BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KIỂM TRA ĐỘ TINH SẠCH ĐOẠN GENE 16S rDNA
TRONG XÁC ĐỊNH LOÀI BẰNG PHƯƠNG PHÁP DGGE
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. Hoàng Quốc Khánh
CN Ngô Đức Duy
Sinh viên thực hiện : Hà Trầm Xuân
MSSV: 0851110305 Lớp: 08DSH6
TP. Hồ Chí Minh, 2012
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
i
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ v
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ .................................................. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... vii
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 5
1.1. Tổng quan về nhóm vi sinh vật ..................................................................... 5
1.2. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA genomic .................................. 5
1.2.1. Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật trong
môi trường tự nhiên .............................................................................................................. 5
1.2.2. Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật từ dịch
nuôi cấy. .................................................................................................................................. 7
1.3. Các ứng dụng của phương pháp PCR ............................................................ 7
1.3.1. Ứng dụng phương pháp PCR trong xác định trình tự nucleic acid. ....... 7
1.3.2. Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình xác định loài vi sinh
vật. .................................................................................................................................... 7
1.3.3. Ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện các tác nhân vi sinh
vật gây bệnh nhiễm trùng. .................................................................................................. 9
1.3.4. Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình thúc đẩy nhanh công
nghệ giải trình tự. ................................................................................................................. 9
1.3.5. Ứng dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh di
truyền. .................................................................................................................................. 10
1.4. Phương pháp DGGE và ứng dụng ............................................................... 10
1.5. Định danh nhóm vi khuẩn ........................................................................... 12
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ii
1.5.1. Định danh bằng phương pháp truyền thống ................................................ 12
1.5.2. Định danh nhóm vi khuẩn bằng sinh học phân tử. .................................... 14
1.6. Xây dựng cây phát sinh loài chủng loài ......................................................... 19
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................. 20
2.1. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 20
2.2. Vật liệu thí nghiệm ...................................................................................... 20
2.3. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 22
2.4. Quy trình kiểm tra độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA của từng
chủng vi khuẩn. ...................................................................................................... 23
2.4.1. Quy trình ly trích và thu nhận DNA genomic bằng nhiệt. ....................... 24
2.4.2. Quy trình kiểm tra sự xuất hiện DNA genomic trong mẫu sau khi ly
trích. .................................................................................................................................. 26
2.4.3. Khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của nhóm vi khuẩn bằng phương
pháp PCR. ............................................................................................................................. 27
2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng QIAGEN Kit. ............................................. 28
2.4.5. Quy trình Applied Biosystems.......................................................................... 30
2.4.6. Xác định thành phần của mỗi chủng vi khuẩn bằng phương pháp
DGGE. ................................................................................................................................... 32
2.5. Sử dụng phần mềm tin sinh học .................................................................... 36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ............................................................ 37
3.1. Kết quả tăng sinh và kiểm tra hình thái tế bào của 9 chủng vi khuẩn. .......... 37
3.2. Kết quả ly trích DNA genomic bằng nhiệt của 9 chủng vi khuẩn. ................. 42
3.3. Kết quả khuếch đại đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp PCR. ............. 42
3.4. Kết quả tinh sạch đoạn gene 16S rDNA bằng QIAGEN Kit.......................... 43
3.5. Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA của 9 chủng vi khuẩn. ................ 44
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
iii
3.6. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loài ................................................... 54
3.7. Kết quả khuếch đại vùng V3 cho phương pháp DGGE ................................. 56
3.8. Kết quả kiểm tra nồng độ DNA bằng máy BEKMAN .................................. 57
3.9. Kết quả vùng V3 trên gel polyacrylamide của 9 chủng vi khuẩn bằng
phương pháp DGGE. ............................................................................................. 58
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ............................................................ 59
4.1. Kết luận ........................................................................................................... 59
4.2. Kiến nghị......................................................................................................... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 61
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CTAB Cetyl – trimetyl – ammomiumbromide
DNA Deoxyribonucleic acid
DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates
EDTA Ethylene – Diamine – Tetraacetic – Acid
EtBr Ethidium bromide
PCR Polymerase chain reaction
SDS Sodium dodecyl sulfate
RNA Ribonucleic acid
TAE Tris – Acetic – EDTA
Taq Thermus aquaticus
TE Tris – EDTA
UV Ultra Violet