng chứng cho thấy rằng đây không phải là yếu tố gây
độc, mặc dù chúng có thể tự bảo vệ khỏi sự thực bào và đáp ứng miễn dịch bằng
cách gây đông. Có một số nhầm lẫn về mối liên quan giữa coagulase và yếu tố gây
đông đâu là yếu tố quyết định sự gắn kết fibrinogen trên bề mặt tế bào S. aureus.
Một vài nghiên cứu cho thấy thật sự chỉ có một lượng nhỏ coagulase trên bề mặt tế
bào vi khuẩn và chúng phản ứng với prothrombin làm đông sợi fibrin. Nhưng
những nghiên cứu di truyền chỉ ra rằng không thể giải thích rõ là coagulase và yếu
tố gây đông có tồn tại riêng biệt hay không. Bởi vì những đột biến thiếu coagulase
vẫn duy trì hoạt tính yếu tố gây đông và những đột biến thiếu yếu tố gây đông vẫn
biểu hiện hoạt tính coagulase bình thường.
Staphylokinase: đây là yếu tố phân giải fibrin. Một phức hợp sẽ được hình thành
giữa staphylokinase và plasminogen kích hoạt hoạt tính phân giải protein giúp
phân hủy fibrin. Cũng như coagulase, không có đủ bằng chứng để cho thấy
staphylokinase là yếu tố gây độc, mặc dù việc phân giải fibrin giúp cho sự lan
rộng của tụ cầu.
Các enzyme ngoại bào khác
TNase: là enzyme kháng nhiệt, có khả năng hidro hóa DNA và RNA của tế
bào chủ.
DNase, protease, lipase: cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn, có tác động
gây bệnh thấp.
FAME (fatty acid modifying enzyme): là enzyme rất quan trọng ở những chỗ
bị abscess, đó là nơi chúng có thể biến đổi những lipid kháng khuẩn và kéo
25
dài sự sống của vi khuẩn.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Khả năng gây bệnh
Các dòng S. aureus đều có thể tổng hợp enterotoxin là loại độc tố bền nhiệt
(không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút) gây các triệu chứng buồn nôn, nôn mửa,
đau bụng, có hay không có tiêu chảy, ngoài ra còn có thể bị đau đầu, chuột rút, thay
đổi huyết áp. Sự hiện diện của S. aureus cho thấy điều kiện vệ sinh kiểm soát nhiệt
26
độ của thực phẩm kém.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi Sinh – Khoa Môi Trường và Công Nghệ
Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM.
- Thời gian: 24/06/2013 – 15/09/2013.
2.2. Địa điểm lấy mẫu
Khu vực: chợ Hoàng Hoa Thám, đường Hoàng Hoa Thám, P.24, Q.Tân Bình,
27
TP.HCM.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Chợ
Hải Sản Hoàng Hoa Thám
6
7
10 0
5 Rau Quả
8
9
Hải Sản
3
2
1
4 Cửa hàng gia vị
Hình 2.1: Sơ đồ lấy mẫu
Chú thích:
: quầy thịt bò
: quầy thịt heo
28
: cống thải
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
2.3. Vật liệu
2.3.1. Mẫu
Mẫu thực phẩm phân tích: thịt bò
2.3.2. Hóa chất, môi trường nuôi cấy
- Saline Pepton Water (SPW) (Himedia - Ấn Độ)
- Plate Count Agar (PCA) (Himedia - Ấn Độ)
- Tryptone Soya Agar (TSA) (Himedia - Ấn Độ)
- Violet Red Bile Agar (VRB) (Himedia - Ấn Độ)
- Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) (Himedia - Ấn Độ)
- Eosine Methylene Blue Agar (EMB) (Himedia - Ấn Độ)
- Canh Tryptone (Himedia - Ấn Độ)
- Canh Methyl Red – Voges Proskauer (MR – VP) (Himedia - Ấn Độ)
- Thạch Simmon Citrate (Himedia - Ấn Độ)
- Thuốc thử Kovac (Merck - Đức)
- Thuốc thử Methyl Red (Merck - Đức)
- Thuốc thử α-naphtol 5% (Merck - Đức)
- KOH 40% (Merck - Đức)
- NaCl 0,85% (Trung Quốc)
- Cồn 700 và cồn 960
- Nước cất
2.3.3. Dụng cụ
- Ống nghiệm có nắp
- Đĩa petri vô trùng
- Cân điện tử
- Cốc thủy tinh
- Bình chứa môi trường
- Đũa thủy tinh
29
- Kéo
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
- Túi nylon vô khuẩn
- Đèn cồn
- Que cấy
- Bông không thấm nước
- Micropipette
2.3.4. Thiết bị
- Autoclave
- Tủ lạnh, tủ cấy
- Bếp từ, bếp đun
- Tủ ấm 300C
- Tủ ấm 370C
- Bể ổn nhiệt
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp đánh giá cảm quan (TCVN 7046 : 2002)
Tên chỉ tiêu Yêu cầu
1.Trạng thái - Bề mặt khô, không dính lông và tạp chất lạ.
- Mặt cắt mịn.
- Có độ đàn hồi, ấn ngón tay vào thịt không để lại dấu ấn
trên bề mặt khi bỏ tay ra.
- Tủy bám chặt vào thành ống tủy (nếu có).
2.Màu sắc Màu đặc trưng của sản phẩm.
3.Mùi Đặc trưng của sản phẩm, không có mùi lạ
30
4.Nước luộc thịt Thơm, trong, váng mỡ to.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Hình 2.2: Mẫu thịt bò tươi
2.4.2. Phương pháp thu mẫu và chuẩn bị mẫu
2.4.2.1. Thu mẫu và xử lý mẫu
Mẫu được lấy từ 10 quầy thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám, cho vào nylon sạch
và vận chuyển về phòng thí nghiệm. Các mẫu thực phẩm sau khi lấy phải đảm bảo
không nhiễm lẫn nhau.
Cho các mẫu vào các túi PE vô trùng, kí hiệu chính xác từng mẫu.
2.4.2.2. Chuẩn bị mẫu
Cân mẫu
Cân chính xác một lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầu
của chỉ tiêu phân tích. Lượng mẫu này được cho vào các bao PE vô trùng. Trong đề
tài này khối lượng mẫu cân là 10g.
Đồng nhất mẫu
Do sự phân bố không đồng đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên mẫu cần
được đồng nhất trước khi phân tích. Việc đồng nhất các mẫu lỏng được thực hiện
bằng cách lắc kỹ trước khi phân tích, các mẫu rắn được lắc hay đảo trộn bằng các
dụng cụ chuyên dùng, ví dụ như: thiết bị dập mẫu (Stomacher), có thể đồng nhất
31
mẫu bằng tay (nếu không có đủ điều kiện).
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
2.4.3. Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC) bằng phương pháp đổ
đĩa
2.4.3.1. Nguyên tắc
Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của
mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ
sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm.
Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng
phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng thành
các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất
vào trong môi trường nuôi cấy, các khuẩn lạc hình thành trong môi trường sau khi ủ
được xem như chúng hình thành từ một tế bào riêng lẻ. Theo yêu cầu của tiêu chuẩn
Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 300C trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 370C trong 48 giờ ± 6
32
giờ.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
2.4.3.2. Quy trình phân tích
Cân 10g mẫu và 90ml môi trường SPW đồng nhất trong 30 giây
độ pha loãng 10-1
Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4
Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi
trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 450C.
Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội úp ngược ủ ở 300C
trong 72 giờ
Đọc kết quả các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 - 250
Tính toán kết quả tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu
Hình 2.3: Quy trình phân tích chỉ tiêu TPC
2.4.3.3. Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu
Cân chính xác 10g mẫu cho vào bao PE vô trùng, thêm vào 90ml môi trường
SPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất bằng tay trong 30 giây. Khi
33
đó, ta sẽ được độ pha loãng 10-1.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng
micropipette vô trùng chuyển 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa
9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta sẽ có được dịch pha loãng
10-2. Tiếp tục thực hiện tương tự đến độ pha loãng 10-4.
1 2 3 4 Ống số
Tỷ lệ pha loãng 1 10 1 100 1 1000 1 10000
Thể tích mẫu 0,1 0,01 0,001 0,0001 ban đầu (ml)
10-1 10-2 10-3 10-4 Độ pha loãng
Cấy mẫu
Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4, dùng micropipipette với các đầu tip vô
trùng để chuyển 1ml dịch pha loãng vào giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi
độ pha loãng cấy 2 đĩa. Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường PCA đã
hấp khử trùng và làm nguội đến 45 – 500C. Trộn đều mẫu vào môi trường bằng
cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3 – 5 lần. Đặt đĩa lên
mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc, lật ngược đĩa ủ 300C trong 72 giờ. Chọn các
đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 để đếm.
2.4.3.4. Đọc kết quả
Kết quả 10-2 10-3 10-4
Đĩa 1
Đĩa 2
Công thức tính toán
A=
(cfu/g)
34
𝑁 𝑛1𝑉1𝑓1 +⋯ +𝑛𝑖𝑉𝑖𝑓𝑖
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Trong đó:
A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1g mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường
f: độ pha loãng tương ứng
2.4.4. Định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
2.4.4.1. Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa
lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ 370C sau 24 – 48
giờ. Ngoài lactose môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi
khuẩn Gram dương. Trên môi trường này khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, đường
kính > 0,5cm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tủa muối mật. Việc khẳng định được
thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như canh BGBL.
Để phát hiện được bộ phận tế bào bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá
trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không phát triển được
trong môi trường chọn lọc, do đó trước tiên mẫu phải được cấy vào môi trường tăng
35
sinh không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
2.4.4.2. Quy trình phân tích
Cân 10g mẫu và 90ml môi trường SPW đồng nhất trong 30 giây
độ pha loãng 10-1
Cấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó, đổ môi trường
TSA đã được làm nguội đến 450C và chờ trong 30 phút
Đổ môi trường VRB lên môi trường TSA
RB
Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ
Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối
mật, đường kính > 0,5mm
Ở mỗi đĩa chọn 3 – 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL
Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ
Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả
36
Hình 2.4: Quy trình phân tích chỉ tiêu Coliforms
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
2.4.4.3 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu
Cân chính xác 10g mẫu cho vào bao PE vô trùng, thêm vào 90ml môi trường
SPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất bằng tay trong 30 giây. Khi
đó, ta sẽ được độ pha loãng 10-1.
Cấy mẫu
Cấy chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào 2 đĩa petri. Cho vào mỗi đĩa
đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 450C, trộn đều
dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim
đồng hồ. Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ nhằm phục hồi khả năng của
Coliforms. Đổ thêm 10 – 15ml môi trường VRB. Chờ môi trường đông đặc, lật
ngược đĩa và ủ ở 370C trong 24 giờ.
Chọn các đĩa có số đếm từ 10 – 100 khuẩn lạc Coliforms để tính. Khuẩn lạc
Coliforms có màu đỏ đến đỏ đậm và đường kính > 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có
quầng tủa muối mật.
Thử nghiệm khẳng định
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường canh BGBL và ủ ở
370C trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi vi sinh vật sinh khí trong ống Durham.
Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khuẩn lạc
khẳng định.
2.4.4.4. Đọc kết quả
Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ xác nhận, tính mật độ của Coliforms
theo công thức:
× 𝑅
A =
𝑁 𝑛1𝑉1𝑓1 +⋯ +𝑛𝑖𝑉𝑖𝑓𝑖
Trong đó:
N: tổng số khuẩn lạc đếm được
ni: số đĩa có số lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng
37
V: thể tích cấy vào mỗi đĩa
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
R = số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL / số khuẩn lạc đã cấy
2.4.5. Phương pháp định tính E.Coli trong thực phẩm
2.4.5.1. Nguyên tắc
Phương pháp này dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện
E.Coli trong một khối lượng mẫu xác định.
Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh (BGBL), kiểm tra trên môi trường phân lập
(EMB) và thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC).
38
2.4.5.2. Quy trình phân tích
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Cân 10g mẫu và 90ml môi trường SPW đồng nhất trong 30 giây Cân 10g mẫu và 90ml môi trường SPW đồng nhất trong 30 giây
độ pha loãng 10-1 độ pha loãng 10-1
Cấy 1ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào 10ml môi trường BGBL
Ủ ở 440C ± 0,5 trong 24 giờ
Chọn các ống sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB. Mẫu không sinh hơi được coi là âm tính E.Coli
Ủ ở 370C ± 0,5 trong 24 giờ
Khuẩn lạc đặc trưng của E.Coli trên EMB: tròn lồi,
đường kính < 0,5mm, có ánh kim tím
Cấy vào môi trường 1 Tryptone, 2 MR – VP, 1 Simmons Citrate
Ủ ở 370C ± 0,5 trong 24 giờ
Sử dụng các loại thuốc thử để test thử nghiệm IMViC
Kết luận: phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong 10g mẫu
39
Hình 2.5: Quy trình phân tích chỉ tiêu E.Coli
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
2.4.5.3. Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu
Cân chính xác 10g mẫu cho vào bao PE vô trùng, thêm vào 90ml môi trường
SPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất bằng tay trong 30 giây. Khi
đó, ta sẽ được độ pha loãng 10-1.
Cấy mẫu
Tăng sinh: cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1 vào ống nghiệm
chứa 10ml canh BGBL, ủ 440C trong 24 giờ.
Phân lập: sau 24 giờ, chọn các ống nghiệm cho phản ứng dương tính (môi
trường đục và có sinh hơi) cấy chuyển sang môi trường phân lập EMB. Ủ ở 370C
trong 24 giờ.
Nhận dạng khuẩn lạc E.Coli: khuẩn lạc tròn, màu tím, có bờ đều, đường kính
0,5mm, có ánh kim tím.
Thử nghiệm khẳng định
Những khuẩn lạc nghi ngờ được thực hiện qua các bước thử nghiệm sinh hóa
(thực hiện nghiệm pháp IMViC) như sau:
Thử nghiệm khả năng sinh Indole: cấy vi sinh vật qua môi trường canh
Tryptone, ủ 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, nhỏ thêm thuốc thử Kovac vào và quan
sát. Nếu trên bề mặt có vòng đỏ cánh sen xuất hiện là phản ứng Indole dương tính,
âm tính khi không có vòng đỏ xuất hiện.
Thử nghiệm Methyl red: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose
phosphate, ủ 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, nhỏ thêm thuốc thử methyl red vào.
Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ, âm tính khi môi trường
giữ nguyên màu vàng.
Thử nghiệm Voges – Proskauer: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose
phosphate, ủ 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, nhỏ thêm thuốc thử α-napthol 5% và
KOH 40%. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút. Phản ứng Voges – Proskauer
dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ, phản ứng âm tính khi không có sự
40
đổi màu.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Thử nghiệm Citrate: cấy vi sinh vật vào môi trường thạch nghiêng Simmon
Citrate có màu xanh lục, ủ 370C trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi trường
đổi sang màu xanh dương, âm tính khi môi trường không đổi màu.
Bảng 2.1 : Ghi nhận kết quả thử nghiệm sinh hóa
Kết TT Thử nghiệm sinh hóa quả
1. Indole +
2. Methyl red +
3. Voges - Proskauer -
4. Khả năng sử dụng Citrate -
2.4.5.4. Đọc kết quả
41
Phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong 10g mẫu.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hiện trạng khu vực thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám
3.1.1. Đặc điểm khu vực chợ
Có tính hợp lý, rõ ràng, gồm một số khu vực điển hình: khu vực thịt, khu vực
hải sản, khu vực rau quả...
Số lượng người mua rất đông, nhất là vào các giờ cao điểm (từ 9h – 11h30).
Do có một số lượng lớn khách hàng đi xe máy vào chợ, nên có nhiều bụi bẩn và
nguy cơ ngoại nhiễm rất cao.
3.1.2. Đặc điểm quầy thịt bò (nơi thu mẫu)
- Các quầy thịt bò được bố trí không hợp lý, không tập trung mà nằm một cách
rải rác, không có trật tự tại chợ. Có một số quầy (Q3, Q8, Q9) được bày bán gần
khu vực cống thải.
- Môi trường không sạch sẽ, có quá nhiều nguồn nước bẩn xung quanh khu
vực.
Dựa vào những nguyên nhân trên, có thể nhận thấy rằng việc bố trí khu vực
bày bán thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám không hợp lý do các quầy hàng buôn bán
tự do, không chuyên biệt cho từng loại sản phẩm nên dễ dẫn đến tình trạng nhiễm
chéo, làm cho nguy cơ nhiễm vi sinh vật gây bệnh trên thịt bò là khá cao. Chính vì
vậy, cần phải có những biện pháp nhằm ngăn chặn khả năng nhiễm vi sinh trên thực
phẩm.
3.2. Kết quả đánh giá cảm quan mẫu thịt bò
- Về màu sắc của mẫu: có màu sắc đặc trưng của thịt bò, lớp thịt có màu đỏ,
lớp mỡ có màu vàng nhạt. Không có mảng bầm tím, tụ máu.
- Về trạng thái của mẫu: bề mặt ngoài của mẫu thịt khô, không nhớt, không
dính lông và tạp chất lạ.
Mặt cắt mịn, khối thịt rắn chắc, có độ đàn hồi, ấn ngón tay vào thấy thịt mềm,
có độ dính và không để lại dấu ấn trên bề mặt thịt khi bỏ tay ra.
42
- Về mùi của mẫu: có mùi đặc trưng của thịt bò, không có mùi lạ.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Dựa vào kết quả đánh giá cảm quan có thể nhận thấy rằng, phần lớn các mẫu
thịt bò được lấy từ chợ vẫn trong tình trạng rất tốt, màu sắc và mùi vị vẫn còn tính
đặc trưng của sản phẩm. Do thời điểm lấy mẫu bắt đầu lúc 7h30 – 8h30, đây là thời
điểm thịt vừa được vận chuyển từ lò mổ về nên sản phẩm thường có trạng thái tươi
ngon và mới.
Tuy nhiên vẫn có mẫu thuộc Q5 và Q9 không ổn định về mùi và độ đàn hồi,
điều này có thể lý giải do một số nguyên nhân: sản phẩm thịt còn thừa của ngày
hôm qua, sản phẩm đã trải qua quá trình bảo quản lạnh qua đêm, nơi buôn bán gần
các nguồn nhiễm (rác thải, cống ngầm).
Việc đánh giá cảm quan của sản phẩm sẽ có cái nhìn sơ bộ về tình trạng mẫu
trước khi phân tích. Đối với những mẫu thịt có dấu hiệu cảm quan không tốt, điều
này có thể dẫn đến sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong mẫu khá cao. Tuy
nhiên, đối với các mẫu đạt trạng thái cảm quan tốt cũng không chứng tỏ chúng
không mang các vi sinh vật gây bệnh. Do đó, các mẫu thịt này đạt chất lượng hay
không còn phụ thuộc vào kết quả đánh giá sự hiện diện của các chỉ tiêu vi sinh vật
gây bệnh sẽ khảo sát sau đây.
3.3. Kết quả đánh giá chỉ tiêu vi sinh vật hiện diện trong thịt
Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046 : 2002 – Thịt tươi – quy định kỹ thuật
thì các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 3.1. Chỉ tiêu vi sinh trên thịt tươi [16]
Giới hạn Tên chỉ tiêu tối đa
1.Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1 g sản phẩm 106
2. E.Coli, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 102
3. Salmonella, số vi khuẩn trong 25 g sản phẩm 0
4. B. cereus, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 102
5. Staphylococcus aureus, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 102
6. Clostridium perfringens, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 10
43
7. Clostridium botulinum, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 0
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
3.3.1. Kết quả đánh giá chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC)
Kết quả đánh giá mức độ hiện diện tổng vi sinh vật hiếu khí trong sản phẩm
1200000
1000000
800000
600000
thịt bò được trình bày trên hình 3.1
g / U F C
400000
200000
0
Q1
Q2
Q3
Q4
Q5
Q6
Q7
Q8
Q9 Q10
Tiêu chuẩn
Quầy
Hình 3.1: Mức độ nhiễm khuẩn TPC trong 10 quầy thịt bò
Dựa vào hình 3.1, có thể thấy rằng mỗi quầy thịt đều nhiễm TPC với những
mật độ khác nhau, trong đó quầy có mức độ nhiễm cao nhất là Q2 và Q10 là quầy
có mức độ nhiễm thấp nhất. Mức độ nhiễm giữa các quầy có sự chênh lệch rất lớn,
không đồng đều.
Mặc dù có sự khác biệt về mật độ TPC nhưng trong 10 quầy thịt bò được khảo
sát với 3 lần lặp lại, không có bất kỳ mẫu nào vượt quá chỉ tiêu cho phép (theo
TCVN 7046 :2002, 106 CFU/g). Điều này chứng tỏ rằng chất lượng của sản phẩm
thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám khá tốt. Có thể lý giải cho kết luận trên là do mẫu
được thu vào buổi sáng và đây là thời điểm chợ chưa đông khách, tình trạng vệ sinh
ở chợ còn tương đối sạch sẽ đồng thời các mẫu vừa được vận chuyển từ lò mổ về
44
nên thịt vẫn còn tươi ngon.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Hình 3.2: Khuẩn lạc TPC trên môi trường PCA
3.3.2. Kết quả đánh giá chỉ tiêu Coliforms
Kết quả đánh giá mức độ hiện diện Coliforms trong sản phẩm thịt bò được
250
200
trình bày trên hình 3.3
/
150
100
g U F C
50
0
Q1
Q2
Q3
Q4
Q5
Q6
Q7
Q8
Q9 Q10
Tiêu chuẩn
Quầy
45
Hình 3.3: Mức độ nhiễm khuẩn Coliforms trong 10 quầy thịt bò
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Hình 3.3. cho thấy trong tổng số các mẫu tại 10 quầy được phân tích có 4 quầy
vượt quá tiêu chuẩn về “tiêu chuẩn Coliform tổng số cho phép trong thực phẩm, Bộ
Y Tế” (102 CFU/g). Tất cả các mẫu còn lại cho kết quả Coliforms thấp hơn tiêu
chuẩn cho phép.
Mặc dù đối với chỉ tiêu TPC, mức độ nhiễm vượt quá chỉ tiêu cho phép là
không có trên 10 quầy, nhưng đối với chỉ tiêu Coliforms có đến 4 quầy có mức độ
nhiễm cao (Q3, Q4, Q9, Q10) chiếm 40% tổng số quầy.
Xét riêng từng quầy lấy mẫu:
- Tại Q3 với 3 mẫu đem phân tích thì có 1 mẫu đạt tiêu chuẩn cho phép (chiếm
33,3%) và 2 mẫu vượt mức chỉ tiêu (chiếm 66,6%).
- Tại Q4 với 3 mẫu đem phân tích thì có 2 mẫu đạt tiêu chuẩn cho phép và 1
mẫu vượt mức chỉ tiêu (chiếm 33,3%).
- Tại Q9, Q10 mỗi quầy đem phân tích 3 mẫu thì cả 3 mẫu đều vượt mức chỉ
tiêu cho phép (chiếm 100%). Đáng lưu ý ở đây là Q9 mức độ nhiễm
Coliforms cao gấp 2 lần chỉ tiêu cho phép của Bộ Y Tế.
Sự hiện diện của Coliforms trong mẫu với mật độ cao có thể do hiện trạng khu
vực xung quanh mẫu có nhiều nguy cơ nhiễm Coliforms. Việc bố trí các quầy
không hợp lý cũng là một nguyên nhân gây ra sự nhiễm chéo giữa các quầy khác
nhau (quầy cá, quầy hải sản...). Đối với những người bán tại chợ, họ không thực
hiện đúng các nguyên tắc đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm.
Đối với Q9, như đã đánh giá cảm quan ở trên và nhìn nhận về hiện trạng lấy
mẫu, có thể nhận định rằng quầy này nhiễm Coliforms chủ yếu thông qua tác nhân
bên ngoài: khu vực bày bán gần cống thải, đây chính là nguyên nhân tiền đề làm
46
tăng mối nguy nhiễm Coliforms trên các quầy thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms
3.3.3. Kết quả đánh giá chỉ tiêu E.Coli
Tỷ lệ nhiễm E.Coli
Âm tính
Dương tính
23%
77%
47
Hình 3.5: Mức độ nhiễm khuẩn E.Coli trong 10 quầy thịt bò
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Hình 3.5. cho thấy rằng trong 30 mẫu được phân tích, có 7 mẫu được xác định
là dương tính với E.Coli (chiếm 23% tổng số mẫu).
Xét riêng từng quầy lấy mẫu:
- Tại Q2, Q3 và Q5, cứ mỗi quầy với 3 lần lặp lại thì có 1 mẫu dương tính với
E.Coli (chiếm 33.3%) và 2 mẫu còn lại âm tính.
- Tại Q9, Q10 với 3 lần lặp lại thì tỷ lệ dương tính với E.Coli cao hơn (chiếm
66,6%).
Việc các mẫu thịt bò ở Q9 và Q10 tỷ lệ nhiễm E.Coli cao hơn là điều có thể dự
báo được vì kết quả đánh giá cảm quan các mẫu thịt thu từ quầy này không tốt.
Không những vậy, kết quả đánh giá chỉ tiêu Coliforms của 2 quầy này cũng cao hơn
so với tiêu chuẩn rất nhiều lần. Sự hiện diện của E.Coli trong mẫu có thể do một số
nguyên nhân: việc bố trí các quầy thịt bò không hợp lý giữa các quầy, phân bố
không đều mà nằm rải rác từng khu vực, việc này đã dẫn đến hiện tượng nhiễm
E.Coli từ các mẫu khác trong chợ: quầy cá, quầy hải sản... Một số quầy (Q3, Q9)
tập trung gần khu vực cống thải làm cho một lượng lớn mẫu thịt bò có thể bị nhiễm
ngay từ môi trường ngoài. Vi khuẩn E.Coli có thể lan truyền từ người không rửa tay
sau khi đi vệ sinh mà tiếp xúc trực tiếp với các mẫu thịt.
48
Hình 3.6: Khuẩn lạc E.Coli
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Tóm lại, trong tổng số 30 mẫu thịt bò thu từ 10 quầy tại chợ Hoàng Hoa
Thám, chúng tôi nhận thấy: phần lớn thịt bò tại các quầy có đặc điểm cảm quan tốt,
chỉ tiêu TPC có mức độ nhiễm vừa phải tuy nhiên không có mẫu nào vượt mức tiêu
chuẩn. Riêng đối với chỉ tiêu Coliforms thì có đến 4 quầy vượt mức cho phép và
cao nhất ở các mẫu của Q9, Q10. Đặc biệt cũng chính các mẫu thịt bò ở 2 quầy này
có sự hiện diện của vi khuẩn E.Coli. Như vậy, nhìn chung tình trạng vệ sinh an toàn
thực phẩm của các quầy thịt bò cũng không đáng mức báo động ngoại trừ các mẫu ở
Q9 và Q10. Do đó, chúng tôi khuyến cáo với người tiêu dùng nên cân nhắc khi sử
dụng sản phẩm thịt bò từ 2 quầy này. Riêng đối với các sản phẩm thịt từ chợ Hoàng
Hoa Thám thì người tiêu dùng không nên ăn sống, tái mà phải chế biến kỹ để tránh
49
tình trạng rối loạn tiêu hóa do vi khuẩn đường ruột gây ra.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Đánh giá cảm quan
Hầu hết các mẫu thịt bò (28/30) đều được đánh giá tốt về mặt cảm quan từ
trạng thái đến mùi vị vẫn còn tính đặc trưng của sản phẩm.
Chỉ tiêu TPC
Trong tổng số 30 mẫu thịt bò được lấy tại 10 quầy để phân tích thì tất cả 30
mẫu đều nhiễm TPC với mật độ khác nhau, tuy nhiên không có mẫu nào nhiễm
TPC vượt quá chỉ tiêu cho phép (106 CFU/g).
Chỉ tiêu Coliforms
Ở chỉ tiêu này, phát hiện 4 quầy trên tổng số 10 quầy (chiếm 40% tổng số quầy
được phân tích) có mức độ nhiễm Coliforms vượt quá giới hạn cho phép
(102CFU/g).
Đánh giá mức độ nhiễm E.Coli
Ở thí nghiệm này, phát hiện có 7 mẫu nhiễm E.Coli trong tổng số 30 mẫu được
phân tích và tỷ lệ mẫu không đạt chiếm 23%.
4.2. Kiến nghị
Đối với đề tài: Cần nhiều thời gian để có thể phân tích nhiều mẫu hơn và đánh
giá thêm một số chỉ tiêu vi sinh vật như Salmonella, S. aureus... Vì với những mẫu
có mức độ nhiễm Coliforms cao nhưng lại không có sự hiện diện E.Coli cũng không
chứng tỏ chúng không mang các vi sinh vật đường ruột khác như Salmonella,
Shigella.
Đối với các quầy thịt tại chợ:
Vệ sinh thực phẩm là tất cả những điều kiện và biện pháp nhằm đảm bảo an
toàn và tính hợp lý của thực phẩm. Vì thế các tiểu thương phải:
50
- Đảm bảo được nguồn gốc nơi lấy mẫu.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
- Đảm bảo điều kiện bảo quản mẫu trong suốt quá trình vận chuyển. Phương
tiện vận chuyển được chế tạo bằng vật liệu không làm ô nhiễm mẫu và dễ
làm sạch.
- Địa điểm, diện tích buôn bán thích hợp, có khoảng cách an toàn đối với
nguồn gốc gây hại, nguồn gây ô nhiễm.
- Có hệ thống xử lý nước, rác thải để bảo vệ môi trường xung quanh khu vực
quầy hàng.
- Phòng ô nhiễm chéo các thực phẩm lẫn nhau, các dụng cụ sang thực phẩm
51
như dao, thớt..., bàn tay, trang phục của người bán hàng trực tiếp bị bẩn.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt [1]. GSTSKH. Nguyễn Trọng Cẩn, GVC. Đỗ Minh Phụng, GV.ThS. Nguyễn Lê
Hà. Công nghệ đồ hộp thủy sản và gia súc gia cầm. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật.
[2]. Trần Linh Thước (2003). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo dục.
[3]. PGS.TS. Nguyễn Phùng Tiến, GS.TS. Bùi Minh Đức, GS.TS. Nguyễn Văn Dịp
(2003). Vi sinh vật trong thực phẩm – Kỹ thuật kiểm tra và chỉ tiêu đánh giá chất
lượng an toàn thực phẩm. NXB Y Học Hà Nội.
[4]. Nguyễn Tiến Dũng (2006). Tài liệu bài giảng Phương pháp kiểm nghiệm vi
sinh trong thực phẩm. Đại học Khoa Học Tự Nhiên.
[5]. Phạm Minh Nhựt (2007). Tài liệu bài giảng Phương pháp đánh giá chất lượng
vệ sinh an toàn thực phẩm. Lưu hành nội bộ Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ
TPHCM.
[6]. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2006). Thực tập vi sinh vật học thực phẩm.
NXB Đại học Quốc Gia TPHCM.
[7]. Lê Huy Chính (2001). Vi sinh y học. Nhà xuất bản Y học Hà Nội.
II. Tài liệu tiếng Anh
[8]. Kenneth Todar, (2005) Todar’s Online Textbook of Bacteriology University of
Wisconsin-Madison Department of Bacteriology (Staphylococcus). Kenneth Todar
University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology.
III. Tài liệu internet
[9]. http://www.doko.vn/luan-van/vi-sinh-vat-trong-thit-va-cac-san-pham-tu-thit-
211505
[10].http://luanvan.net.vn/luan-van/de-tai-tong-quan-ve-he-vi-sinh-vat-trong-thit-
va-cac-san-pham-tu-thit-37834/
52
[11].http://giaoan.violet.vn/present/same/entry_id/278892
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
[12]. http://www.vba.com.vn
[13].http://www.doko.vn/luan-van/nghien-cuu-xay-dung-mo-hinh-che-bien-cac-
san-pham-tu-tinh-bot-dam-bao-ve-sinh-an-toan-thuc-pham-ve-cac-chi-tieu-ly-hoa-
vi-sinh-vat-33371
[14]. http://123doc.vn/document/323538-vi-khuan-escherichia-coli.htm
[15]. http://www.textbookofbacteriology.net/staph.html
53
[16]. http://www.spsvietnam.gov.vn
